DominikHollfelderDissertation

Durchführung eines EMS-Screens zur Identifizierung von an der
Muskelentwicklung in Drosophila melanogaster beteiligten Genen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Dominik Hollfelder
aus Coburg
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 06.12.2013
Vorsitzende/r des Promotionsorgans: Prof. Dr. Johannes Barth
Gutachter/in:
Prof. Dr. Manfred Frasch
Prof. Dr. Achim Paululat
2
Index
Index ........................................................................................................................ 3
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................. 7
Tabellenverzeichnis .................................................................................................. 9
Abkürzungen ........................................................................................................... 10
1
Zusammenfassung ..................................................................................... 12
2
Einleitung .................................................................................................... 15
2.1
Muskelentwicklung in Drosophila melanogaster ............................................... 15
2.1.1
Grundlagen der frühen Mesodermentwicklung ....................................................... 17
2.1.2
Grundzüge der Entwicklung der somatischen Muskulatur ...................................... 18
2.1.3
Überblick über die Entwicklung der viszeralen Muskulatur ..................................... 19
2.1.4
Das Dorsalgefäß als Herz-Äquivalent..................................................................... 21
2.1.4.1 Aufbau des embryonalen/larvalen Fliegen-Herzes ................................................. 21
2.1.4.2 Entwicklung des Dorsalgefäßes ............................................................................. 22
2.1.4.3 Entwicklung und Funktion der Alarmuskeln ............................................................ 24
2.1.4.4 Die extrazelluläre Matrix als unterstützende Struktur bei der Organogenese.......... 25
2.2
EMS-Mutagenese-Screen und Zielsetzung dieser Arbeit .................................. 27
2.2.1
Überblick ................................................................................................................ 27
2.2.2
Die GFP-/RFP-Reporterlinien S13b16b18a.1 und S13b16c18a.1 .......................... 28
2.2.3
Spezielle Zielsetzung der Arbeit ............................................................................. 30
3
Material und Methoden ............................................................................... 31
3.1
Material ................................................................................................................. 31
3.1.1
Verwendete Geräte ................................................................................................ 31
3.1.2
Medien, Puffer und Lösungen ................................................................................ 32
3.1.3
Enzyme und Reagenzien-Kits ................................................................................ 34
3.1.4
Antikörper............................................................................................................... 34
3.1.5
Oligonukleotide ...................................................................................................... 36
3.1.6
Fliegenstämme ...................................................................................................... 39
3.1.6.1 Reporterstämme .................................................................................................... 39
3
3.1.6.2 Balancerstämme .................................................................................................... 40
3.1.6.3 Defizienz-Linien...................................................................................................... 40
3.1.6.4 Mutanten ................................................................................................................ 41
3.1.6.5 P-Element-Insertionen............................................................................................ 43
3.1.6.6 UAS- und GAL4-Linien ........................................................................................... 44
3.2
Methoden .............................................................................................................. 45
3.2.1
Arbeiten mit Drosophila melanogaster .................................................................... 45
3.2.1.1 Stammhaltung und Zucht ....................................................................................... 45
3.2.1.2 Fixierung von Drosophila-Embryonen mit Formaldehyd ......................................... 46
3.2.1.3 Hitzefixierung von Drosophila-Embryonen.............................................................. 46
3.2.1.4 EMS-Mutagenese-Screen ...................................................................................... 47
3.2.2
Molekulargenetische Arbeiten ................................................................................ 49
3.2.2.1 Herstellung chemisch kompetenter Zellen (Sambrook und Russell, 2001) ............. 49
3.2.2.2 Transformation von chemisch kompetenten Zellen (Sambrook und Russel, 2001). 50
3.2.2.3 Plasmid-Isolierung im präparativen Maßstab (Midi-Präparation) ............................ 50
3.2.2.4 Isolation von genomischer DNA aus Drosophila Embryonen .................................. 50
3.2.2.5 Isolation von genomischer DNA aus Fliegen .......................................................... 51
3.2.2.6 DNA-Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction,
PCR) ...................................................................................................................... 51
3.2.2.7 Aufreinigung von PCR-Fragmenten und Sequenzierung ........................................ 52
3.2.2.8 RNA-Sondensynthese ............................................................................................ 52
3.2.3
Histologische Methoden ......................................................................................... 53
3.2.3.1 Antikörper-DAB-Färbung nach der „Avidin-Biotinylated Enzyme Complex“Methode ................................................................................................................. 53
3.2.3.2 Immunfluoreszenzfärbung ...................................................................................... 54
3.2.3.3 Verstärkung des Signals mit dem TSA-System ...................................................... 54
3.2.3.4 Fluoreszenz in Situ Hybridisierung ......................................................................... 55
3.2.4
Mikroskopie ............................................................................................................ 56
4
Ergebnisse .................................................................................................. 57
4.1
EMS-Mutagenese-Screen des zweiten Chromosoms zur Identifizierung
neuer, an der Muskelentwicklung in Drosophila melanogaster beteiligter
Gene ...................................................................................................................... 57
4.1.1
Generierung von Muskelmutanten durch EMS-induzierte Punktmutationen ........... 57
4.1.2
Phänotypen der somatischen Muskulatur ............................................................... 59
4.1.3
Phänotypen der viszeralen Muskulatur................................................................... 64
4.1.4
Herz- und Alarmuskel-Phänotypen ......................................................................... 66
4
4.1.4.1 Phänotypen des Dorsalgefäßes ............................................................................. 66
4.1.4.2 Phänotypen der Alarmuskeln ................................................................................. 72
4.1.5
Zusammenfassung der Mutagenese-Screen-Ergebnisse ....................................... 73
4.2
Erweiterung der bisher bekannten Funktionen des FGF-Signalwegs in der
Mesoderm-Entwicklung von Drosophila durch die Analyse von EMSinduzierten Mutanten ........................................................................................... 76
4.2.1
Punkt-Mutationen im Gen pyramus führen zu Defekten in der Entwicklung des
Mesoderms ............................................................................................................ 76
4.2.2
Fehlerhafte Entwicklung der longitudinalen viszeralen Muskulatur in Mutanten
mit verringerter Aktivität der FGF-Liganden pyramus und thisbe ............................ 81
4.2.3
Verschiedene Gewebe als mögliche Quelle der FGF-Liganden für Heartless in
den LVM-Gründerzellen ......................................................................................... 87
4.2.4
Ektopische FGF-Signale sind in der Lage, die Wanderung der LVMGründerzellen neu auszurichten und deren Überleben zu fördern .......................... 88
4.3
Einfluss von Mutationen in Genen, welche für Komponenten der
extrazellulären Matrix kodieren, auf die Morphologie und Stabilität des
Herzens ................................................................................................................. 94
4.3.1
Zwei Komplementationsgruppen mit fehlerhafter Anheftung der Alarmuskeln ........ 94
4.3.2
Der Alarmuskel-Phänotyp korreliert mit der Ablösung von Perikardialzellen und
der fehlerhaften Lokalisation von ECM-Komponenten ............................................ 98
4.3.3
Die Alarmuskeln spielen eine Rolle bei der Ablösung der Perikardialzellen .......... 101
4.3.4
Identifizierung der Cg25C-Allele ........................................................................... 105
4.3.5
Identifizierung der LamininB1-Allele ..................................................................... 108
4.3.6
Genetische Interaktion zwischen den Cg25C- und LamininB1-Allelen.................. 112
4.3.7
Cg25C und LamininB1 werden in den Kardioblasten exprimiert ........................... 114
4.3.8
LanB1S0733 und Cg25CS3064 haben unterschiedlichen Einfluss auf die Ausbildung
der das Herz umgebenden extrazellulären Matrix ................................................ 117
5
Diskussion ................................................................................................ 120
5.1
Analyse EMS-induzierter Mutanten gewährt einen tieferen Einblick in
verschiedene Prozesse der Muskelentwicklung in Drosophila ...................... 120
5.1.1
Vergleich des EMS-Screens mit anderen Screen-Verfahren ................................ 121
5.1.2
Sättigung des EMS-Screens ................................................................................ 122
5.2
Der FGF-Signalweg steuert die Entwicklung des longitudinalen viszeralen
Mesoderms ......................................................................................................... 124
5.2.1
Die Heartless-Liganden pyramus und thisbe sind teilweise redundant ................. 124
5
5.2.2
FGF-Signale gewährleisten das Überleben der LVM-Gründerzellen .................... 125
5.2.3
FGF-abhängige Wanderung der LVM-Gründerzellen ........................................... 126
5.2.4
Pyr und Ths wirken vorwiegend auf kurze Distanz ............................................... 128
5.2.5
Vermutete Wirkungsweise von Pyr und Ths während der LVMGründerzellwanderung ......................................................................................... 128
5.3
Die extrazelluläre Matrix trägt entscheidend zur Morphologie und Stabilität
des Herzens bei .................................................................................................. 129
5.3.1
Alarmuskel-Ablösung als Folge einer fehlerhaften oder instabilen extrazellulären
Matrix ................................................................................................................... 129
5.3.1.1 Aminosäureaustausche in der Laminin-N-terminalen Domäne von LanB1 führen
zu Unterbrechungen im ECM-Netzwerk im Bereich des Herzens ......................... 129
5.3.1.2 Glycin-Austausche innerhalb der Kollagen IV-Trippelhelix-Domäne destabilisieren
die das Herz umgebende ECM ............................................................................ 132
5.3.1.3 Ursachen des Perikardialzellphänotyps ................................................................ 135
5.3.2
Mögliche Quellen der ECM-Komponenten Cg25C und LanB1 ............................. 136
5.3.3
Mutationen in Kollagen- und Laminin-Genen in Zusammenhang mit Defekten in
der extrazellulären Matrix in Vertebraten .............................................................. 137
6
Literatur ..................................................................................................... 140
7
Anhang ...................................................................................................... 153
Danksagung ........................................................................................................... 162
Erklärung................................................................................................................ 163
Dissertationsbezogene Publikation ..................................................................... 164
6
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Embryonale/larvale Hauptmuskeltypen in Drosophila melanogaster ............... 16
Abbildung 2: LVM-Frühentwicklung...................................................................................... 20
Abbildung 3: Aufbau des embryonalen/larvalen Drosophila-Herzens ................................... 22
Abbildung 4: Hauptkomponenten der Basalmembran .......................................................... 25
Abbildung 5: GFP-/RFP-Reporterkonstrukte ........................................................................ 29
Abbildung 6: Kreuzungsschema des EMS-Screens ............................................................. 48
Abbildung 7: Beispiele für verschiedene im Screen erhaltene Phänotypen der
somatischen Muskulatur ............................................................................. 62
Abbildung 8: Muskel-Morphologie verschiedener EMS-Allele .............................................. 63
Abbildung 9: Beispiele für gefundene Phänotypen der longitudinalen viszeralen
Muskulatur .................................................................................................. 65
Abbildung 10: Ausgewählte Beispiele für isolierte Mutanten mit Herz-Defekten in den drei
phänotypischen Hauptkategorien: „keine oder reduzierte Kardioblasten“
(B-D), „extra Kardioblasten“ (E, F) und „morphologische Defekte“ (G-L). .... 70
Abbildung 11: Analyse der Herz-Phänotypen verschiedener EMS-Linien ............................ 72
Abbildung 12: Alarmuskel-Phänotypen ................................................................................ 73
Abbildung 13: EMS-induzierte pyramus-Allele zeigen Defekte in der
Mesodermentwicklung ................................................................................ 76
Abbildung 14: Genomische Anordnung der FGF-Liganden pyramus und thisbe .................. 78
Abbildung 15: Dosis-Reduktion des FGF-Liganden pyramus führt zu Herzdefekten ............ 79
Abbildung 16: Verlust von Eve-positiven Vorläufer-Zellen im dorsalen Mesoderm von
FGF-Mutanten ............................................................................................ 80
Abbildung 17: Entwicklung der longitudinalen viszeralen Muskulatur in Mutanten mit
reduzierter FGF- Liganden-Aktivität ............................................................ 83
Abbildung 18: Wanderung der LVM-Gründerzellen in Mutanten mit reduzierter FGFLiganden-Aktivität ....................................................................................... 84
Abbildung 19: Wanderung der LVM-Vorläuferzellen in Abwesenheit beider FGF-Liganden . 86
Abbildung 20: Expression der FGF-Liganden pyramus und thisbe während der LVMGründerzellen-Wanderung und der Darmentstehung .................................. 88
Abbildung 21: Auswirkung ektopischer Expression von pyr und ths auf die LVMGründerzell-Wanderung .............................................................................. 90
Abbildung 22: Rettung und Neuausrichtung der LVM-Gründerzellwanderung in FGF8-NullMutanten durch ektopische Expression von pyr und ths ............................. 92
Abbildung 23: EMS-Linien mit Defekten in der Anheftung der Alarmuskeln Komplementationsgruppe I ......................................................................... 95
7
Abbildung 24: EMS-Linien mit Defekten in der Anheftung der Alarmuskeln Komplementationsgruppe II ........................................................................ 97
Abbildung 25: Ablösung der Perikardialzellen in LanB1S0733 und Cg25CS3064 ....................... 99
Abbildung 26: Kardioblasten-Zahl und -Polarität in Embryonen der Linien LanB1S0733 und
Cg25CS3064 ................................................................................................ 101
Abbildung 27: Anheftung der Alarmuskeln während der Bildung des Herzschlauchs ......... 103
Abbildung 28: Phänotypen verschiedener Cg25C-Allele .................................................... 106
Abbildung 29: Cg25C – genomische Region und Protein-Struktur ..................................... 107
Abbildung 30: Vergleich zwischen dem hypomorphen und amorphen LanB1-Phänotyp .... 109
Abbildung 31: LanB1 – genomische Region und Protein-Struktur ...................................... 111
Abbildung 32: Expression von Cg25C und LamininB1 im Bereich der Herzzellen .............. 115
Abbildung 33: Verteilung von ECM-Komponenten entlang des Dorsalgefäßes von Cg25Cund LanB1- Mutanten ............................................................................... 118
Abbildung 34: Austausch von konservierten Aminosäuren innerhalb der LN-Domäne ....... 130
Abbildung 35: Cg25C - Genkarte ....................................................................................... 157
Abbildung 36: LanB1 - Genkarte ........................................................................................ 159
Abbildung 37: Embryonale Expression von Cg25C und LanB1 .......................................... 161
8
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendete Geräte ............................................................................................. 31
Tabelle 2: Medien, Puffer und Lösungen.............................................................................. 33
Tabelle 3: Enzyme ............................................................................................................... 34
Tabelle 4: Reagenzien-Kits .................................................................................................. 34
Tabelle 5: Primär-Antikörper ................................................................................................ 35
Tabelle 6: Sekundär-Antikörper ........................................................................................... 36
Tabelle 7: Cg25C-Primer ..................................................................................................... 37
Tabelle 8: LanB1-Primer ...................................................................................................... 38
Tabelle 9: Reporterstämme.................................................................................................. 39
Tabelle 10: Balancerstämme ............................................................................................... 40
Tabelle 11: Defizienz-Linien ................................................................................................. 41
Tabelle 12: Mutanten ........................................................................................................... 43
Tabelle 13: P-Element-Insertionen ....................................................................................... 43
Tabelle 14: UAS- und Gal4-Linien........................................................................................ 44
Tabelle 15: EMS-Screen Statistik......................................................................................... 58
Tabelle 16: Übersicht der identifizierten EMS-Allele ............................................................. 75
Tabelle 17: Anzahl der Eve-positiven Zellkluster in Embryonen mit reduzierter FGFLiganden-Aktivität ............................................................................................ 80
Tabelle 18: Übersicht der identifizierten LanB1-Allele ........................................................ 111
Tabelle 19: Komplementationsmatrix der Cg25C- und LanB1-Mutanten ............................ 113
Tabelle 20: Erweiterte EMS-Screen-Statistik ..................................................................... 153
Tabelle 21: Komplementations-Ergebnisse – Typ IV-Kollagen ........................................... 154
Tabelle 22: Komplementations-Ergebnisse – LanB1 .......................................................... 155
Tabelle 23: Komplementations-Ergebnisse – Typ IV-Kollagen/LanB1................................ 156
9
Abkürzungen
°C
Grad Celsius
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
µM
mikromolar
bp
base pairs, Basenpaare
BSA
bovine serum albumin, Rinderserum-Albumin
C-terminal
carboxy-terminal
Cy3
Cyanin3
Cy5
Cyanin5
DAB
Diaminobenzidin
DEPC
Diethylpyrocarbonat
Df
Defizienz
DNA
deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
dsRNA
Doppelstrang-RNA
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EGFP
enhanced green fluorescent protein, verstärktes grün fluoreszierendes Protein
EtOH
Ethanol
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
g
Gramm
GFP
green fluorescent protein, grün fluoreszierendes Protein
h
Stunden
HCl
Salzsäure
Ig
Immunglobulin
l
Liter
lacZ
β-Galactosidase
LB-Medium
Luria-Bertani Bakterienmedium
(m)M
(milli)molar
MeOH
Methanol
mg
Milligramm
min
Minuten
ml
Milliliter
mRNA
messenger ribonucleic acid, Boten-RNA
nm
Nanometer
N-terminal
amino-terminal
OD600
optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600nm
PBS
phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Salzlösung
PBT
phosphatgepufferte Salzlösung mit Tween 20
RFP
red fluorescent protein, rot fluoreszierendes Protein
10
RNA
ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RNAi
RNA Interferenz
RNase
Ribonuklease
sec
Sekunden
SSC
saline sodium citrate
Taq
Thermus aquaticus
TE
Tris-EDTA-Puffer
tRNA
Transfer-RNA
Tween 20
Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat
UAS
upstream activating sequence, stromaufwärts gelegene aktivierende Sequenz
UTR
untranslated region, nicht-translatierter Bereich
upm
Umdrehungen pro Minute
v/v
Volumen pro Volumen
w/v
weight per volume, Gewicht pro Volumen
11
1 Zusammenfassung
Die Bildung der somatischen und longitudinalen viszeralen Muskulatur sowie des Herzens
erfordert eine Reihe komplexer Entwicklungsprozesse. Um ein besseres Verständnis für
diese Prozesse zu bekommen und weitere daran beteiligte Gene zu finden, wurde ein EMSMutagenese-Screen im Modelorganismus Drosophila melanogaster durchgeführt. Durch die
auf
Chromosom 2 gerichtete Mutagenese wurden insgesamt 469 Mutanten mit
Muskeldefekten isoliert. Eine Vielzahl von Mutanten, vorrangig solche mit Herzdefekten,
wurde im Verlauf dieser Arbeit aufgrund ihres Phänotyps bestimmten Genen zugeordnet.
Die exemplarische Identifizierung von Allelen erwarteter Entwicklungsgene demonstrierte die
Wirksamkeit der Mutagenese. Darüber hinaus wies die Mutantenanalyse auf bisher weniger
gut verstandene Aspekte der Muskelentwicklung hin, von denen zwei in dieser Arbeit
detaillierter untersucht wurden. Dies waren zum einen die Rolle des FGF-Signalwegs
während der Entwicklung der longitudinalen viszeralen Muskulatur (LVM) und zum anderen
die Stabilität des Herzschlauches und dessen Verknüpfung mit den daran befestigten
Alarmuskeln über Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM).
Zwei aus dem Screen isolierte Linien mit Mutationen im Gen pyramus (pyr) zeigen neben
Defekten im Herz und in der somatischen Muskulatur Unregelmäßigkeiten in der Anordnung
der Fasern der longitudinalen viszeralen Muskulatur. In Drosophila regulieren die FGF8ähnlichen Signalmoleküle Pyr und Thisbe (Ths) über den Rezeptor Heartless (Htl) unter
anderem die frühe Wanderung mesodermaler Zellen nach deren Invagination im Zuge der
Gastrulation. Durch die hier dargestellte Analyse von FGF8-Mutanten und durch
Misexpressions-Experimente konnte gezeigt werden, dass der FGF-Signalweg auch die
Wanderung der LVM-Gründerzellen entlang des viszeralen Rumpfmesoderms steuert und
deren Zelltod verhindert. In Übereinstimmung mit dieser Funktion konnte die Expression von
pyr
und
ths
entlang
des
Pfades
der
LVM-Gründerzellwanderung
im
viszeralen
Rumpfmesoderm und im Endoderm nachgewiesen werden. Des Weiteren lieferten die
Untersuchungen Hinweise darauf, dass pyr und ths teilweise redundant sind und die FGFSignale vorwiegend auf eine kurze Distanz wirken.
Bei Mutanten aus zwei anderen Komplementationsgruppen kommt es in der späten
Embryonalentwicklung zur Ablösung von Alarmuskeln und Perikardialzellen vom Herzen. Als
Ursache für diese Defekte wurden domänenspezifische Punktmutationen in Komponenten
der ECM ermittelt. Die erste Gruppe, welche aus hypomorphen Mutanten des Gens
LamininB1 (LanB1) besteht, zeichnet sich durch Aminosäureaustausche in der N-terminalen
LN-Domäne der Laminin-β-Kette aus. In diesen Mutanten werden Komponenten der HerzECM nicht ordnungsgemäß eingebaut. Linien der zweiten Gruppe, welche einen milderen
und teilweise dominant temperatursensitiven Phänotyp aufweisen, tragen Mutationen im Typ
IV-Kollagen-kodierenden Gen Cg25C. Alle hier identifizierten Cg25C-Mutationen betreffen
12
Glycin-Austausche in der Trippelhelix-bildenden Region. Lebendbeobachtungen mutanter
Cg25C- und LanB1-Embryonen zeigen, dass die Ablösung der Alarmuskeln und der
Perikardialzellen meist erst nach der Bildung des Herzschlauchs geschieht und dass die von
den Alarmuskeln ausgehende Kraft teilweise für diesen Phänotyp verantwortlich ist.
13
Summary
The formation of somatic and visceral muscles and the heart is regulated by complex
developmental processes. In order to get a better understanding of these processes, an EMS
mutagenesis screen was performed in the model organism Drosophila melanogaster.
Targeting the second chromosome, the screen has led to the isolation of 469 mutants with
muscle defects. Based on their phenotype several of the isolated mutants, especially those
with heart defects, could be assigned to particular genes.
The efficiency of the mutagenesis could be demonstrated by the isolation of alleles of
expected developmental genes. Furthermore, mutant analysis pointed towards some aspects
of muscle development that are less well understood. Two of those aspects were analyzed in
more detail, i.e. the role of the FGF signaling pathway during development of the longitudinal
visceral musculature (LVM) and the integrity of the heart tube and its connection to the
attached alary muscles via components of the extracellular matrix (ECM).
Two isolated lines harbor EMS-induced mutations in the pyramus (pyr) gene and exhibit
abnormalities in the arrangement of the LVM fibers in addition to defects in the heart and
somatic musculature. FGF signals, mediated by the FGF8-like ligands Pyr and Thisbe (Ths)
and the Heartless receptor, control early migration of the invaginated mesodermal cells at
the end of Drosophila gastrulation. The analysis of FGF8 mutants and misexpression
experiments revealed additional pro-survival and guidance functions of the FGF signaling
pathway during the migration of LVM founder cells along the trunk visceral mesoderm.
Accordingly pyr and ths expression could be detected along the path of the migrating cells in
the trunk visceral mesoderm and the endoderm. Moreover the experiments indicate that pyr
and ths are partially redundant and function mainly at short range.
Mutants from two other complementation groups display a detachment of alary muscles and
pericardial cells from the heart during late embryogenesis. These defects are caused by
domain-specific point mutations in components of the ECM. The first group consists of
hypomorphic LamininB1 (LanB1) mutants and is characterized by amino acid substitutions in
the N-terminal LN-domain of the laminin β-chain. In these mutants components of the ECM
surrounding the heart are not incorporated properly. The members of the second group,
showing a weaker and partially dominant temperature-sensitive phenotype, carry mutations
in the type IV collagen coding gene Cg25C. All Cg25C mutations lead to glycine substitutions
in the triple helix-forming domain. Live imaging of Cg25C and LanB1 mutant embryos
showed, that alary muscle detachment and dissociation of pericardial cells usually take place
after the formation of the heart tube and that the force provided by the alary muscles is in
part responsible for this phenotype.
14
2 Einleitung
2.1
Muskelentwicklung in Drosophila melanogaster
Die Erforschung der Prozesse bei der Entstehung von komplexen Organen und Geweben ist
Voraussetzung für das Verständnis von pathogenen Mechanismen, die auf genetisch
bedingten Entwicklungsdefekten beruhen. Da Experimente am Menschen schon allein unter
ethischen Gesichtspunkten nicht möglich sind, besteht die Möglichkeit, auf verschiedene
Modellorganismen zurückzugreifen. Die Taufliege Drosophila melanogaster erlaubt als
Modellorganismus aufgrund der Sequenz-Homologie vieler Gene zu Vertebraten-Genen eine
Organismus-übergreifende Forschung. Das Drosophila-Genom enthält viele Komponenten
von Signalwegen, welche auch in Vertebraten existieren, weist jedoch eine weitaus
geringere genetische Redundanz auf. Drosophila hat eine relativ geringe Generationszeit
und ist leicht zu mutagenisieren. Außerdem ist das Genom vollständig sequenziert. Die im
Vergleich zu Vertebraten relativ einfachen Strukturen sind eine ideale Voraussetzung für
histologische und genetische Studien. Das trifft auch auf die verschiedenen Muskeltypen in
der Fliege und insbesondere auf das Herz zu. Dieses liegt im Gegensatz zum gekammerten
Vertebraten-Herz als linearer Schlauch vor. Auch das Herz in Vertebraten bildet in frühen
Entwicklungsstadien zunächst einen Schlauch, so dass ein besseres Verständnis der HerzEntwicklung in Drosophila tiefere Einblicke in Entwicklung des Vertebraten-Herzens
ermöglicht.
In Drosophila gibt es drei bereits in der Larve erkennbare Hauptmuskeltypen: die
Herzmuskulatur, die somatische und die viszerale Muskulatur (Abb. 1). Das auch als
Dorsalgefäß bezeichnete Herz der Fliege ist für die Zirkulation der blutähnlichen
Körperflüssigkeit, der Hämolymphe, zuständig. Die Larve und die adulte Fliege benötigen zur
Fortbewegung die somatische Muskulatur. Diese ist am Exoskelett befestigt und wird
deshalb auch als Körperwandmuskulatur bezeichnet. In der Larve gibt es ungefähr 30
verschiedene Muskelfasern pro Segment mit jeweils unterschiedlicher Ausrichtung (siehe
auch Abb. 5B‘). Die Flugmuskulatur der ausgewachsenen Fliege zählt ebenfalls zur
somatischen Muskulatur. Bei dem dritten Hauptmuskeltyp handelt es sich um die
Darmmuskulatur, welche sich im Bereich des Mitteldarms in longitudinale und zirkuläre
Muskelfasern untergliedert. Sie ist für die peristaltischen Bewegungen des Darms
verantwortlich.
15
Abbildung 1: Embryonale/larvale Hauptmuskeltypen in Drosophila melanogaster
Vereinfachte Darstellung der drei Hauptmuskeltypen (Herz, Körperwandmuskulatur
Darmmuskulatur) in Drosophila gegen Ende der Embryonalentwicklung.
und
Um weitere Gene zu finden, welche an der Entstehung der Muskulatur beteiligt sind, wurde
ein EMS-Mutagenese-Screen durchgeführt. Das Ziel des Screens bestand darin, ein
besseres Verständnis für die während der Mesodermentwicklung ablaufenden Prozesse zu
erlangen. Diese Arbeit befasst sich im Folgenden vor allem mit der Bildung des Herzens und
seiner Verbindung mit spezialisierten somatischen Muskeln (Alarmuskeln) und der
longitudinalen viszeralen Muskulatur. Aus diesem Grund wird deren Entwicklung in den
Kapiteln 2.1.3 und 2.1.4 detaillierter beschrieben. Zunächst jedoch werden kurz einige
Grundlagen der Muskelentwicklung und die Grundzüge der Entwicklung der somatischen
Muskulatur dargelegt.
16
2.1.1
Grundlagen der frühen Mesodermentwicklung
Alle Muskelzellen gehen aus bestimmten Regionen des Mesoderms hervor. Somit zählen die
Bildung und die Unterteilung des Mesoderms zu den ersten Schritten bei der Muskelbildung.
Bereits kurz nach der Eiablage werden im Embryo ventral liegende Zellen als mesodermale
Zellen festgelegt. Diese wandern im Zuge der Invagination in den Embryo ein und bilden
eine dünne Zellschicht unterhalb des Ektoderms. Ein für die Invagination und die darauf
folgende Musterbildung und Differenzierung des Mesoderms essentieller Transkriptionsfaktor
wird von dem Gen twist (twi) codiert (Ip et al., 1992; Jiang et al., 1991). Twi aktiviert eine
Reihe von mesodermspezifischen Zielgenen, welche an den oben genannten Prozessen
beteiligt sind. Ein weiterer Transkriptionsfaktor, der vom Gen snail (sna) codiert wird,
reprimiert die Expression neuroektodermaler Gene im Bereich des späteren Mesoderms und
lässt so dessen Entstehung zu (Leptin, 1991). Nach der Einwanderung des Mesoderms auf
der ventralen Seite des gastrulierenden Embryos breitet sich dieses in Richtung dorsaler
Bereiche des Keimstreifs aus. Vor allem der über den Rezeptor Heartless aktivierte FGFSignalweg steuert nach Abschluss der Gastrulation die Wanderung der mesodermalen
Zellen und spielt außerdem eine Rolle bei der Spezifizierung einer Reihe von VorläuferZellen von Strukturen des dorsalen Mesoderms (Gisselbrecht et al., 1996; Kadam et al.,
2009; Klingseisen et al., 2009; Shishido et al., 1997). Die zwei FGF8-ähnlichen Gene
pyramus und thisbe codieren die beiden Heartless-Liganden. FGF8 kontrolliert die
Gastrulation, Herz- und Extremitätenbildung in Vertebraten (Maruoka et al., 1998). Nach der
Ausbreitung des Mesoderms erfolgt dessen Unterteilung in einen dorsalen und ventralen Teil
durch das Zusammenwirken von Signalen aus dem darüber liegenden Ektoderm und dem
mesodermal exprimierten Homeobox-Gen tinman (tin). Die ektodermalen Signale werden
durch das sekretierte Protein Decapentaplegic (Dpp) vermittelt, einem Mitglied der „Bone
morphogenetic protein“ (BMP)-Familie mit großer Ähnlichkeit zu BMP2/4 in Vertebraten
(Frasch, 1995). Aus dem dorsalen Mesoderm gehen das Herz, die viszerale Muskulatur und
die dorsalen somatischen Muskeln hervor, das ventrale Mesoderm bildet den größten Teil
der restlichen somatischen Muskulatur. Durch Wingless (Wg)- und Hedgehog (Hh)-Signale
aus dem Ektoderm erfolgt in Kombination mit Dpp und Tin eine weitere Unterteilung der
mesodermalen Parasegmente in anteriore und posteriore Domänen (Azpiazu et al., 1996).
Auf die Unterteilung des Mesoderms folgt eine Reihe weiterer, zur Muskelbildung
erforderlicher Prozesse. Dazu gehören die Spezifizierung von Vorläuferzellen, die
Diversifizierung von spezialisierten Subpopulationen, Zellwanderungen und schließlich die
Differenzierung zu funktionellen Muskeln mit definierter Identität (Beckett und Baylies, 2006;
Tixier et al., 2010). Für spätere Aspekte der Differenzierung werden Gene benötigt, welche
muskel-spezifische Strukturgene aktivieren und die Entstehung vielkerniger Muskelfasern
fördern. Ein wichtiger Vertreter dieser Gruppe ist das Gen mef-2 (Bour et al., 1995).
17
2.1.2
Grundzüge der Entwicklung der somatischen Muskulatur
Mit Ausnahme des Dorsalgefäßes bestehen alle Muskeln aus vielkernigen Muskelfasern. Für
deren Entstehung sind zwei Gruppen von Zellen notwendig, Gründerzellen und
fusionskompetente Zellen. In der frühen Embryonalentwicklung gehen aus bestimmten
Bereichen des somatischen Mesoderms Muskelvorläuferzellen hervor. Dabei sorgt die durch
den Notch-Signalweg vermittelte laterale Inhibition für die richtige Anzahl an Vorläuferzellen
(Baker und Schubiger, 1996; Corbin et al., 1991). Neben den Genen für den Rezeptor Notch
(N) und dessen Liganden Delta und Serrate sind hieran eine Vielzahl weiterer Gene beteiligt,
unter anderem beispielsweise die Gene kuzbanian (kuz) und mastermind (mam). Das Gen
kuz kodiert eine Metalloprotease, welche an der Spaltung des aktivierten Notch-Rezeptors
beteiligt ist (Fambrough et al., 1996; Lieber et al., 2002; Pan and Rubin, 1997; Sotillos et al.,
1997), und mam codiert einen Transkriptionsfaktor und Koaktivator des Signalwegs
(Petcherski und Kimble, 2000; Yedvobnick et al., 2004). Die Muskelvorläuferzellen teilen sich
und es entstehen entweder zwei Gründerzellen, oder eine Gründerzelle und eine adulte
Muskelvorläuferzelle (Knirr et al., 1999; Ruiz-Gomez and Bate, 1997). Aus den adulten
Muskelvorläuferzellen geht während der Metamorphose ein Großteil der adulten Muskulatur
hervor. Die Identität der Muskeln ist durch das Vorhandensein einer spezifischen
Kombination von
Transkriptionsfaktoren in den Gründerzellen festgelegt. Die nicht als
Vorläuferzellen determinierten Zellen werden zu fusionskompetenten Zellen. Im weiteren
Verlauf der Entwicklung fusionieren diese Zellen mit den Gründerzellen und bilden die
vielkernigen Muskelfasern. Einige der zur Fusion benötigten Gene, wie zum Beispiel blown
fuse (blow) und kette (Doberstein et al., 1997; Schröter et al., 2004) sind bereits bekannt.
Eine stabile Anheftung an die Anheftungsstellen in der Epidermis ist wichtig für die Integrität
der Muskeln. Voraussetzung dafür ist die ordnungsgemäße Wegfindung der sich
ausbreitenden Muskelfasern und die Erkennung der Anheftungsstellen. Beispielsweise sind
die wandernden Myoblasten einer Untergruppe von somatischen Muskeln durch die
Expression von kon-tiki (kon), welches ein Transmembranprotein kodiert, in der Lage, die
richtigen Anheftungsstellen zu erkennen. Vermutlich binden dort sitzende Integrine Kon über
dessen extrazelluläre Laminin-Domänen (Estrada et al., 2007; Schnorrer et al., 2007). Neben
der Anheftung sind für die Aufrechterhaltung der Integrität Faktoren von entscheidender
Bedeutung, welche die Muskeln daran hindern, in Apoptose zu gehen und zu degenerieren.
Ein Beispiel dafür ist das im somatischen und viszeralen Mesoderm exprimierte Gen mib2
(Nguyen et al., 2007).
18
2.1.3
Überblick über die Entwicklung der viszeralen Muskulatur
Die larvale viszerale Muskulatur von Drosophila besteht aus einer dünnen Schicht von
Muskelfasern,
welche
den
Verdauungstrakt
umgeben
und für
die
peristaltischen
Bewegungen des Darms verantwortlich sind. Die viszerale Muskulatur des Mitteldarms,
welcher den größten Teil des Verdauungstraktes darstellt, bildet ein Geflecht von innen
liegenden zirkulären und äußeren longitudinalen Muskelfasern (Georgias et al., 1997; Kusch
and Reuter, 1999). Die zirkulären Muskeln bilden kleine Synzytien mit je zwei Kernen. Sie
umschließen jeweils den halben Darmschlauch und sind an der dorsalen und ventralen
Mittellinie des Darms mit den Fasern der anderen Seite verbunden. Bei den longitudinalen
Muskeln handelt es sich um lange, vielkernige Fasern, welche sich über die gesamte Länge
des Mitteldarms erstrecken. Im Gegensatz zum mittleren Teil sind Vorder- und Hinterdarm
nur von zirkulären Muskeln umgeben (Lee, Zaffran und Frasch, 2006: Development of the
Larval Visceral Musculature, in Sink (2006).
In Stadium 10 existieren im Embryo elf Zellkluster innerhalb des dorsalen Mesoderms (Abb.
2A). Sie liegen zwischen den Parasegmenten 2 und 12 und enthalten sowohl alle VorläuferZellen der zirkulären viszeralen Muskeln als auch einen Teil der Zellen, welche zur Bildung
der longitudinalen Darmmuskeln beitragen. Im weiteren Verlauf der Entwicklung geht aus
den Zellklustern das viszerale Rumpfmesoderm („trunk visceral mesoderm“, TVM) hervor.
Das Gen bagpipe (bap) ist dabei für die Spezifizierung des TVM während der frühen
Mesoderm-Entwicklung verantwortlich (Azpiazu und Frasch, 1993). Es handelt sich dabei um
einen Transkriptionsfaktor der NK-Homeodomain-Familie. Eines seiner Zielgene ist biniou
(bin). Es gehört zur FoxF-Unterfamilie der Forkhead-Domain-Gene und reguliert die weitere
Differenzierung (Zaffran et al., 2001). Auch bei der Entwicklung des viszeralen Mesoderms
ist eine Unterteilung der Vorläuferzellen in Gründerzellen und fusionskompetente Zellen
notwendig. Die Gene Anaplastic lymphoma kinase (Alk) und jelly-belly (jeb) codieren
Komponenten eines Signalwegs, welcher diese Unterteilung steuert (Englund et al., 2003;
Lee et al., 2003). Alk codiert eine Rezeptor-Tyrosinkinase und wird zusammen mit bap und
bin in allen Vorläufern des TVM exprimiert. Alk-bindende Jeb-Signale aus dem ventrolateralen somatischen Mesoderm induzieren in den ventral liegenden TVM-Vorläuferzellen
das Gründerzell-Schicksal (Lee et al., 2003), die restlichen TVM-Zellen werden zu
fusionskompetenten Zellen.
Die Anlagen der viszeralen Muskulatur des Vorder- und Hinterdarms liegen in der Nähe der
anterioren und posterioren Grenzen des Mesoderms im Bereich der Einstülpungen des
Stomodeums und Proctodeums. An das Hinterdarm-Mesoderm schließt anterior das
sogenannte kaudale viszerale Mesoderm („caudal visceral mesoderm“, CVM) an, welches
die Vorläufer der longitudinalen Mitteldarm-Muskulatur („longitudinal visceral musculature“,
LVM) enthält (Kusch und Reuter, 1999; Nguyen und Xu, 1998).
19
Abbildung 2: LVM-Frühentwicklung
Entwicklung des longitudinalen viszeralen Mesoderms in den Stadien 10 bis 12. (A) Die Anlage des
CVM liegt in Stadium 10 am posterioren Ende des Keimstreifs. Die Zellen teilen sich in Stadium 11 in
zwei laterale Kluster auf und wandern auf dem TVM nach anterior (B). (C) Im späten Stadium 12
haben die CVM-Zellen das anteriore Ende des entstehenden Mitteldarms erreicht. CVM: Kaudales
viszerales Mesoderm (“caudal visceral mesoderm”); HVM: Hinterdarm-Mesoderm (“hindgut visceral
mesoderm”); TVM: viszerales Rumpfmesoderm (“trunk visceral mesoderm”) (Quelle: Lee, Zaffran und
Frasch, 2006: Development of the Larval Visceral Musculature, in Sink (2006)
Der früheste spezifische Marker für das CVM ist HLH54F, ein Twist-ähnlicher „Helix-LoopHelix“-Transkriptionsfaktor (Ismat et al., 2010). Die Zellen des CVM wandern über eine große
Distanz in Richtung anterior, bevor sie nach Fusion mit den aus dem TVM stammenden
fusionskompetenten Zellen die longitudinalen Muskeln des Mitteldarms bilden. Die ersten
Zellen verlassen während Stadium 11 ihre Position innerhalb der Anlage und spalten sich in
zwei laterale Kluster auf. Diese wandern auf beiden Seiten auf die posterioren Zellen des
TVM (Abb. 2B). Während der Wanderung beginnen die Zellen mit der Expression von
20
dumbfounded/kirre und werden zu den Gründerzellen des LVM (Ruiz-Gomez et al., 2000).
Die Wanderung der Zellen setzt sich solange fort, bis sie sich gleichmäßig über den
entstehenden Mitteldarm hinweg ausgebreitet haben (Abb. 2C). Das geschieht vorrangig
entlang des dorsalen und ventralen Rands des viszeralen Rumpfmesoderms. In diesem
Stadium fusionieren die LVM-Gründerzellen mit den übrig gebliebenen fusionskompetenten
Zellen aus dem TVM zu vielkernigen Synzytien (Klapper et al., 2002; Martin et al., 2001).
Schlussendlich verteilen sich die longitudinalen Fasern in paralleler Ausrichtung entlang der
anterior-posterioren Achse gleichmäßig um den Mitteldarm herum. Die gesamte viszerale
Muskulatur wird auch für die Ausbildung der Darmeinschnürungen und Darmschleifen an
bestimmten Positionen entlang des Mitteldarms benötigt.
2.1.4
Das Dorsalgefäß als Herz-Äquivalent
2.1.4.1 Aufbau des embryonalen/larvalen Fliegen-Herzes
In Drosophila erstreckt sich das Dorsalgefäß entlang eines Großteils der Körperachse. Eine
Gruppe von somatischen Muskeln, die Alarmuskeln, heften mit ihren dorsalen Enden an das
Herz an (Bate und Rushton, 1993; Curtis et al., 1999; Lehmacher et al., 2012). Die ventralen
Enden dieser Muskelfasern sind an jeder Segmentgrenze unterhalb der Epidermis verankert.
Das Herz besteht hauptsächlich aus zwei Zelltypen, den Kardioblasten und den
Perikardialzellen. Die Kardioblasten sind in zwei Reihen angeordnet und bilden einen
zentralen Hohlraum, welcher das Herz-Lumen darstellt (Abb. 3). In den abdominalen
Segmenten A2 bis A7 existieren jeweils sechs Paare von Kardioblasten. Vier KardioblastenPaare exprimieren tin und stellen die eigentlichen kontraktilen Zellen dar, die restlichen
Kardioblasten-Paare exprimieren seven-up (svp) und Dorsocross (Doc) (Abb. 3). Flankiert
werden die Kardioblasten von einer äußeren Reihe von nicht-kontraktilen Zellen (Rizki, 1978:
The circulatory system and associated cells and tissues, in Ashburner and Wright (1979))
(Haag et al., 1999; Rugendorff et al., 1994). Diese Zellen stehen in lockerem Kontakt mit den
Kardioblasten. Sie bilden in der thorakalen Region die Lymphdrüse, welche der Larve als
blutbildendes Organ dient. Die Zellen im abdominalen Bereich werden als Perikardialzellen
bezeichnet, ein Teil davon fungiert als Nephrozyten (Das et al., 2008; Weavers et al., 2009).
Durch die Expression bestimmter Transkriptionsfaktoren findet eine weitere Unterteilung in
Eve-/Tin-, Tin-, und Odd-skipped (Odd)-positive Perikardialzellen statt (Ward und Skeath,
2000). Der geschlossene Herzschlauch gliedert sich in einen engeren anterioren Teil, die
Aorta und einen breiteren posterioren Abschnitt, das eigentliche Herz. Eine Reihe von
homeotischen Genen, die Hox-Gene, sind für die Untergliederung des Herzschlauchs
entlang der anterior-posterioren Körperachse verantwortlich (Monier et al., 2007). Im HerzAbschnitt existieren drei Paare von einfachen Klappen, auch Ostien genannt (Rizki, 1978:
21
The circulatory system and associated cells and tissues, in Ashburner and Wright (1979))
(Molina und Cripps, 2001). Durch diese gelangt die Hämolymphe in das Dorsalgefäß und
wird dann durch die Aorta nach anterior gepumpt. Die posterioren drei Svp/Doc-positiven
Kardioblasten-Paare sind für die Ausbildung der Ostien verantwortlich.
Abbildung 3: Aufbau des embryonalen/larvalen Drosophila-Herzens
Schematische Darstellung des embryonalen/larvalen Drosophila-Herzens. Der Herzschlauch besteht
aus einer Doppelreihe von Tin- und Svp-/Doc-positiven Kardioblasten, umgeben von Perikardialzellen.
Die Lymphdrüse sitzt im Bereich der anterioren Aorta. Sieben Paare von Alarmuskeln heften an das
Herz an.
2.1.4.2 Entwicklung des Dorsalgefäßes
Aus den durch die Dpp- und Wg-Signale definierten anterioren Domänen des dorsalen
Mesoderms (siehe Kapitel 2.1.1) gehen neben den Vorläufern für die dorsalen somatischen
Muskeln die Herzzell-Vorläufer hervor (Baylies et al., 1995; Wu et al., 1995). Dabei ist das
Gen tinman essentiell für die Spezifizierung der Vorläufer des Dorsalgefäßes (Azpiazu und
Frasch, 1993; Bodmer, 1993). In Drosophila ist tin zunächst im gesamten Mesoderm
exprimiert (Azpiazu und Frasch, 1993; Bodmer et al., 1990). Nach Abschluss der dorsalen
Ausbreitung des Mesoderms beschränkt sich die Expression auf das dorsale Mesoderm.
