Interaktion von Keratinozyten und sensorischen Fasern in

Zusammenfassung
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In der hier vorgelegten Doktorarbeit wurde der Mechanismus der Photodynamischen
Therapie (PDT), einer neuen Behandlungsmethode von Hautkrebs, untersucht. Die
Effektivität dieser Therapie ist in zahlreichen Studien bestätigt worden, allerdings ist
der zelluläre Ablauf noch nicht vollständig aufgeklärt. Bei der PDT werden
Substanzen, z.B. δ-Aminolävulinsäure (ALA) oder dessen methylierte Form (MAL),
als Creme oder Gel auf die betroffene Hautstelle aufgebracht. Dabei handelt es sich
um Substanzen, die in den Zellen auch normalerweise gebildet werden und im
Rahmen des Hämzyklus verstoffwechselt werden. Dadurch wird dann die eigentliche
photosensitive Substanz Protoporphyrin IX (PpIX) gebildet, eine Vorläufersubstanz
von Häm. Durch die Zugabe von ALA bzw. MAL im Überschuss wird mehr PpIX als
unter physiologischen Bedingungen gebildet. Dies geschieht vor allem in
Tumorzellen, weshalb diese gezielt bei der PDT behandelt werden können. Wird das
PpIX mit rotem Licht (635 nm) angeregt, entstehen durch eine photochemische
Reaktion reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Da das PpIX in den Mitochondrien
gebildet wird, können die ROS hier direkt in die mitochondriale Funktion eingreifen
und die Zelle schädigen. Im Verlauf dieser Behandlung klagen einige Patienten über
einen brennenden Schmerz, dessen Ursache jedoch noch nicht bekannt ist.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Aufnahmemechanismus von ALA und MAL in
verschiedene Keratinozytenlinien untersucht und die Ursache des Schmerzes
erforscht. Bei der PDT möchte man gezielt die Tumorzellen zerstören und das
umliegende Gewebe dabei möglichst nicht schädigen. Aus diesem Grund wurde
untersucht, ob ALA und MAL über verschiedene Wege in die Zellen aufgenommen
werden können und ob daraus abgeleitet eine gezieltere Aufnahme in Tumorzellen
erreicht werden kann. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl ALA als auch MAL
besser in Tumorzellen aufgenommen werden können und die Aufnahmekapazität der
normalen Keratinozyten begrenzt ist. In einer normalen (CCD-Zellen) und einer
pathologisch
veränderten
(A431-Zellen)
Keratinozytenzellinie
wurde
als
Hautptransportmechanismus der GABA-Transporter Typ 3 (GAT-3) gefunden. Es
konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass dieser Transportertyp in der Epidermis
exprimiert wird. Bisherige Untersuchungen in anderen Zelltypen beschränkten sich
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auf die Klasse der BETA-Transporter. Diese Ergebnisse zeigten, dass die
Keratinozyten ALA und MAL über denselben Mechanismus aufnehmen können und
es an diesem Punkt keine Möglichkeit zur differenzierten Aufnahme ausschließlich in
Tumorzellen gibt.
Bei der PDT sterben die Krebszellen ab. Dies kann sowohl apoptotisch als auch
nekrotisch geschehen. Der eingeschlagene Weg ist dabei abhängig von der PpIXBildung und der Bestrahlungsintensität. Die Ergebnisse zeigten, dass in normalen
Zellen eher Nekrose auftritt, während Tumorzellen vermehrt apoptotisch sterben.
Dies ist auch abhängig von der verwendeten ALA-Konzentration. Eine hohe
Konzentration führt zu mehr PpIX, wodurch mehr ROS gebildet werden können und
somit die Zelle stärker geschädigt wird. Tumorzellen besitzen vermutlich zusätzliche
Schutzmechanismen gegen ROS, wodurch sie nicht so anfällig sind für nekrotischen
Zelltod, sondern den apoptotischen Zelltod einleiten können. In der medizinischen
Praxis ist dies erwünscht, da dadurch die Entzündungsreaktionen und mögliche
Nebenwirkungen geringer ausfallen.
Im Rahmen der Schmerzentstehung wurde die Interaktion von sensorischen
Neuronen und Keratinozyten analysiert. Die Hautzellen und die Fortsätze der
Neuronen befinden sich in der Epidermis in direktem Kontakt und kommunizieren
miteinander, z.B. indem Keratinozyten Adenosintriphosphat (ATP) freisetzen, was im
Rahmen dieser Arbeit in der Tat gezeigt werden konnte. Die ATP-Sekretion von
Keratinozyten war abhängig von der ALA-Konzentration. Diese Sekretion konnte
durch den Einsatz von spezifischen ALA-Aufnahmeinhibitoren reduziert werden.
Hiermit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass während der PDT ATP
freigesetzt wird.
Um die Nervenaktivierung während der PDT zu untersuchen, wurden jetzt
sensorische Neurone und A431-Zellen zusammen inkubiert und die Reaktion der
Neurone auf das Medium von PDT-behandelten A431-Tumorzellen untersucht. In
direkten Kokulturen konnte kein toxischer Einfluss auf die Neuronen gefunden
werden. Durch calcium imaging-Versuche konnte allerdings gezeigt werden, dass die
Keratinozyten während der Bestrahlung pro-nozizeptive Substanzen freisetzen, die
die Neurone aktivieren können. Hier wurden eine eher geringe Beteiligung von ATP
und eine größere Beteiligung von Acetylcholin (ACh) gezeigt. Diese ACh-Reaktion
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konnte
durch
spezifische
ACh-Rezeptorblocker
unterbunden
werden.
Die
Freisetzung von Ach wurde nur in Keratinozyten beobachtet, die mit hohen ALAKonzentrationen inkubiert wurden und durch eine große PpIX- und ROS-Ausbeute
nekrotisch
starben.
Daher
kann
mit
den
derzeitigen
Experimenten
nicht
ausgeschlossen werden, dass ACh durch platzende Zellen freigesetzt wird.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte der Mechanismus der zellulären Aufnahme
von ALA und MAL in Keratinozyten charakterisiert und wichtige Hinweise zur
Entstehung des Schmerzes während der PDT gefunden werden. Die Ergebnisse
können zur Verbesserung der klinischen Anwendung der PDT herangezogen
werden.
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