gegen Fusarium gram - 400 Bad Request
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Universität für Bodenkultur Interuniversitäres Department für Agrarbiotechnologie Tulln Institut für Biotechnologie in der Pflanzenproduktion Feldversuch zur Untersuchung der Resistenzeigenschaften europäischer Winterweizensorten gegen Fusarium graminearum und Fusarium sporotrichioides sowie dem Zusammenhang mit morphologischen Merkmalen Diplomarbeit Eingereicht von: Hasitschka Sonja bakk. techn. Matrikelnummer: 0540328 Studienrichtung: H 066 455 Nutzpflanzenwissenschaften Betreuer: Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Bürstmayr Hermann November 2016 Danksagung Ich möchte mich an erster Stelle herzlich bei meinem Betreuer Prof. Dr. Hermann Bürstmayr bedanken, der viel Geduld bewiesen hat und mir Zeit gab diese Arbeit ohne Termindruck zu verfassen. Er stand mir insbesonders bei den statistischen Auswertungen hilfreich und mit Rat und Tat zur Seite. Mit seinem Fachwissen gab er mir viele Inputs und Anregungen die in diese Arbeit miteinflossen. Danke auch für die schnellen Korrekturen und das Verständnis für die Verzögerung der Fertigstellung. Danke an alle Mitarbeiter des IFAs die an der Umsetzung des Versuchs beteiligt waren. Besonderer Dank geht an den ehemaligen Institutsmitarbeiter Imer Maloku der mich 2013 bei der Durchführung des Feldversuchs, insbesondere bei der Herstellung des Inokulums, beim Inokulieren selbst als auch bei den Boniturarbeiten, unterstützt hat. Und zu guter Letzt möchte ich mir auch selbst danken, dafür, dass ich nach 3 turbulenten Jahren die Energie, die Zeit und den Willen aufgebracht habe, diese Diplomarbeit fertigzustellen und damit mein Studium abzuschließen. 1 Zusammenfassung Im Jahr 2013 wurden 190 Winterweichweizensorten und –zuchtlinien in einem Freiland Feldversuch in Österreich auf ihre Resistenzeigenschaften gegen Ährenfusariose, induziert durch die zwei Fusariumarten Fusarium graminearum und Fusarium sporotrichioides, getestet. Ziel des Versuchs war es, die Resistenzeigenschaften des Versuchsmaterials zu erfassen und diese in Abhängigkeit zu physiologischen und morphologischen Merkmalen zu stellen und zu prüfen. Die Parzellen des Versuchs wurden künstlich im Sprühverfahren inokuliert. Der Krankheitsverlauf wurde in regelmäßigen Abständen visuell bonitiert. Um den Zusammenhang von Resistenz zu physiologischen Sorteneigenschaften zu hinterfragen, wurden die Merkmale Blühbeginn, Antherenausstoß und Wuchshöhe dokumentiert. Nach der Ernte wurden die Einzelkörner des erhaltenen Ernteguts der einzelnen Parzellen visuell auf Fusariumbefall untersucht. Im Anschluss daran wurden Toxinmessungen, insbesondere auf DON und HT-2 und T-2, durchgeführt. Die Parzellen, die mit F. graminearum inokuliert wurden, wiesen einen doppelt so starken FHB-Befall als die mit F. sporotrichioides inokulierten Flächen auf. Die weiteren Ergebnisse dieses Versuchs zeigten, dass aufgrund des Infektionsverlaufs und der Symptomausprägung im Bestand auf die Korn-Schädigung durch Fusarium im Erntegut und auch auf die Mykotoxinbelastung des Ernteguts geschlossen werden kann. Die AUDPC-Werte korrelierten positiv für beide Experimente, sowohl mit FDK als auch mit den Toxingehalten. Durch eine gezielte Auswahl resistenter Sorten bzw. Genotypen kann Fusariumbefall und auch Mykotoxinbelastung des Ernteguts verringert werden. Es besteht ein Zusammenhang zwischen den morphologischen Merkmalen Wuchshöhe und Antherenaustoß der durch die Ergebnisse der Korrelationsanalysen belegt wurde. Je höher die Wuchshöhe eines Genotyps und je geringer die Antherenretention, desto geringer ist die Anfälligkeit für FHB. Das Blühdatum hatte keinen Einfluss auf eine Resistenz gegenüber den Pathogenen. Eine der wichtigsten Erkenntnisse dieser Studie ist die positive Korrelation aller fusariumbezogenen Merkmale für F. graminearum und F. sporotrichioides. Es kann von Resistenzeigenschaften eines Genotyps gegenüber F. graminearum auf die Resistenz gegenüber F. sporotrichioides geschlossen werden und umgekehrt. 2 Abstract This study is about a field trial in Austria in 2013 where 190 wheat cultivars and breeding lines were tested in two experiments for resistance against FHB induced by two different Fusarium isolates, Fusarium graminearum and Fusarium sporotrichioides. The goal was to evaluate the resistance traits of the used plant material and to explore if there are possible correlations to morphological traits. The plots were artificially inoculated via spray inoculation in frequent intervals. The FHB disease severity was constantly measured in visual evaluation. To prove a correlation between morphological traits of the different genotypes and resistance against FHB, anthesis date, anther retention and plant-height were also measured. The harvested kernels per plot were evaluated for Fusarium damaged kernels and also analyzed for their mycotoxin-content, especially for the toxins DON and HT-2 and T-2. The FHB disease severity of the plots inoculated with F. graminearum were twice as high as the plots inoculated with F. sporotrichioides. Relying on the visual evaluation results within the field, the percentage of Fusarium damaged kernels and also the mycotoxin content in the harvested grain can be suggested. The correlation coefficient for AUDPC with FDK and toxin content was positive for both isolates. Selection of resistant cultivars leads to lower FHB severity and also lower contamination of mycotoxin within the kernels. The results showed a negative correlation between plant height and susceptibility to FHB. The higher the wheat stem, the better the resistance against FHB. Positive correlation was shown between anther retention and resistance. The higher the anther extrusion from the spikelets, the more distinct was the resistance against FHB. Anthesis date had no influence on the resistance traits of the genotypes. The most important result of this study was the correlation between the FHB related traits of F. graminearum and F. sporotrichioides. This means, genotypes, that are resistant against F. graminearum, can also be considered as resistant against F. sporotrichioides and vice versa. 3 Abkürzungen ANOVA Analysis of variance Varianzanalyse Aret_rel Anther retention, relative Relative Einbehaltung der Antheren AUDPC Area under disease pro- Maß für den Infektionsverlauf gress curve D1May Days after 1. May Blühdatum in Tagen nach dem ersten Mai DON FDK Deoxynivalenol Fusarium damaged Befallene Körner im Erntegut kernels FG FHB FHB_B5 Fusarium graminearum Fusarium Head Blight Ährenfusariose Fusiarumbefall in % zum Zeitpunkt der 5. Bonitur FS Fusarium sporotrichioides HT2 + T2 Summe der Mykotoxine HT-2 und T-2 IFA Interuniversitäres Department für Agrarbiotechnologie in Tulln NIV Nivalenol QTL Quantitative Trait Loci WH Wiederholungen des Versuchs WUH Wuchshöhe ZON Zearalenon 4 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung ................................................................................................................ 2 Abstract ................................................................................................................................. 3 Abkürzungen ......................................................................................................................... 4 Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................. 5 1 Einleitung ....................................................................................................................... 7 2 Stand der Forschung ...................................................................................................... 9 2.1 Fusarium ................................................................................................................. 9 2.1.1 2.2 Ährenfusariose an Weizen .....................................................................................11 2.2.1 Infektionsweg und Krankheitsverlauf ...............................................................11 2.2.2 Symptome .......................................................................................................13 2.2.3 Toxine .............................................................................................................14 2.2.4 Bedeutung und Konsequenzen .......................................................................18 2.2.5 Kontrolle von FHB ...........................................................................................20 2.3 Resistenz ...............................................................................................................23 2.3.1 Resistenzmechanismen ..................................................................................24 2.3.2 Resistenzherkunft ...........................................................................................26 2.3.3 Vererbbarkeit...................................................................................................27 2.4 3 Die Pathogene ................................................................................................. 9 Künstliche Inokulation ............................................................................................28 Material und Methoden ..................................................................................................30 3.1 Pflanzenmaterial ....................................................................................................30 3.2 Feldversuch............................................................................................................30 3.2.1 Versuchsstandort ............................................................................................30 3.2.2 Versuchsanlage ..............................................................................................31 3.2.3 Pflanzenbauliche Maßnahmen ........................................................................32 3.2.4 Witterungsverlauf ............................................................................................33 3.3 Inokulation ..............................................................................................................35 3.3.1 Inokulumherstellung ........................................................................................35 3.3.2 Konzentration ..................................................................................................37 3.3.3 Zeitpunkt der Inokulation .................................................................................38 3.3.4 Inokulationsmethode .......................................................................................39 3.4 Bonituren................................................................................................................40 3.4.1 Blühbonitur ......................................................................................................40 5 3.4.2 Antherenbonitur...............................................................................................41 3.4.3 Fusariumbonitur ..............................................................................................42 3.4.4 Kornbonitur .....................................................................................................45 3.4.5 Sonstige Bonituren ..........................................................................................45 3.4.6 Toxinanalysen .................................................................................................46 3.5 4 5 Statistische Auswertung .........................................................................................46 Ergebnisse ....................................................................................................................48 4.1 Beschreibende Kennzahlen....................................................................................48 4.2 Varianzanalysen und Häufigkeitsverteilungen ........................................................50 4.2.1 Fusarium graminearum ...................................................................................51 4.2.2 Fusarium sporotrichioides ...............................................................................52 4.2.3 Morphologische Merkmale ..............................................................................53 4.3 Infektionsverlauf .....................................................................................................56 4.4 Korrelationsanalysen und Streudiagramme ............................................................58 Diskussion .....................................................................................................................69 5.1 Infektionsverlauf und fusariumbezogene Parameter ...............................................69 5.2 Einfluss der Sorten und Isolat-Wiederholungen ......................................................70 5.3 Mykotoxine .............................................................................................................71 5.4 Zusammenhänge mit morphologischen Merkmalen ...............................................71 6 Literatur .........................................................................................................................74 7 Verzeichnisse ................................................................................................................79 8 7.1 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................79 7.2 Tabellenverzeichnis................................................................................................81 Anhang ..........................................................................................................................83 6 1 Einleitung Durch Fusarium spp. verursachte Ährenfusariose ist eine der wichtigsten Weizenkrankheiten weltweit. Fusarium Head Blight verursacht in Weizenbeständen und anderen Getreidearten hohe Ertragsverluste und Qualitätsverluste. Neben diesen wirtschaftlichen Aspekten produziert der Pilz eine Reihe von hochgiftigen Mykotoxinen, die bei Konsumation eine Gefahr für Mensch und Tier darstellen. Sowohl im Lebensmittelbereich als auch in der Futtermittelindustrie gelten für zu verarbeitenden Weizenpartien strenge Höchstgrenzen hinsichtlich des Mykotoxingehalts. Somit stellt FHB ein direktes Problem für die Landwirtschaft, Händler und verarbeitende Industrie dar, aber auch eine Herausforderung für Pflanzenzüchtung und Pflanzenschutzindustrie. Obwohl die Pilzkrankheit schon seit Anfang des 20. Jahrhunderts bekannt ist, gibt es bis heute keine vollständig resistenten Sorten. Einige wenige Sorten, die relativ gute Resistenzeigenschaften aufweisen, haben ungenügende Ausprägung der Ertragsleistung und Qualitätsmerkmale. Resistenzzüchter und Biotechnologen weltweit versuchen sich in der Kombination von Resistenzeigenschaften und ökonomischen Eigenschaften. Die Funktion und Wirkung der Resistenzmechanismen auf molekularbiologischer Ebene sind noch nicht vollständig geklärt. Auch inwiefern morphologische Merkmale wie Blühverhalten, Antherenausstoß, Begrannung oder Wuchshöhe mit Resistenzphänomen zusammenhängen, ist Gegenstand aktueller Studien. Vor allem bei warmen und feuchten Wetter während der Blüte sind die Bestände anfällig für eine Infektion. Die Erstinfektion erfolgt über Sporen und Konidien, die sich auf Ernterückständen oder im Boden entwickelt haben. Die Menge an Primärinokulum und die Umweltbedingungen während der Anthese bestimmen den Schweregrad des Krankheitsverlaufs. Die Maßnahmen um eine FHB Epidemie zu verhindern bzw. einzudämmen beschränken sich derzeit auf eine Kombination von Auswahl eines möglichst resistenten Saatgutes, Fruchtfolgewechsel, geeignete Bodenbearbeitungsmaßnahmen zur Beseitigung der Ernterückstände und einen gezielten Fungizideinsatz. Ein Ausbruch von epidemischem Ausmaß wie es zuletzt Anfang der Neunziger in den USA vorkam, kann im schlimmsten Fall zu Totalausfällen von Kornerträgen befallener Bestände führen. Durch Verringerung von Ernteverlusten und Vermeidung von Kontaminationen durch Mykotoxine in Speise- und Futtergetreide, kann die Züchtung resistenter Sorten einen entscheidenden Beitrag zur Welternährung leisten. Außerdem stellt der Anbau resistenter, gesunder Sorten eine der umweltfreundlichsten und kostengünstigsten Maßnahmen im Pflanzenbau 7 dar, da auf Folgebehandlungen in Form von Pflanzenschutzmitteleinsatz weitgehend verzichtet werden kann. Viele Studien befassen sich mit dem Thema Resistenz gegenüber Fusarium spp., die aktuellsten und umfassendsten Reviews wurden von Buerstmayr und Lemmens (2015) und Buerstmayr et al. (2012) veröffentlicht. Diese Arbeit befasst sich mit einem Freilandversuch in dem 190 verschiedene Weizengenotypen auf ihre Resistenzeigenschaften im Zusammenhang mit morphologischen Merkmalen getestet wurden. Die Ziele dieser Studie und des Feldversuchs waren Erfassung der Resistenzeigenschaften des verwendeten Pflanzenmaterials Untersuchung eines Zusammenhangs zwischen Resistenzeigenschaften und physiologischen bzw. morphologischen Merkmalen der jeweiligen Sorten bzw. Zuchtlinien Charakterisierung eines Zusammenhangs von Symptomausprägung an der Pflanze im Feld und Mykotoxingehalt des Ernteguts Erhebung ob eine Resistenz gegenüber F. graminearum auch eine Resistenz gegenüber F. sporotrichioides bedingt und umgekehrt. 8 2 Stand der Forschung 2.1 Fusarium Fusarium ist eine große und weitverbreitete Gattung im Reich der Pilze (Stack 2003). Die phytopathogenen Arten verursachen unterschiedliche Krankheitsbilder an verschiedensten Wirten, wie vaskuläre Welkeerscheinungen, Fusariumwelke, Fäulniserscheinungen an verschiedenen Teilen der Pflanze und Ährenfusariose (Agrios 2005). Fusarium gehört zu den Ascomyceten und umfasst die anamorphen Stadien der Gattungen Gibberella und Nectria. Fusarium-Pilze sind fakultative Parasiten und leben saprophytisch im Boden auf abgestorbenem Pflanzenmaterial. Von dort aus können die Sporen auf gesundes Pflanzenmaterial gelangen und dieses infizieren. Es handelt sich um eher schwache Saprophyten mit effektiven Überdauerungsstrategien wie Chlamydosporen, verdickte Hyphen und widerstandsfähigen Perithecien (Liddell 2003). Ährenfusariose verursacht durch Fusarium spp. ist eine weltweit auftretende Weizenkrankheit (Stack 2003). Hauptinfektionsquellen sind in den meisten Fällen nicht eingearbeitete Ernterückstände auf der Bodenoberfläche auf denen der Pilz überdauern kann. Eine Infektion des Saatguts führt nur bedingt zur Produktion einer ausreichenden Menge an Primärinokulum (Shaner 2003). Eine Infektion kann von Konidien, Chlamydosporen, Myzel sowie den vom sexuellen Stadium gebildeten Ascosporen ausgehen (Bai and Shaner 1994). 