Dpp-Signale aus dem dorsalen Ektoderm werden dazu benötigt, die Expression von tin im
dorsalen Mesoderm aufrecht zu erhalten. Kurz vor dem Rückzug des Keimstreifs findet tin22
Expression ausschließlich in den kardialen Vorläufer-Zellen statt. In dieser Phase ist tin für
die korrekte Differenzierung und Morphogenese des Herzes verantwortlich. (Bodmer et al.,
1990). Zu den kardiogenen Faktoren gehören auch die Dorsocross (Doc) T-Box-Gene Doc1,
Doc2 und Doc3, welche aus einer Gen-Duplikation entstanden und genetisch weitestgehend
redundant sind (Reim et al., 2003). Die Doc-Gene werden in Kombination mit tin dazu
benötigt, frühe Spezifizierungsprozesse kardialer Vorläufer voranzutreiben. Eine der
frühesten und wichtigsten Funktionen von Doc und tin während der Herz-Entwicklung ist die
Aktivierung des GATA-Transkriptionsfaktors Pannier (Pnr) (Reim und Frasch, 2005). Hierbei
handelt es sich um einen weiteren kritischen Faktor im Zuge der frühen Spezifizierung der
meisten kardialen Linien (Alvarez et al., 2003; Gajewski et al., 1999). Pnr hält nach der
Spezifizierung der Herzzell-Vorläufer die Expression von tin und Doc im kardialen Mesoderm
aufrecht (Reim und Frasch, 2005).
Aus dem kardialen Mesoderm entstehen im Stadium 11 in jedem Segment verschiedene
Gruppen von Herzzell-Vorläufern. Untergruppen von diesen Zellen exprimieren even-skipped
(eve), ladybird early (lbe) oder seven-up (svp). Aus den eve-exprimierenden Zellen
entstehen in jedem Hemisegment zwei Perikardialzellen und zwei dorsale Muskeln. Im
Gegensatz dazu entstehen aus den lbe-exprimierenden Vorläufern zwei Perikardialzellen
und zwei Kardioblasten. Auch aus den svp-exprimierenden Vorläufern gehen zwei
Kardioblasten und zwei Perikardialzellen hervor. Die Eve- und Lbe-positiven Vorläufer
exprimieren zusätzlich tin. Weitere Tin-positive Vorläufer-Zellen, welche weder eve noch lbe
exprimieren, generieren die letzten zwei Kardioblasten pro Hemisegment (Alvarez et al.,
2003; Han und Bodmer, 2003; Ward und Skeath, 2000). Die Herzzell-Vorläufer durchlaufen
eine Reihe von Zellteilungen und benötigen dabei unter anderem Faktoren, welche für die
asymmetrische Zellteilung wichtig sind. Komponenten des Notch-Signalwegs stellen solche
Faktoren dar. Das in Zellen der eve- und svp-Linie vorkommende membran-assoziierte
Numb-Protein wirkt der Aktivität des Notch-Rezeptors der Tochterzelle entgegen, was zu
einer asymmetrischen Lokalisation von Numb führt. Die Folge davon ist die Teilung dieser
Zellen in Kardioblasten mit uniform verteiltem Numb-Protein und Perikardialzellen mit
aktiviertem Notch-Rezeptor (Ward und Skeath, 2000).
Die Herz-Vorläufer auf beiden Seiten des Embryos bewegen sich mit fortlaufender
Entwicklung aufeinander zu und bilden den linearen Herzschlauch an der dorsalen Mittellinie.
Der Aufbau des kontraktilen Herzschlauchs findet hoch geordnet statt, indem sich die
Vorläufer der rechten und linken Seite exakt gegenüber anordnen und ein Lumen zwischen
sich bilden. Die Lumenbildung wird maßgeblich durch den Slit/Robo-Signalweg gesteuert.
Die Gene slit und roundabout (robo) werden in den Kardioblasten exprimiert (Rothberg et al.,
1990; Santiago-Martínez et al., 2006). Slit codiert ein sekretiertes Protein, das den Liganden
für den Robo-Rezeptor darstellt (Brose et al., 1999; Dickson und Gilestro, 2006; Kidd et al.,
1999; Rothberg et al., 1988). Slit-Signale werden zum einen für die Zellform-Änderung der
23
Kardioblasten,
als
auch zur
Etablierung
einer
nicht-adhärenten Lumen-formenden
Membrandomäne benötigt (Medioni et al., 2008). Durch das Verhindern eines dauerhaften
Membrankontakts wirkt der Slit/Robo-Signalweg anderen Faktoren entgegen, welche einen
Membrankontakt fördern und zur Ausbildung von Zell-Zell-Verbindungen beitragen
(Santiago-Martínez et al., 2008).
Während der Metamorphose findet eine Umgestaltung des Herzens statt (Molina und Cripps,
2001; Monier et al., 2005; Zeitouni et al., 2007). Aus der posterioren Aorta der Larve wird das
adulte Herz gebildet, der anteriore Teil der larvalen Herzkammer wird zur terminalen
Herzkammer in der Fliege. Die posterioren Segmente des larvalen Herzens werden
histolysiert. Aus den Svp-positiven Zellen der larvalen Aorta entstehen die Ostien des
adulten Herzens (Molina und Cripps, 2001). Dieses ist in vier Kammern unterteilt und besitzt
zusätzlich ein Band aus ventralen longitudinalen Muskelfasern.
In Bezug auf die verschiedenen Prozesse während der Herz-Entwicklung gibt es noch immer
offene Fragen und es gilt weitere Gene zu finden, die an diesen Prozessen beteiligt sind.
Das Gleiche trifft auf die im folgenden Kapitel vorgestellten Herz-assoziierten Alarmuskeln
zu.
2.1.4.3 Entwicklung und Funktion der Alarmuskeln
Es ist relativ wenig bekannt über die Entwicklung und Funktion der Alarmuskeln. Angaben
zur Funktion der Alarmuskeln beruhen aufgrund fehlender Daten meist auf Vermutungen.
Sehr wahrscheinlich spielen die Alarmuskeln eine Rolle bei der Verankerung des Herzens im
dorsalen Rumpfbereich (Bate und Rushton, 1993; Curtis et al., 1999). Außerdem haben sie
möglicherweise eine unterstützende Funktion bei den Kontraktionen des Dorsalgefäßes.
Bekannt ist, dass das Gen org-1 in den Vorläuferzellen der Alarmuskeln exprimiert wird und
für deren Entwicklung benötigt wird (Schaub et al., 2012). Hox-Gene kontrollieren das
Alarmuskel-Muster entlang des Dorsalgefäßes. Die Gene des Bithorax-Komplexes sind
spezifisch in den Alarmuskelfasern exprimiert. Die anterioren drei Paare exprimieren
Ultrabithorax, in den vier posterioren Paaren kann abdominal-A-mRNA nachgewiesen
werden (LaBeau et al., 2009). Die embryonalen beziehungsweise larvalen Alarmuskeln
heften an ein den Herzschlauch umgebendes ECM-Fasernetzwerk an (Lehmacher et al.,
2012) (siehe auch Kapitel 2.1.4.4). Während der Metamorphose und der Reorganisation des
Herzens findet eine Reduktion von sieben auf vier Alarmuskel-Paare statt (Molina und
Cripps, 2001).
24
2.1.4.4 Die extrazelluläre Matrix als unterstützende Struktur bei der Organogenese
Die extrazelluläre Matrix („extracellular matrix“, ECM) spielt bei der Organogenese eine
wichtige Rolle (Pastor-Pareja und Xu, 2011; Urbano et al., 2009). Sie grenzt verschiedene
Gewebe voneinander ab und dient wandernden Zellen als Substrat (Martin et al., 1999;
Urbano et al., 2011). In Drosophila trägt die ECM maßgeblich zur Entwicklung der
beschriebenen Muskeltypen bei. Sie umgibt den Herzschlauch und den Darm und dient
Muskelfasern als Anheftungspunkt (Bo et al., 2002; Brown et al., 2000; Lehmacher et al.,
2012). Im Bereich des Herzens existieren zwei verschiedene Arten von extrazellulärer
Matrix. Die Kardioblasten und Perikardialzellen sind von einer Basalmembran umgeben,
welche für die Adhäsion zwischen den Zellen verantwortlich ist (Haag et al., 1999).
Hauptkomponenten der Basalmembran in Drosophila sind Laminin, Typ IV-Kollagen,
Nidogen und Perlecan (Abb. 4).
Abbildung 4: Hauptkomponenten der Basalmembran
Schematische Darstellung des Aufbaus einer Basalmembran mit den Hauptkomponenten Laminin,
Typ IV-Kollagen, Nidogen und Perlecan (nach Alberts et al. (2007)).
Laminine sind heterotrimere kreuzförmige Moleküle, bestehend aus einer zentralen α-Kette
und den Seitenketten β und γ. Während die Seitenketten vor allem für die Quervernetzung
der Laminin-Trimere verantwortlich sind, bindet die α-Kette an Transmembran-Proteine der
Integrin-Familie. In Säugern existieren fünf verschiedene α-, vier β- und drei γ-Ketten aus
deren Kombination mindestens 15 Laminin-Trimere gebildet werden. Das Drosophila-Genom
kodiert im Gegensatz dazu nur vier Laminin-Ketten: zwei α-Ketten (α1,2 und α3,5), eine β25
und eine γ-Kette. Diese formen die zwei Laminin-Trimere LamininA (α3,5;β;γ) und LamininW
(α1,2;β;γ). Laminin A (LanA) codiert die eine α-Kette (α3,5), das Gen wing blister (wb) die
andere (α1,2) (Garrison et al., 1991; Martin et al., 1999). Die β- und γ-Kette werden von den
Genen Laminin B1 (LanB1) beziehungsweise Laminin B2 (LanB2) kodiert (Fessler et al.,
1987; Montell und Goodman, 1989). wb und LanB1 liegen auf dem zweiten Chromosom,
LanA und LanB2 auf dem dritten. Alle Laminin-Gene werden unter anderem in den
Hämozyten und im Fettkörper exprimiert (Bunt et al., 2010). Die embryonalen Hämozyten
werden zunächst im Kopf-Mesoderm gebildet und wandern von dort aus entlang
verschiedener Routen durch den gesamten Embryo. Auf ihrer Wanderung sezernieren sie
neben Laminin weitere Komponenten der extrazellulären Matrix (Fessler und Fessler, 1989;
Wood und Jacinto, 2007).
Die Laminine bilden das Grundgerüst für weitere Proteine der extrazellulären Matrix (LaBeau
et al., 2009; Urbano et al., 2009; Yurchenco und Wadsworth, 2004), vor allem für Typ IVKollagene. Dabei handelt es sich ebenfalls um heterotrimere Moleküle, die eine fibrilläre
Struktur besitzen. In Drosophila existieren zwei Typ IV-Kollagene, Cg25C und viking (vkg).
Beide Gene liegen nebeneinander in einer Kopf- an Kopf-Anordnung auf dem linken Arm des
zweiten Chromosoms. Die Kollagen-Trimere bestehen jeweils aus zwei Cg25C- und einem
vkg-Molekül (Hudson et al., 1993; Timpl, 1989). Die Expression von Cg25C und vkg kann,
wie auch die der Laminine, in den Hämozyten und im Fettkörper nachgewiesen werden
(Mirre et al., 1988; Yasothornsrikul et al., 1997), wobei vkg zusätzlich in den Perikardialzellen
exprimiert wird (Fisher et al., 2012). Zumindest im Vertebratensystem ist bekannt, dass Typ
IV-Kollagen als Heterotrimer sekretiert wird (LeBleu et al., 2007). Ein weiteres Typ IVKollagen-ähnliches Protein wird von dem auf dem dritten Chromosom liegenden Gen
Pericardin (Prc) kodiert. Prc wird in Perikardialzellen und einigen Kardioblasten exprimiert
(Chartier et al., 2002). Daneben existiert mit multiplexin ein zusätzliches im Herz exprimiertes
Kollagen-kodierendes Gen (Harpaz et al., 2013; Meyer und Moussian, 2009). Multiplexin
weist Homologie zu Kollagen XV und XVIII von Vertebraten auf.
Die ECM-Komponenten Nidogen und Perlecan stellen Verbindungen zwischen dem Typ IVKollagen- und Laminin-Netzwerk her und erhöhen die Stabilität des Kollagen-/LamininGerüsts (Aumailley et al., 1989; Fox et al., 1991; Pastor-Pareja und Xu, 2011). Auf diese
Weise beeinflussen Nidogen und Perlecan die strukturelle Integrität von Basalmembranen.
Neben ihrer strukturbildenden Funktion wurde bestimmten Komponenten der ECM
außerdem eine modulierende Funktion bei Signalprozessen zugeschrieben. Von Hämozyten
sekretiertes
Typ
IV-Kollagen
verstärkt
beispielsweise
BMP-Signale,
die
für
die
ordnungsgemäße Form und Positionierung der malpighischen Gefäße notwendig sind (Bunt
et al., 2010).
26
Bei der zweiten Form von ECM im Bereich des Herzens handelt es sich um das in Kapitel
2.1.4.3 erwähnte ECM-Fasernetzwerk, welches den Alarmuskeln als Anheftungsstelle dient.
An den Stellen, wo die Muskelfilamente enden und das aus Kollagenfasern bestehende
Netzwerk beginnt, entstehen bestimmte Anheftungszonen (Lehmacher et al., 2012). So
bildet sich ein flexibler und elastischer indirekter Zell-Zell-Kontakt zwischen den
Kardioblasten und den Alarmuskeln aus. In Kapitel 4.3 werden zwei Gruppen von EMSLinien beschrieben, in denen Gene mutiert sind, welche Matrix-Komponenten kodieren. In
diesen Linien geht der Kontakt zwischen den Alarmuskeln und dem Herz im Verlauf der
Embryonalentwicklung verloren.
2.2
EMS-Mutagenese-Screen und Zielsetzung dieser Arbeit
2.2.1
Überblick
Die Muskelentwicklung in Drosophila basiert auf einer Reihe von unterschiedlichen
morphogenetischen Prozessen. Darunter fallen Zell-Spezifizierung, Zell-Anheftung und Wanderung, sowie Zell-Differenzierung. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, ein
besseres Verständnis für die an der Entwicklung der in den vorangestellten Abschnitten
erwähnten Hauptmuskeltypen in Drosophila zu bekommen. Um neue Gene zu entdecken
oder die Funktionen bereits bekannter Gene zu erweitern, welche an oben genannten
Prozessen beteiligt sind, wurde ein EMS-Mutagenese-Screen durchgeführt. Gene können
dadurch
identifiziert
werden,
dass
Mutationen
zu
morphologisch
erkennbaren
Entwicklungsdefekten führen. Mithilfe spezieller Reporterkonstrukte wurde die Muskulatur
der generierten Mutanten auf das Vorhandensein von Defekten hin untersucht. Dabei lag der
Fokus auf Mutanten mit bestimmten Herzdefekten. Diese wurden anhand spezieller
Merkmale in verschiedene phänotypische Gruppen unterteilt.
Drosophila melanogaster besitzt vier verschiedene Chromosomen, unterteilt in ein Paar
Geschlechtschromosomen und 3 Paar Autosomen. Das X-Chromosom sowie die beiden
Arme des zweiten und dritten Chromosoms sind in etwa gleich groß, das vierte Chromosom
hingegen enthält nur wenige Gene. Bei dem in dieser Arbeit dargestellten Screen wurden
Mutationen auf dem zweiten Chromosom selektiert, welches entsprechend einem Anteil von
etwa 40% des Genoms ungefähr 5600 Gene enthält (Adams et al., 2000). FlyBase listet
zurzeit
insgesamt
ungefähr
14000
protein-kodierende
Gene
(http://flybase.org/static_pages/docs/release_notes.html). Die EMS-Mutagenese bringt eine
Reihe von Vorteilen mit sich. Mutationen werden zufällig und mit hoher Frequenz im
gesamten Genom erzeugt. Die Vielfalt dieser Mutationen reicht von hypomorphen, domänenspezifischen oder konditionellen (zum Beispiel temperatursensitiven) bis hin zu NullMutationen. Allerdings sind mit dieser Art von Screen auch einige Nachteile verbunden. Die
27
verwendete Chemikalie Ethylmethansulfonat (EMS) ist hochgradig giftig und krebserregend,
weshalb die Mutagenese unter erhöhten Sicherheitsvorkehrungen durchgeführt werden
muss. Der größte Nachteil ist die aufwendige Prozedur der molekularen Kartierung der
erzeugten Punktmutationen. Diese Kartierung wird zusätzlich durch das mögliche
Vorhandensein von mehreren Mutationen auf einem Chromosom erschwert. Durch die
Verfügbarkeit von immer mehr überlappenden Defizienzen, die inzwischen 98% der
euchromatischen Gene abdecken, sind die Möglichkeiten der Genkartierung jedoch deutlich
verbessert worden (http://flystocks.bio.indiana.edu/Browse/df/dfkit-info.htm).
Zur Durchführung eines EMS-Screen werden zunächst Fliegen einer Reporterlinie mit der
Chemikalie EMS gefüttert, um zufällige Punktmutationen, seltener Deletionen, zu erzeugen.
Mithilfe von Balancer-Chromosomen (Chromosomen, die genetische Rekombination
verhindern und das Erhalten von letalen Mutationen in einer Fliegenlinie ermöglichen) ist es
anschließend möglich, heterozygote Linien zu etablieren. Der nächste Schritt ist die Analyse
der Muskelphänotypen später Embryonalstadien mithilfe der Reporterkonstrukte und die
Selektion der Linien mit verändertem Reportermuster. Für ausgewählte Linien folgt eine
detaillierte phänotypische Analyse und die genetische Zuordnung der Mutation.
2.2.2
Die GFP-/RFP-Reporterlinien S13b16b18a.1 und S13b16c18a.1
Die Reporterlinien des der Arbeit zugrunde liegenden EMS-Screens, S13b16b18a.1 und
S13b16c18a.1, enthalten jeweils drei verschiedene Reporterkonstrukte, um Vertreter aller
Hauptmuskeltypen in Drosophila zu markieren (Abb. 5D, siehe auch Kapitel 3.1.6.1).
Das tinC*-GFP-Konstrukt steht unter der Kontrolle eines der Enhancer-Elemente im tin-Gen
(Venkatesh et al., 2000; Yin et al., 1997) und treibt die Expression von GFP in allen
Kardioblasten (Abb. 5A). Das entspricht nicht genau der endogenen tin-Expression, die auf
vier von sechs Kardioblasten-Paaren pro abdominalem Segment beschränkt ist, erwies sich
jedoch als hinreichend zur erwünschten Markierung von Kardioblasten.
Das org-1-HN18-SM-RFP-Konstrukt wurde zur Markierung einer Gruppe von somatischen
Muskeln verwendet. Es enthält ein für die somatische Expression von org-1 verantwortliches
Enhancer-Element und ist unter anderem verantwortlich für die RFP-Expression in drei
unterschiedlichen Muskeln der Körperwand-Muskulatur und den Alarmuskeln (Abb. 5B). Bei
den drei Muskeln der Körperwand-Muskulatur handelt es sich um die in den abdominalen
Segmenten A2 bis A8 vorkommenden lateralen Muskeln 5 und 8 und dem in A2 bis A7
ventral gelegenen Muskel 25 (Abb. 5B‘). Zusätzlich markiert das org-1-HN18-SM-RFPKonstrukt vier Muskeln im Thorax und in A2 bis A8 zwei laterale adulte MuskelvorläuferZellen (lAMP) pro Segment. Dabei gehen Muskel 5 und 25 bzw. 8 und mindestens ein lAMP
jeweils aus gemeinsamen Vorläuferzellen hervor.
28
Abbildung 5: GFP-/RFP-Reporterkonstrukte
Übersicht über die im Screen verwendeten GFP-/RFP-Reporterkonstrukte. (A) tinC-GFP wird in allen
Kardioblasten, schwach in manchen Perikardialzellen und in Strukturen im Kopf exprimiert. (B)
Markierung der somatischen Muskeln 5, 8 und 25, sowie der Alarmuskeln mittels org-1-HN18-SMRFP. (B‘) Schematische Darstellung der Muskeln pro larvalem Körpersegment. Die durch das
Konstrukt markierten Muskelfasern sind rot hervorgehoben. Zusätzlich sind die ebenfalls org-1-RFPpositiven lateralen AMPs eingezeichnet. (C) Expression von HLH54F-LVM-RFP in den Fasern der
LVM. (D) Dorso-laterale Ansicht der Reporterlinie S13b16c18a.1 einschließlich aller
Reporterkonstrukte.
29
Das Expressionsmuster entspricht im Wesentlichen dem in Schaub et al. (2012)
dargestellten org-1-HN39-LacZ-Reporter, welcher ein Subfragment des hier verwendeten
Enhancers trägt.
Ein drittes RFP-Reporterkonstrukt hebt die Fasern des longitudinalen viszeralen Mesoderms
hervor (Abb. 5C). Getrieben durch den HLH54F-LVM-Enhancer (HLH54Fb, (Ismat et al.,
2010)) wird RFP in allen viszeralen Längsmuskeln und in deren Vorläufern exprimiert.
2.2.3
Spezielle Zielsetzung der Arbeit
Aufgrund von zwei gefundenen Allelen des FGF-Liganden pyramus bestand das Ziel eines
Teils dieser Arbeit darin, herauszufinden, welche Rolle der FGF-Signalweg bei der
Entwicklung des longitudinalen viszeralen Mesoderms spielt. Aus diesem Grund wurden die
LVM-Phänotypen in Embryonen mit veränderter Aktivität der heartless-Liganden pyramus
und thisbe analysiert. In diesem Zusammenhang sollte auch geklärt werden, ob die LVMVorläuferzellen fehlen, oder ob Wanderungsdefekte für den Phänotyp verantwortlich sind.
Um eine Aussage darüber treffen zu können, über welche Entfernungen die FGF-Signale
wirken und welche Gewebe als mögliches Substrat für die wandernden LVM-Vorläufer in
Frage kommen, wurde außerdem die Quelle der FGF-Liganden bestimmt. Weiterhin sollte
durch eine ektopische Expression von pyramus oder thisbe geklärt werden, ob diese
künstlich bereitgestellten Signale in der Lage sind, den LVM-Phänotyp in den Mutanten zu
retten.
Ein weiteres Teilziel war die Identifizierung und nähere Charakterisierung von Mutanten mit
defekter Alarmuskel-Anheftung an das Herz. Um den Zeitpunkt zu bestimmen, an dem der
Phänotyp auftritt, wurde die Entwicklung der Embryonen verfolgt. Eine Sequenzierung der
identifizierten Cg25C- und LanB1-Allele sollte Aufschluss über die Natur der Mutationen
geben. Außerdem geht aus bisher veröffentlichten Daten nicht eindeutig hervor, ob
Kardioblasten
und/oder
Perikardialzellen
selbst
Gene
exprimieren,
welche
Matrix-
Komponenten kodieren. Da Cg25C und LanB1 jeweils eine Untereinheit des Typ IVKollagen- beziehungsweise Laminin-Trimers kodieren, wurde die Anwesenheit von Cg25Cund LanB1-mRNA in den Kardioblasten und Perikardialzellen überprüft. Nach Lehmacher et
al. (2012), dient die extrazelluläre Matrix als Ansatzstelle für die Alarmuskel-Fasern. Aus
diesem Grund wurde die Beschaffenheit der Matrix in den Cg25C- beziehungsweise LanB1Mutanten näher analysiert. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob und in welcher Weise die
verschiedenen aus dem Screen isolierten Cg25C- und LanB1-Allele genetisch interagieren.
30
3 Material und Methoden
3.1
Material
3.1.1
Verwendete Geräte
Die folgende Tabelle stellt eine Übersicht der wichtigsten während dieser Arbeit verwendeten
Geräte dar:
Autoklav
Binokulare
Heizblock
Kaltlichtquellen
Magnetrührer
PCR-Maschinen
pH-Meter
V150, Systech, Wettenberg
SMZ645, Nikon, Düsseldorf
ZSH, Olympus, Hamburg
Block Heater SBH130DC, Stuart (Bibby Scientific Limited),
Staffordshire, Großbritannien
KL 200 LED, Schott, Mainz
KL 1500 LCD, Schott, Mainz
MR3001, Heidolph, Schwabach
MR Hei-Standard, Heidolph, Schwabach
Labcycler, SensoQuest GmbH, Göttingen
PTC-100 Thermal Cycler, MJ Research, St. Bruno, Kanada
Ultra Basic, Denver Instrucment, Göttingen
C1 Platform Shaker, New Brunswich Scientific, Nürtingen
Schüttler
KS-130 basic, IKA, Staufen
Nutation mixer, VWR International, Darmstadt
Vortex
Wasserbäder
Reax top, Heidolph, Schwabach
AQUAline AL12, Lauda, Lauda-Königshofen
WPE45, Memmert, Schwabach
Centrifuge 5415 R, Eppendorf, Hamburg
Zentrifugen
Centrifuge 5424, Eppendorf, Hamburg
Mini-Spin, Eppendorf, Hamburg
Tabelle 1: Verwendete Geräte
31
3.1.2
Medien, Puffer und Lösungen
Name
Inhaltsstoffe
Ampicillin (1000x)
100mg/ml in dH2O
Block-Puffer für Antikörperfärbung
5% Kälberserum-Albumin in PBT
DAB-Lösung für Färbung
1ml PBT
70µl 10mg/ml DAB
0,3µl H2O2
DNA Gel-Ladepuffer (6x)
50mM Tris-HCl (pH 7,6)
0,25% (m/v) Bromphenolblau
0,25% (m/v) Xylene Cyanol
30% Glycerin
Fixierlösung
800µl Puffer B (5x)
800µl Formaldehyd (37%)
2,5ml dH2O
8ml Heptan
Hybridisierungslösung
50% deionisiertes Formamid
5x SSC
100µg/ml Lachs-Sperma-DNA
100µg/ml Hefe-tRNA
50µg/ml Heparin
0,1% Tween-20
pH 6,8
Karbonat-Puffer (2x)
120mM Na2CO3
80mM NaHCO3
pH 10,2
LB-Medium
20g/l LB Broth Base (Invitrogen) in dH2O
Lyse-Puffer (DNA-Isolation)
100mM Tris HCl ph9.0
100mM EDTA
1%SDS
Puffer B (5x)
50mM Kaliumphosphat-Puffer
225mM KCl
75mM NaCl
65mM MgCl2
pH 6,8
32
Name
Inhaltsstoffe
PBS (10x)
100mM Na2HPO4
20mM KH2PO4
1,37M NaCl
27mM KCl
pH 7,4
PBT
0,1% Tween-20 in PBS (1x)
„Squishing buffer“ (DNA-Isolation)
10mM Tris HCl ph7.5
1mM EDTA
25mM NaCl
200µg/ml Proteinase K
TAE-Puffer (50x) (1l)
242g Tris
57,1ml Eisessig
100ml 0,5M EDTA (pH 8,0)
Tbf I
2,94g/l Kaliumacetat
12,1g/l RbCl2
1,47g/l CaCl2
8,09g/l MnCl2 x 2H2O
15% Glycerin
pH 5,8
2,09g/l MOPS
11g/l CaCl2
Tbf II
1,2g/l RbCl2
15% Glycerin
pH 7,0
TE
10mM Tris-HCl (pH 8,0)
1mM EDTA (pH 8,0)
XB-Medium
5g/l Hefeextrakt
20g/l Trypton
5g/l MgSO4 x 7H2O
0,76g/l KCl
pH 7,6
YT-Medium (2x)
10g/l Hefeextrakt
16g/l Trypton
5g/l NaCl
Tabelle 2: Medien, Puffer und Lösungen
33
3.1.3
Enzyme und Reagenzien-Kits
Die folgenden Enzyme und molekularbiologischen Kits wurden verwendet:
Enzym
Hersteller
FastStart TaqTM DNA-Polymerase
Roche
T7 RNA-Polymerase
New England BioLabs (NEB)
Tabelle 3: Enzyme
Reagenzien-Kit
Hersteller
QIAfilterTM Plasmid Midi Kit (25)
Qiagen
QIAquick Gel Extraktion Kit (250)
Qiagen
QIAquick PCR Purification Kit (50)
Qiagen
TM
TSA
Cyanine 3 System
PerkinElmer Inc.
TSATM Fluorescein System
PerkinElmer Inc.
Vectastain elite ABC-kit
Vector Labs
Tabelle 4: Reagenzien-Kits
3.1.4
Antikörper
Es folgt eine Liste der in den Antikörperfärbungen verwendeten primären und sekundären
Antikörper mit Angabe der Spezies und Verdünnung.
Primär-Antikörper:
Antigen
Spezies
Verdünnung
Herkunft/Referenz
β-Galactosidase
Kaninchen
1:1000
Promega
Developmental Studies
β-Galactosidase (40-1a)
Maus
1:100
Hybridoma Bank
(University of Iowa)
DIG
Schaf
1:1000
Dorsocross-23
Meerschweinchen 1:1000, TSA
(Reim et al., 2003)
Even-skipped
Kaninchen
(Ismat et al., 2010)
1:5000
Roche
34
Antigen
Spezies
Verdünnung
Herkunft/Referenz
Developmental Studies
Even-skipped (2B8)
Maus
1:100
Hybridoma Bank
(University of Iowa)
Developmental Studies
Fasciclin-3 (7G10)
Maus
1:20
Hybridoma Bank
(University of Iowa)
GFP (A6455)
Kaninchen
1:2000
Invitrogen
GFP (A11120)
Maus
1:200, TSA
Invitrogen
J. Skeath, Washington
H15
Kaninchen
1:2000
University School of
Medicine, St. Louis, USA
(Leal et al., 2009)
Laminin β (ab47650)
Kaninchen
1:1000
Mef2
Kaninchen
1:1500
Abcam
H. T. Nguyen (Bour et al.,
1995)
A. Holz, Justus-Liebig-
Nidogen
Kaninchen
1:1000
Universität Gießen
(Wolfstetter et al., 2009)
Odd-Skipped
Ratte
1:600
(Kosman et al., 1998)
Developmental Studies
Pericardin (EC11)
Maus
1:10, TSA
Hybridoma Bank
(University of Iowa)
RFP
Kaninchen
1:300
Abcam
Developmental Studies
Slit (C555.6D)
Maus
1:2, TSA
Hybridoma Bank
(University of Iowa)
Tinman
Kaninchen
1:750
(Yin et al., 1997)
Tropomyosin
Ratte
1:200
Babraham Institute, UK
Developmental Studies
Wingless (4D4)
Maus
1:50
Hybridoma Bank
(University of Iowa)
Zfh-1
Kaninchen
1:1000
(Broihier et al., 1998)
Tabelle 5: Primär-Antikörper
Der Zusatz „TSA“ bei der Angabe der Verdünnung einiger Antikörper bedeutet, dass das Signal
mithilfe des TSA-Systems verstärkt worden ist (siehe Kapitel 3.2.3.3).
35
Sekundär-Antikörper:
Antigen (Modifikation)
Spezies
Verdünnung
Herkunft
Meerschweinchen IgG
Ziege
1:200
Vector Laboratories
Maus IgG (biotinyliert)
Pferd
1:500
Vector Laboratories
Maus IgG (Cy3)
Ziege
1:250
Jackson Immuno Research
Maus IgG (Cy5)
Ziege
1:500
Jackson Immuno Research
Maus IgG (FITC)
Ziege
1:500
Jackson Immuno Research
Kaninchen IgG (AP)
Ziege
1:250
Dianova
Kaninchen IgG (biotinyliert)
Ziege
1:500
Vector Laboratories
Kaninchen IgG (Cy3)
Ziege
1:250
Dianova
Kaninchen IgG (Dylight 549)
Ziege
1:250
Jackson Immuno Research
Kaninchen IgG (Dylight 649)
Ziege
1:250
Jackson Immuno Research
Kaninchen IgG (FITC)
Ziege
1:250
Jackson Immuno Research
Ratte IgG (biotinyliert)
Ziege
1:500
Vector Laboratories
Schaf IgG (biotinyliert)
Esel
1:500
Dianova
(biotinyliert)
Tabelle 6: Sekundär-Antikörper
3.1.5
Oligonukleotide
Zur Sequenzierung der Cg25C- und LanB1-Allele wurden die DNA-Sequenzen der jeweiligen
Gene in Fragmente unterteilt (siehe Abb. 35 und 36 im Anhang) und diese mithilfe der
folgenden Primerpaare amplifiziert. Die Synthese der Primer erfolgte durch die Firma
Metabion.
Cg25C Primer:
Bezeichnung
Nukleotid-Sequenz
Cg25C-F01
5'-GAG CAC GAA AAA AGT CAA AAA GCA G-3'
Cg25C-B01
5'-GAA ACA CAC ATT CAC AAC CGA GC-3'
Cg25C-F02
5’-AAG TAG TAG TCT GGT CTC GGT CCG G-3’
Cg25C-B02
5’-AAT ACT TTT TTA GGC CAT AAC TGG G-3’
Cg25C-F03
5'-TCT GGA AGC GGT AAG AAA AAT GAC-3'
Cg25C-B03
5'-TTG CTG CGG GGA AAA GGA G-3'
Cg25C-F04
5'-ACG AAG CAC AGT TCC TAA CCC TC-3'
36
Bezeichnung
Nukleotid-Sequenz
Cg25C-B04
5'-CGT CGC AAC CGT CTT TAC CG-3'
Cg25C-F05
5'-CGT GGT GAT AAG GGT GAG CG-3'
Cg25C-B05
5'-TCC TGG GGG TCC AAA GTT ACC-3'
Cg25C-F06
5'-AGA GAA GGG TGC CTC CTG CTA C-3'
Cg25C-B06
5'-GGT GTC CAA TGG GTC CGA TG-3'
Cg25C-F07
5'-CGG GTC CTC AGG GAT ACA ATG-3'
Cg25C-B07
5'-TCA CCA GGC GGT CCA GTT TG-3'
Cg25C-F08
5'-TCG GCG GCA AAT GCT CAT CG-3'
Cg25C-B08
5'-AGG TCC CTG TGG TCC AGT GTT G-3'
Cg25C-F09
5'-ACG GAG CAA AGG GCG ACA AG-3'
Cg25C-B09
5'-TTT CCA GGA GCA CCA CGG TCA C-3'
Cg25C-F10
5'-AAT GGA CAG CCT GGA CCG AG-3'
Cg25C-B10
5'-AAT CCT TGG TTA CCC TTT TCG C-3'
Cg25C-F11
5'-GCT TCT GGC TTG ACT GGC AAC-3'
Cg25C-B11
5'-TCC CTT ATC ACC ACG AAT GTC G-3'
Cg25C-F12
5'-AGG GAG AGC CTG GTC TAT CTG G-3'
Cg25C-B12
5'-GAA GCC ATC CTG TCC TGG TTG-3'
Cg25C-F13
5'-CAG GTC TTA TTG GAG CAC CCG-3'
Cg25C-B13
5'-CGT TTC CGA TTG ACT GTG TCG C-3'
Cg25C-F14
5'-GCT TGA TTG GCA TCC AGG G-3'
Cg25C-B14
5'-GGG AAA CTT CGG AAA CGC ATC-3'
Cg25C-F15
5'-ACT GTC CGA ATG GCT GGG AG-3'
Cg25C-B15
5'-ACT TAT GCT CTG TGC TGT GGG TG-3'
Cg25C-F16
5'-GTT CGA GAG GCC ACA GCA GCA GA-3'
Cg25C-B16
5'-CAG TTG AGG ATT CGA TTC GTT CGA-3'
Tabelle 7: Cg25C-Primer
Die Position der einzelnen Fragmente innerhalb des Cg25C-Gens ist in Abb. 35 im Anhang
eingetragen.
LanB1 Primer:
Bezeichnung
Nukleotid-Sequenz
LanB1-F01
5'-CTC TGT TAT CGA AGC ATC GCA AAG-3'
LanB1-B01
5'-CAG GGA GAA GGA GTG AGC GAG AC-3'
LanB1-F02
5'-ACG CAC CAG GCA ACA ACG G-3'
LanB1-B02
5'-GGA GGA TCT CTC GCA TGG ATG AG-3'
37
Bezeichnung
Nukleotid-Sequenz
LanB1-F03
5'-CGT GGA CAA GTG TAA GAG ATC CCC-3'
LanB1-B03
5'-TGA AGA CAG CCT CAT CGA AGT GAC-3'
LanB1-F04
5'-CGA TGT GAG TGT ACC CAC AAC ACC-3'
LanB1-B04
5'-TGA CGG CTG CGA TCA GGA AG-3'
LanB1-F05
5'-CGA TGC GGT TAT ACG TTA CCA GAG C-3'
LanB1-B05
5'-CAG TGA TCG CCA GTC GTC TGA TAC-3'
LanB1-F06
5'-GGA CAA CTT CTT TGG CAA TCC G-3'
LanB1-B06
5'-GCA ATT CCT ATC GGT GTT CGA TG-3'
LanB1-F07
5'-CGC TAA GTT TGT CGG GCG TTG-3'
LanB1-B07
5'-GGT GGC ACT TGT GGC AGA CTG-3'
LanB1-F08
5'-CGA TGA GGA AAC GTA TTC CGC C-3'
LanB1-B08
5'-TGC AGT GTT GGT TTT CGC TTA GAG-3'
Tabelle 8: LanB1-Primer
Die Position der einzelnen Fragmente innerhalb des LanB1-Gens ist in Abb. 36 im Anhang
eingetragen.
Zur Herstellung der Cg25C- und LanB1-RNA-Sonden wurden die folgenden Fusionsprimer
verwendet:
5'-TAATACGACTCACTATAGGTTTCCAGGAGCACCACGGTCAC-3' (T7-Cg25C-B09)
5'-TAATACGACTCACTATAGGGGTGGCACTTGTGGCAGACTG-3'
(T7-LanB1-B07)
38
3.1.6
Fliegenstämme
Eine Reihe von verschiedenen Fliegen-Stämmen wurde im Verlauf dieser Arbeit verwendet.
Die nachfolgenden Listen beinhalten die genaue Bezeichnung und Herkunft der jeweiligen
Linien.
3.1.6.1 Reporterstämme
Fliegenlinie
Referenz
HLH54Fb-lacZ-T16c
I. Reim (Enhancer wie in Ismat et al., 2010)
S13b16b18a.1 (Referenzstamm für
Mutanten S0001-S0800)
S13b16c18a.1 (Referenzstamm für
Mutanten S0801-S4600)
I. Reim
I. Reim
T13b16c18b.1
I. Reim
HCH-GFP
(Han and Olson, 2005)
handC-GFP
(Sellin et al., 2006)
trol-GFP (P{PTT-un1}trolZCL1973)
vkg-GFP (P{PTT-un1}vkgG454)
FlyTrap collection/Cooley lab (Kelso et al.,
2004)
FlyTrap collection/Cooley lab (Kelso et al.,
2004)
Tabelle 9: Reporterstämme
Die Linien S13b16b18a.1, S13b16c18a.1, sowie T13b16c18b.1 wurden als Referenzstämme
für die EMS-Linien verwendet. Diese Stämme tragen die im EMS-Screen verwendeten GFP/RFP-Reporterkonstrukte (siehe auch Kapitel 2.2.2). S13b und T13b kennzeichnen das tinCGFP-Konstrukt, S16c und T16c das HLH54F-LVM-RFP-Konstrukt und S18a/S18b, sowie
T18b stehen für das org-1-SM-RFP-Konstrukt. Die Buchstaben S und T stehen für das
zweite („second“) beziehungsweise dritte („third“) Chromosom, dem Träger-Chromosom der
Insertionen.
39
3.1.6.2 Balancerstämme
Fliegenlinie
Referenz
y*w*; Sco/CyO
M. Frasch
y*w*; Dr/TM6b, Tb
w
1118
M. Frasch
Gla-1
; In(2LR)Gla, wg
/CyO,
P{w+mC=GAL4-twi.G}2.2, P{AUS2xEGFP}AH2.2
w1118; DrMio/TM3, P{w+mC=GAL4-twi.G}2.3,
1
P{UAS-2xEGFP}AH2.3, Sb Ser
1
w1118; P{w+mC=hs-hid}2, wgSp-1/CyO
w1118; P{w+mC=hs-hid}3, Dr1/TM6B, Tb1
y* w*; hs-hid-2, Sp/CyO, twi >> EGFP
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#6662
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#6663
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#7757
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#7758
Kombination aus Bloomington#6662 und
Bloomington#7757 (I. Reim)
y*w*; hs-hid-2, Sp/CyO, twi >> EGFP;
Kombination aus y* w*; hs-hid-2, Sp/CyO,
T13b16c18b.1
twi >> EGFP und T13b16c18b.1 (I. Reim)
Tabelle 10: Balancerstämme
3.1.6.3 Defizienz-Linien
Neben einem Satz von das zweite Chromosom abdeckenden Defizienz-Linien zur Kartierung
der Mutationen wurden für die genauere Analyse der EMS-Linien in den Kapiteln 4.2 und 4.3
speziell folgenden Defizienz-Linien benutzt:
Fliegenlinie
Referenz
A. Stathopoulos , California Institute of
36
Df(2R)pyr /CyO, wg-lacZ
Technology, Pasadena, USA (Kadam et al.,
2009)
A. Stathopoulos , California Institute of
Df(2R)ths
238
/CyO, wg-lacZ
Technology, Pasadena, USA (Kadam et al.,
2009)
Df(2R)BSC25/SM6a
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#6865
40
Fliegenlinie
w1118; Df(2R)BSC259/CyO
w1118; Df(2L)BSC110/CyO
w1118; Df(2L)BSC172/CyO
w1118; Df(2L)BSC233/CyO
w1118; Df(2L)ED12527/CyO
w1118; Df(2L)Exel7022/CyO
Referenz
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#23159
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#8835
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#9605
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#9708
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#24129
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#7794
Tabelle 11: Defizienz-Linien
3.1.6.4 Mutanten
Die für Komplementationstests und zur Identifizierung der Allele verwendeten Mutanten und
P-Element-Insertionen sind in diesem und dem folgenden Kapitel aufgeführt.
Fliegenlinie
Referenz
Alk1/CyO, wg-lacZ
(Englund et al., 2003)
bib1/CyO
Dp(l2)bwD blow1 bwD/CyO
Cg25Cb9/CyO
Cg25CDTS-L3/CyO
cn1 EGFRf2 bw1 sp1/CyO
HLH54F∆598
inscP49/CyO
C452
kon
/CyO
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#1595
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#4128
M. Mink, Universität von Szeged, Ungarn
(Kelemen-Valkony et al., 2012)
M. Mink, Universität von Szeged, Ungarn
(Kelemen-Valkony et al., 2012)
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#2768
(Ismat et al., 2010)
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#5849
(Schnorrer et al., 2007)
41
Fliegenlinie
kuze29-4/CyO
LanA9.32/TM3
mam8/CyO
Mef222-21/CyO, wg-lacZ
ske[Be1]
mib2
/CyO, wg-lacZ
y1 w*; mute1281/CyO
numb2 pr cn Bc/CyO
OJ487
org-1
/Fm7c
pyr18, twi:CD2 cn1/CyO
cn1 scb2 bw1 sp1/CyO
scwl1 rdo1 hk1 pr1/CyO
IB09
shn
/CyO
Referenz
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#5804
C. S. Goodman (bezogen von T. Volk)
(Henchcliffe et al., 1993)
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#1596
H. T. Nguyen (Bour et al., 1995)
H. T. Nguyen (Nguyen et al., 2007)
S. Bulchand, National University of
Singapore (Bulchand et al., 2010)
(Skeath and Doe, 1998)
C. Schaub (Schaub et al., 2012)
A. Müller, University of Dundee, UK
(Klingseisen et al., 2009)
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#3098
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#4351
(Arora et al., 1995)
Tübingen Drosophila stock collection, Max-
snaIIG cn1 bw1 sp1/CyO
Planck-Institut für Entwicklungsbiologie –
Z288
cn1 sli2 bw1 sp1/CyO
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#3266
A. Müller, (bezogen von A. Stathopoulos ,
ths759/CyO, wg-lacZ
California Institute of Technology, Pasadena,
USA) (Klingseisen et al., 2009)
cn1 tumAR2 bw1/CyO
cn1 tumDH15 bw1/CyO
tup1 cn1 bw1 sp1/CyO
cn1 twi1 bw1 sp1/CyO
ush2 cn1 bw1 sp1/CyO
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#8686
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#8687
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#2207
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#2381
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#2508
42
Fliegenlinie
wg1 cn1
cn1bw1sp1zip1/CyO
Referenz
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#2978
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#4199
Tabelle 12: Mutanten
3.1.6.5 P-Element-Insertionen
Fliegenlinie
y1 w67c23; P{lacW}Cg25Ck00405/CyO
-c1
jeb
y1; P{SUPor-P}LanB1KG03456/CyO, ry506
y1 w67c23; P{EPgy2}muteEY22147/CyO
P{PZ}Rca103300 cn1/CyO; ry506
w*; SCAR∆37 P{neoFRT}40A/CyO
P{PZ}vkg01209 cn1/CyO, ry506
cn1 P{ry+t7.2=PZ}wb09437/CyO; ry506
Referenz
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#10479
(Weiss et al., 2001)
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#13957
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#22655
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#11294
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#8754
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#11003
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#12362
Tabelle 13: P-Element-Insertionen
43
3.1.6.6 UAS- und GAL4-Linien
Die folgende Tabelle listet die für die Experimente im Zuge der Untersuchungen der
Wirkungsweise von Pyr und Ths verwendeten UAS- und Gal4-Linien auf.
