Dokument_24.

Charakterisierung eines neuen inhibitorischen
Rezeptors auf B1 Lymphozyten mit Hilfe von
Siglec-G-defizienten Mäusen
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Anja Hoffmann
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen
Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 25. Oktober 2007
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Lars Nitschke
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Andre Gessner
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG
-1-
1.1 DAS IMMUNSYSTEM
-1-
1.2 DIE B-ZELLE
-1-
1.3 DIE T-ZELL-ABHÄNGIGE IMMUNANTWORT
-2-
1.4 DIE T- ZELL-UNABHÄNGIGE IMMUNANTWORT
-3-
1.5 ENTWICKLUNG DER B-ZELLEN
-3-
1.5.1 DIE ENTWICKLUNGSSCHRITTE DER B-ZELLEN IM KNOCHENMARK
-3-
1.5.2 DIE REIFUNG DER B-ZELLEN IN DER MILZ
-5-
1.6 B1-ZELLEN IN DER BAUCHHÖHLE
-6-
1.7 DIE SIGNALLEITUNG DES BZR
-7-
1.7.1 DIE CALCIUMSIGNALKASKADE IN B LYMPHOZYTEN
-8-
1.8 DIE FAMILIE DER SIGLECS
-9-
1.8.1 CD22
- 11 -
1.8.2 MURINES SIGLEC-G
- 11 -
1.9 ZIELSETZUNG
- 12 -
2
- 13 -
MATERIAL
2.1 TIERE
- 13 -
2.2 ANTIBIOTIKA
- 13 -
2.3 ANTIKÖRPER
- 13 -
2.3.1 FACS ANTIKÖRPER
- 13 -
2.3.2 STIMULIERENDE ANTIKÖRPER
- 14 -
2.3.3 ANTIKÖRPER ZUR B ZELL AUFREINIGUNG ÜBER KOMPLEMENTLYSE
- 14 -
2.3.4 WESTERN ANTIKÖRPER
- 15 -
2.3.5 ANTIKÖRPER FÜR ELISA UND ELISPOT
- 15 -
2.4 PRIMER
- 15 -
2.5 PUFFER UND LÖSUNGEN
- 16 -
2.6 CHEMIKALIEN
- 19 -
2.7 ENZYME
- 20 -
2.8 VERWENDETE KITS
- 20 -
3
- 21 -
METHODEN
Inhaltsverzeichnis
3.1 ZELLBIOLOGISCHE UND IMMUNOLOGISCHE METHODEN
- 21 -
3.1.1 ORGANENTNAHME UND AUFARBEITUNG
- 21 -
3.1.2 T ZELL DEPLETION DURCH KOMPLEMENT- LYSE
- 21 -
3.1.3 FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING (FACS)
- 22 -
3.1.4 CALCIUM MESSUNG
- 22 -
3.1.5 ELISA
- 23 -
3.1.5.1 Gesamt Immunglobulin Sandwich- ELISA
- 23 -
3.1.5.2 Antigen spezifischer Sandwich- ELISA
- 23 -
3.1.6 ELISPOT
- 24 -
3.1.7 PROLIFERATIONSTEST
- 25 -
3.1.8 IN VITRO STIMULATION
- 25 -
3.2 MAUSEXPERIMENTE „IN VIVO“
- 25 -
3.2.1 ADOPTIVER KNOCHENMARK-TRANSFER
- 25 -
3.2.2 BRDU FÜTTERUNGSEXPERIMENTE
- 26 -
3.2.3 IMMUNISIERUNGEN
- 26 -
3.2.3.1 Thymus- abhängige Antigene
- 26 -
3.2.3.2 Thymus- unabhängige Antigene
- 26 -
3.2.3.3 Immunisierung mit Erythrozyten aus dem Schaf und Histologie
- 26 -
3.3 KULTIVIERUNG EMBRYONALER STAMMZELLEN DER MAUS
- 27 -
3.3.1 ES-ZELLEN AUFTAUEN UND PLATTIEREN
- 27 -
3.3.2 ES-ZELLEN PASSAGIEREN
- 27 -
3.3.3 ES-ZELLEN EINFRIEREN
- 27 -
3.3.4 VORBEREITUNG VON ES-ZELLEN FÜR DIE INJEKTION IN BLASTOCYSTEN
- 27 -
3.4 BIOCHEMISCHE METHODEN
- 28 -
3.4.1 HERSTELLUNG VON ZELLLYSATEN FÜR WESTERN BLOT
- 28 -
3.4.2 SDS PAGE GEL FÜR WESTERN BLOT
- 28 -
3.4.3 ELEKTRO BLOT VON PROTEINGELEN
- 29 -
3.4.4 IMMUNOLOGISCHE DETEKTION BEIM WESTERN BLOT
- 29 -
3.5 NUKLEINSÄURE-SPEZIFISCHE METHODEN
- 30 -
3.5.1 DNA ISOLATION AUS MÄUSESCHWÄNZEN
- 30 -
3.5.2 DNA ISOLATION AUS ZELLEN
- 30 -
3.5.3 RNA ISOLIERUNG AUS PRIMÄREN ZELLEN
- 31 -
3.5.4 CDNA SYNTHESE
- 31 -
3.5.5 STANDARD PCR PROTOKOLL
- 31 -
3.5.6 SOUTHERN BLOT
- 32 -
3.5.6.1 Southern Gel
- 32 -
3.5.6.2 Kapillarblot
- 32 -
Inhaltsverzeichnis
3.5.6.3 Hybridisierung
- 33 -
ERGEBNISSE
- 34 -
4
4.1 EXPRESSION VON SIGLEC-G
- 34 -
4.1.1 MRNA EXPRESSION VON SIGLEC-G IN VERSCHIEDEN ZELLPOPULATIONEN
- 34 -
4.1.2 SIGLEC-G EXPRESSION AUF PROTEINEBENE
- 35 -
4.2 HERSTELLUNG EINER SIGLEC-G DEFIZIENTEN MAUS
- 37 -
4.2.1 STRATEGIE UND ES-ZELLMANIPULATIONEN
- 38 -
4.2.2 ÜBERPRÜFUNG DER SIGLEC-G DEFIZIENTEN MAUSLINIEN
- 40 -
4.2.2.1 Prüfung der Mutation auf DNA Ebene
- 40 -
4.2.2.2 Nachweis über das Fehlen von Siglec-G mRNA in der knock out Maus
- 42 -
4.2.2.3 Knock out Mäuse besitzen kein Siglec-G Protein mehr
- 42 -
4.3 PHÄNOTYP DER SIGLEC-G DEFIZIENTEN MAUSLINIE
- 43 -
4.3.1 SIGLEC-G DEFIZIENTE MÄUSE ZEIGEN IM KNOCHENMARK KEINE VERÄNDERTE BZELLENTWICKLUNG
- 43 -
4.3.2 SIGLEC-G -/- MÄUSE ZEIGEN EIN STARK VERGRÖßERTES B1-ZELLKOMPARTMENT
- 45 -
4.3.3 SIGLEC-G-DEFIZIENTE MÄUSE ZEIGEN EINE STARK VERGRÖßERTE B1A ZELLPOPULATION
IM PERITONEUM
- 46 -
4.3.4 DIE EXPANSION DER B1-ZELLEN IST DURCH ZELLINTERNE VORGÄNGE BEGRÜNDET
- 49 -
4.3.5 B1-ZELLEN ZEIGEN EINE VERLANGSAMTE GENERATIONENFOLGE
- 51 -
4.3.6 B1-ZELLEN ENTWICKELN SICH IN DER SIGLEC-G -/- MAUS FRÜHER
- 52 -
4.3.7 B1A-ZELLEN DER SIGLEC-G DEFIZIENTEN MAUS WEISEN EINEN STARK ERHÖHTEN CALCIUM
SIGNALLEITUNG AUF
- 54 -
4.3.8 B-ZELLEN DER SIGLEC-G DEFIZIENTE MAUS ZEIGEN KEINE VERSTÄRKTE PROLIFERATION
NACH BZR-STIMULATION
- 55 -
4.3.9 B-ZELLEN VON SIGLEC-G -/- ZEIGEN NACH IN VITRO STIMULATION EINE NORMALE
HOCHREGULIERUNG VON AKTIVIERUNGSMARKERN
- 57 -
4.3.10 SIGLEC-G DEFIZIENTE MÄUSE ZEIGEN EINEN ERHÖHTEN IGM SPIEGEL
- 58 -
4.3.11 SIGLEC-G DEFIZIENTE MÄUSE ZEIGEN LEICHT VERÄNDERTE IMMUNANTWORTEN
- 60 -
4.3.11.1 Siglec-G defiziente Mäuse zeigen eine leicht verstärkte Immunantwort auf Thymus
unabhängige Typ2 Antigene
- 60 -
4.3.11.2 Siglec-G defiziente Mäuse zeigen eine fast normale Immunantwort bei Thymus
abhängigen Antigenen
- 62 -
4.3.11.3 Siglec-G-defiziente Mäuse zeigen eine normale Architektur der Milz nach
Immunisierung
- 63 -
4.3.12 SIGLEC-G DEFIZIENTE MÄUSE HABEN LEICHT ERHÖHTE IGM AUTOANTIKÖRPER
- 63 -
Inhaltsverzeichnis
4.3.12.1 Siglec-G defiziente Mäuse zeigen keine erhöhte Penetranz von anti-DNA oder antinukleäre Antikörpern
- 64 -
4.3.12.2 Siglec-G knock out Mäuse haben einen leicht erhöhten Titer an Rheumafaktor - 64
4.3.12.3 Verstärktes Auftreten von anti Erytrozyten Autoantikörpern der Siglec-G defizienten
Maus
- 65 -
5
DISKUSSION
- 67 -
6
ZUSAMMENFASSUNG
- 72 -
7
SUMMARY
- 73 -
8
LITERATUR
- 74 -
9
ANHANG
- 82 -
9.1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
- 82 -
9.2 PUBLIKATIONEN
- 85 -
9.3 LEBENSLAUF
- 86 -
9.4 DANKSAGUNG
- 87 -
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Das Immunsystem
Das Immunsystem umfasst viele verschiedene Zelltypen und immunkompetente Organe des
Körpers. Es dient der Abwehr von Krankheitserregen und körpereigenen entarteten Zellen.
Das komplexe System der verschiedenen beteiligten Organe, Gewebe, Zellen und
Molekülen
gewährleistet
einen
effektiven
Schutz.
Im
Bereich
des
angeborenen
Immunsystems arbeiten z.B. Granulozyten, dendritische Zellen, natürliche Killerzellen und
Makrophagen zusammen um eine schnelle erste Abwehr gegen Pathogene zu bilden
(Überblick in Janeway). Diese angeborene Abwehr ist schon vorhanden und immer bereit,
ohne vorher den Kontakt zu diesen Pathogenen zu benötigen. Zusätzlich hierzu gibt es ein
spezifisches Abwehrsystem, auch adaptives Immunsystem genannt. Im adaptiven
Immunsystem sind B- und T-Zellen die hauptverantwortlichen Abwehrzellen. Sie erkennen
körperfremde Substanzen spezifisch und können ein so genanntes Gedächtnis ausbilden,
das bei Infektion mit dem selben Erreger zur schnelleren und effektiveren zweiten Antworten
führt (Überblick in Janeway).
1.2 Die B-Zelle
B-Zellen wurden nach ihrem Entstehungsort in Vögeln benannt: der bursa fabricii. Bei
Säugetieren entwickeln sich B-Zellen im Knochenmark und sind für die humorale Antwort
innerhalb des Immunsystems verantwortlich, d.h. sie produzieren spezifische Antikörper
gegen Pathogene, nachdem sie diesen bei ihrer Wanderung durch den Körper begegnet
sind.
Wie T-Zellen gehören B-Zellen zum adaptiven Immunsystem. Die B-Zelle wird durch das
Rearrangement von genomischer DNA, die den Antikörper kodiert, einzigartig. Dieser
einmalige membranständige Antikörper dient der Antigenerkennung. Dieses Rearrangement
wird in der B-Zellentwicklung vollzogen. Willkürlich werden VH, DH, JH Genabschnitte der
schweren Kette und die VL, JL Gensegmente der leichten Kette neu zusammengefügt und die
jeweils konstanten Teile der schweren und leichten Ketten angefügt. Die einzigartige
Bindungsstelle des Antikörpers für Antigene wird durch die variablen Abschnitte der leichten
und schweren Kette gebildet. Diese variablen Domänen enthalten hypervariable Regionen.
Diese Regionen werden von Aminosäuren gebildet, die alle jeweils auch eine andere
-1-
Einleitung
Spezifität bedingen (komplementaritätsdeterminierende Regionen, CDR). (Überblick in
Janeway). Bindet die B- Zelle jedoch an körpereigene Antigene, wird sie durch negative
Selektion zur Apoptose gezwungen. Dieser Vorgang ist wichtig zur Verhinderung von
Autoimmunkrankheiten.
Auch an der Bildung des immunologischen Gedächtnisses ist die B- Zelle beteiligt. Wird die
B- Zelle durch Antigen und T-Zell-Hilfe aktiviert, bildet sie sich nicht nur zur Plasmazelle
weiter, die Antikörper sezerniert, sondern auch zu nicht-sekretorische Gedächtniszellen, die
im Körper verbleiben und bei einem wiederholten Angriff des gleichen Erregers eine schnelle
Immunantwort einleiten können (McHeyzer-Williams &McHeyzer-Williams, 2006).
1.3 Die T-Zell-abhängige Immunantwort
Kam eine B- Zell noch nicht mit einem spezifischen Antigen in Berührung, wird sie als naiv
bezeichnet. Trifft die B- Zelle auf ihrer Zirkulation durch den Körper auf ein zu ihrer Spezifität
passendes proteinhaltiges Antigen, wird dieses über den BZR gebunden und internalisiert,
prozessiert und auf dem MHC Kl.II Molekül präsentiert (Lanzaveccia et al, 1985). Die B-Zelle
wandert nun in die T-Zellzone der Milz ein und kann mit Hilfe von CD4 T-Helfer-Zellen
aktiviert werden. Die T-Helfer-Zelle kann über ihren spezifischen T-Zellrezeptor an das
präsentierte Peptid auf dem MHC KL.II Molekül binden und die B- Zelle über Zytokine und
membranständige Liganden, z.B. CD40L, aktivieren (Gray et al, 1997). Die B-Zelle wandert
in primäre Folikel ein und beginnt mit der klonalen Expansion. Es entwickeln sich
Keimzentren. In diesem Stadium kommt es zur somatischen Hypermutation (Teng et al,
2007). Während der somatischen Hypermutation kommt es zu Punktmutationen in den
variablen Regionen der schweren und leichten Ketten. B-Zellen mit Antikörpern, die besser
an das von Follikulären Dendritischen Zellen gebundene Antigen binden, überleben. Dies
führt zur Affinitätsreifung der Antikörper. In Abhängigkeit von der Umgebung oder des
Antigentyps wird auch der Klassenwechsel vollzogen. Die rearrangierten VDJ-Gene des
Antikörpers werden direkt mit anderen C-Regionen als der ursprünglichen Cμ konstanten
Region verbunden. Es entsteht eine DNA-Schleife, damit die dazwischen liegenden
Sequenzen herausgeschnitten werden können. Hier wird der Isotyp der produzierten
Antikörper verändert, was auch eine Veränderung der hinzugezogen Effektorzellen bei der
Immunantwort hat (Überblick in Janeway). Da diese Form der Immunantwort der Hilfe von TZellen bedarf, wird sie T- Zell- abhängige Immunantwort genannt. Diese T- Zell Hilfe ist bei
Antigenen aus Kohlehydratbestandteilen nicht nötig.
-2-
Einleitung
1.4 Die T- Zell-unabhängige Immunantwort
Antigene aus Kohlehydratbestandteilen lösen eine Immunantwort aus, die keine T- Zell- Hilfe
benötigt (Snapper & Mond, 1996). Die Antigene werden als Thymus-unabhängige ( Thymus
independent, TI) Antigene bezeichnet und sind in zwei Gruppen aufgeteilt. Die TI- Typ1
Antigene, z.B. LPS, sind in der Lage bei hohen Konzentrationen fast alle B-Zellen direkt zu
aktivieren. Bei niedrigen Konzentrationen aktivieren sie wiederum nur die Zellen mit
spezifischem BZR. Die TI- Typ2 Antigene bestehen aus repetitiven Strukturen, die vor allem
auf Bakterienoberflächen vorkommen. Sie sind in der Lage, mehrere BZRs auf der
Oberfläche von B-Zellen zu vernetzen und so die Zellen direkt ohne weitere Hilfe zu
aktivieren. Hauptverantwortlich für die T- unabhängige Immunantwort sind Marginalzonen BZellen und B1 B-Zellen. Damit stehen diese Zellen zwischen adaptivem und angeborenem
Immunsystem.
1.5 Entwicklung der B-Zellen
Die B- Zelle entwickelt sich über viele Entwicklungsschritte zunächst im Knochenmark und
reift weiter in der Peripherie.
1.5.1 Die Entwicklungsschritte der B-Zellen im Knochenmark
Der Ort der B-Zellentstehung bei Säugetieren ist das Knochenmark. Hier findet die
Blutbildung, die Hämatopoiese, statt. Sie beginnt mit den pluripotenten Stammzellen von
denen die lymphoiden und myeloiden Vorläuferzellen abstammen. Aus myeloiden
Vorläuferzellen entwickeln sich Monozyten, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile,
Basophile, Mastzellen, Blutplättchen und Erythrozyten. Aus „common lymphoid progenitors“,
den lymphoiden Vorläuferzellen, entstehen B-, T- und NK- Zellen. (Rolink et al, 2006)
Verschiedene Entwicklungsstadien von B-Zellen können anhand von charakteristischen
Oberflächenmolekülen, Zellgröße, Wachstums- und Teilungseigenschaften, Aufenthaltsort
und Rekombinationsstatus der Immunglobulingene eingeteilt werden (Osmond et al, 1998;
Hardy et al, 1991; Karasuyama, 1997).
-3-
Einleitung
pro-B
große
prä-B
kleine
prä-B
unreife
B-Zelle
(A/B)
(C)
(D)
(E)
KM
Prä BCR
transit.
B-Zelle
reife
B-Zelle
(F)
IgM
IgM
Tr
R
IgD
H.C. Ig Rearrangement
L.C. Rearrangement
T1
T2
?
?
IgM
B1
Fötale Leber
B1a: CD5+
B1b: CD5-
MZ
R
B1
Vorläufer
R
R
KZ
Bauchhöhle
Milz
fremdes Antigen
Abbildung 1: Übersicht über die B-Zellentwicklung
Tr: transitionale B-Zelle; R: reife B-Zelle; T1 und T2: transitionale B-Zelle Typ1 und Typ2; MZ: Marginal Zonen BZelle; KZ: Keimzentrum; H.C.: engl. Schwere Kette; L.C.: engl. Leichte Kette.
Die B-Zellentwicklung wird durch verschiedene Entwicklungsschemata beschrieben. Hier
wird das Entwicklungsschema von Hardy (1991) benutzt, der die verschiedenen
Entwicklungsstufen in Fraktionen eingeteilt hat.
Frühe Pro B- Zelle (Fraktion A):
Dieses Stadium wird erreicht, wenn alle typischen Gene der lymphoiden Vorläuferzelle nicht
mehr exprimiert werden. Die frühe Pro B- Zelle ist durch die Marker B220low, CD43high und
HSAlow definiert.
Pro B- Zelle (Fraktion B/C):
In diesem Entwicklungsschritt sind die pseudo- leichte Kette und die Rekombinationsenzyme
Rag1 und Rag2 intrazellulär schon nachweisbar. Die Pro B- Zelle zeichnet sich durch die
Marker B220low, CD43+, HSAmedium und CD19+ aus. (Zelm et al, 2006)
Prä B- Zelle (Fraktion C):
Große Prä-B-Zellen sind frühe Prä-B-Zellen, die B220+, CD43+, HSAhigh, BP-1+ und CD19+
sind. Auf ihrer Oberfläche tragen sie nun den Prä- BZR, der nur über eine Interaktion der
rearrangierten schweren Kette und der pseudo- leichten Kette aus λ5 und VpreB zustande
-4-
Einleitung
kommt. Die erfolgreiche Expression des Prä- BZR und eine funktionierende Signalleitung
über den Prä- BZR sind essentielle Voraussetzungen für eine Weiterentwicklung der B- Zelle
(Martensson et al, 2007). Jetzt wird der Genlocus für die schwere Kette verschlossen
(allelische Exklusion) und eine starke Proliferation der Prä B- Zelle setzt ein.
Späte Prä B- Zelle (Fraktion D):
Diese Zellen sind klein, exprimieren die B220+, HSAhigh, BP-1+, CD25+ und CD19+ und
beginnen mit dem Rearrangement der Gene für die leichte Kette.
Unreife B- Zelle (Fraktion E):
Nach Abschluß des Rearrangement der leichten Kette wird ein BZR des IgM Isotyps auf der
Zelloberfläche exprimiert. Nun kann sich die unreife B- Zelle unabhängig von anderen Zellen
weiterentwickeln. Es folgt eine negative Selektion der unreifen B-Zellen. Bei Zellen mit einem
BZR, der von (Auto-) Antigenen kreuzvernetzt wird, wird der Genlocus für die leichte Kette
wiedereröffnet und nochmals rearrangiert. Diesen Vorgang nennt man Rezeptor Editing
(Tiegs et al, 1993). Verbleibende autoreaktive unreife B-Zellen werden vermutlich deletiert
(klonale Deletion).
Transitionale B-Zelle:
Naive B-Zellen wandern aus dem Knochenmark über das Blut in die Milz aus. Sie werden in
zwei Gruppen unterteilt. Die Transitionalen Zellen vom Typ1 (IgMhoch, IgD-, CD21-, CD23-)
brauchen ein Überlebenssignal (Loder et al, 1999) über den BZR um zur transitionalen Zelle
vom Typ2 (IgMhoch, IgDhoch, CD21+, CD23+) weiterzureifen.
1.5.2 Die Reifung der B-Zellen in der Milz
Naive B-Zellen (transitionale B-Zellen) wandern über den Blutstrom in die Milz und sind auch
dort negativer Selektion ausgesetzt. Hier führt eine Kreuzvernetzung mit Autoantigenen zu
Apotose oder Anergie. Diese einwandernden Zellen nennt man transitionale1 (T1) Zellen.
Man kann sie nur in der äußeren periateriolaren lymphoiden Schicht nachweisen und erkennt
sie an den Oberflächenmarkern IgMhigh, IgD-, CD21-, CD23-. Nach einem Signal des BZR
wandert ein kleiner Prozentsatz in die Folikel ein und wird zu transtionalen2 (T2) Zellen
(Loder et al, 1999). Die anderen Zellen sterben. Reife folikuläre B-Zellen exprimieren IgMlow,
IgDhigh, CD21low und CD23+ und zirkulieren durch die sekundären lymphatischen Organe.
Diese B-Zellen (T1, T2 und reife) werden B2 B-Zellen genannt.
In der Milz gibt es noch andere B- Zellpopulationen, die den oben erwähnten nicht zugerechnet werden: Marginalzonen B-Zellen und B1 B-Zellen. Marginalzonen B-Zellen (MZ)
kommen, wie der Name verrät, nur in der Marginalzone der Milz vor. Diese befindet sich in
einem Ring außerhalb der B-Zellfollikel. Die MZ B-Zellen sitzen direkt an der Stelle wo das
Blut in die Milz eintritt und sind dort auf die erste Immunantwort gegen Antigene aus dem
-5-
Einleitung
Blut, z.B. Bakterien; spezialisiert (Martin & Kearny, 2002). B1 B-Zellen kommen mit den B2
B-Zellen ebenfalls in der Milz vor. Es wird angenommen, dass sie über die Milz in die
Bauchhöhle einwandern (Wardemann et al, 2002).
1.6 B1-Zellen in der Bauchhöhle
Die Hauptpopulation der B1 B-Zellen befindet sich in der Bauchhöhle. Sie machen dort ca.
40% aller lymphozytären Zellen aus. In der Milz sind sie mit 1% Anteil aller Zellen vertreten.