2.1.1 Die Pathogene In dieser Arbeit wurden zwei Fusarium-Arten untersucht: Fusarium graminearum ist ein bodenbürtiges Pathogen welches die Wurzeln, den Bereich des unteren Stängels sowie die Ähren von Gräsern befallen kann. Unter landwirtschaftlichen Kulturarten werden hauptsächlich Weizen, Durum, Gerste und Mais befallen. Sein zugehöriger Teleomorph ist Gibberella zeae. Das Myzel ist auffallend rötlich gefärbt. F. graminearum bildet ausschließlich Makrokonidien welche sichelartig geformt und septiert sind (Liddell 2003). Das anamorphe Stadium kann neben Makrokonidien Chlamydosporen sowie Myzel bilden und als solches im Boden oder auf Pflanzenresten überleben. Ascosporen sind die sexuell gebildeten Verbreitungseinheiten des teleomorphen Stadiums Gibberella zeae. Sowohl Makrokonidien als auch Ascosporen werden als Hauptinokulumquelle für FHB angesehen (Bai and Shaner 9 1994; Paulitz 1999; Shaner 2003). Die optimale Temperatur für eine Infektion liegt bei 25°C, die benötigte Feuchteperiode beträgt 36-72 Stunden (Andersen 1948). F. graminearum gehört in Europa (neben F. culmorum und F. avenaceum) zu den drei Haupt-Erregern von FHB, es bevorzugt feucht-warmes kontinentales Klima und wird derzeit vor allem in Zentral- und Südosteuropa vorgefunden (Bottalico and Perrone 2002). F. graminearum ist in Hinblick auf FHB einer der wichtigsten Produzenten des Mykotoxins Deoxynivalenol (DON) (Chester et al. 2003). Fusarium sporotrichioides Auch dieses Pathogen überwintert bodenbürtig auf Ernterückständen und kann Ährenfusariose an Getreide verursachen. Diese Art produziert hoch toxische und krebserregende Mykotoxine, ein Befall mit F. sporotrichioides kann daher eine starke Kontamination des Ernteguts nach sich ziehen. Es ist kein sexuelles Stadium bekannt. Das Myzel auf befallenem Gewebe erscheint ebenfalls rötlich, die Makrokonidien sind sichelförmig aber etwas kleiner als bei F. graminearum. Der Pilz bildet eine hohe Zahl von eiförmigen bis spindelförmigen Mikrokonidien welche auch auf dem Luftweg verbreitet werden können (Liddell 2003). F. sporotrichioides produziert ein breites Mykotoxinspektrum: Deoxynivalenol (DON), T-2 und HT-2 Toxine, sowie Diacetoxyscirenol, Neosolaniol, 15-ADON, 4-ANIV und NIV (Abramson et al. 1993). F. sporotrichioides wird hauptsächlich mit der Bildung von A-Trichothecenen assoziiert, allen voran gilt diese Fusarium-Art als wichtiger T-2 und HT-2 Produzent (Chester et al. 2003). Mykotoxine, die von F. sporotrichioides produziert werden, gehören zu den toxischsten bekannten Verbindungen (Liddell 2003). Dill-Macky und Jones (2000) fanden während Versuchen zum Einfluss von Bodenbearbeitungssystemen auf FHB heraus, dass dieses Pathogen auf Ernterückständen von Sojabohne vermehrt vorkommt. Auch Ivic et al. (2009) fanden in Kroatien auf geernteten Sojabohnen vermehrt F. sporotrichioides. Die optimale Wachstums-Temperatur für F. sporotrichioides liegt bei 25-30°C (Nazari et al. 2014). F. sporotrichioides wird in Europa weit weniger oft auf Kornproben vorgefunden als F. graminearum. Ein vermehrtes Auftreten wurde Ende der Neunziger vor allem in Zentral- und Norddeutschland, Polen, Russland, Ungarn und den skandinavischen Ländern beobachtet (Bottalico and Perrone 2002). Die sichtbaren Symptome, die von den beiden Pathogenen verursacht werden, sind annähernd die gleichen, sie unterscheiden sich hauptsächlich in ihrer Ausprägung. 10 2.2 Ährenfusariose an Weizen Im deutschsprachigen Raum unter den Namen „Ährenfusariose“ oder „partielle Taubährigkeit“ bekannt, wird der Befall der Ähre von Fusarium spp. international als „Fusarium Head Blight“, „Fusarium Ear Blight“ oder „Fusarium Wheat Scab“ bezeichnet. Fusarium Head Blight (FHB) wird von knapp 20 verschiedenen Fusarium-Arten verursacht, unter anderem von F. graminearum und F. sporotrichioides, wobei F. graminearum - weltweit betrachtet - der wichtigste Erreger ist (Leplat et al. 2013; Liddell 2003; Schroeder and Christensen 1963). Die Umweltbedingungen spielen eine große Rolle für die Infektion sowie die Ausbreitung und Entwicklung der Krankheit (Andersen 1948). Feuchte und warme Bedingungen im Frühling sowie zur Blüte begünstigen eine Infektion, da die Entwicklung der Perithecien auf Pflanzenrückständen gefördert wird und Ascosporen zeitgleich mit der Blüte der Getreidepflanzen entlassen werden. Die Sporen sowie die Konidien der Erreger werden durch aufprallende Wassertropfen oder durch Wind auf die Ähren übertragen. Sowohl Ascosporen als auch Konidien keimen bei genügend Feuchtigkeit innerhalb 3 bis 6 Stunden (Bushnell et al. 2003). Auch für die weitere Entwicklung benötigt das Pathogen Feuchtigkeit, besonders die Frühstadien der Infektion sind auf ausreichend Feuchtigkeit angewiesen (Andersen 1948). Die höchste Anfälligkeit für FHB im Laufe der Entwicklung der Weizenpflanze ist während der Blüte (Andersen 1948; Bushnell et al. 2003; Mesterhazy 2003a; Schroeder and Christensen 1963; Siou et al. 2014). Durch Wasseraufnahme und darauffolgendes Anschwellen der Lodiculae öffnet sich das Blütchen, die Antheren platzen und werden ausgestoßen. Sporen und Konidien des Pathogens können nun leichter eindringen und über die Besiedelung der Antheren und der Filamente ins Innere des Blütchens gelangen, wo sie die nach der Befruchtung seneszenten Antheren besiedeln (Bushnell et al. 2003). Auch nach der Anthese bleiben die Ährchen bis zur Teigreife (BBCH 85) sehr anfällig für eine Infektion (Andersen 1948; Schroeder and Christensen 1963). Da die Zeitspanne für eine Infektion beschränkt ist, hat Fusarium spp. nur einen Infektionszyklus pro Saison (Bai and Shaner 1994). Die FHB Ausprägung ist daher vom Primärinokulum abhängig (Dill-Macky and Jones 2000). 2.2.1 Infektionsweg und Krankheitsverlauf Die Infektion der Pflanze erfolgt über die Blütchen (Bushnell et al. 2003), Ascosporen oder Konidien werden von Pflanzenrückständen im Boden auf die blühenden Ähren verfrachtet (Pritsch et al. 2000). Nach Keimung der Konidien wachsen die Pilzhyphen zunächst unverzweigt über die Pflanzenoberfläche. Auf der Suche nach Eintrittspforten zum Inneren der 11 Blütchen formieren sie sich zu einem dünnen Myzel. Obwohl kein Appressorium gebildet wird, berichteten Pritsch et al. (2000), dass F. graminearum in der Lage ist, die Oberfläche der Ährchen zu penetrieren. Auf welchem Weg der Erreger ins Innere gelangt, wurde in mehreren Studien untersucht und ist dennoch nicht ganz geklärt, mögliche Zugänge sind über die ausgestoßenen Antheren, die Öffnung zwischen den Deckspelzen und die Stomata in den Spelzen (Bushnell et al. 2003; Lewandowski et al. 2006; Pritsch et al. 2000). Pugh et al. (1933) entdeckten, genauso wie vor ihnen schon Strange und Smith (1971) eine positive Korrelation zwischen Infektionsrate und dem Phänomen von teilweise ausgestoßenen Antheren, welche sich zwischen den Spelzen verfangen und somit offensichtlich eine gute Eintrittspforte bieten. Untersuchungen von Bai (1995) und Stack (1989) (in Bushnell et al. 2003) zufolge, führen schon einige wenige Makrokonidien die ins Innere eines Blütchens gelangen mit großer Wahrscheinlichkeit zu einer Infektion. Die ersten Strukturen die innerhalb einer Blüte vom Pathogen besiedelt werden sind Antheren, Stigmen, und Lodiculae, sowie etwas später der Fruchtknoten (Tu 1950). Pritsch et al. (2000) entdeckten, dass nach Penetration des Gewebes das Hyphenwachstum sowohl subkutikular als auch intrazellulär im Parenchym erfolgen kann. Eine Studie von Brown et al. (2010) zeigte, dass F. graminearum in der Lage ist, innerhalb weniger Tage nach Infektion sowohl interzellulär als auch intrazellulär eine große Masse an Hyphen zu bilden und fast jeden Zelltyp im Ährchen und in der Ährenspindel besiedeln kann. An der Basis des infizierten Blütchens gelangen die Hyphen des Pilzes durch Besiedelung der Rachilla mittels intrazellulärem Wachstum in das Leitgewebe, um sich von dort aus über die Ährenspindel und die Spindel-Nodien weiterzuverbreiten (Brown et al. 2010; Ribichich et al. 2000). Die Ausbreitung des Pathogens von einem Ährchen zum nächsten erfolgt hauptsächlich über die vaskulären Gefäße in der Ährenspindel und den Spindel-Nodien (Ribichich et al. 2000; Tu 1950). Das sich ausbreitende Myzel stammt aus keimenden Ascosporen oder Makrokonidien, kann aber auch aus infizierten Blütchen durch die Stomata hinauswachsen (Ribichich et al. 2000). Die Kornanlagen werden über den - direkt nach der Befruchtung ungeschützten - Fruchtknoten befallen. Über die Penetration der Epidermis des Fruchtknotens gelangt das Pathogen in das sich entwickelnde Endosperm (Pugh et al. 1932). Bereits 48 bis 76 Stunden nach der Erstinfektion hat der Pilz voll entwickelte Konidien an Konidiophoren produziert, welche die Infektion weitertragen (Pritsch et al. 2000). Ribichich et al. (2000) entdeckten, dass der Pilz Veränderungen im vaskulären System und im Gewebe hervorruft. Die Zellwände verdicken sich, Ablagerungen und Hyphen verursachen eine Verstopfung der Gefäße. Letztendlich werden Chlorenchym, Phloem und Phloem-Parenchym durch das Eindringen des Pilzes zerstört und verlieren ihre Funktion (Brown et al. 2010; 12 Ribichich et al. 2000). Laut Tu (1950) ist das Phloem das meist durchwachsene Gefäß innerhalb des Leitsystems. Abbildung 1: Fusarium graminearum Infektionszyklus (Trail 2009) 2.2.2 Symptome Zwei bis vier Tage nach der Infektion treten erste sichtbare Läsionen an den Spelzen und in weiterer Folge an den Karyopsen auf (Andersen 1948; Lewandowski et al. 2006). Die Läsionen erscheinen meist als unregelmäßige, punktuelle bräunliche Verfärbungen, oft auch mit ausgebleichtem Zentrum und braunen Rändern (Bennett 1931). Unter feuchten Bedingungen erscheinen die Läsionen zuerst als wassergetränkte Spots, welche sich später braun färben und ausbleichen (Atanasoff 1920; Pugh et al. 1933). Bei fortgeschrittenen Infektionen erscheinen durch Myzel- und Makrokonidienproduktion die Spelzen und Blütchen, vor allem an den Rändern, rosa-rötlich gefärbt (Atanasoff 1920; Pugh et al. 1933). Auch unter den Spel13 zen an den Ährenspindel-Nodien werden oft gefärbte Myzel-Anhäufungen gefunden (Brown et al. 2010). Die Läsionen vergrößern sich und gesamte Blütchen verfärben sich bräunlich und bleichen schließlich aus (Bushnell et al. 2003). In Weizen breiten sich die Krankheitssymptome von den infizierten Ährchen ausgehend sowohl apikal als auch basal aus. Durch die verstopften Leitgefäße in der Spindel ist der Teil der Ähre, der sich über der Infektion befindet, meist gezwungen frühzeitig abzureifen. Dies führt auch bei nicht direkt infizierten Blütchen zu schlechter Kornausbildung durch mangelnde Versorgung von Wasser und Nährstoffen (Bushnell et al. 2003; Schroeder and Christensen 1963). Wenn die Ähren sehr früh und mit hohen Inokulummengen befallen werden, findet oft gar keine Kornentwicklung statt (Bai and Shaner 1994) und resultiert im Krankheitsbild der Taubährigkeit. An den Weizenkörnern selbst verursacht eine Infektion mit FHB vorerst braune Flecken. Bei starker Infektion kann das gesamte Korn mit Myzel überzogen sein, die Körner bleichen aus und haben ein verschrumpeltes Aussehen (Bushnell et al. 2003; Shaner 2003). Sowohl Größe als auch Anzahl der gebildeten Körner ist reduziert (Andersen 1948; Bushnell et al. 2003), was teilweise auf die frühzeitigen Abreifeerscheinungen aufgrund der abgeschnittenen Wasser und Nährstoffzufuhr zurückzuführen ist (Atanasoff 1920; Bennett 1931). 2.2.3 Toxine Verschiedenste Fusarium-Gattungen sind in der Lage giftige Stoffwechselprodukte, so genannte Mykotoxine, zu bilden, die im Korn eingelagert werden können (Bottalico 1998). Mykotoxine spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese und der Ausbreitung der Pilzinfektion. Der Übergang vom biotrophischen zum nekrotrophischen Stadium des Pilzes wird unter anderem durch die Produktion von phytotoxischen Mykotoxinen eingeleitet (Bushnell et al. 2003; Nathanail et al. 2015). Die in Europa am häufigsten auftretenden Mykotoxine in Bezug auf Ährenfusariose sind Deoxynivalenol und Zearalenon, produziert von F. graminearum, welches vor allem in wärmeren Regionen vorherrscht und F. culmorum, welches in den kühleren Gebieten vermehrt auftritt (Bottalico and Perrone 2002). Die in Europa wichtigsten und am häufigsten vorkommende Mykotoxine in Assoziation mit FHB sind Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZON). DON wird vor allem von F. graminearum und F. culmorum produziert. Auf infizierten Pflanzen finden sich oft mehrere verschiedene Mykotoxin-Arten nebeneinander (Bottalico 1998; Bottalico and Perrone 2002). T-2 Toxin-Derivate werden in erster Linie von F. sporotrichioides und F. poae produziert (Bottalico and Perrone 2002). Mykotoxine, die von F. sporotrichioides produziert werden, gehören zu den toxischsten bekannten Verbindungen (Liddell 2003). 14 Die Mykotoxine, die von den Fusarium-Arten, welche in dieser Arbeit untersucht wurden, gebildet werden, sind in Tabelle 1 aufgelistet (Bottalico 1998). Tabelle 1: Mykotoxinproduktion von F. graminearum und F. sporotrichioides auf Getreide Fusarium spp. Mykotoxine F. graminearum DON, ZON, NIV, FUS, AcDON, DAcDON, DAcNIV F. sporotrichioides T2, HT2, NEO, MAS, DAS Die am häufigsten auftretenden Mykotoxine, welche von Fusarium spp. unter natürlichen Infektionsbedingungen in Getreide produziert werden, gehören hauptsächlich drei strukturellen Gruppen an: Trichothecene, Zearalenone und Fumonisine (Bottalico 1998). 2.2.3.1 Trichothecene Trichothecene sind zyklische Sesquiterpene welche über Trichodiene im Stoffwechsel der Pilze synthetisiert werden. Sie enthalten eine olefinische Gruppe an den Kohlenstoffatomen 9,10 und eine Epoxyd-Gruppe zwischen den Kohlenstoffatomen 12 und 13 welche charakteristisch für diese Gruppe ist (Chester et al. 2003). Die Typ-B-Trichothecene sind charakterisiert durch eine Ketogruppe auf C-8 und werden daher 8-Ketotrichothecene genannt. Das Fehlen dieser Ketogruppe ist das Kennzeichen der Typ-A-Trichothecene (Chester et al. 2003). Trichothecene sind farblos, meist kristallin und löslich in polaren organischen Lösungsmitteln aber nur wenig löslich in Wasser (Chester et al. 2003). Trichothecene wirken als starke Inhibitoren der Protein-Synthese in Eukaryoten. Es wird angenommen, dass nach der Infektion in der befallenen Pflanze gebildete Trichothecene die Expression von Abwehr-Proteinen unterdrücken. Trichothecene sind phytotoxisch. Sie verursachen Chlorosen, Nekrosen und Welkeerscheinungen in Pflanzengewebe (Lemmens et al. 2005). Die Fähigkeit, phytotoxische Trichothecene, allen voran DON, zu produzieren, wird als möglicher Virulenz-Faktor in Hinsicht auf die Pathogenität von Fusarium spp. betrachtet (Buerstmayr et al. 2012; Lemmens et al. 2005). 15 Tabelle 2: Überblick über die Mykotoxingruppe der Trichothecene Trichothecene Typ A-Trichothecene T-2 Toxin (T2) HT-2 Toxin (HT2) Diacetoxyscirpenol (DAS) Monoacetoxyscirpenol (MAS) Neosolaniol (NEO) Typ B-Trichothecene Deoxynivalenol (DON) 3-AcDON,15-AcDON (mono-acetyliert) 3,15-AcDON (di-acetyliert) Nivalenol (NIV) 4,15-AcNIV (di-acetyliert) Fusarenone X (FUS) Trichothecene können bei Tieren und Menschen Vergiftungserscheinungen auslösen, die sich unter anderem in Hautentzündungen, Verdauungsproblemen, Organblutungen, hämolytischen Erkrankungen, Abbau des Knochenmarks sowie Beeinträchtigungen des Immun- und Nervensystems äußern können. Mit Trichothecenen kontaminiertes Futter verursacht bei Nutztieren Mykotoxikose. Hier spielen vor allem T-2, DAS, MAS (Typ A) und DON, NIV und FUS (Typ B) eine Rolle. Für den Menschen besteht eine reelle Gefahr vor allem beim Verzehr von mit T-2 und DON kontaminierten Nahrungsmitteln. Da Trichothecene in erster Linie als effektives Zellgift wirken und dadurch die Zellen zerstören, bevor sie mutagene Effekte auslösen könnten, werden sie laut IARC als nicht karzinogen eingestuft (Bottalico 1998). Deoxynivalenol Deoxynivalenol gehört zu den Typ-B-Trichothecenen und ist eines der wichtigsten Toxine. DON wurde erstmals 1973 in Japan entdeckt und ist auch unter dem Namen Vomitoxin bekannt, da der Verzehr von kontaminiertem Getreide bei Schweinen zu Erbrechen führte. Die Bildung von DON wurde lange nur mit F. graminearum assoziiert, 1993 fanden Abramson et al. heraus, dass unter anderem auch die Arten F. avenaceum, F. crookwellense, F. culmorum, F. equiseti, F. poae und F. sporotrichioides DON produzieren. Von DON gibt es vielfäl16 tige Derivate, unter anderem die unter natürlichen Bedingungen häufig vorkommenden Formen 3-AcDON und 15-AcDON (Chester et al. 2003). Die Produktion von DON gilt möglicherweise als Virulenz-Faktor für FHB (Buerstmayr et al. 2012). In der EU-Verordnung EG 1881/2006 sind verschiedene Höchstwerte unter anderem für Deoxynivalenol festgesetzt. Für unverarbeiteten Weizen gilt aktuell ein Grenzwert von 1250 µg/kg. (Kommission 2006) T-2 und HT-2 Die beiden Toxine sind sich sehr ähnlich, HT-2 ist die deacetylierte Form von T-2, ihm fehlt die Acetyl-Gruppe an C-4. Fusarium langsethiae, F. poae, und vor allem F. sporotrichioides sind die Hauptproduzenten von T-2 und HT-2 die am häufigsten in kühleren und feuchteren Regionen auftreten. Die Toxine blockieren die Protein-Synthese sowie die Zellteilung in Pflanzengewebe und verursachen wie die meisten Trichothecene akute oder chronische Vergiftungserscheinungen in Tieren und Menschen. Es kann zu Wachstumsverzögerungen, Veränderungen des Knochenmarks, Abbau der roten Blutkörperchen und bei Hautkontakt zu nekrotischen Läsionen führen (Nathanail et al. 2015). Aufgrund des toxischen Potentials hat die EFSA (European Food Safety Authority) eine Aufnahme von 100 ng/kg Körpergewicht für die Summe aus T-2 und HT-2 als täglich tolerierbare Menge (TDI) festgelegt (Nathanail et al. 2015). Auch die EU-Kommission hat 2013 in der Empfehlung 2013/165/EU Richtwerte für die Höchstwerte der Summe aus T-2 und HT-2 abgegeben, neben Richtwerten für den menschlichen Verzehr und Futtermittel enthält die Empfehlung auch Richtwerte für unverarbeitetes Getreide. Für Weizen liegt der Wert hier bei 100 µg/kg, ab diesem Wert sollen weitere Untersuchungen durchgeführt werden. 