Fliegenlinie
Referenz
Bloomington Drosophila Stock Center,
48Y-GAL4
Indiana University, Bloomington#4935
(Martin-Bermudo et al., 1999)
bap3-GAL4
(Lee et al., 2003)
Bloomington Drosophila Stock Center,
MD237
pan
-GAL4
Indiana University, Bloomington#3039
(Fromental-Ramain et al., 2008)
SG24 twi-GAL4
UAS-EGFP#5a.2
(Greig and Akam, 1993)
Bloomington Drosophila Stock Center,
Indiana University, Bloomington#5431
w; Sp/CyO, ftz-lacZ; UAS-pyr
(Kadam et al., 2009)
w; Sp/CyO, ftz-lacZ; UAS-ths
(Kadam et al., 2009)
Tabelle 14: UAS- und Gal4-Linien
44
3.2
3.2.1
Methoden
Arbeiten mit Drosophila melanogaster
3.2.1.1 Stammhaltung und Zucht
Alle Fliegenlinien wurden zur Stammhaltung in Glas- beziehungsweise Kunststoff-Röhrchen
mit einer Höhe von acht und einem Durchmesser von zwei Zentimetern gehalten und alle
vier Wochen umgesetzt. Diese Röhrchen sind etwa zur Hälfte mit Fliegenfutter gefüllt. Zur
Expansion bestimmter Linien wurden die Fliegen in größere Kunststoff-Röhrchen mit einer
Höhe von zehn und einem Durchmesser von vier Zentimetern gegeben.
Eine Voraussetzung für das Ansetzten von Kreuzungen ist die Unterscheidung von adulten
männlichen und weiblichen Fliegen. Ein Merkmal dabei ist die Pigmentierung der Oberseite
der letzten abdominalen Segmente. Während diese bei Männchen durchgehend dunkel
gefärbt sind, zeigen Weibchen ein wechselnd helles und dunkles Muster. Außerdem läuft
das Abdomen bei weiblichen Fliegen spitz zu, bei männlichen Fliegen nimmt es eine eher
runde Form an. Ausschließlich die Männchen besitzen an ihrem ersten Beinpaar eine kammförmige dunkel gefärbte Struktur, die „sex combs“. Ein weiteres Merkmal ist die nur bei
männlichen Fliegen vorhandene pigmentierte Genitalplatte. Sie befindet sich an der
Unterseite der letzten Abdominal-Segmente. Ziel der Kreuzungs-Experimente war in vielen
Fällen das Erzeugen von Nachkommen mit einem bestimmten genetischen Hintergrund. Aus
diesem Grund wurden in der Regel unbefruchtete Weibchen gekreuzt. Das Kriterium hierfür
ist das Alter der Fliegen. Junge, noch nicht fortpflanzungsfähige Weibchen haben einen
dunklen Punkt im Darm, der durch die noch nicht pigmentierte Unterseite des Abdomens gut
zu erkennen ist. Bei sorgfältig geleerten Fliegen-Röhrchen können bei einer Temperatur von
25°C alle innerhalb von fünf bis sechs Stunden geschlüpften Weibchen als jungfräulich
angesehen werden, da die Spermien der frisch geschlüpften Männchen erst nach dieser Zeit
ausgereift sind (Ashburner und Wright, 1979).
Die EMS-Linien wurden zur Stammhaltung bei einer Temperatur von 19°C gehalten.
Kreuzungen fanden in der Regel bei 25°C statt. Bei einigen Überexpressionsexperimenten
oder Experimenten mit temperatursensitivem Hintergrund wurden die Fliegen für einen
gewissen Zeitraum einer Temperatur von 29°C ausgesetzt. Für Komplementationstests
wurden in der Regel drei bis vier jungfräuliche Weibchen mit zwei Männchen verpaart. Zur
Auswertung der Tests wurde der Anteil an Balancer-Tieren und transheterozygoten
Nachkommen bestimmt, die durch die Abwesenheit bestimmter Marker der BalancerChromosomen zu erkennen sind. Um einen statistisch sinnvollen Wert zu erhalten, empfiehlt
es sich, mindestens 70 bis 100 Fliegen auszuzählen. Bei vollständiger Komplementation ist
ein
Verhältnis
von
ungefährer
zwei
Drittel
Balancer-Fliegen
zu
einem
Drittel
45
transheterozygote Nachkommen zu erwarten. Kreuzungen, aus denen weniger als 20%
transheterozygote Tiere hervorgehen, werden als sub-lebensfähig beziehungsweise
semiletal bezeichnet. Zwei Linien komplementieren nicht, wenn aus der Kreuzung keine
transheterozygoten Nachkommen hervorgehen.
3.2.1.2 Fixierung von Drosophila-Embryonen mit Formaldehyd
Die Fixierung von Drosophila-Embryonen ist die Vorrausetzung für alle histologischen
Methoden, wie Antikörperfärbung und in Situ Hybridisierung. Dabei werden die Proteine
quervernetzt, womit die Struktur des Embryos während der gesamten Prozedur erhalten
bleibt. Des Weiteren ist es durch das Fixieren möglich, die embryonale Entwicklung zu einem
beliebigen Zeitpunkt zu unterbrechen, um bis dahin gebildete Strukturen analysieren zu
können.
Die Ei-Ablagen fanden in einem Käfig statt, an dessen Boden eine Petrischale, gefüllt mit
Apfelsaft-Agar, befestigt war. In die Mitte der Schale wurde eine geringe Portion HefeSuspension gegeben, um den Fliegen einen zusätzlichen Anreiz zur Ablage zu liefern. Die
Eier wurden zunächst mithilfe eines Pinsel und Leitungswasser von der Agar-Platte abgelöst
und in ein Sieb-Körbchen überführt. Nach dem Entfernen von Hefe-Resten durch Spülen mit
Leitungswasser wurden die Siebchen für 2 min in Chlorix getaucht um die äußere Eihülle,
das sogenannte Chorion, unter wiederholtem Spülen mit einer Plastik-Pipette aufzulösen.
Anschließend wurden die Embryonen nach gründlichem Waschen in ein Szintillationsgefäß
mit Fixier-Lösung transferiert und für 20 min auf einem Schüttler inkubiert. Nachdem die
wässrige Phase mit dem Formaldehyd entfernt worden war, wurde das Gefäß mit Methanol
aufgefüllt und ca. 30 sec kräftig geschüttelt. Diese Maßnahme diente der Entfernung der den
Embryo umgebenden Vitelinmembran. Der Heptan-Überstand wurde im abschließenden
Schritt entfernt und die auf den Boden gesunkenen Embryonen wiederholt mit Methanol
gewaschen und bei 4°C in Methanol bis zur weiteren Verwendung gelagert.
3.2.1.3 Hitzefixierung von Drosophila-Embryonen
Eine Alternative zur Fixierung mit Formaldehyd stellt die Hitzefixierung dar, welche als
Vorbereitung zum Nachweis der Laminin-β-Kette mithilfe des Laminin β-Antikörpers ab47650
(Abcam) zum Einsatz gekommen ist. Dabei wurden die Embryonen zunächst wie unter
3.2.1.2 beschrieben dechorionisiert. Anschließend wurden die Siebchen mit den Embryonen
in eine Petrischale mit TNX (0,7% NaCl und 0,01% Triton X-100) gestellt und kurz
geschwenkt. Eine Koch-Pufferlösung (68mM NaCl und 0,04% Triton X-100) wurde in einem
46
Becherglas zum Kochen gebracht und die Siebchen darin für 5-7 sec eingetaucht.
Nachfolgend wurden diese direkt in eine Petrischale mit Eis-gekühltem Kochpuffer gestellt
und geschwenkt. Die Embryonen wurden dann in Szintillationsgefäße mit 50:50
Heptan/Methanol überführt. Die Devitelinisierung erfolgte durch Schütteln für ungefähr 30
sec. Der Heptan-Überstand wurde entfernt und die Embryonen wiederholt für je 10 min mit
Methanol und mindestens zweimal für je 20 min in Ethanol gewaschen. Die Embryonen
wurden abschließend bei 4°C in Ethanol bis zur weiteren Verwendung gelagert (Protokoll
modifiziert nach Albrecht et al. (2011)).
3.2.1.4 EMS-Mutagenese-Screen
Die EMS-Behandlung von Fliegen wurde aufgrund der hohen Toxizität und des
kanzerogenen Charakters von EMS unter erhöhten Sicherheitsbedingungen durchgeführt.
Dazu gehören das Arbeiten unter einem Abzug und das Tragen von zwei Paar NitrilHandschuhen, eines Laborkittels und einer Schutzbrille während des Hantierens mit der
Chemikalie und potentiell kontaminierten Materialien. Es ist ebenfalls wichtig, alle
kontaminierten Labor-Utensilien für mindestens 24 Stunden
in einer Natriumthiosulfat-
Lösung zu inkubieren, um das EMS zu inaktivieren.
Zur Vorbereitung der Mutagenese wurde der Boden von zwei nach oben schmal
zulaufenden, dünnwandigen Polypropylen-Gefäßen („6-oz Square bottom bottle“) mit vier
Lagen 3MM-Whatman-Filterpapier (mit Heftklammern zusammengeheftet und an der
Unterseite mit doppelseitigem Tesa-Film versehen) ausgelegt. Anschließend wurden 100
bzw. 150 maximal zehn Tage alte Fliegen-Männchen des Referenzstammes in die Gefäße
gegeben und diese mit einem Schaumgummi-Stopfen verschlossen, durch welchen eine
1ml-Pipettenspitze gestochen worden war. Durch diese wurde ein fusselfreies Papier
gedreht und mit Leitungswasser angefeuchtet. In diesem Zustand verweilten die Fliegen zum
Aushungern für acht Stunden, wobei in regelmäßigen Abständen etwas Wasser nachgetropft
wurde. Danach wurde der Schaumgummi durch einen Baumwoll-Stopfen ersetzt und die
Tiere für 30 min dehydriert. Die eigentliche EMS-Behandlung begann mit dem Auflösen von
EMS in einer 1%igen Saccharose-Lösung in einem kleinen Becherglas (0,24ml/100ml für
eine Endkonzentration von 30mM), wobei die entstehenden EMS-Tröpfchen bis zur
kompletten Durchmischung wiederholt mit einer 3ml-Spritze aufgezogen und wieder
ausgestoßen wurden. Nachfolgend wurden 2ml mit der Spritze aufgezogen, die Kanüle am
Baumwollstopfen vorbei in das Gefäß geführt und die Lösung mittig auf den 3MM-WhatmanFilterpapier-Stapel getropft. Auf die EMS-Fütterung von ungefähr 19 Stunden folgte eine
Erhohlungsphase über Nacht. Dazu wurden die Fliegen mit Hilfe eines Trichters in große
Futterröhrchen umgesetzt. Um ein Umschütten des eventuell vom Boden gelösten
47
Whatman-Papiers zu verhindern, wurde dieses vor dem Überführen der Fliegen mit
mehreren durch das Gefäß gestochenen Zahnstochern fixiert. Eine der Anzahl der
männlichen Fliegen entsprechende Zahl an Weibchen eines Balancer-Stamms, welche
zusätzlich ein Hitzeschock-Konstrukt besitzen, wurde den Ansätzen zugegeben und die
Tiere über einen Zeitraum von bis zu zehn Tagen täglich auf neue Flaschen umgesetzt
(siehe Kreuzungsschema, Abb. 6).
Abbildung 6: Kreuzungsschema des EMS-Screens
Darstellung der für einen F3-Screen notwendigen Kreuzungen einschließlich des Hinweises auf
durchzuführende Einzelkreuzungen und Hitzeschock in beziehungsweise nach der F1-Generation.
S13b16c18a.1* steht jeweils für das mutagenisierte Chromosom.
48
Die Männchen wurden am Tag 5 nach der Behandlung entfernt, um das Ansammeln
identischer Mutationen aus frühen Keimzell-Klustern zu verhindern. Schlüpfende Männchen
der F1-Generation wurden im weiteren Verlauf einzeln mit sechs bis acht der im
Kreuzungsschema angegebenen Balancer-Weibchen gekreuzt und die entstehende F2Generation jeweils an Tag 5 und 6 einem Hitzeschock (1h, 37°C) ausgesetzt (Abb. 6). Die
über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tagen geschlüpften Adulten der F2-Generation
wurden zur Etablierung eines Stammes für zwei bis drei Tage auf frisches Futter gesetzt. Es
folgte der Transfer in eine spezielle Ei-Sammelvorrichtung, das Kondo. Durch seine spezielle
Konstruktion
erlaubt
das
Kondo
die
gleichzeitige
Ei-Ablage
und
anschließende
Dechorionisierung der Embryonen von bis zu 15 Fliegenlinien. Für das mutierte Chromosom
homozygote Embryonen (identifizierbar durch die Abwesenheit des GFP-markierten
Balancer-Chromosoms)
Übernachtablage
von
der
0-19
nachfolgenden
Stunden
bei
F3-Generation
25°C
wurden
(Abb.
mithilfe
6)
der
aus
einer
GFP/RFP-
Reporterkonstrukte auf Veränderungen der somatischen oder viszeralen Muskulatur und des
Herzens hin untersucht. Bei gemischtem Phänotyp oder einer unvollständigen Penetranz
wurden die F1-Kreuzungen mit mindestens drei einzelnen F3-Männchen wiederholt, um
Mosaizismus zu vermeiden.
3.2.2
Molekulargenetische Arbeiten
3.2.2.1 Herstellung chemisch kompetenter Zellen (Sambrook und Russell, 2001)
Zur Herstellung chemisch kompetenter Zellen wurde zunächst eine Vorkultur, bestehend aus
0,5ml XB-Medium und Zellen des E.coli Stammes XL-1 blue, für 1 Stunde bei 37°C im
Schüttler inkubiert. Nach Zugabe von 5ml vorgewärmtem XB-Medium (1:10 Verdünnung)
wurde die Inkubation bis zum Erreichen einer OD600 von 0,3 fortgesetzt. Es folgte eine
erneute Verdünnung der 5ml Kultur von 1:20 mit 100ml vorgewärmtem XB-Medium und eine
Inkubation bis zu einer OD600 von 0,48. Für alle folgenden Schritte war es wichtig die
Bakterien auf Eis kühl zu halten. Die Zellen wurden im Kolben für 15 min auf Eis abgekühlt
und danach 5 min bei 0°C und 2500upm abzentrifugiert. Nachdem das Pellet vorsichtig in
eiskaltem TbfI mithilfe einer vorgekühlter Glas-Pipette resuspendiert worden war, wurden die
Zellen für 5 min auf Eis gestellt und anschließend erneut für 5 min bei 0°C und 2500upm
zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4ml eiskalten TbfII resuspendiert, wobei wiederum eine
vorgekühlte Pipette verwendet wurde. Die Zellen wurden nach weiteren 15 min auf Eis in
100µl Portionen aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung erfolgte bei 80°C.
49
3.2.2.2 Transformation von chemisch kompetenten Zellen (Sambrook und Russel,
2001)
Zur
Vorbereitung
der pyr-
beziehungsweise
ths-RNA-Sondensynthese wurden die
entsprechenden cDNA-Klone (bezogen von A. Stathopoulos (Stathopoulos et al., 2004))
retransformiert. Zur Transformation von chemisch kompetenten Zellen wurden diese
zunächst auf Eis aufgetaut und dann die zu transformierende DNA zugegeben und mit den
Zellen gemischt. Es folgten eine 30-minütige Inkubation auf Eis und ein Hitzeschock bei 42°C
für 90sec. Die Bakterien wurden sofort wieder auf Eis gestellt, 900µl 2x YT-Medium
zugegeben und der Ansatz für 60 min bei 37°C im Schüttler inkubiert. Die Zellen wurden
nachfolgend für 2 min bei 3000upm abzentrifugiert und in 100µl 2x YT-Medium
resuspendiert. Die Suspension wurde auf einer mit einem speziellen Antibiotikum versetzten
LB-Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Es konnten nur die Bakterien
wachsen, welche transformiert worden waren und somit die auf dem Plasmid sitzende
Resistenz gegen dieses Antibiotikum erworben hatten.
3.2.2.3 Plasmid-Isolierung im präparativen Maßstab (Midi-Präparation)
Die Midi-Präparation zur Isolierung der retransformierten Plasmide wurde mithilfe des
QIAfilterTM Plasmid Midi Kit (25) von Qiagen nach Anleitung des Herstellers durchgeführt.
3.2.2.4 Isolation von genomischer DNA aus Drosophila Embryonen
Die Sequenzanalyse der Mutationen aus dem EMS-Screen hervorgegangener Linien
erforderte meist eine Isolation von DNA aus Embryonen. Da die Mutationen über ein GFPBalancer-Chromosom gehalten wurden, konnten homozygote (GFP-negative) Embryonen
unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop selektiert werden. Diese waren zuvor nach
Standard-Protokoll fixiert und rehydriert worden. Das verwendete EGFP fluoresziert selbst
nach der Fixierung, einer mehrtägiger Lagerung in Methanol und der Rehydrierung noch
hinreichend. Nach dem Überführen in ein Eppendorf-Gefäß und dem Abnehmen des PBTÜberstands wurden die Embryonen zweimal in PBT gewaschen. Anschließend wurde das
PBT durch den „Squishing Buffer“ ersetzt, wobei das Volumen der doppelten Anzahl an
Embryonen in µl entsprach. Der Ansatz wurde durch wiederholtes auf- und ab-pipettieren
homogenisiert und für 30-60 min auf 37°C inkubiert. 15 min nach Beginn der Inkubation
wurde erneut homogenisiert. Die Proteinase K wurde zum Abschluss 10 min bei 95°C hitzeinaktiviert und die DNA bei -20°C gelagert.
50
3.2.2.5 Isolation von genomischer DNA aus Fliegen
Für die Isolation von genomischer DNA aus adulten Fliegen wurden zunächst 20 Tiere in ein
Eppendorf-Gefäß transferiert und in 400 µl Lyse-Puffer homogenisiert. Darauf folgte eine
Inkubation bei 70°C im Heizblock für 30 min unter gelegentlichem Mischen. Anschließend
wurden 77µl 8M Kalium-Acetat hinzugegeben, der Ansatz gut vermischt und 20 min lang auf
Eis gestellt bevor dieser bei 10000upm für 15 min zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde
in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und erneut 10 min bei 10000upm zentrifugiert. Nach
abermaligem Überführen wurde der Überstand mit 65 µl 2M NaCl und 600µl Isopropanol gut
vermischt, 10 min auf Eis gestellt und für 15 min bei 13000upm zentrifugiert. Durch
nochmalige Zentrifugation für 10 min bei 13000upm wurde das Pellet mit 600µl 70% Ethanol
gewaschen und danach getrocknet. Die Resuspension erfolgte in 40µl TE (10mM Tris HCl
pH 7.5, 1mM EDTA) für ungefähr 30 min bei Raumtemperatur wobei nach 15 min kurz auf
und ab pipettiert wurde.
3.2.2.6 DNA-Amplifikation
durch
Polymerase-Kettenreaktion
(polymerase
chain
reaction, PCR)
Zur Vorbereitung der Sequenzierung wurden die Cg25C- beziehungsweise LanB1Fragmente aus genomischer DNA von Embryonen der jeweiligen EMS-Linien amplifiziert.
Der DNA-Gehalt im PCR-Ansatz entsprach dem eines Embryos. Für einen 50µl PCR-Ansatz
wurden folgende Reaktions-Komponenten benutzt:
DNA (embryonal)
bidest. Wasser
2µl
39,5µl
10x Reaktions-Puffer (mit MgCl2)
5µl
10mM dNTP-Mix
1µl
10µM Vorwärts-Primer
1µl
10µM Rückwärts-Primer
1µl
FastStart Taq DNA Polymerase (Roche) (5u/µl)
0,5µl
51
Das folgende Programm wurde als Standard-Programm verwendet:
Reaktions-Zyklen:
1x
Denaturierung
95°C
5 min
30x
Denaturierung
95°C
30 sec
Primer-Hybridisierung
x °C
40 sec (primerabhängig)
Elongation
72°C
1-2 min pro 1kb Fragment-Größe
1x
Elongation
72°C
7 min
1x
Abkühlung
10°C
unbegrenzt
3.2.2.7 Aufreinigung von PCR-Fragmenten und Sequenzierung
Für die Aufreinigung von PCR-Produkten wurde das QIAquick PCR-Purification-Kit von
Qiagen benutzt. Die DNA wurde mittels eines speziellen Puffers an ein Säulchen gebunden,
mit Ethanol gewaschen und letztendlich in Eluationspuffer gelöst. Alle Schritte erfolgten
durch Zentrifugation. Die aufgereinigte DNA konnte anschließend in der gewünschten
Verdünnung zusammen mit speziellen Sequenzier-Primern zum Sequenzieren geschickt
werden. Waren auf dem Gelbild zusätzliche Nebenbanden zu sehen, wurde die gewünschte
Bande aus dem Gel ausgeschnitten und mithilfe des QIAquick Gel Extraktion Kits von
Qiagen aufgereinigt.
Die Sequenzierungen wurden von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz) (www.gatcbiotech.com)
durchgeführt.
Alle
Cg25C-
beziehungsweise
LanB1-Fragmente
mit
bedeutsamen Mutationen wurden zweimal aus unabhängigen Proben sequenziert.
3.2.2.8 RNA-Sondensynthese
Für die in Situ Hybridisierung gegen Cg25C, LamininB1, pyr und ths wurden im Vorfeld
Digoxigenin-markierte RNA-Sonden synthetisiert. Der erste Schritt der Sondensynthese war
die Amplifizierung eines DNA-Fragments des Zielgens mittels PCR (Standard-50µl-Ansatz,
siehe Kapitel 3.2.2.6). Das Cg25C-Fragment wurde mit dem Primerpaar Cg25C_F08 und T7Cg25C_B09 amplifiziert, für das LanB1-Fragment wurden die Primer LanB1_F06 und T7LanB1_B07 benutzt (siehe Kapitel 3.1.5). Bei den Rückwärts-Primern handelte es sich
jeweils um Fusionsprimer mit der vorangestellten T7-Promotorsequenz. Nach der
Aufreinigung der PCR wurde die In vitro-Transkription nach folgendem Schema angesetzt
und für zwei Stunden bei 37°C inkubiert:
52
DNA (PCR-Fragment)
xµl (entsprechend 200ng)
DEPC-behandeltes Wasser
xµl (Gesamtvolumen: 40µl)
Transkriptionspuffer (10x)
4µl
DIG-Labeling-Mix (10x)
4µl
RNasin
2µl
T7-RNA-Polymerase
4µl
Im nächsten Schritt wurde die Sonde fragmentiert. Zum Transkriptions-Ansatz wurden 40µl
DEPC-behandeltes Wasser und 80µl 2x Karbonat-Puffer gegeben und das Gemisch für 5
min auf 65°C inkubiert. Anschließend wurden 160µl 0,2M Natriumacetat hinzugefügt. Es
folgte die Fällung der RNA durch die Zugabe von 6µl tRNA (20mg/ml), 48µl 4M LiCl und
960µl Ethanol (100%) bei einer Temperatur von -20°C über Nacht. Am nächsten Tag wurde
der Ansatz für 15 min bei 13.000 upm in einer Kühlzentrifuge bei ungefähr 4°C zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und 70% Ethanol hinzugefügt. Nach einem erneuten
Zentrifugations-Schritt für 15 min wurde das Pellet getrocknet und in 200µl HybridisierungsLösung resuspendiert.
3.2.3
Histologische Methoden
3.2.3.1 Antikörper-DAB-Färbung nach der „Avidin-Biotinylated Enzyme Complex“Methode
Das Methanol, in dem die fixierten Embryonen gelagert waren, wurde zunächst durch 50%
Methanol, gelöst in PBT, ersetzt. Darauf folgten drei kurze Waschschritte in PBT, an die sich
eine Inkubation in 5% Kälberserum-Albumin (in PBT) von 30 bis 60 min Dauer anschloss, um
unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Der primäre Antikörper gegen das zu
analysierende Protein wurde ebenfalls in PBT verdünnt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am
nächsten Tag wurde zuerst dreimal 30 min in PBT gewaschen und nachfolgend der
speziesspezifische Biotin-konjugierte sekundäre Antikörper in der gewünschten Verdünnung
zu den Embryonen gegeben. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von zwei Stunden
bei Raumtemperatur, gefolgt von wiederum drei 30-minütigen Waschschritten in PBT. Vor
dem letzten Waschschritt wurde der AB-Komplex vorbereitet, indem Lösung A und Lösung B
jeweils in einer Verdünnung von 1:100 zu dem benötigten Volumen an PBT pipettiert wurden
und der Ansatz für 30 min bei Raumtemperatur zur Komplex-Bildung beiseite gestellt wurde.
Im Anschluss an das Waschen wurde die Lösung mit dem AB-Komplex zu den Embryonen
gegeben und eine Stunde ebenfalls bei Raumtemperatur inkubiert. Auf diesen Schritt folgte
wiederum dreimaliges Waschen von je 30 min Dauer. Zur Vorbereitung für die Färbereaktion
53
wurden zu je 1ml PBT 70µl 4mg/ml DAB und 3µl einer 1:10 verdünnten 35%
Wasserstoffperoxid-Lösung gegeben. Die Umsetzung von DAB durch die im AB-Komplex
befindliche Meerrettich-Peroxidase führt zur Entstehung eines braunen oder durch Zugabe
von Nickelsulfat und Kobaltchlorid bläulich-violetten Farbstoffes. Die Färbung fand in
Blockschälchen statt, in welche die Embryonen zusammen mit der Färbelösung transferiert
wurden. Nach dem Erreichen der gewünschten Färbeintensität wurde die Reaktion durch
rasches viermaliges Waschen in PBT abgestoppt, und die Embryonen wurden in ein
sauberes 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt. Anschließend wurden diese durch eine AlkoholReihe dehydriert, um letztendlich in Permount-Medium eingebettet werden zu können.
Alternativ konnte eine zweite Färbung gestartet werden, was jedoch die Inaktivierung von
DAB-Resten voraussetzt. Dazu wurden die Embryonen entweder für 20 min in Glycin/HCl pH
2,5 oder bei 72°C im Heizblock inkubiert.
3.2.3.2 Immunfluoreszenzfärbung
Diese Art der Färbung gleicht der Antikörperfärbung nach der „Avidin-Biotinylated Enzyme
Complex“-Methode bis zur Zugabe des sekundären Antikörpers. Anstelle von Biotin ist in
diesem Fall ein Fluorophor gebunden, das bei Anregung mit Licht bestimmter Wellenlänge
Licht mit längerer Wellenlänge abstrahlt, welches mit einem herkömmlichen FluoreszenzMikroskop oder durch den Laser eines konfokalen Mikroskops detektiert werden kann. Bei
einer
Doppelfärbung
konnten
die
Embryonen
mit
aus
unterschiedlichen
Spezies
stammenden Primär-Antikörpern und den jeweiligen Sekundärantikörpern parallel inkubiert
werden. Entstammten die Primär-Antikörper jedoch der gleichen Spezies, wurden die
Färbungen sequentiell und mit einem dazwischen liegenden in Kapitel 3.2.3.1 beschriebenen
Inaktivierungsschritt mit Glycin/HCl pH 2,5 durchgeführt.
Die dem Einbetten vorangestellte Alkohol-Reihe entfiel bei der Immunfluoreszenzfärbung, da
als Medium Vectashield® H-1000 (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, USA) verwendet
wurde, welches das Präparat vor dem Ausbleichen der Fluoreszenz zu schützt.
3.2.3.3 Verstärkung des Signals mit dem TSA-System
Die direkte Fluoreszenz-Färbung führte bei manchen Primär-Antikörpern nur zu einem sehr
schwachen Signal. Dieses konnte mit dem TSATM Fluorescein System (Perkin Elmer)
verstärkt werden. Dazu wurden die Embryonen zunächst für zwei Stunden mit dem
entsprechenden biotinylierten Sekundär-Antikörper inkubiert. Darauf folgten drei 30-minütige
Waschschritte mit PBT und die einstündige Inkubation mit der AB-Lösung (siehe auch
Kapitel 3.2.3.1). Nach drei weiteren Waschschritten von je 30 min Dauer wurden die
54
Embryonen für 10-30 min im TSA-Gemisch inkubiert. Hierbei wurde 1µl FluoresceinReagenz in 100µl des mitgelieferten Amplifikationspuffers oder in selbsthergestellten, frisch
mit 0,1% einer 35% Wasserstoffperoxid-Lösung versetzten Boratpuffer (0,1M Borsäure, pH
8,5) gegeben. Es folgten zwei kurze und drei 30-minütige Waschschritte mit PBT und die
Einbettung der Embryonen in Vecatshield® H-1000.
3.2.3.4 Fluoreszenz in Situ Hybridisierung
Die Expression eines bestimmten Gens kann im Fliegen-Embryo durch Hybridisierung mit
einzelsträngiger, Digoxigenin-markierter RNA komplementär zur Ziel-mRNA nachgewiesen
werden. Bei dieser sogenannten Whole-Mount in Situ Hybridisierung sollten alle Lösungen,
welche bis zum Inkubations-Schritt mit der RNA-Sonde verwendet werden, im Vorfeld
entweder direkt oder, falls dies nicht möglich ist, zumindest das zum Ansetzten benutzte
Wasser mit DEPC behandelt (Sambrook and Russell, 2000) und autoklaviert werden. Durch
diese Maßnahme kann ein Abbau der RNA durch eventuell vorhandene RNasen verhindert
werden.
Die in Methanol gelagerten Embryonen wurden zunächst in einer Verdünnungs-Reihe mit
steigender PBT-Konzentration (70%/50%/30% MeOH) vorsichtig rehydriert. Es folgten drei
fünf-minütige Waschschritte in PBT, eine Post-Fixierung in 10% Formaldehyd für 20 min und
wiederum fünfmal fünf-minütiges Waschen in PBT. Die Embryonen wurden anschließend
kurz
in
einem
1:1
Gemisch
von
PBT/Hybridisierungs-Lösung
sowie
einmal
in
Hybridisierungs-Lösung inkubiert, bevor die Prä-Hybridisierung in frischer Lösung für 1
Stunde bei 55°C stattfand. Die Inkubation mit der RNA-Sonde erfolgte danach über zwei
Nächte bei 55°C auf einem Drehgestell. Das Protokoll wurde mit dreimaligem Waschen in
Hybridisierungs-Lösung für je 1 Stunde bei 55°C fortgesetzt, auf das ein 20-minütiger
Waschschritt
in
1:1
Hybridisierungs-Lösung/PBT
bei
gleicher
Temperatur
und
4
Waschschritte bei Raumtemperatur von je 20 min Dauer folgten. Danach erfolgte die
Inkubation mit dem Primär-Antikörper (Schaf anti-Digoxigenin, 1:1000) bei 4°C über Nacht.
Das Protokoll wurde mit einem kurzen Waschschritt in PBT und anschließendem
dreimaligem Waschen von je 30 min Dauer fortgesetzt. Es folgten die Inkubation mit dem
Sekundär-Antikörper
(biotinylierter
Esel anti-Schaf-IgG,
1:500) für 2 Stunden bei
Raumtemperatur, drei weitere 30-minütige Waschschritte in PBT und die einstündige
Inkubation mit der AB-Komplex-Lösung. Der Komplex wurde vor dem letzten Waschschritt
wie unter 3.2.3.1 beschrieben angesetzt und prä-inkubiert. Nach dem Auswaschen der ABKomplex-Lösung (3x 30 Minuten PBT) wurde das TSA-System (siehe Kapitel 3.2.3.3) zur
Verstärkung des Fluoreszenz-Signals angewendet.
55
3.2.4
Mikroskopie
Die phänotypischen Analyse der EMS-Linien erfolgte an einem Eclipse 80i (Nikon) in
Verbindung mit dem Programm NIS Elements, sowie an einem AX-70 (Olympus) und dem
Programm QCapture. Fluoreszenz-gefärbte Embryonen wurden entweder an einem Zeiss
AxioImager, ausgerüstet mit einem Zeiss Apotome mithilfe des Programms Axiovision 4.8
oder an einem CLSM SP5 II (Leica) mithilfe der Software Leica Application Suite Advanced
Fluorescence (LAS AF) analysiert. Die Bilder der DAB-Färbungen wurden mit dem AX-70
(Olympus) aufgenommen. Zur Bildbearbeitung wurde Photoshop CS5 (Adobe) benutzt.
Zur Vorbereitung der Langzeit-Lebendbeobachtung Fluoreszenz-markierter Embryonen
wurden diese zunächst auf einem Agarblock mit der zu scannenden Seite nach oben
aufgereiht. Anschließend wurden die Embryonen auf ein mit einem dünnen Streifen flüssigen
Heptan-Kleber präpariertes Deckglas transferiert. Die Embryonen wurden mit einem Tropfen
Voltalef®-Öl (VWR International) bedeckt, auf welchen nachfolgend ein Stück Membran
(High Sense, Oxygen Probe Service Kit (Model 5776), YSI Incorporated, Ohio, USA) gelegt
wurde. Die Membran fördert die Ausbreitung des Öls und verhindert ein Herabtropfen. Das
Deckglas wurde mit den Embryonen nach unten auf einen speziell angefertigten Objektträger
mit erhöhten Rändern gelegt und mit Heptan-Kleber zusätzlich fixiert.
Die Zeitserien zur Langzeit-Lebendbeobachtung Fluoreszenz-markierter Embryonen wurden
am CLSM SP5 II (Leica) mithilfe der Software Leica Application Suite Advanced
Fluorescence (LAS AF) und den folgenden Parametern durchgeführt: 20x Objektiv mit einer
numerischen Apertur von 0,7 und einem Refraktionsindex von 1,52 in Verbindung mit einem
1,8x optischen Zoom; eine Auflösung von 1024x600 Bildpunkten; eine Stapeltiefe von
insgesamt ungefähr 70µm und einem Abstand der einzelnen Stapelbilder von 3µm; die
Aufnahmezeit eines Stapels betrug ungefähr 90 sec; es wurde mit einem Standard-Pinhole
(1 airy), einer Scan-Geschwindigkeit von 200Hz und mit 3x Line-Average bidirektional
gescannt.
Die anschließende Bearbeitung der Bilddaten erfolgte ebenfalls mit dem Programm LAS AF.
56
4 Ergebnisse
4.1
EMS-Mutagenese-Screen des zweiten Chromosoms zur Identifizierung neuer, an
der Muskelentwicklung in Drosophila melanogaster beteiligter Gene
4.1.1
Generierung von Muskelmutanten durch EMS-induzierte Punktmutationen
Um Gene zu identifizieren, welche an den morphogenetischen Prozessen während der
Muskelentwicklung in Drosophila melanogaster beteiligt sind, wurde ein EMS-MutageneseScreen des zweiten Chromosoms durchgeführt. Die für die Mutagenese verwendete
Fliegenlinie enthält die in der Einleitung beschriebenen Reporterkonstrukte zur Markierung
der drei Hauptmuskeltypen, und ermöglicht somit die Detektion von Entwicklungsdefekten.
Die Reporterkonstrukte treiben die Expression von GFP in den Kardioblasten und RFPExpression in einer Untergruppe von somatischen Muskeln, inklusive der Alarmuskeln.
Außerdem wird RFP in den Fasern der longitudinalen Darmmuskulatur exprimiert (siehe
Kapitel 2.2.2).
Zur Durchführung des Screens wurden zunächst Fliegen der Reporterlinie durch das Füttern
mit EMS mutagenisiert. Anschließend wurden einzelne Männchen der nächsten Generation
mit Weibchen eines Balancer-Stamms zur Etablierung heterozygoter Linien gekreuzt. Die
Phänotypen wurden anhand von Ablagen in homozygoten Embryonen der nächsten
beziehungsweise übernächsten Generation analysiert (siehe Kreuzungsschema, Material
und Methoden, Kapitel 3.2.1.4). Dabei wurden vorwiegend späte Stadien verwendet. Bei
fehlenden Strukturen wurde deren Vorhandensein in früheren Entwicklungs-Stadien
überprüft. Der Mutagenese-Screen erfolgte in vier Etappen mit jeweils unterschiedlichen
EMS-Konzentrationen (siehe Tab. 20 im Anhang). In der ersten Etappe (Pilot-Screen)
wurden die Bedingungen und die technische Durchführbarkeit durch Patrick Lo und Ingolf
Reim etabliert und dabei 123 Mutanten isoliert (Patrick Lo und Ingolf Reim, unveröffentlichte
Daten). Diese Mutanten standen mir für eine spätere Analyse zur Verfügung. Die Ergebnisse
dieses Ansatzes wurden im Sinne einer zusammenfassenden Darstellung des Screens in die
Angaben in Tabelle 15 und Tabelle 20 im Anhang mit einbezogen. Die Etappen 2-4 des
Screens wurden von mir unter Beteiligung von Dr. Ingolf Reim (Etappen 2-4) und Dr.
Christoph Schaub (Etappe 4) durchgeführt. Insgesamt wurden von 4600 angesetzten F1Kreuzungen 3764 Linien beziehungsweise Chromosomen getestet. Es wird angenommen,
dass die letalen Treffer gemäß der Poisson-Verteilung gleichmäßig über das gesamte
Chromosom verteilt sind. Es handelt sich dabei um eine starke Vereinfachung, welche
allerdings oft für eine grobe Abschätzung herangezogen wird. Deswegen kann die Formel
P(0)=e-µ zur Ermittlung der durchschnittlichen Anzahl an letalen Treffern pro Chromosom
herangezogen werden (Nüsslein-Vollhard et al, 1984). Dabei steht P(0) für den Anteil an
57
Chromosomen ohne letalen Treffer und µ für die durchschnittliche Anzahl an letalen Treffern
pro Chromosom. Das bedeutet, dass bei durchschnittlich zwei letalen Treffern pro
Chromosom im Verlauf des Screens ungefähr 7600 letale Genmutationen analysiert worden
sind. Auf dem zweiten Chromosom befinden sich ungefähr 5600 Gene, etwa ein Drittel
davon letal (siehe Einleitung, Kapitel 2.2.1). Folglich kann man davon ausgehen, dass jedes
letale Gen mindestens einmal getroffen worden ist und der Screen damit als gesättigt
angesehen werden kann (siehe Diskussion, Kapitel 5.1.2).
Von den 3764 überprüften Linien wurden 469 mit vorhandenem Muskel-Phänotyp
aufgehoben (Tab. 15), was einem Anteil von ungefähr zwölf Prozent entspricht. Ein Großteil
davon weißt Defekte in der somatischen Muskulatur, einschließlich der Alarmuskeln, auf. Bei
288 Linien ist die longitudinale Darmmuskulatur oder die Morphologie des Mitteldarms
betroffen. 313 EMS-Linien zeigen Unregelmäßigkeiten in der Herzentwicklung. In vielen
Fällen sind in einer Mutante mehrere oder sogar alle Hauptmuskeltypen betroffen. Die
meisten aus dem Screen isolierten Allele sind im embryonalen oder in einem frühen larvalen
Stadium letal.
F1-Kreuzungen
4600
getestete Linien
3746
Letalität
84,1%
durchschnittliche Anzahl letaler Treffer
2,02
aufgehobene Linien
469
somatische Muskeldefekte
viszerale Defekte
Herzdefekte
372 Linien
288 Linien
313 Linien
Tabelle 15: EMS-Screen Statistik
Übersicht der wichtigsten Zahlen aus dem EMS-Screen. Eine ausführlichere Darstellung erfolgt in
Tab. 20 im Anhang.
Grundsätzlich gab es zwei verschiedene Wege zur Identifizierung sämtlicher in den
folgenden Kapiteln beschriebener EMS-Allele. Voraussetzung für den ersten Weg war ein für
bestimmte mesodermale Gene charakteristischer und bereits beschriebener Phänotyp.
Nachfolgend wurden Komplementations-Kreuzungen mit möglichen Kandidaten angesetzt
58
und auf Letalität überprüft. Bei vorliegender Letalität folgte eine Überprüfung des
transheterozygoten Phänotyps. Stimmte dieser mit dem homozygoten Phänotyp des EMSAllels überein, galt dieses als identifiziert. Führte dieser Weg zu keinem Ergebnis oder gab
es für einen interessanten Phänotypen eines EMS-Allels keine Kandidaten, wurde die zu
untersuchende EMS-Linie gegen einen Satz von Defizienzen gekreuzt. Dabei handelt es sich
um eine Sammlung von Fliegenlinien, in denen bestimmte Bereiche des zweiten
Chromosoms deletiert sind. Somit konnte in den meisten Fällen die Region des oder der
letalen Treffer bestimmt und anschließend durch Kreuzungen mit Sub-Defizienzen weiter
eingegrenzt werden. Auch bei diesem zweiten Weg zur Identifizierung von EMS-Allelen
folgte zur Bestätigung eine Kontrolle des transheterozygoten Phänotyps. In einigen Fällen
wurden parallel zur Identifizierung durch die Analyse von Antikörperfärbungen zusätzliche
Informationen
eingeholt.
Mit
einer
Wingless-Färbung
lassen
sich
mögliche
Segmentierungsdefekte erkennen, die Tropomyosin-Färbung ermöglicht einen Überblick
über die gesamte Muskulatur.
Die folgenden Kapitel 4.1.2 und 4.1.3 geben einen Überblick über die erhaltenen Phänotypen
der somatischen und viszeralen Muskulatur. In Kapitel 4.1.4 werden die das Dorsalgefäß
betreffenden Phänotypen ausführlicher dargestellt. Einige der isolierten Mutanten, die bereits
bekannten Genen entsprechen, werden in diesen Kapiteln exemplarisch gezeigt. Damit wird
gleichzeitig der Nachweis über die prinzipielle Durchführbarkeit und die Effizienz des
Mutagenese-Screens erbracht. Die darauf folgenden Kapitel widmen sich detaillierteren
Untersuchungen zu ausgewählten Mutanten. Kapitel 4.2 behandelt den Einfluss des FGFSignalwegs auf die Entwicklung der longitudinalen viszeralen Muskulatur. Kapitel 4.3 befasst
sich mit einer speziellen phänotypischen Gruppe von EMS-Linien mit AlarmuskelAnheftungsdefekten.
4.1.2
Phänotypen der somatischen Muskulatur
Die Linien mit Defekten in der somatischen Muskulatur wurden aufgrund verschiedener
Parameter, wie Existenz, Anzahl oder Morphologie der Muskelfasern, unterschiedlichen
phänotypischen Gruppen zugeteilt. Eine dieser phänotypischen Gruppen ist dadurch
charakterisiert, dass in den Embryonen die org-1-RFP-positiven Strukturen entweder stark
reduziert sind oder komplett fehlen. Das lässt vermuten, dass in diesen Fällen die org-1positiven Muskeln oder auch mehrere, eventuell sogar alle somatischen Muskeln entweder
fehlen oder im Lauf der Entwicklung verlorengegangen sind. Die Abwesenheit aller
somatischen Muskeln in Kombination mit Defekten in den anderen Hauptmuskeltypen ist ein
Hinweis auf eine fehlerhafte frühe Mesoderm-Spezifizierung. Die Gene twi und sna, für die
aus dem Screen jeweils zwei neue Allele isoliert wurden (Tab. 16), spielen dabei eine
59
essentielle Rolle, weswegen Allele von beiden Genen in dieser Phänotypen-Klasse zu
erwarten sind. Twi aktiviert eine Reihe von Mesoderm-spezifischen Zielgenen, sna reprimiert
die Expression nicht-mesodermaler Gene (Leptin, 1991). Fehlende Muskelfasern können
auch die Folge einer fehlenden Differenzierung der Muskeln sein. Starke, beziehungsweise
amorphe Allele des Gens mef-2, welches für späte Aspekte der Differenzierung aller drei
Hauptmuskeltypen benötigt wird (Bour et al., 1995), rufen dieser Phänotypen-Klasse
entsprechende Defekte hervor. Fünf dieser Allele wurden aus dem Screen isoliert. Bei dem
sechsten mef-2-Allel dieser Komplementationsgruppe handelt es sich scheinbar um ein
Hypomorph, da teilweise noch Muskelfasern vorhanden sind (I. Reim, persönliche
Mitteilung).
Eine weitere phänotypische Gruppe beinhaltet Linien mit deutlich mehr oder verbreiterter
org-1-RFP-Expression was auf zusätzliche oder dickere Muskelfasern hindeutet. Wie sich
zeigte, kann dieser Phänotyp häufig auf Mutationen in Genen, die in den Notch-Signalweg
involviert sind, zurückgeführt werden (zum Beispiel big brain (bib) oder mastermind (mam),
siehe Tab. 16). Die Beeinträchtigung des Prozesses der durch diesen Signalweg vermittelten
lateralen Inhibition während der frühen Mesodermentwicklung (Baker und Schubiger, 1996)
führt zu überschüssigen Muskelvorläuferzellen.
Linien mit einer ungewöhnlich dünnen org-1-RFP-Expression wurden zu einer weiteren
phänotypischen Gruppe zusammengefasst. Eine Antikörperfärbung gegen Tropomyosin
zeigt in diesen Linien insgesamt kurze Muskelfasern und kleine runde Myoblasten. Dieser
Phänotyp tritt häufig dann auf, wenn der Prozess der Fusion von den Muskel-Gründerzellen
mit den fusionskompetenten Zellen gestört ist. Das ist zum Beispiel in den fünf aus dem
Screen isolierten blown fuse (blow)- und sechs sticks and stones (sns)-Allelen (Tab. 16) der
Fall.
Die größte phänotypische Gruppe besteht aus EMS-Linien mit variablen Defekten der
somatischen Muskulatur. Darunter fallen das Fehlen einzelner Muskeln, eine falsche
Orientierung oder abnormale Form der Fasern. Große abgerundete Muskeln sind in der
Regel das Resultat von Defekten in der Anheftung der Fasern oder deuten auf absterbende
Muskelzellen hin. Anheftungsdefekte werden zum Beispiel durch Mutationen des kon-tiki
(kon)-Gens hervorgerufen, welches in insgesamt sieben EMS-Linien betroffen ist (Tab. 16).