B1-Zellen werden durch die Marker B220low, IgMhigh, CD43+, IgDlow und CD23- klassifiziert.
Diese Zellpopulation kann in Zellen, die CD5 exprimieren (B1a) und Zellen, die negativ für
CD5 sind (B1b), aufgeteilt werden (Marcos et al, 1989; Kroese et al, 1992). B1a und B1bZellen geben verschieden Antworten auf Pathogene. So sind B1b-Zellen z.B. an der
adaptiven Immunantwort gegen Streptococcus pneumoniae (Haas et al, 2005) beteiligt. Auf
B1a-Zellen wird im Weiteren speziell eingegangen. Die Zellzahl der B1b-Zellen (CD5-) ist
sehr gering, während die B1a-Zellen ca. 30% aller Lymphozyten in der Bauchhöhle
ausmachen. B1a Zellen zeigen prinzipiell einen niedrigeren Calcium Fluss und proliferieren
auch schwächer nach BZR Stimulation als B2-Zellen (Bikah et al, 1996). Man nimmt an,
dass die niedrigere Proliferation an der Expression des inhibitorischen Moleküls CD5 liegt,
da bei B1a-Zellen aus der CD5 -/- Maus eine erhöhte Proliferation beobachtet wurde (Bikah
et al, 1996). B1a-Zellen zeigen eine konstitutive Expression des Transkriptionsfaktors
STAT3, sind nicht zirkulierend, „in vitro“ langlebig (Hayakawa & Hardy, 1988) und haben die
Kapazität zur Selbsterneuerung (Berland & Wortis, 2002). Sie tragen zur Thymusunabhängigen Immunantwort bei und produzieren natürliches IgM. Diese natürlichen
Antikörper haben eine breite Spezifität, sind schwach-affin für Autoantigene und bilden die
erste Verteidigungslinie auch gegen Pathoge aus dem Darm (Bos et al, 1988; Haury et al,
1997; Su et al, 1991). Da die von den B1-Zellen stammenden IgM Antikörper oft schwach
autoreaktiv sind, werden B1-Zellen auch mit Autoimmunkrankheiten in Verbindung gebracht
(Boes, 2000). Außerdem zeigen diese natürlichen Antikörper nur ein eingeschränktes
Repertoire. Es gibt keine Somatische Hypermutation in B1a-Zellen und nur wenige NInsertionen in den rearrangierten Antikörper-Genen, die für Antikörper kodieren (Kantor,
1997).
Die Herkunft der B1-Zellen ist nach wie vor umstritten. Früher wurde postuliert, das B1 BZellen ausschließlich in der fötalen Leber entstehen (Hardy et al, 1991) (Kantor et al, 1993).
Neue Experimente haben aber gezeigt, dass B1-Zellen auch aus adulten lymphatischen
Vorläuferzellen im Knochenmark entstehen können. In einem Experiment hat ein TI-2
Antigen eine Entwicklung von B1-Zellen induziert und die Spezifität des BZR gibt die
Differenzierung zu B1-Zellen oder B2-Zellen vor (Hayakava et al, 1986; Lamet et al, 1999).
-6-
Einleitung
Die Bedingungen in der fötalen Leber sind für die Entwicklung von B1-Zellen idealer als die
im
Knochenmark.
So
wird
in
der
fötalen
B-Zellentwicklung
keine
terminale
Desoxyribonukleotransferase (TdT) exprimiert, die in adulten Zellen die N- Insertionen in die
Antikörpergene einfügt (Gregoire et al, 1979; Li et al, 1993). Außerdem werden bei den B1Zellen die proximalen V- Gene bevorzugt (Malynn et al, 1990).
1.7 Die Signalleitung des BZR
B-Zellen sind für die humorale Immunantwort verantwortlich. In dem sie ein Antigen mittels
ihres spezifischen BZR binden, startet eine zellinterne Signalkaskade mit der die B-Zelle auf
das Antigen reagiert.
Diese Signalkaskade nimmt ihren Anfang am BZR. Der BZR ist ein membranständiges
Immunglobulinmolekül, an dem ein kovalent gebundenes Heterodimer bestehend aus Igα
und Igβ bindet (Hombach et al, 2000). Ohne dieses Igα und Igβ Heterodimer findet kein
Transport des BZR an die Oberfläche der Zelle statt. Dieses Heterodimer ist über eine
extrazelluläre Disulfidbrücke untereinander verbunden. Der zytoplasmatische Teil von IgM
oder IgD BZRs besteht nur aus drei Aminosäuren und ist zu kurz, um für die Signalleitung
verantwortlich zu sein. Die Aufgabe des BZRs besteht allein in der Bindung von Antigen. Igα
und Igβ weisen größere intrazelluläre Domänen auf. In diesem Teil der Moleküle befinden
sich auch ITAM- (Immunreceptor Tyrosin- based Activation Motif) Sequenzen. Das
Heterodimer ist demnach für die Weiterleitung des Signals ins Zellinnere zuständig. Sind die
zellinternen Domänen von Igα/Igβ deletiert, ist eine Weiterleitung des Signals nicht mehr
möglich (Torres et al., 1996; Reichlin et al, 2001).
Multivalentes Antigen kann die BZRs auf der Zelloberfläche vernetzen. Somit werden
mehrere BZRs und die daran gebundenen Heterodimere Igα/Igβ in enge räumliche Nähe
gebracht, was zur Aktivierung von Protein Tyrosin Kinasen führt. Es wirken drei Familien von
Protein Tyrosin Kinasen (PTK) mit, nämlich die Src- Familie (Lyn, Fyn, Blk), die Syk- Kinasen
und die Tec- Kinasen (z.B. Btk, Brutons Tyrosin Kinase). Die PTKs sind für die
Phosphorylierung von Adaptermolekülen wie z.B. BLNK und NTAL zuständig, was wiederum
zur
Rekrutierung
und
Koordination
von
Effektorkinasen
führt.
Dieser
große
Multiproteinkomplex kann verschiedene Signalkaskaden anstoßen. So kann z.B. der
Ras/Raf-, oder Rho- oder PKC- Signalweg eingeleitet werden. Diese Kaskaden enden in der
Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie z.B. ELK1, Jun, NFAT oder NFκB. Auch die
Calcium Mobilisierung wird über BZR Signale gesteuert und hier als Beispiel einer
Signalkaskade genauer erläutert.
-7-
Einleitung
1.7.1 Die Calciumsignalkaskade in B Lymphozyten
Am Anfang steht die Bindung von Antigen durch den BZR. Dadurch werden wie oben
erwähnt Src-Kinasen aktiviert und phosphorylieren Tyrosine im intrazellulären Teil von
Igα/Igβ. Lyn und Fyn können nun mit ihrer SH2 Domäne an diese ITAM- Motive binden
(Pleiman et al, 1994). Sie sind jetzt in der Lage, weitere Kinasen und auch Co-Rezeptoren
auf der Zelloberfläche zu phosphorylieren. Syk bindet ebenfalls über seine zwei SH2Domänen an diese ITAM- Motive und verstärkt die Kinaseaktivität (Kimura et al,1996;
Kurosaki et al, 1995) Syk kann auch schon gebunden an den BZR vorliegen und sich nach
BZR Aktivierung selbst phosphorylieren und selbstständig eine Signalkaskade einleiten (Rolli
et al, 2002). Syk bewerkstelligt dies durch die Phosphorylierung von BLNK, Btk und
Phospholipase Cγ2 (PLCγ2). Btk kann PLCγ2 phosphorylieren, was zu deren vollständiger
Aktivität führt (Rodriguez et al, 2001). BLNK funktioniert hierbei als Adaptermolekül, das
sowohl Btk als auch PLCγ2 bindet. (Wienands et al, 1998)
PLCγ2 spaltet nun Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2), das in der Zellmembran
vorliegt, in Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG). IP3 gelangt nun in das
Zytoplasma, während DAG an der Membran verbleibt. IP3 bindet an IP3 Rezeptoren auf
dem Calcium Speicherorgan endoplasmatisches Retikulum (ER). Diese Rezeptorbindung hat
einen Calcium-Ausstrom ins Zytoplasma der Zelle zur Folge (Berridge et al, 1993). Dieser
Ausstrom ist das Signal, den Einstrom von Calcium in die Zelle von außen durch Öffnung der
Calciumkanäle zu ermöglichen. Dieser Einstrom wird das Membranmolekül STIM1, das auf
auf der Membran des ER sitzt und entweder direkt mit dem Calciumkanal Orai1 oder über
ein zweites STIM1 Molekül mit Orai1 in Kontakt tritt, gesteuert (Soboloff et al, 2006). Ist die
maximale
Calciumkonzentration
erreicht,
wird
das
Calcium
über
Pumpen
aktiv
zurücktransportiert (Chen et al, 2004). Das freie Calcium im Zytoplasma bindet an die
Calcium-abhängige Kinase Calmodulin oder an die Phosphatase Calcineurin, die dann
Transkriptionsfaktoren aktivieren können.
Alle Signalleitungskaskaden, die über den BZR laufen sind stark reguliert. Auch
Oberflächenmoleküle wie CD22 spielen hierbei eine Rolle. CD22 wirkt negativ auf das
Calciumsignal. In CD22 defizienten Mäusen konnte ein erhöhter Calciumfluss gemessen
werden, da dieser inhibitorische Einfluss fehlte (Nitschke et al, 1997). Dieser Effekt konnte
jedoch nur bei den B2 B-Zellen beobachtet werden, nicht bei peritonealen B1a B-Zellen. So
war es vorstellbar, dass weitere unbekannte Oberflächenmoleküle in der BZR Signalleitung
eine Rolle spielen. Da CD22 zu den Siglecs gehört, wurde auch in dieser Familie nach
Molekülen, die in die Signalleitung eingreifen, gesucht.
-8-
Einleitung
1.8 Die Familie der Siglecs
Siglecs (sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin) reihen sich ein in die riesige Anzahl
der Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie. Eine große Untergruppe der Immunglobulin
Superfamilie sind die zuckerbindenden Lektine (Williams et al, 1988). Siglecs sind
Sialinsäure bindende Lectine (Typ1 Membranproteine), die hauptsächlich auf Zellen des
haemapoietischen Systems exprimiert sind (Powell et al, 1995; Angata & Brinkman, 2002;
Kelm et al, 1994; Varki & Angata, 2006). Die Ausnahme bildet hier Siglec-4 (MAG), das als
einziges Siglec auf Zellen des Nervensystems zu finden ist (Kelm et al, 1994).
V
V
V
V
V
V
V
V
+-
+-
3 ITIM
ITIM
distales Y
distales Y
Sialoadhesin
Siglec-1
CD22
Siglec-2
mCD33
Siglec-3
MAG
Siglec-4
Makrophagen
B-Zellen
unreife myeloid Glia Zellen
Neutrophile
α2,3 Sia
α2,6 Sia
α2,6 SiaGalNAc
mSiglec-H
myeloide
Vorläufer
α2,3 Sia
?
mSiglec-F
Eosinophile
α2,3 Sia
ITIM
distales Y
mSiglec-E
Neutrophile
Makrophagen
DC (Untergr.)
NK (Untergr.)
α2,3 Sia,
α2,6 Sia,
α2,8 Sia
ITIM
distales Y
mSiglec-G
?
α2,3 Sia,
α2,6 Sia,
?
Abbildung 2: Übersicht über die Siglec Familie in der Maus
Die Kreise stellen die einzelnen Immunglobulin-Domänen dar. Der Doppelstrich beschreibt die Zellmembran.
Name, Zellarten auf denen die Siglecs zu finden sind und Sialinsäure- Bindespezifität sind (unten) aufgeführt.
Der extrazelluläre Teil der Siglecs ist aus einer N-terminalen V-set Ig Domäne, die für die
Zuckerbindung verantwortlich ist, und einer variablen Anzahl an C2-set Domänen aufgebaut.
Daran folgt eine Transmenbrandomäne und die intrazellulären Domäne, die jeweils
unterschiedlich lang ausfällt oder sogar ganz fehlt, wie bei Siglec-1, -14 und -15; und
verschiedene Signalmotive aufweist. Bis jetzt sind 15 verschiedene Siglecs bekannt, die
allerdings nicht bei allen Spezies vorhanden sind (Crocker et al, 2007). So haben Menschen
13 Siglecs, die Maus weist dagegen nur 9 Siglecs auf. Die Familie der Siglecs kann grob in
-9-
Einleitung
zwei Gruppen aufgeteilt werden. Die erste Gruppe zeigt untereinander nur eine Homologie
von ca. 30%, dafür besitzen alle Mitglieder klare Orthologe in den verschiedenen Spezies.
Zu dieser Gruppe gehören Siglec-1, CD22, MAG und Sigelc-15. In der zweiten Gruppe, der
CD33-verwandten Siglecs, sind die Familienmitglieder untereinander eng verwandt. Sie
zeigen eine Sequenzhomologie von bis zu 99% innerhalb der Familie. Gleichzeitig
entwickelte die CD33-verwandte Familie jedoch eine große Diversität zwischen den Arten
während der Evolution, was zu einem Verlust von direkten Orthologen zwischen den Spezies
führte (Angata, 2006). Ausgehend von CD33 entwickelten sich im Menschen neun und in der
Maus
fünf
CD33-verwandte
Siglecs
durch
Genduplikation,
Exonverschiebung
und
Exonverlust (Varki & Angata, 2006). Manche Siglecs sind nur auf eine Zellpopulation
beschränkt exprimiert, wie Siglec-1, das sogar als Marker für eine bestimmte Klasse von
Makrophagen, den metallophilen Makrophagen, dient (Oetke et al, 2006). Andere sind auf
mehreren Zelltypen anzutreffen, wie z.B. Siglec-E, das in der Maus auf Neutrophilen,
Monozyten und dendritischen Zellen vorkommt.
Siglecs binden Sialinsäuren auf der eigenen Zelloberfläche (in cis) und Sialinsäuren, die sich
auf anderen Zelloberflächen befinden (in trans) (Razi und Varki, 1998). Es gibt über 50
verschieden Sialinsäureformen, drei davon kommen jedoch am häufigsten vor: NAcetylneuraminsäure
(Neu5Ac),
N-Glycolylneuraminsäure
(Neu5Gc)
und
5,(7)9-N,O-
Diacetylneuraminsäure (Neu5,(7)9Ac2). Die Sialinsäuren sind an zugänglichen, nicht
reduzierenden Enden von Oligosacchariden über verschiedene Verknüpfungen (z.B. α2-3,
α2-6 oder α2-8) gebunden (Crocker et al, 2007). Die Verknüpfungen werden von einigen
Siglecs (z.B. mCD22) spezifisch erkannt, während andere Siglecs wie hSiglec-10 mehrere
Verknüpfungen bei ihrer Bindekapazität tolerieren (Crocker et al, 2007; Blixt et al, 2003).
Die Funktionen der CD33-verwandten Siglecs sind breit gefächert. Sie reichen von der
Inhibition der Proliferation (Vitale et al, 1999; Balaian et al, 2003) über die Einleitung der
Apoptose (Nutku et al, 2003; von Gunthen et al, 2005) und die Inhibition der Zellaktivierung
(Avril et al, 2004 und 2005; Ikehara et al, 2004) bis zur Rolle in der Zytokinproduktion. Die
Funktion der meisten CD33 verwandten Siglecs ist noch unbekannt, wie z.B. bei Siglec-G.
Da fast alle Siglecs jedoch ITIM Motive besitzen, kann grundsätzlich von einer eher
inhibitorischen Funktion ausgegangen werden.
- 10 -
Einleitung
1.8.1 CD22
CD22 gehört ebenfalls zu der Familie der Siglecs. CD22 besteht aus sieben Immunglobulinähnlichen Domänen und besitzt drei ITIM Motive. Mit deiner V-Set Domäne bindet CD22 nur
Sialinsäure, die eine α2,6 Verknüpfung aufweist. CD22 kann Sialinsäure in cis und trans
binden und wirkt daher auch als Adhäsionsmolekül. Ist CD22 an zelleigene Sialinsäure
gebunden so ist es „maskiert“. In diesem Fall sind Zell-Zell-Kontakte nicht möglich. In
bestimmten Entwicklungphasen regulieren B-Zellen Sialinsäure auf ihrer Oberfläche jedoch
herab, so dass CD22 z.B. Sialinsäure auf sinusiden Epithelzellen des Knochenmarks binden
kann. Somit kann ein „Homing“ in das Knochenmark stattfinden (Nitschke et al, 1999). Es
wird auch eine Rolle für CD22 in trans-Interaktinen zu anderen Zellen diskutiert, wobei eine
fehlende Hemmung durch CD22 eine Aktivierung der B-Zelle erleichtert (Lanoue et al, 2002).
CD22 spielt eine wichtige Rolle in der Calciumsignalleitung. Nach Kreuzvernetzung des BZR
wird es schnell phophoryliert. Die phophrylierten ITIM Motive von CD22 rekrutieren SHP-1
(Doody et al, 1995). SHP-1 ist ein wichtiger Inhibitor des Calciumsignals. Außerdem aktiviert
CD22 die Calciumpumpe PMCA4 und sorgt damit für einen schnellen Ausstrom des
intrazellulären Calciums (Chen et al, 2004).
Die CD22 defiziente Maus wurde von mehreren Arbeitsgruppen hergestellt (Nitschke et al,
1997; O´Keefe et al, 1996; Otipoby et al, 1996; Sato et al, 1996). B-Zellen dieser Mäuse
zeigen ein erhöhtes Calciumsignal nach BZR Stimulation. Die CD22-/- B-Zellen zeigen auch
eine vermehrte Apoptose nach BZR Stimulation. Die CD22 defizienten Mäuse haben
außerdem eine verringerte Anzahl von T2 B-Zellen und eine erhöhte Anzahl von reifen BZellen. Das „homing“ von
CD22-/- B-Zellen“ ins Knochenmark war jedoch nicht mehr
möglich (Nitschke et al, 1999), d.h. es befanden sich keine rezirkulierenden B-Zellen im
Knochenmark. Auch die Anzahl der Marginalzonen B-Zellen in der CD22-/-Maus war stark
verringert. Deshalb zeigen diese Mäuse auch eine erniedrigte IgM Antwort auf TI Typ2
Antigene (Samardzic et al, 2002; Lopes-Carvalho et al, 2005). Insgesamt zeigen die CD22
defizienten Mäuse einen B-Zell spezifischen Phänotyp.
1.8.2 Murines Siglec-G
Siglec-G gehört zur Gruppe der CD33 verwandten Siglecs und wurde in Paul Crockers Labor
das erste Mal kloniert und sollte in dieser Arbeit charakterisiert werden. Siglec-G besitzt fünf
Immunglobulindomänen und hat mit humanem Siglec-10 ein klares Ortholog, gemessen an
Sequenzhomologie, Genlocus und strukturellem Aufbau (Angata et al, 2001). Im
- 11 -
Einleitung
intrazellulären Teil von Siglec-G sind drei Signalleitungsmotive zu finden (Crocker et al,
2007). Es konnte ein Grb-2- Bindungsmotiv, ein klassisches ITIM- Motiv und ein ITIMähnliches Motiv bestimmt werden. Siglec-G scheint laut Chip Hybridisierungsexperimenten
eine B- Zell restringierte Expression zu zeigen (Su et al, 2004). Das gilt für das humane
Siglec-10 nur bedingt, da es außer auf B-Zellen auch noch auf Monozyten und Eosinophilen
exprimiert ist (Li et al, 2001; Munday et al, 2001; Whitney et al, 2001). Eine Spezifität in der
Sialinsäurebindung konnte für Siglec-G noch nicht nachgewiesen werden. hSiglec-10 weist
eine Vorliebe für α2,3 und α2,6 Verknüpfungen auf, wobei hSiglec-10 jedoch keine deutliche
Spezifität, sondern eine breite Akzeptanz vieler Sialinsäuren zeigt (Blixt et al, 2003). Über die
biologische Funktion von Siglec-G war zu Beginn dieser Arbeit noch nichts bekannt.
1.9 Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit war, die Funktion des Siglec-G Proteins aufzuklären. Über Siglec-G war
noch nicht viel bekannt, außer dass es wahrscheinlich auf B-Zellen exprimiert wird und ITIMMotive besitzt (Su et al, 2004).
Zur Erforschung der Funktion sollte eine Siglec-G defiziente Mauslinie hergestellt werden.
Anhand des Phänotyps dieser Mäuse erhoffte man sich einen Aufschluss über eine mögliche
Aufgabe von Siglec-G in der Signalleitung und der B-Zell Biologie. Der Targetvektor und
erste transfizierte embryonale Stammzellen waren in der Arbeitsgruppe schon vorhanden
und mussten mit dem Start dieser Arbeit noch auf die richtige homologe Rekombination des
Siglec-G Gens hin überprüft werden. Dann sollten die Injektion in Blastozysten von
Spendermäusen und der Transfer dieser manipulierten Blastozysten in scheinschwangere
Ammenmäuse stattfinden.
Nach der erfolgreichen Geburt von Chimaeren sollten diese weiterverpaart werden um eine
Siglec-G-defiziente Mauslinie zu erhalten. Der Phänotyp dieser defizienten Mäuse sollte
dann Aufschluss über die Funktion von Siglec-G geben. Um diesen Phänotyp zu
charakterisieren, waren Standardmethoden geplant, mit denen die B-Zellentwicklung, die
verschiedenen B- Zellpopulationen und deren Funktion untersucht werden sollten. Außerdem
sollte die Expression von Siglec-G in verschiedenen Lymphozytenpopulationen untersucht
werden. Nach der Entwicklung eines anti-Siglec-G Antikörpers sollte dann auch die Siglec-G
Expression auf Proteinebene überprüft werden.
- 12 -
Material
2 Material
2.1 Tiere
Verwendete Mausstämme:
BALB/c
BALB/c CD45.1
C57Bl/6
RAG1 -/Siglec-G defizient
Das Alter der Versuchstiere variierte abhängig von der Art der Versuche von Tag 18
embryonal bis 12 Monate. Die meisten Versuche wurden mit Tieren durchgeführt, die
zwischen 8 und 12 Wochen alt waren. Die Tiere wurden pathogenarm im Tierhaus gehalten.
Bei Versuchen mit transgenen Tieren und wildtypischen Tieren wurden Geschwistertiere
oder Tiere gleichen Alters mit gleichem genetischen Hintergrund verwendet.
2.2 Antibiotika
Neomyin (G418)
Gibco
Penicillin/ Streptomycin
Gibco
2.3 Antikörper
2.3.1 FACS Antikörper
B220
FITC
1:100
eBioscience
PE
1:50
BD Pharmingen
Cycrome
1:200
BD Pharmingen
APC
1.50
BD Pharmingen
BP-1
PE
1:50
BD Pharmingen
CD19
FITC
1:50
eigenes Hybridom
Bio
1:50
eigenes Hybridom
CD21
FITC
1:50
eigenes Hybridom
CD23
PE
1:200
eBiosciences
- 13 -
Material
CD25
Bio
1:500
BD Pharmingen
CD4
PE
1:300
BD Pharmingen
CD43
PE
1:250
BD Pharmingen
CD45.1
FITC
1:1000
eBiosciences
Bio
1:100
eBiosciences
PE
1:300
eBiosciences
CD45.2
Bio
1:200
eBiosciences
CD5
Bio
1:300
eBiosciences
PE
1:80 (für B1/B1a Zellen)
eBiossciences
CD8a
FITC
1:200
BD Pharmingen
cKit
PE
1:250
eBiosciences
GR-1
PE
1:100
BD Pharmingen
FITC
1:50
BD Pharmingen
FITC
1:100
eigenes Hybridom
Bio
1:200
eigenes Hybridom
FITC
1:100
eigenes Hybridom
Bio
1:50
eigenes Hybridom
IgM (Fab2)
PE
1:40
Caltag Laboratories
Mac-1
FITC
1:50
eBiosciences
Strept- Avidin Cycrome
1:300
BD Pharmingen
TCRβ
Bio
1.100
eBiosciences
Thy-1
Bio
1:500
eBisciences
IAb (MHC Kl.II)
IgD
IgM (29.11)
2.3.2 Stimulierende Antikörper
Ziege anti Maus IgM (Fab)2 Jackson ImmunoResearch
B7.6
eigenes Hybridom
2.3.3 Antikörper zur B Zell Aufreinigung über Komplementlyse
αCD4:
RL174.2 (IgM)
eigener Hybridomüberstand
αCD8:
3168.1 (IgM)
eigener Hybridomüberstand
αThy-1:
AT83A (IgM)
eigener Hybridomüberstand
- 14 -
Material
2.3.4 Western Antikörper
Anti Siglec-G
Pineda, durch Immunisierung von
Kanninchen/Meerschweinchen gewonnen
Anti Actin (Mouse monoklonal)
Dianova
Ziege anti Kaninchen-HRP
Santa- Cruz Biotechnology
Ziege anti Meerschweinchen-HRP Jackson ImmunoResearch
Ziege anti Maus-HRP
Jackson ImmunoResearch
2.3.5 Antikörper für ELISA und ELISpot
Ziege anti IgM
Ziege anti IgGgesamt
Ziege anti IgG1
Ziege anti IgG2a
Ziege anti IgG2b
Ziege anti IgG3
Ziege anti IgA
Unkonjugiert und jeweils mit alkalischer Phosphatase konjugiert.