2.2.3.2 Zearalenone Zearalenon (ZON) und seine Derivate gehören zu den am weitverbreitetsten Mykotoxinen in Agrarprodukten und werden hauptsächlich von F. graminearum und F. culmorum produziert (Bottalico and Perrone 2002). Vor allem in Mais kann es sehr hohe Konzentrationen aufweisen. Es handelt sich um eine östrogen wirkende Verbindung die Veränderungen am Uterus hervorrufen kann, welche vor allem bei Schweinen zu Reproduktionsproblemen führen können. Mit dem Futter aufgenommenes ZON verursacht wiederkehrende Toxikose, Hyperöstrogenismus und dessen Folgen bei Schweinen, Unfruchtbarkeit und geringe Leistungsfähigkeit bei Rindern und Geflügel. Auch ein möglicher Einfluss auf die menschliche Gesundheit 17 wird nicht ausgeschlossen, ZON wurde jedoch als nicht karzinogen eingestuft (Bottalico 1998). 2.2.3.3 Fumonisine Es existieren drei Kategorien von Fuminosinen A, B und C. Jede Kategorie enthält 4 Stoffe: Tabelle 3: Überblick über die Mykotoxingruppe der Fumonisine A-Fumonisine FA1 FA2 FA3 FA4 B-Fumonisine FB1 FB2 FB3 FB4 C-Fumonisine FC1 FC2 FC3 FC4 Die Kategorie B enthält dabei die aktivsten Toxine, allen voran FB1. Futtermittel die mit FB1 kontaminiert sind, verursachen Leukenzephalopathie bei Pferden, Lungenödeme und Niereninsuffizienz bei Schweinen, Leistungsabnahme bei Geflügel sowie Veränderungen der Leber und Störungen der Immunfunktion bei Rindern. Bei Menschen wurde ein Zusammenhang von Speiseröhrenkrebs und FB1 nachgewiesen. Fumonisine sind als kanzerogen wirkend eingestuft (Bottalico 1998). Weitere von Fusarium-Pilzen produzierte Mykotoxine sind Moniliformin (MON), Beauvericin (BEA) und Fusaproliferin (FUP) (Bottalico 1998). 2.2.4 Bedeutung und Konsequenzen FHB ist eine weltweit verbreitete Pilzkrankheit die bei anhaltenden feuchten Wetterbedingungen während der Blüte und Kornfüllungsphase in allen Lagen vorkommen kann. Schwere Ausbrüche von epidemischem Ausmaß sind seit Anfang des 20. Jahrhunderts vor allem in 18 den USA, Kanada, Argentinien, China und Südkorea dokumentiert. Wie 1993 in den USA, kann Ährenfusariose an Weizen bei entsprechenden Umweltbedingungen in Beständen von potentiellen Hochleistungs-Weizensorten zu einem Totalausfall des Ertrags führen (McMullen et al. 1997). FHB ist international von großer Bedeutung. Der negative Einfluss auf Kornerträge, Qualitätseigenschaften und Saatgutqualität, Mykotoxingehalte sowie die dadurch resultierenden geringeren Marktpreise, führen zu hohen ökonomischen Verlusten im landwirtschaftlichen Sektor (Bai and Shaner 1994; McMullen et al. 1997). Ein erhöhter Anteil an FDK Schmachtkörnern beeinträchtigt das Hektolitergewicht (McMullen et al. 1997). Auch hinsichtlich der Saatgutqualität entstehen indirekte Verluste durch die verminderte Keimfähigkeit und das erhöhte Auftreten von Auflaufkrankheiten (Bai and Shaner 1994). Ein Befall mit FHB führt zu einem geringeren Kornertrag sowie einer Belastung mit Mykotoxinen (Kubo et al. 2014). Fusariumbefall hat daher einen direkten negativen Effekt auf die Erntemenge, sowie die Kornqualität. Die Kornqualität wird durch FHB stark reduziert. Geschädigte Weizenkörner haben einen reduzierten Gehalt an Stärke, Cellulose und Hemicellulose. In mehreren Untersuchungen wurde eine veränderte Proteinzusammensetzung festgestellt, vor allem der Gluteningehalt erwies sich als stark reduziert, was zu deutlich verschlechterten Backeigenschaften führt (Boyacioglu and Hettiarachchy 1995; Dexter and Nowicki 2003). Vermarktung, Export, Verarbeitung und Verfütterung sind nur unter erschwerten Bedingungen möglich. Das größte Problem in Bezug auf eine FHB-Infektion ist die Kontamination des Ernteguts mit den vom Fusarium-Pilz produzierten Mykotoxinen. Die Toxine sind giftig für Mensch und Tier und können erhebliche Gesundheitsprobleme verursachen (Buerstmayr et al. 2012). Vor allem unter der Gruppe der Trichothecene befinden sich problematische Toxine die zu Vergiftungserscheinungen, Verdauungsproblemen und Verweigerung der Futteraufnahme führen. Auch für den Menschen besteht Gefahr einer Mykotoxikose, wenn kontaminierte Getreideprodukte konsumiert werden. Manche Mykotoxin-Verbindungen stehen im Verdacht krebserregend zu sein (Bottalico 1998; Bottalico and Perrone 2002). Momentan liegt das Hauptaugenmerk hinsichtlich Nahrungsmittelsicherheit und Gesundheitsgefährdung in Bezug auf FHB-Problematik auf den Gehalten an Trichothecenen und Zearalenon von betroffenen Getreide (Dexter and Nowicki 2003). Verschiedene Institute wie 19 die EFSA oder die Europäische Kommission haben Höchstgrenzwerte bzw. Empfehlungen für Richtwerte bezüglich Mykotoxinen herausgegeben. Die Qualitätskontrollen bezüglich Nahrungsmittelsicherheit verschärfen sich und auch die Anforderungen der Konsumenten an sichere Lebensmittel und Inhaltsstoffe werden immer höher (Dexter and Nowicki 2003; McMullen et al. 1997). Nach der Ernte werden in der Regel schon beim ersten Aufkäufer die angelieferten Weizenpartien mittels Schnelltestern auf erhöhte Mykotoxinwerte kontrolliert. Genauere Analysen und laufende Kontrollen erfolgen dann in den Labors der verarbeitenden Industrie wie Mühlen, Futtermittelherstellern und Nahrungsmittelindustrie. Obwohl es für Vermarkter bzw. Industrie teilweise Maßnahmen gibt um die Mykotoxingehalte zu reduzieren, lassen sie sich nicht gänzlich eliminieren (Dexter and Nowicki 2003). Weizenpartien mit Mykotoxingehalten oberhalb der erlaubten Höchstgrenze sind unverkäuflich bzw. werden nur mit hohen Preisabschlägen gehandelt. FHB hat nachteilige Effekte auf die Vermahlungsfähigkeit des Weizens, auf die Mehleigenschaften sowie die Qualität des Endprodukts (Dexter and Nowicki 2003; McMullen et al. 1997). 2.2.5 Kontrolle von FHB Es gibt mehrere Strategien um gegen FHB vorzugehen. Für optimales FHB Management sollte man auf die Kombination mehrerer Maßnahmen setzten um auch bei epidemischen Auftreten von FHB sowohl den Schweregrad der Krankheit, als auch den Mykotoxingehalt so gering wie möglich zu halten (McMullen et al. 2008). Pflanzenzüchterische Maßnahmen Die effektivste sowie nachhaltigste Lösung des FHB-Problems wäre die Entwicklung einer resistenten Sorte (Paulitz 1999; Prat et al. 2014). Weltweit sind Pflanzenzüchter im Bereich der Resistenzzüchtung auf der Suche nach resistenten Weizensorten bzw. –linien. Aktuell ist kein Material von T. aestivum bekannt, das vollständige Resistenzen gegenüber FHB besitzt (Buerstmayr et al. 2012). Die meisten kommerziellen Sorten haben eine gemäßigte bis hohe Anfälligkeit für FHB (Paulitz 1999). Mit einigen wenigen Sorten, die vielversprechende Resistenzeigenschaften aufweisen, wird intensive Forschung betrieben. Eine besondere Schwierigkeit besteht unter anderem darin, agronomisch wertvolle Sorteneigenschaften mit guten Resistenzeigenschaften in einem Genom zu vereinen (Bai and Shaner 1994; Buerstmayr et al. 2009). Durch konventionelle Selektion sowie molekularbiologische Methoden wie DNA-Marker und QTL-Mapping gelangen bereits große Fortschritte auf der Suche nach genetischer Resistenz 20 in Weizensorten (Buerstmayr et al. 2009). Auch in der Biotechnologie im Bereich der Gentechnik wird aktuell mit genetisch veränderten Weizenlinien geforscht, jedoch zurzeit nur mit geringen Erfolgen. Für die Überprüfung von Hypothesen und der Funktion möglicher Resistenz-Gene ist die Gentechnik jedoch ein wichtiges Werkzeug, welches auch in der Zukunft aus der Resistenzzüchtung nicht mehr wegzudenken sein wird (Buerstmayr et al. 2012). Pflanzenbauliche Maßnahmen Mit einigen wenigen Ausnahmen weisen die kommerziell genutzten Weizensorten eher geringe bis schlechte Resistenzen gegenüber FHB auf (Mesterhazy 2003b; Paulitz 1999). Bei der Vermeidung von FHB sollte in erster Linie auf eine abwechslungsreiche Fruchtfolge Wert gelegt werden. Vor allem wenn Weizen nach Mais angebaut wird, ist die Anfälligkeit für FHB sehr hoch, da sich die Ascosporen von Gibberella zeae über Ernterückstände übertragen und eine effektive Inokulumquelle darstellen (Dill-Macky and Jones 2000). In diesem Fall ist das Risiko für eine FHB Epidemie zwei- bis dreifach erhöht (Dill-Macky and Jones 2000; Mesterhazy 2003b). Um Inokulumquellen auf Ernterückständen zu vermeiden, ist die Planung der optimalen Fruchtfolge wichtig. Der Anbau von Weizen nach Weizen oder Mais ist kontraproduktiv. Die Fruchtfolge sollte durch Anbau von Nicht-Wirtspflanzen durchbrochen werden (Dill-Macky and Jones 2000). Die Menge an Inokulum, das für eine mögliche Infektion von FHB zur Verfügung steht, ist abhängig von der Menge an vorhandenen Ernterückständen (Dill-Macky and Jones 2000). Der Infektionsdruck kann daher verringert werden, indem man die Ernterückstände beseitigt bzw. einarbeitet. Konservierende Bodenbearbeitung sowie no-tillage Systeme erhöhen die Wahrscheinlichkeit für eine Epidemie signifikant und sind ungeeignet um Inokulumquellen zu reduzieren. Die besten Ergebnisse werden mit wendender Bodenbearbeitung, also mit Pflugeinsatz erzielt (Dill-Macky and Jones 2000; Mesterhazy 2003b). McMullen et al. (1997) führen das wiederholte epidemische Auftreten von FHB seit 1993 in der U.S. Region Upper Midwest unter anderem auf einen starken Anstieg von Ackerflächen mit konservierender Bodenbearbeitung zurück. Mit Fusarium kontaminiertes Saatgut führt zwar nicht zur Bildung von Primärinokulum für FHB, jedoch zu indirekten Verlusten durch verschlechterten Saataufgang und infizierten Keimlingen, welche dann faulen und absterben („Seedling Blight“) (Bai and Shaner 1994; Shaner 2003). Saatgutbeizungen mit Fungiziden führen zwar zu einer Reduktion von samenbürtigem Inokulum und erhöhen die Widerstandskraft der Keimlinge, haben jedoch nur wenig Effekt auf FHB wegen der großen Anzahl an Inokulum auf Ernterückständen (Bai and Shaner 1994). 21 In mehreren Freilandversuchen mit verschiedenen N-Düngern zeigten Lemmens et al. (2004), dass eine Stickstoff-Düngung Auswirkungen auf die Intensität der FHB Ausprägung hat, wobei es keine Rolle spielt welcher N-Dünger verwendet wird und ob die Stickstoffquelle mineralischer oder organischer Herkunft ist. Mit gesteigerten N-Gaben erhöht sich auch der Schweregrad der FHB Ausprägung. Bei höheren N-Ausbringungsmengen über 80 kg N pro Hektar - wie es auch für den modernen Ackerbau relevant ist - blieben die Werte jedoch konstant. Das erhöhte Auftreten von FHB ist eher auf das veränderte feuchtere Mikroklima zurückzuführen, das durch das dichtere Pflanzenwachstum und die vermehrte Blattmasse entsteht, als auf die Stickstoffdüngung per se. Maßnahmen innerhalb des Stickstoffmanagements sind daher ungeeignet um FHB einzudämmen (Lemmens et al. 2004; Leplat et al. 2013). Chemische Maßnahmen Vor allem bei regnerischem Wetter während oder vor der Blüte sollte eine chemische Pflanzenschutzmaßnahme stattfinden. Unter natürlichen Bedingungen ist ein Infektionsrisiko bei über 5mm Niederschlag pro Tag gegeben. Ein Fungizideinsatz soll nicht nur die Infektion und Ausbreitung der Krankheit stoppen bzw. verhindern, sondern auch die MykotoxinKontamination des Ernteguts so gering wie möglich halten (Mesterhazy 2003b). Wirksamkeit des Fungizids, zeitgerechtes Timing und Effizienz der Applikation sind für einen effektiven Pflanzenschutz mit chemischen Mitteln notwendig. Die besten Resultate werden erzielt, wenn die Fungizide gegen FHB während der vollen Blüte appliziert werden und die Spritzbrühe von zwei Seiten auf die Ähren ausgebracht wird (z.B. mit einer Doppelflachstrahldüse) (Mesterhazy 2003b). Laut Yoshida et al. (2012) ist 20 Tage nach der Blüte im Stadium der späten Milchreife (BBCH 77) ein kritischer Zeitpunkt bezüglich der Mykotoxinkontrolle, hier kann man mit einer Fungizid-Spritzung noch den DON-Wert reduzieren. Vor allem die Wahl des richtigen Zeitpunkts für eine Fungizidapplikation ist von großer Bedeutung für einen Erfolg der Pflanzenschutzmaßnahme. Die Applikation sollte während der Blüte stattfinden, vor allem die Benetzung der Antheren mit der Spritzbrühe ist essentiell (Mesterhazy 2003b). Systemische Fungizide wie Triazole oder Strobilurine verlagern ihre Wirkstoffe nur in geringen Spuren von den Blättern in die Ähren. Kontaktfungizide werden vom Saftstrom nicht aufgenommen. Der früheste Termin für eine Spritzung ist daher wenn alle Ähren erschienen und voll entwickelt sind (Mesterhazy 2003b). Laut Mauler-Machnik und Suty (1997) sollte eine Spritzung maximal 1-2 Tage vor oder nach einer möglichen Infektion stattfinden um die Wirksamkeit zu gewährleisten. D’Angelo et al. (2014) hingegen postulierten nach Feldversuchen in Ohio und lllinois, dass eine Fungizidapplikation auch bis zu 6 Tage nach der Anthese gleich gute Ergebnisse erzielt. Der Einsatz von Netzmitteln erhöht die 22 Wirksamkeit von Tebuconazol und Propiconazol. Auch eine Ausbringung mit höherem Spritzdruck erwies sich als vorteilhaft (Mesterhazy 2003b). Die Wirkstoffkombination Tebuconazol + Prothiconazol sowie Metconazol sind aktuell die zwei effektivsten Fungizide gegen FHB. Prothiconazol und Tebuconazol allein zeigen im Vergleich einen schwächeren Wirkungsgrad. Hinsichtlich einer DON-Reduzierung erwies sich Metconazol am wirkungsvollsten (Paul et al. 2008). Um Resistenzbildungen des Pathogens zu vermeiden sollten die Wirkstoffgruppen abgewechselt werden (Mesterhazy 2003b). Biologische Maßnahmen Bezüglich der biologischen Kontrolle von FHB wird aktuell intensiv Forschung betrieben. Verschiedene Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen und Pilze, welche antagonistische Wirkungen auf Fusarium spp. haben bzw. haben sollen stehen im Mittelpunkt von verschiedensten Untersuchungen (Khan et al. 2004; Pirgozliev et al. 2003). Mit dem Biofungizid CLO-1 das den Pilzstamm Clonostachys rosea enthält, erzielten Xue et al. (2014) in neuesten Untersuchungen vielversprechende Erfolge sowohl im Glashaus, als auch in Freilandversuchen. Zur Praxistauglichkeit gibt es allerdings noch wenige Ergebnisse. In einem Review stellte Paulitz (1999) drei grundsätzliche Strategien zur biologischen Kontrolle von FHB vor: Beizung des Saatguts mit biologischen Pflanzenschutzmitteln Ausbringung von Mikroorganismen auf die Ähren kurz vor der Blüte welche vor einer Infektion mit FHB schützen bzw. unterdrücken sollen Ausbringung von Mikroorganismen auf die Ernterückstände, um diese schneller verrotten zu lassen und die Perithecien Ausbildung zu stören Die pflanzenschützende Wirkung besteht im Wesentlichen aus den Mechanismen Antibiose, Konkurrenz und Inhibition der Mykotoxinproduktion. 2.3 Resistenz Die aktuelle Forschungslage lässt darauf schließen, dass Resistenzeigenschaften von T. aestivum gegenüber Ährenfusariose weder von der Fusarium-Art (Fusarium spp.), noch von der Unterart (Fusarium sp. ssp.) bzw. dem Isolat abhängig sind (Buerstmayr et al. 2012). Ist eine Weizensorte gegenüber Fusarium graminearum resistent, kann auch angenommen werden, dass sie gegenüber allen anderen Fusarium-Arten resistent ist. Es gibt daher keine 23 Spezifität zwischen den verschiedenen Fusarium-Arten, es handelt sich um eine quantitative, horizontale Resistenz (Mesterhazy et al. 2005; Mesterhazy et al. 1999). 2.3.1 Resistenzmechanismen Resistenzen gegenüber Pathogenen sind komplexe Phänomene, die noch immer nicht gänzlich erforscht sind (Mesterhazy 2003a). Folgende Typen von aktiven Resistenzmechanismen gegenüber FHB sind zurzeit bekannt: 1. Resistenz gegenüber Erstinfektion (Schroeder and Christensen 1963) 2. Resistenz gegenüber Ausbreitung des Pathogens in infiziertem Gewebe (Schroeder and Christensen 1963) 3. Resistenz gegenüber Mykotoxinen (Miller et al. 1985) 4. Resistenz und Toleranz gegenüber Infektion der Körner (Mesterhazy 1995; Mesterhazy et al. 1999) 5. Toleranz gegen Fusarium Head Blight bzw. Ertragsreduktion (Mesterhazy 1995) Der Versuch, zwischen den Resistenz-Typen zu unterscheiden, ist ein wichtiger Ansatz um das Auftreten von Resistenzerscheinungen näher zu verstehen (Kubo et al. 2014). Für diesen Zweck wurden im Laufe der Zeit verschiedene Inokulationsmethoden entwickelt, siehe Punkt 2.4 Künstliche Inokulation. Resistenz gegenüber der Ausbreitung des Pilzes innerhalb einer Ähre (Typ 2) ist eine relativ stabile Eigenschaft und wird weniger von Umweltbedingungen beeinflusst als Resistenz gegenüber einer Erstinfektion (Typ 1) (Bai and Shaner 1994, 1996). Obwohl Resistenz gegen Ährenfusariose ein komplexes quantitatives Merkmal ist, wird Resistenz nach Typ 2 als Hauptmechanismus gesehen der von mehreren Genen kontrolliert wird (Bai and Shaner 1994). Seit den 80ern ist der Resistenzmechanismus nach Typ 3 bekannt und wird als eine Unempfindlichkeit von Genotypen gegenüber den Toxinen von Fusariumpilzen beschrieben, indem resistente Individuen die Fähigkeit besitzen, DON abzubauen (Wang and Miller 1988). Eine eigene Testmethode für diesen Resistenztyp wurde von Lemmens et al. (2005) entwickelt. Es besteht eine positive Korrelation zwischen Symptomausprägung von FHB an den Ähren, DON-Gehalten und Fusarium-befallenen Körnern (Bai et al. 2001; Kubo et al. 2014). Nach Mesterhazy et al. (1999) weisen manche Genotypen eine signifikant niedrigere Korninfektion auf, als es die Werte für die FHB-Infektion der Ähren erwarten ließe. Dieser zusätzliche Resistenzparameter entspricht dem Typ 4 der Resistenzmechanismen. Durch die gerin24 gere Infektion der Körner, ist das Erntegut dieser Genotypen weniger befallen als erwartet (Mesterhazy et al. 1999). Toleranz gegenüber Ährenfusariose kann auf verschiedenen Resistenzebenen beobachtet werden. Es handelt sich hierbei nicht um eine „Teil-Resistenz“, sondern um einen eigenen Resistenzmechanismus, den Mesterhazy et al. (1999) als Typ 5 beschreiben. Es ist anzunehmen, dass die einzelnen Typen selten als Reinform vorliegen und dass Resistenzen gegenüber FHB verschiedenen Kombinationen der Resistenzmechanismen unterliegen. Neben den aktiven Resistenzmechanismen gibt es auch mehrere passive Resistenzmechanismen, welche unabhängig von den physiologischen aktiven Resistenzkomponenten sind (Mesterhazy 2003a). Morphologische Merkmale wie Wuchshöhe, Blattabstand sowie Länge der Internodien beeinflussen die natürliche Verbreitung des Pathogens. Geringe Wuchshöhen, wenig Abstand der Blattetagen zueinander und kurze Internodien begünstigen eine Infektion durch Spritzer von auf Sporenmaterial aufprallenden Wassertropfen, in welchem Inokulum enthalten ist (Mesterhazy 1995; Parry et al. 1995; Zinkernagel et al. 1997). Einer Studie nach von Hilton et al. (1999) gibt es einen direkten Zusammenhang von Wuchshöhe und Anfälligkeit für Fusarium Head Blight, welche jedoch nicht nur mit der höheren räumlichen Entfernung vom Inokulummaterial zu tun hat. Es wird angenommen, dass bei kurzstrohigen Sorten die höheren Assimilatmengen in der Ähre zu einer höheren FHBAnfälligkeit führen. Laut Mesterhazy (1995) ist die Gefahr einer Fusarium-Infektion bei begrannten Weizensorten und –linien um 80% höher als bei jenen ohne Grannen. Gilsinger et al. (2005) beobachteten, dass Weizenlinien die eher offen blühen eine höhere Anfälligkeit für eine Fusarium-Infektion hatten. Blütchen, die sich während des Blühstadiums weiter öffneten, tendierten auch dazu länger geöffnet zu bleiben und daher einen Pathogeneintritt sowohl zeitlich als auch räumlich zu begünstigen. Ob das Ausmaß, in welchem die Antheren während der Blüte aus dem Ährchen ausgestoßen werden, einen möglichen Einfluss auf die Fusarium-Infektion hat, ist Thema mehrerer Untersuchungen (Graham and Browne 2009; Kubo et al. 2013a; Mesterhazy 2003a; Skinnes et al. 2010). Die aktuellste Studie von Kubo et al. (2013a) zeigt, dass sowohl Weizenlinien, bei denen die Antheren während der Blüte innerhalb des Ährchens verbleiben, als auch Linien mit einem kompletten und schnellem Antherenausstoß eine geringere FHB-Ausprägung aufweisen. Linien, bei denen der Ausstoß der Antheren nur teilweise stattfand, hatten die höchste Anfälligkeit für FHB. Dieser Umstand wird damit erklärt, dass, wenn die Staubbeutel 25 nur teilweise ausgestoßen werden und somit zwischen den Spelzen stecken, die Sporen direkt auf den Antheren landen und in weiterer Folge leicht den Keimling besiedeln können. Ohne Antherenausstoß hingegen müssen die Konidiosporen erst keimen und das Myzel muss sich seinen Weg zwischen den Spelzen hindurch bahnen um die Antheren zu erreichen. Wenn die Staubbeutel komplett ausgestoßen sind, können die Sporen zwar leicht die Antheren erreichen, das Infektionspotenzial ist aber dennoch verringert weil sich die Antheren außerhalb der Blüte befinden (Kubo et al. 2013a). Umstritten ist auch, ob die Betain- und Cholin-Verbindungen in den Antheren von Weizen das Hyphenwachstum des Fusariumpilzes stimulieren, oder nicht (Engle et al. 2004; Strange and Smith 1978). Ein weiteres morphologisches Merkmal mit möglichen Resistenzeigenschaften könnte die Ährchendichte innerhalb einer Ähre sein. Beobachtungen von Mesterhazy (2003a) lassen darauf schließen, dass eine dichte, sehr kompakt gebaute Ähre den Befall fördert, während eher lose Ähren das Gegenteil bewirken. Obwohl passive Resistenzeigenschaften insbesondere für anfällige Sorten und Linien wichtig sind, bieten sie bei hohem Infektionsdruck keinen Schutz vor Fusarium-Befall. Das züchterische Augenmerk sollte auf einer Erhöhung der aktiven Resistenzmechanismen liegen (Mesterhazy 2003a). 