Sind alle org-1-RFP-markierten Muskeltypen zwar vorhanden aber in jeweils ähnlich
reduzierter Gesamtanzahl, kann das ein Hinweis auf Segmentierungsdefekte sein. Im
folgenden Abschnitt werden einige Beispiele aus den oben genannten phänotypischen
Gruppen detaillierter beschrieben.
60
Die Linien in Abbildung 7B bis D sind Vertreter der phänotypischen Gruppe mit stark
reduzierter oder fehlender org-1-Expression. Den Embryonen fehlen sämtliche org-1-RFPpositiven Strukturen. Das lässt darauf schließen, dass zumindest ein Großteil der
somatischen Muskulatur nicht existiert. Eine Antikörperfärbung gegen Tropomyosin
bestätigte in beiden Fällen die Abwesenheit aller somatischen Muskeln (Daten nicht gezeigt).
In den gezeigten Linien sind die Gene sna (Abb. 7B) bzw. twi (Abb. 7C) betroffen. Abbildung
7D zeigt den Embryo einer Linie mit stark reduziertem org-1- und HLH54F-RFP. Die Linie
konnte dem Gen mef-2 zugeordnet werden. Eine muskel-spezifische Antikörperfärbung
eines anderen mef-2-Allels bestätigt den Verlust der somatischen Muskelfasern (Abb. 8B).
Abbildung 7E zeigt ein Beispiel aus einer Gruppe von Linien mit zusätzlicher org-1RFP-Expression. Die Muskeln 5 und 8 sind deutlich breiter und nicht mehr eindeutig
voneinander zu unterscheiden. Viele Alarmuskel-Fasern sind ebenfalls dicker als im Wildtyp.
Aufgrund des für Mutanten des Notch-Signalwegs typischen Phänotyps (welcher sich
außerdem durch eine Zunahme von Kardioblasten äußert, siehe Kapitel 4.1.4.1) wurden
Kreuzungen gegen die Mutanten bib1 und mam8 (Skeath und Carroll, 1992; Yedvobnick et
al., 1988) durchgeführt. Diese ergaben, dass es sich bei der Linie S3430 um ein bib-Allel
handelt. Insgesamt wurden fünf bib-Allele, sowie acht phänotypisch sehr ähnliche Allele des
Gens mam isoliert.
Das ungewöhnlich dünn erscheinende org-1-Expressionsmuster des Embryos der Linie in
Abbildung 7F deutet auf kleine, wenige Kerne beinhaltende Synzytien hin. Dieser Phänotyp
ist charakteristisch für Fusions-Mutanten, wie in diesem blow-Allel. Blow steuert Vorgänge,
welche
bei
der
Verschmelzung
der
Membranen
von
Muskel-Vorläufern
und
fusionskompetenten Zellen ablaufen (Schröter et al., 2004). Die Tropomyosin-Färbung macht
eine Vielzahl kleiner, runder Zellen sichtbar, die sich zwischen kurzen Muskelfasern befinden
(Abb. 8C). Dabei handelt es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um nicht-fusionierte
fusionskompetente Zellen.
Die Linien in Abbildung 7G und H vertreten die phänotypischen Gruppen mit variablen
Defekten innerhalb der somatischen Muskulatur. Abbildung 7G zeigt den Embryo einer Linie,
in welcher der Muskel 5 in jedem Segment entweder abgerundet ist (Abb. 7G, Pfeile) oder
fehlt. Die Muskeln 25 zeigen auch Anzeichen einer beginnenden Abrundung. Diese
beginnende Degeneration der Muskeln wird in diesem Fall durch Veränderungen des mib2Gens ausgelöst. Die Funktion von mib2 ist die Aufrechterhaltung der Integrität und die
Gewährleistung des Überlebens von Muskeln (Nguyen et al., 2007). Insgesamt wurden vier
mib2-Allele isoliert.
61
Abbildung 7: Beispiele für verschiedene im Screen erhaltene Phänotypen der somatischen
Muskulatur
Weitfeld-Fluoreszenzaufnahmen von Embryonen verschiedener EMS-Linien im Stadium 16/17 in einer
lateralen Ansicht mit Entwicklungsdefekten in einer Gruppe von mittels org-1-RFP markierten
somatischen Muskeln. Die Linien exprimieren zusätzlich HLH54F-RFP in den LVM-Fasern. (A)
Kontrolle. (B) In der snail-Mutante fehlen sämtliche Muskel-RFP-Marker. (C) twist-Allel ohne
Muskulatur, jedoch mit einigen (vermutlich HLH54F-)RFP-positiven Zellen. (D) Starke Reduktion der
somatischen und viszeralen Muskulatur in einem mef2-Allel. (E) Zusätzliche org-1-RFP-Expression in
einem big brain-Allel. (F) Mutationen im Gen blown fuse führen zu dünnen Muskelfasern und
teilweisem Faserverlust. (G) mib2-Allel mit abgerundeten Muskeln 5 (Pfeile) und verkürzten Muskeln
25. (H) Fehlerhafte Anheftung der Muskelfasern in einer kon-tiki-Mutante.
62
Auch im Embryo in Abbildung 7H deutet das org-1-RFP-Muster auf verkürzte, sich
abrundende Muskelfasern hin. Anhand einer Tropomyosin-Färbung ist zu erkennen, dass
neben den Muskeln 8 und 25 auch andere Fasern, vor allem die ventralen longitudinalen
Muskeln, betroffen sind (Abb. 8D). Abbildung 7H zeigt den Embryo eines der sieben aus
dem Screen isolierten kon-Allele. Der Phänotyp stimmt mit den von Schnorrer et al., 2007
gemachten Beobachtungen überein. Das Transmembran-Protein Kon-tiki ist wichtig für die
stabile Anheftung einer Gruppe von Muskelfasern an die Muskelanheftungsstellen in der
Epidermis (Estrada et al., 2007; Schnorrer et al., 2007).
Abbildung 8: Muskel-Morphologie verschiedener EMS-Allele
Embryonen im Stadium 16/17 in einer lateralen Ansicht nach Antikörperfärbung gegen Tropomyosin.
(A) Kontroll-Embryo. (B) mef2-Allel ohne somatische Muskelfasern. (C) Ein Embryo einer blowFusionsmutante mit vielen kleinen Muskelzellen zwischen wenigen kurzen Muskelfasern (Pfeile). (D)
In der kon-Mutante weisen einige Muskeln Anheftungsdefekte auf.
Die Phänotypen der Alarmuskeln, welche eine spezielle Gruppe von somatischen Muskeln
darstellen, werden im Zusammenhang mit den Herzphänotypen in Kapitel 4.1.4 ausführlich
behandelt.
63
4.1.3
Phänotypen der viszeralen Muskulatur
Die Anwesenheit und die Morphologie der longitudinalen viszeralen Muskulatur (LVM)
wurden mit Hilfe des eingangs beschriebenen HLH54F-RFP-Transgens begutachtet. Die in
Mutanten auftretenden Defekte wurden wie schon bei der somatischen Muskulatur in
unterschiedliche Phänotypen-Gruppen unterteilt. Dabei treten die Defekte entweder
zusammen mit Unregelmäßigkeiten innerhalb der somatischen Muskulatur auf oder die
Linien zeigen primär LVM-Defekte. Die Mehrzahl der Defekte der longitudinalen
Darmmuskulatur treten meist gemeinsam mit Unregelmäßigkeiten in der Morphologie des
Mitteldarms auf. Häufig fehlen einzelne oder alle Einschnürungen oder es kommt zu einer
fehlerhaften Anordnung der Darmschleifen.
In eine phänotypische Gruppe fallen Embryonen ohne oder mit stark reduziertem LVM. In
der in Abbildung 9B gezeigten Linie S0323 ist kein HLH54F-RFP zu erkennen, was darauf
hindeutet, dass das LVM fehlt. Dafür sprechen auch die fehlenden Einschnürungen des
Darms. Aufgrund seines Expressionsmusters stellte das Gen HLH54F selbst einen
möglichen Kandidaten dar (Georgias et al., 1997) und tatsächlich konnte die Linie als
HLH54F-Allel identifiziert werden. Die mit Hilfe des Screens isolierten Allele erwiesen sich
als äußerst hilfreich bei der Untersuchung der Funktion von HLH54F (Ismat et al., 2010). Das
Gen kodiert einen Transkriptionsfaktor, der entscheidend zur Spezifizierung, Wanderung und
zum Überleben der Vorläufer des LVM beiträgt (Ismat et al., 2010). Embryonen der Linie in
Abbildung 9C fehlen ebenfalls die Darmeinschnürungen. Im Unterschied zu HLH54FMutanten
existieren
bis
Stadium
11/12
aber
noch
wandernde
LVM-Vorläufer
(Beobachtungen I. Reim und J. Raufer). Da das TVM den wandernden LVM-Zellen als
Substrat dient (Reim et al., 2012), könnten auch Mutationen in Genen, welche an der TVMEntwicklung beteiligt sind, ursächlich für die starke Reduktion des LVM sein. Deshalb kamen
die Gene jeb und Alk als mögliche Kandidaten in Frage. Ausgelöst werden die Defekte in
diesem Fall durch Veränderungen im Alk-Gen. Ebenfalls aus dem Screen isolierte jeb-Allele
besitzen einen ähnlichen Phänotyp (Abb. 9D), was mit der Tatsache übereinstimmt, dass die
Genprodukte in einem gemeinsamen Signalweg bei der Spezifizierung der TVMGründerzellen wirken (Lee et al., 2003). Insgesamt wurden zwölf Alk- und vier jeb-Allele
isoliert. Veränderungen im bereits im vorrangegangenen Kapitel erwähnten Gen mef-2
führen ebenfalls zu einer Reduktion des LVM (Bour et al., 1995) (siehe auch Abb. 7D).
Linien einer zweiten phänotypischen Gruppe zeigen Lücken in der Darmmuskulatur, größere
Abstände zwischen den einzelnen Fasern oder eine unvollständige Ausbreitung des
viszeralen Mesoderms über den Mitteldarm.
64
Abbildung 9: Beispiele für gefundene Phänotypen der longitudinalen viszeralen Muskulatur
Weitfeld-Fluoreszenzaufnahmen von Embryonen verschiedener EMS-Linien im Stadium 16/17 in einer
lateralen Ansicht mit Entwicklungsdefekten in der mittels HLH54F-RFP markierten longitudinalen
viszeralen Muskulatur. Die Linien exprimieren zusätzlich org-1-RFP in einer Gruppe von somatischen
Muskeln. (A) Kontrolle. (B) Mutationen im Gen HLH54F führen zum vollständigen Verlust des LVMs.
(C) Alk-Allel mit einzelnen HLH54F-RFP-positiven Fasern. (D) Jeb-Allel ohne sichtbare LVM-Fasern.
(E) Embryo einer dem Gen wing blister zugeordneten Linie mit reduziertem LVM um den Mitteldarm
herum. (F) Reduzierte Anzahl an LVM-Fasern in bestimmten Abschnitten des Mitteldarms in
homozygoten Embryonen der Linie S1174.
Abbildung 9E zeigt einen Embryo mit kugelförmigem Darm ohne Einschnürungen, an dessen
Seiten sich einzelne LVM-Fasern befinden. Der zentrale Bereich des Mitteldarms ist jedoch
frei von Muskulatur. Die somatischen Muskeln besitzen ebenfalls eine irreguläre Form, einige
Alarmuskeln fehlen. Bei dem gezeigten Beispiel handelt es sich um eines von insgesamt
acht isolierten wing blister (wb)-Allelen. Das Gen wb codiert eine Kette des Laminin-Proteins
(siehe Kapitel 2.1.4.4). Die viszeralen Muskelfasern benötigen für das Umwandern des
Darms die extrazelluläre Matrix. Die Laminin-Proteine bilden das Grundgerüst für die
Basallamina (Urbano et al., 2009), welche unter anderem auch den Darm umgibt. Die Rolle
der Laminin-Gene bei der Mesodermentwicklung wird an späterer Stelle im Zusammenhang
mit Herzphänotypen genauer analysiert (Kapitel 4.3). In Embryonen der Linie S1174 ist die
65
Anzahl der HLH54F-RFP-positiven LVM-Fasern in bestimmten Bereichen des Mitteldarms
reduziert (Abb. 9F). Zudem fehlt mindestens eine Darmeinschnürung. Die Identifizierung
dieser Linie steht noch aus.
In Embryonen der Linien S0439 und S3547 sind die Abstände zwischen den LVM-Fasern
vergrößert (siehe Kapitel 4.2.1, Abb. 13 und Kapitel 4.2.2, Abb. 17E, G). Außerdem fehlt in
einigen Segmenten der Muskel 25. Beide Linien konnten als Allele des FGF-kodierenden
Gens pyr identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals der Einfluss von
Genen des FGF-Signalwegs auf die Wanderung der LVM-Gründerzellen nachgewiesen
werden. Im Zuge der Untersuchungen wurden auch die Linien S0439 und S3547 einer
genaueren Analyse unterzogen (siehe Kapitel 4.2).
4.1.4
Herz- und Alarmuskel-Phänotypen
4.1.4.1 Phänotypen des Dorsalgefäßes
Ein Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung von EMS-Mutanten mit Defekten in der
Herzentwicklung. Auch die dem somatischen Mesoderm zugeordneten Alarmuskeln können
wegen ihrer Anheftung an das Dorsalgefäß potentiell Herzdefekte aufdecken. Ähnlich der
Kategorien für die bereits beschriebenen Defekte im somatischen und viszeralen Mesoderm
erfolgt auch hier eine Einteilung in verschiedene phänotypische Gruppen, die in diesem
Kapitel mit einigen Beispielen kurz vorgestellt werden sollen.
Die erste phänotypische Gruppe fasst Linien zusammen, die eine stark reduzierte Anzahl
oder gar keine Kardioblasten besitzen. Eine Ursache dafür kann die Beeinträchtigung von
Genen sein, welche für die Spezifizierung des dorsalen oder kardiogenen Mesoderms
zuständig sind. Beispiele dafür sind die Komponenten des Dpp- oder Wg-Signalwegs
(Frasch, 1995; Wu et al., 1995) (siehe Kapitel 2.1.4.2). Der Funktionsverlust von Genen, die
für die frühe Entwicklung des gesamten Mesoderms von Bedeutung sind, führt ebenfalls zum
Verlust der Herzstrukturen. Beispiele dafür sind die bereits im Zusammenhang mit der
somatischen Muskulatur erwähnten Gene twist und snail. Außerdem kann durch den Verlust
oder
die
Reduktion
der
GFP-Reporterexpression
der
Eindruck
entstehen,
dass
Herzstrukturen fehlen. Bei Linien mit einer stark reduzierten Anzahl von Kardioblasten kann
die frühe Wanderung der mesodermalen Zellen, die teilweise eingeschränkte Spezifizierung
von Herzzell-Vorläufern oder die fehlende Spezifizierung ganz bestimmter Herzzell-Vorläufer
betroffen sein. Denkbar wäre auch der sekundäre Verlust einzelner Zellen in späteren
Stadien. Mutationen in Genen, welche Komponenten des FGF-Signalwegs kodieren, können
beispielsweise zu Phänotypen dieser Klasse führen (siehe Kapitel 4.2.1).
66
Linien der zweiten phänotypischen Gruppe zeigen einen gegenteiligen Phänotyp, nämlich
extra Zellen im Herz. Zusätzliche Kardioblasten sind häufig auf Mutationen in Genen
zurückzuführen welche an der Notch-Signaltransduktion beteiligt sind (zum Beispiel
kuzbanian, oder mastermind, siehe Tab. 16). Der Notch-Signalweg steuert mittels der
lateralen Inhibition auch die Selektion der Vorläufer-Zellen des kardiogenen Mesoderms
(Albrecht et al., 2006; Hartenstein et al., 1992), ähnlich der Funktion im somatischen
Mesoderm. Zusätzlich ist er in einer späteren Entwicklungs-Phase erforderlich, bei der seine
Aktivität
nach
der
asymmetrischen Teilung
bestimmter
Herzzell-Vorläufer
für
die
Unterdrückung des Kardioblasten-Zellschicksals und die Förderung des PerikardialzellSchicksals in einer der Tochterzellen sorgt (siehe Kapitel 2.1.4.2).
Die größte phänotypische Gruppe bilden Linien mit veränderter Herzmorphologie. Zu den
morphologischen Veränderungen zählen Anreihungsdefekte der Kardioblasten oder eine
irreguläre Zellform. Außerdem können die Lumenbildung oder das Zusammenführen der
bilateralen Kardioblasten-Reihen betroffen sein. Die genannten Defekte können auf sehr
unterschiedlichen Wegen zustande kommen. Mutationen in Genen, welche an der
Entstehung des Herz-Lumens beteiligt sind, indem sie zum Beispiel in den Kardioblasten
bestimmte Membrandomänen festlegen, können ebenfalls zu den für diese PhänotypenKlasse typischen Defekten führen (siehe Einleitung, Kapitel 2.1.4.2). Ein Beispiel dafür ist
das Gen slit, für das ein neues Allel aus dem Screen isoliert wurde. Wenn Gene betroffen
sind, welche eine Rolle beim Rückenschluss spielen, können häufig Fehler in der Ausbildung
des Herzschlauchs beobachtet werden. Eine abnormale Zellform kann ein Hinweis auf eine
fehlerhafte oder unvollständige Zellteilung sein. Vertreter dieser phänotypischen Subklasse
sind beispielsweise Faktoren, welche wichtige Vorgänge zur Vorbereitung der Zellteilung
steuern. Im folgenden Abschnitt werden einige Beispiele aus den genannten phänotypischen
Klassen vorgestellt.
In der EMS-Linie S0125 (Abb. 10B) kommt es neben Veränderungen der somatischen
Muskulatur zum Verlust des Dorsalgefäßes. Durch den unvollständigen Rückenschluss ist
die Gesamtmorphologie verändert. Die Linie konnte dem Gen schnurri (shn) zugeordnet
werden, einem Regulator des Dpp-Signalwegs (Affolter et al., 2001; Arora et al., 1995;
Grieder et al., 1995). In die Gruppe ohne Herzzellen fallen auch starke Allele des Gens
wingless (wg) (Abb. 10C), welche die Darmmuskulatur als einzige erkennbare mesodermale
Struktur besitzen. Sowohl in den schnurri-Allelen, als auch in den starken wg-Allelen
existieren in Embryonen einzelne tinC-GFP-positive Zellen mit unklarer Identität (Abb. 10B
und C, Stern). Dabei handelt es sich um die in Kapitel 2.2.2 beschriebene ektopische
Expression des tinC-GFP-Reporterkonstrukts. Abbildung 10D zeigt eine Linie mit einer
großen Lücke im Herzschlauch. Dünne, org-1-RFP-positive Fasern, bei denen es sich
wahrscheinlich um Ausläufer eines oder mehrerer Alarmuskeln handelt, verbinden die beiden
67
Herzabschnitte. Die übrigen Alarmuskeln sind in der Nähe des posterioren Herzteils
angeheftet. Diese Phänotypen-Subklasse wurde bisher nicht intensiv untersucht.
Sieben
EMS-Linien
wurden
aufgrund
ihres
Phänotyps
ebenfalls
zunächst
der
phänotypischen Gruppe ohne Kardioblasten zugeteilt. Allen gemeinsam ist das Fehlen
jeglicher tinC-GFP-Expression. Allerdings sind alle anderen Muskeln einschließlich der
Anheftung und Ausrichtung der Alarmuskeln morphologisch unauffällig (Daten nicht gezeigt).
Der Phänotyp konnte jedoch durch das Einkreuzen eines alternativen tinC-GFPReporterkonstrukts
gerettet
werden.
Zudem
bestätigen
Antikörperfärbungen
gegen
herzspezifischen Proteine die Existenz der Herzstrukturen und lassen keinen Defekt
erkennen (Daten nicht gezeigt). In diesen Fällen ist sehr wahrscheinlich eine Mutation im
GFP-Gen des Reporters für den Phänotyp verantwortlich.
In dreizehn Linien ist die Expression des tinC-GFP-Reporters entweder in bestimmten
Bereichen des Herzens oder in allen Kardioblasten stark reduziert. Im Gegensatz zu den
EMS-Linien ohne tinC-GFP-Expression lässt sich der Phänotyp durch ein zusätzlich
eingekreuztes GFP-Reporterkonstrukt nicht retten. Um den Grund für die Reduktion der
Reporter-Expression herauszufinden, sind weitere Untersuchungen notwendig.
Extra Zellen im Herz zeigen die Beispiele aus der zweiten phänotypischen Gruppe. In den
Linien S0669 und S1736 (Abb. 10E, F) ist die tinC-GFP Expression stark verbreitert, wobei
sich die erhöhte Anzahl an Zellen entweder auf das Dorsalgefäß beschränkt (Abb. 10F) oder
ebenfalls die somatische Muskulatur betrifft (Abb. 10E, Pfeil). Beide Allele konnten mithilfe
des Kandidaten-Verfahrens (siehe Kapitel 4.1.1) als Komponenten des Notch-Signalwegs
identifiziert werden. Die Mutation der Linie S0669 in Abbildung 10E betrifft das Gen
mastermind, einen Ko-Aktivator des Signalwegs (Petcherski and Kimble, 2000). In der Linie
S1736 in Abbildung 10F ist das Gen kuzbanian betroffen, das für eine Metalloprotease
kodiert, welche an der Spaltung des Notch-Rezeptors beteiligt ist (Albrecht et al., 2006;
Lieber et al., 2002; Pan und Rubin, 1997). bib-Allele konnten ebenfalls aus dem Screen
isoliert werden und zeigen einen den mastermind-Allelen entsprechenden Phänotyp. In
Bezug auf die somatische Muskulatur wurde die Ähnlichkeit der Phänotypen bereits in
Kapitel 4.1.2 erwähnt. Um das Vorhandensein von zusätzlichen Kardioblasten zu bestätigen,
wurde eine Antikörperfärbung gegen Mef2 und Doc durchgeführt. Mef2 markiert die Kerne
aller Muskelzellen, Doc ist in einer Untergruppe von Kardioblasten exprimiert. Das in
Abbildung 11B gezeigte bib-Allel besitzt mehr Zellkerne im Herz, was am einfachsten an den
Doc-positiven Zellen zu sehen ist. Anstatt der im Wildtyp vorhandenen zwei Zellen pro
Hemisegment existieren in diesem Embryo im Herz-Abschnitt jeweils vier Doc-positive Kerne
(Abb. 11B, Pfeile). Wie bereits unter 4.1.2 angemerkt, wurden durch Komplementationstests
insgesamt fünf bib- und acht mam-Allele isoliert.
68
Eine weitere Linie, S3633 mit einem sehr ähnlichen Herz- und somatischen MuskelPhänotyp (Daten nicht gezeigt) konnte überraschenderweise weder bib- noch mam-Allele
komplementieren: diese Linie war letal sowohl über die Mutante bib1 und die bib-deletierende
Defizienz Df(2L)BSC50, als auch über mam8 und andere mam-Allele aus dem Screen.
Allerdings ist die zusätzliche tinC-GFP-Expression in S3633-Homozygoten schwächer
ausgeprägt als in homozygoten Embryonen der klar zuzuordnenden bib- oder mam-Allele.
Phänotypisch ähneln mam8/S3633-Embryonen S3633-Homozygoten im Herzen eher als
bib1/S3633-Embryonen. Bei letzteren scheint das Herz weitgehend normal zu sein,
wohingegen die org-1-RFP-markierten somatischen Muskelfasern deutlicher verbreitert sind
als bei mam8/S3633-Embryonen. Es besteht die (statistisch allerdings sehr selten zu
erwartende) Möglichkeit, dass es sich bei der Linie um eine Doppelmutante bestehend aus
speziellen hypomorphen bib- und mam-Allelen handelt. Überdies existieren alternative
Erklärungsmöglichkeiten zu deren Aufklärung weitere Untersuchungen erforderlich wären.
Bei den folgenden Beispielen handelt es sich um Vertreter der großen
phänotypischen Gruppe mit veränderter Herzmorphologie (Abb. 10G - L). Der Embryo in
Abbildung 10G zeigt eine etwas breitere tinC-GFP-Expression in der Linie S1459. In dem in
der Vergrößerung dargestellten Herz-Abschnitt scheinen sich zusätzliche tinC-GFP-positive
Zellen zu befinden. Eine Kardioblasten-spezifische Antikörperfärbung zeigte lediglich
Anreihungsdefekte,
aber
keine
zusätzlichen
Zellen
(Daten
nicht
gezeigt).
Durch
Kreuzungsexperimente mit Defizienz-Linien konnten zwei letale Regionen bestimmt werden.
Allerdings konnte der Phänotyp in trans über die die Regionen überspannenden Defizienzen
Df(2R)BSC597 und Df(2L)ED1378 nicht bestätigt werden. Das Zusammenführen der
Kardioblasten-Reihen ist in der Linie S1238 (Abb. 10H) unvollständig. Nur im anterioren Teil
der Aorta treffen die Zellreihen an der dorsalen Mittelinie aufeinander. Dieser und ähnliche
Effekte sind häufig die Folge von Veränderungen in Prozessen, welche den Rückenschluss
während der Embryonal-Entwicklung steuern. Eine Rolle dabei spielt zipper (zip) (Blake et
al., 1999), was in diesem Beispiel betroffen ist. Die Embryonen der Linie S1635 (Abb. 10I)
besitzen ebenfalls einen Abschnitt
im Bereich der hinteren Aorta, in dem der Abstand
zwischen den beiden Kardioblasten-Reihen vergrößert ist, was zur Ausbildung einer „o“förmigen Struktur führt. Wegen des komplexen Zusammenhangs mit dem epidermalen
Rückenschluss wurde auch diese Phänotypen-Klasse bisher nicht näher analysiert. Deshalb
können auch keine Aussagen darüber gemacht werden, inwieweit bei einzelnen Linien
Mutationen direkten Einfluss auf die Bildung des Herzschlauchs haben, oder ob ein
unvollständiger Rückenschluss vorliegt. Ein Zeichen für letzteres wäre eine Herausstülpung
des Darms zwischen die Kardioblasten-Reihen, was in einigen Linien, nicht aber in den hier
gezeigten Beispielen beobachtet wurde.
69
Abbildung 10: Ausgewählte Beispiele für isolierte Mutanten mit Herz-Defekten in den drei
phänotypischen Hauptkategorien: „keine oder reduzierte Kardioblasten“ (B-D), „extra
Kardioblasten“ (E, F) und „morphologische Defekte“ (G-L).
70
Abbildung 10: Ausgewählte Beispiele für isolierte Mutanten mit Herz-Defekten in den drei
phänotypischen Hauptkategorien: „keine oder reduzierte Kardioblasten“ (B-D), „extra
Kardioblasten“ (E, F) und „morphologische Defekte“ (G-L).
Gezeigt sind Embryonen verschiedener EMS-Linien im Stadium 16/17 in einer dorsalen
beziehungsweise dorso-lateralen Ansicht mit Entwicklungs-Defekten im Herz. Die Linien exprimieren
zusätzlich org-1-RFP in einer Gruppe von somatischen Muskeln und HLH54F-RFP in der
longitudinalen viszeralen Muskulatur. Bei allen Aufnahmen handelt es sich um Projektionen mit dem
Apotome aufgenommener Bildstapel. (A) Wildtyp. (B) shn-Allel ohne erkennbare Herz-Strukturen. (C)
Fehlende Kardioblasten sind ebenfalls ein Merkmal von wg-Allelen. Die einzigen tinC-GFP-positiven
Zellen in B und C sind nicht-kardiale Zellen mit unklarer Identität (Stern). (D) Ein Teil des Herzes fehlt
in homozygoten Embryonen der Linie S0825. (E, F) Extra Kardioblasten als Folge von Mutationen in
Genen des Notch-Signalwegs am Beispiel von mastermind (E) und kuzbanian (F). Im mastermindAllel sind vergrößerte somatische Muskelfasern sichtbar (E, Pfeil). (Die weitestgehend normalen org1-RFP-positiven Muskeln der kuz-Mutante liegen hier außerhalb des projizierten Bereichs.) (G)
Fehlerhafte Anordnung der Kardioblasten mit einzelnen Zellen im Herzlumen in der Linie S1459. (H)
Mutation im zipper Gen führt zu posterior offenem Herzschlauch. (I) S1635 zeigt einen „o“-förmigen
Abschnitt in der Mitte des Herzschlauchs. (J) Slit-Allel mit Defekten in der Ausbildung des
Herzschlauchs. Einreihige Abschnitte und Anreihungs-Defekte sind die Folge (Pfeile). (K)
Unregelmäßig geformtes Dorsalgefäß in homozygoten S1264-Embryonen. (L) tum-Allel zeigt
vergrößerte Kardioblasten und unregelmäßige Anordnung der Zellen.
In Embryonen der Linie S0988 (Abb. 10J) sind die Kardioblasten unregelmäßig angeordnet.
Im Bereich der anterioren Aorta kann man einen kurzen Abschnitt erkennen, welcher nur aus
einer Zellreihe zu bestehen scheint (Abb. 10J, Pfeil). Im hinteren Teil des Dorsalgefäßes ist
die reguläre Anreihung der Kardioblasten häufig unterbrochen. Es handelt sich in diesem Fall
um das weiter oben erwähnte slit-Allel. Der in der Literatur beschriebene Lumen-Defekt
(Medioni et al., 2008; Santiago-Martínez et al., 2008) lässt sich allerdings anhand des tinCGFP-Expressionsmusters in der Aufsicht bei dieser Auflösung nicht zuverlässig erkennen.
Andere Mutanten mit subtilen Lumendefekten als einziges Merkmal sind möglicherweise in
diesem Screen nicht oder nur unvollständig erfassbar. Die Linie S1264 (Abb. 10K) zeigt
sowohl eine veränderte Morphologie des Herzschlauchs, der an einigen Stellen seitliche
Ausläufer bildet, als auch das scheinbare Vorhanden-Sein von extra Kardioblasten. Die
zusätzlichen Zellen scheinen sich aber im Gegensatz zu den in Abb. 10E und F gezeigten
Beispielen
nur
in
bestimmten
Regionen
des
Dorsalgefäßes
zu
befinden.
Eine
Antikörperfärbung gegen Doc23 und Mef2 zeigt jedoch auch hier, dass keine zusätzlichen
Zellen vorhanden sind. Vielmehr sind einzelne Kardioblasten deplatziert und befinden sich
innerhalb des Herz-Lumens (Abb. 11D). Einen subtilen Defekt kann man in der Linie S1395
in Abbildung 10L erkennen. Bei genauer Betrachtung fallen die in ihrer Form und Größe
veränderten Herz-Zellen auf und auch die ersten drei Paare von Alarmuskeln wirken am
dorsalen Ende stark verbreitert. Das für den Phänotyp verantwortliche Gen ist in diesem Fall
überraschenderweise tumbleweed (tum), welches an der Induktion des kontraktilen Rings im
71
Vorfeld der Zellteilung beteiligt ist (Zavortink et al., 2005). Defekte in der Zellteilung führen
hier
vermutlich
zu
vergrößerten
Kardioblasten,
allerdings
sind
keine
deutlichen
Abweichungen in der Zellzahl feststellbar (Abb. 11C). Die Antikörperfärbung gegen Doc23
und Mef2 zeigt vielmehr mehrere kleine Zellkerne auf engem Raum (Abb. 11C, Pfeil). Das
könnte ein Hinweis auf eine unvollständige Zellteilung und das Vorhandensein von
Doppelkernen sein.
Abbildung 11: Analyse der Herz-Phänotypen verschiedener EMS-Linien
Dorsale Ansicht von Dorsalgefäßen verscheidender EMS-Linien mit Defekten in der Herz-Entwicklung.
Die Kardioblasten sind durch eine Antikörperfärbung gegen Doc2+3 und Mef2 markiert. (A) Herz eines
Kontroll-Embryos mit jeweils vier Doc-negativen und zwei Doc-positiven Kardioblasten pro
Hemisegment. (B) bib-Allel mit extra Kardioblasten, leicht an den zusätzlichen Doc-positiven
Zellkernen zu erkennen (Pfeile). (C) Paarige Anordnung von Doc- und Mef-2-positiven Zellkernen in
einem tum-Allel. Der enge Kontakt der Kerne (Pfeil) ist ein möglicher Hinweis auf mehrkernige Zellen.
(D) EMS-Linie mit Defekten in der Anordnung der Kardioblasten im Herz-Abschnitt.
4.1.4.2 Phänotypen der Alarmuskeln
Eine spezielle Gruppe von Herzphänotypen bilden Mutanten mit Defekten in der Entwicklung
der Alarmuskeln. In der Regel wurden diese Defekte zusammen mit denen der somatischen
Muskulatur
behandelt.
Die
in
diesem
Abschnitt
vorgestellten
EMS-Linien
zeigen
hauptsächlich Alarmuskeldefekte und sind Vertreter von zwei Phänotyp-Gruppen.
Die erste Gruppe umfasst Linien, welche eine irreguläre Anzahl von Alarmuskelfasern
aufweisen. In der Linie S0017 (Abb. 12B) fehlen sämtliche Alarmuskeln. Es sind nur die
viszeralen Muskelfasern zu erkennen, welche leichte Unregelmäßigkeiten in Bezug auf den
Abstand zwischen den einzelnen Fasern aufweisen. Das Herz besteht teilweise nur aus
einer Zellreihe. Die restlichen org-1-RFP-positiven somatischen Muskeln sind vorhanden,
allerdings sind die Muskeln 5 und 8 in ihrer Form teilweise verändert oder deplatziert (nicht
mit abgebildet in der dorsalen Projektion von Abb. 12B). Im Gegensatz dazu zeigt die Linie
S1947 (Abb. 12C) deutlich mehr als sieben Alarmuskel-Paare, wie sie im Wildtyp
vorkommen. Auch in diesem Fall ist das Herz etwas abnormal.
72
In den Linien der zweiten phänotypischen Gruppe ist die Anheftung der Alarmuskelfasern an
das Herz beeinträchtigt. Die Linie S3064 (Abb. 12D) zeigt einen Anheftungs-Phänotyp.
Einige Alarmuskel-Fasern sitzen an einer lateralen Position ohne Kontakt zum Herz. In dem
hier gezeigten Beispiel hat mindestens ein Alarmuskel den Kontakt zum Dorsalgefäß
verloren, oder hält die Verbindung nur über dünne Ausläufer aufrecht (Abb. 12D, Pfeile). Die
detaillierte Analyse der Phänotypen und die Identifizierung der dieser Phänotypen-Klasse
zugeordneten Linien werden in Kapitel 4.3 im Detail beschrieben.
Abbildung 12: Alarmuskel-Phänotypen
(A) Wildtyp-Embryo mit sieben Paaren von Herz-assoziierten Alarmuskeln. Aus dem Screen konnten
Linien ohne Alarmuskeln (B) oder mit zusätzlichen Alarmuskelfasern (C) isoliert werden. Die
somatische Muskulatur (nicht oder nur teilweise im betrachteten Fokusbereich) und das Herz sind in
beiden Fällen ebenfalls leicht verändert. (D) Embryo mit Anheftungsdefekt. Die Distanz zwischen
einigen Alarmuskeln und dem Herz ist vergrößert (Pfeile).
4.1.5
Zusammenfassung der Mutagenese-Screen-Ergebnisse
Durch diesen Mutagenese-Screen wurden 469 Linien mit Mutationen auf dem 2. Chromosom
selektiert. Einige der isolierten Allele konnten bereits aufgrund bestimmter Merkmale und
bestehender Kenntnisse auf Kandidaten-Basis, andere durch Komplementationstests mit
einem Defizienzensatz bestimmten Genen zugeordnet werden. Die meist mehrfache
Isolierung von Allelen bekannter mesodermaler Entwicklungsgene verdeutlicht dabei die
Wirksamkeit mit der bei diesem Screen Mutanten generiert wurden. Es ist somit möglich, mit
Hilfe dieses Screens und den darin verwendeten Reporterkonstrukten Gene zu identifizieren,
73
welche an der Entwicklung eines oder mehrerer der drei betrachteten Muskeltypen
(somatische, viszerale, und Herz-Muskeln) beteiligt sind.
Tabelle 16 zeigt eine Übersicht bereits identifizierter Allele mit Angabe des betroffenen
Muskeltyps. Die Identifizierung erfolgte dabei in Zusammenarbeit mit Ingolf Reim (IR),
Christoph Schaub (CS), Denise Mackrodt (DM) und Jasmin Raufer (JR) (wie angegeben). In
vielen Fällen ist die Einordnung in nur eine Kategorie nicht möglich, da zwei oder sogar alle
drei Hauptmuskeltypen Defekte aufweisen.
74
Gen
Kategorie
Anzahl der Allele
Anaplastic lymphoma kinase
LVM
12 (IR+JR)
big brain
DV + SM + LVM
5
blown fuse
SM + LVM
5 (IR)
Cg25C / collagenIV a1
DV + AM
5
epidermal growth factor receptor
DV + SM +LVM
4 (IR)
HLH54F
LVM
2 (IR)
inscuteable
DV
1
jelly belly
LVM
4 (IR+JR)
kon-tiki
SM
7 (IR)
kuzbanian
DV
16
Laminin B1
DV + SM + LVM
8 (IR)
mastermind
DV + SM
8
mind bomb 2
SM
4 (IR)
muscle wasted
DV + SM + LVM
3 (IR)
myocyte enhancer factor 2
SM + LVM
6 (IR)
numb
DV + SM
3 (IR)
pyramus / FGF8-like2
DV +SM + LVM
2 (IR)
raw
DV
1
scab / αPS3-Integrin
DV + SM
1 (IR)
schnurri
DV + SM + LVM
7
screw
DV + SM + LVM
2
slit
DV +SM
1 (IR)
snail
DV + SM + LVM
2
sticks and stones
SM + LVM
6 (IR+CS)
tailup / islet
DV + SM
2 (IR+DM)
tumbleweed / racGAP50C
DV + SM + LVM
3
twist
DV + SM + LVM
2
u-shaped
DV + SM
1 (IR)
wing blister
DV + SM + LVM
8 (IR)
wingless
DV + SM
1 (IR)
zipper
DV
1
Tabelle 16: Übersicht der identifizierten EMS-Allele
DV: Dorsalgefäß („dorsal vessel“); LVM: longitudinale viszerale Muskulatur; SM: somatische
Muskulatur
75
4.2
Erweiterung der bisher bekannten Funktionen des FGF-Signalwegs in der
Mesoderm-Entwicklung von Drosophila durch die Analyse von EMS-induzierten
Mutanten
4.2.1
Punkt-Mutationen im Gen pyramus führen zu Defekten in der Entwicklung des
Mesoderms
Eine aus dem EMS-Screen hervor gehende Komplementationsgruppe, bestehend aus den
Linien S0439 und S3547, zeichnete sich durch eine Kombination charakteristischer Defekte
im Herzen sowie in der viszeralen und somatischen Muskulatur aus. Beide Mutanten zeigen
Unregelmäßigkeiten in der Anordnung der Herzzellen und man kann Bereiche im Herz mit
nur einer Reihe von Herzzellen erkennen (Abb. 13B, C, Pfeile). Zusätzlich fehlt in den
Embryonen beider Linien in einigen Segmenten der org-1-RFP-positive somatische Muskel
25 (Abb. 13E, F, Pfeilspitzen). Eine muskelspezifische Antikörperfärbung bestätigte die
Abwesenheit von Muskel 25 und einiger zusätzlicher Muskel der Körperwandmuskulatur
(Daten nicht gezeigt). Die Längsmuskulatur des Darms weißt ebenfalls Veränderungen auf.
Der Abstand zwischen den einzelnen Fasern ist vor allem im Bereich des vorderen
Mitteldarms vergrößert (Abb. 13E, F), in einzelnen Embryonen sind dort auch
Unterbrechungen in der viszeralen Muskulatur zu erkennen.
Abbildung 13: EMS-induzierte pyramus-Allele zeigen Defekte in der Mesodermentwicklung
76
Abbildung 13: EMS-induzierte pyramus-Allele zeigen Defekte in der Mesodermentwicklung
Dorsale beziehungsweise ventrale Ansicht von Kontroll-Embryonen und Embryonen der aus dem
Screen isolierten pyr-Allele. GFP-/RFP-Reporterkonstrukte markieren Vertreter der drei
Hauptmuskeltypen (tinC-GFP in allen Kardioblasten; org-1-SM-RFP in den Alarmuskeln und in einer
Gruppe von somatischen Muskeln; HLH54F-LVM-RFP im LVM). (A) Dorsale Ansicht eines KontrollS0439
Embryos in Stadium 16. (B) pyr
-Embryo mit veränderter Morphologie des Dorsalgefäßes und
S3547
kleinen Lücken im Herz (Pfeil). Ähnliche Defekte zeigen Embryonen des zweiten EMS-Allels pyr
(C). (D) Ventrale Ansicht eines Kontroll-Embryos in Stadium 16. (E, F) Ventrale Ansichten der EMSinduzierten pyr-Allele S0439 und S3547 mit vergrößerten Abständen zwischen den longitudinalen
viszeralen Muskelfasern. Außerdem fehlt Muskel 25 in einzelnen Hemisegmenten (Pfeilspitzen).
Zusammengenommen gaben diese eher subtilen aber spezifischen Defekte in allen drei
Muskelgruppen Anlass zu einer genaueren Analyse. Die im Folgenden dargestellte
genetische Charakterisierung der beiden EMS-Linien wurde von Ingolf Reim durchgeführt,
meine Aufgabe bestand in der weiteren Analyse der Phänotypen. Teile dieses Kapitels sind
in Reim et al. (2012) veröffentlicht.
Beide Linien erwiesen sich, basierend auf der Letalität der transheterozygoten Kombination,
als allelisch. Die Region mit dem letalen Treffer konnte mithilfe von Defizienzen auf den
Abschnitt 48C1-4 auf dem rechten Arm des zweiten Chromosoms festgelegt werden. Sowohl
die Letalität als auch der Phänotyp konnten in transheterozygoten Kombinationen mit
Defizienzen dieser Region bestätigt werden. Alle nicht komplementierenden Defizienzen
entfernen die beiden FGF8-verwandten Gene pyramus (pyr) und thisbe (ths) (Abb. 14). Da
bekannt ist, dass der FGF-Rezeptor heartless (htl) eine entscheiden Rolle bei der
Entwicklung des Herzens und bestimmter somatischer Muskeln spielt (Gisselbrecht et al.,
1996; Shishido et al., 1997) (Kadam et al., 2009; Klingseisen et al., 2009), wurde überprüft,
ob
die
beiden
Linien
Mutationen
in
pyr
oder
ths
aufweisen.
Durch
weitere
Komplementationstests mit kleineren Deletionen der beiden FGF-Gene wurde pyramus als
das Gen identifiziert, welches am wahrscheinlichsten betroffen ist. Beide EMS-Allele sind
über die pyr-Deletionen Df(2R)pyr36 und pyr18 (Kadam et al., 2009; Klingseisen et al., 2009)
letal oder semi-letal. Im Gegensatz dazu komplementieren Deletionen, welche ausschließlich
ths entfernen (Df(2R)ths238 und ths759 (Kadam et al., 2009; Klingseisen et al., 2009)),
vollständig. Tatsächlich deckte die Sequenzierung der Exons des pyr-Gens in beiden EMSLinien im Vergleich zum Referenz-Stamm jeweils eine einzige Punktmutation auf (Abb. 14).
In pyrS0439 wird das Codon CAG, welches ein Glutamin an Position 117 innerhalb der FGFDomäne kodiert in ein vorzeitiges Stop-Codon (TAG) überführt. In pyrS3547 ist die SpliceStelle nach Exon 3 von GT zu AT mutiert. Das nicht prozessierte Transkript kodiert folglich
ein Protein mit stark verkürzter FGF-Domäne, da die Sequenz des folgenden Introns ein
Stop-Codon enthält. Die in beiden Fällen entstehenden Proteine sind mit großer
77
Wahrscheinlichkeit nicht funktionsfähig, da ein erheblicher Teil der FGF-Domäne fehlt. Die
folgenden von mir durchgeführten phänotypischen Analysen bestätigen diese Vermutung.
Abbildung 14: Genomische Anordnung der FGF-Liganden pyramus und thisbe
Karte der genomischen Region, welche die Gene pyramus und thisbe enthält. Sie zeigt zusätzliche
Gene im Überlappungsbereich der Defizienzen, die benutzt wurden, um beide FGF8-ähnlichen Gene
18
759
zu eliminieren. Zusätzlich sind die pyr-Deletion pyr und die ths-Deletion ths eingetragen. Darunter
ist die Gen-Struktur von pyr und die Positionen der identifizierten Mutationen der EMS-Allele
abgebildet.