Diese Antikörper stammten von der Firma Southern Biotech.
2.4 Primer
10 pgk-prom(1)
AAG CGC ATG CTC CAG ACT GC
Actin fwd
CCA GGT CAT CAC TAT TGG CAA GGA
Actin rev
GAG CAG TAA TCT CCT TCT GCA TCC
SigG ex 1bS
CTG CTG TCC TTC CTG TTG GA
SigG ex 1S
CCC TAA GGC CAC GAT GTC AC
SigG ex 2S
GCC TCA AGG TCA GAT GGA GA
SigG ex 3AS
AGG CTC CAG GAC CTC AGG AA
SigG ex 4AS
GGC CTT GCT GAA CTT CCA GA
SigG ex 4S
GGG ACT CTG GAC ACT ACA CT
SigG ex 6AS
GAG ATGGCA TTC CTG AGG AT
SigG in 2AS
GCT CCT CCC AGA AGT AGT CT
Sonde 3 (Siglec-G)
GTG TGT TCG TGC ATA TAA GTG TAG CTG CCC T
Sonde 5 (Siglec-G)
TCG AGG TAG TGG ATA GAT ACG ATC AGT GTA CAT TG
Alle Primer wurden bei MWG bestellt.
- 15 -
Material
2.5 Puffer und Lösungen
Mausschwanz Lysispuffer A:
10mM
Tris –HCL pH 7,8- 8,0
5mM
EDTA pH 8,0
0,2%
SDS
200mM
NaCl
Mausschwanz Lysispuffer B:
2,5ml
10%iges Sarcosyl (Sigma)
1ml
5M NaCl
2,5g
Chelex ( Biorad)
auffüllen auf 50ml mit Wasser.
Standardmedium für primäre Zellen:
500ml RPMI- Medium (Gibco)
5% FCS
3ml
Glutamin ( 200mM; Gibco)
5ml
Natrium Pyrovat (100mM; Gibco)
5ml
MEM nicht essentielle Aminosäuren (100x; Gibco)
5ml
Penicillin/Streptomycin ( 10000units/ml; Gibco)
0.5ml
β- Mercapthoethanol (50mM; Gibco)
Lösungen zur Erythrozytenlyse (Geys Lösung):
Lösung A
35g
NH4Cl
1,85g
KCl
1,5g
Na2HPo4 x 2H2O
0,12g
KH2PO4
5g
Glucose
(Oder: 5,5g
Glucosemonohydrat)
Auffüllen auf 1 Liter, sterilfiltrieren
- 16 -
Material
Lösung B
1.05g
MgCl2 x 6H2O
0.35g
MgSO4 x 7H2O
0.85g
CaCl2
(Oder: 1.1259g
CaCl2 x 2H2O)
Auffüllen auf 250ml, autoklavieren
Lösung C
5,625g
NaHCO3
Auffüllen auf 250ml, sterilfiltrieren
Geys Lösung:
350ml H2O
100ml Lsg. A
25ml
Lsg. B
25ml
lsg. C
Standardlysepuffer zur Herstellung von Zellysaten:
2,75ml
5M NaCl
5ml
1M Tris pH
10ml
Glycerin
0,1ml
0,5M EDTA pH8
10%
TritonX oder Brij
auffüllen auf 80ml mit Wasser
Dem Lysepuffer werden frisch folgende Proteinase- Inhibitoren zugegeben:
6ml Lysispuffer:
0,03ml
Leupeptin
Endkonz. 1μg/ml
0,06ml
PMFS
Endkonz. 1mM
0,06ml
Na-ortho-Vanadt
Endkonz. 1mM
0,006ml
Aprotinin
Endkonz. 5μg/ml
FACS Puffer:
1xPBS
0,1% BSA
0,5% NaAzid
- 17 -
Material
Diethanolamin- Puffer:
0,1g
MgCl2 x H2O
0,2g
NaAzid
97ml
Diethanolamin (falls fest im 37C Wasserbad erwärmen)
pH mit 10M HCL auf pH 9,8
auffüllen auf 1Liter
ELISA Blockierungspuffer:
1x PBS
1% BSA
0,05% NaAzid
ELISA Verdünnungspuffer:
1x PBS
0,1% BSA
0,05% NaAzid
AMP (2amino2methyl1propanol)-Lösung:
95,8ml
AMP (2amino2methyl1propanol)
150mg
MgCl2 x 6H2O
0,1ml
TritonX
pH 10,25 mit HCL
auffüllen auf 1Liter
AMP-BCIP (5bromo4chloro3indoylphophat dinatrium Salz)
1mg/ml BCIP in AMP- Lösung
Medium für ES- Zellen:
DMEM + Glutamax (Gibco) 500ml
Pen/Strep
5ml
Glutamin
5ml
β-Mercaptoethanol
1ml
alle drei Zutaten sterilfiltrieren
15% FCS
LIF (ESGROW)
0,06ml (1000u/ml)
(10% FCS
für EMFI- Medium)
FCS muss vorher Hitze inaktiviert werden: 30min bei 56°C erhitzen.
- 18 -
Material
DEPC-Wasser:
DEPC
1ml
Wasser
1000ml
Über Nacht rühren, am nächsten Tag autoklavieren um das DEPC zu inaktivieren. Das
Wasser ist jetzt RNase frei.
Krebs-Ringer-Lösung:
10mM
HEPES (pH 7.0)
140mM
NaCl
4mM
KCl
1mM
MgCl2
1mM
CaCl2
10mM
Glucose
2.6 Chemikalien
Hier werden Chemikalien, die allgemein im Labor vorrätig sind, nicht erwähnt. Diese
Chemikalien wurden bei Firma Roth oder Sigma bestellt.
[H3] Thymindin
MP Biomedicals
[P32] dCTP
Hartmann
Alu-Gel Suspension
Serva
AMP (2amino2phenyl1propanol)
Roth
Baby Rabbit Complement
Cedarlane
BCIP
Roth
BrdU
Roche
Brij96 (Polyoxyethylen)
Roth
Chelex
BioRad
DEPC
Roth
Diethanolamin
Roth
DMSO
Roth
ECL Western Blotting Detektions Reagenz Amersham
ESGRO (LIF- Leukemia Inhition Factor))
Chemicon
Hybond ECL- Membran
Amersham
INDO-1-AM
Invitrogen
Low melting Agarose (seaplaque)
Biozym
LPS (E.coli 005: B5)
Calbiochem
- 19 -
Material
Magermilchpulver
Roth
Mitomycin
Invitrogen
NP40
Ambion
NP-OVA
Biosearch Technologies
Photobiotin
Sigma
Qickhyb Hybridisation Solution
Stratagen
seeDNA
Amersham
TNP-ficoll
Biosearch Technologies
TNP- OVA
Biosearch Technologies
TritonX
Roth
Tween20
Roth
α1,3 Dextran
Sigma
β- Mercaptho- ethanol
Invitrogen
2.7 Enzyme
PstI
Fermantas
Supertaq
HAT Biotechnology
Proteinase K
Roche
DNase
Roche
RNase
Fermentas
EcoRI
Fermentas
BamHI
Fermentas
2.8 Verwendete Kits
BrdU Flow Kit
BD Pharmingen
Nucleotide removal Kit
Quiagen
TRIZOL
Invitrogen
seeDNA
Amersham
Random Primers DNA labelling system
Invitrogen
SuperScript II Revere Transcriptase
Invitrogen
ECL Western Detection Kit
Amersham
Gel elution Kit, Quiaquick
Quiagen
- 20 -
Methoden
3 Methoden
3.1 Zellbiologische und immunologische Methoden
3.1.1 Organentnahme und Aufarbeitung
Milz, Oberschenkelknochen, Thymus und Lymphknoten wurden mit CO2 getöteten Mäusen
entnommen und auf Eis gelagert. Durch eine Peritoneallavage mit 5ml Medium werden
peritoneale Zellen aus der Bauchhöhle der Mäuse ausgespült. Peritoneale Zellen werden
ohne weitere Behandlung in Exprimenten verwendet.
Blut von getöteten Mäusen wurde mittels einer Spritze aus dem Herz entnommen oder bei
lebenden Mäusen durch Anritzen der Schwanzvene mit einem Skalpell.
Milz,
Thymus
und
Lymphknoten
wurden
durch
ein
Zellsieb
gedrückt,
um
Einzelzellsuspensionen zu erhalten. Suspensierte Thymus- und Lymphknotenzellen wurden
ohne weitere Behandlung in Experimenten verwendet.
Das Knochenmark wurde mit Hilfe von 1ml Medium in einer Spritze mit 28G Kanüle aus dem
Knochen ausgespült und als Einzelzellsuspension in Medium aufgenommen.
Um die Erythrozyten aus dem Blut und den Suspensionen aus Milzzellen und
Knochenmarkszellen zu entfernen, wurden die Zellen ein oder zweimal im Fall von Blut mit
Geys Solution für fünf Minuten inkubiert und danach zweimal mit Medium gewaschen.
3.1.2 T Zell Depletion durch Komplement- Lyse
Aufgearbeitete Milzzellen wurden in 1ml RPMI-Medium resuspendiert und mit 1ml anti-CD4
(RL174.2) und 1ml anti-CD8 (3168.1) gemischt und 30min auf Eis inkubiert. Die Zellen
werden 5min bei 1300rpm und 4C zentrifugiert und mit Medium gewaschen. Danach wurden
die Zellen in 3ml Medium aufgenommen, mit 0,33ml Baby Rabbit Komplement versetzt (eine
Flasche Lyophylisat wird in 1ml eiskaltem Wasser gelöst) und 45min bei 37°C sanft
schüttelnd inkubiert. Zum Abschluss wurden die Zellen nochmals gewaschen, in Medium
aufgenommen und gezählt. Die Reinheit wird mittels FACS untersucht. Die Zellen wurden
mit anti-B220 und anti-Thy-1 gefärbt um das Fehlen von T-Zellen und die Reinheit der BZellen zubestätigen.
- 21 -
Methoden
3.1.3 Fluorescence activated cell sorting (FACS)
Ca. 1,5x106 Zellen wurden in einem FACS Röhrchen abzentrifugiert, mit Antikörpern in der
jeweils richtigen Verdünnung (siehe Materialteil) in 25μl FACS- Puffer resuspendiert und für
30min auf Eis im Dunkeln inkubiert. Die Antikörper sind mit fluoreszierenden Farbstoffen
gekoppelt wie z.B. FITC und PE. Antikörper können auch biotinyliert sein. Außerdem wurde
jeder ersten Färbelösung der Antikörper 2.4G2 zugegeben, um die FcRezeptoren auf B
Zellen zu blockieren. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und in FACS- Puffer
aufgenommen. Wurde in dem ersten Färbeschritt ein biotinylierter Antikörper verwendet,
folgt ein zweiter Färbeschritt mit einem sekundären Strept-Avidin Antikörper, der meist mit
Cychrome gekoppelt war.
Die Zellen wurden dann an einem FACS Calibur vermessen.
3.1.4 Calcium Messung
Methode1:
INDO-1-AM- Farbstoff (50μg), gelöst in 25μl DMSO, wurde mit 25μl Pluronic F127 und 113μl
FCS versetzt und 10min bei RT inkubiert. 2,5x107 Zellen in 5ml RPMI 1% FCS Medium
wurden mit 75μl dieses Gemisches versetzt und 45min bei 37°C sanft schüttelnd im Dunkeln
inkubiert. Danach wurden die INDO-1 beladenen Milzzellen und peritoneale Zellen mit antiB220 und anti-CD5 Antikörpern in PBS oder Medium angefärbt um einzelne Zellpopulationen
unterscheiden zu können. Die behandelten Zellen wurden in 2.5ml Medium aufgenommen
und nach einer Verdünnung in Medium erfolgt die Aufnahme der Basislinie. Nach einer
Stimulation der B Zell- Rezeptors durch Antikörperzugabe wurde die Calcium Freisetzung in
der Zelle an einem LSR II oder FACSvantage mit UV Laser gemessen.
Methode2:
INDO-1-AM- Farbstoff (50μg), gelöst in 480μl DMSO, wurde mit 37μl Pluronic F127 versetzt
und 10min bei RT inkubiert. 5x106 Zellen wurden geerntet und in 700μl RMPI Medium mit 5%
FCS aufgenommen. Zur Probe wurden dann 7μl der Indo-Mixtur gegeben und 25min bei
30°C inkubiert.
Nach Zugabe von 700μl RMPI Medium mit 5% FCS folgte ein weiterer Inkubationsschritt von
10min bei 37°C.
Danach wurden die Zellen 2mal mit Krebs-Ringer-Lösung gewaschen und zum Schluss in
500μl Krebs-Ringer aufgenommen. Die Messung der Calcium Freisetzung ebenfalls erfolgte
an einem LSR II.
- 22 -
Methoden
3.1.5 ELISA
Seren wurden aus Mäuseblut gewonnen, indem das Blut bei 37°C für zwei Stunden oder bei
4°C über Nacht inkubiert wurde und nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei maximaler
Geschwindigkeit das Serum in der oberen Phase abgenommen. Serum kann kurzzeitig bei
4°C und langfristig bei -20°C aufbewahrt werden.
3.1.5.1 Gesamt Immunglobulin Sandwich- ELISA
Polysorb- ELISA-Platten wurden mit 1μg/ml Ziege anti-Maus IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3,
IgA beschichtet, durch Inkubation bei 37°C für zwei Stunden oder bei 4°C über Nacht. In jede
Vertiefung wurde 50μl der Antiköper/ PBS- Lösung gegeben.
Die beschichteten Platten wurden mit 200μl 1% BSA in PBS + 0,05% Azid pro Vertiefung
zwei Stunden bei 37°C blockiert. Nun wurden die Platten dreimal mit PBS gewaschen. Es
folgte die Inkubation mit den zu testenden Seren und den dazugehörigen Standards. Die
Seren wurden 1:200 vorverdünnt und dann in einer 1:3 seriellen Verdünnungsreihe weiter
verdünnt und in 50μl Portionen pro Vertiefung auf die Platte gegeben. Antikörperproteine der
Klassen IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA dienten in einer Startkonzentration von
0,1mg/ml als Standards. Auch sie wurden in einer 1:3 seriellen Verdünnung weiter verdünnt
und ebenfalls in 50μl pro Vertiefung auf die Platte gegeben. Daraufhin folgte eine weitere
Inkubationsphase (37°C für zwei Stunden oder bei 4°C über Nacht) und dreimaliges
Waschen mit PBS. Im nächsten Schritt wurden die Platten mit Ziege anti-Maus Antikörpern
des passenden Isotyps für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die Antikörper sind mit einer
alkalischen Phosphatase gekoppelt, die das Enzym für das nachfolgende Substrat darstellte.
Auch diese Antikörper wurden in einer Konzentration von 1μg/ml in 50μl pro Vertiefung
eingesetzt. Nach einem weiteren Waschschritt wurden 100μl des Substrats pro Vertiefung
auf die Platten pipetiert. Das Substrat besteht aus 1mg/ml p-Nitrophenylphosphat in
Dietholaminpuffer bei einem pH von 9,8. Die Platten wurden im Dunkeln bei RT inkubiert bis
der Substratpuffer in der obersten Reihe der Vertiefungen eine OD von ca. 3 aufweist und
dann in einem Elisa-Reader bei 405 nm gemessen.
3.1.5.2 Antigen spezifischer Sandwich- ELISA
Bei Antigen spezifischen Elisas wurden die Platten mit dem entsprechenden Antigen im
ersten Schritt beschichtet. Nach Immunisierungen wurden die Platten mit 10mg/ml Ficoll
oder TNP-BSA oder Dextran beschichtet.
Bei Elisas zur Detektion von doppelsträngiger DNA sind zwei Beschichtungschritte
notwendig. In ersten Schritt wurden die Platten mit 10μg/ml Avidin in PBS beschichtet und
zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mir PBS folget der zweite
Schritt. 1μg/ml biotinylierte Plasmid DNA wurden in 50μl Portionen pro Vertiefung auf die
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Methoden
Platten gegeben und zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Alle weiteren Schritte entsprechen
denen im Protokoll aus 1.1.5.1.
Biotinylierte DNA kann folgendermaßen hergestellt werden. 50μg Plasmid und 50μg
Photobiotin (Sigma) werden 1:1 gemischt und 20min mit einer Lampe mit 200 Watt aus 10cm
Entfernung bestrahlt. Nach einer Ethanolfällung kann die biotynilierte DNA verwendet
werden.
3.1.6 ELISPOT
Mittels des ELISPOT-Assays kann die Zahl der Antikörper- sezenierenden Zellen ermittelt
werden. Spezielle Elispot-Platten (DUNN) wurden mit Ziege anti Maus IgM und/oder Ziege
anti Maus IgG beschichtet. 1ml von den Antikörpern (1μg/ml) in PBS wurde pro Vertiefung
auf die Platten gegeben und bei 37°C 2-4 Stunden inkubiert. Danach erfolgte ein dreimaliges
Waschen mit PBS. Mit 5% FCS in PBS (1ml pro Vertiefung) wurden die Platten blockiert. Es
folgte ein weiterer Waschschritt, bevor die steril aufbereiteten Zellen aus Knochenmark
und/oder Milz auf die Platten gegeben wurden. Die Zellen wurden in vier verschiedenen
Konzentrationen in Medium mit 5% FCS ohne sonstige Zusätze auf die Platte gegeben. Die
Anfangskonzentration bestand meist aus 3x106 Zellen/ml und darauf folgte dann eine 1:3
serielle Verdünnung. Die verschiedenen Konzentrationen können variieren, da bei der
Auswertung
der
Versuche
auf
Anzahl
antikörpersezernierender
Zellen
pro
1x106
hochgerechnet wird. Nachdem die Zellen auf den Platten sind, sollten diese nicht mehr
bewegt werden. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C in Brutschrank. Bei allen
bisherigen Schritten wurde steril gearbeitet. Am nächsten Tag wurden die Platten dreimal mit
PBS + 0,03% TWEEN und einmal mit PBS gewaschen um die Zellen zu entfernen. Die
sekundären Antikörper, die wie beim ELISA mit Alkalischer Phosphatase gekoppelt sind,
wurden in einer Konzentration von 1μg/ml auf die Platten gegeben und 3 Stunden bei 37°C
sanft schüttelnd auf einer Wippe inkubiert. Es folgte ein Waschschritt wie nach der
Inkubation der Zellen. Danach fand die Überschichtung der Platten mit Agarose, die das
Substrat enthält statt. Dafür wurde das Substrat BZIP in einer Konzentration von 1mg/ml in
der Amp- Lösung gelöst. Ein Teil 3% low melting Agarose (heiß) wurde mit fünf Teilen AmpBZIP- Lösung vermischt (auf 37°C vorgewärmt) und sofort je 1ml auf eine Vertiefung
gegeben. Die Platte darf nun nicht mehr bewegt werden! Die sezernierten Antikörper wurden
von Antikörpern gebunden, die mit alkalischer Phosphatase gekoppelt sind. Diese
Phosphatase verwandelt nun das Substrat in einen blauen Farbstoff. Überall wo eine
Antikörper- sezernierende Zelle Antikörper ausgeschieden hat, entsteht ein blauer Punkt.
Diese Punkte wurden ausgezählt und die Anzahl Antikörper-sezernierender Zellen pro eine
Million Zellen errechnet.
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Methoden
3.1.7 Proliferationstest
B2 Zellen (B220+, CD5-) aus der Milz und B1 Zellen (B220+, CD5+) aus der Bauchhöhle
wurden mit Hilfe eines MoFlo FACS Zellsorters sortiert. Die sortierten Zellen wurden in eine
98 well Platte in einer Konzentration von 5 x 105 Zellen/ml (200μl/Vertiefung) in 5% FCS
RPMI Medium ausgesät. Die Zellen wurden für 48 Stunden mit verschiedenen
Konzentrationen und Kombinationen von α IgM-Antikörper (10μg/Probe), α CD40-Antikörper
(0,3μg/Probe), LPS (10μg/ml) und/oder IL4 (5μg/ml) stimuliert. In den letzten acht Stunden
der Inkubation wurde (3H)Thymidin (1μCi/ Probe) zugegeben. Am Ende der Inkubationszeit
können die Platten eingefroren werden bis zur Messung in einem β-Counter, der die
Proliferation in „counts per minute“ nach Thymindin –Einbau angibt.
3.1.8 In Vitro Stimulation
Einzelzellsuspensionen von Milzzellen und aus dem Peritoneum wurden für 48 Stunden in
Kultur genommen. Die Konzentration der Zellen betrug 2 x 106/ml. Es gab jeweils eine
unstimulierte Probe als Kontrolle. Weitere Proben wurden mit α IgM (Fab)2 (25μg/ml) oder
LPS (10μg/ml) für 24 und/oder 48 Stunden stimuliert. Nach der Inkubationszeit wurden die
Zellen geerntet und mittel FACS Analyse (s.o.) auf Aktivierungsmarker, hier B7.2, CD69 und
MHC Kl.II, getestet.
3.2 Mausexperimente „in vivo“
3.2.1 Adoptiver Knochenmark-Transfer
Für Knochenmark- Transferexperimente wurden RAG1 -/- Mäuse (C57Bl/6 Hintergrund) mit
10Gy lethal bestrahlt. Danach wurde den Mäusen eine Ruhepause von einem Tag gegönnt.
Am Tag danach wurden 5 x 105 Knochenmarkszellen aus Siglec-G und die gleiche Zellzahl
aus Wildtyp Mäusen (BALB/c CD45.1), die alle mit αCD4 (RL174.2), αCD8 (3.168.1), αB220
(RA3-3A1) Antikörpern und Komplement behandelt wurden um B- und T-Zellen zu entfernen,
gemischt und über die Schwanzvene i.v. in die behandelten RAG1 -/- Mäuse injiziert. Um die
Wildtypzellen von den Siglec-G defizienten Zellen unterscheiden zu können, tragen die
Wildtyp
Mäuse
den
allotypischen
Marker
CD45.1.
Der
Wiederaufbau
des
Lymphozytenkompartments wurde mittels FACS Analyse des Blutes aus der Schwanzvene
der Empfängertiere verfolgt. Es wurde auf die Existenz von B- und T-Zellen untersucht mittel
Antikörpern gegen B220 und Thy-1. Nach sieben und zehn Wochen wurden die
- 25 -
Methoden
Empfängertiere getötet und die Organe der Tiere analysiert um den Beitrag der
verschiedenen Zellen am Aufbau des Immunsystems mittels des Markers CD45.1 zu
studieren.
3.2.2 BrdU Fütterungsexperimente
Das Trinkwasser der Mäuse wurde mit 1mg/ml BrdU und 10mg/ml Saccharose versetzt und
die Flaschen abgedunkelt, da BrdU lichtempfindlich ist. Alle zwei Tage wurde das Wasser
gewechselt. Die Mäuse wurden nach drei, fünf, acht und zwölf Tagen getötet und die
Organe, hier Knochenmark, Milz und peritoneale Lavage, aufgearbeitet (s.o.). In die DNA
eingebautes BrdU kann mittels einer intrazellulären FACS Anfärbung detektiert werden.