2.3.2 Resistenzherkunft Aktuell ist von T. aestivum kein genetisches Material bekannt das eine grundlegende FHBResistenz aufweist. Fast alle Resistenzquellen beinhalten nur eine Teil-Resistenz gegenüber dem Pathogen (Buerstmayr et al. 2012; Kubo et al. 2013b). Aktuell sind drei verschiedene „Gen-Pools“ für die Quellen von FHB-Resistenzen an hexaploidem Weizen bekannt (Buerstmayr et al. 2009): Sommerweizen aus Asien: unter anderem die Sorten Sumai-3 (China), Ning7840 (China), Ning8331 (China), Chockwang (Korea) Sommerweizen aus Brasilien: Frontana Frontana scheint eine Quelle für moderate Typ-1-Resistenz zu sein, dies ist wahrscheinlich zum Teil auf die morphologischen Eigenschaften wie stabile Spelzen und eher geschlossenes Blühverhalten der Sorte zurückzuführen (Buerstmayr et al. 2009). Winterweizen: verschiedenste Sorten aus Europa, Japan, USA 26 Der wahrscheinlich höchste Level an FHB Resistenz existiert möglicherweise in China und Japan in der Sorte Sumai-3 und deren Nachkommen und verschiedensten Landsorten (Bai and Shaner 2004). Resistenzen in tetraploidem Durumweizen sind bis heute kaum bekannt. Obwohl T. durum einige Allele mit resistenzsteigernden Eigenschaften besitzt, ist der Großteil der DurumSorten hoch anfällig für FHB (Prat et al. 2014; Stack et al. 2002). Auch in den Genomen nah verwandter Arten wie Triticum spelta, Triticum dicoccum, Triticum dicoccoides oder Triticum macha werden aktuell neue Resistenzquellen gesucht (Buerstmayr et al. 2003; Cai et al. 2005; Prat et al. 2014). 2.3.3 Vererbbarkeit Hilton et al. (1999) fanden in einem Feldversuch mit zwergwüchsigen und hochwüchsigen Sorten heraus, dass die Anfälligkeit von Winterweizen für FHB ein quantitativer Charakter ist, dessen Expression von mehreren Genen kontrolliert wird. Sie nahmen an, dass die Krankheitsanfälligkeit in verschiedenen Genotypen nicht nur von der Wuchshöhe, sondern von anderen unabhängigen Genen beeinflusst wird. Sie stellten eine klare Tendenz von Hochwüchsigkeit und FHB-Resistenz fest, sich in der F3-Generation aufzuspalten. Sie schlossen daraus, dass eine genetische Basis für diese Beziehung besteht. Dabei könnte es sich entweder um Genkopplung zwischen einem oder mehreren Genen welche die Resistenz hervorrufen, oder um Pleiotropie handeln, wobei Gene die Kurzstrohigkeit fördern auch Anfälligkeit gegenüber FHB fördern könnten. Die Anwesenheit der dwarfing-genes Rht1 und Rht2 erhöhten die Krankheitsausprägung signifikant. Es wurde jedoch kein Unterschied zwischen den beiden Genen nachgewiesen. Genkopplung scheint die wahrscheinlichste Erklärung für die Beziehung zwischen Schweregrad des FHB-Befalls und Wuchshöhe zu sein (Hilton et al. 1999). Additive Effekte werden als Ursache der genetischen Varianz für FHB-Resistenz in den meisten Fällen angesehen, obwohl Dominanz und Epistase in manchen Fällen auch eine Rolle spielen. Durch Selektion von transgressiven Nachkommen sollte es möglich sein, die Resistenz-Gene aus verschiedenen Quellen in einer Sorte zu vereinen (Bai et al. 2000). Resistenz gegenüber FHB in Weizen ist beständig, kein Einbruch der Resistenzleistung ist bekannt (Buerstmayr et al. 2012). Verschiedenste Studien befassen sich mit der Identifikation von Quantitative Trait Loci (QTL) für zugehörige Resistenzmechanismen und mit QTLs, die pleiotropische Effekte auf Resistenzkomponenten haben. Weiterhin wird versucht, ein Zusammenhang zwischen QTLs, wel27 che Resistenzen ausprägen und QTLs, die morphologische Eigenschaften beeinflussen herzustellen. QTLs für FHB Resistenzeigenschaften wurden auf allen Chromosomen von Weizen gefunden, mit Ausnahme des Chromosoms 7D. Die meist gefundenen QTLs sind eindeutig Fhb1 auf dem Chromosom 3BS, Qfhs.ifa-5A auf 5AS und Fhb2 auf dem Chromosom 6BS (Buerstmayr et al. 2009). In europäischem Winterweizen wurden die wichtigsten QTLs wiederholt auf den Chromosomen 1BL (Qfhs.lfl-1BL), 6AL (Qfhs.lfl-6AL) und 7BS (Qfhs.lfl-7BS) gefunden (Buerstmayr et al. 2012). 2.4 Künstliche Inokulation Um quantitative Resistenzeigenschaften zu untersuchen, benötigt man reproduzierbare Inokulationsmethoden und quantifizierbare Krankheitsbonituren. Für die praktische Pflanzenzüchtung sollte ein Versuch einfach, billig, schnell und auch auf größere Pflanzenpopulationen anwendbar sein. Sich auf natürliche Krankheitsausbrüche zu verlassen, funktioniert nur in Lagen in denen die Krankheit regelmäßig auftritt, aber auch hier gibt es keine Garantie dafür, dass Infektionen auftreten und der Infektionsdruck gleichmäßig über den Versuch verteilt ist. Daher wird in den meisten Fällen eine Fusarium-Infektion mittels künstlicher Inokulation induziert (Buerstmayr et al. 2012). Fusarium-Isolate werden aus auf natürlichem Wege befallenem Kornmaterial gewonnen. Vor der Isolation der Fusarium-Arten werden die Körner desinfiziert und die Spezies bestimmt. Danach kann die Massenproduktion auf bestimmten Substraten erfolgen, hierfür gibt es verschiedene Methoden (siehe Material und Methoden). Für die Infektion von Weizen können Makrokonidien, Myzel sowie Ascosporen von Fusarium spp. benutzt werden, die Art des Inokulums beeinflusst nicht die Aggressivität des Isolates (Buerstmayr et al. 2012). Um zwischen den aktiven Resistenzmechanismen nach Typ 1 und Typ 2 zu unterscheiden, wurden verschiedene Inokulationsmethoden entwickelt: „kernel-spawn“-Methode: Verteilung von mit Gibberella besiedelten Getreidekörnern im Versuchsfeld. Die Infektion tritt natürlich auf und Ascosporen-Inokulum wird über längere Zeit bereitgestellt. Diese Methode wird eingesetzt um Populationen in einem größeren Rahmen zu überprüfen (Buerstmayr et al. 2012). Sprüh-Inokulation: um sicherzugehen, dass jede Pflanze dieselbe Menge an Inokulum erhält und auch jede Pflanze sicher inokuliert wird, wird während der Blüte eine Sporen28 suspension auf die Ähren gesprüht. Dies kann für einzelne Parzellen erfolgen oder (wie auch im vorliegenden Versuch) an mehreren Terminen für den gesamten Versuch (Miedaner et al. 2006). Einzelblüten-Inokulation: Hierbei wird im Frühstadium der Blüte Inokulum mit Hilfe einer Injektionsspritze oder einer Mikropipette in ein zentrales Ährchen appliziert. Mit dieser Methode erzielt man die sichersten Ergebnisse um die Resistenz eines Genotyps zu bewerten, da im Glashaus relativ stabile Verhältnisse herrschen und variable Umwelteinflüsse weitgehend ausgeschaltet werden können (Bai and Shaner 1996; Schroeder and Christensen 1963; Wang and Miller 1988). Die „kernel-spawn“-Methode und die Sprüh-Inokulations-Methode werden eingesetzt um generelle Feldresistenzen zu bewerten, als auch um eine Kombination zwischen Typ 1 und Typ 2 der Resistenzmechanismen zu untersuchen. Mit der Einzelblüten-Inokulation wird hauptsächlich die Verbreitung der Symptome nach dem Resistenztyp 2 untersucht (Buerstmayr et al. 2012). 29 3 Material und Methoden 3.1 Pflanzenmaterial Für den Feldversuch wurden insgesamt 190 verschiedene Winterweichweizensorten und Zuchtlinien verwendet. Der Versuch wurde in Kooperation mit französischen Pflanzenzuchtfirmen durchgeführt. Das Saatgut wurde von 4 verschiedenen Institutionen zur Verfügung gestellt: Arvalis, ein französisches Forschungsinstitut im Bereich des Pflanzenbaus, welches von französischen Primärproduzenten finanziert und verwaltet wird. Die Hauptaufgabe besteht in Informationsbereitstellung und Beratung der Landwirte und Agrarorganisationen um die Wettbewerbsfähigkeit der Betriebe zu sichern und die Profitabilität der Anbausysteme zu erhöhen. Florimend desprez (FD), ein französischer Züchter. Das zur Verfügung gestellte Saatgut umfasst eine Auswahl aus Zuchtlinien und Zuchtstämmen. RAGT, ein französischer Saatgutproduzent mit 19 Zuchtstationen in Europa. IFA, das internationale Department für Agrarbiotechnologie in Tulln steht unter der Leitung der Universität für Bodenkultur Wien. Im Bereich Biotechnologie in der Pflanzenproduktion wird unter anderem Forschung in der Resistenzzüchtung betrieben. Unter dem Versuchsmaterial befinden sich Sorten und Linien die in diesem Versuch zum ersten Mal in Hinsicht auf die Versuchsziele getestet wurden, eine kleine Gruppe wurde sowohl in Frankreich auf einem Partnerinstitut als auch in Tulln dem gleichen Feldversuch unterzogen und 86 Proben werden zum wiederholten Male am IFA in Tulln untersucht. Eine komplette Liste der verwendeten Sorten und Zuchtlinien befindet sich im Anhang. 3.2 3.2.1 Feldversuch Versuchsstandort Der Feldversuch wurde in Niederösterreich in Tulln an der Donau auf Versuchsflächen der Universität für Bodenkultur am Institut für Agrarbiotechnologie (IFA) angelegt. Der Standort befindet sich im Tullnerfeld welches den Südteil des Tullner Beckens bildet. Es ist etwa 48km lang und an seiner ausgedehntesten Stelle 14km breit. Es ist Teil der Molassezone, mit einem zirka 5 km breiten Auenland beiderseits der Donau. Das fruchtbare Tullnerfeld wird im Süden vom Wienerwald, im Norden vom Wagram begrenzt. Im Tullnerfeld 30 berühren sich das mitteleuropäisch-ozeanische und das pannonisch-kontinentale Klima (vgl. Universität für Bodenkultur Wien 2014). Die Versuchsflächen befinden sich auf einer Seehöhe von 180 m, der mittlere Jahresniederschlag beträgt in dem Gebiet 639 mm. Der Versuch wurde auf hochwertigem Ackerland auf tiefgründigem Tschernosem angelegt. Der Boden aus der Typengruppe der Schwarzerden bildete sich aus feinem Schwemmmaterial der Donau, er weist eine mäßige Durchlässigkeit und mäßige Wasserspeicherkraft auf und gilt als mäßig trocken. Die Bodenhorizonte bestehen bis zu 90 cm Tiefe aus schluffigem Lehm, darunter befindet sich lehmiger Sand bzw. Schluff. Der Boden hat einen hohen Kalkgehalt und weist einen mittleren Humusanteil auf (vgl. Bundesforschungs- und Ausbildungszentrum für Wald). 3.2.2 Versuchsanlage Beim Versuchsdesign handelt es sich um eine randomisierte Blockanlage mit je zwei Blöcken. Es wurden zwei Experimente mit zwei verschiedenen Pathogenen durchgeführt (Fusarium graminearum und Fusarium sporotrichioides). 190 verschiedene Sorten und Linien wurden in 4 Wiederholungen angebaut, je zwei davon wurden mit je einem der beiden Fusarium Stämme inokuliert. Pro Wiederholung wurden 195 Parzellen in 5 Fahrten zu je 3 Reihen angebaut. Auf Parzellen die aufgrund der geometrischen Versuchsanlage leer blieben sowie zwischen den Wiederholungen wurde eine neutrale Weizensorte angebaut, die im Versuch nicht bewertet wurde und hier „Rand“ genannt wird. Dieser Rand zwischen den zwei Experimenten sollte auch eine wechselseitige Infizierung mit dem jeweils anderen Pathogen erschweren und die Experimente räumlich trennen. Eine Parzelle bestand aus einer Doppelreihe von angebauten Weizenpflanzen mit 17 cm Reihenabstand und 65 cm Länge. Der Abstand zwischen den Doppelreihen der Parzellen belief sich auf 33 cm. 31 5 6 7 8 9 10 = WH1 = WH2 = WH3 = WH4 4 3060 3059 3058 3057 3056 3055 3054 3053 3052 3051 3050 3049 3048 3047 3046 3444 3443 3442 3441 3440 3439 3438 3437 3436 3435 3434 3433 3432 3431 3430 5 3061 3062 3063 3064 3065 3066 3067 3068 3069 3070 3071 3072 3073 3074 3075 3445 3446 3447 3448 3449 3450 3451 3452 3453 3454 3455 3456 3457 3458 3459 6 3090 3089 3088 3087 3086 3085 3084 3083 3082 3081 3080 3079 3078 3077 3076 3474 3473 3472 3471 3470 3469 3468 3467 3466 3465 3464 3463 3462 3461 3460 7 3091 3092 3093 3094 3095 3096 3097 3098 3099 3100 3101 3102 3103 3104 3105 3475 3476 3477 3478 3479 3480 3481 3482 3483 3484 3485 3486 3487 3488 3489 8 3120 3119 3118 3117 3116 3115 3114 3113 3112 3111 3110 3109 3108 3107 3106 3504 3503 3502 3501 3500 3499 3498 3497 3496 3495 3494 3493 3492 3491 3490 9 3121 3122 3123 3124 3125 3126 3127 3128 3129 3130 3131 3132 3133 3134 3135 3505 3506 3507 3508 3509 3510 3511 3512 3513 3514 3515 3516 3517 3518 3519 10 3150 3149 3148 3147 3146 3145 3144 3143 3142 3141 3140 3139 3138 3137 3136 3534 3533 3532 3531 3530 3529 3528 3527 3526 3525 3524 3523 3522 3521 3520 11 3151 3152 3153 3154 3155 3156 3157 3158 3159 3160 3161 3162 3163 3164 3165 3535 3536 3537 3538 3539 3540 3541 3542 3543 3544 3545 3546 3547 3548 3549 12 13 3180 3181 3179 3182 3178 3183 3177 3184 3176 3185 3175 3186 3174 3187 3173 3188 3172 3189 3171 3190 3170 3191 3169 3192 3168 3167 Rand 3166 3564 3565 3563 3566 3562 3567 3561 3568 3560 3569 3559 3570 3558 3571 3557 3572 3556 3573 3555 3574 3554 3575 3553 3576 3552 3551 Rand 3550 14 15 16 17 Rand 4 3 3031 3032 3033 3034 3035 3036 3037 3038 3039 3040 3041 3042 3043 3044 3045 3415 3416 3417 3418 3419 3420 3421 3422 3423 3424 3425 3426 3427 3428 3429 Rand 3 2 3030 3029 3028 3027 3026 3025 3024 3023 3022 3021 3020 3019 3018 3017 3016 3414 3413 3412 3411 3410 3409 3408 3407 3406 3405 3404 3403 3402 3401 3400 Rand 2 1 3001 3002 3003 3004 3005 3006 3007 3008 3009 3010 3011 3012 3013 3014 3015 3385 3386 3387 3388 3389 3390 3391 3392 3393 3394 3395 3396 3397 3398 3399 Rand 1 18 3193 3194 3195 3196 3197 3198 3199 3200 3201 3202 3203 3204 3205 3206 3207 3577 3578 3579 3580 3581 3582 3583 3584 3585 3586 3587 3588 3589 3590 3591 19 3222 3221 3220 3219 3218 3217 3216 3215 3214 3213 3212 3211 3210 3209 3208 3606 3605 3604 3603 3602 3601 3600 3599 3598 3597 3596 3595 3594 3593 3592 20 3223 3224 3225 3226 3227 3228 3229 3230 3231 3232 3233 3234 3235 3236 3237 3607 3608 3609 3610 3611 3612 3613 3614 3615 3616 3617 3618 3619 3620 3621 21 3252 3251 3250 3249 3248 3247 3246 3245 3244 3243 3242 3241 3240 3239 3238 3636 3635 3634 3633 3632 3631 3630 3629 3628 3627 3626 3625 3624 3623 3622 22 3253 3254 3255 3256 3257 3258 3259 3260 3261 3262 3263 3264 3265 3266 3267 3637 3638 3639 3640 3641 3642 3643 3644 3645 3646 3647 3648 3649 3650 3651 23 3282 3281 3280 3279 3278 3277 3276 3275 3274 3273 3272 3271 3270 3269 3268 3666 3665 3664 3663 3662 3661 3660 3659 3658 3657 3656 3655 3654 3653 3652 24 3283 3284 3285 3286 3287 3288 3289 3290 3291 3292 3293 3294 3295 3296 3297 3667 3668 3669 3670 3671 3672 3673 3674 3675 3676 3677 3678 3679 3680 3681 25 3312 3311 3310 3309 3308 3307 3306 3305 3304 3303 3302 3301 3300 3299 3298 3696 3695 3694 3693 3692 3691 3690 3689 3688 3687 3686 3685 3684 3683 3682 26 3313 3314 3315 3316 3317 3318 3319 3320 3321 3322 3323 3324 3325 3326 3327 3697 3698 3699 3700 3701 3702 3703 3704 3705 3706 3707 3708 3709 3710 3711 27 3342 3341 3340 3339 3338 3337 3336 3335 3334 3333 3332 3331 3330 3329 3328 3726 3725 3724 3723 3722 3721 3720 3719 3718 3717 3716 3715 3714 3713 3712 28 3343 3344 3345 3346 3347 3348 3349 3350 3351 3352 3353 3354 3355 3356 3357 3727 3728 3729 3730 3731 3732 3733 3734 3735 3736 3737 3738 3739 3740 3741 29 30 3372 3373 3371 3374 3370 3375 3369 3376 3368 3377 3367 3378 3366 3379 3365 3380 3364 3381 3363 3382 3362 3383 3361 3384 3360 3359 Rand 3358 3756 3757 3755 3758 3754 3759 3753 3760 3752 3761 3751 3762 3750 3763 3749 3764 3748 3765 3747 3766 3746 3767 3745 3768 3744 3743 Rand 3742 Abbildung 2: Feldversuchsplan Die Wiederholungen 1 und 3 wurden mit Fusarium graminearum inokuliert. Die Wiederholungen 2 und 4 wurden mit Fusarium sporotrichioides inokuliert. 3.2.3 Pflanzenbauliche Maßnahmen Die Vorfrucht auf der Fläche des Versuchs war Sojabohne, nach der Ernte erfolgte der Umbruch und die Bodenbearbeitung mittels Grubber, Tiefenlockerer (30 cm) und Kreiselegge. Der Versuch wurde daraufhin an zwei verschiedenen Terminen angelegt. Die Wiederholungen 1 und 2 wurden am 24.10.2012, die Wiederholungen 3 und 4 am 17.11.2012 angebaut. Saatstärke: 5g pro Parzelle/Doppelreihe Im Frühjahr wurde an zwei Terminen Mineraldünger auf die Versuchsfläche ausgebracht (siehe Tabelle 4), im Mai erfolgten zwei Pflanzenschutzmaßahmen mit verschiedenen Herbiziden (Tabelle 5). 32 Tabelle 4: Düngemaßnahmen Termin Menge und Düngerart 15.04.2013 300kg/ha Volldünger 16:6:18+S 21.05.2013 220 kg/ha NAC (KAS) 27% Tabelle 5: Herbizidmaßnahmen Termin Menge und Pflanzenschutzmittel 08.05.2013 1,5 l/ha Andiamo Maxx 21.05.2013 1 l/ha Puma Extra Der Versuch wurde Mitte Juli mit einem Parzellendrescher geerntet. Das Erntegut wurde gesondert pro Parzelle in je einen Papiersack gefüllt. Jeder Sack war mit einem Etikett versehen welches Versuchsnamen, Parzellennummer, Wiederholung und Sorten- bzw. Liniennamen enthielt. 