Unter Einbeziehung der erlangten Erkenntnisse wurde der entdeckte Herz-Phänotyp mithilfe
einer
Antikörperfärbung
gegen
die
Gen-Produkte
von
Dorsocross2(Doc2)/Dorsocross3(Doc3) und H15 genauer analysiert. Während H15 in
sämtlichen Kardioblasten exprimiert wird (Reim et al., 2005), beschränkt sich die Verteilung
von Doc auf eine Untergruppe von Herzzellen, welche für die Ausbildung der Ostien
verantwortlich ist (Reim und Frasch, 2005) (Abb. 15A). Die embryonalen Herzphänotypen
wurden in trans über Df(2R)BSC25 analysiert, um möglich Effekte von zusätzlichen
Mutationen auf dem mutierten Chromosom auszuschließen. In Embryonen, denen beide
Heartless-Liganden fehlen, existieren nur einzelne durch anti-Doc2+3 und/oder anti-H15
markierte Zellen entlang der dorsalen Mittelinie (Abb. 15B). Das entspricht im Wesentlichen
dem htl Null-Phänotyp. In der transheterozygoten Kombination von pyrS0439 über
Df(2R)BSC25 treten Unregelmäßigkeiten in der Anordnung der Kardioblasten auf, oft auch
Abschnitte mit nur einer Reihe von Herzzellen (Abb. 15C). Die normalerweise dort sitzenden
Zellen sind entweder deplatziert oder fehlen. Bei den fehlenden Kardioblasten scheint es
sich hauptsächlich um Doc-negative Zellen zu handeln. Im Wesentlichen zeigen beide EMSAllele eine ähnlich starke Ausprägung dieses Phänotyps (Abb. 15C, D), wobei in der
78
transheterozygoten Kombination die Herz-Defekte tendenziell stärker ausgeprägt sind als in
den homozygoten EMS-Mutanten. Die beobachtete Verstärkung des Phänotyps mit
Df(2R)BSC25 wird möglicherweise durch die zusätzliche Entfernung einer Kopie des
potentiell redundanten thisbe Gens hervorgerufen. Des Weiteren ist der KardioblastenPhänotyp der EMS-Mutanten mindestens ebenso stark wie der der kompletten pyr-Deletion
(pyr18/ Df(2R)BSC25, Abb. 15E), meist sogar etwas stärker. Eine phänotypische Verstärkung
im Vergleich zu pyr18 wurde auch bei der weiter unten dargestellten Analyse des
Darmmuskel-Phänotyps beobachtet. Mögliche Ursachen hierfür werden daher später
diskutiert.
Abbildung 15: Dosis-Reduktion des FGF-Liganden pyramus führt zu Herzdefekten
Antikörperfärbung gegen Doc2+3 (grün) und H15 (rot) zur Analyse des Herz-Phänotyps. (A) WildtypEmbryo mit H15 in allen Kardioblasten und Doc2+3 in den Ostien-bildenden Zellen. (B) Der Verlust
beider FGF-Liganden führt zum fast vollständigen Verlust der Herzstrukturen. Einzelne Doc/H15markierte Zellen entlang der dorsalen Mittelinie (Pfeile). Unregelmäßigkeiten in der Anordnung der
S0439
S3547
Herzzellen und Lücken (Pfeilspitzen) in pyr
/Df(2R)BSC25- (C) und pyr
/Df(2R)BSC2518
Embryonen (D). (E) Embryonen der pyr-Deletion pyr in trans über Df(2R)BSC25 zeigen einen
ähnlichen Herz-Phänotyp.
Eine Gruppe von Perikardialzellen und dorsalen somatischen Muskeln gehen aus Klustern
von Even-skipped (Eve)-positiven Vorläuferzellen im dorsalen Mesoderm hervor. Wie bereits
veröffentlicht (Shishido et al., 1997) (Kadam et al., 2009; Klingseisen et al., 2009), spielt der
FGF-Signalweg
eine
entscheidende
Rolle
bei
der
Bildung
dieser
Eve-positiven
Vorläuferzellen. Um die Auswirkungen im mutanten Hintergrund oder durch den
vollständigen oder teilweisen Verlust der FGF-Liganden zu analysieren, wurde eine
Antikörperfärbung gegen das Even-skipped Protein in Embryonen (Stadium 10-11) mit
79
entsprechendem genetischem Hintergrund durchgeführt. Die Resultate wurden anschließend
einer einfachen statistischen Betrachtung unterzogen (Tab. 17). Die Analyse sollte
bestätigen, dass es sich bei den pyr-Allelen aus dem EMS-Screen um amorphe Allele
handelt. In amorphen Allelen verliert das Protein durch die Mutation seine Funktion.
Abbildung 16: Verlust von Eve-positiven Vorläufer-Zellen im dorsalen Mesoderm von FGFMutanten
(A-C) Even-skipped Antikörperfärbung zur Markierung der Vorläufer-Zellen des dorsalen Mesoderms.
Im Wildtyp sind in Stadium 10 elf dieser Zellkluster entlang des ausgestreckten Keimstreifs zu
erkennen (A). Zusätzlich ist Even-skipped im Nervensystem exprimiert. Der Verlust beider FGF8S0439
/Df(2R)BSC25-Embryo
ähnlichen Gene führt zum Verlust der Eve-positiven Zellkluster (B). (C) pyr
mit einzelnen verbliebenen Vorläufer-Zellen (Pfeilspitze).
Eve-positive Zellkluster
Genotyp
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
BSC25 x BSC259
20
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
BSC25 x pyr18
20
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
BSC25 x pyrS0439
5
9
1
2
2
-
1
-
-
-
-
-
BSC25 x pyrS3547
3
5
6
3
3
-
-
-
-
-
-
-
238
-
-
-
-
1
1
2
5
3
5
3
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
20
BSC259 x ths
S13b16c18a.1
Tabelle 17: Anzahl der Eve-positiven Zellkluster in Embryonen mit reduzierter FGF-LigandenAktivität
Aufgeführt ist die Anzahl der verbliebenen Eve-positiven Zellkluster abhängig vom genetischen
Hintergrund. Pyr-defiziente Mutanten zeigen bei gleichzeitiger Reduktion der thisbe-Gendosis eine
starke Reduktion der Vorläufer-Zellen, der umgekehrte Fall hat einen deutlich schwächeren Phänotyp
zur Folge. Sowohl in pyr- als auch in ths-Mutanten bestehen die übrig geblieben Zellkluster in vielen
Fällen aus weniger Zellen als im Wildtyp.
Die Abwesenheit von pyr und ths führt immer zu einem vollständigen Verlust der Evepositiven Zellkluster (Abb. 16B), was bereits beschriebene Ergebnisse (Kadam et al., 2009)
bestätigt. Allein die eve-Expression im Nervensystem bleibt bestehen. Die Kombination von
Df(2R)BSC25 über die pyramus-Deletion pyr18 (Klingseisen et al., 2009) führt zu dem
80
gleichen Ergebnis. In den meisten Embryonen der Linie pyrS0439 ist bei gleichzeitig halbierter
ths-Gendosis die Anzahl der Kluster von elf auf eins reduziert oder sie fehlen komplett (Abb.
16C), es existieren aber einzelne Embryonen mit mehr Eve-positiven Zellklustern. Ein
ähnliches Ergebnis liefert die Kombination des zweiten EMS-Allels pyrS3547 über
Df(2R)BSC25, allerdings mit einer leichten Verschiebung des Maximums an vorhandenen
Klustern. Es ist anzumerken, dass in anderen pyr-Allelen, welche pyr entweder komplett
deletieren (Df(2R)pyr36) oder zum Verlust detektierbarer pyr-Expression führen (PiggyBacInsertion pyr02915) ebenfalls vereinzelte Eve-Kluster auftreten (Kadam et al., 2009). Eine
Ausnahme davon bilden die homozygote Embryonen der Linie pyr18. Hier fehlen alle EveKluster (Klingseisen et al., 2009). In diesem Fall kann jedoch der spezielle genetische
Hintergrund für den Phänotyp verantwortlich sein (siehe Diskussion, Kapitel 5.2.1).
Die Existenz vereinzelter Eve-positive Zellen in pyr-mutantem Hintergrund führt zu der
Annahme, dass vor allem pyr für die Spezifizierung der Eve-Kluster verantwortlich ist und ths
in geringerem Maße zu dieser Spezifizierung beiträgt. Unterstützt wird dies durch die
Beobachtung, dass in Abwesenheit von ths ebenfalls einige Zellen verloren gehen (siehe
Tab. 17: Kombination von Df(2R)BSC259 über die thisbe-Deletion ths238 (Kadam et al.,
2009)). Die dominierende Rolle von pyr bei der Induktion von Eve-positiven Zellen im
dorsalem Mesoderm kann man durch die stärkere Expression von pyr im darüber liegenden
Ektoderm oder durch unterschiedliche Aktivität oder Reichweite der Protein-Produkte infolge
differentieller proteolytischer Prozessierung erklären (Stathopoulos et al., 2004; Tulin und
Stathopoulos, 2010).
4.2.2
Fehlerhafte Entwicklung der longitudinalen viszeralen Muskulatur in Mutanten
mit verringerter Aktivität der FGF-Liganden pyramus und thisbe
Zu Beginn dieser Arbeit gab es kaum Untersuchungen zur Funktion des FGF-Signalwegs bei
der Bildung der longitudinalen viszeralen Muskulatur. Dabei ist die reguläre Wanderung der
LVM-Vorläuferzellen die Voraussetzung für die Ausbildung der longitudinalen Muskelfasern.
Um die Rolle der FGF8-ähnlichen Gene pyramus und thisbe bei der Entstehung des LVM zu
beleuchten, wurde deren Entwicklung im mutanten Hintergrund mit verringerter Aktivität oder
in Abwesenheit der FGF-Liganden analysiert. Zu diesem Zweck wurden Fliegen-Linien der
gewünschten Genotypen verwendet, die zusätzlich das HLH54Fb-LacZ-Konstrukt enthalten.
So
konnten
die
Zellen
des
LVM
durch
eine
anschließende
β-Galactosidase-
Antikörperfärbung sichtbar gemacht werden. Diese Methode hat gegenüber der RFPAnalyse den Vorteil, bereits zu Beginn der LVM-Wanderung in Stadium 10 nachweisbar zu
sein. Beide aus dem Screen hervorgegangenen pyr-Allele zeigen im Stadium 16 einen
subtilen LVM-Phänotyp. In pyrS0439 und pyrS3547 existieren kleinere Bereiche vor allem im
vorderen Mitteldarm, in denen die longitudinalen Muskelfasern entweder unterbrochen sind
81
oder fehlen (Abb. 17E und G). Der Abstand der einzelnen Fasern ist in diesem Bereich im
Vergleich zum Wildtyp meist deutlich vergrößert. Diese Defekte scheinen auch die Ursache
für die unvollständige oder fehlende Einschnürung im vorderen Abschnitt des Mitteldarms zu
sein, was in der Folge zu irregulären Darmwindungen führt. Die LVM-Phänotypen wurden
ebenfalls in trans über Df(2R)BSC25 überprüft, um wie bereits in Kapitel 4.2.1 beschrieben
den Einfluss von zusätzlichen Mutationen ausschließen zu können. Genau wie bei den
Herzdefekten kann auch hier eine Verstärkung des Phänotyps beobachtet werden. Man
erkennt in späten Embryonen große Bereiche, besonders um den anterioren Mitteldarm
herum, die frei von LVM-Fasern sind (Abb. 17F, H), dabei gibt es keine signifikanten
Unterschiede zwischen pyrS0439 und pyrS3547. pyr18/Df(2R)BSC25-Embryonen, in denen pyr
deletiert ist, zeigen ähnliche oder leicht schwächere Defekte (Abb. 17C).
Darüber hinaus wurde wegen der möglichen Redundanz zwischen pyr und ths die
Entwicklung des LVM auch in Mutanten untersucht, denen ein funktionsfähiges thisbe Gen
fehlt, oder in denen weder pyr noch ths vorhanden sind. In transheterozygoten
ths759/Df(2R)BSC25-Embryonen ist ebenfalls eine Reduktion von LVM-Fasern am Ende der
Embryonalentwicklung zu erkennen, ähnlich der Phänotypen der korrespondierenden
Genotypen mit den pyr-Allelen aus dem EMS-Screen (Abb. 17D). Wenn alle Kopien beider
FGF8-ähnlichen Gene durch überlappende Defizienzen eliminiert werden, wird keine
longitudinale Darmmuskulatur gebildet (Abb. 17B). Vereinzelte übriggebliebene VorläuferZellen sind in der Lage, eine kleine Anzahl vielkerniger Fasern zu bilden.
Um die Ursache für die Reduktion der longitudinalen viszeralen Muskulatur in den Mutanten
mit verringerter pyr- oder ths-Aktivität zu finden, wurden die Morphologie und Wanderung der
LVM-Gründerzellen während der LVM-Entwicklung näher analysiert. Die Untersuchungen in
Embryonen der Stadien 12 beziehungsweise 13 wurden von Ingolf Reim durchgeführt. Es
folgt eine Zusammenfassung der Ergebnisse.
Die aus dem Screen hervorgegangenen pyr-Allele zeigen in homozygotem Zustand im
Stadium 13 einige LVM-Gründerzellen ohne Kontakt zum viszeralen Rumpfmesoderm („trunk
visceral mesoderm“, TVM), markiert durch eine Fasciclin III-Antikörperfärbung, die Mehrzahl
wandert jedoch regulär entlang des viszeralen Rumpfmesoderms (Abb. 18E, G). Die
Untersuchung der pyr/Df(2R)BSC25-Mutanten in früheren Stadien der LVM-Entwicklung
führte zu der Erkenntnis, dass die Gründer-Zellen in normaler Anzahl vorhanden sind und
während Stadium 11 regulär mit der Wanderung beginnen (Daten nicht gezeigt). Allerdings
verlieren viele dieser Zellen in pyr-Mutanten im späten Stadium 12, zu einem Zeitpunkt, wo
sich die Gründer-Zellen normalerweise entlang der viszeralen Rumpf-Muskulatur ausbreiten,
den Kontakt zu diesem Gewebe (Abb. 18C, F, H). Während Stadium 13 kann eine große
Zahl an abgerundeten und geschrumpften Zellen in einiger Entfernung zum TVM beobachtet
werden (Pfeilspitzen), was auf ein Absterben dieser Zellen hindeutet.
82
Abbildung 17: Entwicklung der longitudinalen viszeralen Muskulatur in Mutanten mit
reduzierter FGF- Liganden-Aktivität
(A) HLH54Fb-lacZ Wildtyp-Embryo mit anti-β-Gal-Färbung zur Darstellung der longitudinalen
viszeralen Muskelfasern, im Stadium 17 gleichmäßig um den gesamten Darm verteilt. (B) Das
Entfernen von pyr und ths durch die Benutzung der überlappenden Defizienzen Df(2R)BSC25 und
Df(2R)BSC259 führt zu einem kompletten Verlust des LVMs, selten existieren einzelne LVM-Fasern.
Der Verlust von pyr (C) oder ths (D) führt zu einer Reduktion von LVM-Fasern im Bereich des
S0439
vorderen Mitteldarms (Sterne). (E) Homozygoter pyr
-Embryo mit HLH54Fb-lacZ, der eine leichte
Degeneration von longitudinalen viszeralen Muskelfasern im anterioren Abschnitt des Mitteldarms
S3547
zeigt (Stern). (G) Ähnliche Defekte in einem pyr
-Embryo mit größeren Zwischenräumen zwischen
den LVM-Fasern im Vergleich zu (A). Zusätzlich sind irreguläre Windungen des Darms in
Zusammenhang mit einer unvollständigen anterioren Darmeinschnürung zu erkennen. (F, H)
S0439
S3547
Embryonen mit den EMS-induzierten Mutation pyr
bzw. pyr
in trans über die pyr- und thsdeletierende Defizienz Df(2R)BSC25 mit deutlicher Reduktion von LVM-Fasern, speziell im Bereich
des vorderen Mitteldarms (Stern).
83
Abbildung 18: Wanderung der LVM-Gründerzellen in Mutanten mit reduzierter FGF-LigandenAktivität
Anti-β-Gal-Färbung von HLH54Fb-lacZ Embryonen, um die wandernden Vorläufer der longitudinalen
viszeralen Muskelfasern nach Abschluss des Keimstreifrückzugs sichtbar zu machen. Das TVM ist
durch eine Färbung gegen Fasciclin III grün markiert. (A) Wildtyp. (B) In der FGF8-Nullmutante ist die
Anzahl der LVM-Gründerzellen im späten Stadium 12 stark reduziert und fast alle Zellen haben den
Kontakt zum TVM verloren. (C) In Embryonen ohne pyr verlieren einige LVM-Gründerzellen den
Kontakt zum TVM und erscheinen als kleine abgerundete Punkte (Pfeilspitzen). (D) ths-defizienter
S0439
S3547
- und pyr
-Embryonen mit vereinzelt
Embryo mit ähnlichem Phänotyp. (E, G) Homozygote pyr
abgerundeten Zellen (Pfeilspitzen). Die Mehrzahl der LVM-Gründerzellen hält den Kontakt zum TVM
aufrecht. Beide EMS-induzierten pyr-Mutanten zeigen in trans über die pyr- und ths-deletierende
Defizienz Df(2R)BSC25 eine Verstärkung des Phänotyps (F, H).
84
Die Verstärkung des Phänotyps der Allele pyrS0439 und pyrS3547 über Df(2R)BSC25 ist folglich
bereits an diesem Zeitpunkt der Entwicklung zu erkennen. In transheterozygoten
ths759/Df(2R)BSC25-Embryonen kann man ähnliche Defekte während der Wanderung der
LVM-Gründerzellen beobachten (Abb. 18D). Die Wanderungsdefekte im Zusammenhang mit
dem Absterben der Zellen erklären die geringere Dichte der longitudinalen Muskelfasern in
den
späten
Stadien
der
für
pyr
oder
ths
mutanten
Embryonen.
In
Df(2R)BSC25/Df(2R)BSC259-Embryonen verlieren so gut wie alle Gründerzellen im späten
Stadium 12 den Kontakt zur viszeralen Rumpfmuskulatur, die meisten sind schlussendlich
dem Zelltod ausgesetzt (Abb. 18B).
Zusätzlich
wurden
Langzeit-Lebendbeobachtungen
von
Kontroll-Embryonen,
der
transheterozygoten Kombination der beiden überlappenden Defizienzen Df(2R)BSC25 und
Df(2R)BSC259 und von pyrS0439/Df(2R)BSC25-Embryonen durchgeführt, um die Wanderung
der LVM-Gründerzellen in Abwesenheit von pyr oder beider FGF-Liganden genauer zu
analysieren. Die Bewegung der mithilfe eines HLH54F-RFP-Reporterkonstrukts markierten
Zellen wurde jeweils von Stadium 11 bis 13 verfolgt.
Der Verlust von pyramus und thisbe führt bereits in Stadium 11 zu einer verringerten Anzahl
an LVM-Vorläuferzellen und zu einem lockereren Kontakt dieser Zellen zum TVM (Abb.
19D). Zu Beginn von Stadium 12 lösen sich die ersten Zellen vom TVM ab und runden sich
ab, am Ende desselben Stadiums haben praktisch alle LVM-Vorläufer den Kontakt zum
viszeralen Rumpfmesoderm verloren (Abb. 19E, F). Nach Abschluss des Keimstreifrückzugs
sind nur noch einzelne abgerundete Zellen oder Zellfragmente erkennbar. Die Wanderung
der LVM-Gründerzellen ist in pyrS0439/Df(2R)BSC25-Embryonen zunächst normal, allerdings
scheint die Anzahl der Zellen leicht reduziert zu sein (Abb. 19G). Im weiteren Verlauf runden
sich allerdings ebenfalls einige Zellen ab und verlieren den Kontakt zum TVM (Abb. 19H, I).
Die übrigen LVM-Vorläufer beginnen zu fusionieren und Fasern auszubilden (Abb. 19I).
Eine interessante Beobachtung konnte in Kontroll-Embryonen am Ende des Stadiums 12
gemacht werden. Nach der Aufspaltung der LVM-Vorläuferzellen in eine dorsale und ventrale
Reihe bilden die dorsalen Zellen eine Reihe von Filopodien aus, welche in Richtung des
Dotters bzw. des Endoderms zielen (Abb. 19C). Diese Zellfortsätze werden in Abwesenheit
von pyr nicht in dieser ausgeprägten Form gebildet (Abb. 19I). Diese Beobachtung führt zu
der Annahme, dass das Endoderm als eine mögliche Quelle für pyr und/oder ths in Betracht
gezogen werden muss. Der Nachweis der Expression von pyr mittels in situ Hybridisierung
bestätigt diese Vermutung (siehe Kapitel 4.2.3).
85
Abbildung 19: Wanderung der LVM-Vorläuferzellen in Abwesenheit beider FGF-Liganden
Langzeit-Lebendbeobachtung der Wanderung der LVM-Gründerzellen im Wildtyp (A-C),
S0439
Df(2R)BSC25/Df(2R)BSC259-Embryonen (D-F) und pyr
/Df(2R)BSC25-Embryonen (G-I). Die
LVM-Zellen sind durch HLH54F-RFP markiert, die Aufnahmen umfassen die Stadien 11-13. (C) Im
späten Stadium 12 bilden die LVM-Gründerzellen im Wildtyp vermehrt Filopodien aus, welche in
Richtung des Endoderms weisen (Pfeile). (D) In Df(2R)BSC25/Df(2R)BSC259-Embryonen sind von
Beginn an weniger LVM-Gründerzellen vorhanden, die Zellen sind über einen größeren Bereich
verteilt. Bereits im Stadium 11 sind die ersten abgerundeten Zellen zu erkennen. (E) Im weiteren
Verlauf verlieren die Zellen den Kontakt zum Substrat, die ersten Zellfragmente werden sichtbar. (F)
Im späten Stadium 12 sind im pyr/ths-defizienten Hintergrund überwiegend abgerundete oder
fragmentierte LVM-Zellen vorhanden. Eine Ausbildung von Filopodien ist nicht erkennbar. Die Anzahl
S0439
/Df(2R)BSC25-Embryonen ist ebenfalls reduziert (G, H). (I) Später
der LVM-Gründerzellen in pyr
treten ebenfalls abgerundete Zellen auf (Pfeil), es kommt kaum zur Ausbildung von Filopodien in
Richtung Endoderm.
86
4.2.3
Verschiedene Gewebe als mögliche Quelle der FGF-Liganden für Heartless in
den LVM-Gründerzellen
Ohne pyr- und ths-Signale verlieren die LVM-Gründerzellen den Kontakt zum TVM und
sterben ab. Möglicherweise fungiert das TVM selbst als Quelle der FGF-Signale, um den
Heartless Rezeptor in den nahe an dieser Quelle wandernden LVM-Zellen zu aktivieren. Um
diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde die Expression von pyr und ths in den Geweben
entlang des Pfads der wandernden Zellen genauer analysiert. Es wurden in situ
Hybridisierungen mit pyr- und ths-Sonden zusammen mit Marker-Färbungen für das TVM
(bap3-lacZ) und das Endoderm (48Y-Gal4/UAS-GFP) durchgeführt.
Die Färbungen für pyr zeigen, dass der Ligand in den frühen Stadien der LVM-Wanderung
sowohl im TVM als auch im Endoderm (vordere und hintere Mitteldarm-Anlage) exprimiert
wird (Abb. 20A). Später erlischt die pyr-Expression im TVM, bleibt aber im Endoderm
bestehen (Abb. 20B, C). Da die LVM-Gründerzellen größtenteils entlang der dorsalen und
ventralen Begrenzung des TVM wandern, befinden sie sich in Stadium 12 und 13 auch in der
Nähe von pyr-exprimierenden endodermalen Zellen. Das aus dem Endoderm stammende
pyr ist möglicherweise für die bereits weiter oben erwähnte Ausbildung von längeren
zellulären Fortsätzen verantwortlich, welche von den LVM-Gründerzellen gebildet werden.
Diese zeigen im Wildtyp während der Wanderung der Zellen in Richtung des Endoderms. In
pyr-Mutanten werden diese Fortsätze nur in geringem Maße ausgebildet.
Ähnlich wie pyr ist auch ths im TVM exprimiert, was durch frühere Experimente bereits
angedeutet worden ist (Stathopoulos et al., 2004). Allerdings bleibt im Gegensatz zu pyr
dessen Expression in diesem Gewebe bestehen (Abb. 20D-F). Im Stadium 11 bis 12 ist die
ths-Expression in den posterioren zwei Dritteln des TVM am stärksten (Abb. 20D), eine
Expression im Endoderm kann nicht nachgewiesen werden. Beide Gene sind des Weiteren,
wie bereits veröffentlicht (Gryzik und Müller, 2004; Stathopoulos et al., 2004), sowohl im
Vorder- und Hinterdarm als auch in der Epidermis exprimiert.
87
Abbildung 20: Expression der FGF-Liganden pyramus und thisbe während der LVMGründerzellen-Wanderung und der Darmentstehung
Nachweis der Expression von pyr und ths RNA (rot) durch in situ Hybridisierung in Embryonen mit
48Y-Gal4/UAS-EGFP- (A, B, F) oder bap3-lacZ-Konstrukt (C, D, E). 48Y-Gal4 treibt GFP-Expression
(grün, anti-GFP) hauptsächlich im Endoderm, schwach im LVM und in einigen Bereichen der
Epidermis (ep). bap3-lacZ (grün, anti-β-Galactosidase) ist ausschließlich in der viszeralen
Rumpfmuskulatur (tvm) exprimiert. (A) Seitliche Ansicht eines Embryos in Stadium 11 mit pyrExpression in den GFP-markierten Anlagen des anterioren und posterioren Mitteldarms (amg, pmg)
und in der Reihe von TVM-Gründerzellen (tvm). (B, C) Ventrale Ansichten von weiter innen liegenden
Schnittebenen von Embryonen im Stadium 13, die Koexpression von pyr zusammen mit EGFP im sich
bildenden Mitteldarm-Endoderm (mg), zeigen. Keine Expression im TVM nachweisbar. (D) Seitliche
Ansicht eines Embryos in Stadium 11 mit ths-Expression in den GFP-markierten Anlagen des TVM.
Innerhalb des TVM exprimieren nur die ventral gelegen TVM-Gründerzellen ths (Pfeil). (E, F) Ventrale
Ansichten von weiter innen liegenden Schnittebenen von Embryonen in Stadium 13 , welche
Koexpression von ths zusammen mit LacZ im TVM zeigen. Keine Expression im Mitteldarm (mg)
nachweisbar. Beide Gene sind außerdem im Vorderdarm (fg), Hinterdarm (hg) und in der Epidermis
(ep) exprimiert.
4.2.4
Ektopische FGF-Signale sind in der Lage, die Wanderung der LVMGründerzellen neu auszurichten und deren Überleben zu fördern
Die bisherigen Daten lassen die Frage offen, auf welche Weise der FGF-Signalweg die LVMEntwicklung beeinflusst. Eine Möglichkeit besteht darin, dass FGF-Signale eine Rolle bei der
Anheftung der wandernden LVM-Zellen an das Substrat spielen und somit deren Zelltod
verhindern. Es ist ebenso denkbar, dass die Signale eine chemotaktische Funktion ausüben,
um die Zellen entlang eines bestimmten Pfads zu führen. Um herauszufinden, ob ektopische
FGF-Signale die Wanderung und das Überleben der LVM-Gründerzellen beeinflussen
können, wurden Überexpressionsexperimente in An- und Abwesenheit endogener Pyr- und
Ths-Signale durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden induzierbare UAS-pyr- und UAS-thsTransgene (Kadam et al., 2009) und unterschiedliche gewebe-spezifische Gal4-Treiber
benutzt.
88
Mithilfe des twist-Gal4-Treibers SG24 (Greig und Akam, 1993) wurde die Expression von pyr
oder ths auf das gesamte Mesoderm ausgeweitet. Die LVM-Gründerzellen beginnen in
beiden Fällen damit, sich nach anterior zu bewegen. Das bedeutet, dass die Wanderung der
Zellen nicht beeinträchtigt ist. Allerdings fehlt die im Wildtyp auftretende Aufteilung in zwei
bilaterale Kluster (Abb. 21C, D im Vergleich zu A). Zusätzlich können Zellen in der Nähe der
Mittellinie beobachtet werden. Diese scheinen zufällig orientiert zu sein und bewegen sich in
verschiedene Richtungen. Im weiteren Verlauf der Entwicklung gehen vor allem in
Embryonen mit pan-mesodermaler Expression von pyr einige LVM-Zellen verloren. Nach
dem Keimstreifrückzug bilden die restlichen Zellen im posterioren Teil des Embryos
Ansammlungen von zufällig orientierten, kurzen Fasern aus (Daten nicht gezeigt).
Zur Analyse der Reaktion der wandernden LVM-Gründerzellen auf FGF-Signale aus anderen
Geweben wurde ein Gal4-Enhancer-Trap im pannier (pnr)-Lokus, pnrMD237-Gal4 (Heitzler et
al., 1996), benutzt. Im Gegensatz zur endogenen pnr-Expression im dorsalen Ektoderm und
im kardiogenen Mesoderm ist dieser ausschließlich im dorsalen Ektoderm aktiv ( siehe auch
zusätzliche Daten in Reim et al., 2012). Werden pyr oder ths im dorsalen Ektoderm
überexprimiert, wandern viele LVM-Gründerzellen nicht mehr auf dem TVM, sondern entlang
eines mehr lateralen Pfads (Abb. 21E, F). Die LVM-Zellen bewegen sich zwischen die
vergrößerten Eve-positiven Zellkluster im dorsalen Mesoderm und umgeben diese oft
vollständig. Im Fall der Überexpression von ths ist dieser Effekt weniger stark ausgeprägt.
Mit fortschreitender Entwicklung setzen viele der nach lateral gewanderten Zellen ihren Weg
nach anterior fort. Einige LVM-Gründerzellen wandern immer noch entlang des normalen
Pfads (Abb. 21H, siehe auch Abb. 22C). Abweichend vom Wildtyp können einzelne LVMFasern sowohl unterhalb des dorsalen Ektoderms als auch um den Mitteldarm herum
gefunden werden (Abb. 21H, im Vergleich zu 21G). Die Überexpression von pyr im dorsalen
Ektoderm verhindert teilweise eine Wanderung der LVM-Zellen über weite Entfernungen.
Viele LVM-Fasern sammeln sich in der Nähe des posterioren dorsalen Ektoderms (Abb.
22B). Das Zurückhalten der LVM-Vorläufer stellt womöglich eine schwächere Variante der
posterioren Ansammlung von LVM-Fasern bei pan-mesodermaler Expression von pyr oder
ths dar. Die Tatsache, dass die ektopischen Eve-positiven Kluster nach Überexpression von
ths im Vergleich zu pyr weniger stark vergrößert sind, führt zu der Annahme, dass pyr in
unseren Versuchsansätzen das stärkere Signal darstellt. Diese höhere FGF-Signalaktivität
ist vermutlich der Grund für die posteriore Ansammlung von Zellen und die damit
einhergehende Einschränkung der Wanderung über weite Entfernungen.
89
Abbildung 21: Auswirkung ektopischer Expression von pyr und ths auf die LVM-GründerzellWanderung
90
Abbildung 21: Auswirkung ektopischer Expression von pyr und ths auf die LVM-GründerzellWanderung
Wildtyp, mutante und FGF-überexprimierende Embryonen wurden gegen HLH54F RNA (grün) und
Even-skipped (Eve) Protein (rot) gefärbt. A-F, I und J zeigen dorsale Ansichten von Embryonen mit
ausgestrecktem Keimstreif, die kaudalen Enden weisen nach links. (A) Wildtyp-Embryo in Stadium 11
mit HLH54F-Expression in den LVM-Gründerzellen (grün) und Eve-positiven Vorläufern spezifischer
perikardialer und somatischer Muskelzellen im dorsalen Mesoderm (dm) (rot). Die Pfeile zeigen die
Richtung der LVM-Gründerzell-Wanderung an. Eine schwache HLH54F-Expression ist in einem
Vorläufer eines ventro-lateralen somatischen Muskels pro Segment zu erkennen (sm), Eve markiert
zusätzlich Zellen des zentralen Nervensystems (central nervous system, cns). (B) Embryo in Stadium
11 und FGF8-Null-Hintergund. Die Wanderung der LVM-Zellen ist weniger symmetrisch, einige Zellen
wandern in Richtung der Mittellinie (Pfeilspitze). Die Anzahl an wandernden LVM-Gründerzellen ist
leicht reduziert, keine Eve-positiven Zellen im dorsalen Mesoderm. (C, D) Die ektopische Expression
von pyr (C) oder ths (D) im gesamten Mesoderm mittels twi-Gal4 (SG24) verhindert die Aufspaltung
der LVM-Gründerzellen in zwei bilaterale Gruppen, die mesodermalen Eve-Kluster sind vergrößert. (E,
MD237
-Gal4
F) Die ektopische Expression von pyr (E) oder ths (F) im dorsalen Ektoderm mittels pnr
verursacht eine mehr nach lateral gerichtete Wanderung der LVM-Gründerzellen. Die LVMGründerzellen zwischen den (vergrößerten) Eve-Klustern des dorsalen Mesoderms bilden Fortsätze in
Richtung des Ektoderms aus. (G) Laterale Ansicht eines Wildtyp-Embryos in Stadium 15 mit LVMFasern entlang des gesamten Mitteldarms. Eve-Expression kann dorsal in Perikardialzellen, schwach
im somatischen Muskel DA1 und ventral im Nervensystem beobachtet werden. (H) Embryo im
MD237
-Gal4-getriebender Expression von ths im dorsalen Ektoderm. LVM-Fasern
Stadium 15 mit pnr
können wie in (G) entlang des gesamten Mitteldarms ausgemacht werden, aber viele LVM-Zellen
wurden in dorsale Bereiche unter dem Ektoderm umgelenkt (Pfeilspitzen). (I, J) Wenn entweder pyr (I)
oder ths (J) im TVM mittels bap3-Gal4 überexprimiert werden, wandern LVM-Gründerzellen in
Embryonen in Stadium 11 normal (verglichen mit A).
Da das TVM der endogenen Signal-Quelle am ähnlichsten ist, wurden pyr oder ths auch in
diesem Gewebe überexprimiert. Mithilfe von bap3-Gal4 (Lee et al., 2003) wurde die viszerale
Expression der beiden Gene von den TVM-Gründerzellen auf alle TVM-Zellen ausgeweitet.
Das hat allerdings weder Einfluss auf die Wanderungsrichtung der LVM-Gründerzellen, noch
auf die Distanz, welche diese zurücklegen (Abb. 21I, J, siehe auch Abb. 22H, I). Die
Überexpression von pyr im TVM führt in späten Entwicklungsstadien zu kleinen Lücken in
der Anordnung der LVM-Fasern (Abb. 22H). Diese Unregelmäßigkeit wird wahrscheinlich
durch eine örtlich begrenzte Anhäufung von Zellen hervorgerufen, die durch eine leicht
erhöhte Aktivität des FGF-Signalwegs zustande kommt.
Die Überexpressionsexperimente haben gezeigt, dass eine ektopische Expression von pyr
oder ths die Wanderung der LVM-Gründerzellen beeinflusst. Das wirft die Frage auf, ob in
FGF8-Nullmutanten ektopische FGF-Signale in der Lage sind, Defekte bei der Wanderung
der LVM-Zellen zu retten und deren Zelltod zu verhindern. Eine Überexpression von pyr
oder ths im gesamten Mesoderm mittels twist-Gal4 führt zur Akkumulation der LVMGründerzellen im posterioren Teil des Embryos und ist deshalb nicht in der Lage, die
91
Wanderung des LVM zu retten. Im Vergleich zu regulären FGF8-Nullmutanten überlebt
jedoch eine größere Anzahl von LVM-Zellen (Daten nicht gezeigt).
Die pnrMD237-Gal4-getriebene ektopische Expression von pyr oder ths im dorsalen Ektoderm
verhindert den Zelltod der LVM-Gründerzellen und rettet deren Wanderung über größere
Entfernungen (Abb. 22E, F, im Vergleich zu A, D). Allerdings wandern ohne endogene FGFSignale nur wenige Zellen entlang des TVM und Endoderms. Die meisten LVM-Zellen
bewegen sich zwischen die Eve-positiven Zellkluster in Richtung des dorsalen Ektoderms
(Abb. 22E, F), was den Beobachtungen der analogen UAS/Gal4-Experimente im WildtypHintergrund entspricht (Abb. 22B, C). Insbesondere bei Überexpression von ths im dorsalen
Ektoderm wandern mehr Zellen entlang des regulären Pfads. Scheinbar hat Ths einen
geringeren Einfluss auf die Vorgabe der Wanderungsrichtung als Pyr (Abb. 22F, im Vergleich
zu E).
Die bisher erlangten Ergebnisse zeigen, dass auch ektopische FGF-Signale dazu in der
Lage sind, das Überleben der LVM-Gründerzellen zu gewährleisten. Sie bestätigen
außerdem, dass das TVM auch in Abwesenheit lokaler FGF-Signale die Wanderung der
LVM-Gründerzellen leiten kann.
Abbildung 22: Rettung und Neuausrichtung der LVM-Gründerzellwanderung in FGF8-NullMutanten durch ektopische Expression von pyr und ths
92
Abbildung 22: Rettung und Neuausrichtung der LVM-Gründerzellwanderung in FGF8-NullMutanten durch ektopische Expression von pyr und ths
Wildtyp und mutante Embryonen mit und ohne Gal4-getriebene FGF-Expression entsprechend
Abbildung 21 gefärbt. Gezeigt sind laterale Ansichten von Embryonen im Stadium 13 (A-F) oder 14
(G-L). (A) Im Wildtyp breiten sich die LVM-Vorläufer beidseitig über den gesamten Rumpf entlang
einer dorsalen und ventralen Reihe aus. (B) Die ektopische Expression von pyr im dorsalen Ektoderm
eines ansonsten wildtypischen Embryos führt zu einer Anhäufung von LVM-Vorläufern in der Nähe
des dorsalen Ektoderms (Pfeilspitzen). Viele Zellen schlagen nach wie vor den normalen Pfad der
Wanderung ein (Pfeile). Verbreiterte eve-Expression in der dorsalen somatischen/kardiogenen
MD237
-Gal4-getriebene Expression von ths zeigt ähnliche Effekte, obwohl mehr Zellen
Region. (C) pnr
unterhalb des dorsalen Ektoderms weiter nach anterior wandern. Die Ausdehnung der eve-Expression
ist weniger stark ausgeprägt. (D) FGF8-Nullmutante (Df = Df(2R)BSC25/Df(2R)BSC259), in der fast
kein LVM gebildet wird. Die perikardialen und somatischen Eve-positiven Vorläufer fehlen ebenfalls.
MD237
-Gal4-getriebene Expression
(E, F) Ohne endogene Expression von pyr und ths verhindert die pnr
der beiden FGF8-Liganden den Zelltod der LVM-Gründerzellen. Fast alle LVM-Zellen akkumulieren in
der Nähe des dorsalen Ektoderms, nur vereinzelt wandern Zellen auf dem normalen Weg (gepunktete
Pfeile). In FGF8-Null-Mutanten mit künstlicher ths-Expression (F) werden die Eve-positiven Vorläufer
nur in einigen Segmenten gerettet, aber es ist mehr Zellen möglich, sich nach anterior zu bewegen,
als in Mutanten mit künstlicher pyr-Expression (E). (G) Wildtyp-Embryo im Stadium 14 mit mehreren
Reihen von HLH54F-exprimierenden vielkernigen LVM-Fasern. Eve-Expression ist dorsal in
Perikardialzellen, schwach im somatischen Muskel DA1 und ventral im Nervensystem zu erkennen.
(H, I) bap3-Gal4-getriebene Expression von pyr (H) oder ths (I) im TVM hat geringen oder gar keinen
Einfluss auf die Wanderung der LVM-Vorläufer. Dem TVM entstammendes Pyr führt ebenfalls zu einer
starken Ausdehnung der dorsalen eve-Expression. (J) FGF8-Nullmutante in Stadium 14 ohne
jegliches LVM und dorsaler eve-Expression. (K, L) Künstliche Expression von pyr oder ths durch
bap3-Gal4 verhindert den Zelltod der LVM-Gründerzellen in Df(2R)BSC25/Df(2R)BSC259Embryonen. Das LVM entwickelt sich relativ normal, abgesehen von einigen Defekten in der
Anordnung der Fasern im Fall von pyr-Überexpression (K). Die Spezifizierung der Eve-Vorläufer im
dorsalen Mesoderm wird nur bei einer Überexpression von pyr im TVM (teilweise) gerettet (K
verglichen mit L).
Die Überexpression von pyr oder ths im TVM von FGF8-Nullmutanten mithilfe des bap3Gal4-Treibers zeigt aber, dass die Wanderung der Zellen am besten funktioniert, wenn die
Signale vom zugrunde liegenden Substrat ausgehen. In diesem Fall bewegen sich die Zellen
größtenteils entlang des normalen Pfads (Abb. 22K, L, im Vergleich zu J). Im Vergleich zur
Überexpression im Wildtyp-Hintergrund ist die Wanderung leicht verzögert. Vor allem bei der
Überexpression von pyr im TVM von FGF8-Nullmutanten sind die Zellen außerdem während
der Wanderung unregelmäßig angeordnet (Abb. 22H, im Vergleich zu G, I). Wird ths zur
Rettung benutzt, entwickelt sich die longitudinale viszerale Muskulatur relativ normal. Die
Überexpression von pyr kann die Bildung des LVM nicht vollständig retten. Der Grund hierfür
ist möglicherweise eine zu hohe Signal-Aktivität, welche für die leichten Defekte in früheren
Stadien verantwortlich ist (Daten nicht gezeigt, Abb. 22H).
93
Die Misexpressions- und Rettungsexperimente zeigen, dass die FGF-Liganden Pyr und Ths
in der Lage sind, die Wanderungs-Richtung der LVM-Gründerzellen zu beeinflussen und
deren vorzeitigen Zelltod abseits vom TVM zu verhindern. Da pyr und ths regulär im TVM
und in anderen Geweben entlang des Pfades der LVM-Gründerzell-Wanderung exprimiert
sind, handelt es sich bei den genannten Aktivitäten möglicherweise um weitere Funktionen
des FGF-Signalwegs im Wildtyp.
4.3
Einfluss von Mutationen in Genen, welche für Komponenten der extrazellulären
Matrix kodieren, auf die Morphologie und Stabilität des Herzens
4.3.1
Zwei Komplementationsgruppen mit fehlerhafter Anheftung der Alarmuskeln
Ein Drosophila-Embryo besitzt in Stadium 16 sieben Paare von Alarmuskeln. Sie bilden an
ihren dorsalen Enden eine Reihe von teilweise die Perikardialzellen umschließenden
Verzweigungen aus, um den Kontakt untereinander und mit dem das Herz umgebenden
Kollagenfaser-Netzwerk herzustellen (LaBeau et al., 2009; Lehmacher et al., 2012). Der
EMS-Screen lieferte eine Reihe von Linien mit embryonalem Alarmuskelphänotyp, welche in
die in Kapitel 4.1.4.2 beschriebenen Kategorien unterteilt worden sind. Eine Fraktion dieser
Linien zeigt neben einer leicht veränderten Morphologie des Herzschlauches die Ablösung
mehrerer Alarmuskelfasern. Die übrigen somatischen Muskeln sowie die longitudinale
viszerale Muskulatur zeigen keine auffälligen Defekte. Eine Kreuzungsanalyse in Bezug auf
die Letalität der Allele in transheterozygotem Zustand führte zur Aufspaltung der
phänotypischen Gruppe in zwei Komplementationsgruppen. Innerhalb einer Gruppe gehen
aus keiner Kombination der Allele adulte Nachkommen hervor, aber auch die
transheterozygoten Tiere aus Kreuzungen der Linien beider Gruppen untereinander weisen
in einigen Fällen eine eingeschränkte Lebensfähigkeit auf (siehe Kapitel 4.3.6 und Tab. 2123 im Anhang). Die Überprüfung der embryonalen Phänotypen in trans untereinander und
mit den weiter unten erläuterten Defizienzen hat einerseits zu der Unterteilung in die zwei
Komplementationsgruppen geführt. Außerdem konnten die letalen Mutationen unter
Zuhilfenahme der besagten Defizienz-Linien auf jeweils unterschiedliche Bereiche des
zweiten Chromosoms eingegrenzt werden.
Die erste Komplementationsgruppe besteht aus den EMS-Linien S0120, S0791, S1348,
S2186 und S3064. Die genetische Zuordnung zu dieser Gruppe ist komplex und wird daher
in ausführlicher Form in einem späteren Abschnitt dargestellt. Die homozygoten Embryonen
der
Linien
der
ersten
Komplementationsgruppe
zeigen
im
späten
Stadium
16
beziehungsweise im Stadium 17 eine im mittleren Bereich des Herzschlauchs auftretende
Ablösung der Alarmuskeln (Abb. 23A, B, Pfeile). In späten embryonalen Stadien oder in der
frühen Larve verlieren meistens fast alle Muskelfasern den Kontakt zum Dorsalgefäß (Abb.
94
23E). Die Morphologie des Herzes weist ebenfalls Unregelmäßigkeiten auf. Der hintere
Abschnitt erscheint vergrößert und besitzt ein weiteres, unregelmäßig geformtes Lumen, in
dem sich tinC-GFP-positive Zellen befinden (Abb. 23A, B). In früheren Stadien zeigen die
Embryonen gar keinen oder einen deutlich schwächer ausgeprägten Alarmuskelphänotyp,
der in manchen Fällen nur durch den lockeren Kontakt der Muskelfasern zum Herz zu
erkennen ist. Durch eine Erhöhung der Temperatur während der Entwicklung auf 29°C kann
bei allen Allelen der Phänotyp verstärkt bzw. dessen Auftreten beschleunigt werden (Daten
nicht gezeigt).