Hierzu wird der BrdU Flow Kit der Firma BD Pharmigen nach Herstellerangaben verwendet.
3.2.3 Immunisierungen
3.2.3.1 Thymus- abhängige Antigene
100μg NP-OVA wurden jeder Maus an Tag0 und Tag14 intraperitoneal (ip) injiziert. Die
Immunreaktion wird mittels Elisa verfolgt. Dazu müssen die Mäuse an Tag0, 7, 14 und 21
aus der Schwanzvene geblutet werden. Das Serum wird daraufhin auf anti-NP-Antikörper
vom Isotyp IgG1 und/oder IgG2a untersucht.
Herstellung des Immunisierungsreagenz:
200μl NP-OVA, 200μl PBS und 400μl AluGel-S werden gemischt und eine Stunde im
Dunkeln bei RT inkubiert. Nun werden 5ml PBS dazugegeben und das ganze bei 1500rpm
für 5min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 2ml PBS
aufgenommen. Je Maus werden 100μl (100μg NP-OVA) ip injiziert.
3.2.3.2 Thymus- unabhängige Antigene
Mäuse werden einmalig an Tag0 mit Dextran (100μg/100μl in PBS pro Maus) oder TNPFicoll (10μg/100μl in PBS pro Maus) ip immunisiert. Den Mäusen wird an Tag 0, 5 und 8 Blut
aus der Schwanzvene entnommen und Serum gewonnen. Mittels Elisa wird auf das
Vorhanden sein und die Menge von Antigen-spezifischer Antikörper des IgM- und/oder IgG3Isotyps getestet.
3.2.3.3 Immunisierung mit Erythrozyten aus dem Schaf und Histologie
Die roten Blutkörperchen aus dem Schaf werden bei 2400rpm für 20min zentrifugiert und der
Überstand verworfen. Die Erythrozyten werden in PBS aufgenommen und gezählt. Jeder
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Methoden
maus werden 1x109 Erythrozyten in 200μl PBS ip injiziert. Zehn Tage nach der Injektion
werden die Mäuse getötet und Milzschnitte angefertigt.
3.3 Kultivierung embryonaler Stammzellen der Maus
3.3.1 ES-Zellen auftauen und plattieren
Die in flüssigem Stickstoff gefrorenen ES- Zellen wurden noch im Einfrierröhrchen im
Wasserbad bei 37°C schnell aufgetaut, sofort in Medium gegeben und bei 1300rpm für 5min
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Zellpellet in frischem Medium gelöst
und auf vorbereite Flaschen mit embryonalen Fibroblasten (EMFI) gegeben. Bei ES- Zellen
ist die Passage für weitere Versuche sehr wichtig und muss immer mit angegeben werden.
3.3.2 ES-Zellen passagieren
Die fest auf den EMFIs sitzenden ES-Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Danach
wurden die Zellen für 5min bei 37°C mit Trypsin/EDTA inkubiert, um die Zellen abzulösen
und Zellverbände/Kolonien aufzulösen. Durch kräftiges Auf und Ab pipettieren konnte eine
komplette Vereinzelung der Zellen erreicht werden. Die Zellsuspension wurde danach
zentrifugiert und in Medium aufgenommen und entweder auf eine größere Kulturflasche oder
zu einem Drittel in eine Flasche selber Größe plattiert. Die ES-Zellen waren nun eine
Passage „älter“.
3.3.3 ES-Zellen einfrieren
ES-Zellen wie oben beschrieben durch Trypsinierung von der Flasche lösen. Nach
Zentrifugation wurde das Pellet in Einfriermedium aufgenommen. Ca. ein Drittel der Zellen
einer großen Flasche wurden in 1ml Einfriermedium (80% FCS, 20% DMSO) in ein
Einfrierrohrchen gefüllt. Die Zellen wurden sofort aus Eis gestellt, danach folgte ein
langsames Einfrieren bei -80C. Einen Tag später konnten sie dann zur längerfristigen
Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt werden.
3.3.4 Vorbereitung von ES-Zellen für die Injektion in Blastocysten
ES-Zellen einer möglichst niedrigen Passage kultivieren und bei der richtigen Dichte ernten
(s.o.). Nach dem Zentrifugationsschritt wurde das Zellpellet in Injektionsmedium (DMEM,
15%FCS, ohne weitere Zusätze) aufgenommen und auf einer 6cm Gewebekulturschale
ausplattieren. Die Zellen wurden eine halbe Stunde im Brutschrank inkubiert um den EMFIs
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Methoden
Zeit zu geben sich zu setzen. Nun wurde vorsichtig das Medium, das zum Grossteil tote und
nicht vitale ES-Zellen enthält, mit einer Pipette abgesaugt. Daraufhin wurde wieder frisches
Medium auf die Zellen gegeben und wieder vorsichtig mit einer Pipette abgenomen. Hier
waren jetzt die gewünschten vitalen ES-Zellen enthalten. Diese wurden zentrifugiert, in
wenig Medium aufgenommen und auf Eis bis zur Injektion in Blastocysten aufbewahrt.
3.4 Biochemische Methoden
3.4.1 Herstellung von Zelllysaten für Western Blot
Einzelzellsuspensionen wurden bei 1500rpm für 5min bei 4C abzentrifugiert und der
Überstand abgenommen. Das Zellpellet wird in Zellysepuffer, der mit Protease- und
Phosphatase- Inhibitoren versetzt ist (siehe Materialteil), auf genommen, z.B. 2x106 Zellen
pro 20μl Lysispuffer. Die Proben wurden 20min auf Eis inkubiert und konnten dann
wahlweise gleich weiterverwendet oder bei -20C gelagert werden.
3.4.2 SDS PAGE Gel für Western Blot
Totalzellysate wurden mit reduzierendem Ladepuffer (Roth) für fünf Minuten aufgekocht. Die
denaturierten Proteine wurden mittels einer SDS-Page aufgetrennt.
Rezept für zwei 10x10cm Gele:
10%iges Trenngel
Zutaten
10ml gesamt
5%iges Sammelgel
3ml gesamt
4ml
H2O
2,1ml
3,3ml
30% Acrylamid
0.5ml
2,5ml
1,5M Tris pH 8,0
1M Tris pH 6,8
0,38ml
0,1ml
10% SDS
0,03ml
0.1ml
10% APS
0,03ml
0,004ml
TEMED
0,003
Vor dem Gießen des Trenngels wurde ein sehr schnell polymerisierendes Fußgel gegossen,
das das Gel am Auslaufen hindern sollte. Dieses Fußgel bestand aus 1ml Trenngel und je
0,01ml APS und TEMED.
- 28 -
Methoden
Es folgte ein Gelvorlauf bis die Proben vom Sammelgel in das Trenngel eingedrungen
waren, bei ca. 80-100V. Danach wurde das Gel bis zur gewünschten Auftrennung der
Proben bei 120-160V laufen lassen.
3.4.3 Elektro Blot von Proteingelen
Das Trenngel wurde vom Sammelgel befreit und beim Aufbau des Elektroblots benutzt. Der
Aufbau erfolgte von Kathode in Richtung Anode:
Schwamm
Drei zugeschnittene Whatmanpapiere
Nitrocellulose – Membran (BioTraceNT; PALL)
Gel
Drei zugeschnittene Whatmanpapiere
Schwamm
Dieses „Sandwich“ wurde mit der Gelseite Richtung Anode in die Kammer geklemmt und
dann die Kammer mit Transferpuffer aufgefüllt.
Die Proteine aus dem Gel wurden über Nacht bei 40V und 4°C auf die Membran geblottet.
3.4.4 Immunologische Detektion beim Western Blot
Zunächst wurde die Membran für mindestens zwei Stunden bei RT in Blockierungspuffer
(PBS+ 5% Milchpulver) geschwenkt, um dann in PBS/TWEEN kurz gewaschen zu werden.
Nun wurde der primäre Antikörper in der jeweils passenden Verdünnung in PBS + 1%
Milchpulver gelöst und die Membran wieder mindestens zwei Stunden lang bei RT inkubiert.
Nach drei fünfminütigen Waschschritten wurde der sekundäre Antikörper, mit HRP
gekoppelt, in der passenden Verdünnung in PBS + 1% Milchpulver auf die Membran
gegeben und ebenfalls für mindestens eine Stunde inkubiert. Es folgten drei weitere
Waschschritte, danach wurde die Substratlösung für die Chemilumineszenz nach
Herstellerangaben des ECL KITs gemischt und auf die Membran pippetiert. Daraufhin wurde
die überschüssige Lösung abgeschüttet und ein Röntgenfilm aufgelegt.
- 29 -
Methoden
3.5 Nukleinsäure-spezifische Methoden
3.5.1 DNA Isolation aus Mäuseschwänzen
Methode 1:
Die Mäuseschwanzspitze wurde mit 0,3ml LysispufferA und 0,01ml Proteinase K (10mg/ml)
über Nacht bei 56°C schüttelnd inkubiert. Am nächsten Morgen wurde die verdaute DNA
kräftig geschüttelt und bei 10000rpm in der Tischzentrifuge bei RT fünf Minuten zentrifugiert.
Der Überstand wurde mit 0.5ml Isopropanol vermischt, danach die ausgefallene DNA mit
einer Pasteurpipette aufgewickelt und kurz in 70% Ethanol getaucht. Nach einer kurzen
Lufttrocknung wurde die DNA in Wasser gelöst. (Die vollständige Lösung im Wasserbad
benötigt 2 Stunden bei 65°C)
Methode2:
Die Schwanzspitze wurde mit 0,2ml LysispufferB und 15μl Proteinase K (10mg/ml) bei 56°C
für 2 Stunden inkubiert. Die Lösung wurde nun für acht Minuten aufgekocht und danach bei
maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Im Überstand befand sich nun die DNA, die sauber
genug für Standard- PCR-Anwendungen ist.
Die DNA kann bei 4°C als auch bei -20°C aufbewahrt werden.
Diese Methode wurde hauptsächlich verwendet, da sie schneller und bei vielen Proben
praktikabler (durch den Wegfall des DNA Aufwickelns) ist, als Methode1.
3.5.2 DNA Isolation aus Zellen
Zellen wurden geerntet (ES- Zellen oder primäre Zellen) und zweimal in eiskaltem PBS
waschen. Das Zellpellet (ca. 1x107 Zellen) wurde in 1ml Lysepuffer1 gut resuspendiert und
dann 1ml von Lysepuffer2 dazugegeben und gemischt. Nach Zugabe von Proteinase K
(Endkonz. 0,4mg/ml) wurden die Proben bei 56°C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag
wurden den Proben 2ml Phenol:Chloroform zugegeben, gut gemischt, bei 1300rpm
zentrifugiert und die obere wässrige Phase in ein neues Gefäß überführt. Dieser Schritt
wurde dreimal wiederholt. Der letzten abgenommenen wässrigen Phase wurde ein
Volumenteil an Chloroform zugegeben, danach wurde sie zentrfugiert und die obere Phase
abgenommen. Jetzt folgte eine Ethanolfällung. Die ausgeflockte DNA wurde um eine
Pasteurpipette gewickelt, in 70% Ethanol getaucht und an der Luft getrocknet. Die DNA
wurde in ca 0,5ml Wasser aufgenommen und bei 4°C oder -20°C gelagert. Die so präparierte
DNA ist geeignet für Southern Blot Experimente.
- 30 -
Methoden
3.5.3 RNA Isolierung aus primären Zellen
Alle verwendeten Materialien und Gebrauchsgegenstände müssen RNase frei sein. So
wurden nur gestopfte Spitzen verwendet und sehr häufig die Handschuhe gewechselt. 2x107
aufgearbeitete Zellen wurden in 1ml Trizol gut resuspendiert. Der Probe wurden 200μl
Chloroform zugegeben und gevortext. Für die Expressionsanalyse wurden verschiedene
Zellpopulationen mit einer gleichen Zellzahl, z.B. 5x105, verwendet. Diese Proben wurden
wegen der geringen Zellzahl länger, ca. 30min, und schneller, ca.1800rpm statt der
1300rpm, zentrifugiert. Diese Pellets wurden danach in 0,5ml Trizol aufgenommen und dann
mit 100μl Chloroform vermischt. Nach einer kurzen Inkubation bei RT wurden die Proben bei
4°C 10min lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Die obere Phase wurde in ein
Gefäß mit 500μl Isopropanol überführt und nach Zugabe von 2μl seeDNA 10min bei RT
inkubiert. Nach einem erneuten Zentrifugationsschritt wurde die RNA mit 80% Ethanol
gewaschen und anschließend luftgetrocknet. Die RNA wurde in DEPC- Wasser
aufgenommen, photometrisch vermessen und bei -80C gelagert.
3.5.4 cDNA Synthese
1μg RNA wurde mit 1μl Oligo dT (500μg/ml) vermischt und mit DEPC- Wasser auf 12μl
aufgefüllt. Die Probe wurde 10min bei 70C inkubiert und danach direkt auf Eis gestellt. Jetzt
wurden der Probe 4μl 5x Puffer, 2μl DTT, 1μl 10mM dNTPs zugefügt und die Probe für 2min
auf 42°C gebracht. Während einer zehnminütigen Inkubation bei 25°C wurde der Probe 1μl
Superscript II zugegeben und dann folgendes Programm absolviert: 50min bei 42°C, 15min
70°C und abschließend bis zur Entnahmen der Probe 4°C. Die cDNA wurde bei 4°C oder 20C gelagert werden.
3.5.5 Standard PCR Protokoll
Der Standard PCR Ansatz bestand aus:
5μl
10x Puffer für SuperTaq
1,5μl
Primer1 (60-66ng/ml)
1,5μl
Primer2 (60-66ng/ml)
1μl
dNTPs (10mM)
0,1μl
Taq Polimerase (SuperTaq, 5Units/μl)
1-5μl Template (z.B 200ng Plasmid DNA, 5ng cDNA)
auffüllen auf 50μl mit Wasser
- 31 -
Methoden
Standard PCR- Programm in MWG Cycler:
1.
94°C
5min
2.
72°C
1min
3.
50-58°C
1min
(je nach Schmelztemp. der Primer)
4.
72°C
0,5-2min
(je nach Länge der Fragmente)
5.
30 bis 35malige Wiederholung der Schritte 2 bis 4
6.
72°C
5min
7.
4°C
bis zur Probenentnahme
3.5.6 Southern Blot
Genomische DNA aus Mäuseschwänzen oder ES- Zellen wurde mit einen passenden
Restriktionsenzym (20Units/15μg gDNA über Nacht, dann nochmals 10Units dazugeben und
den Verdau noch ein paar Stunden weiterführen) verdaut und der vollständige Verdau auf
einem Agarosegel überprüft.
3.5.6.1 Southern Gel
Ein 0.8%iges Agarosegel wurde mit 15 bis 20μg genomischer DNA beladen, die mit dem
passenden Enzym verdaut wurde. Ein Größenstandard wurde ebenfalls geladen. Der Gellauf
erfolgte langsam bei ca. 60V über acht Stunden oder noch langsamer bei ca.20V über
Nacht. Ein Gelfoto wurde angefertigt und mit einem Lineal fotografiert, um später die
Bandengrößen abschätzen zu können.
Nach dem Fotografieren wurde das Gel für 20min in 0,25M HCl depuriniert. Darauf folgte ein
zweimaliges 15min Schwenken in 0,4N NaOH.
3.5.6.2 Kapillarblot
Blotaufbau von unten nach oben:
Pufferbrücke aus Whatmanpapier
Agarosegel mit den Taschenöffnungen nach unten
Trockene Membran (Hybond-N+, Amersham)
Nasses Whatmanpapier
Trockenes Whatmanpapier
Papierstapel aus trockenem Handtuchpapier
Ca. 1kg Gewicht
Der Transferpuffer bestand aus 0,4N NaOH und war in zwei Tanks gefüllt, aus der die
Whatmanpapier- Pufferbrücke den Transferpuffer durch einen Kapillareffekt hochziehen
konnte. Die DNA wurde über Nacht auf die Membran geblottet.
- 32 -
Methoden
Nach den Blotabbau am nächsten Tag wurden die Taschen mit Kugelschreiber zur späteren
Orientierung auf der Membran nachgezeichnet. Die Membran wird kurz in 2x SSC
geschwenkt und dann luftgetrocknet. Ist die Membran trocken wird die DNA auf der
Membran mittels UV-Licht (0,12J/cm2) durch Kreuzvernetzung fest gebunden.
3.5.6.3 Hybridisierung
Die Membran wurde mit vorgeheizter Quickhyb- Lösung (ca. 15ml pro Membran, die einem
großen Gel entspricht) für eine Stunde bei 65°C vorhybridisiert.
Währendessen wurde die DNA- Sonde (hergestellt durch PCR, ca. 20ng) mittels des
„random priming kit“ von Invitrogen nach Herstellerangaben radioaktiv markiert. Als
radioaktives Isotop wurde (α 32P) dCTP verwendet. Die Sonde wurde nun von
überschüssigen radioaktiv markierten Nucleotiden mittels des „Quiaquick nucleotide removel
kit“ von Quiagen nach Herstellerangeben gereinigt und danach für 5min bei 98°C denaturiert.
Die fertige Sonde wurde mit etwas Quickhyb- Lösung gut vermischt und zur Membran mit
der Vorhybridisierunglösung gegeben. Die Membran wurde anschließend bei 65°C über
Nacht drehend in einer Röhre hybridisiert. Am nächsten Tag musste die Membran
gewaschen werden. Im ersten Schritt wurde sie für ca. 30min bei 65°C mit 0.5x SSC + 0.2%
SDS und danach in einem zweiten Schritt bei 65°C mit 0.2x SSC + 0,1 SDS (bis der Filter
nur noch ca. 50cpm abstrahlte) gewaschen. Die gewaschene Membran wurde in
Frischhaltefolie eingewickelt und flach in eine Filmkassette geklebt. In der Dunkelkammer
wurde ein Röntgenfilm aufgelegt und bei -20°C geeignet lange exponiert. Der Film wurde
entwickelt und das Ergebnis, d.h. die Bandengröße, mit Hilfe des Größenmarkers
ausgewertet.
- 33 -
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Expression von Siglec-G
Die Expression von Siglec-G auf RNA- und Proteinebene ist noch weitgehend unbekannt. Es
sind nur wenige Daten aus ChipHybridisierungsexperimenten (Su et al, 2004), die auf eine
B- Zell spezifische Expression von Siglec-G hinweisen, bekannt.
4.1.1 mRNA Expression von Siglec-G in verschieden Zellpopulationen
Um Rückschlüsse auf die Funktion von Siglec-G ziehen zu können, sollte die Expression
dieses Moleküls in der Maus genauer studiert werden. In dieser Arbeit wurde hierzu eine
Studie
der
Expression
der
Siglec-G
mRNA
mit
spezifischen
Primern
in
einer
semiquantitativen RT-PCR gemacht. Verschiedene Zellpopulationen der Maus wurden mit
Hilfe eines MoFlo Sorters aus Knochenmark, Milz und Bauchhöhle aufgereinigt und daraus
mRNA isoliert. Nach der Umschreibung der mRNA in cDNA konnte mit spezifischen Primern
das Genprodukt von Siglec-G quantitativ nachgewiesen wurden.
KM
Pro B Zellen
Rag-/-
Prä B Zellen
B220+ CD25+
Unreife B Zellen
B220 low IgM+
Reife B Zellen
B220 high IgM+
Siglec G
Actin
Milz
B Zellen
B220+
NICHT B u. T Zellen
B220- CD5-
T Zellen
CD5+
Siglec G
Actin
Peritoneum
B2+ B1b B Zellen
B220+ CD5-
B1a B Zellen
B220+ CD5+
Siglec G
Actin
cDNA: 1:5 serielle Verdünnung
Abbildung 3: Siglec-G wurde in allen Stadien der B-Zellentwicklung auf mRNA-Ebene exprimiert
RT-PCR der Siglec-G Expression in Pro-B-Zellen (aus Rag-/- Mäusen) und anderen FACS-sortierten Zellpopulationen
aus wildtypischen Mäusen. Die Pfeile stellen die 1:5 serielle Verdünnung dar. Die Menge an Siglec-G mRNA wurde mit
Hilfe von Actin mRNA standardisiert. (KM= Knochenmark)
- 34 -
Ergebnisse
In Abbildung 3 ist eine B-Zell-spezifische Expression von Siglec-G zu erkennen. In
Zellpopulationen, die weder B-Zellen noch T-Zellen sind, konnte keine mRNA von Siglec-G
nachgewiesen wurden, obwohl die Actin Expression aller Zelltypen vergleichbar war. In T –
Zellen ist nur eine sehr schwachen Bande sichtbar, die entweder auf eine leichte
Verunreinigung der Probe schließen lässt oder auf eine schwache Expression von Siglec-G
auch in T- Zellen. Auf Proteinebene lässt sich allerdings bei T –Zellen kein Hinweis auf
Siglec-G Expression in T- Zellen feststellen (siehe nächstes Kapitel). Siglec-G mRNA lässt
sich bereits zu einem frühen Zeitpunkt in der B –Zell Entwicklung nachweisen. In Pro-BZellen ist eine deutliche Expression sichtbar. Im nächsten Entwicklungsschritt, den Prä-BZellen, ist das Maximum der Siglec-G Expression bei B- Zellen im Knochenmark erreicht.
Danach ist die Expression auf ein gleich bleibendes Niveau bei unreifen und reifen B- Zellen
gesenkt. Auch in reifen B- Zellen in der Milz wurde in etwa dieses Expressionsniveau erreicht
(Abb.3). Alle anderen Zelltypen in der Milz zeigen keine oder nur eine sehr schwache
Expression der Siglec-G mRNA. Auch in den B- Zellpopulationen der Bauchhöhle ist SiglecG exprimiert. B2 und B1b B- Zellen zeigen eine schwache Expression, wohingegen B1aZellen die stärkste Siglec-G Expression überhaupt aufweisen (Abb.3). Siglec-G ist demnach
B-Zell-restringiert exprimiert. Die höchsten Expressionsspiegel an Siglec-G weisen Prä-BZellen und B1a-Zellen auf.
4.1.2 Siglec-G Expression auf Proteinebene
Mehrere Versuche einen Antikörper gegen den extrazellulären Teil von Siglec-G herzustellen
sind fehlgeschlagen. Paul Crocker stellte ein Siglec-G Fc- Protein her. Dieses bestand aus
dem Fc- Teil von humanen IgG und zweimal die ersten drei Immunglobulindomänen von
Siglec-G. Es wurden Schafe und Kaninchen mit diesem Fc- Protein immunisiert. Leider
konnte nie ein Antikörper gegen Siglec-G gewonnen werden, der Siglec-G außer auf mit
Siglec-G-transfizierten Zellen auch auf primären Zellen spezifisch erkannte. In einem zweiten
Versuch wurden Schafe mit Zellen, die Siglec-G exprimierten, immunisiert. Auch dieser
Versuch war nicht von Erfolg gekrönt. Deshalb wurde im Zuge dieser Arbeit eine Firma
(PINEDA) beauftragt, einen Antikörper gegen ein Peptid des intrazellulären Teils von SiglecG herzustellen. Folgendes dreizehn Aminosäuren langes Peptid wurde verwendet um
Kaninchen oder Meerschweinchen zu immunisieren: NH2-KKQKDPHFTYPGC-CONH2.
Serum der immunisierten Tiere wurde über eine Säule, die dieses Peptid enthielt,
aufgereinigt um monospezifisches Antiserum gegen Siglec-G zu erhalten. Die Firma testete
dieses Serum mittels Elisa mit dem an ein Trägerprotein gekoppelten Siglec-G-Peptid. Nach
Erhalt der Antiseren von der Firma wurde das Serum mittels Western Blot getestet. Dazu
wurden Zellysate aus DT40 Zellen hergestellt, die mit einem Siglec-G-GFP Fusionsprotein
transfiziert waren (hergestellt von Julia Jellusova). Zur Kontrolle dienten Zellysate aus DT40
Zellen, die nur GFP exprimierten.