3.2.4 Witterungsverlauf Das Department für Nutzpflanzenwissenschaften der Universität für Bodenkultur Wien hat am Standort Tulln eine Wetterstation installiert, die laufend erhobenen Messdaten werden gespeichert und können online abgerufen werden (Universität für Bodenkultur Wien 2014). In Abbildung 3 sieht man den Temperaturverlauf der Tagesmittelwerte während der Vegetationsperiode (vom Anbau bis zur Ernte) des Versuchs und in Abbildung 4 die Niederschlagsmengen über denselben Zeitraum. Auffallend waren die im Jahr 2013 relativ niedrigen Temperaturen im Mai, es hatte während des ganzen Monats unter 20 Grad Celsius. Ende Mai bis Anfang Juni war es ungewöhnlich kalt und nass, es zog eine Kaltfront durch die 75 mm Niederschlag brachte und sowohl die Bonituren als auch die Inokulationen erschwerte. Erst Mitte Juni stieg das Thermometer dann auf sommerliche Temperaturen. Insgesamt gab es im Monat Mai 90,2 mm Niederschlag und im Juni sogar 161,3 mm Niederschlag. Das sind mit 251,5 Liter pro Quadratmeter fast 40 Prozent des mittleren Jahresniederschlags innerhalb von zwei Monaten. 33 Temperatur in 2 m Höhe °C 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 Abbildung 3: Temperaturverlauf während der Vegetationsperiode in °C Niederschlag in mm 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Abbildung 4: Niederschlagsmengen während der Vegetationsperiode in mm 34 3.3 Inokulation Die Versuchswiederholungen wurden ab der Blüte durch künstliche Inokulation mit den zwei Fusarium-Stämmen infiziert. Die Isolate der beiden Stämme wurden im März 2013 vorab im Labor am IFA hergestellt, in der gewünschten Konzentration abgefüllt und bis zum Einsatz eingefroren. 3.3.1 Inokulumherstellung Die für beide Inokula erforderlichen Stammkulturen wurden am IFA in der Stammkulturensammlung in Glasröhrchen mit einem Substrat aus Erde-Sand-Gemisch gekühlt aufbewahrt. Das Inokulum von F. graminearum wurde als Einzelisolat aus einem Stamm mit Hilfe der Bubble-Breeding-Methode hergestellt, im Inokulum waren hauptsächlich Makrokonidien enthalten. Für das Inokulum von F. sporotrichioides wurde eine Mischung aus 4 verschiedenen Stämmen verwendet (475, 198, 488 und 309) damit alle Arten von Mikrokonidien für die Infektion vorhanden sind. Im Substrat befindet sich das Myzel der Fusariumpilze. Für die Kulturvermehrung wurde ein wenig Substrat entnommen und auf Agarplatten ausgestreut. Diese wurden bei Zimmertemperatur 72 Stunden lang gelagert. Das auf diese Weise auf den Agarplatten gezüchtete Myzel kann danach zur Beimpfung der Substrate und Suspensionen verwendet werden. Die für die Inokulierung erforderlichen Konidiosporen werden je nach Fusariumstamm durch spezielle Verfahren hergestellt. 3.3.1.1 Bubble-Breeding-Methode für Fusarium graminearum Für die Herstellung von Konidiensuspensionen von F. graminearum wird ein flüssiges Nährsubstrat benötigt. Dafür wurden 90 Gramm Mungobohnen gekocht und der Sud in großen 10 Liter Glasflaschen abgefüllt. Der Sud wurde auf 9 Liter mit Osmosewasser aufgefüllt und die Flaschen danach im Dampfsterilisator für eine Stunde bei 121°C und 1 bar autoklaviert. Die so sterilisierten Gefäße wurden nach dem Abkühlen unter einem Luftabzug mit Myzel von F. graminearum beimpft. Dafür wurde mit einer über einem Bunsenbrenner sterilisierten Impfnadel ein Stück von der mit dem Myzel befallenen Agarplatte herausgeschnitten und in die Flasche gefügt. Ein autoklavierter hohler Glasstab wurde in die Flasche gestellt und mit ebenfalls sterilisierten Gummischläuchen an eine Druckluftleitung angeschlossen. Die Druckluftzufuhr wurde so geregelt, dass in den Flaschen eine stetige moderate Luftzufuhr herrscht und das Substrat Blasen wirft. Eine konstante Durchmischung des Mediums wird somit gewährleistet. 35 Die Flaschen blieben für 5 Tage bei Zimmertemperatur stehen. Der Pilz entwickelte sich in dieser Zeit unter aeroben Bedingungen durch Nährstoffbezug aus den Kohlenhydraten des Substrats und Ausbildung von Konidiosporen. Danach wurden die Flaschen von der Druckluft genommen, verschlossen und im Kühllager weitere zwei Tage aufbewahrt. Die Konidien sanken auf den Boden der Flaschen ab und eine vorzeitige Keimung der Konidiosporen wurde vermieden. Nun wurde der Überstand und das diffuse Myzel abgesaugt und der übrig gebliebene Bodensatz mit den enthaltenen Konidien filtriert und in eine extra Flasche gefüllt. Die so gefilterte Lösung ist nun zur Sporenauszählung bereit. Die Inokulum-Herstellung durch die Bubble-Breeding-Methode erfolgte nach der Standardarbeitsanweisung SOP 3-01 des IFA. 3.3.1.2 Gläschen-Methode für Fusarium sporotrichioides F. sporotrichioides kann wie die meisten Fusariumstämme relativ simpel in Gläsern mit Getreidesubstrat kultiviert werden. Als Nährsubstrat wurde in einem Glasgefäß 50 g eines Weizen-Hafer-Gemisches (1 Teil Hafer, 2 Teile Weizen) mit Osmosewasser gequollen. Nach 24 Stunden wird das überschüssige Wasser entleert und das Gefäß samt Nährsubstrat danach autoklaviert. Nach dem Abkühlen wurde das Substrat unter sterilen Bedingungen mit der Stammkultur beimpft (siehe Bubble-Breeding-Methode), danach mit einem Schraubverschluss verschlossen und zehn Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt. Nach einigen Tagen werden weißlich bis rötliche Pilzrasen am Substrat sichtbar. Das Myzel durchzieht das Getreidegemisch und bildet Konidien aus. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Gläser im Kühlschrank bei 4°-8° C gelagert. Das Substrat wurde mit destilliertem Wasser ausgewaschen und die Gläser danach gespült, in dem aufgefangenen Wasser befanden sich die Konidien in Lösung. Für eine detaillierte Anleitung zur Inokulum-Herstellung durch diese Methode siehe Standardarbeitsanweisung SOP 3-04 des IFA. Die Anleitung wurde zwar für die Herstellung von Inokulum von F. culmorum erstellt, ist aber genauso für F. sporotrichioides gültig. 36 Abbildung 5: Konidienherstellung nach Abbildung 6: Konidienherstellung nach der Gläschenmethode Bubble-Breeding-Methode 3.3.2 der Konzentration Um die Konzentration der hergestellten Konidiensuspensionen zu bestimmen, erfolgte die Auszählung der Konidien unter dem Mikroskop in einer Bürker-Türk-Kammer. Jeweils 1 Mikroliter der Sporenlösung wurde auf ein Auszählungskreuz der Kammer pipettiert. Für die Auszählung wurden nur die großen Kammern mit 4 x 10-6 ml Volumen verwendet. Da die Sporendichte sowohl bei F. graminearum als auch bei F. sporotrichioides sehr hoch war, wurden die Suspensionen vor der Auszählung im Verhältnis 1:10 bzw. 1:40 mit destilliertem Wasser verdünnt. Es wurde die Konidienanzahl in 2 mal 10 Quadraten gezählt. Tabelle 6: Ergebnisse der Konidienauszählung F. graminearum Durchschnittliche Konidien- 4,2 F. sporotrichioides 18,2 anzahl pro Quadrat [K] Verdünnungsfaktor 1:10 1:40 Rechenweg 4,2 K x 10 / 4 x 10-6 ml 18,2 K x 40 / 4 x 10-6 ml Konzentration C1 10,5 Mio. Konidien/ml 182 Mio. Konidien/ml Konzentrationsvorgabe C2 20.000 Konidien/ml 40.000 Konidien/ml 37 Als Inokulationsvorgabe sollten auf Wiederholung 1 und 3 pro Inokulationstermin je 20.000 Konidien/ml von F. graminearum verdünnt in 10 Liter Wasser ausgebracht werden und auf Wiederholung 2 und 4 je 40.000 Konidien/ml von F. sporotrichioides in 10 Liter Wasser. Gemäß der Formel C1 x V1 = C2 x V2 wobei C1 = bekannte Konzentration der Konidiensuspension V1 = unbekanntes Volumen der Konidiensuspension C2 = gewünschte Konzentration des Inokulums V2 = bekanntes Volumen des Inokulums (vergl. SOP 3-01) ergab sich folgendes zu pipettierendes Volumen: F. graminearum F. sporotrichioides 20.000 K/ml x 10.000 ml V1 = 10.500.000 K/ml V1 = 19,1 ml V1 = 40.000 K/ml x 10.000 ml 182.000.000 K/ml V1 = 2,2 ml Das errechnete Volumen für jede Fusariumart wurde in je 60 Tubes pipettiert, beschriftet und bei -80°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren um die Keimfähigkeit der Konidien zu erhalten. 3.3.3 Zeitpunkt der Inokulation Die Inokulation erfolgte an insgesamt 10 Terminen gleichzeitig für alle Wiederholungen im Abstand von 2-3 Tagen ab Blühbeginn der ersten Parzellen. Ab Mai wurden die Versuchsbestände daher laufend visuell auf erste Anzeichen des Blühbeginns kontrolliert. Durch die kühle Witterung im Mai blühten die verschiedenen Sorten erst relativ spät, der Blühbeginn der ersten Weizenlinien wurde am 28.05.2013 registriert. Der Beginn der Blüte war gleichzeitig auch der erste Inokulationstermin. Die Inokulationen wurden vornehmlich am späteren 38 Nachmittag durchgeführt, um starke Sonneneinstrahlung zu vermeiden. In Tabelle 7 sind die Inokulationstermine aufgelistet. Tabelle 7: Inokulationstermine Termin-Nr. Datum 1 28.Mai 2 31.Mai 3 03.Jun 4 05.Jun 5 07.Jun 6 09.Jun 7 11.Jun 8 13.Jun 9 15.Jun 10 17.Jun Durch den zeitlichen Abstand des Saattermins waren bei den Wiederholungen 3 und 4 die Bestände hinsichtlich Entwicklung und Blühbeginn gegenüber den Wiederholungen 1 und 2 verzögert, sie wurden dennoch zu den gleichen Terminen inokuliert. Mit den laufenden Inokulationen wurde der gesamte Blühzeitraum aller Sorten und Zuchtlinien des Versuchs abgedeckt. Um eine etwaige spätere Blüte zu kompensieren und um sicherzugehen, dass alle Ähren mit ausreichend Inokulum besprüht wurden, wurden nachdem auch die letzten Sorten geblüht haben noch zwei Inokulationstermine angeschlossen. 3.3.4 Inokulationsmethode Die Inokulation erfolgte manuell mithilfe einer tragbaren Rückenspritze. Zuerst wurden die eingefrorenen Tubes mit der enthaltenen Konidiensuspension in einem lauwarmen Wasserbad aufgetaut und der Inhalt von je zwei Tubes in Kanistern mit 20 Litern normalem Gebrauchswasser verdünnt. Der Inhalt des Kanisters wurde durch manuelles Schütteln durch39 gemischt und dann in die Spritze gefüllt. Ein tragbarer Spritzbalken mit 3 Düsen ist mit einem Schlauch mit der Spritze verbunden. Die inokulierende Person geht mit der Spritze auf dem Rücken und dem Spritzbalken in der Hand über die Fahrten, es wurde darauf geachtet, dass in gleichmäßiger Höhe je eine Düse über einer Reihe geführt wird. Somit wurden jeweils 3 (Parzellen-)Reihen auf einmal inokuliert. 20 Liter Konidien-Wasser-Gemisch wurden inklusive Wechsel der Gehrichtung in zwei Durchgängen auf beiden zu inokulierenden Wiederholungen ausgebracht, die Sprühdauer über einer Parzelle dauerte im Durchschnitt ca. 2 Sekunden. Es wurde darauf geachtet, dass nur die jeweiligen Wiederholungen mit dem jeweiligen Inokulum besprüht wurden, die Randparzellen wurden ausgelassen. Vor Inokulum-Wechsel wurde die Spritze gründlich mit Wasser ausgespült. Für optimale Infektionsbedingungen wurden die Versuchsfelder während des Inokulationszeitraums mit einer Sprühberegnung in regelmäßigen Abständen befeuchtet. Abbildung 7: Inokulierung mit Handspritze, im Hintergrund ist die Anlage für die Sprühberegnung ersichtlich 3.4 Bonituren Es wurden zu verschiedenen Zeitpunkten verschiedene Merkmale der Sorten bonitiert. Die Bonituren erfolgten visuell und können daher subjektive Abweichungen enthalten. Die Bonituren starteten ab Beginn der Blüte am 28.05.2013 und erfolgten danach in regelmäßigen Abständen. 3.4.1 Blühbonitur Ab 1. Mai wurde jede Parzelle auf Anzeichen der Blüte kontrolliert. Der Blühprozess wird von den anschwellenden Lodiculae initiiert, die Hüllspelzen werden auseinander gedrückt, das 40 Blütchen öffnet sich (Bushnell et al. 2003). Wenn die Antheren prall und gelb und voll Pollen sind, bereit sind aufzuplatzen und aus den Ährchen ausgestoßen werden, ist der Zeitpunkt der Blüte da. Manche Arten blühten jedoch auch verschlossen, bzw. aufgrund der kühlen Witterung im Mai ohne sichtbaren Antherenausstoß ab. Durch vorsichtiges Aufziehen der Hüllspelzen der Ährchen konnte man die Staubbeutel auch innerhalb des Blütchens kontrollieren. Sobald mehr als 50 Prozent der Pflanzen innerhalb einer Parzelle Blühmerkmale zeigten, wurde das jeweilige Datum als Blühbeginn dokumentiert. Abbildung 8: Antheren sind noch grün, Abbildung 9: Weizen-Ährchen kurz vor der Blüte Blüte noch nicht erreicht. 3.4.2 Antherenbonitur Um den Zusammenhang zwischen Blühverhalten und Schweregrad des Befalls zu überprüfen, erfolgte 6 Tage nach der Blüte die Antherenbonitur der jeweiligen Parzellen. Es wurde dabei ermittelt, ob während der Blüte die Staubbeutel aus den Blütchen ausgestoßen werden oder ob sie im Inneren verbleiben. Dieses Merkmal kann je nach Sorte unterschiedlich ausgeprägt sein, manche Sorten blühten mit exzessivem Antherenausstoß und bei anderen verblieben die Antheren komplett im Inneren. Für die Bonitur wurden die Blütchen mit der Hand leicht geöffnet, mit Hilfe zweier mechanischer Hand-Zählwerke wurde die Anzahl der bonitierten Ährchen sowie die Anzahl der im Blütchen verbliebenen Antheren notiert. Es wurden pro Parzelle insgesamt 20 Blütchen von verschiedenen verblühten Ähren betrachtet und die in den Blütchen verbliebenen Antheren ausgezählt. 41 Tabelle 8: Termine Antherenbonitur Blühbeginn Antherenbonitur 28.05.2013 03.06.2013 31.05.2013 06.06.2013 03.06.2013 09.06.2013 05.06.2013 11.06.2013 07.06.2013 13.06.2013 09.06.2013 15.06.2013 11.06.2013 17.06.2013 13.06.2013 19.06.2013 Abbildung 10: Weizensorte mit starkem Antherenausstoß 3.4.3 Fusariumbonitur Zehn Tage nach der Blüte folgte die erste Bonitur auf Fusariumbefall. Die Bonitur erfolgte durch visuelle Betrachtung der Ähren, anhand eines Bonitur-Schemas (siehe Tabelle 10 und Abbildung 11) wurden die Symptome pro Parzelle verglichen, ausgewertet und der Schweregrad des Befalls in Prozent ausgedrückt. Danach wurde jede Parzelle laufend im 4-Tages-Abstand bonitiert. Insgesamt wurde jede Parzelle an sechs verschiedenen Terminen bonitiert. Tabelle 9: Termine der Fusariumbonitur Inokulationstermine: B1 B2 B3 1 28.05.13 07.06.13 11.06.13 2 31.05.13 10.06.13 3 03.06.13 4 5 B4 B5 B6 15.06.13 19.06.13 23.06.13 27.06.13 14.06.13 18.06.13 22.06.13 26.06.13 30.06.13 13.06.13 17.06.13 21.06.13 25.06.13 29.06.13 03.07.13 05.06.13 15.06.13 19.06.13 23.06.13 27.06.13 01.07.13 05.07.13 07.06.13 17.06.13 21.06.13 25.06.13 29.06.13 03.07.13 07.07.13 42 6 09.06.13 19.06.13 23.06.13 27.06.13 01.07.13 05.07.13 09.07.13 7 11.06.13 21.06.13 25.06.13 29.06.13 03.07.13 07.07.13 11.07.13 8 13.06.13 23.06.13 27.06.13 01.07.13 05.07.13 09.07.13 13.07.13 9 15.06.13 25.06.13 29.06.13 03.07.13 07.07.13 11.07.13 15.07.13 10 17.06.13 27.06.13 01.07.13 05.07.13 09.07.13 13.07.13 17.07.13 An den späteren Terminen wurde die Bonitur durch die einsetzenden Abreifeprozesse deutlich erschwert, durch die Gelbfärbung des Getreides konnten leicht Verwechslungen zwischen Symptomen der Ährenfusariose und natürlichen Reifevorgängen auftreten. Tabelle 10: Verwendetes Schema für die visuelle Fusariumbonitur (Bürstmayr, 2011) % befallene Ährchen je Parzelle 0 0,1 0,5 1 2 3 5 10 15 20 25 30 40 50 60 70 80 90 100 entspricht in etwa keine Symptome sichtbar erste Spuren von FHB sichtbar 0.1 Ährchen pro Parzelle befallen (= ein Ährchen in 10 % der Ähren) 0.2 Ährchen pro Parzelle befallen (= ein Ährchen in 20 % der Ähren) 0.4 Ährchen je Ähre befallen 0.6 Ährchen je Ähre befallen 1 Ährchen je Ähre befallen 2 Ährchen je Ähre befallen 3 Ährchen je Ähre befallen 4 Ährchen je Ähre befallen 5 Ährchen je Ähre befallen 6 Ährchen je Ähre befallen 8 Ährchen je Ähre befallen 10 Ährchen je Ähre befallen 12 Ährchen je Ähre befallen 14 Ährchen je Ähre befallen 16 Ährchen je Ähre befallen 18 Ährchen je Ähre befallen alle Ährchen befallen 43 Abbildung 11: Boniturhilfe für Ährenfusariose (Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft 2000) Abbildung 12: Symptom einer beginndenden Abbildung 13: mit Fusarium befallenes Ähr- FHB Infektion am 2. Boniturtermin chen 44 Abbildung 14: Fusarium-Myzel (orange) sichtbar 3.4.4 Abbildung 15: Mit FHB befallene Kornanlage Kornbonitur Die Papiersäcke mit dem Erntegut der gedroschenen Parzellen wurden einzeln durch einen mobilen Labordrescher des Modells LD 350 der Firma Wintersteiger mittels Durchlauf der Dreschtrommel und Luft von Verunreinigungen befreit und anschließend wieder in die jeweiligen Säcke gefüllt. Anschließend erfolgte die Bonitur der Weizenkörner auf Fusariumbefall und die Dokumentation je nach Parzelle. Vorab wurden zur besseren Vergleichbarkeit 11 Schalen mit je 200 abgezählten Körnern vorbereitet. Jede Musterschale enthielt einen gewissen Prozentanteil an mit Fusarium befallenen Körnern. So wurden 11 verschiedene Muster in Abstufungen von 3%-90% dargestellt. Das zu bonitierende Korngut jeder Parzelle wurde nun flach in eine eigene Boniturschale gefüllt und leicht geschüttelt, damit die Körner nicht übereinander liegen und jedes Korn gut sichtbar ist. Dann erfolgte die visuelle Bonitur der Einzelkörner. Jene Körner, die Symptome eines Fusariumbefalls aufwiesen wurden ausgezählt und der Prozentanteil des Schadbefalls anhand des Vergleichs mit Musterschalen geschätzt. 3.4.5 Sonstige Bonituren Um den Zusammenhang von Resistenzeigenschaften mit physiologischen Merkmalen der Sorten zu hinterfragen, wurde im Juni nach vollständiger Entwicklung der Weizenpflanzen sowohl die Wuchshöhe als auch die Begrannung der Ähren dokumentiert. Bei der Ausprägung der Begrannung wurde zwischen unbegrannt (=Kolbenweizen) und begrannt (=Grannenweizen) unterschieden. Bei einigen Sorten wurden auch Mischtypen festgestellt. 45 3.4.6 Toxinanalysen Für die Toxinanalysen wurden die 2 Wiederholungen der jeweiligen Isolate volumenmäßig zusammengelegt und eingeschickt. Die Analyse erfolgte nicht am IFA selbst, sondern wurde im Labor der französischen Firma Capinov mittels Gaschromatografie mit einem Tandem Massenspektrometer GC/MS durchgeführt (Bürstmayr mündl. 08.09.2016). Die Proben wurden auf die Mykotoxine DON, HT-2, T-2 und ZON analysiert, die Ergebnisse liegen in µg/kg vor. 3.5 Statistische Auswertung Um den Verlauf der Krankheitsentwicklung der verschiedenen Linien besser darstellen und vergleichen zu können, wurden aus den Feldbonituren je Genotyp die AUDPC-Werte (= area under disease progress curve) nach folgender Formel berechnet: 𝑛 (𝑦𝑖 + 𝑦𝑖−1 ) 𝐴𝑈𝐷𝑃𝐶 = ∑ [ . ( 𝑡𝑖 − 𝑡𝑖−1 )] 2 𝑖=1 Von den Feldbonituren auf Fusarium wurden nur die ersten 5 Boniturtermine pro Linie ausgewertet, da beim 6. Termin, 30 Tage nach der Blüte, die visuelle Bonitur aufgrund der Verfärbung der Ähren durch die Abreifeprozesse erheblich erschwert war. Folgende Merkmale wurden statistisch ausgewertet: Die ersten 5 Fusarium-Bonituren (FHB_B1, FHB_B2, FHB_B3, FHB_B4 und FHB_B5), die Werte entsprechen dem Prozentsatz an befallenen Ähren innerhalb einer Parzelle an den verschiedenen Boniturterminen. Die AUDPC-Werte über die 5 Bonituren und der Prozentsatz an Fusarium-befallenen Körnern in der Kornbonitur nach der Ernte (FDK). Von den erhobenen morphologischen Merkmalen wurde das Blühdatum, gemessen in Tagen nach dem ersten Mai (D1May), die Wuchshöhe (WUH) in cm und die relative Antherenretention (Aret_rel, 1 = völlige Einbehaltung der Antheren, 0 = kompletter Antherenausstoß) analysiert. Bei den Messungen für die Mykotoxine wurden bei der Auswertung die Messungen für ZON aufgrund geringer Relevanz weggelassen. Bei F. sporotrichioides wurden die Ergebnisse für die Toxine HT-2 und T-2 (HT2 + T2) summiert, da sie ähnliche Eigenschaften aufweisen und die Ausprägung in einer gewissen Verhältnismäßigkeit auftritt. 