Abbildung 23: EMS-Linien
Komplementationsgruppe I
mit
Defekten
in
der
Anheftung
der
Alarmuskeln
-
Embryonen in Stadium 16 in einer dorsalen bzw. dorso-lateralen Ansicht. GFP-/RFPReporterkonstrukte markieren Vertreter der drei Hauptmuskeltypen (tinC-GFP in allen Kardioblasten;
org-1-SM-RFP in den Alarmuskeln und in einer Gruppe von somatischen Muskeln; HLH54F-LVM-RFP
im LVM). (A, B) In den Linien S1348 und S3064 existieren Alarmuskeln ohne Kontakt zum Herz
(Pfeile). Unregelmäßigkeiten in der Morphologie des Herz-Abschnitts sind erkennbar. (C-E) Weitere
Linien der Komplementationsgruppe zeigen den Alarmuskelphänotyp auch in der transheterozygoten
Situation. (F) Transheterozygoter Embryo der Linie S3064 über die letale Defizienz Df(2L)Exel7022
mit einem der homozygoten Situation vergleichbaren Phänotyp.
95
Die Linie S0120 stellt eine Ausnahme dar, da zusätzliche Mutationen bereits in der
homozygoten Situation zu einem insgesamt schwereren Phänotyp führen. Dieser soll an
dieser Stelle nicht näher betrachtet werden. In transheterozygoten Embryonen aus
Kreuzungen der Linien innerhalb der Gruppe weisen die Alarmuskeln ebenfalls
Anheftungsdefekte auf (Abb. 23C-E, Pfeile). Dabei ist kein Unterschied zum homozygoten
Phänotyp zu erkennen. Abhängig von der Allel-Kombination zeigt schätzungsweise
mindestens die Hälfte der Embryonen einen Alarmuskelphänotyp, wobei der Anteil durch die
Erhöhung der Temperatur auf 29°C erhöht werden kann.
Die Linien S1348 und S3064 wurden zur Kartierung der Punktmutation(en) gegen einen Satz
von Defizienzen gekreuzt (siehe Kapitel 4.1.1). In beiden Linien wurden mehrere letale
Treffer gefunden, davon ein gemeinsamer in der von der Defizienz Df(2L)Exel7022
abgedeckten Region. Wie weitere Komplementationstests zeigten, sind alle Mitglieder der
Komplementationsgruppe gekreuzt über diese Defizienz letal. Schätzungsweise mindestens
die Hälfte der S3064/Df(2L)Exel7022-Embryonen zeigt bei 25°C einen der homozygoten
Situation vergleichbaren Phänotyp (Abb. 23F; im Vergleich zu B). In transheterozygoten
Embryonen aus der Kombination von Df(2L)Exel7022 mit den anderen Linien der
Komplementationsgruppe variiert die Penetranz und die Stärke des Phänotyps. Nur etwa ein
Viertel der transheterozygoten Embryonen aus Kreuzungen von S0120 beziehungsweise
S0791 über Df(2L)Exel7022 zeigen einen leichten Alarmuskelphänotyp, welcher sich durch
die
Ablösung
einzelner
Fasern
bemerkbar
macht
(Daten
nicht
gezeigt).
In
S1348/Df(2L)Exel7022- und S2186/Df(2L)Exel7022-Embryonen treten bei 25°C gar keine
Defekte auf. Bei allen Kombinationen kann durch eine Erhöhung der Temperatur auf 29°C
während der Embryonalentwicklung die Häufigkeit des Auftretens der Defekte gesteigert
werden. Die phänotypische Varianz in Kombination mit den relativ spät einsetzenden
Defekten und der Temperatursensitivität erschwerten zunächst die eindeutige Zuordnung
dieser EMS-Linien, jedoch konnten im Zuge weiterer Arbeiten bei allen Linien dieser Gruppe
Mutationen in dem von Df(2L)Exel7022 deletierten Kollagen-IV-kodierenden Gen Cg25C
nachgewiesen werden (siehe Kapitel 4.3.4).
Die zweite Komplementationsgruppe besteht aus den Linien S0733, S1163 und S3773. Die
homozygoten Embryonen dieser Linien zeigen ebenfalls Defekte in der Anheftung der
Alarmuskeln an das Herz (Abb. 24A, B). Im Gegensatz zu den Embryonen der
Komplementationsgruppe I sind die Defekte hier voll penetrant. Außerdem verlieren in
diesen Embryonen vor allem die posterioren Fasern den Kontakt zum Dorsalgefäß, welches
ebenfalls eine abnormale Morphologie aufweist. Das tinC-GFP-Muster zeigt einen Wechsel
von schmalen und breiten Abschnitten entlang des Herzschlauchs, was auf Defekte in der
Anordnung der Kardioblasten hinweist. In der Linie S3773 sind die Defekte insgesamt
96
schwächer ausgeprägt, auch die posterioren Alarmuskeln lösen sich nur leicht vom Herz.
Gegen Ende der Embryonalentwicklung kann vor allem in den Linien S0733 und S1163 eine
noch deutlicher veränderte Morphologie beobachtet werden. Das Herz scheint sich durch
den Verlust der posterioren Anheftung zu verkürzen, mitunter treten zudem in manchen
Embryonen Lücken innerhalb der Kardioblasten-Reihen auf. Zusätzlich ist einem Teil der
Embryonen aller drei Linien ein subtiler Phänotyp der longitudinalen viszeralen Muskulatur
erkennbar. Kleine Bereiche vor allem im vorderen Teil des Mitteldarms sind frei von LVMFasern (Daten nicht gezeigt). Die Herz- und Alarmuskeldefekte treten mit 100%iger
Penetranz auch in transheterozygoten Embryonen auf, welche aus Kreuzungen der Linien
innerhalb der Komplementationsgruppe hervorgehen (Abb. 24C). Auch hier zeigen die
Embryonen der jeweiligen Kombination mit S3773 einen schwächeren Phänotyp (Daten nicht
gezeigt). Die der zweiten Gruppe zugeordneten Linien besitzen einen gemeinsamen letalen
Treffer im Überlappungsbereich der Defizienzen Df(2L)ED12527 und Df(2L)BSC233. Alle
drei EMS-Allele zeigen in trans über beide Defizienzen einen Phänotyp, welcher dem der
homozygoten Embryonen entspricht (Abb. 24D; im Vergleich zu B). Hier liegt die Penetranz
ebenfalls bei 100%.
Abbildung 24: EMS-Linien
Komplementationsgruppe II
mit
Defekten
in
der
Anheftung
der
Alarmuskeln
-
Embryonen im Stadium 16-17 in einer dorsalen beziehungsweise dorso-lateralen Ansicht. GFP-/RFPReporterkonstrukte markieren Vertreter der drei Hauptmuskelgruppen. (A, B) Anheftungsdefekt der
posterioren Alarmuskel-Paare in den Linien S0733 und S3773 (Pfeile). Häufig verdrehte Anordnung
der Kardioblasten-Reihen (B). (C) Der Alarmuskelphänotyp tritt auch in transheterozygoten
Embryonen aus Kreuzungen der Linien innerhalb der Komplementationsgruppe auf. (D)
S3773/Df(2L)ED12527-Embryonen zeigen einen schwächeren Phänotyp.
97
Im Zuge weiterer Arbeiten konnte bei allen Linien dieser Gruppe Mutationen in dem im
Überlappungsbereich der beiden oben genannten Defizienzen liegenden Gen LanB1
nachgewiesen werden (siehe Kapitel 4.3.5). Wegen dem Erscheinungsbild anderer LamininMutanten (siehe wb in Kapitel 4.1.3, Abb. 9E und bereits identifizierte LanB1-Allele, Kapitel
4.3.5, Abb. 30C) (Martin et al., 1999; Urbano et al., 2009; Wolfstetter und Holz, 2011) war
das Ergebnis zunächst überraschend. Wie sich jedoch herausstellte, handelt es sich hier um
spezielle hypomorphe Allele (siehe Kapitel 4.3.5).
4.3.2
Der Alarmuskel-Phänotyp korreliert mit der Ablösung von Perikardialzellen und
der fehlerhaften Lokalisation von ECM-Komponenten
Es wird vermutet, dass die Alarmuskeln an bestimmte Odd-Skipped (Odd)-positive
Perikardialzellen anheften (LaBeau et al., 2009). Deshalb existieren prinzipiell mehrere
Möglichkeiten, welche die fehlende Alarmuskel-Anheftung in den Cg25C- beziehungsweise
LanB1-Allelen hervorrufen könnten. Darunter fallen das Fehlen der Ziel-Perikardialzellen,
das Ablösen dieser Zellen oder eine fehlerhafte Anheftung der Alarmuskelfasern an die
Perikardialzellen oder ihre Umgebung. Weniger wahrscheinlich sind Defekte bei der
Migration
und
der
Zielfindung
der
Muskelenden,
da
die
Alarmuskeln
beider
Komplementationsgruppen zunächst normal mit dem Herz assoziiert sind. Um die Ursache
der Defekte herauszufinden, wurden die betreffenden Perikardialzellen in den Linien
LanB1S0733 und Cg25CS3064 mittels einer Antikörperfärbung markiert. Das in den Alarmuskeln
vorhandene RFP-Konstrukt konnte gleichzeitig dazu benutzt werden, die Lage der
Muskelfasern in Relation zu den Perikardialzellen zu analysieren. Die Odd-positiven
Perikardialzellen liegen im Wildtyp jeweils an der Außenseite der Kardioblasten und bilden
ebenfalls eine Doppelreihe. Innerhalb der Lymphdrüse sind ebenfalls Odd-positive Zellen
sichtbar (Abb. 25A). Die Alarmuskeln sitzen mit ihren Anheftungsstellen in unmittelbarer
Nähe der Perikardialzellen entlang des Dorsalgefäßes. LanB1S0733 zeigt eine deutliche
Unterbrechung der Zell-Doppelreihe, die dort fehlenden Zellen sind jedoch meistens an
lateralen Positionen zu finden (Abb. 25B). Es fällt auf, dass die Alarmuskel-Fasern, welche
den Kontakt zum Herz verloren haben, mit ihrem dorsalen Ende genau an diese abgelösten
Perikardialzellen anzuheften scheinen. Einen vergleichbaren Phänotyp zeigt die EMS-Linie
Cg25CS3064. Viele Perikardialzellen sitzen in mehr lateralen Bereichen des Embryos und
stehen in Kontakt mit den ebenfalls abgelösten Alarmuskeln (Abb. 25C). Generell gibt es in
beiden Linien keine Spezifizierungsdefekte, da alle Kardioblasten- und Perikardialzelltypen
vorhanden sind (siehe Abb. 25 und nicht gezeigte Daten).
98
S0733
Abbildung 25: Ablösung der Perikardialzellen in LanB1
und Cg25C
S3064
S0733
S3064
und Cg25C
in
Dorsale Ansicht von Wildtyp-Embryonen und Embryonen der Linien LanB1
Stadium 16/17 mit einer Antikörperfärbung gegen Odd-skipped (grün) und RFP (rot) (A-C) bzw. gegen
Pericardin (rot) und Tinman (grün) (D-F). (A) Kontroll-Embryo mit zwei Reihen von Odd-positiven
Perikardialzellen und sieben Paaren von in unmittelbarer Nähe dazu anheftenden org-1-RFP-positiven
S0733
Alarmuskeln. (B) LanB1
-Embryo mit abgelösten Perikardialzellen (Pfeile) und daran anheftenden
S3064
Alarmuskeln. Ein identischer Phänotyp ist auch in Cg25C
-Embryonen zu sehen (C). (D) KontrollEmbryo mit typischem Tinman-Muster (jeweils vier positive Kardioblasten und mehrere flankierende
Perikardialzellen pro Hemisegment). Außerdem ist die gleichmäßige Verteilung des überwiegend von
S0733
den Perikardialzellen sekretierten Pericardin-Proteins zu erkennen. (E) Embryo der Linie LanB1
S3064
mit einer unregelmäßigen Verteilung des Pericardins (Pfeile). (F) Cg25C
-Embryo mit einer
beinahe dem Wildtyp entsprechenden Verteilung des Pericardins mit einzelnen lateralen ProteinS0733
S3064
Ansammlungen (Pfeile). Sowohl in LanB1
-Embryonen als auch in Cg25C
-Embryonen sind die
Tin-positiven Perikardialzellen normal mit dem Herz assoziiert (E, F).
Perikardialzellen und zum Teil Kardioblasten sekretieren das Pericardin-Protein, ein Typ IVKollagen-ähnliches Molekül, welches einen wichtigen Bestandteil der extrazellulären Matrix
in der Umgebung des Dorsalgefäßes darstellt (Chartier et al., 2002). Dieses Protein verteilt
sich im Wildtyp entlang des Dorsalgefäßes mit einer leicht erhöhten Konzentration um den
eigentlichen Herz-Abschnitt herum (Abb. 25D). Dieses klar begrenzte Muster wird in der
Linie LanB1S0733 nicht ausgebildet. Pericardin ist diffus um die Herzzellen herum verteilt und
gelangt auch in dorso-laterale Bereiche des Embryos (Abb. 25E). Da in dem mutanten
Hintergrund auch die Perikardialzellen an seitlichen Positionen sitzen, war diese
Beobachtung zu erwarten. Im Gegensatz dazu zeigt allerdings die Linie Cg25CS3064 ein
beinahe dem Wildtyp entsprechendes Pericardin-Muster (Abb. 25F). Es befinden sich
99
lediglich kleinere Ansammlungen des Proteins in größerer Distanz zum Herz, die
möglicherweise ebenfalls mit Perikardialzellen assoziiert sind. Das bedeutet, dass nicht nur
die Position der Perikardialzellen für die stark irreguläre Verteilung des Pericardins in
LanB1S0733-Embryonen verantwortlich sein kann, da sich die Odd-positiven Perikardialzellen
in Cg25CS3064 ebenfalls vom Herz lösen. Auch für die Identifizierung der EMS-Linien ergab
sich hieraus neben der in Kapitel 4.3.1 erwähnten Komplementations-Analyse ein weiterer
Hinweis, dass unterschiedliche Gene für die Defekte verantwortlich sind.
Die Markierung der Tin-positiven Kardioblasten und Perikardialzellen zeigt keine eindeutigen
Abweichungen in der Anzahl und Anordnung der Zellen. Das tin-Muster liegt in beiden Linien
in weitgehend unveränderter Form vor. Allerdings deutet vor allem das veränderte tinC-GFPMuster in LanB1S0733-Embryonen in Stadium 16/17 auf Defekte im Herz hin. Um die Anzahl
der Kardioblasten und deren Polarität zu überprüfen, wurde eine Antikörperfärbung gegen
Mef2 und Slit durchgeführt. Mef2 markiert im Wildtyp die Kerne aller Muskeln, einschließlich
der Kardioblasten (Abb. 26A). Das Slit-Protein akkumuliert in Stadium 16 an den
Kontaktstellen zwischen den Kardioblasten und an der dem Lumen zugewandten Seite der
Zellen. In Embryonen der Linie LanB1S0733 scheint die Anzahl der Kardioblasten normal zu
sein, lediglich deren Anordnung ist an manchen Stellen irregulär (Abb. 26B). Die Mutation
hat keinen generellen Einfluss auf die Polarität der Zellen, die wenigen Unregelmäßigkeiten
in der Verteilung des Slit-Proteins sind auf die Anordnungsdefekte der Kardioblasten
zurückzuführen (Abb. 26B, Pfeile). Auch vor dem Aufeinandertreffen der KardioblastenReihen entspricht das Slit-Muster in LanB1S0733-Embryonen dem Wildtyp, was bedeutet, dass
das Protein gleichmäßig in der Zellmembran der Kardioblasten verteilt ist (Daten nicht
gezeigt). In Embryonen der Linie Cg25CS3064 sind ebenfalls keine Abweichungen in der
Kardioblasten-Zahl erkennbar, auch die Zellpolarität ist nicht beeinträchtigt (Abb. 26C).
Allerdings zeigen alle Embryonen eine geringere Konzentration von Slit im eigentlichen
Herzabschnitt.
100
S0733
Abbildung 26: Kardioblasten-Zahl und -Polarität in Embryonen der Linien LanB1
S3064
Cg25C
S0733
und
S3064
Überprüfung der Anzahl und Polarität der Kardioblasten in LanB1
- und Cg25C
-Embryonen
durch Markierung der Kardioblasten mittels Mef2 und des Slit-Proteins als Polaritäts-Marker. (A) In der
Kontrolle ist Slit vor allem an der dem Lumen zugewandten Seite der Mef2-positiven Kardioblasten zu
S0733
finden. (B) LanB1
-Embryo mit leichten Anordnungsdefekten der Kardioblasten und daraus
resultierender abschnittsweise veränderter Slit-Verteilung. (C) Weitgehend normale Anordnung und
S3064
-Embryo. Normale Verteilung von Slit im Bereich der Aorta,
Zahl an Kardioblasten in einem Cg25C
wenig Protein im hinteren Herzabschnitt.
4.3.3
Die Alarmuskeln spielen eine Rolle bei der Ablösung der Perikardialzellen
Die bisherigen Ergebnisse haben gezeigt, dass ein Zusammenhang zwischen dem
Kontaktverlust
der
Alarmuskelfasern
zum
Herz
und
der
Ablösung
von
einigen
Perikardialzellen besteht. Unklar ist allerdings, ob die Perikardialzellen von allein ihren
Kontakt zum Herzschlauch verlieren oder ob die Zugkraft, welche von den Alarmuskeln
ausgeht, für den Perikardialzellphänotyp verantwortlich ist Für das Verständnis der Wirkung
der betroffenen Genprodukte ist es außerdem sinnvoll, genauer zu analysieren, zu welchem
Zeitpunkt in der Embryonalentwicklung sich der Gesamtphänotyp manifestiert. Zu diesem
Zweck wurde mit Hilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (KLSM) eine Langzeit-
101
Lebendbeobachtung Fluoreszenz-markierter Kontroll-Embryonen und von homozygoten
Embryonen der Linien LanB1S0733 und Cg25CS3064 von Stadium 14 bis 17 durchgeführt.
Neben den bereits weiter oben erwähnten GFP-/RFP-Konstrukten zur Markierung der
somatischen und viszeralen Muskulatur sowie der Kardioblasten wurde ein weiteres GFPReporterkonstrukt unter Kontrolle des „hand cardiac and hematopoietic enhancers“ (HCHGFP) (Han and Olson, 2005) in die Fliegenlinien gekreuzt. Dieses markiert sämtliche
Kardioblasten und Perikardialzellen. Außerdem sind die Zellkerne des zirkulären viszeralen
Mesoderms HCH-GFP-postitiv.
Im Kontroll-Embryo sind die Alarmuskeln im späten Stadium 14 in Kontakt mit den
Perikardialzellen und diese wiederum mit den Kardioblasten (Abb. 27A). Im weiteren Verlauf
formen die beiden Kardioblasten-Reihen den Herzschlauch. Der enge Kontakt zwischen den
Alarmuskelfasern und den Perikardialzellen bleibt durchgehend bestehen (Abb. 27B-D). Im
homozygoten LanB1S0733-Embryo sind im späten Stadium 14 einzelne Abschnitte erkennbar,
in denen sich einige Perikardialzellen von den Kardioblasten gelöst haben (Abb. 27E). Die
dorsalen Ausläufer der Alarmuskelfasern sind weiterhin in der näheren Umgebung dieser
Zellen angeheftet. Mit fortschreitender Entwicklung stellen einige dieser Perikaridalzellen
zunächst erneut den Kontakt mit den Kardioblasten her (Abb. 27F). Kurz bevor die Bildung
des Herzschlauchs abgeschlossen ist, beginnen einige Alarmuskelfasern damit, sich vom
posterioren Teil des Dorsalgefäßes abzulösen (Abb. 27F). Mit fortschreitender Entwicklung
wächst die Distanz zwischen diesen Alarmuskeln und dem Herz, außerdem sind an deren
dorsalen Enden deutlich HCH-GFP-positive Zellen zu erkennen (Abb. 27G, H). Dabei
handelt es sich basierend auf den Beobachtungen vorangegangener Experimente (Kapitel
4.3.2, Abb. 25) aller Wahrscheinlichkeit nach um Odd-positive Perikardialzellen.
Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, dass die Alarmuskeln in diesem Fall für die
Ablösung einiger Perikardialzellen verantwortlich sind und, dass der Phänotyp erst in der
späten Embryonalentwicklung entsteht, da alle Muskelfasern in frühen Stadien mit dem Herz
verbunden sind. Unregelmäßigkeiten im Aufbau der extrazellulären Matrix könnten ein Grund
für den Kontaktverlust der Alarmuskeln und der Perikardialzellen sein (siehe Diskussion),
worauf auch die diffuse Verteilung des Matrix-Proteins Pericardin hindeutet (Kapitel 4.3.2).
Um eine aktive Rolle der Alarmuskelfasern zu bestätigen, musste die Entwicklung in
Embryonen ohne Alarmuskeln verfolgt werden. In Schaub et al., 2012, wird die org-1Mutante org-1OJ487 beschrieben, welcher sämtliche Alarmuskeln fehlen,
Vorläuferzellen
nicht
spezifiziert
werden.
Es
wurde
eine
org-1OJ487;
da deren
LanB1S0733-
Doppelmutante generiert und deren Entwicklung verfolgt (Abb. 27I-L).
102
Abbildung 27: Anheftung der Alarmuskeln während der Bildung des Herzschlauchs
103
Abbildung 27: Anheftung der Alarmuskeln während der Bildung des Herzschlauchs
Langzeit-Lebendbeobachtung eines fluoreszenz-markierter Wildtyp-Embryos (A-D), eines Embryos
S0733
OJ487
S0733
der EMS-Linie LanB1
(E-H) und der Alarmuskel-freien Doppelmutante org-1
; LanB1
(I-L)
in den Stadien 14 bis 17. HCH-GFP markiert Kardioblasten und Perikardialzellen und org-1-SM-RFP
die Alarmuskeln. Zusätzlich ist HCH-GFP in den Kernen der zirkulären viszeralen Muskulatur und
HLH54F-RFP in den longitudinalen viszeralen Muskeln aktiv. (A-D) Im Wildtyp stehen die Alarmuskeln
S0733
und Perikardialzellen in durchgehendem, engem Kontakt mit den Kardioblasten. (E) In LanB1
Embryonen verlieren im späten Stadium 14 einzelne Perikardialzellen den Kontakt zu den
Kardioblasten (Pfeilspitzen). Die Alarmuskeln sind noch in der Nähe der Perikardialzellen angeheftet.
(F) Beginnende Ablösung der posterioren Alarmuskelpaare zusammen mit einigen Perikardialzellen
kurz vor dem Aufeinandertreffen der Kardioblasten-Reihen (Pfeile). (G) Vergrößerung der Distanz
zwischen den Alarmuskelfasern und dem Herz. Deutlich sind HCH-GFP-positive Perikardialzellen am
dorsalen Ende der Alarmuskeln zu erkennen (Pfeile). (H) Große Distanz zwischen den
Alarmuskelfasern und dem Dorsalgefäß, zusätzlich bedingt durch eine posteriore Ablösung des
OJ487
S0733
; LanB1
-Doppelmutante,
Herzschlauchs. (I) Die Alarmuskeln fehlen in Embryonen der org-1
die Spezifizierung der Herzzellen erfolgt jedoch wie in org-1-Einzelmutanten (Schaub et al., 2012)
normal. (J) Loser Kontakt zwischen Perikardialzellen und Kardioblasten im späten Stadium 15
(Pfeilspitzen). (K, L) In Stadium 16 befinden sich keine Perikardialzellen in großer Distanz zu den
Kardioblasten. Die posteriore Anheftung des Dorsalgefäßes geht verloren und aufgrund der org-1Mutation fehlt die anteriore Darmeinschnürung. Einzelne HCH-GFP-positive Zellkerne des TVM
erkennbar.
Kurz vor dem vollständigen Schluss des Dorsalgefäßes ist der Kontakt zwischen
Perikardialzellen und Kardioblasten in der Doppelmutante lockerer als im Wildtyp (Abb. 27J,
im Vergleich zu B). Im weiteren Verlauf der Entwicklung lösen sich, wie in homozygoten
LanB1S0733-Embryonen, einige Perikardialzellen von den Kardioblasten (Abb. 27K, L).
Allerdings bleiben diese Zellen im Gegensatz zu den Perikardialzellen in LanB1S0733Embryonen in der näheren Umgebung der Kardioblasten. Auch nach dem Beginn der
Kontraktionen des Embryos können keine Perikardialzellen in größerer Entfernung zum Herz
beobachtet werden (Abb. 27L). Im Zuge der Langzeit-Lebendbeobachtung wurde darüber
hinaus festgestellt, dass die Wanderung der Vorläufer der Flügelherzen aus dem thorakalen
perikardialen Bereich in den Kopfbereich (Tögel et al., 2008) sowohl in den Einzel- als auch
in den Doppelmutanten normal verläuft.
Die Ergebnisse bestätigen, dass die Kraft, welche von den Alarmuskelfasern ausgeht, für die
komplette Ablösung der Perikardialzellen verantwortlich ist, welche in größerer Distanz zum
Herz liegen. Sie zeigen auch, dass die Lage der abgelösten Perikardialzellen in LanB1S0733
der verbreiterten Pericardinfärbung entspricht. Das deutet darauf hin, dass die Zellen noch
teilweise über eine veränderte, weniger stabile ECM mit dem Dorsalgefäß verbunden sind
(detaillierte Untersuchung der ECM in Kapitel 4.3.8).
Mit der EMS-Linie Cg25CS3064 als Vertreter der zweiten Komplementationsgruppe mit
Alarmuskel-Anheftungsphänotyp wurde ebenfalls eine Langzeit-Lebendbeobachtung am
104
KLSM
durchgeführt,
allerdings
traten
hierbei
die
ursprünglich
beobachteten
Anheftungsdefekte der Alarmuskeln nur sehr selten und in subtiler Form auf (Daten nicht
gezeigt). Eine Erklärung für dieses zunächst überraschende Ergebnis ist die mögliche
Temperatursensitivität dieser Gruppe von EMS-Allelen, da die Lebendbeobachtungen in
einem speziell für Mikroskope klimatisierten Raum bei einer Temperatur von 20°C bis 22°C,
die anderen phänotypischen Analysen in der Regel jedoch bei 25°C, durchgeführt worden
sind. Neben der bereits erwähnten Beobachtung, dass sich die Phänotypen durch eine
Temperaturerhöhung auf 29°C verstärken lassen, ist dies ein weiterer Hinweis auf das
Vorliegen eines temperatursensitiven Allels. Auch die spezielle Einbettung durch das
Ankleben der Embryonen an ein Deckglas, trägt unter Umständen zur Unterdrückung des
Phänotyps bei, da die Embryonen dadurch in ihrer Flexibilität stärker eingeschränkt sind
(siehe Diskussion).
4.3.4
Identifizierung der Cg25C-Allele
Der letale Treffer innerhalb der Defizienz Df(2L)Exel7022 in der Region 25C auf dem linken
Arm des zweiten Chromosoms, welchen die EMS-Linien S0120, S0791, S1348, S2186 und
S3064 gemeinsam haben, konnte mithilfe von Komplementationstests mit den kleineren
Defizienzen Df(2L)BSC110 und Df(2L)BSC172 weiter eingeschränkt werden (Abb. 29A). In
allen drei Fällen liegt er im Überlappungsbereich dieser beiden Deletionen, in dem sich
lediglich das Gen Cg25C befindet, welches eines der beiden Typ IV-Kollagene in Drosophila
kodiert. Des Weiteren zeigen mehr als 50% der transheterozygoten Embryonen einer
Kombination zwischen S3064 und den oben genannten Defizienz-Linien den der
homozygoten Situation entsprechenden Phänotyp (Abb. 23F und Daten nicht gezeigt). Die
zusätzliche Deletion des benachbart liegenden zweiten Typ IV-Kollagens viking (vkg)
(Yasothornsrikul et al., 1997) durch die Defizienz Df(2L)BSC172 hat dabei keinen Einfluss
auf die Stärke der Defekte. Die phänotypische Analyse der P-Insertion Cg25Ck00405 und des
im Verlauf der Arbeit von Kelemen-Valkony et al. (2012), publizierten Cg25C-Allels DTS-L3
durch das Einkreuzen der tinC*-GFP und org-1-SM-/HLH54f-LVM-RFP-Reportergene auf
dem dritten Chromosom bestätigen die bisherigen Ergebnisse im Prinzip (Abb. 28C, D). Bei
Cg25CDTS-L3 handelt es sich um ein dominant-temperatursensitives Cg25C-Allel mit vier
missense-Mutationen und einer Mutation im nicht-kodierenden Bereich. Eine der missenseMutationen, G552D, ist identisch mit der in Cg25CS3064. Sowohl bei 25°C als auch bei 29°C
zeigen nur sehr wenige homozygote Cg25Ck00405-Embryonen Anheftungsdefekte einzelner
Alarmuskelfasern (Abb. 28C). Bei homozygoten Cg25CDTS-L3-Embryonen waren die Defekte
bei 25°C ebenfalls nur bei einem Teil der Embryonen zu beobachten (Abb. 28D), ließen sich
aber bei Temperaturerhöhung auf 29°C in fast allen Embryonen kurz vor dem Schlupf
105
nachweisen. In der transheterozygoten Kombination beider Allele mit S3064 tritt der
Alarmuskeldefekt deutlich häufiger beziehungsweise mit voller Penetranz auf. Der Zeitpunkt
der Ablösung der Alarmuskeln ist jedoch auch hier etwas verzögert (korreliert in etwa mit
dem Einsatz von Muskelkontraktionen) und die Stärke der Ausprägung des Phänotyps ist
etwas milder als in homozygoten S3064-Embryonen. Dafür ist vermutlich der zusätzliche
genetische Hintergrund in der EMS-Linie verantwortlich (siehe Diskussion).
Abbildung 28: Phänotypen verschiedener Cg25C-Allele
Homozygote Embryonen verschiedener Cg25C-Allele in Stadium 16/17 bei 25°C. LebendBeobachtung mithilfe der bereits beschriebenen GFP-/RFP-Reporterkonstrukte, wie angegeben. (A)
Kontrolle (B) S3064-Embryo mit Alarmuskel-Anheftungsdefekt (Pfeil). (C, D) Beispiele von Embryonen
k00405
DTS-L3
(C) und des Cg25C-Allels Cg25C
(D), die eine Ablösung von
der P-Insertion Cg25C
Alarmuskeln zeigen (Pfeile).
Die Komplementations-Ergebnisse aus den Kreuzungen der Cg25C-Allele untereinander
sind komplex (siehe Tab.21 im Anhang) und mit Unregelmäßigkeiten bei der Überprüfung
der Phänotypen verbunden. Die Stärke und Penetranz der Phänotypen homozygoter
Df(2L)Exel7022- und Cg25Ck00405-Embryonen, also Embryonen ohne Cg25C-Protein, ist im
Vergleich zu homozygoten Cg25CS3064-Embryonen deutlich geringer. In Kelemen-Valkony et
al. (2012) gehen die Autoren von einer antimorphen Wirkung des Cg25C-Allels DTS-L3 aus,
was eine Erklärung für die unerwarteten Ergebnisse der Phänotypen-Überprüfungen sein
kann. Das bedeutet, dass nicht das fehlende, sondern ein verändertes Protein den Phänotyp
hervorruft.
106
Die zur Bestimmung des Charakters der Mutation durchgeführte Sequenzierung der
mutmaßlichen Cg25C-Allele S0791, S1348, S2186 und S3064 offenbahrte in allen Fällen
jeweils eine einzelne Punktmutation im Cg25C-Gen und bestätigte somit auch die
Ergebnisse der Komplementationstests. Diese Mutation führt in allen Allelen zu einem
Glycin-Austausch an unterschiedlichen Positionen innerhalb eines bestimmten ProteinsAbschnitts, der sogenannten Trippelhelix-Domäne (Abb. 29B). Diese bildet neben einer Nterminalen 7S-Domäne und einer kleinen C-terminalen NC1-Domäne den Hauptbestandteil
des monomeren Cg25C-Proteins und besteht aus mehreren Wiederholungen eines Glycin-XY-Motivs. Die Trippelhelix-Domäne spielt bei der Bildung des Typ IV-Kollagen-Trimers,
bestehend aus zwei Cg25C- und einem Viking-Molekül eine entscheidende Rolle (Hudson et
al., 1993; Timpl, 1989).
Abbildung 29: Cg25C – genomische Region und Protein-Struktur
(A) Karte der genomischen Region 25C auf dem linken Arm des zweiten Chromosoms mit den beiden
k00405
Typ IV-Kollagenen Cg25C und viking (vkg). Zusätzlich sind der Insertionsort von P{lacW}Cg25C
und Defizienz-Linien eingezeichnet, in denen diese Region teilweise oder komplett deletiert ist
(modifiziert nach www.flybase.org). (B) Übersicht der Protein-Struktur von Cg25C, bestehend aus
einer Trippelhelix-Domäne und der NC1-Domäne. Die Glycin-Austausche der EMS-Allele sind mit
Positionsangabe und resultierendem Aminosäureaustausch im Einbuchstaben-Code eingetragen und
befinden sich alle in der Trippelhelix-Domäne.
107
Die Analyse der Cg25C-Sequenz der EMS-Linie S0120, die durch den Einfluss zusätzlicher
Mutationen eine Ausnahme darstellt (siehe Kapitel 4.3.1), zeigt, dass in dieser Linie ebenfalls
eine Punktmutation für einen Glycin-Austausch innerhalb der Trippelhelix-Domäne
verantwortlich ist (Abb. 29B).
4.3.5
Identifizierung der LamininB1-Allele
Die EMS-Linien S0733, S1163 und S3773 sind untereinander in trans gekreuzt letal, und alle
transheterozygoten Embryonen zeigen den für die Einzellinien beschriebenen spezifischen
Alarmuskel- und Herzphänotyp (Kapitel 4.3.1, Abb. 24A-C). Wie die Kartierung mit
Defizienzen ergab, besitzen sie einen gemeinsamen letalen Treffer in einem überlappenden
Bereich der Defizienzen Df(2L)ED12527 und Df(2L)BSC233 (Abb. 31A). Dieser Abschnitt auf
dem linken Arm des zweiten Chromosoms beinhaltet 20 Gene. Unter diesen Genen befindet
sich das LanB1-Gen, welches die β-Kette der in Drosophila vorkommenden Laminin-Trimere
kodiert (siehe Einleitung, Kapitel 2.1.4.4). Wegen der Beteiligung von Laminin am Aufbau
des ECM-Gerüsts um das Dorsalgefäß erschien es denkbar, dass die genannten Linien
Mutationen in LanB1 tragen. Allerdings entspricht der relativ spezifische Phänotyp nicht dem
der in der Literatur beschriebenen LanB1-Nullmutanten (Urbano et al., 2009) oder amorphen
Mutanten für die ebenfalls essentielle γ-Laminin-Kette (LanB2; Wolfstetter und Holz, 2011).
Außerdem konnten im Verlauf unseres EMS-Screens zuvor bereits fünf LanB1-Allele
(S0212, S0464, S0473, S1522 und S2941) isoliert werden, welche im Vergleich zu den oben
genannten drei Linien einen deutlich stärkeren und alle drei Hauptmuskeltypen betreffenden
Phänotyp aufweisen (vergleiche Abb. 30C mit Abb. 30B). Die tinC-GFP-Expression weisst
bei diesen starken und vermutlich amorphen Allelen in dem meisten Fällen größere Lücken
oder einen Wechsel zwischen dünneren und dickern Bereichen auf, was darauf hindeutet,
dass der Herzschlauch unterbrochen ist oder stellenweise nur eine Zellreihe vorhanden ist
(Abb. 30C). Einige org-1-RFP-positiven Alarmuskelfasern befinden sich in einiger Entfernung
zu den Resten des Dorsalgefäßes. Auch die übrigen somatischen Muskelfasern besitzen in
vielen Fällen eine irreguläre Form oder Orientierung. Desweiteren zeigen die genannten
LanB1-Allele einen auffälligen wing blister (Laminin α1,2)-ähnlichen Phänotyp in der
viszeralen Muskulatur (siehe Abb. 30C und Abb. 9E) Im Bereich des Mitteldarms fehlt die
longitudinale viszerale Muskulatur fast vollständig, nur in den dorsalen bzw. ventralen
Randbereichen sind einzelne HLH54F-RFP-positive LVM-Fasern erkennbar (Abb. 30C). Wie
die gemeinsame Betrachtung mit hand-GFP ergab, liegen diese LVM-Fasern im Bereich der
ebenfalls abnormal lokalisierten zirkulären viszeralen Muskulatur (I. Reim, persönliche
Mitteilung). Bedingt durch die starke Reduktion der viszeralen Muskulatur fehlen sämtliche
Darmeinschnürungen.
108
Die vier LanB1-Allele mit starken multiplen Defekten komplementieren untereinander sowie
mit LanB1KG03456 nicht im Bezug auf Letalität, und die Defekte heteroallelischer
Kombinationen von EMS-Allelen oder Hemizygoten in trans zu Defizienzen der Region
gleichen den Herz-, Skelettmuskel- und Darmdefekten der homozygoten Embryonen. Um zu
überprüfen, ob es sich bei den Linien S0733, S1163 und S3773, welche über ihren
spezifischen Alarmuskel- und Herzdefekt isoliert wurden, ebenfalls um LanB1-Allele handelt,
wurden Letalitäts-Tests aus Kombinationen dieser Linien mit den bereits identifizierten
Allelen durchgeführt. Auch in diesem Fall sind alle transheterozygoten Organismen entweder
embryonal oder früh larval letal (siehe auch Tab. 22 im Anhang). Die beobachteten MuskelDefekte beschränken sich hauptsächlich auf die Ablösung der Alarmuskeln und eine
irreguläre Morphologie des Dorsalgefäßes (Abb. 30D), was dem homozygoten Phänotyp der
drei Linien entspricht. Des Weiteren ist auch die P-Insertion LanB1KG03456 über jede der
Linien letal.
Es ist daher davon auszugehen, dass es sich bei den EMS-Linien S0733, S1163 und S3773
um hypomorphe LanB1-Allele handelt.
Abbildung 30: Vergleich zwischen dem hypomorphen und amorphen LanB1-Phänotyp
Lebendbeobachtung verschiedener LanB1-Embryonen in Stadium 16. (A) Kontrolle (B) Homozygoter
Embryo des LanB1-Hypomorphs S0733 mit Anheftungsdefekten der posterioren Alarmuskelpaare
(Pfeile). (C) Homozygote Embryonen der Linie S1522 zeigen LanB1-Nullphänotyp. Charakteristisch
dafür sind lateral sitzende Alarmuskeln (Pfeile) und Lücken im Herz in Kombination mit
Anordnungsdefekten der Kardioblasten. Zusätzlich ist die longitudinale viszerale Muskulatur stark
abnormal und es fehlen die Darmeinschnürungen (Stern). (D) Die transheterozygote Kombination von
Hypomorph und Null-Allel zeigt nur den Alarmuskelphänotyp (Pfeile) und leichte Unregelmäßigkeiten
im Herz.
109
Um mögliche Unterschiede der Mutationen der hypomorphen und amorphen Allele
aufzudecken und zur Absicherung der Ergebnisse der Komplementationstests wurde das
LanB1-Gen in den sieben oben genannten EMS-Linien sequenziert. Tatsächlich konnte in
allen Linien jeweils eine Punktmutation gefunden werden, welche entweder einen
Aminosäureaustausch oder den Einbau eines vorläufigen Stop-Codons zur Folge hat (Abb.
31, Tab. 18). Die Mutationen in den starken LamininB1-Allelen S0473, S1522 und S2941
führen durch den Einbau eines vorzeitigen Stop-Codons jeweils zu verkürzten Proteinen.
Während die Translation in S2941 bereits an Position 355 und in S0473 an Position 465 der
Aminosäurekette, also innerhalb der ersten Domäne mit EGF-ähnlichen Wiederholungen,
abbricht, führt der vorzeitige Translationsabbruch in der Linie S1522 an Position 1696 zu
einer verkürzten C-terminalen „Laminin-coiled-coil“-Domäne (Abb. 31B, Tab. 18). In
Vertebraten ist diese Domäne für die Bildung des Laminin-Trimers von entscheidender
Bedeutung (Beck et al., 1993; Colognato und Yurchenco, 2000). Für das Drosophila-Protein
ist das bisher nicht gezeigt worden, so dass diese neue Erkenntnis die vorgeschlagenen
Modelle von Laminin-Molekülen in anderen Organismen und Zellkulturexperimenten
bestätigt. Durch die Verkürzung des Proteins wird außerdem ein weiter C-terminal liegendes
Cystein entfernt, welches vermutlich eine essentielle intermolekulare Disulfidbrücke
zwischen den unterschiedlichen Ketten des Laminin-Trimers herstellt (Beck et al., 1993;
Kumagai et al., 1997). Aus diesem Grund kommt vermutlich trotz des nur geringfügig
verkürzten LanB1-Proteins der Null-Phänotyp zustande (siehe Abb. 30C). In der EMS-Linie
S0464 ist ein Aminosäureaustausch im LanB1-Protein an Position 364 für den MuskelPhänotyp verantwortlich (Abb. 31B). Das an dieser Stelle sitzende Cystein wird durch
Tyrosin ersetzt, was Einfluss auf die Konformation des Polypeptids haben kann, da Cysteine,
wie bereits erwähnt, Disulfid-Brückenbindungen ausbilden und somit zur Tertiärstruktur
beitragen (Kalkhof et al., 2010a; Kalkhof et al., 2010b). Das falsch gefaltete Protein wirkt sich
nach dem Einbau möglicherweise negativ auf die Funktion des Laminin-Trimers aus.
Die Mutationen der hypomorphen LanB1-Allele S0733, S1163 und S3773, welche sich
primär auf die ECM des Dorsalgefäßes auswirken, haben auffallenderweise alle einen
Aminosäureaustausch in der Laminin N-terminalen (LN) Domäne zur Folge (Abb. 31B, Tab.
18). Eine interessante Erkenntnis ergibt sich aus dem Vergleich des Alarmuskelphänotyps
der hypomorphen und starken LanB1-Alelle. Auch bei einem starken Allel sind die
Alarmuskeln zum Teil noch angeheftet (Abb. 30C), das heisst der Alarmuskelphänotyp ist in
den hypomorphen Allelen annähernd gleich stark. Das weisst auf eine besondere Bedeutung
von LanB1 in Bezug auf das Herz hin. Daraus ergibt sich die Frage, welchen Einfluss die
Mutationen innerhalb der LN-Domäne auf den Aufbau der ECM haben (siehe Kapitel 4.3.8,
Abb. 33). Außerdem bleibt die Frage zu beantworten, ob der LN-Domäne eine spezielle
Rolle bei der Bildung der ECM um das Herz zukommt (siehe Diskussion).
110
Abbildung 31: LanB1 – genomische Region und Protein-Struktur
(A) Karte der genomischen Region 28C4 – D3 mit dem LanB1-Gen und diesen Bereich (teilweise)
deletierenden Defizienz-Linien Df(2L)BSC233 und Df(2L)ED12527 (modifiziert nach www.flybase.org).
(B) Strukturelle Übersicht der Domänen des LanB1-Proteins und der Postion der Mutationen in den
sieben
sequenzierten
EMS-Allelen.
Alle
hypomorphen
LanB1-Allele
weisen
einen
Aminosäureaustausch in der LamininN-Domäne auf. Zwei der drei vorläufigen Stop-Codons befinden
sich innerhalb der ersten EGF-ähnlichen Domäne. Bei den in orange angegebenen Linien handelt es
sich um die hypomorphen Allele, die starken Allele sind mit roter Schriftfarbe angegeben.
Hypomorphe LanB1-Allele
Starke LanB1-Allele
EMS-Linie
Mutation
EMS-Linie
Mutation
S0733
E215K
S0464
C364Y
S1163
G286R
S0473
W465*
S3773
V226G
S1522
E1696*
S2941
C355*
Tabelle 18: Übersicht der identifizierten LanB1-Allele
Auflistung der identifizierten LanB1-Allele. Unterteilung in hypomorphe und starke Allele, jeweiliges mit
Angabe der Position des Aminosäureaustausches beziehungsweise desvorzeitigen Stop-Codons (*).
111
4.3.6
Genetische Interaktion zwischen den Cg25C- und LamininB1-Allelen
Da sowohl Cg25C als auch LanB1 Untereinheiten von extrazellulären Matrix-Proteinen
kodieren, liegt die Vermutung nahe, dass die in dieser Arbeit beschriebenen Allele aus
beiden Gruppen genetisch interagieren. Die Tatsache, dass aus der Kreuzung der beiden
nicht überlappenden Defizienzen Df(2L)Exel7022 (Cg25C- und vkg-) und Df(2L)ED12527
(LanB1-)
(siehe
Kapitel
4.3.4
und
4.3.5)
keine
transheterozygoten
Nachkommen
hervorgehen, liefert einen ersten Hinweis auf eine genetische Interaktion. Die Ergebnisse der
Komplementationstests mit verschiedenen Cg25C- und LanB1-Allelen scheinen das zu
bestätigen. Da die transheterozygoten Embryonen keiner Allel-Kombination sichtbare
Defekte der Hauptmuskeltypen aufweisen, wurde die Überlebensrate der Nachkommen als
Kriterium für den Grad der genetischen Interaktion herangezogen. Die Ergebnisse aller
Komplementations-Kreuzungen aus verschiedenen Kombinationen der Cg25C- und LanB1Allele sind in Form einer Komplementationsmatrix in Tabelle 19 dargestellt (detaillierte
Ausführung in Tab. 23 im Anhang).