- 35 -
DT40
SigG- GFP
DT40
GFP
Ergebnisse
130 kD
100 kD
70 kD
Abbildung 4: Der Antikörper (PINEDA) erkennt das Siglec-G Protein spezifisch
DT40-Zellen wurden mit GFP oder Siglec-G-GFP transfiziert. Lysate dieser Zellen wurden in einem Western Blot
verwendet. Das anti-Siglec-G monospezifische Serum band spezifisch an Siglec-G (ca. 130kD). In dieser Größe
wurde bei dem Lysat aus DT-40 GFP kein Protein erkannt.
In Abbildung 4 sieht man die Western Blot Analyse von DT40 Zellen mit und ohne Siglec-G
mittels des affinitätsgereinigtem Antiserums der Firma PINEDA. In der ersten Spur konnte
auf der erwarteten Höhe von ca.130kD keine Bande festgestellt werden. In Spur zwei jedoch
konnte Siglec-G Protein, das mit GFP fusioniert, ist nachgewiesen werden. Beide Proteine
haben zusammen eine Größe von ca. 130kD. Dieser Siglec-G-Antikörper eignete sich
demnach für Western Blot Versuche und erkannte Siglec-G spezifisch. Nun konnte er für die
Analyse der Siglec-G Protein-Expression von primären Zellen verwendet werden.
B- Zellen aus der Milz und B1a-Zellen aus der Bauchhöhle wurden aufgereinigt und daraus
ein Zelllysat hergestellt. Nach der Auftrennung der Proteine auf einem SDS-Gel und der
Westernhybridisierung mittels des neu hergestellten anti-Siglec-G-Antikörpers können
Siglec-G-spezifische Proteinbanden nachgewiesen wurden.
- 36 -
B1a B cells
from P.C. 1 x106
kD
B cells
from Spleen 1 x106
Ergebnisse
130
α Siglec G
100
55
α Actin
40
Abbildung 5: B1a-Zellen haben mehr Siglec-G Protein als B2-Zellen
Western Blot Analyse von aufgereinigten B2_zellen aus der Milz und B1a-Zellen aus der Bauchhöhle. Es wurden
6
jeweils 1x10 Zellen für die Lysate eingesetzt. Actin diente als Ladekontrolle.
In Abbildung 3 wurde die unterschiedliche Menge an Siglec-G mRNA in der verschieden
Zellpopulationen aufgezeigt. In Abbildung 5 wurde die gleiche Zellzahl (hier 1x106 Zellen) an
B- Zellen aus der Milz und B1a-Zellen aus der Bauchhöhle auf das Vorhandensein und die
Menge an Siglec-G Protein getestet. Die Menge an dem „Haushaltsprotein“ Aktin, die bei
beiden Populationen gleich ist, dient als Standard für die Proteinmenge. Abbildung 5 zeigt,
dass die Menge an Siglec-G Protein in B1a-Zellen höher war als in B-Zellen aus der Milz.
Das Phänomen, dass mehrere Siglec-G Banden sichtbar sind, weist entweder auf
unterschiedliche Glykosylierung des Proteins oder auf mehrere Spleißvarianten hin. Die
stärkere Proteinexpression in B1a-Zellen aus der Bauchhöhle scheint mit dem erhöhten
mRNA Expressionslevel zu korrelieren.
4.2 Herstellung einer Siglec-G defizienten Maus
Um die physiologische Funktion von Siglec-G aufzuklären, wurde im Zuge dieser Arbeit eine
Siglec-G-defiziente Mauslinie hergestellt. Die ersten Klonierungen des Siglec-G-Gens aus
der Maus wurden von Sheena Kerr aus Paul Crockers Labor in Dundee gemacht. Darauf
aufbauend hat Sheena Kerr mit Hilfe von Jiquan Zhang, ebenfalls aus Paul Crockers
- 37 -
Ergebnisse
Arbeitsgruppe, den Siglec-G Targetvektor zur Herstellung der Siglec-G knock out Maus
hergestellt. Hierzu wurde eine klassische „gene targeting- Strategie“ angewandt.
4.2.1 Strategie und ES-Zellmanipulationen
Pst I
Pst I
4 5 6 7 89
1 2 3
Sonde
1.2 kb
Targetvektor
Sonde
3.2 kb
1 loxP
loxP
4
Pst I Pst I
Pst I
RT-PCR 1
RT-PCR 2
WT Allel
Pst I
4 5 6 7 89
1
9
Ko Allel
Abbildung 6: „gene targeting“ –Strategie
Eine loxP –flankierte Neo-Kassette (hellgrau) ersetzte den größten von Exon zwei und drei. Damit sollte die
Sialinsäurebindungsstelle von Siglec-G zerstört werden. Die Lage der Sonde für den Southern Blot und die Lage
der Primer sind eingezeichnet. Die HSV Thymidin Kinase-Kassette ist schwarz eingezeichnet.
Der Targetvektor besteht aus einem langen und kurzen Arm, wie in Abbildung 6 zu sehen.
Teile des zweiten und dritten Exon sind durch eine Neomycin- Resistenzkassette ersetzt.
Somit ist die V-Domäne 1 und Domäne 2 und damit die Sialinsäurebindungsstelle zerstört.
Zur negativen Selektion befindet sich am Ende des kurzen Armes eine ThymidinkinaseKassette. Zur positiven Selektion wurde die Neo- Kassette, die von loxP Stellen flankiert ist,
verwendet. Ziel ist die homologe Rekombination des Targetvektors in die BALB/c ES-Zelle
(Noben-Trauth et al, 1996). Zur Kontrolle des homologen Einbaus wurden PCR Techniken
sowie Southern Blot Experimente eingesetzt. Die Lage der Primer für den Screen mittels
PCR sowie die Lage der externen Southern Sonde und die Restriktionsenzym-Schnittstellen
für den Southern Blot sind eingezeichnet.
Die ES-Zelltransfektion und das Screening wurden von Lars Nitschke und Carolin Dix
durchgeführt. Es wurden 2,6x107 Zellen transfiziert, davon wurden 480 doppel-resistente
Klone gepickt. Nach dem ersten PCR Screen konnten zehn Klone als positiv für die knock
out Mutation festgestellt werden. Nach der zweiten PCR Screening-Runde konnte die
gewünschte Mutation bei vier Klonen bestätigt werden.
- 38 -
Ergebnisse
Die veränderten embryonalen Stammzellen wurden mittels Southern Blot überprüft.
WT
tg
*
Positive Klone
Abbildung 7: Die korrekte homologe Rekombination des Targetvektors wurde mittels Southern bei zwei
Klonen nachgewiesen.
Genomische DNA von ES-Zellen wurde mit Pst I verdaut. Mit der externen Sonde konnten nach einer
Hybridisierung bei 65°C über Nacht zwei positive Klone gefunden werden: 4E1 und 9B6 (ganz links und rechts).
Man erwartete bei positiven Klonen zwei Banden. Die größere Bande bei ca. 11kb zeigt den
Wildtypzustand des Gens an. Bei zwei Klonen, 4E1 und 9B6, konnte auch die kleinere
Bande bei ca. 6,5kb festgestellt werden (Abb.7). Diese Klone tragen das veränderte Siglec-G
Gen. Damit wurden zwei embryonale Stammzellklone, die für die gewünschte knock out
Mutation positiv waren, erhalten und weiter kultiviert
Die Injektion der embryonalen Stammzellen in Blastozysten von Spendermäusen wurde von
Martina Döhler übernommen. Den Transfer in scheinschwangere Ammenmäuse hat Burkhart
Kneitz durchgeführt. Es wurden mehrere unterschiedliche chimäre Mäuse geboren, die fast
alle eine Weitergabe des veränderten Gens durch Keimbahntransfer zeigten. Die folgende
Tabelle gibt hier eine Übersicht.
- 39 -
Ergebnisse
Klone
Chimaere
Nr.
Geschlecht
4E1
4E1
4E1
4E1
4E1
4E1
4E1
4E1
4E1
4E1
4E1
4E1
4E1
9B6
9B6
9B6
9B6
9B6
9B6
9B6
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
251
252
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♂
♀
♀
♀
♀
♀
♂
♂
♂
% chimaer Keimbahntransmission
80
80
60
30
30
15
90
40
25
85
25
15
10
5
15
20
15
35
60
65
gemischt
100%
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
gemischt
n.v.
n.v.
100%
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
gemischt
100%
Tabelle 1: Übersicht über den Erfolg der Blastozysteninjektionen
Nicht verpaart wurde n.v. abgekürzt
Die Nachkommen der chimären Mäuse, die einen heterozygoten Genotyp aufwiesen,
wurden untereinander weiterverpaart. Nach Züchtung der Mäuse konnten zwei unabhängige
Siglec-G defiziente Mauslinien etabliert werden.
4.2.2 Überprüfung der Siglec-G defizienten Mauslinien
Nach der Herstellung genetisch-veränderter Mäuse ist es zwingend notwendig, diese zu
testen, ob sie wirklich die gewünschte Veränderung in ihren Genen tragen.
4.2.2.1 Prüfung der Mutation auf DNA Ebene
Um die korrekte Mutation in der Maus zu überprüfen, wurde Schwanz-DNA von
Nachkommen der Chimären mittels Southern Blot getestet. Hier wurde dieselbe externe
Sonde wie bei den ES Zellen verwendet.
- 40 -
Ergebnisse
+/-
+/-
+/-
+/+
WT
+/+
10kb
8kb
6kb
KO
Abbildung 8: Einige Nachkommen der chimaeren Mäuse waren heterozygot
Genomische DNA aus Mäuseschwanzen wurde mit PST I verdaut und über Nacht bei 65°C mit der Sonde (siehe
Abb.6) hybridisiert.
Abbildung 8 zeigt fünf Nachkommen (F1-Generation) chimärer Mäuse. Nummer eins, zwei
und vier weisen auch die kleine Bande auf, die das veränderte Gen anzeigt. Bei diesen
Mäusen fand also eine Keimbahntransmission des mutierten Gens statt. Diese Mäuse
wurden zur weiteren Züchtung herangezogen. Bei den nächsten Nachkommen, der F2
Generation, konnte dann die erste homozygote knock out Maus nachgewiesen werden.
*
*
*
WT
tg
* SigG -/- (4E1)
Abbildung 9: Die ersten Siglec-G -/- Mäuse wurden durch PCR bestätigt
Eine PCR-Strategie mit drei Primern konnte eine Wildtyp- und transgene Bande nachweisen. Mäuse, die nur die
kleinere Bande aufwiesen, waren homozygot für das mutierte Siglec-G-Gen.
In Abbildung 9 ist das Ergebnis einer PCR zur Genotypisierung der F2–Generation
dargestellt. Maus Nummer 2, 4 und 6 mit nur einer Bande auf Höhe von 200bp sind
homozygote Siglec-G „knock-out“ Mäuse. Die obere Bande bei ca. 500bp stellt die
Wildtypbande dar. Hier konnten die ersten drei Siglec-G defizienten Mäuse bestätigt werden.
- 41 -
Ergebnisse
4.2.2.2 Nachweis über das Fehlen von Siglec-G mRNA in der knock out Maus
Da nur ein Teil des Siglec-G Gens zerstört wurde, musste auch auf die Abwesenheit der
Siglec-G mRNA in Teilen oder Spleißvarianten getestet werden, um einen tatsächlichen
„knock-out“ zu überprüfen. Aus Milzzellen von Wildtyp, heterozygoten und homozygoten
Mäusen wurde mRNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Diese cDNA wurde in Siglec-G
spezifische PCR Reaktionen eingesetzt um festzustellen, ob noch Siglec-G mRNA produziert
wurde. Es wurden verschieden Abschnitte der mRNA getestet um auch alternatives Spleißen
3
Neg.
Ko
+/-
B
4 5 6
7 89
10
pgk-neo
1
-/-
+/+
-/-
Neg.
Ko
A
B
A
1 2
+/-
-/-
+/+
-/-
ausschließen zu können.
4 5 6
7 89
WT Allel
ko Allel
Abbildung 10: Siglec-G -/- Mäuse weisen keine Siglec-G mRNA mehr auf.
Mit zwei Strategien konnte nachgewiesen werden, dass das Siglec-G-Gen nicht mehr in Siglec-G defizienten
Mäusen als mRNA exprimiert wurde. Hier wurden zwei defiziente, eine heterozygote und eine wildtypische Maus
getestet. Als Negativkontrolle diente wildtypische mRNA ohne reverse Transkriptase.
Es wurden in Abbildung 10 zwei Abschnitte der Siglec-G RNA überprüft. Bei A handelt es
sich um ein Fragment von Exon 1 bis Exon 4. Bei wildtypischer cDNA war hier eine Bande in
der Größe von ca. 900bp zu erkennen. Auch bei heterozygoten Mäusen war dieses
Fragment in der cDNA enthalten. In Siglec-G -/- Mäusen konnte keine Bande gefunden
werden. Die Neo-Kassette war demnach in der cDNA enthalten und macht durch ihre Größe
eine PCR Amplifikation unmöglich. Auch ein alternatives Spleißen konnte ausgeschlossen
werden, da auch keine kleineren Banden auftraten. Das gleiche trifft auf Fragment B zu.
4.2.2.3 Knock out Mäuse besitzen kein Siglec-G Protein mehr
Auch auf Proteinebene wurden die Siglec-G defizienten Mäuse getestet. In Abbildung 11 ist
eine Western Blot Analyse zu sehen, die Siglec-G in B- Zellen der Wildtyp Maus nachweist.
- 42 -
+/+ Thym.
-/- Thym.
+/+ B cells
-/- B cells
Ergebnisse
kD
130
100
70
Abbildung 11: Siglec-G defiziente Mäuse besitzen kein Siglec-G Protein mehr.
Western Blot Analyse von Lysaten aus B-Zellen aus der Milz und T-Zellen (Thymus) aus wildtypischen und
Siglec-G -/- Mäusen mit monospezifischem anti-Siglec-G Serum. Es wurden jeweils 1x106 Zellen eingesetzt.
In Abbildung 11 konnte in Spur 2 bei wildtypischen B-Zellen Siglec-G-Protein nachgewiesen
werden. In B-Zellen weist das Siglec-G-Protein eine Größe von ca. 110kD auf, wie in Spur 2
zu sehen ist. Siglec-G scheint als Protein überhaupt nicht in Thymozyten vorzukommen.
Außerdem wurde keine Siglec-G Expression in defizienten B- Zellen gefunden (Spur 1). Es
gab ebenfalls keine Hinweise auf ein unvollständiges Siglec-G-Protein in der Siglec-G -/Maus, da keine kleineren Bande in Spur 2 zu erkennen waren. Die Siglec-G defizienten
Mäuse wiesen keinerlei Siglec-G-Protein auf.
4.3 Phänotyp der Siglec-G defizienten Mauslinie
Es wurde mit zwei unabhängig von einander hergestellten Siglec-G-defizienten Linien
(Siglec-G-/- 4E1 und 9B6) gearbeitet, bis der Basisphänotyp für beide Linien bestätigt war.
Beide Linien zeigten einen gleich stark ausgeprägten Phänotyp. Danach wurden aus
Gründen der Praktikabilität nur noch Mäuse des Siglec-G-/- (4E1)- Stamms verwendet.
Um einem Phänotyp der Siglec-G-defizienten Mäuse auf die Spur zu kommen, wurde als
erstes die B- Zellentwicklung per FACS Analyse studiert.
4.3.1 Siglec-G defiziente Mäuse zeigen im Knochenmark keine
veränderte B-Zellentwicklung
Die B- Zellentwicklung im Kochenmark der Siglec-G-defizienten Maus ist ähnlich der der
Wildtyp Maus. Bei der FACS Analyse konnten normale Zellzahlen und Zellpopulationen
- 43 -
Ergebnisse
festgestellt wurden. Eine Blockierung einer bestimmten Entwicklungsphase lag ebenfalls
nicht vor.
SiglecG-/-
Wildtyp
02.05.05.001
02.05.05.004
CD43
Pro B Zellen
5.0%
R3
R4
10 0
10 1
R3
R4
77.5%
10 2
10 3
FL1-B220
5.9%
10 4
10 0
10 1
72.4%
10 2
10 3
FL1-B220
10 4
B220
02.05.05.008
02.05.05.005
Prä B Zellen
BP-1
45.9%
R5
R5
43.1%
R6
10 0
10 1
10 2
10 3
FL1-B220
42.2%
36.7%
R6
10 0
10 4
10 1
10 2
10 3
FL1-B220
10 4
B220
Siglec G -/-
IgM
Wildtyp
02.05.05.014
02.05.05.016
10%
12%
R7
18%
R3
17%
R8
R3
7.8%
R4
100
101
Transitionale B Zellen
R7
6.3%
R4
42%
102
103
FL1-B220
Reife
B Zellen
R8
104
100
101
Unreife
B Zellen
45%
102
103
FL1-B220
104
Pro/prä B Zellen
B220
Abbildung 12: Keine Veränderung der Vorläuferzellen und B-Zellen aus dem Knochenmark in der Siglec-G
-/- Maus.
FACS Analyse der verschiedenen Zellpopulationen des Knochenmarks. In den Gates sind die jeweiligen
prozentualen Anteile der Zellen bezogen auf die Lymphozyten angegeben.
- 44 -
Ergebnisse
Pro und Prä- B- Zellen (IgM-, B220+) zeigten einen regulären Prozentanteil von 42-45%
(Abb.12). Unreife B- Zellen (IgMlow, B220low) machten einen normalen Prozentanteil von ca.
17% aus. Auch transitionale (IgMhigh) und reife B- Zellen (IgMlow, B220high) lagen in
vergleichbaren Zahlen nämlich 10% und ca. 7% vor, wie beim Wildtyp. Insgesamt konnten
bei den Knochenmarkszellen in der Siglec-G defizienten Maus keine Unterschiede zur
Wildtypmaus festgestellt werden, auch bei den absoluten Zellzahlen nicht (Siehe Tabelle 2)
4.3.2 Siglec-G -/- Mäuse zeigen ein stark vergrößertes B1Zellkompartment
In der Milz zeigten Siglec-G -/- Mäuse ebenfalls eine wildtypische Anzahl von Marginalzonen
B- Zellen und folikulären B- Zellen (Abb.13). Der Anteil der Marginalzonen B- Zellen (B220+,
CD21+, CD23neg-low) lag bei 3%, der Anteil der folikulären B- Zellen (B220+, CD21+, CD23high)
bei 37-40%
Wildtyp
Siglec-G -/22.11.05.047
22.11.05.043
CD23
Marginalzonen B-Zellen
3%
3%
Folliculäre B-Zellen:
reife+ T2 B-Zellen
37%
10 0
10 1
10 2
FL2-CD23
10 3
40%
10 4
100
101
102
FL2-CD23
103
104
CD5
CD21
40%
38%
2%
12%
B1-Zellen
B2-Zellen
41%
35%
B220
Abbildung 13: Siglec-G-/- Mäuse zeigten eine vergrößerte B1-Zellpopulation.
FACS Analyse der Zellpopulationen der Milz. Prozentzahlen machen einen Vergleich zwischen Wildtyp und
Siglec-G -/- Mäusen möglich.
- 45 -
Ergebnisse
Bei einer Anfärbung der Zellen mit B220 und CD5 kann man T- Zellen, B2-Zellen und B1Zellen unterscheiden. Siglec-G Mäuse zeigten normale T- Zellzahlen. B2-Zellzahlen waren
prozentual allerdings leicht von 41% auf 35% erniedrigt. Deutlich erhöht war dahingegen der
prozentuale Anteil der B1-Zellen von 2% bei der wildtypischen Maus auf 12% in der Siglec-G
defizienten Maus. Um diese Unterschiede zu verifizieren, wurden die absoluten Zellzahlen
ermittelt (Abb.14).
5x 107
50000000
WT
45000000
4x 107
40000000
Siglec-G-/-
35000000
3x 107
30000000
25000000
2x 107
20000000
15000000
***
1x 107
10000000
5000000
0
0
B1
B2
Abbildung 14: Erhöhte B1-Zellzahlen in der Milz.
Die Zellzahlen wurden anhand der Prozentzahlen aus der FACS Analyse (Abb.13) und der Gesamtzellzahl der
jeweiligen Milzen errechnet.*** bedeutet eine Signifikanz von p< 0,001
B2-Zellen zeigten keinen Unterschied in absoluten Zellzahlen (Abb.14). Die tatsächliche
Zellzahl liegt bei ungefähr 2,4-2,8 x 107 Zellen ohne signifikanten Unterschied zwischen
beiden Mauslinien. Die erhöhte Anzahl an B1-Zellen konnte bestätigt werden. In der SiglecG-defizienten Maus sind ca. 8 x 106 B1-Zellen vorhanden, etwa viermal so viele wie bei der
Wildtyp Maus mit ca. 2 x 106 B1-Zellen. Dieser Unterschied ist signifikant (p<0,001).
4.3.3 Siglec-G-defiziente Mäuse zeigen eine stark vergrößerte B1a
Zellpopulation im Peritoneum
In der Bauchhöhle, dem Ort an dem B1-Zellen hauptsächlich vorkommen, war ebenfalls ein
deutlicher Anstieg der Zellzahl zu verzeichnen (Abb.15). In relativen Anteilen ausgedrückt
waren ca. 83% der Zellen in der Bauchhöhle einer Siglec-G-defizienten Maus B1a-Zellen in.
Die anderen Zellpopulationen zeigten stark erniedrigte prozentuale Anteile im Vergleich zu
der prozentualen Verteilung von Zellen in der Wildtypmaus. So waren die T- Zellzahlen von
18% auf 4% und die B2-Zellen in Kombination mit B1b-Zellen von 32% auf 5% reduziert.
- 46 -
Ergebnisse
T Zellen
SiglecG-/-
103
102
101
15%
32%
100
101
102
103
104
100
10
B1a B Zellen
104
4
10
103
28%
18%
0
10
1
10
2
CD5
Wildtyp
83%
4%
4%
5%
100
101
102
10 3
IgM
10 4
B2 + B1b B Zellen
***
8x 106
6x 106
WT
Siglec G -/-
4x 106
2x 106
1x 106
T
B2+B1b
B1a
Abbildung 15: Stark erhöhte Zahl an B1a-Zellen in der Bauchhöhle
FACS Analyse der Zellpopulationen der Bauchhöhle. Prozentzahlen machen einen Vergleich zwischen Wildtyp
und Siglec-G -/- Mäusen möglich.
Die Zellzahlen wurden anhand der Prozentzahlen aus der FACS Analyse und der Gesamtzellzahl aus den
jeweiligen Bauchhöhlen errechnet. B1a-Zellen sind B220+ und CD5+. B2- und B1b-Zellen sind B220+, CD5 ***
bedeutet eine Signifikanz von p< 0,001
Betrachtet man die absoluten Zellzahlen so zeigte sich auch hier, dass nur eine drastische
Expansion der B1a-Zellen stattfindet (Abb.15). Hier war der Unterschied von Wildtyp Maus
zu Siglec-G -/- Maus noch deutlicher. Die knock out Maus besaß ca 9 x 106 B1a-Zellen,
während in der wildtypischen Maus nur ca. 1 x 106 dieser Zellen vorkamen. Dieser
Unterschied ist signifikant (p<0,001). Die Zellzahlen der T- Zellen und B2 B- Zellen mit B1b
B- Zellen waren bei beiden Mäusen auf demselben Niveau von ca. 0,5 und 0,8 x 106 Zellen.
Untersuchte man B1b-Zellen mit einer speziellen Anfärbung, konnte auch hier eine kleine
Veränderung festgestellt werden (Abb.16).
- 47 -
Ergebnisse
Wild type
104
104
24.08.06.055
B1a B cells
102
103
103
B2 B cells
00
10
10
1011
10
3
1022
10
10
103
FL2-CD43
101
59%
16%
4
10
104
100
24%
100
101
102
CD5
Siglec-G
24.08.06.053
4%
00
10
10
B1b B cells
90%
5%
1011
10
1022
103
10
FL2-CD43
FL2-CD43
4
10
104
CD43
gated CD19+
Abbildung 16: Veränderte prozentuale Verteilung der B1b-Zellen in der Siglec-G -/- Maus
FACS Analyse der Zellpopulationen der Bauchhöhle. Mit dieser Anfärbung war die Analyse der B1b-Zellen
separat möglich. Prozentzahlen machen einen Vergleich zwischen Wildtyp und Siglec-G -/- Mäusen möglich.