46 Die ANOVAs für die verschiedenen Merkmale wurden als einfache Varianzanalyse in Form einer randomisierten Blockanlage berechnet. Hierbei wurde folgendes lineares Modell verwendet: 𝑋𝑖𝑗 = µ + 𝑤𝑗 + 𝑔𝑖 + Ɛ𝑖𝑗 𝑋𝑖𝑗 = Beobachtungswert aufgrund der Faktoren µ = allgemeiner Mittelwert 𝑤𝑗 = Effekt der Wiederholungen 𝑔𝑖 = Effekt der Genotypen Ɛ𝑖𝑗 = Restvarianz Zur Auswertung der bei der Feldbonitur erhobenen Daten für Mittelwerte und Varianzanalysen wurde das Statistikprogramm SAS/STAT 9.3 verwendet. Die Auswertung der Kennzahlen, Histogramme, Diagramme und Korrelationsanalysen erfolgte mit Excel 2010. 47 4 Ergebnisse 4.1 Beschreibende Kennzahlen Da die beiden Experimente mit den Isolaten F. graminearum (FG) und F. sporotrichioides (FS) in jeweils 2 Wiederholungen im Feldversuch getestet wurden, wurde zuerst für jedes Isolat der arithmetische Mittelwert aller Merkmale aus den beiden Wiederholungen errechnet, sodass für jedes Isolat ein Durchschnitt der Merkmale aus den zwei Wiederholungen vorlag. In den folgenden Tabellen wird ein Überblick über die wichtigsten statistischen Kennzahlen der beiden Experimente gegeben. In Tabelle 11 sind die Kennzahlen der erhobenen Merkmale für das Experiment mit F. graminearum über beide Isolat-Wiederholungen ersichtlich. Die Weizensorte, die den geringsten AUDPC-Wert, den geringsten FHB-Befall zum Zeitpunkt der 5. Bonitur als auch den niedrigsten FDK-Wert aufwies, war die ungarische Zuchtlinie UNG-136.16.7.4.7. Den niedrigsten DON-Wert im Erntegut hatte hingegen die Zuchtlinie 1305.6.5_P1. Die Sorte Dakter hatte den höchsten AUDPC-Wert, bei der 5. Bonitur erreicht sie neben anderen Sorten das Maximum an Befallsausprägung. Auch die höchsten DON-Werte im Erntegut wies Dakter auf. Den Maximum-Wert an FDK erreichte unabhängig davon die Sorte Royssac. Da das Mykotoxin HT-2 nur in 19 Proben und T-2 nur in 2 Proben in sehr geringen Mengen gemessen wurde, wurde hier auf eine Darstellung verzichtet. Tabelle 11: Mittelwert, Median, Minimum und Maximum für FHB_B5, AUDPC, FDK und DON im Experiment mit F. graminearum F. graminearum Mittelwert Median Minimum Maximum FHB_B5 [%] 32,7 32,5 4,0 65,0 AUDPC 298,7 303,4 25,4 614,4 FDK [%] 25,8 26,3 0,3 56,5 DON [µg/kg] 20668,8 21800,0 1560,0 49100,0 In Tabelle 12 sind die gleichen Kennzahlen für das Experiment mit F. sporotrichioides über zwei Wiederholungen ersichtlich. Bei allen gemessenen Parametern lagen die Werte unter denen von F. graminearum. Der niedrigste Befall bei der 5. Bonitur wurde bei der französischen Zuchtlinie A40 22 1 2 gemessen. Die gleiche Linie wies die niedrigsten Werte bei HT2+T2 und neben anderen bei FDK auf. Die Linie UNG-136.16.7.4.7 hatte sowohl bei AUDPC als auch bei den gemessenen DON-Werten das absolute Minimum. 48 Die französische Sorte Karillon erreichte das Maximum an AUDPC und neben 2 anderen Sorten und der Zuchtlinie RW21126 auch den höchsten Fusariumbefall am 5. Boniturtermin. Die meisten ausgezählten fusariumbefallenen Körner nach der Ernte (FDK) hatten die Sorte Nogal sowie die französische Zuchtlinie RW21124. Hinsichtlich der Mykotoxinwerte erreichte bei HT2+T2 die Sorte Ascott den Höchstwert, bei DON die Linie RW21126. Tabelle 12: Mittelwert, Median, Minimum und Maximum für FHB_B5, AUDPC, FDK, DON und HT2+T2 im Experiment mit F. sporotrichioides F. sporotrichioides Mittelwert Median Minimum Maximum FHB_B5 [%] 20,1 20,0 0,5 35,0 AUDPC 144,0 143,6 3,8 350,7 FDK [%] 7,5 6,8 0,0 22,5 DON [µg/kg] 2230,5 1995,0 58,0 8130,0 HT2 + T2 [µg/kg] 1233,9 1102,5 46,0 3662,0 Alle Sorten und Zuchtlinien wurden sowohl von F. graminearum als auch von F. sporotrichioides infiziert. Aus den Werten FHB_B5 und AUDPC ist ersichtlich, dass alle Parzellen in beiden Experimenten mit den jeweiligen Isolaten infiziert wurden und zum Zeitpunkt der 5. Bonitur (26 Tage nach der Blüte) infiziert waren. Bis auf 3 Ausnahmen bei F. sporotrichioides wurde im Erntegut aller getesteter Sorten und Zuchtlinien Körner gefunden, die Fusariumbefall aufwiesen. DON wurde in allen Proben gemessen. Die Ausprägung aller Werte ist für F. graminearum weit höher als für F. sporotrichioides. Durchschnittlich sind die Werte für AUDPC 2-mal höher, für FDK 3,5-mal höher und die DON-Werte ca. 9-mal höher als bei einer Infektion mit F. sporotrichioides. Für die morphologischen Merkmale Blühdatum, Wuchshöhe und Antherenausstoß, die bei allen Parzellen für beide Experimente erhoben wurden, wurden die Mittelwerte über alle 4 Wiederholungen errechnet. Einen Überblick über die Kennzahlen gibt die Tabelle 13. Tabelle 13: Mittelwert, Median, Minimum und Maximum für D1May, WUH und Aret_rel für die Experimente mit F. graminearum und F. sporotrichioides Mittelwert Median Minimum Maximum D1May [Tage] 36,9 36,6 28,8 45,0 WUH [cm] 74,6 72,5 57,5 103,8 Aret_rel 0,6 0,6 0,0 1,0 49 Den frühesten Blütezeitpunkt erreicht die Sorte Nogal, am längsten dauerte es bei den am IFA gezüchteten Linien 1309.2.4_P1 und 1354.4.11_P2 bis die Blüte erreicht wurde. Im Bereich der Wuchshöhe war die Sorte Musik die kürzeste, den höchsten Wuchs erreichte T.macha-A. Hinsichtlich des Blühverhaltens wies die Zuchtlinie UNG-136.16.7.4.7 einen fast vollständigen Antherenausstoß auf, die Sorte Calabro hingegen behielt alle ihrer Antheren nach der Blüte innerhalb der Blütchen. 4.2 Varianzanalysen und Häufigkeitsverteilungen Mit Hilfe der Varianzanalysen wurde der Einfluss der Sorten auf die verschiedenen erhobenen Parameter und Merkmale überprüft und mit Hilfe von Histogrammen die Häufigkeitsverteilungen visualisiert. In Abbildung 16 wurde die Häufigkeitsverteilung der AUDPC-Werte für beide Isolate in einem Histogramm veranschaulicht. Der Unterschied in der Befallsausprägung zwischen den Isolaten wird deutlich. Bei F. graminearum liegt die Bandbreite in der Ausprägung des Fusariumbefalls zwischen 50 und 650 liegt und bei F. sporotrichioides zwischen 50 bis 400. Auch die Normalverteilung der Daten ist optisch ersichtlich. 60 50 Häufigkeit 40 30 20 10 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 AUDPC F.graminearum F.sporotrichioides Abbildung 16: Histogramm für die AUDPC Werte der beiden Isolate FG und FS Abbildung 17 zeigt ein Histogramm für die Häufigkeitsverteilung der fusariumbefallenen Körner im Erntegut. Auch hier sieht man sehr deutlich, dass es einen Unterschied in der Band50 breite der Isolate und der Genotypen gibt. Während F. sporotrichioides analog zu den geringeren AUDPC-Werten auch eine geringere Ausprägung an Fusariumbefall im Erntegut zeigte, hat F. graminearum eine weitere Variation und weist auch höhere FDK-Werte auf. 80 70 Häufigkeit 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 FDK in % F. graminerarum F. sporotrichioides Abbildung 17: Histogramm für den FDK Wert in % der beiden Isolate FG und FS 4.2.1 Fusarium graminearum Mit Hilfe von Varianzanalysen wird der Effekt der Sorten auf die Merkmale FHB_B5, AUDPC und FDK für das Isolat FG über je zwei Wiederholungen separat getestet. Die Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen dargestellt. Tabelle 14: Varianzanalyse für das Merkmal FHB_B5 für das Isolat FG über 2 Wiederholungen Varianzursache WH Genotyp Error Corrected Total DF 1 189 192 382 Type III SS 28,86 62092,86 12140,97 74266,81 Mean Square 28,86 328,53 63,23 F-Wert 0,46 5,20 p-Wert 0,5001 <.0001 51 Der Unterschied zwischen den Isolat-Wiederholungen ist nicht signifikant. Es gibt einen signifikanten Unterschied zwischen den getesteten Sorten und Zuchtlinien bezüglich des Parameters FHB_B5. Tabelle 15: Varianzanalyse für das Merkmal AUDPC für das Isolat FG über 2 Wiederholungen Varianzursache WH Genotyp Error Corrected Total DF 1 189 192 382 Type III SS 70453,58 7017127,44 1278998,78 8368749,43 Mean Square 70453,58 37127,66 6661,45 F-Wert 10,58 5,57 p-Wert 0,0014 <.0001 Der Unterschied zwischen den Isolat-Wiederholungen als auch der Unterschied zwischen den verschiedenen Genotypen ist signifikant. Tabelle 16: Varianzanalyse für das Merkmal FDK für das Isolat FG über 2 Wiederholungen Varianzursache WH Genotyp Error Corrected Total DF 1 189 192 382 Type III SS 2460,55 86622,15 9338,66 98418,28 Mean Square 2460,55 458,32 48,64 F-Wert 50,59 9,42 p-Wert <.0001 <.0001 Auch für das Merkmal FDK ist sowohl der Unterschied zwischen den Isolat-Wiederholungen als auch der Unterschied zwischen den Genotypen signifikant. Der Haupteffekt der Sorten/Zuchtlinien ist daher für alle fusariumbezogenen Merkmale gegeben. 4.2.2 Fusarium sporotrichioides Mit Hilfe von Varianzanalysen wird der Effekt der Sorten auf die Merkmale FHB_B5, AUDPC und FDK für das Isolat FS über je zwei Wiederholungen separat getestet. Die Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen dargestellt. Tabelle 17: Varianzanalyse für das Merkmal FHB_B5 für das Isolat FS über 2 Wiederholungen Varianzursache WH Genotyp Error Corrected Total DF 1 189 191 381 Type III SS 1223,94772 19592,05166 6764,15728 27595,98955 Mean Square 1223,94772 103,66165 35,41444 F-Wert 34,56 2,93 p-Wert <.0001 <.0001 52 Die Sorten als auch die Isolat-Wiederholungen haben signifikanten Einfluss auf die Ausprägung des Fusariumbefalls zum Zeitpunkt der 5. Bonitur. Tabelle 18: Varianzanalyse für das Merkmal AUDPC für das Isolat FS über 2 Wiederholungen Varianzursache WH Genotyp Error Corrected Total DF 1 189 191 381 Type III SS 95025,628 1641055,578 517470,759 2254365,768 Mean Square 95025,628 8682,834 2709,271 F-Wert 35,07 3,2 p-Wert <.0001 <.0001 Auch auf die AUDPC Werte haben sowohl die Isolat-Wiederholung als auch die verschiedenen Genotypen einen signifikanten Effekt. Tabelle 19: Varianzanalyse für das Merkmal FDK für das Isolat FS über 2 Wiederholungen Varianzursache WH Genotyp Error Corrected Total DF 1 189 191 381 Type III SS 1,654438 9791,800175 1935,67056 11730,23364 Mean Square 1,654438 51,808467 10,1344 F-Wert 0,16 5,11 p-Wert 0,6866 <.0001 Ein signifikanter Unterschied zwischen den Sorten zeigt sich auch für die abhängige Variable FDK, jedoch ist hier der Unterschied zwischen den Isolat-Wiederholungen nicht gegeben. 4.2.3 Morphologische Merkmale In Abbildung 18 ist die Häufigkeitsverteilung für die Mittelwerte des Merkmals Blühdatum über alle 4 Wiederholungen dargestellt. Anzumerken ist an dieser Stelle, dass die Wiederholungen 3 und 4 drei Wochen später angebaut wurden als die Wiederholungen 1 und 2. Daher hat sich auf diesen Parzellen, aufgrund der späteren Entwicklung der Pflanzen, das Blühdatum nach hinten verschoben. Das Blühdatum der verschiedenen Genotypen variierte innerhalb von 2 Wochen. 53 40 35 30 Häufigkeit 25 20 15 10 5 0 28.Mai 30.Mai 01.Jun 03.Jun 05.Jun 07.Jun 09.Jun 11.Jun 13.Jun 15.Jun und größer D1May Abbildung 18: Histogramm für das Blühdatum über beide Experimente FG und FS Auch die Varianzanalyse für D1May zeigte, dass es Unterschiede zwischen den Genotypen bezüglich des Blühzeitpunkts gibt, siehe Tabelle 20. Die Auswahl der Sorten/Zuchtlinien hat daher einen signifikanten Einfluss auf den Blühzeitpunkt. Auch die Wiederholungen hatten einen signifikanten Effekt auf das Blühdatum, was durch die unterschiedlichen Anbautermine erklärt werden kann. Tabelle 20: Varianzanalyse für das Merkmal Blühdatum in Anzahl der Tage nach dem 1. Mai (D1May) über 4 Wiederholungen Varianzursache WH Genotyp Error Corrected Total DF 3 189 572 764 Type III SS 2899,10 12257,40 1497,62 16655,31 Mean Square 966,37 64,85 2,62 F-Wert 369,09 24,77 p-Wert <.0001 <.0001 54 Auch für das Merkmal Wuchshöhe gab es eine weite Variationsbreite über alle 4 Wiederholungen betrachtet. Die 190 verschiedenen Genotypen waren im Schnitt zwischen 60 cm und 105 cm hoch, wobei die meisten Sorten und Linien bei 70 bis 75 cm Höhe lagen. 60 50 Häufigkeit 40 30 20 10 0 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 Wuchshöhe Abbildung 19: Histogramm für das Merkmal Wuchshöhe (WUH) in cm über beide Experimente FG und FS Tabelle 21 zeigt die Ergebnisse der Varianzanalyse für die abhängige Variable Wuchshöhe. Es gibt signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen betreffend der Wuchshöhe. Tabelle 21: Varianzanalyse für das Merkmal Wuchshöhe (WUH) in cm über 4 Wiederholungen Varianzursache WH Genotyp Error Corrected Total DF 3 189 573 765 Type III SS 374,57 58299,86 5220,84 63895,01 Mean Square 124,86 308,46 9,11 F-Wert 13,7 33,85 p-Wert <.0001 <.0001 Als nächstes wurde der Einfluss der Sortenwahl auf das Blühverhalten untersucht. Das Histogramm in Abbildung 20 zeigt die große Bandbreite des Merkmals relativer Antherenausstoß, wobei ein Wert von Aret_rel 0 für kompletten Antherenausstoß und ein Wert von 1 für komplette Einbehaltung der Antheren steht. Auch dieses Merkmal wurde über 4 Wiederholungen betrachtet. 55 35 30 Häufigkeit 25 20 15 10 5 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 und größer Aret_ret Abbildung 20: Histogramm für das Merkmal relativer Antherenausstoß (Aret_rel) über beide Experimente FG und FS Laut Varianzanalyse in Tabelle 22 gibt es auch hier für das Merkmal Aret_rel signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen und innerhalb der Wiederholungen. Tabelle 22: Varianzanalyse für das Merkmal Antherenausstoß (Aret_rel) über 4 Wiederholungen Varianzursache WH Genotyp Error Corrected Total 4.3 DF 3 189 573 765 Type III SS 3,60 47,80 14,37 65,75 Mean Square 1,20 0,25 0,03 F -Wert 47,81 10,08 p-Wert <.0001 <.0001 Infektionsverlauf Die angewandte Sprühinokulation führte bei allen Genotypen zu einer erfolgreichen Infektion und bewirkte unterschiedliche Krankheitsverläufe in den verschiedenen Sorten und Linien. Die Befallsdaten wurden im Laufe der regelmäßig stattfindenden Boniturtermine erhoben. In den nächsten beiden Diagrammen wird der Infektionsverlauf von einigen ausgewählten Sorten für jedes Fusarium Isolat dargestellt. 56 70 60 Befall in % 50 40 30 20 10 0 0 10 14 18 22 26 Tage nach 1. Inokulation UNG-136.16.7.4.7 Dakter Capo Karillon Mittelwert Abbildung 21: Infektionsverlauf von F. graminearum für UNG-136.16.7.4.7, Dakter, Capo und Karillon im Vergleich zum Mittelwert In Abbildung 21 wurden die Krankheitsverläufe der Linie UNG-136.16.7.4.7, welche den niedrigsten Befallsgrad aufwies und der Sorte Dakter, die den stärksten Befall an Fusarium verzeichnete, betrachtet. Zum Vergleich dazu wurde auch die österreichische Standard Sorte Capo sowie Karillon, eine französische Sorte, welche beim zweiten Experiment mit dem Isolat FS die höchsten AUDPC-Werte erreichte, dargestellt. Capo, der im Allgemeinen eine recht gute Fusariumresistenz aufweist befindet sich auch hier deutlich unter dem Mittelwert. Die unterschiedlichen Anfälligkeiten der verschiedenen Sorten gegenüber dem Isolat sind sehr gut ersichtlich. 57 40 35 Befall in % 30 25 20 15 10 5 0 0 10 14 18 22 26 Tage nach 1. Inokulation UNG-136.16.7.4.7. Dakter Capo Karillon Mittelwert Abbildung 22: Infektionsverlauf von F. sporotrichioides für UNG-136.16.7.4.7, Dakter, Capo und Karillon im Vergleich zum Mittelwert In Abbildung 22 wurde der Infektionsverlauf der gleichen Sorten nach der Inokulation mit F. sporotrichioides betrachtet. Auffällig sind die insgesamt geringeren Befallsraten für dieses Isolat, die Sorten zeigen ähnliche Krankheitsverläufe wie bei F. graminearum. Karillon war bei diesem Experiment jedoch die anfälligste Sorte, während die Kurve von UNG136.16.7.4.7 fast bei null stagniert. 4.4 Korrelationsanalysen und Streudiagramme In den folgenden Tabellen werden die errechneten Korrelationskoeffizienten der verschiedenen Korrelationsanalysen dargestellt. Für die Berechnungen wurden die Mittelwerte aus den jeweiligen Isolat-Wiederholungen herangezogen, bei den morphologischen Merkmalen die Mittelwerte über alle 4 Wiederholungen. In Tabelle 23 sind die Korrelationskoeffizienten der erhobenen Merkmale für das Experiment mit dem Isolat F. graminearum ersichtlich. Auffallend ist hier der hohe Korrelationskoeffizient zwischen FDK und FHB_B5 sowie AUDPC und die starke Korrelation zwischen DON und FDK, AUDPC und FHB_B5. Das Blühdatum (D1May) korrelierte kaum mit den fusariumbe58 zogenen Merkmalen, auch bezüglich des Zusammenhangs des Blühdatums mit dem Verhalten des Antherenausstoßes stagniert der Koeffizient bei fast null. Das morphologische Merkmal Wuchshöhe (WUH) weist recht hohe negative Korrelationen mit FHB_B5, AUDPC, FDK und DON auf. Auch Aret_rel zeigt eine Korrelation mit den fusariumbezogenen Merkmalen. Tabelle 23: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Parameter für das Experiment mit Isolat FG FG AUDPC FDK DON D1May WUH Aret_rel FHB_B5 0,96 0,86 0,85 -0,11 -0,61 0,58 AUDPC FDK DON D1May WUH 0,85 0,86 -0,03 -0,61 0,62 0,91 -0,29 -0,74 0,62 -0,30 -0,73 0,61 0,49 -0,09 -0,46 In den folgenden drei Streudiagrammen werden ausgewählte Korrelationen der fusariumbezogenen Merkmale dargestellt. 60 r = 0,85 50 FDK_FG 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 500 600 700 AUDPC_FG Abbildung 23: Streudiagramm für AUDPC und FDK im Experiment mit F. graminearum 59 60000 r = 0,86 50000 DON_FG 40000 30000 20000 10000 0 0 100 200 300 400 500 600 700 AUDPC_FG Abbildung 24: Streudiagramm für AUDPC und DON im Experiment mit F. graminearum 60000 r = 0,91 50000 DON_FG 40000 30000 20000 10000 0 0 10 20 30 40 50 60 FDK_FG Abbildung 25: Streudiagramm für FDK und DON im Experiment mit F. graminearum 60 In Tabelle 24 wurden die gleichen Korrelationsanalysen für die Merkmale des Experiments mit F. sporotrichioides durchgeführt. Auch hier zeigt sich eine Korrelation zwischen FDK und FHB_B5 sowie AUDPC, wenn auch nicht so ausgeprägt wie bei F. graminearum. Auch die Mykotoxin-Werte weisen eine positive Korrelation auf mit FHB_B5, AUDPC und FDK, vor allem die Summe aus HT2+T2. Das Blühdatum wies auch hier kaum eine Korrelation auf mit den fusariumbezogenen Merkmalen, auch mit Aret_rel korreliert es hier gegen null. Die Wuchshöhe zeigt eine negative Korrelation für die Merkmale FHB_B5, AUDPC, FDK, DON und HT2+T2. Die Antherenretention (Aret_rel) korreliert positiv mit den fusariumbezogenen Merkmalen als auch mit den Mykotoxin-Werten. Tabelle 24: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Parameter für das Experiment mit Isolat FS FS AUDPC FDK DON HT2 + T2 D1May WUH Aret_rel FHB_B5 0,91 0,61 0,53 0,62 -0,15 -0,57 0,45 AUDPC FDK DON HT2 + T2 D1May WUH 0,61 0,54 0,70 -0,04 -0,57 0,51 0,80 0,73 -0,31 -0,63 0,54 0,59 -0,40 -0,62 0,62 -0,12 -0,55 0,56 0,49 -0,09 -0,46 In den folgenden Abbildungen werden die Korrelationen in Form von Streudiagrammen für ausgewählte fusariumbezogene Parameter dargestellt. 