Hervorzuheben ist die zum Teil deutlich eingeschränkte Lebensfähigkeit von Cg25CS3064 und
Df(2L)Exel7022 über beinahe alle bisher identifizierten amorphen und hypomorphen LanB1Allele. Die unwahrscheinliche Möglichkeit einer zweiten Mutation in der Linie S3064
ausgerechnet im LanB1 wurde durch die Sequenzierung des Gens ausgeschlossen. Ähnlich
verhält sich LanB1S0733 über verschiedene Cg25C-Allele beziehungsweise Defizienzen, in
welchen die beiden Typ IV-Kollagene Cg25C und vkg deletiert sind.
Während die Komplementations-Ergebnisse einzelner Kombinationen durch zusätzliche
Mutationen beeinflusst sein könnten, weist die Gesamtheit der Daten darauf hin, dass trotz
fehlender transheterozygoter Phänotypen in den betrachteten embryonalen Muskelgeweben
ein gewisses Maß an genetischer Interaktion vorhanden ist.
112
S0473
S0733
S1163
S1522
S2941
S3773
++
S0464
S0212
-
KG03456
-
LanB1
Df(2L)ED12527
Df(2L)Exel7022
Df(2L)BSC233
LamininB1
+
-
+
+
-
+
++
Df(2L)BSC110
-
+
++
Df(2L)BSC172
-
+
++
+
++
+
+
+
Cg25C
k00405
Cg25C
S0120
++
++
S0791
++
++
+
+
++
++
S1348
++
++
+
++
++
-
++
++
++
+
+
-
+
+
+
++
+
+
++
++
++
S2186
S3064
Cg25C
DTS-L3
Cg25C
b9
+
++
++
+
+
++
+
+
-
Tabelle 19: Komplementationsmatrix der Cg25C- und LanB1-Mutanten
Ergebnisse der Komplementationstests verschiedener Cg25C- und LanB1-Allele. Die Cg25C-Allele
sind in der linken Spalte angegeben, in der obersten Zeile stehen die LanB1-Allele. Bedeutung der
Ergebnisangaben: ++ vollständige Komplementation, + unvollständige Komplementation, - keine
Komplementation
113
4.3.7
Cg25C und LamininB1 werden in den Kardioblasten exprimiert
Die extrazelluläre Matrix im Bereich des Herzens ist notwendig für die Adhäsion der
verschiedenen Zelltypen und die Anheftung der Alarmuskeln. Über die Entstehung der ECM
ist relativ wenig bekannt, aber vermutlich spielen die Hämozyten dabei eine wichtige Rolle.
Diese exprimieren eine Reihe von Genen, welche Komponenten der ECM kodieren
(einschließlich Cg25C und LanB1) (Fessler und Fessler, 1989; Mirre et al., 1988; Olofsson
und Page, 2005; Tepass et al., 1994; Wolfstetter und Holz, 2011; Yasothornsrikul et al.,
1997) und wandern während der Entwicklung durch den Embryo (Tepass et al., 1994). Die
entlang des Herzens wandernden Hämozyten sind in der Lage, Bestandteile der Matrix zu
sekretieren. Zusammen mit zirkulierenden Vorläufer-Molekülen kann auf diesem Weg die
ECM aufgebaut werden. Um zu testen, ob auch die Herzzellen selbst Cg25C und LanB1
exprimieren, wurden in situ Hybridisierungen gegen Cg25C- und LanB1-mRNA in
Embryonen der Stadien 12 bis 17 durchgeführt. Außerdem wurden alle Muskelzellen durch
eine Antikörperfärbung gegen das Mef2-Protein hervorgehoben, um gegebenenfalls eine
Expression im Mesoderm, beziehungsweise in späteren Stadien in den Muskelzellen,
insbesondere den Kardioblasten, eindeutig zuordnen zu können.
Die Expression von Cg25C beginnt in Stadium 12 und kann dann vor allem im posterioren
Abschnitt des sich zurückziehenden Keimstreifs nachgewiesen werden. Die mRNA liegt dort
ungleichmäßig verteilt vor und befindet sich allem Anschein nach nicht in den Vorläuferzellen
der Muskulatur, da keine Kolokalisation mit Mef2 beobachtet werden kann (Daten nicht
gezeigt). Zellen im Kopfbereich des Embryos, bei denen es sich wahrscheinlich um die
Vorläufer der Hämozyten handelt (Tepass et al., 1994), exprimieren ebenfalls Cg25C. Nach
Mirre et al., 1988, wird Cg25C zu diesem Zeitpunkt auch im viszeralen und somatischen
Mesoderm exprimiert. Ab Stadium 14 konzentriert sich die Expression auf die wandernden
Hämozyten und den Fettkörper (Mirre et al., 1988; Yasothornsrikul et al., 1997). Die mRNA
von vkg, dem zweiten Typ IV-Kollagen in Drosophila, kann ebenfalls in diesen Geweben
nachgewiesen
werden
(Yasothornsrikul
et
al.,
1997).
Zusätzlich
zu
den
bereits
veröffentlichten Daten konnte im Rahmen dieser Arbeit die Expression von Cg25C ab
Stadium 13 in den wandernden Kardioblasten nachgewiesen werden (Abb. 32A, A‘). Die
Expression bleibt bis Stadium 16/17 bestehen (Abb. 32B, B‘), ist jedoch im Vergleich zur
Expression
in
den
Hämozyten
deutlich
schwächer
ausgeprägt.
In
homozygoten
Df(2L)Exel7022-Embryonen, welchen das Cg25C-Gen fehlt, ist weder in den Hämozyten
noch im Fettkörper ein Signal zu erkennen. Auch in der Nähe der Kardioblasten ist kein
Signal detektierbar (Abb. 32C, C‘ und Abb. 37 im Anhang).
114
Abbildung 32: Expression von Cg25C und LamininB1 im Bereich der Herzzellen
115
Abbildung 32: Expression von Cg25C und LamininB1 im Bereich der Herzzellen
In situ Hybridisierung in wildtypischen und Defizienz-Embryonen gegen Cg25C-mRNA (A, B) oder
LamininB1-mRNA (C, D) (grün) und zusätzlicher Antikörperfärbung gegen Mef2 (rot). (A) Expression
von Cg25C in den wandernden Kardioblasten (Kb) in Stadium 13. Starke Expression in den
Hämozyten (Hz) (A'). (B, B') Nachweis von Cg25C-mRNA im Herzabschnitt eines Embryos in Stadium
16. (C, C‘) Teil des Dorsalgefäßes eines Cg25C-defizienten Embryos der Defizienz Df(2L)Exel7022
ohne erkennbares in situ-Signal. (D) Frühe LanB1-Expression in den Kardioblasten. Zusätzliche
Expression im Ektoderm und in der Amnioserosa erschweren die genaue Zuordnung (D'). (E) LanB1mRNA in Kardioblasten eines Embryos in Stadium 16. Hämozyten sind ebenfalls LanB1-positiv (E').
(F, F‘) Keine LanB1-Expression im Bereich der Herzzellen in einem homozygoten Embryo der LanB1deletierenden Defizienz Df(2L)ED12527 in Stadium 16. Unspezifische Signale im Bereich der
Segmentgrenzen.
Nach Montell und Goodman, 1989, kann LanB1-mRNA zusammen mit LanA- und LanB2mRNA in Stadium 10 im Mesoderm und schwach im Ektoderm nachgewiesen werden. Ab
diesem Zeitpunkt werden die drei Laminin-Gene vor allem im viszeralen und somatischen
Mesoderm exprimiert. Die Daten aus Wolfstetter und Holz, 2011, bestätigen die frühe
mesodermale Expression von LanA und LanB2, allerdings beschreiben die Autoren eine
zusätzliche Expression der beiden Gene im Endoderm und in späten Stadien in den
Hämozyten und im Fettkörper. Das Gen wb, welches die zweite in Drosophila
vorkommenden Laminin-α-Kette codiert, wird nach einer frühen ubiquitären Expression ab
Stadium 11 vor allem im Bereich des viszeralen Mesoderm und ab Stadium 14 in der Nähe
von Muskelanheftungsstellen exprimiert (Martin et al., 1999). Zu diesem Zeitpunkt kann wbmRNA auch in (von den Autoren nicht näher bezeichneten) Herzzellen detektiert werden. Die
im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Analyse der LanB1-Expression bestätigt die frühe
mesodermale und ektodermale Expression. Zusätzlich konnte ab Stadium 11 ein Signal in
Zellen des extraembryonalen Gewebes, der Amnioserosa detektiert werden. Die späte
LanB1-Expression ähnelt der von Cg25C und findet wie diese in über den Embryo verteilten
Hämozyten und im Fettkörper statt (Abb. 32 und Abb. 37 im Anhang). In Stadium 13 kann
neben der Cg25C-mRNA in den Kardioblasten auch LanB1-mRNA nachgewiesen werden
(Abb. 32D, D‘). In Stadium 16 hebt sich das Dorsalgefäß durch die LanB1-Expression in den
Kardiobasten deutlich von den umliegenden Geweben ab (Abb. 31E, E‘). Auch in diesem Fall
ist die Expression in den Kardioblasten jedoch deutlich schwächer als in den Hämozyten.
Um die Spezifität der LanB1-mRNA-Sonde zu zeigen wurde die in situ Hybridisierung auch
mit
LanB1-defizienten
Embryonen
durchgeführt.
In
homozygoten
Df(2L)ED12527-
Embryonen ist weder in Hämozyten und im Fettkörper, noch in der Amnioserosa ein Signal
detektierbar. Auch in der Nähe der Kardioblasten ist kein Signal zu erkennen. (Abb. 32F, F‘
und Abb. 37 im Anhang).
116
Die hier durchgeführten Expressionsstudien lassen somit den Schluss zu, dass Cg25C und
LanB1 nicht nur wie bisher bekannt stark in Hämozyten und im Fettkörper, sondern auch in
geringerem Umfang in Kardioblasten exprimiert werden.
4.3.8
LanB1S0733 und Cg25CS3064 haben unterschiedlichen Einfluss auf die Ausbildung
der das Herz umgebenden extrazellulären Matrix
Die Sequenzierung der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten EMS-Linien mit AlarmuskelAnheftungsphänotyp hat bestätigt, dass es sich dabei entweder um Cg25C- oder LanB1Allele handelt (Kapitel 4.3.4 und 4.3.5). Beide Gene kodieren Komponenten, die für den
Aufbau und die Stabilität der extrazellulären Matrix von entscheidender Bedeutung sind. Aus
diesem Grund wurden deren Verteilung und die zusätzlicher Strukturproteine der
Basalmembran mittels Antikörperfärbungen eingehender analysiert. Die in Kapitel 4.3.2
beschriebene Analyse des Typ IV-Kollagen-ähnlichen Matrix-Proteins Pericardin gibt einen
Hinweis darauf, dass der Aufbau der extrazellulären Matrix in den Cg25C- und LanB1Mutanten
auf
unterschiedliche
Antikörperfärbungen
in
Weise
Embryonen
verändert
einer
jeweils
sein
für
könnte.
die
Deshalb
wurden
Komplementationsgruppe
stellvertretenden Linie gegen die Laminin-β-Kette und gegen Nidogen, ein Protein, welches
Typ IV-Kollagen und Laminin miteinander verknüpft (Aumailley et al., 1989; Fox et al., 1991),
durchgeführt.
Im Wildtyp ist LanB1 entlang des kompletten Herzschlauchs an der Außen- und Innenseite
der Kardioblasten lokalisiert, wobei die luminale Seite eine höhere Proteinkonzentration
aufweist (Abb. 33A, B). Dieses Muster ist in LanB1S0733 unterbrochen, sowohl die Aorta als
auch der eigentliche Herzabschnitt zeigen nur punktuell eine Akkumulation des LanB1Proteins (Abb. 33C, D). Anhand der vorliegenden Daten kann nicht festgestellt werden, ob es
sich bei den Signalen um intrazelluläres LanB1 handelt oder um komplette und sezernierte
Laminin-Trimere. In Embryonen der Linie Cg25CS3064 hingegen entspricht die Verteilung des
LanB1 der des Wildtyps (Abb. 33E, F).
Nidogen ist wie LanB1 unter normalen Umständen an der Außen- und Innenseite der
Kardioblasten zu finden und auch hier ist die Konzentration an der dem Lumen zugewandten
Seite höher (Abb. 33G, H). Die ebenfalls markierten Odd-positiven Perikardialzellen rahmen
die Aorta von beiden Seiten ein, im eigentlichen Herz-Abschnitt liegen sie leicht über
beziehungsweise
unter
dem
Dorsalgefäß.
Ähnlich
des
unterbrochenen
LanB1-
Proteinmusters sind auch bei der Analyse des Nidogen-Proteins in LanB1S0733-Embryonen
keine durchgehenden Linien entlang der Aorta
zu erkennen (Abb. 33I, J). Allerdings
existieren im Herz kurze Abschnitte mit zusammenhängender Protein-Lokalisation (Abb.
33J). Cg25CS3064-Embryonen zeigen im Bereich der Aorta ein reguläres Nidogen-Muster
117
(Abb. 32K). Dagegen ist das Protein in der ventrikulären Seite der Kardioblasten nur
punktuell detektierbar (Abb. 33L). Diese Beobachtung spiegelt auch den in Kapitel 4.3.1
beschriebenen Herzphänotyp wieder. Erneut kann beobachtet werden, dass einige
Perikardialzellen sowohl in der Cg25C- als auch in der LanB1-Mutante den Kontakt zum
Herzschlauch verlieren (vergleiche Kapitel 4.3.2 und 4.3.3).
Abbildung 33: Verteilung von ECM-Komponenten entlang des Dorsalgefäßes von Cg25C- und
LanB1- Mutanten
118
Abbildung 33: Verteilung von ECM-Komponenten entlang des Dorsalgefäßes von Cg25C- und
LanB1- Mutanten
Antikörperfärbungen gegen das LamininB1- (A-F) bzw. Nidogen- und Odd-Skipped-Protein (G-L) in
S0733
S3064
und Cg25C
in Stadium 16.
Kontroll-Embryonen und in Embryonen der EMS-Linien LanB1
Die Komponenten der extrazellulären Matrix sind jeweils
rot markiert, die Odd-positiven
Perikardialzellen grün. (A, B) In der Kontrolle ist LamininB1 im Bereich der Aorta und im HerzAbschnitt durchgehend an der Außenseite und der dem Lumen zugewandten Seite der Kardioblasten
S0733
-Embryonen ist dieses Muster entlang des kompletten Dorsalgefäßes
lokalisiert. In LanB1
mehrfach unterbrochen (C, D). Im Herzabschnitt ist kaum Protein nachweisbar (D). (E, F) Die
S3064
Lokalisation des LanB1-Proteins in Embryonen der Linie Cg25C
gleicht dem der Kontrolle. (G, H)
Das Muster der Nidogen-Verteilung entspricht dem LanB1-Muster. Deutlich sichtbar ist hier das
Protein zwischen den durch Odd-skipped markierten Perikardialzellen und den nicht markierten
S0733
-Embryonen ist Ndg, ähnlich wie LanB1, nur punktuell
Kardioblasten lokalisiert. (I, J) In LanB1
S3064
entlang der Aorta und im Herzabschnitt verteilt. (K) Im Bereich der Aorta ist in Cg25C
-Embryonen
ein reguläres Ndg-Muster vorhanden. Im Herzabschnitt fehlt das Protein teilweise entlang der dem
Lumen zugewandten Seite der Kardioblasten (L). In beiden Mutanten haben sich einige
Perikardialzellen vom Dorsalgefäß gelöst (I-L, im Vergleich zu G, H).
Wie bereits für das Pericardin-Protein beschrieben, wirkt sich die hypomorphe LamininMutation S0733 auch auf die Verteilung der Matrix-Komponenten LanB1 und Nidogen
stärker aus, als die Cg25C-Mutation S3064. Das lässt den Schluss zu, dass Typ IVKollagene
und
Laminine
verschiedene
Aufgaben
im
Zuge
der
Entstehung
und
Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix übernehmen.
119
5 Diskussion
5.1
Analyse
EMS-induzierter
Mutanten
gewährt
einen
tieferen
Einblick
in
verschiedene Prozesse der Muskelentwicklung in Drosophila
Um ein besseres Verständnis für die während der Muskelentwicklung in Drosophila
ablaufenden morphogenetischen Prozesse zu erlangen, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein
EMS-Mutagenese-Screen des zweiten Chromosoms durchgeführt. Die aus dem Screen
isolierten Mutanten mit Muskeldefekten wurden in verschiedene phänotypische Gruppen
unterteilt und ausgewählte Mutanten näher analysiert. Neben den im Rahmen dieser Arbeit
analysierten und im Folgenden diskutierten EMS-Linien liefert eine Reihe von identifizierten
Allelen mit Herzdefekten einige interessante Aspekte im Hinblick auf zukünftige Arbeiten.
Diese Allele stammen vor allem aus den phänotypischen Gruppen mit reduzierter
Kardioblastenzahl (z.B. Linie S0825, Abb. 10) und mit Defekten in der Anreihung der
Kardioblasten (z.B. S1264 und S1459). In die letztgenannte Kategorie fallen auch Mutanten,
bei denen sich die bilateralen Reihen von Kardioblasten nicht korrekt entlang der dorsalen
Mittellinie anordnen (wie z.B. zip, S1635 und weitere, bisher nicht identifizierte Linien mit
ähnlichem Phänotyp). In diesen Fällen muss noch geklärt werden, ob das fehlerhafte
Zusammenführen
der
Kardioblasten-Reihen
indirekt
durch
einen
unvollständigen
Rückenschluss zustande kommt, oder ob die betroffenen Gene eine zusätzliche Funktion in
Herzzellen oder Herz-assoziierten Geweben haben. Aus dem EMS-Screen sind außerdem
ca. 100 weitere, bisher nicht identifizierte Linien mit Defekten in der Skelett- und
Darmmuskulatur hervorgegangen, deren nähere Charakterisierung noch aussteht.
Im Verlauf der Arbeit konnten einigen für die Muskelentwicklung relevanten Genen weitere
Funktionen zugeordnet werden. So konnte durch die Isolation der beiden pyr-Allele pyrS0439
und pyrS3547 gezeigt werden, dass der FGF-Signalweg neben der Ausbreitung des
Mesoderms während der Gastrulation auch die Wanderung der Gründerzellen der LVM
steuert. Durch die Isolation der Cg25C-Allele und hypomorphen LanB1-Allele konnte der
extrazellulären Matrix im Bereich des Herzens eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der
Morphologie und Stabilität des Herzens zugeordnet werden. Insgesamt führen die aus dem
EMS-Screen gewonnenen Erkenntnisse durch die Ergänzung bereits bekannter Daten zum
besseren Verständnis der Rolle des FGF-Signalwegs bei der Mesodermentwicklung und
verdeutlichen den Beitrag der extrazellulären Matrix zur Organogenese. Beide Aspekte
werden in den Kapiteln 5.2 und 5.3 detaillierter diskutiert.
120
5.1.1
Vergleich des EMS-Screens mit anderen Screen-Verfahren
Um Gene zu finden, welche an der Muskelentwicklung in Drosophila beteiligt sind, wurden
auch von anderen Arbeitsgruppen Mutagenese-Screens durchgeführt. Dabei wurden unter
anderem auch eine Vielzahl von EMS-induzierten Mutanten analysiert (Albrecht et al., 2006;
Bulchand et al., 2010; Estrada et al., 2007; Schnorrer et al., 2007). In Bezug auf die
Herzentwicklung in Drosophila sind auf diesem Weg in der Vergangenheit zum Beispiel neue
Allele der Gene kuz, mam und tum/RacGAP50C gefunden worden (Albrecht et al., 2006;
Meyer et al., 2011). Von den drei Genen wurden im Verlauf dieser Arbeit ebenfalls mehrere
neue Allele isoliert, was die Effizienz des Screens weiter unterstreicht. Einige der hier
aufgeführten Gene, wie tum/RacGAP50C und mute, wurden auch im Zusammenhang mit
Defekten der somatischen Muskulatur in EMS-Screens isoliert (Bulchand et al., 2010; Guerin
and Kramer, 2009), betreffen nach unserer Analyse jedoch auch die Entwicklung der Darmund Herzmuskelzellen.
Ein anderes Screen-Verfahren zur Identifizierung essentieller Faktoren der Herzentwicklung,
der Defizienzen-Screen, wurde von Tao et al. (2007) benutzt. Bei einem Defizienzen-Screen
werden eine Reihe von Defizienzen verwendet, welche das Zielchromosom möglichst
vollständig abdecken. Mithilfe spezieller Reporter werden für die Defizienzen homozygote
Embryonen oder Larven auf Defekte in den zu analysierenden Geweben untersucht. Auf
diese Weise wurde eine Beteiligung der Gene mam und tup an der Herzentwicklung mit
bestehenden Allelen nachgewiesen (Tao et al., 2007). Bei den im Rahmen eines
Defizienzen-Screens gefundenen Phänotypen handelt es sich in der Regel um NullPhänotypen. Ein Vorteil des Defizienzen-Screens gegenüber dem EMS-Screen besteht
darin, dass bei der Verwendung von Defizienzen mit molekular charakterisiertem Bruchpunkt
die Region, in welcher das für den Phänotyp verantwortliche Gen liegt, bekannt ist. Diese
muss anschließend lediglich durch kleinere, überlappende Defizienzen weiter eingeschränkt
werden. Den Vorteil, unvoreingenommen alle Gene zu testen, teilt sich der DefizienzenScreen mit dem EMS-Screen. Der Defizienzen-Screen bringt jedoch eine Reihe von
Problemen mit sich. Durch die Analyse der Defizienzen werden mehrere Gene einer Region
auf einmal untersucht. Deshalb können die Phänotypen die Folge der Deletion mehrerer
Gene sein und schwache von starken Phänotypen überdeckt werden. In geringem Maße trifft
das auch auf den EMS-Screen zu, da mehrere Gene auf dem Chromosom mutiert sein
können. Die Defizienz-Stämme können zudem zusätzliche Mutationen aufweisen. Des
Weiteren können flankierende Gene der Defizienz durch deletierte stromaufwärts liegende
Exons und eine damit verbundene Misregulation oder dem Fehlen bestimmter Isoformen
ebenfalls teilweise betroffen sein.
Eine weitere Möglichkeit, nach an der Herzentwicklung in Drosophila beteiligten Genen zu
suchen, ist der von Kim et al. (2004) durchgeführte RNAi-Screen. Hierbei handelte es sich
121
um einen loss-of-function-Screen, bei welchem durch die Injektion von dsRNA gezielt Gene
inaktiviert wurden. Diese Methode hat gegenüber dem EMS-Screen den Vorteil, gezielt den
Verlust-Phänotyp eines bestimmten Gens zu analysieren. Bei der Durchführung von RNAiExperimenten besteht jedoch immer die Möglichkeit, dass die Zielgene nicht vollständig
ausgeschaltet, sondern nur herunterreguliert werden. Auch können neben dem Zielgen
weitere Gene beeinflusst werden. Ein weiterer Nachteil ist die aufwendige Vorbereitung
eines RNAi-Screens. Für einen genomweiten Screen, in welchem Gene durch Injektion von
RNA inaktiviert werden, müssen im Vorfeld sämtliche dsRNAs synthetisiert und injiziert
werden. Zudem gestaltet sich RNAi in Drosophila-Embryonen generell als schwierig.
Um die dieser Arbeit vorangestellten Ziele zu erreichen, wurde der EMS-Mutagenese-Screen
den anderen Verfahren vorgezogen. Bis auf das Sammeln der für die Einzelkreuzungen
benötigten jungfräulichen Weibchen gibt es keine aufwendige Vorbereitung, auch die
Mutagenese ist einfach durchzuführen. Da durch die Mutationen hypomorphe, amorphe und
konditionelle Allele entstehen können, kann durch den Vergleich unterschiedlicher Allele
gegebenenfalls ein besseres Verständnis der Funktionsweise bestimmter Gene gewonnen
werden. Ein Beispiel dafür ist der Vergleich der im Rahmen dieser Arbeit identifizierten
hypomorphen und amorphen LanB1-Allele. Durch den Einsatz von Balancer-Chromosomen
können außerdem heterozygote Stämme etabliert werden, wodurch die Mutanten langfristig
für weitere Analysen zur Verfügung stehen.
5.1.2
Sättigung des EMS-Screens
Ein Ziel des Mutagenese-Screens war die möglichst vollständige Abdeckung des
Zielchromosoms. Deshalb sollte die Sättigung des EMS-Screen erreicht werden. Sättigung
bedeutet in diesem Fall, dass jedes Gen auf dem Chromosom mindestens einmal
inaktivierend getroffen worden ist.
Unter der vereinfachten Annahme, dass die letalen Treffer gemäß der Poisson-Verteilung
über das Chromosom verteilt sind, kann folgende Formel zur groben Bestimmung der
Sättigung (S) herangezogen werden: S=1-e-(N/n
x λ)
(C. Bökel, 2008: EMS Screens in
Dahmann, (2008)). Dabei steht N für die Anzahl der untersuchten Chromosomen, n für die
Anzahl der letalen Gene auf dem Chromosom und λ für die durchschnittliche Anzahl an
letalen Treffern pro Chromosom. Das Zielchromosom für den Mutagenese-Screen, welcher
dieser Arbeit zugrunde liegt, war das zweite Chromosom. Das zweite, dritte und XChromosom besitzen in Drosophila ungefähr die gleiche Anzahl an Genen, auf dem vierten
Chromosom befinden sich nur wenige Gene. Bei einer Gesamtzahl von ungefähr 14000
Genen entfallen somit geschätzt 5600 Gene auf das zweite Chromosom. Etwa ein Drittel
davon kann auf Letalität mutiert werden (Dahmann, 2008), so dass n hier 1900 Genen
122
entspricht. Insgesamt wurden im Verlauf dieser Arbeit 3746 Chromosomen überprüft, der
Wert für die durchschnittliche Anzahl letaler Treffer liegt bei 2,1. Der Formel nach besteht
somit eine Wahrscheinlichkeit von 98,4%, dass jedes letale Gen mindestens einmal getroffen
worden ist.
Die Tatsache, dass Allele der meisten zu erwartenden Gene identifiziert werden konnten, ist
ein weiterer Hinweis auf die Sättigung des EMS-Screen. Neben den oben bereits erwähnten
Beispielen wurden beispielsweise Allele von twi, sna, wg, mef-2 und HLH54F aus dem
Screen isoliert. In den meisten Fällen wurden hierbei mehrere Allele eines Gens identifiziert,
was ebenfalls auf eine Sättigung hindeutet. Das trifft vor allem auf die Laminin-Gene LanB1
und wb und einige Komponenten des Notch-Signalwegs (mam, bib) zu und hängt
wahrscheinlich mit der Größe der Gene zusammen. Einen Sonderfall stellen die Gene Alk
und kuz dar. Bei diesen beiden Genen wurden deutlich mehr Allele (12 Alk- und 16 kuzAllele) gefunden als bei ähnlich großen Genen. Dabei traten die Allele gehäuft in
Nachkommen aus einem der vier Mutagenese-Ansätze des letzten Durchgangs auf.
Aufgrund dieser Häufung besteht hier die Möglichkeit, dass nicht alle Allele voneinander
unabhängig sind. Dies könnte dadurch zustande kommen, dass die verwendeten Männchen
der F1-Generation Nachkommen eines Männchens waren, in dem die EMS-Behandlung eine
Mutation in einer Keimbahnstammzelle ausgelöst hat. Da die Keimzellen nach der Meiose
drei Tage bis zum reifen Spermium benötigen (Ashburner and Wright, 1979), sollte diese
Möglichkeit jedoch durch das Verwerfen der Männchen nach drei Tagen ausgeschlossen
sein. Eine mögliche Ursache für eine solche Häufung ist eine EMS-unabhängige
Spontanmutation in einem der Elterntiere beziehungsweise in einer prä-meiotischen
Keimzelle.
Für bestimmte Gene mit bekannter Herz- und Muskelbildungsfunktion und Lokalisation auf
Chromosom 2 wurden bisher keine neuen Allele isoliert. Da noch nicht alle Mutanten gezielt
darauf untersucht wurden, könnten sich diese in der Gruppe der noch nicht untersuchten
EMS-Allele befinden. Außerdem ist zu erwarten, dass mit den verwendeten GFP-/RFPMarkern die Entdeckung bestimmter Herz- und Muskeldefekte nicht oder nur sehr schwer
möglich ist. So fallen zum Beispiel subtile Lumendefekte im Herz aufgrund der Verteilung
des zytoplasmatisch lokalisierten tinC-GFPs kaum auf. Unter Berücksichtigung dieser
Einschränkungen ist der hier durchgeführte EMS-Screen weitestgehend der Sättigung nahe.
123
5.2
Der FGF-Signalweg steuert die Entwicklung des longitudinalen viszeralen
Mesoderms
5.2.1
Die Heartless-Liganden pyramus und thisbe sind teilweise redundant
Die im Rahmen dieser Arbeit analysierten pyr- beziehungsweise ths-Mutanten zeigen im
homozygoten Zustand vergleichsweise schwache Defekte. Der Herzphänotyp beschränkt
sich auf kleine Lücken innerhalb einer der beiden Kardioblasten-Reihen und im viszeralen
Mesoderm ist der Abstand zwischen den LVM-Fasern im vorderen Abschnitt des Mitteldarms
vergrößert. FGF8-Null- (Df(2R)BSC25/Df(2R)BSC259) oder heartless-Mutanten hingegen
zeigen deutlich stärkere Defekte (siehe Kapitel 4.2.1 und 4.2.2) (Beiman et al., 1996;
Shishido et al., 1997). Es existieren nur wenige Kardioblasten und beinahe alle LVMVorläuferzellen sterben ab, so dass nur vereinzelt kurze LVM-Fasern gebildet werden
können. Diese phänotypischen Unterschiede deuten darauf hin, dass in den Einzelmutanten
der Verlust eines Liganden durch das Vorhandensein des anderen Liganden größtenteils
kompensiert werden kann.
Allerdings spielt dabei auch die Gendosis eine entscheidende Rolle. Die Reduktion von ths
von zwei Gen-Kopien in einer homozygoten pyr-Mutante auf eine Kopie in der pyr-Mutante
gekreuzt über Df(2R)BSC25 beziehungsweise Df(2R)BSC259 führt zu einer Verstärkung
des Herz- und LVM-Phänotyps. Des Weiteren führt eine ektopisch induzierte, erhöhte Dosis
von Pyr oder Ths zu einem Wanderungs-Stopp der LVM-Gründerzellen (vergleichbar mit
konstitutiv aktivem Heartless-Rezeptor in den Gründerzellen (Reim et al., 2012). Der Grund
dafür ist vermutlich die Störung der Balance zwischen den normalerweise vorkommenden
FGF-Signalen. In Widerspruch dazu stehen Untersuchungen von Kadam et al. (2012),
wonach nur eine Koexpression der Liganden zu einem Wanderungs-Stopp führt. Die
Überexpression der Einzel-Liganden hat deren Ergebnissen zufolge keinen Einfluss auf die
Wanderung der LVM-Gründerzellen, so dass über eine mögliche synergistische Interaktion
zwischen pyr und ths spekuliert wird. Das widerspricht jedoch unseren Beobachtungen.
Überexpressions-Experimente in dieser Arbeit haben gezeigt, dass bereits die ektopische
Expression eines Heartless-Liganden im gesamten Mesoderm mittels eines twi-Gal4Treibers (SG24) zur Akkumulation der LVM-Gründerzellen im posterioren Teil des Embryos
führt und eine geordnete Wanderung dieser Zellen verhindert. Ein Grund für die
beobachteten Unterschiede ist möglicherweise eine unterschiedliche Signaldosis, welche
von den verwendeten Gal4-Treibern abhängt. Der von Kadam et al. (2012) verwendete simGal4-Treiber ist vermutlich schwächer als die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Gal4Treiber, worauf auch die Ergebnisse in Zusammenhang mit der Umlenkung der LVMGründerzellwanderung hindeuten (siehe Kapitel 5.2.3).
Obwohl es sich bei pyr18 um eine Deletion handelt, zeigen die aus dem EMS-Screen
isolierten pyr-Allele die stärkeren Defekte in der viszeralen Muskulatur und bei der Reduktion
124
von Kardioblasten. Die (unvollständige) Redundanz von pyr und ths kann ein Grund für den
Unterschied der EMS-Allele und pyr18 sein. Möglicherweise sind Enhancer-Sequenzen
stromaufwärts von pyr durch die pyr18-Deletion näher an den ths-Promotor gelangt und
steigern so die Expression von ths. Eine höhere ths-Expression könnte dann den Wegfall
des Pyr-Signals eventuell besser kompensieren. Eine Ausnahme dabei ist die Induktion der
Eve-positiven Vorläuferzellen im dorsalen Mesoderm. Eine postulierte Repositionierung
regulatorischer Sequenzen in pyr18 sollte für diesen Prozess demnach nicht effektvoll sein,
da sie entweder aufgrund fehlender Elemente nicht zur erforderlichen Verstärkung der thsExpression im entsprechenden Bereich führt oder Ths aufgrund seiner Proteineigenschaften
den Rezeptor in diesem Fall nicht in äquivalenter Weise erreichen und aktivieren kann.
5.2.2
FGF-Signale gewährleisten das Überleben der LVM-Gründerzellen
Die Analyse des Phänotyps der Df(2R)BSC25/Df(2R)BSC259-Embryonen hat gezeigt, dass
während
der
Entwicklung
im
FGF8-Null-Hintergrund
fast
alle
LVM-Gründerzellen
verlorengehen. Durch die ektopische Expression von pyr oder ths im Mesoderm oder im
dorsalen Ektoderm von Embryonen ohne endogene FGF-Signale kann der Zelltod der
Gründerzellen jedoch verhindert werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass pyr und ths
für das Überleben der LVM-Gründerzellen von entscheidender Bedeutung sind. Eine
derartige Funktion konnte dem FGF-Signalweg im Zuge der frühen Mesoderm-Wanderung
während der Gastrulation und bei der Mesoderm-Spezifizierung nicht nachgewiesen werden.
Es ist zwar bekannt, dass pyr eine Funktion bei der Festlegung der Anzahl von Glia-Zellen
während der Augenentwicklung von Drosophila hat (Franzdóttir et al., 2009), allerdings ist
unklar, ob die FGF-Signale in diesem Fall einen Einfluss auf die Überlebensrate bestimmter
Zellen haben oder die Proliferation regulieren. Verschiedene bereits veröffentlichte Daten
zeigen, dass über den FGF-Rezeptor Htl vermittelte Signale für das Überleben der LVMGründerzellen notwendig sind (Kadam et al., 2012; Mandal et al., 2004; Reim et al., 2012). In
htl-Mutanten fehlen fast alle LVM-Fasern (Mandal et al., 2004; Reim et al., 2012) und die
Apoptose-Rate ist ab Stadium 11 allgemein erhöht (Mandal et al., 2004). Die Expression
einer dominant-negativen Form von htl oder htl-RNAi in den LVM-Gründerzellen führt zu
einer reduzierten Anzahl dieser Zellen (Kadam et al., 2012; Reim et al., 2012). Die
Beobachtungen ähneln den von Takeuchi et al. (2005) veröffentlichten Daten. Die Autoren
beschäftigen sich mit der Rolle des FGF-Signalwegs während der Wanderung der
Keimzellen in der Maus. Verschiedene von den wandernden Keimzellen exprimierte FGFRezeptoren sind nach Angabe der Autoren wichtig für das Überleben der Zellen und
regulieren gleichzeitig deren Beweglichkeit und die Ausbildung zellulärer Fortsätze. Die
Liganden sind aufgrund der Vielfalt an FGF-Liganden in Vertebraten nicht bekannt. In
Drosophila wird htl als einziger Rezeptor in den wandernden mesodermalen Zellen
125
exprimiert. Somit kommen nur pyr und ths als Liganden in Frage. Außerdem ist die Situation
vergleichbar mit der einer anderen Rezeptor-Tyrosinkinase, dem PDGF/VEGF-Rezeptor
(Pvr). Dieser wird für das Überleben und die normale Wanderung der Hämozyten benötigt
(Brückner et al, 2004). Der Zelltod von rezeptor-inaktivierten Hämozyten kann durch den
Apoptose-Inhibitor p35 verhindert werden. Die ektopische Expression von p35 in den LVMGründerzellen von htl-Mutanten oder in Df(2R)BSC25-Embryonen verhindert ebenfalls den
Tod dieser Zellen (Kadam et al., 2012; Reim et al., 2012).
Die LVM-Gründerzellen wandern vorzugsweise entlang des Mesoderms und speziell das
TVM dient den Zellen als Substrat für die Wanderung. Neben dem Verlust der HeartlessLiganden führt auch der Verlust des TVM zum Tod der LVM-Gründerzellen (Reim et al.,
2012), da die Hauptquelle der Liganden fehlt. Die Expressionsanalyse von pyr hat gezeigt,
dass auch die endodermalen Zellen als Quelle für die FGF-Signale fungieren. Durch die
Abwesenheit des TVM fehlt aber auch der direkte Kontakt zwischen diesen Zellen und den
LVM-Gründerzellen. Möglicherweise kann der Zelltod nur verhindert werden, wenn ein
direkter Zell-Zell-Kontakt zwischen den LVM-Gründerzellen und den Zellen besteht, welche
die Quelle der FGF-Signale darstellen. Das ist auch eine Erklärung für die Beobachtung,
dass die durch die ektopische Expression von pyr oder ths im dorsalen Ektoderm
umgelenkten Zellen überleben können.
Da es sich dabei um eine Funktion mit kurzer Reichweite handelt, können beide Liganden
gleichermaßen den Zelltod der LVM-Gründerzellen verhindern, obwohl Unterschiede in
deren Aktionsradien bestehen. So ist, wie bereits erwähnt, hauptsächlich pyr in der Lage, die
Eve-positiven mesodermalen Zellen zu induzieren (siehe Kapitel 4.2.1, Tulin und
Stathopoulos, 2010).
Des Weiteren ist die Fähigkeit, den Zelltod zu verhindern, nicht richtungsgebunden, da auch
ein konstitutiv-aktiver Heartless-Rezeptor in den LVM-Gründerzellen deren Überleben
sicherstellt (Reim et al., 2012).
5.2.3
FGF-abhängige Wanderung der LVM-Gründerzellen
In Abwesenheit der beiden Htl-Liganden läuft die Aufteilung des CVM in zwei bilaterale
Kluster und die Wanderung der Zellen auf dem TVM weniger geordnet ab, einige Zellen
bewegen sich zudem in die Nähe der Mittellinie. Nur durch Pyr- und Ths-Signale aus dem
TVM und ein zusätzliches Pyr-Signal aus dem posterioren Mitteldarm-Endoderm findet eine
ordnungsgemäße Wanderung statt. Diese experimentellen Hinweise sprechen dafür, dass
Pyr und Ths die Wanderung der LVM-Gründerzellen lenken. Außerdem hat die ektopische
Expression von pyr oder ths im gesamten Mesoderm mittels twi-Gal4 eine Akkumulation der
LVM-Gründerzellen im posterioren Keimstreif und einen Wanderungs-Stopp zur Folge. Der
Grund dafür ist vermutlich die lokal erhöhte Signaldosis. Allerdings erreichen die
126
Gründerzellen auch ohne FGF-Signale das TVM und die frühe Wanderung in den pyrbeziehungsweise ths-Einzelmutanten ist normal. Das setzt das Vorhandensein zusätzlicher,
bisher nicht identifizierter, Signale voraus, welche die CVM-Zellen auf das TVM leiten. Ein
weiterer Hinweis für die FGF-abhängige Wanderung der LVM-Gründerzellen ist das
Umlenken der Wanderungsrichtung bei ektopischer Expression der FGF-Liganden im
dorsalen Ektoderm durch pnr-Gal4. Auch im Wildtyp-Hintergrund überschreiben diese
Signale teilweise die Information der endogenen Pyr-/Ths-Signale. Das dorsale Ektoderm
liegt in frühen Stadien relativ nah am CVM, so dass zur Umleitung der Zellen nur eine
geringe Signal-Reichweite notwendig ist. Deshalb kann Ths wahrscheinlich diese Aufgabe
fast genauso gut übernehmen, wie Pyr, obwohl Ths-Signale eventuell eine kürzere
Reichweite besitzen (Tulin und Stathopoulos (2010), siehe Kapitel 5.2.4). Es fällt außerdem
auf, dass die Zellen sich bei einer ektopischen Expression von pyr oder ths im dorsalen
Ektoderm relativ normal ausbreiten. Das verdeutlicht die Tendenz der wandernden Zellen,
entlang eines Bereichs FGF8-exprimierender Zellen zu wandern. Wichtig hierbei ist
allerdings das Gleichgewicht zwischen der Anziehung und Anheftung an ein FGF8exprimierendes Substrat und der gegenseitigen Abstoßung. Das erklärt auch die geringere
Ausbreitung der Zellen bei der Expression von pyr im dorsalen Ektoderm (pnr-Gal4), im TVM
(bap-Gal4) und im gesamten Mesoderm (twi-Gal4), wodurch das Gleichgewicht vermutlich
durch die stark erhöhte Signaldosis in Richtung der Anheftung an das Substrat verschoben
wird. In Kadam et al. (2012) wird eine ähnliche Umlenkung der Wanderung beschrieben, in
diesem Fall entlang der ventralen Mittellinie mittels sim-Gal4. Allerdings kann diese
ektopische Expression von pyr oder ths bei Anwesenheit endogener FGF8-Signale die
Wanderungsrichtung nicht beeinflussen. Die Signale sind vermutlich entweder aufgrund
eines zu schwachen Treibers (siehe auch Kapitel 5.2.1) oder der großen Distanz zwischen
Signalquelle und LVM-Gründerzellen zu schwach. Das bedeutet, dass sim-Gal4-getriebene
FGF-Signale die endogenen Signale nicht überschreiben können. Jedoch sind pnr-Gal4getriebene FGF-Signale zusammen mit den endogenen Signalen aus dem dorsalen
Ektoderm scheinbar dazu in der Lage.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mehrere verschiedene Anheftungs- und
Signalmechanismen gleichzeitig bereitgestellt werden müssen (einige teilweise redundant,
andere essentiell), um eine effiziente und genaue Wanderung der LVM-Gründerzellen
entlang der richtigen Pfade zu gewährleisten. Ein Beispiel dafür ist die zusätzliche
Regulation der LVM-Gründerzellwanderung durch das Zusammenspiel von PS-Integrinen in
den wandernden Zellen und Laminin in der das TVM umgebenden ECM (Urbano et al.,
2011).
127
5.2.4
Pyr und Ths wirken vorwiegend auf kurze Distanz
Die Ergebnisse der Misexpressions-Experimente (auch aus Kadam et al. (2012)) und die
daraus folgende Richtungsänderung der LVM-Gründerzellwanderung sprechen auf den
ersten Blick dafür, dass pyr und ths als klassische chemotaktische Signale fungieren.
Allerdings ist in htl-Mutanten die Wanderung der Zellen nach anterior größtenteils
unbeeinflusst, wenn der Zelltod verhindert oder der aktivierte Htl-Rezeptor in den Zellen
selber exprimiert wird (Reim et al., 2012). Außerdem rettet die Expression von pyr und ths in
den LVM-Gründerzellen in Embryonen ohne FGF-Liganden die Wanderung dieser Zellen
(Kadam et al., 2012). Diese Daten sprechen gegen die Funktion von Pyr und Ths als
chemotaktische Signale während dieses Prozesses. Vielmehr wirken die FGF-Liganden über
kurze Distanzen und ohne die Ausbildung eines Gradienten. Sie steuern auf diese Weise die
Anheftung der wandernden Zellen an das Substrat. Wichtig hierbei ist das bereits im
vorangegangenen Kapitel erwähnte Gleichgewicht zwischen Anheftung und Ablösung der
Zellen. Eine chemotaktische Funktion von pyr und ths über mittlere Distanzen wird dadurch
nicht ausgeschlossen, aber sie spielt, wenn existent, nur eine untergeordnete Rolle. Die
Funktion der FGF-Liganden bei der Festlegung der Wanderungsrichtung ist vergleichbar mit
deren Funktion bei der Mesoderm-Wanderung im Zuge der Gastrulation. In diesem Fall
steht die lokale Anheftung der Mesodermzellen an das Ektoderm im Vordergrund,
zusammen mit einer chemotaktischen Funktion über relativ kurze Distanz, welche eine
geordnete Wanderung der Zellen nach dorsal unterstützt.
Nach Tulin und Stathopoulos (2010) wird die Aktivität und Reichweite der Protein-Produkte
von pyr und ths durch eine proteolytische Prozessierung beeinflusst. Das Pyr-Protein wird
proteolytisch gespalten und die für die Aktivierung des Rezeptors nicht notwendige Cterminale Domäne verbleibt in der Zelle. Ein Großteil des Ths-Proteins hingegen wird
zusammen mit der C-terminalen Domäne sekretiert, und diese wirkt inhibierend auf die
Aktivität von Ths. Allerdings ist unklar, ob die Inhibierung durch eine Begrenzung der
Diffusionsreichweite oder durch eine beeinträchtigte Rezeptorbindung geschieht.