Diese Zellpopulation schien prozentual verringert (Abb.16). Die Errechnung absoluter
Zellzahlen zeigte jedoch auch bei diesen B1b B- Zellen einen leichten Anstieg der Zellzahl
von 1,1x105 im Wildtyp auf 2,5x105 in der Siglec-G-/- Maus. Eine Übersicht über die totalen
Zellzahlen aller getesteten Populationen bietet die folgende
Tabelle 2.
Die Tabelle zeigt, dass nur die B1-Zellen der Siglec-G-defizienten Maus in ihrer Zellzahl
verändert waren. Sie zeigten stark erhöhte Zellzahlen. Alle anderen B-Zelltypen sind im
Vergleich zur wildtypischen Maus nicht verändert.
- 48 -
Ergebnisse
Pro- B (CD43+B220+)
Knochenmark
WT
Siglec-G-/-
n= 8
2.5 ± 0.8 x 105
2.6 ± 1.6 x 105
Pre- B (BP-1+B220+)
n= 9-10
14 ± 0.4 x 105
13 ± 0.7 x 105
unreife B (B200loIgMlo)
n= 8-10
5.6 ± 2.0 x 105
6,3 ± 2.7 x 105
transitionale B (B220lo-hiIgMhi)
n= 8-10
2.8 ± 1.7 x 105
1.9 ± 1.5 x 105
reife B (B220hiIgMlo)
n= 8-10
1.6 ± 1.1 x 105
1,1 ± 0.7 x 105
T-Zellen
n= 12
27 ± 12 x 106
30 ± 13 x 106
B-Zellen
n= 8-10
27 ± 16 x 106
30 ± 12 x 106
B1-Zellen (IgM+CD5lo)
n= 8-10
0.15 ± 0.1 x 106
0.61 ± 0.1 x 106 ***
MZ B-Zellen (CD21hiCD23lo)
n= 10
2.2 ± 1.0 x 106
2.6 ± 1.0 x 106
T1 B-Zellen (CD21loIgMhi)
n= 11
4.5 ± 2.7 x 106
3.9 ± 1.8 x 106
T2 B-Zellen (CD21hiIgMhi)
n= 11
2.1 ± 1.5 x 106
3.2 ± 1.4 x 106
reife B-Zellen (CD21loIgMlo)
n= 11
24 ± 1.2 x 106
25 ± 0.8 x 106
B1a-Zellen (IgM+CD5lo)
n= 11-13
9.3 ± 4.7 x 105
83 ± 4.2 x 105 ***
B1b-Zellen (CD19+CD43+CD5-)
n= 6
1.1 ± 0.5 x 105
2.5 ± 0.9 x 105 ***
B2-Zellen (CD19+CD43-CD5-)
n= 6
3.1 ± 1.3 x 105
4.6 ± 2.3 x 105
T-Zellen (CD5hiB220-)
n= 8
4.1 ± 2.6 x 105
4.2 ± 2.0 x 105
Milz
Peritoneum
Tabelle2: Totale Zellzahlen verschiedener Zellpopulationen in Wildtyp und Siglec-G Mäusen
*** entspricht p<0,001
4.3.4 Die Expansion der B1-Zellen ist durch zellinterne Vorgänge
begründet
Um auszuschließen, dass dieser klare Phänotyp Produkt einer Veränderung in anderen
Zellen als B1-Zellen, also ein trans-Effekt ist, wurde eine Knochenmarks-chimäre Maus
hergestellt. Rag1-/- Mäuse, die keine B- Zellen besitzen, wurden lethal mit 10Gy bestrahlt um
alle verbliebenen Zellen des Immunsystems zu eliminieren. Nach einem Ruhetag wurde den
Mäusen eine errechnete 1:1 Mischung von Knochenmarkszellen aus einer Wildtyp Maus
(allotypischer Marker CD45.1) und einer Siglec-G defizienten Maus (allotypischer Marker
- 49 -
Ergebnisse
CD45.2) i.v. injiziert. Sollte die Expansion der B1-Zellen in einer Veränderung des
Mikroenvironments begründet sein, müssten B1a-Zellen beider Allotypen gleichermaßen
expandieren.
Milz
R2: T-Zellen
10
3
58±7,0
38±5,7
R2
35±6,1
64±5,5
10
2
Thy-1
10
4
R1: B-Zellen
CD45.1+: WT
CD45.1-: Siglec-G -/-
10
0
10
1
R1
100
101
102
103
FL2-B220
104
B220
R3: B-Zellen (B2)
100 101 102 103 104
R4: B1-Zellen
10
3
61±4,4
66±9,2
37±4,0
R4
31±10,1
10
1
10
2
CD5
10
4
Milz
100 101 102 103 104
10
0
R3
100
102
103
104
FL3-B220
B220
R5: B2 +B1b-Zellen
4
10
100 101 102 103 104
R6: B1a-Zellen
R7
35±9,2
10
R7: T-Zellen
26.10.06.062
62±7,8
26.10.06.062
89±4,3
37±6,4
60±6,7
R6
9,8±4,2
0
10
1
10
2
CD5
100 101 102 103 104
26.10.06.062
3
Periton.
101
10
R5
100
101
102
103
104
100
101
102
103
FL1-CD45.1
IgM
104
10 0
10 1
10 2
10 3
FL1-CD45.1
10 4
10 0
10 1
10 2
10 3
FL1-CD45.1
10 4
CD45.1
Abbildung 17: B1-Zellexpansion ist zellintrinsisch.
Nach dem Knochenmarktransfer wurden das Knochenmark, die Milz und die Bauchhöhle der Empfängermäuse
mittels FACS Analyse untersucht. Es wurde auf verschiedene Zellpopulationen gegated und Histogramme über
die Menge an CD45.1+ (WT) Zellen erstellt. Prozentangaben sind errechnet aus drei Mäusen mit
Standardabweichung. In rot sind Zellpopulationen gekennzeichnet, die in der Siglec-G -/- Maus signifikant
verändert sind.
Die Knochenmarkzellen wurden zwar 50:50 gemischt, allerdings wurde hier eine ungleiche
Verteilung der Stammzellen sichtbar (Abb.17). Bei allen Zelltypen in Milz und Bauchhöhle,
die in der Siglec-G-defizienten Maus keinen Phänotyp zeigten, T- Zellen und B2 B- Zellen,
trat ein 2:1 Verhältnis (WT:ko) für die wildtypischen Zellen mit dem allotypischen Marker
CD45.1 gegenüber den Siglec-G-/- Zellen auf. Bei den in der Siglec-G-defizienten Maus
veränderten Zellpopulationen kehrte sich dieses Verhältnis um. B1-Zellen der Milz zeigten
ein Verhältnis von 1:2 (WT:ko) und B1a-Zellen in der Bauchhöhle stammten in einem
Verhältnis von 1:9 (WT:ko) von der Siglec-G-/- Maus ab (Abb.17). Diese Daten
- 50 -
Ergebnisse
veranschaulichen, dass die Expansion der B1-Zellen in der Siglec-G-defizienten Maus ein
zellintrinsischer Phänotyp ist und nicht durch andere Zellen als B1-Zellen hervorgerufen
wurde.
4.3.5 B1-Zellen zeigen eine verlangsamte Generationenfolge
Um zu studieren, warum in der Siglec-G knock out Maus die B1 B- Zellpopulation stark
vermehrt ist, wurde Mäusen BrdU gefüttert. Dieses künstliche DNA-Basen-Analog wurde nur
in die DNA eingebaut, wenn sich die Zellen teilten. So konnten Unterschiede in der
Teilungsrate aufgedeckt werden.
Milz
Peritoneum
70
% BrdU positive Zellen
WT B2 Zellen
60
12
WT B1 Zellen
SiglecG-/- B2 Zellen
50
10
SiglecG-/- B1 Zellen
8
40
*
**
WT B1a Zellen
SiglecG-/- B2+B1b Zellen
SiglecG-/- B1a Zellen
6
30
*
**
20
WT B2+B1b Zellen
4
***
**
2
10
*
0
d3
d5
***
0
d8
d 12
d3
d5
d8
*
d 12
Abbildung 18: Siglec-G -/- B-Zellen zeigten einen geringeren „turnover“.
Der „turnover“ von B-Zellen aus Wildtyp und Siglec-G Mäusen wurde anhand des Einbaus von BrdU in die Zellen
gemessen. Mittels FACS Analyse wurde auf die in der Legende angegebenen Populationen gegated und den
Prozentsatz an BrdU positiven Zellen an verschiedenen Tagen gemessen. * p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 (Daten
stammen aus drei unabhängigen Experimenten)
Wie in Abbildung 18 zu sehen bauten alle B- Zellen in der Milz prinzipiell mehr BrdU ein als
Zellen der Bauchhöhle. Sie teilten sich also öfter. In der Siglec-G-defizienten Maus war der
Einbau von BrdU bei B2 und B1-Zellen sowohl in der Milz als auch in der Bauchhöhle zu
den meisten Zeitpunkten signifikant verringert (p<0,01 bis p<0,001). Das bedeutet, dass
beide Zelltypen in der Siglec-G-/- Maus eine erniedrigte Teilungsrate hatten. Bei B2-Zellen
konnte trotz dieser verringerten Teilungsrate keine Veränderung der B2 Zellzahl festgestellt
werden.
- 51 -
Ergebnisse
4.3.6 B1-Zellen entwickeln sich in der Siglec-G -/- Maus früher
Die erhöhte Anzahl an B1-Zellen in der Siglec-G defizienten Maus könnte auch durch eine
frühere Entwicklung, d.h. eine frühere Entstehung, dieser Zellen zustande kommen. Die
Entwicklung der B1-Zellen findet hauptsächlich während der Embryonalentwicklung in der
fötalen Leber statt. In Abbildung 19 ist eine Analyse der fötalen Leber (Tag 18) zu sehen.
Zellen der fötalen Leber wurden auf Anzahl der Pro- und Prä- B-Zellen hin untersucht.
WT
Siglec-G-/-
CD43
27.03.07.002
27.03.07.002
Pro B-Zellen
36%
100
101
102
103
FL3-B220
38%
104
100
101
102
103
FL3-B220
104
B220
Abbildung 19.: FACS von fötaler Leber
Tag 18 der Embryonalentwicklung
Die Analyse der fötalen Leber (Abb.19) förderte keine Unterschiede in der Population der
Pro- und Prä- B- Zellen zwischen Wildtyp und Siglec-G-defizienten Mäusen zu Tage; auch
IgM+, CD5+ Zellen wurden nicht gefunden. Darauf folgte eine Studie über die Entwicklung der
Zellzahlen von B1a-Zellen in der Milz und der Bauchhöhle von Tag 1 bis Woche 7 nach der
Geburt der Mäuse. Auch die Anzahl der B1b B- Zellen in der Bauchhöhle wurde verfolgt.
- 52 -
Ergebnisse
6
8x10
8,E+06
7,E+06
6
6x10
6,E+06
*
*
5,E+06
***
*
***
*
4x106
*
4,E+06
3,E+06
2x106
2,E+06
Alter:
d4
1w
***
2w
3w
4w
5w
6w
PC B1b
PC B1a
Spl B1
PC B1b
PC B1a
Spl B1
PC B1b
Spl B1
PC B1a
PC B1b
PC B1a
Spl B1
PC B1b
**
Spl B1
PC B1a
Spl B1
PC B1b
PC B1a
Spl B1
PC B1b
PC B1a
Spl B1
PC B1a
d1
PC B1b
Spl B1
Spl B1
0
0,E+00
**
*
PC B1a
**
1,E+06
PC B1b
Zellzahl
*
*
WT
SiglecG-/-
7w
Abbildung 20: Siglec-G-defiziente Mäuse zeigen bereits zu frühen Zeitpunkten eine starke B1Zellexpansion.
Die kinetische Analyse der Entwicklung von B1-, B1a- und B1b-Zellen in Wildtyp und Siglec-G defizienten
Mäusen. Die totalen Zellzahlen wurden mittels Prozentzahlen aus der FACS Analyse und der Gesamtzellzahl der
jeweiligen Organe berechnet. Für jeden Zeitpunkt und Mauslinie wurden zwei Mäuse verwendet. * p<0,05;
**p<0,01; ***p<0,001
Wie in Abbildung 20 gezeigt, konnte in der ersten Woche ein Anstieg der B1-Zellen in der
Milz der Siglec-G-/- Mäuse festgestellt werden. Der Unterschied in der Anzahl der B1-Zellen
ist ab Tag 7 signifikant und bleibt über alle Alterstufen als signifikanter Unterschied erhalten.
Erst in der zweiten Lebenswoche konnte ein Auffüllen der Bauchhöhle mit dieser
Zellpopulation gefunden werden. Die B1-Zellen scheinen über die Milz einzuwandern. Auch
hier ist die Anzahl der B1-Zellen in der Siglec-G-/- Maus bereits signifikant erhöht im
Vergleich zu wildtypischen Maus. Die B1-Zellen der wildtypischen Maus traten ebenfalls zu
erst in der Milz auf, waren jedoch nie in so großer Zahl zu finden wie in der Siglec-G -/Maus. B1b-Zellen traten wesentlich später in der Entwicklung auf, ca. in der fünften Woche.
Ab der siebten Woche gibt es signifikant höhere Zahlen dieser Zellen in der Siglec-G
defizienten Maus. Alles in allem zeigte die Siglec-G-/- Maus, dass ihre B1-Zellen schon in
einem sehr frühen Entwicklungsstadium, nämlich bereits an Tag 7, in einer erhöhten Anzahl
vorlagen.
- 53 -
Ergebnisse
4.3.7 B1a-Zellen der Siglec-G defizienten Maus weisen einen stark
erhöhten Calcium Signalleitung auf
Siglec-G ist ein inhibitorisches Molekül, das mit CD22 verwandt ist. Da CD22 Einfluss auf die
Calcium Signalleitung hat, wurde auch die Calciumsignalleitung in Siglec-G -/- Mäusen
analysiert.
Milz
Peritoneum
B220+ CD5- Zellen
B220+ CD5+ Zellen
500
400
400 Fab2
anti IgM
26 μg/ml
300
300
Fab2 anti IgM
12.5 μg/ml
200
200
100
1
2
3
4
5
6 min
1
2
3
4
5
6 min
500
400
400
Fab2 anti IgM
7.8 μg/ml
300
300
Fab2 anti IgM
5 μg/ml
200
200
100
1
2
3
4
5
6 min
1
2
3
4
5
6 min
3
4
5
6 min
500
400
400
Fab2 anti IgM
2.6 μg/ml
300
Fab2 anti IgM
2 μg/ml
300
200
200
100
1
2
3
4
5
6 min
1
2
Siglec G -/Wildtyp
Abbildung 21: Stark erhöhte Calciumsignalleitung in B1a-Zellen der Siglec-G defizienten Mäuse
Die Calciumsignalleitung von den gezeigten Zellen wurde nach BZR Stimulation mit Fab2 anti-IgM für sechs
Minuten gemessen. Die Konzentrationen sind angegeben.
Stimuliert man B2 B- Zellen aus der Milz über den B- Zellrezeptor (BZR) kann ein
Calciumsignal gemessen wurden. Bei diesem Versuchen konnte zwischen Zellen des
Wildtyps und der Siglec-G-/- Maus kein Unterschied festgestellt werden (Abb.21). Beide
Zellpopulationen wiesen einen Calcium Fluss in der gleichen Höhe auf. Wurden allerdings
- 54 -
Ergebnisse
B1a-Zellen aus der Bauchhöhle stimuliert, zeigte der Verlust von Siglec-G starke
Auswirkungen. Das Calciumsignal ist etwa fünfmal so hoch wie in wildtypischen B1a-Zellen.
Prinzipiell zeigen B1a-Zellen eine stark reduzierte Calciumantwort. Die knock-out Maus
jedoch zeigt Calciumsignale vergleichbar mit normalen B2 B- Zellen. Siglec-G scheint nur auf
das Calciumsignal in B1a-Zellen einen Einfluss auszuüben. Ähnliche Ergebnisse wurden mit
einem anderen anti-IgM Antikörper (B7-6) erzielt (nicht gezeigt).
4.3.8 B-Zellen der Siglec-G defiziente Maus zeigen keine verstärkte
Proliferation nach BZR-Stimulation
Ein inhibitorisches Molekül wie Siglec-G könnte auch bei der Proliferation eine Rolle spielen.
Um dies invitro zu testen wurden wildtypische und knock out B2 B- Zellen aus der Milz und
B1a-Zellen aus der Bauchhöhle mit verschiedenen Stimuli stimuliert und auf die Proliferation
mittels Thymindin- Einbau geschlossen.
- 55 -
Ergebnisse
Milz B2 B Zellen
35000
***
30000
25000
20000
***
3H
Thymidin Einbau (cpm)
15000
10000
*
5000
0
35000
Peritoneum B1a B Zellen
**
30000
25000
**
*
20000
15000
*
10000
anti-CD40
LPS
anti-IgM (1.5μg)
anti-IgM (5μg)
anti-IgM (15μg)
0
Medium
5000
WT
SiglecG-/Abbildung 22: B-Zellen der Siglec-G -/- Maus proliferieren schlechter nach anti IgM Stimuli als WT BZellen.
Der Proliferationstest wurde mit sortierten B2-Zellen aus der Milz und sortierten B1a-Zellen aus der Bauchhöhle
durchgeführt. Gemessen wurde der 3H-Thymidineinbau nach Stimuli mit anti IgM, LPS und anti CD40. Die
3
eingebaute H-Thymidinmenge wurde in einem β-Counter mit freundlicher Hilfe der AG Gessner gemessen
*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
Alle B- Zellen der knock out Maus zeigten nach BZR Stimulation eine verringerte
Proliferation (Abb.22). Allerdings war die LPS- oder anti CD40-vermittelte Proliferation in
Siglec-G knock out B1a-Zellen höher, während sie in B2 B- Zellen gleich blieb. Die erhöhte
Anzahl der B1a-Zellen in der Siglec-G-/- Maus konnte somit nicht mit einer erhöhten
Proliferation erklärt werden.
- 56 -
Ergebnisse
4.3.9 B-Zellen von Siglec-G -/- zeigen nach in vitro Stimulation eine
normale Hochregulierung von Aktivierungsmarkern
Auf eine Aktivierung von B-Zellen kann auch anhand von Aktivierungsmarkern auf ihrer
Oberfläche geschlossen werden. Um dies zu untersuchen wurden B1 und B2-Zellen aus
Wildtyp und Siglec-G-/- Mäusen in Kultur genommen und stimuliert.
B1a-Zellen
Bauchhöhle
B2-Zellen
Milz
+/+
unbehandelt
α IgM
LPS
-/-
B7.2
Abbildung 23: Siglec-G Zellen zeigten keine höhere Expression von Aktivierungsmarker B7.2 (CD86)
Milz- und Zellen aus der Bauchhöhle wurden kultiviert und für 24Stunden mit anti IgM oder LPS stimuliert. Mittels
FACS Analyse wurden die Zellen dann ausgewählt (B1a-Zellen: B220+, CD5+; B2-Zellen: B220+, CD5-)und auf
die Expression des Aktivierungsmarkers B7.2 hin untersucht.
Prinzipiell konnte festgestellt werden, dass B1a-Zellen im Vergleich zu B2-Zellen mit anti IgM
Stimuli schlechter zu aktivieren sind (Abb.23). Im Gegensatz dazu ließen sich B1a-Zellen mit
LPS besser aktivieren. Vergleicht man jedoch dieselben Zellpopulationen zwischen Wildtyp
und Siglec-G-/- Mäusen, konnte kein Unterschied im Aktivierungsprofil festgestellt werden.
B2-Zellen beider Mäusetypen exprimieren den Aktivierungsmarker B7.2 (CD86) in gleicher
Höhe nach Stimulation. Das gleiche gilt für den Vergleich von B1a-Zellen in Wildtyp und
Siglec-G-/- Mäusen. Auch hier ist die Höhe der B7.2 Expression ähnlich. Der
Expressionsmarker MHC Kl.II wurde auf nicht stimulierten Zellen untersucht (wird nicht
- 57 -
Ergebnisse
gezeigt). Auch hier waren keinerlei Unterschiede festzustellen. B1a-Zellen in der Siglec-G
defizienten Maus lagen also nicht bereits voraktiviert vor.
4.3.10
Siglec-G defiziente Mäuse zeigen einen erhöhten IgM Spiegel
Da B1-Zellen mitverantwortlich sind für die Serum IgM Produktion (Berland & Wortis, 2002),
wurde der Gesamtimmunglobulinspiegel der Siglec-G-/- Maus analysiert.
IgG1
IgM
IgG2a
IgG2b
IgG3
IgA
10000
Serum Ig levels (µg/ml)
***
**
1000
100
10
WT
SiglecG-/1
Abbildung 24: Siglec-G -/- Mäuse zeigten stark erhöhten Serum IgM Spiegel
Die ELISA Analyse der Antikörpertiter im Serum wurde von je vier Mäusen pro Gruppe angefertigt. **p<0,01;
***p<0,001
Die Siglec-G-defiziente Maus zeigte wie erwartet einen ca. siebenfach erhöhten IgM
Serumspiegel, während der Serumspiegel des IgG2a Isotyps leicht erniedrigt war. Dies
könnte auf einen Defekt in der TH1- Antwort hinweisen. Alle anderen untersuchten Isotypen
sind unverändert im Vergleich zur Wildtyp Maus (Abb.24).
Ob der erhöhte IgM Serumspiegel durch eine vermehrte Produktion von IgM pro Zelle oder
durch eine größere Anzahl von IgM-sezernierenden Plasmazellen bedingt ist, wurde durch
ELISPOT
Versuche
getestet.
Im
ELISPOT
Versuch
antikörpersezernierender Zellen ausgezählt werden (Abb.25).
- 58 -
kann
die
genaue
Anzahl
Ergebnisse
IgM
sezernierende Zellen
600
Antibody
secreting cells
500
400
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
*
WT
SigG-/-
*
300
200
100
0
Milz
KM
IgG
sezernierende Zellen
WT
SigG-/-
Milz
KM
Abbildung 25: Sigelc-G -/- Mäuse zeigten eine erhöhte Anzahl an IgM-sezernierenden Zellen
Ein ELISPOT Assay wurde durchgeführt um die Zahl Antikörper-sezernierende Zellen pro 1x106 Zellen zu
erhalten. * p<0,05
In der Siglec-G defizienten Maus sind sowohl in der Milz als auch im Knochenmark
signifikant mehr IgM-sezernierende Plasmazellen vorhanden, was auch mit dem erhöhten
IgM Serumspiegel korreliert (p<0,05). Die Anzahl der IgG-sezernierenden Plasmazellen ist in
der Milz wie auch im Knochenmark mit der Wildtyp Maus vergleichbar und nicht verändert
(Abb.25).
Eine zusätzliche Bestätigung für die erhöhte Anzahl von IgM-sezernierenden Plasmazellen in
Siglec-G knock out Mäusen konnte eine histologische Analyse der Milz geben.
Wildtyp
IgM
SiglecG-/-
Sialoadhesin/ MOMA
(Florian Weisel)
Abbildung 26: Eine größere Zahl an IgM Plasmazellen wurde in der Siglec-G -/- Maus gefunden.
Es sind Milzschnitte zu sehen, die mit IgM (rot) und MOMA (grün) gefärbt wurden. Die hellroten Zellen außerhalb
der Keimzentren stellen Plasmazellen dar. Vergrößerungsfaktor: x50
Durchgeführt von Forian Weisel.