25 r = 0,61 FDK_FS 20 15 10 5 0 0 100 200 300 400 AUDPC_FS Abbildung 26: Streudiagramm für AUDPC und FDK im Experiment mit F. sporotrichioides 61 4000 r = 0,70 3500 HT2+T2_FS 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 100 200 300 400 AUDPC_FS Abbildung 27: Streudiagramm für AUDPC und HT2+T2 im Experiment mit F. sporotrichioides 4000 r = 0,73 3500 HT2+T2_FS 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 5 10 15 20 25 FDK_FS Abbildung 28: Streudiagramm für FDK und HT2+T2 im Experiment mit F. sporotrichioides 62 In Tabelle 25 wurde eine Korrelationsanalyse für alle fusariumbezogenen Parameter sowie für die Toxine in Gegenüberstellung der beiden Experimente mit den Isolaten F. graminearum und F. sporotrichioides durchgeführt. Alle Werte für FHB_B5, AUDPC, FDK, DON und HT2+T2 zeigten eine positive Isolat-übergreifende Korrelation. Tabelle 25: Korrelationsanalyse für die Parameter FHB_B5, AUDPC , FDK, DON und HT2+T2 für beide Experimente FG und FS FS\FG FHB_B5_FS AUDPC_FS FDK_FS DON_FS HT2+T2_FS FHB_B5_FG 0,70 0,71 0,69 0,69 0,70 AUDPC_FG 0,70 0,74 0,68 0,67 0,75 FDK_FG 0,66 0,68 0,77 0,75 0,76 DON_FG 0,66 0,71 0,76 0,79 0,80 In Abbildung 29 wurden in einem Streudiagramm die AUDPC-Werte der verschiedenen Sorten und Linien für F. graminearum und F. sporotrichioides gegenübergestellt. Es ist eine deutliche positive Korrelation erkennbar. 400 r = 0,74 350 300 AUDPC_FS 250 200 150 100 50 0 0 100 200 300 400 500 600 700 AUDPC_FG Abbildung 29: Streudiagramm der AUDPC-Werte der verschiedenen Genotypen für FG und FS In Abbildung 30 zeigt sich deutlich die positive Korrelation der FDK-Werte für beide Experimente. Auch die Haupttoxine von F. graminearum (DON) und von F. sporotrichioides (HT2+T2) korrelieren eindeutig miteinander, siehe Abbildung 31. 63 25 r = 0,77 20 FDK_FS 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 FDK_FG Abbildung 30: Streudiagramm für FDK der verschiedenen Genotypen für FG und FS 4000 r = 0,80 3500 3000 HT2+T2_FS 2500 2000 1500 1000 500 0 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 DON_FG Abbildung 31: Streudiagramm für DON und HT2+T2 der verschiedenen Genotypen für FG und FS 64 In Tabelle 26 wurden zur besseren Übersicht und Vergleichbarkeit nochmals die fusariumbezogenen Merkmale der beiden Experimente den morphologischen Merkmalen Blühdatum (D1May), Wuchshöhe (WUH) und Antherenretention (Aret_rel) gegenübergestellt. Wie schon oben erwähnt, ist sowohl für F. graminearum als auch für F. sporotrichioides kaum eine Korrelation zwischen AUDPC und Blühdatum gegeben. Die Wuchshöhe korreliert zu AUDPC in beiden Fällen negativ und zu Aret_rel positiv. FDK zeigt eine schwache negative Korrelation zu D1May, eine recht starke negative Korrelation zu WUH und eine positive Korrelation zu Aret_rel. Auch die Korrelationen der beiden Haupttoxine verhalten sich in beiden Experimenten ähnlich, es ist eine schwache negative Korrelation mit D1May gegeben, eine mittelmäßige negative Korrelation zu WUH und eine positive Korrelation zu Aret_rel. Die Korrelationskoeffizienten sind jedoch für DON ausgeprägter als für HT2+T2. Vergleicht man die Ergebnisse der Korrelationsanalysen der Experimente mit F. graminearum und F. sporotrichioides, ergeben sich für beide Isolate sehr ähnliche Korrelationskoeffizienten hinsichtlich des Zusammenhangs mit den morphologischen Merkmalen. Tabelle 26: Gegenüberstellung der Korrelationsanalysen für FG und FS hinsichtlich AUDPC, FDK und DON bzw. HT2+T2 in Bezug auf die morphologischen Merkmale D1May, WUH und Aret_rel FG AUDPC_FG FDK_FG DON_FG D1May WUH Aret_rel -0,03 -0,61 0,62 -0,29 -0,74 0,62 -0,30 -0,73 0,61 FS AUDPC_FS FDK_FS HT2+T2_FS D1May WUH Aret_rel -0,04 -0,57 0,51 -0,31 -0,63 0,54 -0,12 -0,55 0,56 In den folgenden Streudiagrammen (Abbildung 32 bis 43) werden die Korrelationen von AUDPC und den Toxinen im Hinblick auf die morphologischen Merkmale für beide Pathogene dargestellt. 65 Blühdatum 50 50 r = -0,30 45 45 40 40 D1May D1May r = -0,03 35 30 35 30 25 0 200 400 AUDPC_FG 600 25 800 0 20000 40000 DON_FG 60000 Abbildung 32: Streudiagramm für AUDPC und Abbildung 33: Streudiagramm für DON und D1May D1May im Experiment mit FG im Experiment mit FG 50 50 r = -0,12 r = -0,04 45 40 40 D1May D1May 45 35 30 35 30 25 25 0 100 200 AUDPC_FS 300 400 0 1000 2000 HT2+T2_FS 3000 4000 Abbildung 34: Streudiagramm für AUDPC und Abbildung 35: Streudiagramm für HT2+T2 und D1May im Experiment mit FS D1May im Experiment mit FS 66 Wuchshöhe 110 110 100 90 90 WUH WUH r = -0,61 100 80 80 70 70 60 60 50 0 200 400 600 r = -0,73 50 800 0 20000 AUDPC_FG 40000 60000 DON_FG Abbildung 36: Streudiagramm für AUDPC und Abbildung 37: Streudiagramm für DON und WUH WUH im Experiment mit FG im Experiment mit FG 110 110 r = -0,55 100 90 90 WUH WUH r = -0,57 100 80 80 70 70 60 60 50 50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 AUDPC_FS 0 1000 2000 HT2+T2_FS 3000 4000 Abbildung 38: Streudiagramm für AUDPC und Abbildung 39: Streudiagramm für HT2+T2 und WUH im Experiment mit FS WUH im Experiment mit FS 67 Antherenretention 1,2 1,2 r = 0,61 1 1 0,8 0,8 Aret_rel Aret_rel r = 0,62 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0 0 0 200 400 600 800 0 20000 40000 Abbildung 40: Streudiagramm für AUDPC und Abbildung Aret_rel im Experiment mit FG Aret_rel im Experiment mit FG 1,2 41: Streudiagramm für DON und 1,2 r = 0,51 r = 0,56 1 1 0,8 0,8 Aret_rel Aret_rel 60000 DON_FG AUDPC_FG 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 AUDPC_FS 0 1000 2000 HT2+T2_FS 3000 4000 Abbildung 42: Streudiagramm für AUDPC und Abbildung 43: Streudiagramm für HT2+T2 und Aret_rel im Experiment mit FS Aret_rel im Experiment mit FS 68 5 Diskussion 5.1 Infektionsverlauf und fusariumbezogene Parameter Alle Sorten und Zuchtlinien zeigten nach der künstlichen Inokulation eine erfolgreiche Infektion, wobei es Unterschiede im Schweregrad der FHB-Ausprägung gab. Im zeitlichen Verlauf des Versuchs und mit fortschreitender Infektionsstärke fiel bei den laufenden Bonituren schnell auf, dass der Schweregrad der Infektion als auch die Infektionsausbreitung bei F. graminearum viel stärker war als bei F. sporotrichioides. Nach der Auswertung der Daten zeigte sich, dass die AUDPC-Werte für das Experiment mit F. graminearum doppelt so hoch sind als für F. sporotrichioides. Dies kann durch die höhere Aggressivität des Pathogens und der schnellere Infektionsverlauf durch die Produktion von DON als Virulenz-Faktor von F. graminearum erklärt werden. Sowohl beim Experiment für F. graminearum als auch für F. sporotrichioides zeigte sich in der Analyse eine starke positive Korrelation für den Zusammenhang des Infektionsverlaufs (AUDPC) mit den Fusarium geschädigten Körnern (FDK) (FG r=0,85; FS r=0,61), als auch mit den Mykotoxingehalten für DON (FG r=0,86) und für HT2+T2 (FS r=0,70) im Erntegut. Diese Ergebnisse decken sich mit einem 3-jährigen Weizenversuch im Freiland in Japan (Kubo et al. 2014). Sorten bzw. Zuchtlinien mit geringer FHB Befallsausprägung weisen auch einen geringeren Befall in den geernteten Körnern und einen niedrigeren Mykotoxingehalt auf. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass durch die visuelle Bonitur anhand der Infektionssymptome für Ährenfusariose auf den Schweregrad der Schädigung durch FHB im geernteten Getreide und der Kontamination durch Mykotoxine geschlossen werden kann. Dies hatten unter anderem auch schon Bai et al. (2001) beschrieben, indem sie Tests mit dem Befall von F. graminearum bei verschiedenen Weizensorten im Glashaus als auch im Feldversuch auf Zusammenhänge zwischen optisch messbaren Symptomen von FHB und dem daraus resultierenden DON-Gehalt im Korn machten. Auch im aktuellsten Review Artikel von Buerstmayr und Lemmens (2015) wird auf diese Zusammenhänge eingegangen, welche mit den vorliegenden Ergebnissen übereinstimmen. Auch der Anteil der fusariumbefallenen Körner in den jeweiligen Kornproben (FDK) korrelierte positiv mit den DON Werten bei F. graminearum (r=0,91), sowie mit HT2+T2 bei F. sporotrichioides (r=0,73). Hatte ein Genotyp einen hohen Prozentsatz an Fusarium geschädigten Körnern im Erntegut, waren auch die Mykotoxingehalte umso höher. Buerstmayr und Lemmens (2015) kommen zu ähnlichen Ergebnissen und erklären die enge Korrelation damit, dass die Auszählung von FDK am gleichen Kornmaterial wie die Toxinmessungen stattfinden. 69 Die eindeutige Korrelation sowohl von AUDPC als auch von FDK mit den Toxingehalten steht im Gegensatz zur Aussage von Bottalico und Perrone (2002) die postulierten, dass man nicht von der Resistenz einer Sorte gegenüber FHB Befall auf die Einlagerung von Mykotoxinen im Erntegut schließen könne. Bei der Resistenzzüchtung gegen Fusarium und um die Toxinwerte im Getreide zu reduzieren, kann daher eine Selektion auf Genotypen, die wenig visuellen Befall aufweisen bzw. nach der Ernte eine geringe Zahl an Fusariumkörnern im Erntegut aufweisen, zielführend sein. Wobei die Beurteilung anhand von FDK in Hinblick auf den Mykotoxingehalt im Korn sicherer scheint, da hier ein höherer Korrelationskoeffizient gegeben ist. Die Gegenüberstellung der fusariumbezogenen Parameter von beiden Experimenten ergab in allen Fällen eine positive Korrelation (siehe Tabelle 25). Vor allem der starke Korrelationskoeffizient der AUDPC-Werte der beiden Isolate FG und FS (r=0,74) ist interessant. Von den Resistenzeigenschaften der verschiedenen Genotypen und ihrem Verhalten gegenüber dem Befall von F. graminearum kann eine Anfälligkeit gegen F. sporotrichioides abgeleitet werden und umgekehrt. Dieses Resultat wird unterstützt von den Studien von Toth et al. (2008) und Kubo et al. (2014), die beschrieben, dass verschiedene Weizen Genotypen ähnliche Reaktionen gegenüber verschiedenen Fusarium Isolaten zeigten. Buerstmayr und Lemmens (2015) bestätigen in ihrem Review diese Theorie, da Fusariumresistenz nicht isolatspezifisch und artspezifisch ist. Dass die Resistenz gegenüber einer Fusarium-Art auch die Resistenz gegenüber einer anderen bedingt, ist eine wichtige Erkenntnis für zukünftige Versuche und Zuchtprogramme. So reicht die Inokulation mit einem einzelnen aggressiven Fusarium-Isolat aus, um auf allgemeine Fusariumresistenz zu testen (Buerstmayr and Lemmens 2015). 5.2 Einfluss der Sorten und Isolat-Wiederholungen Die Auswahl der Sorten hat sowohl für F. graminearum als auch für F. sporotrichioides einen signifikanten Effekt auf den Schweregrad der Infektion (FHB_B5), den Infektionsverlauf (AUDPC), auf die Anzahl der von Fusarium befallenen Körner (FDK) im Erntegut und damit auch auf den Mykotoxingehalt im geernteten Getreide. Diese Ergebnisse decken sich mit dem 3-jährigen Feldversuch von Kubo et al. (2014). Die Auswahl von möglichst resistenten Sorten für den Weizenanbau ist daher immer noch ein wirksames Mittel zur Vorbeugung gegen Ährenfusariose und eine Konzentration der Züchtung auf die Entwicklung resistenter Sorten absolut sinnvoll. Resistente Sorten verringern den Fusariumbefall und die Gefahr von Kontaminationen durch Mykotoxine. Anhand der Varianzanalysen wurde beim Merkmal AUDPC für beide Experimente ein signifikanter Unterschied in der Isolat-Wiederholung festgestellt. Der Grund liegt wahrscheinlich im 70 3 Wochen späteren Anbau der jeweiligen zweiten Wiederholung (WH 3 und 4), worauf hin diese Parzellen später entwickelt waren, später blühten und auch im Infektionsverlauf im Vergleich zu den Wiederholungen 1 und 2 hinten nach waren. Beim Merkmal FDK wurde bei F. graminearum ein signifikanter Effekt der IsolatWiederholung entdeckt, bei F. sporotrichioides hatte die Isolat-Wiederholung keine messbare Auswirkung. Auch dieser Umstand kann bei F. graminearum mit dem späteren Anbautermin der zweiten Wiederholung argumentiert werden. Bei F. sporotrichioides hatte dies keinen Effekt, da die Infektion dieser Fusarium-Art sich langsamer ausbreitet und in beiden Wiederholungen bis zur Ernte anscheinend genug Zeit war, dass sich die Infektionsfortschritte angleichen konnten. 5.3 Mykotoxine Auffällig bei der Mykotoxin-Analyse der geernteten Kornproben war, dass auch im Erntegut der mit F. sporotrichioides inokulierten Parzellen hohe DON Konzentrationen gefunden wurden, obwohl F. sporotrichioides normalerweise kein DON-Bildner ist. Dies ist auf den Umstand zurückzuführen, dass es aufgrund der regelmäßigen Aktivierung der Sprühberegnungsanlage während des Inokulationszeitraums und der damit einhergehenden optimalen Feuchtigkeit für Fusariumpilze, trotz Rand zwischen den Experimenten zu Nebeninfektionen von F. graminearum oder anderen auf dem Standort natürlich vorkommenden FusariumArten gekommen sein wird. Die DON-Werte sind jedoch um ca. 9-mal niedriger als im Experiment mit F. graminearum und wurden daher in die Auswertung miteinbezogen, aber nicht als das Ergebnis verzerrend angesehen. Im Erntegut der mit F. graminearum inokulierten Flächen wurde hauptsächlich wie erwartet das Mykotoxin Deoxynivalenol gefunden, nur in einigen wenigen Proben konnten auch geringe Kontaminationen mit HT-2 bzw. T-2 nachgewiesen werden, diese Werte wurden in der Auswertung nicht beachtet. Auch auf Zearalenon (ZON) wurden die Kornproben beider Experimente analysiert. Bei FS ließen sich bei kaum einer Probe ZON nachweisen, auch bei FG lagen die Messungen beim Großteil der Proben unter der quantifizierbaren Messgrenze (<LQ). Daher wurde dieses Toxin nicht in die Auswertung miteinbezogen. 5.4 Zusammenhänge mit morphologischen Merkmalen Mesterhazy (1995) als auch Hilton et al. (1999) berichteten in vorausgehenden Studien über einen direkten Einfluss der Wuchshöhe auf die Anfälligkeit auf FHB. Anders als Mesterhazy 71 (1995) erklärten Hilton et al. (1999) die geringere Anfälligkeit langstrohiger Sorten nicht nur durch den größeren Abstand zu potentiellem Infektionsmaterial durch Erntereste am Boden, sondern mit dem Zusammenwirken mehrerer Gene welches die erhöhte Resistenz hervorruft. Dies konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden, wie auch bei Hilton et al. wurden durch die Sprühnebelberegnung die Infektionsbedingungen auf Höhe der Ähren für alle Genotypen konstant gehalten. Es wurde sowohl für F. graminearum als auch für F. sporotrichioides eine negative Korrelation der Wuchshöhe mit den fusariumbezogenen Merkmalen AUDPC (FG r=-0,61; FS r=-0,57), FDK (FG r=-0,74; FS r=-0,63) und Mykotoxingehalt (FG r=-0,73; FS r=-0,55) nachgewiesen. Das bedeutet, je höher die Wuchshöhe, desto geringer die Anfälligkeit für eine FHB-Infektion und in weiterer Folge desto geringer der Besatz an fusariumbefallenen Körnern und die Kontamination mit Mykotoxinen. Das morphologische Merkmal der Antheren Retention, also der Einbehaltung der Antheren nach der Blüte innerhalb der Ährchen, zeigte in dieser Studie für beide Isolate eine direkte positive Korrelation mit AUDPC (FG r=0,62; FS r=0,51), mit FDK (FG r=0,62; FS r=0,54) und mit DON (FG r=0,61) bzw. mit HT2+T2 (FS r=0,56). Die Ergebnisse stehen in Einklang mit Untersuchungen von Graham and Browne (2009) und Skinnes et al. (2010), die ebenfalls einen Einfluss des Verhaltens der Antheren mit der Anfälligkeit für FHB bzw. dem Mykotoxingehalt nachweisen konnten. Eine hohe Rate an einbehalten Antheren scheint zu einer erhöhten Anfälligkeit einer Sorte auf FHB zu führen und desto höher waren auch im Endeffekt die Mykotoxingehalte im Erntegut. Skinnes et al. (2010) gehen davon aus, dass dieser Zusammenhang nicht an den speziellen Inhaltsstoffen (Betain und Cholin) der Antheren liegt, sondern daran, dass die einbehaltenen verblühten Antheren totes Material innerhalb der Ährchen darstellen, das von saprophytisch lebenden Pilzen wie Fusarium einfacher besiedelt und als Nahrungsquelle genutzt werden kann. Die Resultate deuten darauf hin, dass die Selektion auf die morphologischen Merkmale Antherenausstoß bzw. auf hohe Wuchshöhen daher zum Züchtungserfolg hinsichtlich FHBResistenz beitragen könnte. Hierbei muss jedoch beachtet werden, dass langstrohige Sorten zwar eine geringere Fusariumanfälligkeit aufweisen, diese aber auch zu stärkerem Lager neigen. Diese agronomischen Eigenschaften sind in der Praxis nicht erwünscht. Beim Merkmal Antherenausstoß hingegen sind keine unerwünschten agronomischen Eigenschaften betroffen, sodass Selektion auf hohen Antherenausstoß eine einfache und wirksame indirekte Selektion auf Fusariumresistenz darstellen könnte. Der Zeitpunkt der Blüte steht in keinem Zusammenhang mit der Infektionsanfälligkeit für FHB (AUDPC), weder für F. graminearum (r=-0,03), noch für F. sporotrichioides (r=-0,04). Geringe negative Korrelationskoeffizienten ergaben jedoch die Analysen von D1May auf FDK (FG r=-0,29; FS r=-0,31), DON (FG r=-0,30) und HT2+T2 (FS r=-0,12) für beide Isolate. Hier 72 ergibt sich die Schlussfolgerung, je früher der Blühtermin, desto höher die FDK-Werte und die Mykotoxingehalte. Dies steht aber im Widerspruch zur niedrigen Korrelation mit AUDPC, denn durch die regelmäßigen künstlichen Inokulationen hätten dieser These nach die frühblühenderen Genotypen auch einen Vorsprung im FHB-Befall haben müssen, was sich, falls zutreffend, in der AUDPC-Kurve widerspiegeln würde. Kubo et al. (2014) fanden bei ihren Versuchen keine signifikante Korrelation zwischen den fusariumbezogenen Merkmalen und dem Zeitpunkt des Ährenschiebens. Zusammenfassend kann gesagt werden, obwohl F. graminearum einen nahezu doppelt so hohen Krankheitsdruck auf die Weizenpflanzen als F. sporotrichioides ausübt, konnte in beiden Experimenten von der visuellen Bonitur auf FHB-Befall sowohl auf den Schweregrad der Schädigung durch FHB im Erntegut als auch auf den Mykotoxingehalt geschlossen werden. Diese Erkenntnis ist wichtig für Zuchtprogramme insbesondere in der Resistenzzüchtung von Winterweizen. Die Sortenauswahl spielt eine wichtige Rolle im Kampf gegen FHB und Mykotoxinbelastung im Getreide. Von der Resistenz gegenüber F. graminearum kann auf eine Resistenz gegen F. sporotrichioides geschlossen werden und umgekehrt. Außerdem können anhand von Selektion auf morphologische Merkmale wie Wuchshöhe und Antherenaustoß möglicherweise ein Zuchtfortschritt erreicht werden. Das Zusammenspiel der Gene, die eine Resistenz gegen FHB verursachen und den morphologischen Merkmalen, die anscheinend auch mit der Resistenz in Zusammenhang stehen, wird noch untersucht und ist Gegenstand aktueller Forschungen. 