5.2.5
Vermutete
Wirkungsweise
von
Pyr
und
Ths
während
der
LVM-
Gründerzellwanderung
Aus der Zusammenfassung der gewonnenen Erkenntnisse ergibt sich folgende mögliche
Wirkungsweise
der
beiden
Htl-Liganden
Pyr
und
Ths
während
der
LVM-
Gründerzellwanderung. Zu Beginn der Wanderung führen Pyr-Signale aus der hinteren
Mitteldarmanlage zusammen mit bisher nicht identifizierten Signalen die CVM-Zellen auf das
TVM. Diese Wirkungsweise von Pyr auf mittlere Distanz aus dem Endoderm beeinflusst
auch die Wanderungsrichtung der LVM-Gründerzellen während des Keimstreifrückzugs. Von
128
entscheidender Bedeutung sind jedoch die FGF-Signale aus dem TVM, der Hauptquelle der
FGF-Liganden Pyr und Ths. Die nach anterior wandernden LVM-Gründerzellen besitzen die
Tendenz, sich entlang der FGF8-exprimierenden TVM-Gründerzellen zu bewegen. Wichtig
ist dabei der direkte Kontakt zwischen den FGF-exprimierenden Zellen und den LVMGründerzellen, da dieser das Überleben der LVM-Zellen gewährleistet. Die FGF-Liganden
aus dem TVM bilden keinen Gradienten, sondern wirken hauptsächlich über kurze Distanz
und steuern die Anheftung der LVM-Gründerzellen an das Substrat. Pyr und Ths wirken
hierbei zunächst redundant, im weiteren Verlauf der Entwicklung wird jedoch nur die
Expression von ths im TVM aufrechterhalten.
5.3
Die extrazelluläre Matrix trägt entscheidend zur Morphologie und Stabilität des
Herzens bei
5.3.1
Alarmuskel-Ablösung
als
Folge
einer
fehlerhaften
oder
instabilen
extrazellulären Matrix
5.3.1.1 Aminosäureaustausche in der Laminin-N-terminalen Domäne von LanB1
führen zu Unterbrechungen im ECM-Netzwerk im Bereich des Herzens
Im Verlauf der Arbeit wurden mit LanB1S0733, LanB1S1163 und LanB1S3773 drei LanB1-Allele
isoliert, deren Defekte sich fast ausschließlich auf das Herz und die Alarmuskeln
beschränken.
Erst
nach
der
Ausbildung
des
Herzschlauchs
lösen
sich
einige
Alarmuskelfasern vom Herz. Es treten Unregelmäßigkeiten in der Anordnung der
Kardioblasten auf und teilweise entstehen Lücken im Herz. Dieser Phänotyp grenzt die
hypomorphen Allele deutlich von ebenfalls aus dem Screen isolierten starken LanB1-Allelen
ab. Neben Lücken im Herz und sich ablösenden Alarmuskeln ist in den starken Allelen
hauptsächlich der Darm betroffen. Die Fasern der longitudinalen viszeralen Muskulatur sind
aufgrund der irregulären ECM nicht in der Lage den Mitteldarm zu umwandern, sämtliche
Mitteldarm-Einschnürungen fehlen. Zusätzlich zeigen die starken Allele Unregelmäßigkeiten
in der Form und Anordnung der somatischen Muskulatur. Der für die starken Allele
beschriebene Phänotyp gleicht dem typischen LanB1-Nullphänotyp, bei dem Defekte in der
Darmentwicklung im Vordergrund stehen (Urbano et al., 2009). Auch für das Laminin γkodierende Gen LanB2 und die Laminin α3,5- beziehungsweise α1,2-kodierenden Gene
LanA und wing blister werden in der Literatur vor allem Allele beschrieben, in denen neben
dem Herz hauptsächlich die Entwicklung des Darmes und der somatische Muskulatur
beeinträchtigt ist (Martin et al., 1999; Wolfstetter and Holz, 2011; Yarnitzky and Volk, 1995).
Die Ursache für die auf das Herz beschränkten Defekte in den drei hypomorphen LanB1Allelen ist jeweils ein Aminosäureaustausch innerhalb der Laminin-N-terminalen (LN)
129
Domäne. Diese Domäne sitzt am N-terminalen Ende der Laminin-β-Kette und ist wichtig für
die Quervernetzung der Laminin-Trimere (Li et al., 2003; Yurchenco and Cheng, 1993) (Abb.
34). Auch die Enden der anderen beiden kurzen Arme des Trimers besitzen eine solche
Domäne und es wird angenommen, dass diese Domänen bei der Polymerisierung einen
heterotrimeren Komplex bilden (McKee et al., 2007). Ein Aminosäureaustausch innerhalb der
LN-Domäne kann Veränderungen der Konformation und somit eine Einschränkung der
Funktion oder den Funktionsverlust nach sich ziehen.
Abbildung 34: Austausch von konservierten Aminosäuren innerhalb der LN-Domäne
(A) Struktur des LanB1-Proteins mit eingezeichneten Domänen. Zusätzlich sind die Positionen des
Aminosäureaustausches in den hypomorphen LanB1-Allelen S0733, S1163 und S3773 angegeben.
(B) Schematische Darstellung eines Laminin-Trimers. Die Farbkodierung verdeutlicht die Position der
β-Kette innerhalb des Polymers. (C) Vergleich der Aminosäuresequenz eines Abschnitts innerhalb der
LN-Domänen von Laminin β-Ketten in Drosophila melanogaster (D.m. [AAF52563].), Zebrafisch
(Danio rerio, D.r. [NP_775382.1, NP_001229974.1]), Maus (Mus musculus, M.m. [AAI50810.1,
AAC53535.1]) und Mensch (Homo sapiens, H.s. [AAA59482.1, AAB34682.2]). Zu 100% identische
Aminosäuren sind rot markiert. Die konservierten Aminosäuren an den Positionen der
S0733
S1163
S3773
Aminosäureaustausche in LanB1
(286), LanB1
(215) und LanB1
(226) sind gelb
hervorgehoben. Gemeinsame Sekundärstruktur-Elemente sind über den Sequenzen schematisch
angedeutet (α: α-Helix, β: β-Faltblatt).
Vor allem in den Linien LanB1S0733 und LanB1S1163 sollte der Aminosäureaustausch die
Struktur der Domäne beeinflussen. Die Mutation in LanB1S0733 führt zum Ersatz der sauren
Aminosäure Glutaminsäure durch die basische Aminosäure Lysin. Bei LanB1S1163 wird die
unpolare Aminosäure Glycin durch die polare Aminosäure Arginin ersetzt, welche zusätzlich
130
eine große Seitenkette besitzt. In
LanB1S3773 kommt es durch die Mutation zu einem
Wechsel von Valin zu Glycin. Beide Aminosäuren sind unpolar, Valin besitzt jedoch eine
kurze verzweigte hydrophobe Seitenkette.
Die Aminosäuresequenz von LanB1 weist eine hohe Homologie zu der einiger Laminin-βKetten in Vertebraten auf. Auch innerhalb der LN-Domäne können bei einem Vergleich von
LanB1 mit jeweils Laminin β1 und Laminin β2 aus dem Zebrafisch, der Maus und dem
Menschen zahlreiche konservierte Aminosäuren gefunden werden (Abb. 34). Dazu gehören
auch
die
in
LanB1S0733
und
LanB1S1163
ausgetauschten
Aminosäuren
Gly286
beziehungsweise Glu215. Aufgrund der starken Konservierung sind diese Aminosäuren
möglicherweise von struktureller Bedeutung für die LN-Domäne. In Bezug auf Gly286 wird
diese Vermutung durch Ergebnisse eines Vergleichs der LN-Domänen der Maus-Laminine
α5, β1 und γ1 unterstützt (Carafoli et al., 2012). Die in LanB1S3773 betroffene Aminosäure
Val226 ist nicht vollständig konserviert, im Laminin β1 der Maus und in humanem Laminin β1
befindet sich an dieser Position ein strukturell zwischen Valin und Glycin liegendes Alanin.
Valin kommt jedoch in entsprechender Position von Laminin β2 vor. Die demnach primär
etwas geringeren strukturellen Veränderungen im Laminin von LanB1S3773 könnten ein Grund
für den im Vergleich zu LanB1S0733 und LanB1S1163 etwas schwächeren Alarmuskel-Phänotyp
sein. Dennoch lässt sich zusammenfassend sagen, dass in allen drei hypomorphen LanB1Allelen jeweils eine Aminosäure innerhalb eines konservierten Sequenz-Motivs ausgetauscht
wurde, was sehr wahrscheinlich Einfluss auf die Funktion der LN-Domäne hat.
Die Antikörperfärbungen gegen die Laminin-β-Kette und gegen Nidogen zeigen in
Embryonen der LanB1-Hypomorphen deutliche Unterbrechungen im Matrix-Netzwerk im
Bereich des Herzens. Dieser irreguläre Aufbau der ECM ist wahrscheinlich auch der Grund
für die diffuse Verteilung des Pericardins in LanB1S0733, da das Laminin-Netzwerk als
Grundgerüst für den Einbau der übrigen Matrix-Komponenten dient (Urbano et al., 2009). Die
eingeschränkte Vernetzung der Trimere durch die Veränderungen innerhalb der LN-Domäne
ist vermutlich ausschlaggebend für die Lücken im Laminin-Gerüst und folglich für die
gestörte Struktur der ECM.
Es besteht auch die Möglichkeit, dass die Laminin-Trimere aufgrund des Einbaus einer
veränderten β-Kette nicht sekretiert werden können. Die Sekretierbarkeit der mutanten
Formen wurde nicht detailliert untersucht, die Färbungen mit wenigen kurzen Abschnitten
Basallamina-ähnlicher Anordnung von LanB1 und Ndg lassen jedoch vermuten, dass
Laminin zumindest partiell sekretiert wird. In Vertebraten konnte gezeigt werden konnte,
dass Laminin1 nur als Heterotrimer sekretiert werden kann. Laminin1 wird hauptsächlich
während der frühen Embryonalentwicklung der Maus benötigt (Miner et al., 2004), und die
Sequenz der die Monomere kodierenden Gene Lama1 (α1), Lamb1 (β1) und Lamc1 (γ1)
131
weist eine hohe Homologie zu wb (α1,2), LanB1 (β) und LanB2 (γ) in Drosophila auf. Nach
Yurchenco et al. (1997) können extrazellulär nur monomere α-Ketten, jedoch keine β- und γKetten nachgewiesen werden. In der Zelle bilden sich zunächst β-γ-Dimere, welche erst
nach dem Einbau der α-Kette sekretiert werden.
Da die Alarmuskeln in frühen Entwicklungsstadien an das sich entwickelnde Herz anheften,
ist es möglich, dass die extrazelluläre Matrix zu dem Zeitpunkt noch hinreichend intakt ist.
Erst in späten Stadien und durch die zusätzliche mechanische Belastung gehen die
Bindungen zwischen den LN-Domänen weitgehend verloren und die Matrix zerfällt. Dafür
spricht auch der erst ab Stadium 16 auftretende Anreihungsdefekt der Kardioblasten.
5.3.1.2 Glycin-Austausche
innerhalb
der
Kollagen
IV-Trippelhelix-Domäne
destabilisieren die das Herz umgebende ECM
Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier Cg25C-Allele mit einem herzspezifischen Phänotyp
identifiziert. In Embryonen der Linien Cg25CS0791, Cg25CS1348, Cg25CS2186 und Cg25CS3064
verlieren die Alarmuskeln in Stadium 16/17 den Kontakt zum Herz (im Fall von Cg25CS2186
erst bei 29°C). In homozygoten Embryonen des fünften Cg25C-Alleles Cg25CS0120 treten
stärkere Defekte auf, sehr wahrscheinlich aufgrund einer anderen Mutation.
Betrachtet man die Ergebnisse der Komplementationstests dieser Linien untereinander
(siehe Anhang, Tab. 21), so lässt sich eine gewisse Abstufung der Allele erkennen.
Cg25CS0120 und Cg25CS3064 sind über alle anderen Allele letal. Auch die Linien Cg25CS0791
und Cg25CS1348 sind gekreuzt über die anderen Allele, ausgenommen Cg25CS2186, nicht
lebensfähig. Des Weiteren ist in transheterozygoten Cg25CS0120/Cg25CS3064-Embryonen und
Cg25CS0791/Cg25CS3064-Embryonen die Penetranz des Phänotyps nach Cg25CS3064Homozygoten am höchsten und dessen Ausprägung am stärksten. Diese Daten lassen
darauf schließen, dass es sich bei der Linie Cg25CS3064 um das stärkste Allel handelt, etwas
schwächer sind Cg25CS0120, Cg25CS0791 und Cg25CS1348. Bei der Linie Cg25CS2186, welche
primär aufgrund schwacher tinC-GFP-Expression selektiert wurde, handelt es sich demnach
um das schwächste Allel. Dazu passt der fehlende Phänotyp in Cg25CS2186-Homozygoten
sowie Cg25CS2186/Cg25CS3064-transheterozygoten Embryonen bei 25°C.
Die Sequenzierung der Allele ergab in allen Fällen eine Punktmutation mit einem GlycinAustausch innerhalb der Trippelhelix-Domäne als Folge. Die in Vertebraten am häufigsten
gefundenen
destabilisieren
Kollagen-Mutationen
die
Trippelhelix
führen
durch
ebenfalls
unterbrochene
zu
Glycin-Austauschen.
Sie
Wasserstoff-Brückenbindungen
(Brodsky and Persikov, 2005). Solche Struktur-Veränderungen in der Trippelhelix haben
möglicherweise Einfluss auf die Eigenschaften oder gar die Ausbildung des Trimers. So
könnten abstehende Cg25C-Molekülreste beim Einbau in die extrazelluläre Matrix stören und
132
diese destabilisieren. In Drosophila ist neben den Kollagen-ähnlichen Proteinen Pericardin
(Chartier et al., 2002) und Multiplexin (Harpaz et al., 2013) auch Typ IV-Kollagen in der
näheren Umgebung des Herzens lokalisiert und somit wahrscheinlich an der Bildung des
Kollagen-Fasernetzwerks beteiligt. Das durch den Einbau der irregulären Trimere veränderte
ECM-Netzwerk um das Herz kann vermutlich der Belastung durch die Kontraktion der
Alarmuskeln und der Bewegung des Embryos nicht standhalten. Das wiederrum führt zum
Abreißen der Alarmuskel-Fasern. Diese Überlegungen werden durch Ergebnisse der
Lebendbeobachtungen homozygoter Cg25C-Mutanten gestützt. Diese zeigen, dass der
Phänotyp in kurz vor dem Schlupf stehenden und sich bewegenden Embryonen besonders
stark ausgeprägt ist. Vor allem in den Cg25C-Allelen Cg25CS1348 und Cg25CS2186 verlieren
die Alarmuskeln in den meisten Embryonen erst zu diesem Zeitpunkt den Kontakt zum Herz
(häufiger beziehungsweise ausschließlich beobachtet bei einer Temperaturerhöhung auf
29°C).
Die Glycin-Mutationen in Cg25CS0791, Cg25CS1348 und Cg25CS3064 befinden sich hinter einem
häufig an der Y-Position des Glycin-X-Y-Motivs sitzenden Prolin. Dieses Prolin wird im Zuge
der post-translationalen Modifizierung meist hydroxyliert und ist dann wichtig für die
Stabilisierung der Kollagen-Trippelhelix (Vitagliano et al., 2001). Das auf das Prolin folgende
Glycin ist wichtig für die dichte Anordnung der Trippelhelix (Brodsky and Persikov, 2005),
spielt aber möglicherweise eine zusätzliche Rolle bei der Hydroxylierung oder stellt eine
Voraussetzung dafür dar. Somit beeinträchtigt wahrscheinlich der Austausch des Glycins
durch die geringere Stabilität des Typ IV-Kollagen-Trimers die Integrität der ECM.
Ein Glycin-Austausch innerhalb der Trippelhelix-Domäne kann die Struktur des Cg25CMonomers möglicherweise aber auch so stark verändern, dass die Bildung eines KollagenTrimers nicht mehr möglich ist. In einem solchen Fall
wird nach gegenwärtigem
Kenntnisstand kein Typ IV-Kollagen mehr sekretiert (LeBleu et al., 2007) und das ECMNetzwerk um das Herz kann nicht durch Typ IV-Kollagen stabilisiert werden. Eine
Antikörperfärbung gegen das Cg25C-Protein könnte Aufschluss über dessen Lokalisation
geben, allerdings stand kein geeigneter Antikörper zur Verfügung. Das intakte Lamininbeziehungsweise Nidogen-Verteilungsmuster in Cg25CS3064
ist kein Beleg für die
Anwesenheit von Kollagen-Trimeren in der Matrix, da die übrigen Komponenten der
extrazellulären Matrix auch in Abwesenheit von Typ IV-Kollagen deponiert werden können
(Pastor-Pareja und Xu, 2011; Pöschl et al., 2004). Theoretisch könnte eine Cg25C-Mutation
auch zur Ausbildung von Vkg-Homotrimeren führen. Gegen Homotrimere spricht ein
experimenteller Hinweis aus Vertebraten, wonach die Trippelhelices immer als Heterotrimere
vorliegen (Boutaud et al., 2000).
Verschiedene Komplementationstests mit Cg25C-Allelen und Vergleiche der Linien
untereinander haben gezeigt, dass die Ausprägung des Alarmuskelphänotyps von der
während der Entwicklung vorherrschenden Umgebungstemperatur abhängt. Bei 19°C zeigen
133
die meisten Cg25C-Allele keinen Phänotyp, bei 25°C variiert die Penetranz je nach Stärke
des Allels zwischen 50% und 100%. Setzt man die Mutanten einer Temperatur von 29°C
aus, verlieren die Alarmuskeln in den Embryonen fast aller Cg25C-Allele den Kontakt zum
Herz. Die heterozygoten weiblichen Nachkommen von Cg25CS3064 werden außerdem
zunehmend steril. Diese Beobachtung deckt sich mit den Ergebnissen in Kelemen-Valkony
et
al.
(2012).
Die
Autoren
beschreiben
eine
ganze
Gruppe
von
dominant
DTS-L3
temperatursensitiven Cg25C-Allelen von welchen ein Allel, Cg25C
, molekular
charakterisiert worden ist. Veränderungen in der Morphologie der Eileiter-Muskulatur werden
als Ursache für die ebenfalls beobachtete Sterilität der Fliegen genannt. Die in Kapitel
5.2.2.1 beschriebene mögliche Instabilität der ECM in den Cg25C-Mutanten kann auch hier
als Ansatzpunkt für eine Erklärung der Temperatursensitivität dienen. Mit zunehmender
Temperatur steigt die Eigenbewegung aller Moleküle, also auch der in die Matrix
eingebauten Kollagen-Trimere. Zudem bewegen sich die Embryonen nach eigener
Beobachtung bei einer hohen Temperatur mit höherer Frequenz. Zusammengenommen ist
eine höhere Temperatur mit einer höheren Belastung der ECM verbunden. In den Cg25CAllelen hält das instabile Kollagenfaser-Netzwerk um das Herz dieser Beanspruchung
möglicherweise nicht stand und die Alarmuskeln lösen sich ab.
Diese Temperatursensitivität war vermutlich auch der Grund für die fehlende Ausprägung
des Alarmuskel-Phänotyps während der ersten Versuche der Langzeit-Lebendbeobachtung
von Embryonen der Linie Cg25CS3064. Das dafür benutzte Mikroskop befindet sich in einem
klimatisierten Raum mit einer geregelten Temperatur von 20°C bis 22°C. Allerdings führte
eine Erhöhung der Umgebungstemperatur während des Versuchs ebenfalls nicht zu der bei
normalen Ablagen beobachteten phänotypischen Penetranz. Zusätzliche Faktoren, wie zum
Beispiel die Einbettungsmethode scheinen hierbei ebenfalls eine Rolle zu spielen. Die
Embryonen wurden zur Langzeit-Lebendbeobachtung auf ein Deckglas geklebt, was diese in
ihrer Beweglichkeit einschränkt. Nicht auszuschließen ist, dass das zur Einbettung
verwendete Öl, welches im Prinzip keinen Einfluss auf die Entwicklung der Embryonen hat,
durch einen veränderten Sauerstoff-Austausch die Beweglichkeit ebenfalls reduziert.
Die Überprüfung der Phänotypen einiger Cg25C-Allele in trans über die Defizienz
Df(2L)Exel7022 oder über das einem Nullallel zumindest nahekommende Cg25Ck00405
(Langer et al., 2010) führte zu variablen Ergebnissen. In vielen Fällen zeigten die
transheterozygoten Embryonen nur schwache oder gar keine Alarmuskeldefekte. Neben der
bereits beschriebenen Temperatursensitivität könnten vor allem die stärkeren Allele
Cg25CS0120, Cg25CS0791 und Cg25CS3064 zusätzlich einen antimorphen Charakter besitzen. In
einem antimorphen Allel ist nicht der Funktionsverlust oder die Abwesenheit eines Proteins
für den Phänotyp verantwortlich, sondern der von einem veränderten Protein ausgehende
negative Einfluss. Die Autoren Kelemen-Valkony et al. (2012) spekulieren ebenfalls über
134
einen antimorphen Charakter der gefundenen Cg25C-Allele. Das gilt insbesondere für
Cg25CDTS-L3, welches sich bei unserer Analyse des Herzens und der Alarmuskeln im Prinzip
ähnlich wie Cg25CS3064 verhält. Der Phänotyp kann durch eine Erhöhung der WildtypGendosis abgeschwächt werden und ist homozygot stärker als in der transheterozygoten
Situation über ein Nullallel oder die Defizienz.
Die folgende Darstellung möglicher Mechanismen zur antimorphen Wirkung von veränderten
Cg25C-Molekülen stützt sich auf die Überlegungen von Kuo et al. (2012). In den
homozygoten Cg25C-Mutanten existieren zwei mutierte Kopien des Gens Cg25C, so können
ausschließlich veränderte Cg25C-Moleküle in das Trimer eingebaut werden. Die veränderte
Struktur kann eine intrazelluläre Anhäufung des mutanten Heterotrimers und die
Abwesenheit extrazellulärer Typ IV-Kollagen-Trimere zur Folge haben. Eine andere
Möglichkeit besteht, darin, dass die strukturell veränderten Trimere sekretiert werden und
durch ihren Einbau sowohl das Kollagenfaser-Netzwerk um das Herz destabilisieren, als
auch
die
Interaktion
zwischen
den
Matrixkomponenten
beeinträchtigen.
In
der
transheterozygoten Situation über die Defizienz oder das Null-Allel liegt jeweils nur eine
Kopie vor. Das kann dazu führen, dass insgesamt weniger Kollagen-Trimere mit veränderten
Cg25C-Molekülen sekretiert werden und das Kollagen-Netzwerk dadurch in einem
geringeren Maß destabilisiert wird. Der daraus resultierende Phänotyp fällt dann schwächer
aus. Auch in heterozygoten Embryonen wird das veränderte Cg25C-Protein hergestellt.
Allerdings sorgt in diesem Fall das Verhältnis zwischen Wildtyp-Protein und dem veränderten
Protein für eine zusätzliche Abschwächung oder zum Ausbleiben des Phänotyps. So
entstehen statistisch gesehen zu 50% Heterotrimere mit nur einem mutanten Cg25C-Molekül
und zusätzlich zu 25% Heterotrimere aus ausschließlich Wildtyp-Monomeren. Dadurch kann
das Kollagen-Netzwerk um das Herz zumindest partiell ausgebildet werden.
5.3.1.3 Ursachen des Perikardialzellphänotyps
In allen Cg25C-Allelen und hypomorphen LanB1-Allelen lösen sich während der EmbryonalEntwicklung einige Perikardialzellen von den Kardioblasten. Ursachen für diesen Phänotyp
können Defekte in der Zelladhäsion oder die Zugkraft der Alarmuskelfasern in Verbindung
mit einem instabilen beziehungsweise lückenhaften ECM-Fasernetzwerk sein. Die
Lebendbeobachtungen von Embryonen eines LanB1-Hypomorphs zeigen deutlich den
Einfluss der Alarmuskeln auf die Ablösung der Perikardialzellen. Die abreißenden und sich
verkürzenden Alarmuskelfasern ziehen einzelne Perikardialzellen mit sich. Die Analyse von
LanB1-org-1-Doppelmutanten, lässt jedoch den Schluss zu, dass die Alarmuskeln nicht die
einzige Ursache für den Perikardialzellphänotyp darstellen. In den Embryonen kommt es
trotz fehlender Alarmuskeln, welche in Abwesenheit von org-1 nicht differenziert werden
(Schaub et al., 2012), zu Adhäsionsdefekten zwischen Perikardialzellen und Kardioblasten.
135
Allerdings ist die Distanz zwischen den Zellen wesentlich geringer als in der LanB1Einzelmutante und es kann keine extreme Mislokalisation von Perikardialzellen beobachtet
werden. Im Fall der Cg25C-Allele könnten die Glycin-Austausche eine zusätzliche Erklärung
für den Perikardialzellphänotyp liefern. Das Vertebraten-Typ IV-Kollagen wird von Integrinen
gebunden (Heino, 2007; Leitinger and Hohenester, 2007). Integrine sind die wichtigsten
Rezeptoren in Vertebraten, wenn es um die Zell-Adhäsion an die ECM geht (Hynes, 2002).
Das Bindemotiv „GFOGER“ der Haupt-Kollagenrezeptoren Integrin α1β1 und α2β1 liegt im Typ
IV-Kollagen innerhalb der Trippelhelix-Domäne (Knight et al., 2000). Unter der Annahme,
dass in Drosophila ähnliche Voraussetzungen bestehen, kann die Bindung des KollagenTrimers durch eine Mutation im Bindemotiv beeinträchtigt sein. Eine mögliche Folge könnten
Defekte der Zelladhäsion zwischen Kardioblasten und Perikardialzellen sein. Die Mutationen
innerhalb der LN-Domäne in den hypomorphen LanB1-Allelen haben aber sehr
wahrscheinlich keinen direkten Einfluss auf die Bindung an Rezeptoren, da die Integrine mit
anderen Domänen des Laminin-Trimers interagieren (Nishiuchi et al., 2006).
5.3.2
Mögliche Quellen der ECM-Komponenten Cg25C und LanB1
Im Zusammenhang mit der das Herz umgebenden extrazellulären Matrix stellt sich die
Frage, welche Zellen oder Gewebe als mögliche Quelle für die Matrix-Komponenten dienen.
Es ist bekannt, dass sich Hämozyten während der Embryonal-Entwicklung durch den
Embryo bewegen und auf ihrem Weg Matrix-Komponenten sekretieren (Bunt et al., 2010;
Fessler and Fessler, 1989; Martinek et al., 2008; Wood et al., 2006). Ihre Wanderung führt
die Zellen auch in die unmittelbare Umgebung des Dorsalgefäßes. PDGF/VEGF-Signale sind
in der Lage, die Wanderung der Hämozyten zu beeinflussen und diese in Kontakt mit
bestimmten Geweben zu bringen (Bunt et al., 2010; Cho et al., 2002; Wood et al., 2006). Ein
Ligand für den PDGF/VEGF-Rezeptor, pvf-2, wird auch in den Kardioblasten exprimiert
(Wood et al., 2006). Folglich besteht die Möglichkeit, dass die Hämozyten aktiv von den
Kardioblasten angelockt werden. Eine Expression der beiden Typ IV-Kollagene in den
Hämozyten konnte bereits nachgewiesen werden (Mirre et al., 1988; Yasothornsrikul et al.,
1997). Auch die Gene LanA, LanB1 und LanB2 werden unter anderem in diesen Zellen
exprimiert (Bunt et al., 2010; Wolfstetter und Holz, 2011). Im Zuge dieser Arbeit wurde die
Expression von Cg25C und LanB1 in den Hämozyten und im Fettkörper bestätigt (Daten
nicht gezeigt). Darüber hinaus konnte Cg25C-mRNA und LanB1-mRNA in den Kardioblasten
nachgewiesen werden. Eine zusätzliche Expression in den Perikardialzellen konnte nicht
eindeutig nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Herzzellen
selbst bestimmte Komponenten der sie umgebenden ECM sekretieren. Gestützt werden
diese Daten durch bereits veröffentlichte Expressionsdaten von vkg in Perikardialzellen und
wb in Kardioblasten (Fisher et al., 2012; Martin et al., 1999).
136
5.3.3
Mutationen in Kollagen- und Laminin-Genen in Zusammenhang mit Defekten in
der extrazellulären Matrix in Vertebraten
Die Arbeit mit Drosophila als Modellorganismus dient der Grundlagenforschung und ist eine
Möglichkeit, die komplexen Vorgänge in höheren Organismen unter normalen Umständen
und in Krankheits-Situationen zu ergründen. Da in Vertebraten viel mehr Kollagenbeziehungsweise Laminin-Gene existieren, ist es schwierig, die Funktion einzelner Gene
genauer zu analysieren. Beim Menschen existiert eine Vielzahl von Krankheiten im
Zusammenhang mit Defekten in der extrazellulären Matrix. Viele davon sind genetisch
bedingt und haben als Ursache Mutationen in Genen, welche ECM-Komponenten kodieren.
Darunter befinden sich auch Mutationen im Cg25C-Homologen Col4A1. Mehrere
identifizierte Mutationen führen zu einem Glycin-Austausch innerhalb der TrippelhelixDomäne des Col4A1-Monomers. Die betroffenen Personen waren anfällig für Hirnblutungen
und ein Teil entwickelte als Folge eine unvollständige Lähmung einer Körperseite (Gould et
al., 2006; Vahedi et al., 2007). Bei den Mitgliedern von drei Familien wurden insgesamt drei
Glycin-Mutationen in der Trippelhelix-Domäne identifiziert. Die Folge waren Aneurysmen,
Nierenprobleme und Muskelkrämpfe (Plaisier et al., 2007). Mäuse mit einer dominanten
Col4A1-Mutation zeigen Unregelmäßigkeiten in der Schichtdicke und Beschaffenheit der
Basalmembranen. Es entstehen lokale Lücken und die Basalmembranen lösen sich von den
Zellen (Van Agtmael et al., 2005). Heterozygote Embryonen einer Mauslinie mit einem
Defekt im Col4A1-Gen besitzen schwache Gefäßwände, wodurch durch die Belastung im
Uterus oder während der Geburt Hirnblutungen entstehen können (Gould et al., 2006).
Die meisten Defekte sind die Folge dominanter Mutationen und treten bereits in der
heterozygoten Situation auf. Das ist vergleichbar mit der teilweisen Dominanz im Cg25CAllel Cg25CS3064, welche vermutlich durch die antimorphe Wirkung des mutierten Proteins
nach Einbau in die Typ IV-Kollagen-Trippelhelix zustande kommt.
Schwerwiegende Defekte in der extrazellulären Matrix, insbesondere in Muskelgeweben
oder in vaskulären Systemen, sind auch in Vertebraten die Folge von Mutationen in den
Laminin-Genen. Es wurde gezeigt, dass Laminin-β1-defizienten Mausembryonen sämtliche
Basalmembranen fehlen (Miner et al., 2004). Eine Splice-Stellen-Mutation im Laminin-α2Gen, welches eine große Ähnlichkeit zu wb in Drosophila aufweist, führt im Zebrafisch zu
einer schweren Muskel-Dystrophie (Gupta et al., 2012).
Die im Zuge dieser Arbeit isolierten hypomorphen LanB1-Allele weisen interessanterweise
alle eine Mutation innerhalb der LN-Domäne auf. Es gibt Daten aus dem Maus-System und
Analysen
genetisch
bedingter
Krankheiten
beim
Menschen,
die
belegen,
dass
Punktmutationen in der LN-Domäne der drei Laminin-Ketten bestimmte Konsequenzen nach
sich ziehen (Matejas et al., 2010; Patton et al., 2008). In Matejas et al. (2010), werden eine
137
Reihe von Mutationen im Gen Lamb2 charakterisiert. Die Mehrheit dieser Mutationen führt
zum Einbau eines vorzeitigen Stop-Codons und somit zum Funktionsverlust des LamininProteins. Bei den übrigen identifizierten Mutationen handelt es sich um missenseMutationen, welche auffallender Weise gehäuft in der LN-Domäne vorkommen und als
hypomorph eingestuft werden. Da Aminosäureaustausche innerhalb der LN-Domäne
augenscheinlich die Funktion beeinträchtigen, ist die Anhäufung der missense-Mutationen in
dieser Domäne ein Hinweis auf hoch-konservierte Aminosäuren. Die Ausführungen von
Patton et al. (2008), gehen in die gleiche Richtung. Die Autoren zeigen, dass Mäuse mit
einer Lama2-Mutation keine reguläre Basallamina um Schwann´sche Zellen und
Muskelfasern ausbilden. Die beschriebene Mutation ersetzt das Cystein an Position 79 in
einem konservierten CxxC-Motif innerhalb der LN-Domäne durch Arginin. Dieses Cys79 ist
auch in Drosophila konserviert. Das mutierte Protein wird normal ins Trimer eingebaut und
dieses wiederum regulär in die ECM integriert. Auch die Zusammensetzung der Basallamina
ist normal, jedoch weißt diese Unterbrechungen auf. Die Autoren in Patton et al. (2008),
nennen zwei mögliche Gründe für den beschriebenen Phänotyp: (1) Die Veränderungen
innerhalb der LN-Domäne beeinträchtigen die Quervernetzung der Laminin-Trimere. (2) Das
CxxC-Motif ist wichtig für die Interaktion von Laminin mit anderen Proteinen innerhalb der
ECM oder an der Oberfläche von Zellen. Vergleichbare Beobachtungen konnten in dieser
Arbeit bei der Analyse der hypomorphen LanB1-Allele gemacht werden. Die Verteilung von
Laminin um das Herz ist lückenhaft, das Muster spricht aber dafür, dass das Laminin-Trimer
sekretiert und ein (irreguläres) Laminin-Gerüst etabliert wird. In den übrigen Geweben
entspricht die Laminin-Verteilung weitestgehend dem Wildtyp, was den Herz-spezifischen
Phänotyp bestätigt. Möglicherweise ist das Herz mehr beansprucht oder aufgrund der
Zusammensetzung der ECM oder einer eventuellen Prozessierung der ECM-Komponenten
sensibler. Möglich ist auch die Existenz eines bisher nicht identifizierten Herz-spezifischen
Interaktors für das mutierte Interface der LN-Domäne.
Fasst man diese Beobachtungen zusammen, zeigt sich, dass trotz der im Vergleich zu
Drosophila deutlich größeren Anzahl unterschiedlicher Kollagene und Laminine in
Vertebraten viele Proteine eine spezielle, nicht zu kompensierende Funktion besitzen. Durch
Mutationen hervorgerufene Veränderungen nur einer Untereinheit führen in den meisten
Fällen zu dramatischen Defekten, oftmals bereits während der Embryonal-Entwicklung. Die
Analyse der Drosophila-Kollagen- beziehungsweise -Laminin-Mutanten führt zu einem
besseren Verständnis der Folgen von Mutationen in Genen, welche ECM-Komponenten
codieren, inklusive der betroffenen Entwicklungs-Prozesse. Die Tatsache, dass in allen fünf
Cg25C-Allelen jeweils ein Glycin-Austausch innerhalb der Trippelhelix-Domäne für den
Phänotyp verantwortlich ist, bestätigt die Konservierung des Glycin-X-Y-Motivs und dessen
Wichtigkeit für die Ausbildung der Trippelhelix und für die Entstehung des Kollagen-Trimers.
138
Außerdem weisen die Daten darauf hin, dass Typ IV-Kollagen zur Stabilität der ECM
beiträgt. Die aus der Analyse der drei hypomorphen LanB1-Allele gewonnenen Erkenntnisse
heben die Bedeutung der LN-Domäne für die Funktion der Laminin-Trimere hervor.
139
6 Literatur
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152
7 Anhang
Pilot-Screen
Teil 2
Teil 3
Teil 4
EMS-Konzentration
25mM / 35mM
25mM
30mM
30mM
F1-Kreuzungen
400 / 400
800
1000
2000
getestete Linien
299 / 279
664
775
1729
Letalität
90,0% / 93,4%
66,3%
88,5%
88,0%
2,30 / 3,55
1,09
2,16
2,12
122
72
103
172
durchschnittliche Anzahl
letaler Treffer
aufgehobene Linien
Tabelle 20: Erweiterte EMS-Screen-Statistik
Auflistung der wichtigsten Eckdaten aus dem EMS-Screen, unterteilt in die vier Screen-Abschnitte.
153
Typ IV-Kollagen
L
L
vkg01209
L
L
S0120
L
S0791
L
L
S1348
L
L
S2186
L
S3064
L
(auch
19°C)
L
L
L
L
(auch
19°C)
S
8%1
L
L
L
L
L
(auch (auch
19°C) 19°C)
V/S
20%1
L
L
Cg25C
S
8%1
L
L
(auch (auch
19°C) 19°C)
S
2%
L
L
S
3%
S
6%
V
V
S
7%
L
L
L
S
1%
V
L
V
23%
L
L
L
V
L
L
L
V
L
S
1,2%
L
L
S
3%
S
7%
L
V
L
(auch
19°C)
L
L
(auch
19°C)
L
L
(auch
19°C)
L
(auch
19°C)
L
L/S
L
L
L
L
1%
(19°C: (19°C: (19°C:
(auch
(19°C:
10%) 26%) 19%)
19°C)
19%)
L
V
V
fertil
V
fertil
V/S
20%1
L
V
V
23%
L
L
L
V
fertil
V
V
fertil
L
L
(auch (19°C:
19°C) 10%)
S
6%
Cg25Cb9
vkgG00454-GFP
S
10%
L
S
2%
L
(auch
19°C)
DTS-L3
S
10%
vkgG00454-GFP
L
Df(2L)BSC172
Cg25Ck00405
Cg25Cb9
L
Cg25CDTS-L3
L
S3064
Df(2L)BSC110
S2186
L
S1348
L
S0791
vkg01209
Df(2L)Exel7022
S0120
Cg25Ck00405
Df(2L)BSC172
Df(2L)BSC110
Df(2L)Exel7022
Typ IV-Kollagen
L
L
V
L
(19°C:
26%)
L
(19°C:
19%)
L/S
1%
(19°C:
19%)
L
(auch
19°C)
L
L
V
V
L
V
L
V
Tabelle 21: Komplementations-Ergebnisse – Typ IV-Kollagen
Zusammenfassung der Ergebnisse der Komplementationstests verschiedener Typ IV-Kollagen-Allele
untereinander. Durchführung der Tests in der Regel bei 25°C (bei einigen, wie angegeben zusätzlich
bei 19°C). Die Prozentangaben beziehen sich auf den Anteil der transheterozygoten Nachkommen. L:
1
letal, S: semi-letal (weniger als 20% transheterozygote Nachkommen); V: „viable“, lebensfähig;
transheterozygote Nachkommen sind steril
154
LamininB1
L
S3773
S1163
S2941
L
L
L
L
L
L
L
L
L
LanB1KG03456
L
S0464
L
L
S0473
L
L
L
L
L
L
L
S1522
L
S2941
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
S1163
S3773
L
L
Df(2L)ED12527
S0733
S1522
Df(2L)BSC233
S0733
S0473
S0464
LanB1KG03456
Df(2L)ED12527
Df(2L)BSC233
LamininB1
L
L
Tabelle 22: Komplementations-Ergebnisse – LanB1
Zusammenfassung der Ergebnisse der Komplementationstests
untereinander. Durchführung der Tests bei 25°C. L: letal
verschiedener
LanB1-Allele
155
Typ IV-Kollagen
S0733
S1163
S1522
S2941
S3773
S0212
LanB1KG03456
V
S0473
L
S0464
Df(2L)Exel7022
Df(2L)ED12527
Df(2L)BSC233
LamininB1
S
8%
L
S
5%
S
20%
L
L/S
1%
V
Df(2L)BSC110
L
L, S
4%
V
Df(2L)BSC172
L
S
4-12%
V
Cg25Ck00405
S
10%
V
vkg01209
V
V
S0120
S
3%
S
18%
S
12%
V
V
V
V
V
S0791
V
V
S
5%
S
3-22%
V
V
S1348
V
V
S
11%
V/SV
23%
V
L1
(l(2)gl)
V
V
V
L/S
1%
S
9%
L
S
4%
S
13%
L/SL
1%
V
S
17%
S
7%
V
V
V
S2186
S3064
S/V
1-25%
V
2427%
V
Cg25CDTS-L3
S
18%
S
20%
V
Cg25Cb9
S
1-14%
S
11%
L
vkgG00454-GFP
Tabelle 23: Komplementations-Ergebnisse – Typ IV-Kollagen/LanB1
Zusammenfassung der Ergebnisse der Komplementationstests von Typ IV-Kollagen-Allelen mit
LanB1-Allelen. Durchführung der Tests bei 25°C. Die Prozentangaben beziehen sich auf den Anteil
der transheterozygoten Nachkommen. L: letal, S: semi-letal (weniger als 20% transheterozygote
1
Nachkommen); V: „viable“, lebensfähig; Letalität aufgrund einer gemeinsamen zusätzlichen Mutation
im Gen lethal (2) giant larvae (l(2)gl). Kein Alarmuskel-Anheftungsphänotyp in dieser Kombination
oder mit ebenfalls nicht komplementierender l(2)gl-deletierender Defizienz Df(2L)ED50001.
156
157
Abbildung 35: Cg25C - Genkarte
Graphische Darstellung des Gens Cg25C mit Angabe der Exons, der kodierenden Sequenz (Quelle:
www.flybase.org (FBgn0000299)) und der Punktmutationen der isolierten Allele (Transkriptionsstart
entspricht Position 799). Zur Sequenzierung wurde das Gen in sechzehn Fragmente unterteilt.
158
159
Abbildung 36: LanB1 - Genkarte
Graphische Darstellung des Gens LanB1 mit Angabe der Exons, der kodierenden Sequenz (Quelle:
www.flybase.org (FBgn0261800)) und der Punktmutationen der isolierten Allele (orange: hypomorphe
Allele, rot: starke Allele) (Transkriptionsstart (Exon 1A) entspricht Position 2001). Zur Sequenzierung
wurde das Gen in acht Fragmente unterteilt.
160
Abbildung 37: Embryonale Expression von Cg25C und LanB1
Nachweis der Expression von Cg25C- (A-C) und LanB1-mRNA (D-G) (grün) durch in situ
Hybridisierung und zusätzliche Antikörperfärbung gegen Mef2 (rot). Das Experiment wurde sowohl mit
Kontroll-Embryonen (A, B, D, E) als auch mit Cg25C- (C) beziehungsweise LanB1-defizienten
Embryonen (F, G) durchgeführt. (A) In Stadium 13 kann Cg25C-mRNA deutlich in den Hämozyten
(Hz) nachgewiesen werden. (B) Embryo in Stadium 16 mit Cg25C-Expression in den Hämozyten und
im Fettkörper (Fk). (C) Keine Cg25C-Expression in Embryonen der Cg25C-deletierenden Defizienz
Df(2L)Exel7022. (D) LanB1 wird in Stadium 13 vorwiegend in den Hämozyten und schwach in der
Amnioserosa (As) exprimiert. (E) In Stadium 16 ist LanB1-mRNA ebenfalls in den Hämozyten und im
Fettkörper detektierbar. (F, G) Keine spezifischen LanB1-Signale in Embryonen der LanB1-Defizienz
Df(2L)ED12527.
161
Danksagung
Zuerst möchte ich mich bei Dr. Ingolf Reim für die Betreuung meiner Doktorarbeit bedanken,
insbesondere für seine Geduld und dafür, an seinem immensen Wissen teilhaben zu dürfen.
Mein besonderer Dank gilt Prof. Manfred Frasch für die Möglichkeit, meine Doktorarbeit an
seinem Lehrstuhl durchführen zu können. Besonders hoch rechne ich ihm an, mir sofort den
Erhalt
meiner
Stelle
zugesichert
zu
haben,
obwohl
abzusehen
war,
dass
ich
krankheitsbedingt kurz nach Beginn meiner Arbeit für mehrere Monate ausfallen würde.
Vielen Dank an Prof. Achim Paululat für die Übernahme des Zweitgutachtens sowie an Prof.
Benedikt Kost und Prof. Lars Nitschke für die Abnahme der mündlichen Prüfung.
Vielen Dank an alle Kollegen für das tolle Arbeitsklima. Insbesondere danke ich Dr. Ralph
Rübsam dafür, jederzeit ein offenes Ohr für meine Anliegen gehabt zu haben und mir die
faszinierende Welt der Ornithologie nahezubringen. Ich danke Irene für die netten
Gespräche im Sozialraum und auf dem Weg zur Mensa. Angela danke ich für die vielen
unterstützenden Tätigkeiten beim Arbeiten mit Drosophila. Benjamin danke ich für die Hilfe
bei der Sequenzierung der EMS-Allele. Mein Dank gilt auch Christoph für die Lösung
diverser Probleme mit Mac- oder PC-Software.
Danke an Maria Ricca, Marianne Zeidler, Claudia Obermeier, Tina Loy und Thomas
Messingschlager dafür, den Lehrstuhl am Laufen zu halten.
Mein größter Dank gilt meiner Familie für die Unterstützung und den Rückhalt und dafür,
mich auch in schwierigen Situationen immer wieder aufzurichten.
162
Erklärung
Ich versichere, dass ich die vorliegende Dissertation „Durchführung eines EMS-Screens zur
Identifizierung von an der Muskelentwicklung in Drosophila melanogaster beteiligten Genen“
selbstständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt habe und keine anderen als die
angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.
Ich versichere weiterhin, dass diese Arbeit in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner
Prüfungsbehörde vorgelegt wurde.
Erlangen, llllll..
lllllllllllllll.
(Dominik Hollfelder)
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Dissertationsbezogene Publikation
Teile dieser Arbeit wurden bereits im Rahmen eines wissenschaftlichen Artikels
veröffentlicht:
Ingolf Reim, Dominik Hollfelder, Afshan Ismat und Manfred Frasch. (2012). The FGF8related signals Pyramus and Thisbe promote pathfinding, substrate adhesion, and survival of
migrating longitudinal gut muscle founder cells. Developmental biology 368, 28–43.
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