Die Schnitte der Milz zeigten bei Siglec-G-/- Mäusen eine deutliche Erhöhung von IgMhigh/bright
Zellen außerhalb der Keimzentren, was ebenfalls auf mehr IgM Plasmazellen als in der
- 59 -
Ergebnisse
wildtypischen Maus hinweist (Abb.26). In Abb.26 ist ein Beispielbild gezeigt. Insgesamt
wurden Schnitte von jeweils sechs Wildtyp und Siglec-G-defizienten Mäusen angefertigt mit
ähnlichen Ergebnissen. Die Struktur der Milz blieb dabei unverändert, d.h. die Milz zeigte
eine gewöhnliche Follikelstruktur sowie eine normale Marginalzone (durch Anfärbung der
metallophilen Makrophagen ist der marginale Sinus zu erkennen).
4.3.11
Siglec-G defiziente Mäuse zeigen leicht veränderte
Immunantworten
Die veränderte Calcium Signalleitung und die erhöhte Anzahl B1-Zellen in den knock out
Mäusen könnte auf die Immunantwort der Mäuse Auswirkungen haben. Um dies zu
überprüfen, wurden Wildtyp- und knock out Mäuse mit verschiedene Antigenen immunisiert.
4.3.11.1 Siglec-G defiziente Mäuse zeigen eine leicht verstärkte Immunantwort auf
Thymus unabhängige Typ2 Antigene
Mäuse wurden mit 1,3 Dextran immunisiert, das speziell bei B1-Zellen eine Immunantwort
hervorrufen soll (Garcia-Rozas, 1982).
Tag 0
Tag 8
Tag 5
IgG3
1000
Antigen spezifisches IgG3 [units]
Antigen spezifisches IgM [units]
IgM
WT
Siglec-G-/100
10
1
0,1
Tag 0
Tag 5
Tag 8
1000
WT
Siglec-G-/100
10
1
0,1
Tag 0
Tag 5
Tag 8
Abbildung 27: Immunisierung mit α 1,3 Dextran.
Immunisierungschema: Die Spritze stellt eine Immunisierung dar. Die Blutstropfen stehen für eine Blutentnahme
aus der Schwanzvene. Serum von immunisierten Mäusen wurde mittels ELISA auf das Vorhandensein von
antigen-spezifischen Antikörpern untersucht, hier von Isotyp IgM und IgG3. Es wurden pro Gruppe vier Mäuse
verwendet. ***p<0,001
- 60 -
Ergebnisse
Bei den knock out Mäusen lag schon an Tag 0 eine leicht erhöhter Serumspiegel an anti
Dextran Antikörpern vom IgM Isoptyp vor. IgM Antikörper sind dafür bekannt, polyreaktiv zu
sein und diese Maus hatte von Anfang an mehr von diesem Isotyp. In der frühen
Immunantwort an Tag 5 war die IgM Antwort dann signifikant verstärkt, aber nicht mehr an
Tag 8. Der IgG3 Serumspiegel blieb im Vergleich zu den immunisierten Wildtyp Mäusen
jedoch unverändert (Abb.27).
Als zweites Thymus unabhängiges Antigen (TI Type II) wurde mit TNP-Ficoll immunisiert.
Tag 0
Tag 8
Tag 5
IgM
IgG3
10000
TNP spezifisches IgG3 [units]
TNP spezifisches IgM [units]
10000
WT
1000
SiglecG-/-
100
10
Tag 0
Tag 5
1000
WT
SiglecG-/-
100
10
1
0,1
Tag 0
Tag 8
Tag 5
Tag 8
Abbildung 28: Immunsierung mit TNP-Ficoll
Immunisierungschema: Die Spritze stellt eine Immunisierung dar. Die Blutstropfen stehen für eine Blutentnahme
aus der Schwanzvene. Serum von immunisierten Mäusen wurde mittels ELISA auf das Vorhandensein von
Antigen-spezifischen Antikörpern untersucht, hier von Isotyp IgM und IgG3. Es wurden pro Gruppe vier Mäuse
verwendet.
Hier war in etwa der gleiche Verlauf zu beobachten. Die Immunantwort der Siglec-G -/Mäuse startete schon mit einer höheren Anzahl natürlicher IgM Antikörper (Abb.28). Auch in
der frühen Immunantwort auf TNP-Ficoll zeigten die Siglec-G-/- Mäuse leicht erhöhte Menge
an IgM, was aber nicht signifikant war. Nach Immunisierung mit TNP-Ficoll konnte in Bezug
auf die IgG3 Immunantwort ebenfalls kein Unterschied zwischen wildtypischen und Siglec-Gdefizienten Mäusen festgestellt werden (Abb.28).
- 61 -
Ergebnisse
4.3.11.2 Siglec-G defiziente Mäuse zeigen eine fast normale Immunantwort bei Thymus
abhängigen Antigenen
Um Veränderungen in der Thymus-abhängigen Immunantwort aufzudecken, wurden Mäuse
mit TNP-Ovalbumin an Tag 0 und Tag 14 immunisiert. Der Serumspiegel TNP-spezifischer
Antikörper der Isotypen IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgM wurde an Tag 0, Tag 7, Tag 14
und Tag 21 untersucht (Abb.29).
Tag 14
Tag 7
IgG1
Antigen spezifisches IgG2a [units]
Antigen spezifisches IgG1 [units]
Tag 0
1000
100
10
1
0,1
0,01
Tag 0
Tag 7
Tag 14
Tag 21
Tag 21
IgG2a
1000
100
10
1
Tag 0
Tag 7
Tag 14
Tag 21
Abbildung 29: Immunisierung mit TNP-OVA.
Immunisierungschema: Die Spritze stellt eine Immunisierung dar. Die Blutstropfen stehen für eine Blutentnahme
aus der Schwanzvene. Serum von immunisierten Mäusen wurde mittels ELISA auf das Vorhandensein von
antigen-spezifischen Antikörpern untersucht, hier von Isotyp IgG1 und IgG2a. Es wurden pro Gruppe vier Mäuse
verwendet. * p<0,05
Die IgG1 Antikörperantwort in der Siglec-G-/- Maus war durchweg mit der Antwort der
wildtypischen Mäuse vergleichbar. Ebenso war die IgM-, IgG2b-, IgG3-Antwort unverändert
(nicht gezeigt). Nur die IgG2a Antwort bildete hier eine Ausnahme. Schon kurz nach der
Immunisierung an Tag 7 war die Immunantwort der Siglec-G-/- Mäuse ca. fünffach verringert.
Diese verringerten Immunantworten bleiben bis zum Ende des Versuchs an Tag 21 fast
unverändert (Abb.29). Nach der zweiten Immunisierung ist bei beiden Mäuselinien eine
Verstärkung der Immunantwort zu beobachten. Allerdings war die IgG2a Antwort der SiglecG-/- Mäuse weiterhin verringert im Vergleich zur wildtypischen Maus, was auf einen
prinzipiellen Defekt in der TH1 Immunantwort hinweisen könnte. Siglec-G-/- Mäuse zeigten
demnach eine verstärkte IgM Immunantwort auf TI Antigene und eine verringerte IgG2a
Immunantwort auf TD Antigene während sich die Immunantworten der zwei Mäusegruppen
sonst nicht weiter unterschied.
- 62 -
Ergebnisse
4.3.11.3 Siglec-G-defiziente Mäuse zeigen eine normale Architektur der Milz nach
Immunisierung
Erythrozyten aus dem Schaf sind als starke Antigene für TD Immunantworten bekannt und
erzeugen eine hohe Zahl an Keimzentren. Um die Architektur der Milz Siglec-G defizienter
Mäuse im Vergleich zu Wildtyp Mäusen zu studieren, wurden beiden Gruppen von Mäusen
rote Blutkörperchen aus dem Schaf i.p. injiziert und eine histologische Analyse der Milz
(angefertigt von Florian Weisel) nach zehn Tagen durchgeführt.
Wildtyp
IgM
SiglecG-/-
Sialoadhesin/MOMA
PNA
(Florian Weisel)
Abbildung 30: Siglec-G -/- Mäuse zeigten eine normale Ausbildung von Keimzentren.
An Tag zehn nach Immunisierung mit roten Blutkörperchen aus Schafen wurden Milzschnitte angefertigt und mit
IgM (rot), MOMA (grün) und PNA (blau, Erdnuss Agglutinin) gefärbt. Vergrößerungsfaktor: x50
Durchgeführt von Florian Weisel.
Es waren in den Milzen von Siglec-G-/- Mäusen gleich viele und ebenfalls gleich große
Keimzentren entstanden (Abb.30). Wie schon in den Milzschnitten der unimmunisierten
Mäuse zu beobachten war, zeigten auch hier die Siglec-G-defizienten Mäuse eine deutlich
erhöhte Anzahl IgM positiver Plasmazellen (IgMhigh/bright). Die normale Architektur der Milz von
Siglec-G-defizienten Mäusen blieb hiervon unbetroffen.
4.3.12
Siglec-G defiziente Mäuse haben leicht erhöhte IgM
Autoantikörper
Viele genetisch-veränderte Mäuse mit einem Autoimmunphänotyp weisen eine erhöhte Zahl
an B1-Zellen auf (Sidman et al, 1986; Chan et al, 1997; Pan et al, 1999; Sato et al, 1996).
Aus diesem Grund wurden auch 50 bis 70 Wochen alte Siglec-G-/- Mäuse auf autoreaktive
Antikörper getestet.
- 63 -
Ergebnisse
4.3.12.1 Siglec-G defiziente Mäuse zeigen keine erhöhte Penetranz von anti-DNA oder
anti-nukleäre Antikörpern
Anti-doppelsträngige DNA und anti-nukleäre Antikörper des IgG-Isotyps korrelieren oft mit
einer Autoimmunerkrankung. Seren alter Siglec-G knock out Mäuse wurden im Vergleich zu
Seren alter BALB/c Wildtyp Mäusen mittels Elisa oder indirekter Immunfluoreszenz auf Hep2 Zellen von Ute Wellmann darauf getestet.
% positive Mäuse
WT
Siglec-G-/ -
IgG anti-dsDNA
IgG ANA
WT
Siglec-G-/ -
Abbildung 31: Siglec-G zeigten keine größere Anzahl von IgG Autoantikörpern
Das Diagramm zeigt die Penetranz der Autoantikörperproduktion in BALB/c Wildtyp und Siglec-G -/- Seren.
Serum von 18 wildtypischen und 8 Siglec-G -/- Mäusen (50 bis 80 Wochen alt) wurde auf anti ds-DNA IgGAntikörper mittels ELISA (oben) und IgG ANA mittels indirekter Immunofluoreszenz auf Hep-2 Zellen untersucht
(unten). Die Abbildung unten zeigt ein repräsentatives Muster von ANA der Seren. Die Seren wurden 1:50
verdünnt.
Durchgeführt von Ute Wellmann
Bei dieser Analyse konnte kein signifikanter Unterschied in der Penetranz dieser
autoreaktiven IgG Antikörper festgestellt werden (Abb.31). Überraschend war allerdings,
dass BALB/c Wildtyp Mäuse bereits eine hohe Penetranz von ca. 50% aufwiesen.
4.3.12.2 Siglec-G knock out Mäuse haben einen leicht erhöhten Titer an Rheumafaktor
Mittels Elisa kann auch die Anzahl der Antikörper ermittelt wurden, die an andere Antikörper
der Klasse IgG binden.
- 64 -
Ergebnisse
OD 492nm
***
WT
Siglec-G-/ -
Abbildung 32: Es wurden mehr Rheumafaktor Autoantikörper in Siglec-G-/- Serum gefunden.
Die Elisa Platten wurden mit Kaninchen IgG beschichtet. Die OD-Werte für anti-IgG Antikörper vom IgM Isotyp
werden hier in einer 1:100 Verdünnung gezeigt. *** p<0,001
Durchgeführt von Ute Wellmann.
Vergleicht man Seren wildtypischer Mäuse mit denen von Siglec-G-defizienten Mäusen, so
konnte eine erhöhte Anzahl an anti- IgG Antikörpern des IgM-Isotyps (Rheumafaktor)
festgestellt wurden. In den Siglec-G-defizienten Mäusen lag eine signifikant größere Menge
an diesen autoreaktiven Antikörpern im Serum vor, ohne jedoch eine Krankheit
hervorzurufen (Abb.32).
4.3.12.3 Verstärktes Auftreten von anti Erytrozyten Autoantikörpern der Siglec-G
defizienten Maus
Auch anti-Erythrozyten Antikörper spielen bei Autoimmunerkrankungen, z.B. autoimmunhämolytische Anämie, eine Rolle. Vollblut von Mäusen beider Gruppen wurde mittels FACS-
Erythrocyte-bound IgM (mfi)
Analyse auf IgM Antikörper, die an Erytrozyten gebunden vorliegen, getestet.
NZB
BALB/c
Siglec-G -/-
10 0
101
102
103
104
6
5
***
4
NZB
3
2
1
0
BALB/c
Siglec-G -/-
anti-IgM
Abbildung 33: Siglec-G-/- Mäuse zeigten mehr anti Erythrozyten Antikörper im Serum.
Anti-Erytthrozyten Autoantikörper vom IgM Isotyp wurden durch eine Färbung von Erythrozyten mit anti-IgM
Antikörper und darauf folgender FACS Analyse untersucht. Ein Beispiel ist links gezeigt. Die quantitative Analyse
der „mean fluorescence intensity“ ist rechts gezeigt. Seren von zwei NZB- Mäusen diente als Positivkontrolle.
*** p< 0,001
- 65 -
Ergebnisse
In der Siglec-G-/- Maus waren statistisch signifikant mehr anti-Erythrozyten Antikörper an die
roten Blutkörperchen gebunden als bei Wildtyp Mäusen. Allerdings zeigten die Mäuse keine
Autoimmunkrankheit. Ein autoimmun-kranker Mausstamm NZB, der hier als Positivkontrolle
diente, wies weit höhere Zahlen an Erythrozyten- gebundene IgM Antikörper auf, als die
Siglec-G-defizienten Mäuse (Abb.33).
Generell wies die Siglec-G defiziente Maus einen klar umrissenen Phänotyp auf. Dieser
Phänotyp ist vor allem auf die stark erhöhte Zahl an B1-Zellen in der Siglec-G-defizienten
Maus zurückzuführen. Siglec-G ist auf allen B-Zellen exprimiert, scheint jedoch vor allem auf
B1-Zellen seine inhibitorische Funktion auszuführen. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind
kürzlich publiziert worden (Hoffmann et al, 2007)
- 66 -
Diskussion
5 Diskussion
In dieser Arbeit wurde eine Siglec-G-defiziente Mauslinie hergestellt. Nachdem mittels
Southern Blot, RT PCR und Immunoblot festgestellt wurde, dass weder Siglec-G mRNA
noch Siglec-G Protein in der Siglec-G-/- Maus vorhanden ist, konnte mit Hilfe dieser Mäuse
die Funktion von Siglec-G aufgeklärt werden.
Sigelec-G wies ein Expressionsmuster auf, das B-Zell-restringiert war. Besonders hohe
Mengen an Siglec-G mRNA wurden in Prä-B-Zellen aus dem Knochenmark und B1a-Zellen
aus der Bauchhöhle gefunden. Auch der Phänotyp der Siglec-G-defizienten Maus wies auf
eine B-zell-spezifische Funktion von Siglec-G hin. In der Siglec-G-/- Maus wurden achtmal
mehr B1a-Zellen im Peritoneum gefunden als in der wildtypischen Maus. Diese Zellen
zeigten nach IgM Stimulation ein stark erhöhtes Calciumsignal. Korrespondierend zur
Erhöhung der B1a-Zell Anzahl wurde auch eine größere Menge an Serum IgM in diesen
Mäusen produziert, ohne dass jedoch eine gesteigerte Anzahl an IgG Autoantikörpern zu
finden war.
Siglec-G ist ein klares Ortholog zum humanen Siglec-10, das ebenfalls auf B-Zellen
exprimiert wird (Munday et al, 2001). Außerdem wird Siglec-10 noch schwach auf Monozyten
und Eosinophilen exprimiert. Auch für das murine Siglec-G lagen vor dieser Arbeit Hinweise
auf eine Expression vor allem auf B-Zellen vor (Su et al, 2004). Dieses Ergebnis wurde von
unseren RT-PCR und Immunoblot Daten gestützt. Siglec-G wurde in allen Entwicklungstufen
von B-Zellen exprimiert, mit einem Maximum in Prä-B-Zellen und B1a-Zellen. Sehr ähnliche
Ergebnisse fand eine andere Arbeitgruppe, die ebenfalls die Expression von Siglec-G mittels
RT-PCR
untersuchte
(Schebesta
et
al,
2007).
Siglec-G
ist
ein
Zielgen
des
Transkriptionsfaktor Pax5. Pax5 wird ab dem Pro-B-Zellstadium exprimiert und schaltet auch
die Expression von Siglec-G an (Schebesta et al, 2007). Damit lässt sich der hohe mRNA
Spiegel von Siglec-G in Prä-Z-Zellen nachvollziehen. Ob Siglec-G schwach auch auf
anderen Zelltypen oder Subpopulationen exprimiert wird, wie Siglec-10 im Menschen, konnte
in Ermangelung eines Antikörpers, der gegen den extrazellulären Teil von Siglec-G gerichtet
ist und in der Durchflußzytometrie eingesetzt werden kann, nicht geklärt werden.
Obwohl Siglec-G auf allen B-Zellen exprimiert ist, konnte bei der Siglec-G-/- Maus
hauptsächlich in B1a-Zellen eine Veränderung festgestellt werden. In der fötalen Leber, dem
Entstehungsort der B1 –Zellen, konnte kein Unterschied in der Zellzahl oder der Expression
von CD5 zwischen der Wildtypischen und der Siglec-G-defizienten Maus festgestellt werden.
Die Expansion der B1a-Zellen fing jedoch schon kurz nach der Geburt der Siglec-G-/- Mäuse
an. Zuerst wurden die B1 Zellen in der Milz gefunden, danach konnten sie auch in der
Bauchhöhle nachgewiesen werden. Die Milz scheint ein wichtiges Organ für die B1Zellentwicklung und Verteilung zu sein. Diese These wird auch von Wardemann et al (2002)
- 67 -
Diskussion
vertreten. In ihren Versuchen zeigte sie, dass Hox11-defiziente Mäuse, die keine Milz
besitzen, keine B1a-Zellen aufweisen. Außerdem konnte sie einen starken Rückgang der
B1a-Zellen in Bl/6 Mäusen feststellen, nachdem diesen die Milz entfernt wurde.
Die Expansion der B1-Zellpopulation in der Siglec-G-defizienten Maus könnte durch eine
höhere Teilungsrate der Zellen zustande gekommen sein. Die Teilungsrate wurde anhand
von BrdU Einbau in B2- oder B1-Zellen in Milz oder Peritoneum gemessen. Es konnte jedoch
nur eine niedrigere Teilungsrate, dargestellt durch weniger BrdU positive Zellen, bei B2- und
B1-Zellen in der Siglec-G-/- Maus sowohl in der Milz als auch in der Bauchhöhle ermittelt
werden. Auffällig war jedoch, dass auch in der Wildtyp Maus die B1-Zellen in der Bauchhöhle
immer eine niedrigere Teilungsrate hatten als dieselben Zellpopulationen in der Milz. Über
die Teilungsrate von B1 –Zellen gab es bisher nur zwei veröffentlichte Studien (Foster et al,
1991; Lentz et al, 1998). Mit einer erhöhten Teilungsrate konnte die Expansion der B1-Zellen
in der Siglec-G-/- Maus also nicht erklärt werden. Diese geringere Teilungsrate könnte auf
eine verringerte Entstehungsrate im Knochenmark hinweisen, die dadurch zustande kommt,
dass das Kompartiment in der Siglec-G-/- Maus schon komplett mit B1-Zellen gefüllt ist. Eine
andere Möglichkeit wäre, dass die Siglec-G-defizienten B-Zellen eine längere Lebensspanne
aufweisen und deshalb weniger neue Zellen gebraucht werden, um die alten zu ersetzen.
Für diese Möglichkeit sprechen erste in vitro Daten von Julia Jellusova.
Neben einer veränderten Lebensspanne könnte auch das Antikörper-Repertoire der
Siglec-G-/- B1a-Zellen gegenüber dem wildtypischen Repertoire verändert sein.
Die Expansion der B1-Zellen der Siglec-G-defizienten Maus könnte mit der verstärkten
Calciumsignalleitung in diesen Zellen korreliert sein. Es sind einige genetische Defekte, die
die BZR Signalleitung betreffen, bekannt, die eine Veränderung der B1-Zellzahlen bedingen
(Berland &Wortis, 2005; Sidman et al, 1986; Chan et al, 1997; Pan et al, 1999; Sato et al,
1996). So ist in der SHP-1 defizienten Maus und der B-Zellspezifischen SHP-1-/- Maus eine
Erhöhung der B1-Zellzahlen beobachtet worden (Sidmann et al, 1986; Pao et al, 2007) SHP1 bindet an humanes Siglec-10 (Withney et al, 2001). Ob allerdings diese Bindung bei
Siglec-G stattfindet, ist noch nicht bekannt und sollte in Zukunft untersucht werden. Die
Bindung von SHP-1 konnte jedoch für andere CD33-verwandte Siglecs wie z.B. Siglec-7,
Siglec-E und CD33 selbst schon nachgewiesen werden (Ulyanova et al, 2001; Yu et al,
2001; Taylor et al, 1999).
Wichtig ist jedoch, dass mittels eines Knochenmarktransfer-Experiments nach gewiesen
werden konnte, dass die starke B1-Zellexpansion der Siglec-G-defizienten Mäuse ein zellintrinsicher Effekt ist. In der Siglec-G-/- Maus sind also die B1-Zellen selbst für die
Vermehrung der B1-Zellen verantwortlich. Das umgebende Mikromilleu und dessen andere
Zellen und z.B. deren Cytokine spielen keine Rolle bei dieser Expansion. Außerdem konnte
mit diesem Versuch gezeigt werden, dass sich B1-Zellen aus Vorläuferzellen des
- 68 -
Diskussion
Knochenmarks entwickeln können, was in der Literatur immer noch umstritten ist (Berland &
Wortis, 2002).
Normalerweise zeigen B1-Zellen eine schlechtere Calciumsignalleitung als B2-Zellen (Martin
& Kearny, 2001; Berland & Wortis, 2002). In der Siglec-G-defizienten Maus zeigten die B1Zellen jedoch eine starke Calciumsignalleitung, vergleichbar mit B2-Zellen. Siglec-G scheint
somit für die Inhibition des Calciumsignals in B1-Zellen verantwortlich zu sein. Die
hemmende Rolle von Siglec-G auf B-Zell Calciumsignale konnte auch von Julia Jellusova in
ihrer Diplomarbeit bestätigt werden. Sie konnte zeigen, dass Siglec-G auch den Calciumfluss
von DT40-Zellen inhibiert, wenn diese mit Siglec-G transfiziert wurden (Hoffman et al, 2007).
B2-Zellen der Siglec-G-defizienten Mäuse sind von einer Erhöhung des Calciumsignals nicht
betroffen, obwohl auch hier Siglec-G exprimiert wird. Das könnte an der geringeren
Expression von Siglec-G in B2-Zellen liegen. Außerdem ist CD22, auch ein Siglec, für die
Inhibition des Calciumsignals in B2-Zellen verantwortlich (Otipoby et al, 1996; Nitschke et al,
1997; O´Keefe et al, 1996; Sato et al, 1996). Interessanterweise ist CD22 jedoch an der
Inhibition des Calciumsignals in B1-Zellen nicht beteiligt (Lajaunias et al, 2002). CD22 und
Siglec-G scheinen die gleiche Funktion auszuüben – allerdings auf unterschiedlichen
Zelltypen. Der Grund dafür könnte eine differentielle Expression sein. Auch Unterschiede in
der Ligandenbindung könnten diesen Unterschied bedingen. CD22 bindet spezifisch nur
α2,6 verknüpfte Sialinsäure (Crocker et al, 2007). Außerdem wurde nachgewiesen, dass der
inhibitorische Effekt von CD22 von einer Ligandenbindung abhängt (Kelm et al, 2002; Jin et
al, 2006; Collins et al, 2006; Gosh et al, 2006). Für Siglec-G ist noch nicht bekannt, welche
Sialinsäure- Verknüpfung es bindet und ob es eine Verknüpfung spezifisch bindet oder eine
breite Bindungsspezifität vorweist. Für das humane Siglec-10 ist nachgewiesen, dass es
sowohl α2,6 als auch α2,3 verknüpfte Sialinsäure binden kann (Munday et al, 2001).
Aufgrund des erhöhten Calciumsignals in Siglec-G-/- B1-Zellen wurde untersucht, ob auch
eine erhöhte Aktivierung von intrazellulären Signalmolekülen der Calciumsignalkaskade
vorliegt (Julia Jellusova, Diplomarbeit). Es konnte jedoch keine Veränderung der ThyrosinPhosphorylierung der Moleküle PLCγ2, Syk, BTK oder BLNK in der Siglec-G-defizienten
Maus festgestellt werden (Hoffmann et al, 2007). Diese Moleküle sind auch bei der CD22-/Maus, die eine verstärkte Calciumsignalleitung in B2-Zellen aufweist, nicht verändert
(Nitschke et al, 2005). Vielleicht ist wie bei CD22 nicht die Auslösung der Calciumkaskade,
sondern die Beendigung der Calciumantwort betroffen. So reguliert CD22 die Calciumpumpe
PMCA4 (Chen et al, 2004). Da CD22 und Siglec-G beide der Familie der Siglecs angehören,
üben sie vielleicht auch hier die gleiche Funktion auf verschiedenen Zelltypen aus. Es ist
jedoch noch nicht bekannt, ob B1-Zellen die Calciumpumpe PMCA4 exprimieren.
Die CD5-defiziente Maus zeigte eine erhöhte Proliferation bei B1-Zellen und keine
Veränderung in der Calciumsignalleitung (Bikah et al, 1996). Bei der Siglec-G-/- Maus lag ein
- 69 -
Diskussion
entgegengesetzter Phänotyp vor. Hier war die IgM-vermittelte Proliferation nicht gesteigert,
das Calciumsignal allerdings war deutlich erhöht. Die CD22 -/- Maus zeigte ebenfalls keine
Erhöhung der IgM-vermittelten Proliferation (Nitschke et al, 1997). Eine gesteigerte BZR
induzierte Proliferation reicht demnach nicht aus um die B1-Zellzahlen zu erhöhen. Ein
erhöhtes Calciumsignal wie bei den Siglec-G-/- und SHP-1-/- (Pao et al, 2007) Mäusen
scheint, im Gegensatz dazu, ausreichend zu sein um eine Erhöhung der B1-Zellzahlen zu
bedingen.
B1a-Zellen sind verantwortlich für den Großteil der Sekretion von natürlichem IgM. Die
Erhöhung der B1a-Zellzahl in der Siglec-G-defizienten Maus führte also auch zu einem
erhöhten IgM-Spiegel im Serum. Es waren auch mehr IgM-Plasmazellen zu finden, die für
diesen Anstieg verantwortlich sind. Der IgG-Spiegel und die Zahl der IgG-Plasmazellen war
jedoch unverändert in der Siglec-G-/- Maus. Gleichzeitig konnte jedoch keine Erhöhung von
antigenspezifischem IgM nach Immunsierung mit TI-2 Antigenen festgestellt werden, was
unerwartet war. Allerdings sind sowohl B1a-Zellen als auch Marginalzonen B-Zellen für diese
Art der Immunantwort zuständig und die Aufgabenteilung zwischen diesen Zellpopulationen
ist noch nicht vollständig geklärt. Man weiß, dass Marginalzonen B-Zellen speziell die
Immunantwort auf TNP-Ficoll induzieren (Martin et al, 2001; Samardzic et al, 2002). Um eine
spezifische Immunantwort der B1a-Zellen zu provozieren, sollten in Zukunft Infektionsstudien
mit Pathogenen wie S. pneumoniae erfolgen, da B1-Zellen Antikörper vom T15 Isotyp
produzieren (Masmoudi et al, 1990), die eine wichtige Rolle beim Schutz gegen S.
pneumoniae spielen. (Briles et al, 1982; Yother et al, 1982).
Gleichzeitig zum erhöhten IgM-Spiegel wurde eine Erniedrigung des IgG2a Serumspiegels
entdeckt, der begleitet wurde von einem verringerten Spiegel an antigenspezifischem IgG2a
nach Immunisierung mit TD Antigenen. Dieser Befund weist auf einen Defekt in der T-Helfer
Typ1 Immunantwort hin, da dieser Antikörperisotyp hauptsächlich bei dieser Immunantwort
produziert wird (Coffmann et al, 1988). Da keine Veränderungen durch das Fehlen von
Siglec-G bei T-Zellen aufgetreten sind und auch B2-Zellen keinen deutlichen Phäotyp
gezeigt haben, könnte eine myeloide Zellpopulation, die normalerweise T-Helfer-Zellen
stimulieren, für die Erniedrigung des IgG2a Serumspigels verantwortlich sein. Ob Siglec-G
auf myeloiden Zellpopulationen exprimiert wird, konnte noch nicht getestet werden.
Die Produktion von Autoantikörpern wurde in der Vergangenheit immer wieder mit einer
erhöhten Anzahl von B1a-Zellen in Verbindung gebracht. So zeigen NZB Mäuse eine
spontane autoimmune hämolytische Anämie nach dem ihre B1-Zellzahlen angestiegen sind
(Howie et al, 1968; Hayakava et al, 1983) und auch Lupus Erythematosis bricht bei diesen
Mäusen in der Hybrib F1-generation mit NZW aus (Howie et al, 1968). Außerdem konnte
nachgewiesen werden, dass die Gabe von Wasser ip in autoimmunkranke Mäuse vom
Stamm NZB oder NZB/NZW die B1-Zellzahlen reduziert und die Autoimmunität verhindern
- 70 -
Diskussion
konnte (Murakami et al, 1995). In der Siglec-G-/- Maus sind die IgM Autoantikörper in alten
Mäusen allerdings nur leicht erhöht. Da die natürlichen IgM Antikörper aber immer leicht
polyreaktiv sind und die Siglec-G-/- Maus mehr davon besaß, ist eine leichte Erhöhung der
Autoantikörper
vom
IgM-Isotyp
damit
zu
erklären.
Siglec-G-/-
Mäuse
sind
nicht
autoimmunkrank. Sie zeigten weder einen erhöhten IgG Autoantikörperspiegel noch eine
verstärkte Penetranz dieser Antikörper. Es ist allerdings bekannt, dass BALB/c Mäuse nicht
sehr anfällig für Autoimmunkrankheiten sind und sich dieser milde Autoimmun-Phänotyp der
Siglec-G-/- Maus verstärken könnte, falls die Mutation in den BL/6 –Hintergrund
zurückgekreuzt wird (Carlucci et al, 2007). Da CD22 und Siglec-G dieselbe Funktion auf
unterschiedlichen Zelltypen auszuüben scheinen, könnte eine Kompensation des jeweils
fehlenden Moleküls möglich sein. Um diese Kompensation auszuschliessen, wurde damit
begonnen, eine CD22/Siglec-G doppel-defiziente Mauslinie zu züchten. Das Fehlen beider
inhibitorischer Moleküle könnte auch einen stärkeren Autoimmunphänotyp als in der SiglecG-defizienten Maus hervorrufen.
Die Siglec-G-defiziente Maus zeigte einen deutlichen Phänotyp im Gegensatz zu den Gendefizienten Mäusen der anderen Siglecs aus der CD33-verwanden Familie. So konnte bei
der CD33-defizienten Mauslinie (Brinkman-van der Linden et al, 2003) und der Siglec-Edefizienten Maus bisher kein Phänotyp entdeckt werden. Nur in der Siglec-F-defizienten
Mauslinie konnte in einem Modell der induzierten Lungenallergie eine verstärkte Eosinophilie
im Knochenmark und der Lunge festgestellt werden (Zhang et al, 2007). Das weist auf eine
inhibitorische Rolle von Siglec-F hin.
Abschließend kann zusammengefasst werden, dass mit Siglec-G ein neuer Inhibitor der
Calciumsignalkaskade gefunden wurde, der auf B1a-Zellen seine Funktion ausübt. Ohne
diesen Inhibitor kam es zu einem erhöhten Calciumsignal und einem starken Anstieg der B1Zellzahl, der auch einen Anstieg an Serum-IgM und Autoantikörpern von IgM-Isotyp
bedingte. Im Zuge dieser Untersuchungen konnten auch allgemeingültige Befunde über B1aZellen gemacht werden. So treten B1-Zellen in ihrer Entwicklung zu erst in der Milz auf und
erscheinen erst danach in der Bauchhöhle. Außerdem konnten wir zeigen, dass B1-Zellen
auch aus adulten Vorläuferzellen aus dem Knochenmark entstehen können. B1a-Zellen
haben deshalb eine gedämpfte Signelleitung, weil Siglec-G inhibitorisch auf das
Calciumsignal wirkt. Der genaue Mechanismus wird in weiteren Studien untersucht werden.
- 71 -
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde ein neuer inhibitorischer Rezeptor von B1-Zellen charakterisiert:
Siglec-G. Das Expressionsmuster von Siglec-G war zu Beginn der Arbeit noch weitgehend
unbekannt. Deshalb wurde es mittels RT-PCR Technik untersucht. Es wurde festgestellt,
dass Siglec-G in allen Stadien der B-Zellen exprimiert wird. Eine besonders große Menge an
Siglec-G mRNA konnte in Prä-B-Zellen und B1a-Zellen nachgewiesen werden. In T-Zellen
und sonstigen Zellen der Milz konnte bislang noch keine Siglec-G mRNA gefunden werden.
Die Siglec-G-Expression auf Proteinebene zeigte das gleiche Muster: es wurde viel SiglecG-Protein in B1a-Zellen, weniger in B2-Zellen und kein Protein in T-Zellen nachgewiesen.
Um die Funktion von Siglec-G aufzuklären, wurde erfolgreich eine Siglec-G-defiziente
Mauslinie generiert und die Mutation im Siglec-G-Gen, das Fehlen der Siglec-G-mRNA und
des Siglec-G-Proteins nachgewiesen. Der Phänotyp der Siglec-G-defizienten Maus lässt
Rückschlüsse auf eine spezifische Funktion von Siglec-G in B1-Zellen zu. Der Verlust von
Siglec-G hatte zur Folge, dass die Zellzahl der B1-Zellen sowohl in der Milz als auch in der
Bauchhöhle stark anstieg. Das ist vermutlich auf die erhöhte Calciumsignalleitung in SiglecG-defizienten B1-Zellen zurückzuführen. Begleitet wurde der starke Anstieg der Zellzahlen
und der Calciumsignalleitung von einem ebenfalls erhöhten Serumspiegel an natürlichem
und autoreaktivem IgM. Die Mäuse entwickelten jedoch keine Autoimmunität. Eine Erhöhung
der IgM-Plasmazellen konnte in der naiven Maus aber festgestellt werden. Siglec-Gdefiziente Mäuse zeigten nach Immunisierung relativ normale Immunantworten.
Ein Knochenmarkstransfer- Experiment bestätigte, dass dieser deutliche Phänotyp der B1Zellen zellintrinsisch ist. Siglec-G-defiziente Mäuse zeigten schon in der ersten
Lebenswoche größere B1-Zellzahlen als die wildtypischen Kontrollmäuse. Bei diesem
Experiment konnte auch gezeigt werden, dass B1-Zellen prinzipiell in der Entwicklung von
Mäusen zuerst in der Milz auftreten und erst danach in der Bauchhöhle zu finden sind. Die
größere Zahl an B1-Zellen in der Siglec-G-/- Maus konnte nicht mit einer stärkeren
Proliferation erklärt werden. Die Siglec-G-defizienten Zellen proliferierten schlechter als
Wildtyp Zellen nach IgM Stimuli. Außerdem zeigten die B-Zellen in der Siglec-G-/- Maus
einen niedrigeren „turnover“ als die in der Kontrollmaus, wie in einem BrdUFütterungsexperiment herausgefunden wurde. Abschließend kann festgestellt werden, dass
mit Siglec-G ein neuer inhibitorischer Rezeptor auf B1-Zellen gefunden und charakterisiert
wurde.
- 72 -
Summary
7 Summary
In this thesis a new inhibitory receptor of B1 cells was characterized. The expression pattern
of Sigelc-G was unknown so far and we examined it by RT-PCR. Siglec-G is expressed in all
phases of B cell development and shows an especially high expression in pre B cells and
B1a cells. Siglec-G expression in T cells and other splenic cells could not be detected. The
Siglec-G expression on protein level showed the same pattern: high expression of Siglec-G
in B1a cells, a lower expression in B2 cells and no expression in T cells.
To analyse the function of Siglec-G, a Siglec-G deficient mouse strain was successfully
generated and tested for the mutation in the Siglec-G gene, the loss of Siglec-G mRNA and
Protein. The phenotype of the Siglec-G deficient mice indicates a specific function of SiglecG on B1 cells. The loss of Siglec-G caused a massive increase of B1 cell numbers in spleen
as well as in peritoneal cavity. This change in cell numbers is accompanied by a strongly
increased calcium signalling in Siglec-G-/- B1a cells. The Siglec-G deficient mice also
showed an elevated number of natural IgM and auto-reactive IgM in serum. However, the
gene-deficient mice did not develop an autoimmune disease. An increase in IgM positive
plasma cell numbers was detected. Siglec-G deficient mice showed quite normal immune
responses upon immunizations.
A bone marrow transfer experiment proofed that the large B1 cell expansion is a cell intrinsic
effect. Siglec-G deficient mice show already one week after birth a higher number of B1 cells
than wild type control mice. In this experiment it was also shown that during development B1
cells can be found first in spleen and after that in the peritoneal cavity of mice. The increased
number of B1 cells in Siglec-G deficient mice could not be explained by a stronger
proliferation of these cells. The Siglec-G-/- B cells proliferated less after IgM stimuli than wild
type B cells. Besides, Siglec-G B cells showed a lower turnover than wild type B cells in an in
vivo BrdU experiment. In summary, we characterized Siglec-G as a new inhibitory receptor
on B1 cells that is responsible for the size of B1 cell population and calcium signaling in B1
cells.
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Anhang
9 Anhang
9.1 Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
ATP
Adenosintriphosphat
BAD
BCL-2 antagonist of cell death
BCR
B cell receptor
bio
Biotin
BLNK B cell linker protein
BSA
bovine serum albumin
Btk
Bruton´s Tyrosin Kinase
CD
cluster of differentiation
cDNA
copy Desoxyribonucleic acid
cy
cychrome
°C
Grad Celsius
DAG
Diacylglycerol
DMEM
Dulbeccos modifiziertes Eagels Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EDTA
Ethylendiamintetraazetat
EGFP
enhanced green fluorescent protein
Erk
extracellular signal regulated kinases
et al.
et alii/alia
F/FITC
Fluorescein isothiocyanate
FACS
fluorescence activated cell sorter
FCS
fetal calf serum
FO
follikuläre Zellen
GAP
GTPase activating protein
GFP
green fluorescent protein
GRP
guanyl releasing protein
h
hours
hi
high
HEK
human embryonic kidney
HEPES
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-2-Ethansulfonsäure
hr-GFP
humanized recombinant GFP
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Anhang
Ig
Immunoglobulin
IKK
IkB kinase
I-κB
Inhibitor von NF-kB
IRES
internal ribosome entry site
Itk
interleukin-2 inducible T cell kinase
ITIM
immunoreceptor tyrosine-based inhibition motiv
ITAM
immunoreceptor tyrosine-based activation motiv
JNK
c-Jun N-terminal kinase
KDN
2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-glactonon Säure
Konz.
Konzentration
l
Liter
lck
lymphocyte-specific protein tyrosine kinase
lo
low
LPS
Lipopolysaccharid
Lsg.
Lösung
LTR
long terminal repeat
MAG
myelin assoziiertes Glykoprotein
MAPK
mitogen activated protein kinases
MHC
major histocompatibility complex
mg
Milligram
min.
Minute
ml
Milliliter
mRNA
messenger ribonucleic acid
MZ
Marginalzonen-B-Zellen
μl
Mikroliter
μg
Mikrogram
neg.
negativ
Neu5Ac
N-Acetylneuraminsäure
Neu5Gc
N-Glykolilneuraminsäure
NF- κB
nuclear factor κB
NK
natural killer
NP
Nitrophenol
PBS
phosphat buffered Saline
PE
Phycoerythrin
Pen.
Penicilin
pH
pondus hidrogenii
PH
Plekstrin Homologie
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Anhang
PKB
Proteinkinase B
PLC
Phospholipase C
pMSCV
murine stem cell virus
puro
Puromycin
ras
rat sarcoma
RPMI
Roswell Park Memorial Institute Medium
RT
Raumtemperatur
SHP-1
Src homology 2 domain containing protein tyrosine phosphatase 1
SHIP
lipid SH2-domain-containing inositol phosphatase ?
Siglec
Sialinacid bindig immunoglobulin like lectins
SOS
son of sevenless
src
sarcoma(Schmidt-Ruppin A-2) ?
Strep.
Streptomycin
syk
spleen tyrosine kinase
Y
Tyrosin
T
Threonin
T1
transitionelle Zellen vom Typ1
T2
transitionelle Zellen vom Typ2
TdT
terminal deoxynucleotidyl transferase
TI
thymus independent
TNP
Trinitrophenyl
Tyr
Tyrosin
UNLB
unlabeled
VSV-G
G glycoprotein des vesikulären Stomatitis Virus
WT
Wildtyp
z.B.
zum Beispiel
zap70
zeta chain associated protein of 70kDa
zeo
Zeocin
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Anhang
9.2 Publikationen
Anja Hoffmann, Sheena Kerr, Julia Jellusova, Jiquan Zhang, Florian Weisel, Ute Wellmann,
Thomas H. Winkler, Burkhard Kneitz, Paul R. Crocker, Lars Nitschke
Siglec-G is a novel B1-cell inhibitory receptor which controls B1 cell expansion and regulates
calcium signaling specifically in B1 cells
Nat. Immunol. 8, 695-704 (2007)
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Anhang
9.3 Lebenslauf
Anja Hoffmann
Geboren am 04. Juli 1978 in Nürnberg
Deutsche Staatsangehörigkeit
ledig
Dissertation
Seit 10/2003
Dissertation am Institut für Virologie und Immunbiologie der
Universität Würzburg und am Institut für Genetik der Universität
Erlangen-Nürnberg
• Dissertationsthema:
„Charakterisierung eines neuen inhibitorischen Rezeptors auf B1
Lymphozyten mit Hilfe von Siglec-G-defizienten Mäusen“
• Betreuung durch Prof. Dr. Lars Nitschke
Hochschulbildung
10/1997 - 05/2003
Studium der Biologie an der Universität Tübingen
Hauptfach:
Genetik
Nebenfächer: Immunologie und Pharmakologie
• Abschluss: Diplombiologin
Diplomarbeit im Institut für allgemeine Genetik der Universität
Tübingen
• Thema:
„Funktion und Expression von Vertretern der MYBTranskriptionsfaktorfamilie während der Blattseneszenz von
A.thaliana“
• Betreuung durch PD Dr. Ulrike Zentgraf
11/1997 – 05/2003
Studiumsbegleitende Tätigkeit:
Mitarbeit bei ESSO Station West (Bernd Genkinger) in Tübingen
Auslandsaufenthalt
08/1996 – 09/1997
Aufenthalt in Detroit, MI, USA
als Au pair
Schulbildung
1991 – 1996
1988 – 1991
Staatl. Anerkanntes freies Mädchengymnasium
Heimschule Kloster Wald
• Abschluss: Abitur
Realschule Überlingen
1987 – 1988
Grund- und Hauptschule Sipplingen
1984 – 1987
Nachbarschafts- Grund- und Hauptschule Fridingen a.D.
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Anhang
9.4 Danksagung
Bei meinem Betreuer Prof. Dr. Lars Nitschke möchte ich mich bedanken, für die Möglichkeit
diese Promotionsarbeit anzufertigen. Ich konnte jederzeit sein Büro stürmen, ihn mit vielen
Fragen belästigen, mich über etwas aufregen oder freuen und so weiter. Ich freue mich, dass
er sich an meine laute Art gewöhnt hat und wir sehr gut ausgekommen sind.
Herrn Prof. Dr. Andre Gessner danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens, vor allem
da er freiwillig zugesagt hat.
Herrn Prof. Dr. Georg Fey danke ich für sein Interesse an meiner Forschung und die guten
Tipps, was meine zukünftigen Bewerbungen und die wissenschaftliche Subkultur im
Allgemeinen angeht.
Ich möchte mich bei Prof. Dr. Winkler, Prof. Dr. Crocker, Prof. Dr. Kneitz, Dr. Sheena Kerr,
Dr. Jiquan Zhang, Dr. Ute Wellmann, Christian Linden, PD Dr. Slany, Dr. Bochner und Dr.
Klein für die gute Zusammenarbeit bei unserer Veröffentlichung bedanken. Besonders
bedanken möchte ich mich bei Uwe Appelt und Florian Weisel, denen ich wohl am meisten
Stress bereitet habe.
Ein riesengroßes Dankeschön gilt allen, die mich jeden tag „live“ im Labor erlebt und
ertragen haben. Allen vielen Dank für Verständnis, Hilfsbereitschaft, Unterstützung und den
Mordsspaß. Caro Dix hat mir die Arbeit mit Mäusen und die unbekannten Sphären der
FACS-Analyse schmackhaft gemacht - und das immer gut gelaunt. Shin Young war schon
als Doktorandin der beste Postdoc aller Zeiten für mich, da sie auf alle meine Fragen
Antworten hatte. Martina Döhler hat mir nicht nur gezeigt wie man ohne zu matschen
Mäusen Organe entnimmt, sondern hat auch jeden Spaß mitgemacht. Claudia Bandulet
diskutierte begeistert über Forschung und Gott und die Welt mit mir - und zwar ohne dass
dabei die Forschungsthemen langweilig wirkten. Michaela Schäfer war immer bereit mit mir
rauchen zu gehen und mir dabei bei Gejammer oder derben Späßen zuzuhören - das
ersparte mir eindeutig einen Besuch beim Psychiater. Kati Voss spielte nicht nur meine
Chauffeurin, sondern organisierte auch mein Laborleben und nahm ebenfalls an den
Gruppengesprächen zur Erhaltung meiner psychischen Gesundheit teil. Jochen Ackermann
lieferte Wissenswertes als Bereicherung für mein Allgemeinwissen, z.B. dass Bambi ein
Weißwedelhirsch ist. Julia Jellusova, Astrid Elter und Ingrid Obermeier gestalteten meine
Labortage auf die ein oder andere Weise interessant. Allen Mitarbeitern der AG Fey und der
AG Slany danke ich für die stete Hilfsbereitschaft, Freundlichkeit und gute Laune.
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Anhang
Ganz besonders danken möchte ich meiner Familie. Meiner Mutter danke ich für die
großartige Unterstützung in allen Lebenslagen, ihr Durchhaltevermögen und dafür, dass sie
die coolste Mutter der Welt ist. Sie hat sowohl die guten als auch die schlechten Phasen der
Doktorarbeit mit mir durchlebt und begeistert mit meinen genetisch veränderten Mäusen
gespielt. Mein Vater hat mich mit dem Satz: „Natürlich machst du eine Doktorarbeit - wozu
hast du denn sonst studiert!“ zu meinem Glück quasi gezwungen - vielen Dank. Vielen Dank
auch meiner „Stiefmutter“ Maria für das Interesse an meiner Arbeit und die vielen guten
Gespräche. Meiner Tante Anny Schmich vielen Dank für die große Unterstützung.
Ein großes Dankeschön geht an meine beste Freundin Bianka, die mit Durchhalteparolen
und abenteuerlichen Zukunftsplänen meine Freude an der Doktorarbeit erhalten hat. Ohne
sie wüsste ich nicht, wo ich jetzt wäre - ganz sicher nicht hier. Danke.
An meinen Schatz Enzo Salafrica geht ein „mille grazie amore mio“ für die Unterstützung und
Aufmunterung, die er mir auch während schwierigen Zeiten entgegengebracht hat. Dank
seiner Rückenmassagen und seiner Liebe habe ich die Doktorarbeit körperlich und seelisch
unbeschadet überstanden.
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