73 6 Literatur Abramson D, Clear RM, Smith DM (1993) Trichothecene production by Fusarium species isolated from Manitoba grainTrichothecene production by Fusarium species isolated from Manitoba grain. Canadian Journal of Plant Pathology 15:147-152 Agrios GN (2005) Plant Pathology, 5 edn. 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Boniturtermin .................44 Abbildung 13: mit Fusarium befallenes Ährchen ...................................................................44 Abbildung 14: Fusarium-Myzel (orange) sichtbar..................................................................45 Abbildung 15: Mit FHB befallene Kornanlage .......................................................................45 Abbildung 16: Histogramm für die AUDPC Werte der beiden Isolate FG und FS..................50 Abbildung 17: Histogramm für den FDK Wert in % der beiden Isolate FG und FS ................51 Abbildung 18: Histogramm für das Blühdatum über beide Experimente FG und FS .............54 Abbildung 19: Histogramm für das Merkmal Wuchshöhe (WUH) in cm über beide Experimente FG und FS .......................................................................................................55 Abbildung 20: Histogramm für das Merkmal relativer Antherenausstoß (Aret_rel) über beide Experimente FG und FS .......................................................................................................56 Abbildung 21: Infektionsverlauf von F. graminearum für UNG-136.16.7.4.7, Dakter, Capo und Karillon im Vergleich zum Mittelwert .....................................................................................57 Abbildung 22: Infektionsverlauf von F. sporotrichioides für UNG-136.16.7.4.7, Dakter, Capo und Karillon im Vergleich zum Mittelwert ..............................................................................58 Abbildung 23: Streudiagramm für AUDPC und FDK im Experiment mit F. graminearum ......59 79 Abbildung 24: Streudiagramm für AUDPC und DON im Experiment mit F. graminearum .....60 Abbildung 25: Streudiagramm für FDK und DON im Experiment mit F. graminearum ..........60 Abbildung 26: Streudiagramm für AUDPC und FDK im Experiment mit F. sporotrichioides ..61 Abbildung 27: Streudiagramm für AUDPC und HT2+T2 im Experiment mit F. sporotrichioides .............................................................................................................................................62 Abbildung 28: Streudiagramm für FDK und HT2+T2 im Experiment mit F. sporotrichioides .62 Abbildung 29: Streudiagramm der AUDPC-Werte der verschiedenen Genotypen für FG und FS ........................................................................................................................................63 Abbildung 30: Streudiagramm für FDK der verschiedenen Genotypen für FG und FS..........64 Abbildung 31: Streudiagramm für DON und HT2+T2 der verschiedenen Genotypen für FG und FS .................................................................................................................................64 Abbildung 32: Streudiagramm für AUDPC und D1May im Experiment mit FG ......................66 Abbildung 33: Streudiagramm für DON und D1May im Experiment mit FG ..........................66 Abbildung 34: Streudiagramm für AUDPC und D1May im Experiment mit FS ......................66 Abbildung 35: Streudiagramm für HT2+T2 und D1May im Experiment mit FS ......................66 Abbildung 36: Streudiagramm für AUDPC und WUH im Experiment mit FG ........................67 Abbildung 37: Streudiagramm für DON und WUH im Experiment mit FG .............................67 Abbildung 38: Streudiagramm für AUDPC und WUH im Experiment mit FS .........................67 Abbildung 39: Streudiagramm für HT2+T2 und WUH im Experiment mit FS ........................67 Abbildung 40: Streudiagramm für AUDPC und Aret_rel im Experiment mit FG.....................68 Abbildung 41: Streudiagramm für DON und Aret_rel im Experiment mit FG ........................68 Abbildung 42: Streudiagramm für AUDPC und Aret_rel im Experiment mit FS .....................68 Abbildung 43: Streudiagramm für HT2+T2 und Aret_rel im Experiment mit FS ....................68 80 7.2 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Mykotoxinproduktion von F. graminearum und F. sporotrichioides auf Getreide ..15 Tabelle 2: Überblick über die Mykotoxingruppe der Trichothecene .......................................16 Tabelle 3: Überblick über die Mykotoxingruppe der Fumonisine ...........................................18 Tabelle 4: Düngemaßnahmen ..............................................................................................33 Tabelle 5: Herbizidmaßnahmen............................................................................................33 Tabelle 6: Ergebnisse der Konidienauszählung ....................................................................37 Tabelle 7: Inokulationstermine ..............................................................................................39 Tabelle 8: Termine Antherenbonitur .....................................................................................42 Tabelle 9: Termine der Fusariumbonitur ...............................................................................42 Tabelle 10: Verwendetes Schema für die visuelle Fusariumbonitur (Bürstmayr, 2011) .........43 Tabelle 11: Mittelwert, Median, Minimum und Maximum für FHB_B5, AUDPC, FDK und DON im Experiment mit F. graminearum .......................................................................................48 Tabelle 12: Mittelwert, Median, Minimum und Maximum für FHB_B5, AUDPC, FDK, DON und HT2+T2 im Experiment mit F. sporotrichioides ..............................................................49 Tabelle 13: Mittelwert, Median, Minimum und Maximum für D1May, WUH und Aret_rel für die Experimente mit F. graminearum und F. sporotrichioides .....................................................49 Tabelle 14: Varianzanalyse für das Merkmal FHB_B5 für das Isolat FG über 2 Wiederholungen ...................................................................................................................51 Tabelle 15: Varianzanalyse für das Merkmal AUDPC für das Isolat FG über 2 Wiederholungen ...................................................................................................................52 Tabelle 16: Varianzanalyse für das Merkmal FDK für das Isolat FG über 2 Wiederholungen .............................................................................................................................................52 Tabelle 17: Varianzanalyse für das Merkmal FHB_B5 für das Isolat FS über 2 Wiederholungen ...................................................................................................................52 Tabelle 18: Varianzanalyse für das Merkmal AUDPC für das Isolat FS über 2 Wiederholungen ...................................................................................................................53 Tabelle 19: Varianzanalyse für das Merkmal FDK für das Isolat FS über 2 Wiederholungen 53 Tabelle 20: Varianzanalyse für das Merkmal Blühdatum in Anzahl der Tage nach dem 1. Mai (D1May) über 4 Wiederholungen ..........................................................................................54 Tabelle 21: Varianzanalyse für das Merkmal Wuchshöhe (WUH) in cm über 4 Wiederholungen ...................................................................................................................55 81 Tabelle 22: Varianzanalyse für das Merkmal Antherenausstoß (Aret_rel) über 4 Wiederholungen ...................................................................................................................56 Tabelle 23: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Parameter für das Experiment mit Isolat FG ........................................................................................................................................59 Tabelle 24: Korrelationskoeffizienten der einzelnen Parameter für das Experiment mit Isolat FS ........................................................................................................................................61 Tabelle 25: Korrelationsanalyse für die Parameter FHB_B5, AUDPC , FDK, DON und HT2+T2 für beide Experimente FG und FS ..........................................................................63 Tabelle 26: Gegenüberstellung der Korrelationsanalysen für FG und FS hinsichtlich AUDPC, FDK und DON bzw. HT2+T2 in Bezug auf die morphologischen Merkmale D1May, WUH und Aret_rel ................................................................................................................................65 82 8 Anhang Anhang 1: Liste der verwendeten Sorten und Zuchtlinien Name seed provided by Beschreibung 04 CY BH FU 25 FD Zuchtlinie/-stamm 1304.4.2_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1304.4.8_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1305.6.5_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1308.2.5_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1309.2.4_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1312.6.1_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1314.3.10_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1314.3.11_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1325.1.4_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1339.3.5_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1340.2.4_P1 IFA Zuchtlinie/-stamm 1350.6.3_P2 IFA Zuchtlinie/-stamm 1351.5.10_P2 IFA Zuchtlinie/-stamm 1354.2.2_P2 IFA Zuchtlinie/-stamm 1354.4.11_P2 IFA Zuchtlinie/-stamm 1360.5.10_P2 IFA Zuchtlinie/-stamm 1360.5.2_P2 IFA Zuchtlinie/-stamm 1363.3.10_P2 IFA Zuchtlinie/-stamm 1365.3.11_P2 IFA Zuchtlinie/-stamm 1366.3.9_P2 20568.1.3 IFA IFA Zuchtlinie/-stamm Zuchtlinie/-stamm 20812.2.2 IFA Zuchtlinie/-stamm 20818.1.2 A39.9.2.1 IFA FD Zuchtlinie/-stamm Zuchtlinie/-stamm A40 22 1 2 FD Zuchtlinie/-stamm Accroc FD ADAGIO Alchemy Züchter Zulassung Sorte R.A.G.T. 2009 Arvalis Sorte R.A.G.T. 2008 FD Sorte Limagrain 2002 Aligator Arvalis Sorte Unisigma 2009 Alixan Arvalis Sorte LG seeds 2005 ALLEZ Y Arvalis LG seeds 2011 Altigo Arvalis Sorte Sorte LG seeds 2007 AMBELLO Arvalis Sorte R.A.G.T. 2010 Apache Arvalis Sorte LG seeds 1998 AREZZO ARKEOS RAGT Sorte R.A.G.T. 2007 Sorte Sorte LG seeds 2011 Arlequin Arvalis Arvalis LG seeds 2007 As de cœur Arvalis Sorte LG seeds 2010 ASCOTT Arvalis Arvalis Sorte Sorte LG seeds 2012 ATHLON Saaten Union 2010 AZZERTI Arvalis Sorte R.A.G.T. 2009 Azzuro FD Sorte Limagrain 2006 83 Bagou Balance Arvalis FD Sorte Sorte Saaten Union 2006 k.A. 2001 Barok Arvalis Sorte Agri Obtentions 2009 BASMATI Arvalis Sorte Momont k.A. BERGAMO Bermude RAGT Arvalis Sorte Sorte R.A.G.T. 2011 Florimond Desprez 2007 BIO 4036 FD Zuchtlinie/-stamm BIO 5019 FD Zuchtlinie/-stamm BIO 719 FD Zuchtlinie/-stamm Bio110 FD Zuchtlinie/-stamm BONIFACIO Arvalis Arvalis Sorte Sorte R.A.G.T. 2011 Boregar R.A.G.T. 2007 CALABRO Capo RAGT IFA Sorte Sorte R.A.G.T. 2011 Probstdorfer Saatzucht 1989 CAVALINO Centrum RAGT FD Sorte Sorte R.A.G.T. 2011 Saatzucht Dieckmann GmbH 2001 CH761525 IFA Zuchtlinie/-stamm Charger Arvalis Sorte Florimond Desprez 1996 Chevalier Arvalis Sorte DSV Saaten 2006 COMPIL FD Sorte Florimond Desprez 2010 Cordiale Arvalis Sorte R.A.G.T. 2005 CROISADE Dakter FD FD Sorte Sorte Florimond Desprez 2011 LG seeds 2005 E044/119-1 IFA Zuchtlinie/-stamm Enno IFA Sorte k.A. k.A. F046/16-1 IFA Zuchtlinie/-stamm FAIRPLAY FD 07170 = Oregrain FD 08114 = Cellule Arvalis Sorte Secobra 2011 FD Zuchtlinie/-stamm FD Zuchtlinie/-stamm FD09153 FD Zuchtlinie/-stamm FD09160 FD11049 FD Zuchtlinie/-stamm FD Zuchtlinie/-stamm FD11067 FD Zuchtlinie/-stamm FD11084 FD Zuchtlinie/-stamm FD11097 FD11139 FD Zuchtlinie/-stamm FD Zuchtlinie/-stamm FD11172 FD Zuchtlinie/-stamm FD11175 FD12 FD Zuchtlinie/-stamm FD Zuchtlinie/-stamm FD12002 FD Zuchtlinie/-stamm FD12008 FD Zuchtlinie/-stamm FD12009 FD Zuchtlinie/-stamm FD12029 FD Zuchtlinie/-stamm FD12030 FD Zuchtlinie/-stamm FD12035 FD Zuchtlinie/-stamm FD12039 FD Zuchtlinie/-stamm FD12062 FD Zuchtlinie/-stamm FD12065 FD Zuchtlinie/-stamm 84 FD12067 FD Zuchtlinie/-stamm FD12073 FD Zuchtlinie/-stamm FD12077 FD Zuchtlinie/-stamm FD12105 FD Zuchtlinie/-stamm FD12117 FD Zuchtlinie/-stamm FD12120 FD Zuchtlinie/-stamm FD12125 FD Zuchtlinie/-stamm FD12148 FD Zuchtlinie/-stamm FD12158 FD Zuchtlinie/-stamm FD12164 FD Zuchtlinie/-stamm FD3 FLUOR FD Arvalis Zuchtlinie/-stamm Sorte FOLKLOR Fr1E1_1 FD IFA Sorte Zuchtlinie/-stamm Fr1E2_2 IFA Zuchtlinie/-stamm Furore IFA Sorte Golden Spike IFA Sorte Goncourt Arvalis GRAINDOR Unisigma 2010 Agri Obtentions 2011 Probstdorfer Saatzucht Utah Agricultural Experiment Station 1998 Sorte R.A.G.T. 2008 Arvalis Sorte Unisigma 2005 H5-169_B IFA Zuchtlinie/-stamm H5-363_B IFA Zuchtlinie/-stamm Illico Isengrain Arvalis Arvalis Sorte Sorte Syngenta 2010 Florimond Desprez 1997 J3326 JB ASANO RAGT FD Zuchtlinie/-stamm Sorte Saatzucht Breun 2008 Joker Arvalis IFA Sorte Zuchtlinie/-stamm DSV Saaten 2012 K_9_21Ab K_9_21aB IFA Zuchtlinie/-stamm K_9_21ab IFA Zuchtlinie/-stamm K_9_21AB IFA Zuchtlinie/-stamm K11_16_AB.9 IFA Zuchtlinie/-stamm K6_7_AB.7 IFA Zuchtlinie/-stamm K9_21_AB.16 IFA Zuchtlinie/-stamm K9_21_AB.18 IFA Zuchtlinie/-stamm KALYSTAR Arvalis Sorte Momont 2010 KARILLON Arvalis Sorte Agri Obtentions 2011 KWS PROLOG LAURIER FD Sorte Momont 2011 Arvalis Sorte Florimond Desprez 2012 LYRIK Sorte Sorte Agri Obtentions 2012 MANAGER Arvalis Arvalis Semalliance 2006 Mendel Mercato Arvalis Arvalis Sorte Sorte Florimond Desprez 2004 Florimond Desprez 2005 Midas IFA Sorte Saatzucht Donau 2008 MIROIR FD Sorte Saaten Union 2010 MUSIK Arvalis Sorte Agri Obtentions 2011 NOBLESKO Sorte Sorte R.A.G.T. 2011 Nogal Arvalis FD Florimond Desprez 2006 Nuage FD Sorte R.A.G.T. 2006 1999 85 OXEBO Arvalis Sorte P1_1335.6 IFA Zuchtlinie/-stamm P2_1351.5 IFA Zuchtlinie/-stamm Pakito PHARE Arvalis FD Player Premio Lemaire Deffontaines 2009 Sorte R.A.G.T. 2010 Sorte Florimond Desprez 2008 Arvalis Sorte k.A. k.A. Arvalis Sorte R.A.G.T. 2006 R10923 RAGT Zuchtlinie/-stamm Renan RHT_216 Arvalis IFA Sorte Zuchtlinie/-stamm Agri Obtentions 1989 RHT_269 IFA Zuchtlinie/-stamm RHT_423 RONSARD IFA Zuchtlinie/-stamm Arvalis FD Sorte Sorte Secobra 2011 Royssac R.A.G.T. 2003 RUBISKO RAGT Sorte R.A.G.T. 2011 RW21013 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21014 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21016 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21058 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21101 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21106 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21112 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21124 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21126 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21127 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21144 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21201 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21203 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21208 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21213 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21218 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21232 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW21233 RAGT Zuchtlinie/-stamm RW7730 RAGT Zuchtlinie/-stamm RWJ3649BC SAINT EX RAGT Arvalis Zuchtlinie/-stamm Sorte Secobra 2010 SCENARIO Arvalis Sorte R.A.G.T. 2010 SD36311 RAGT Zuchtlinie/-stamm SD41057 SE11 RAGT FD Zuchtlinie/-stamm Zuchtlinie/-stamm SE3 (Robigus) FD Zuchtlinie/-stamm Soissons Arvalis Sorte Florimond Desprez 1988 SOKAL Arvalis Sorte Caussade Semences 2010 SWEET Arvalis Arvalis Sorte Sorte Momont 2011 SY ALTEO Syngenta 2011 SY MOISSON Arvalis Sorte Syngenta 2011 SY TOLBIAC Arvalis Sorte 2011 T.macha-A IFA Syngenta Triticum macha "georgischer Dinkel" Zuchtlinie/-stamm 86 Timber TOBAK FD FD Sorte Sorte Saaten Union k.A. Florimond Desprez 2012 Toisondor TULIP Arvalis Sorte Sorte R.A.G.T. 2003 Saaten Union ungarische Zuchtlinie 2011 UNG-136.16.7.4.7 Arvalis IFA Zuchtlinie/-stamm 87 Anhang 2: Mittelwerte für FHB_B5, AUDPC, FDK, DON, HT2+T2 für FG und FS über zwei Wiederholungen und Mittelwerte für D1May, WUH, Aret_rel über 4 Wiederholungen Name F. graminearum FHB_B5 AUDPC FDK DON [%] [%] F. sporotrichioides FHB_B5 AUDPC FDK HT2+T2 [%] morph. Merkmale D1May WUH Aret_rel [µg/kg] [%] [µg/kg] [Tage] [cm] 04 CY BH FU 25 35,0 335,3 35,0 23000,0 25,0 236,1 8,8 2093,0 42,5 70,0 0,9 1304.4.2_P1 25,0 156,0 5,3 5250,0 22,5 127,8 3,5 296,0 36,8 81,3 0,2 1304.4.8_P1 22,5 174,4 6,3 6610,0 20,0 102,4 2,3 164,0 34,5 86,3 0,2 1305.6.5_P1 10,0 47,6 0,5 1560,0 9,0 56,4 2,0 89,0 41,0 96,3 0,3 1308.2.5_P1 17,5 153,4 5,0 7230,0 3,5 21,0 1,0 355,0 37,5 85,0 0,3 1309.2.4_P1 12,5 71,6 1,3 1590,0 12,5 60,6 2,0 238,0 45,0 98,8 0,3 1312.6.1_P1 22,5 177,0 6,3 3740,0 15,0 101,0 0,5 358,0 44,5 90,0 0,3 1314.3.10_P1 12,5 66,6 2,0 3230,0 15,0 72,2 0,8 188,0 42,0 85,0 0,3 1314.3.11_P1 15,0 113,7 4,3 4270,0 20,0 107,1 5,0 306,0 41,5 81,3 0,2 1325.1.4_P1 15,0 106,0 3,8 4100,0 6,0 39,4 1,0 514,0 41,0 76,3 0,4 1339.3.5_P1 20,0 168,0 10,0 7950,0 17,5 109,4 5,0 705,0 32,8 83,8 0,6 1340.2.4_P1 7,5 40,4 4,0 3120,0 10,3 48,8 1,3 340,0 40,0 82,5 0,3 1350.6.3_P2 10,0 56,6 2,0 1850,0 8,0 41,8 0,8 109,0 44,0 95,0 0,4 1351.5.10_P2 17,5 106,8 2,0 2280,0 5,5 27,8 1,3 138,0 42,5 91,3 0,2 1354.2.2_P2 12,5 104,4 10,0 5910,0 3,5 21,4 2,5 165,0 36,5 87,5 0,9 1354.4.11_P2 20,0 115,6 4,5 4610,0 15,0 69,2 3,3 196,0 45,0 90,0 0,3 1360.5.10_P2 22,5 153,0 4,5 2580,0 13,5 66,0 4,0 141,0 41,0 92,5 0,7 1360.5.2_P2 12,5 79,9 3,3 2240,0 6,5 32,2 3,8 159,0 39,5 91,3 0,6 1363.3.10_P2 15,0 102,4 4,0 3310,0 17,5 81,4 0,8 242,0 35,3 77,5 0,4 1365.3.11_P2 10,0 85,1 4,0 3650,0 0,8 7,2 1,3 112,0 43,0 83,8 0,5 1366.3.9_P2 12,5 76,2 2,8 3030,0 2,5 20,2 3,3 174,0 40,0 86,3 0,7 20568.1.3 7,5 49,4 1,3 3040,0 12,5 65,2 0,0 200,0 36,0 87,5 0,1 20812.2.2 7,5 52,0 1,5 2700,0 9,0 47,2 3,0 70,0 36,5 92,5 0,5 20818.1.2 7,5 44,0 2,8 3150,0 2,8 14,2 0,3 115,0 36,0 90,0 0,5 A39.9.2.1 9,0 60,4 6,5 5180,0 13,0 73,6 1,8 291,0 42,5 82,5 0,1 A40 22 1 2 15,0 80,4 3,0 2970,0 0,5 5,4 0,0 46,0 39,0 86,3 0,1 Accroc 45,0 337,2 46,3 35600,0 27,5 151,2 21,3 1682,0 29,5 66,3 0,8 ADAGIO 30,0 254,2 26,3 20600,0 17,5 115,6 13,0 1292,0 31,0 68,8 0,4 Alchemy 35,0 375,3 21,3 22500,0 22,5 198,1 11,5 1832,0 44,5 76,3 0,6 Aligator 40,0 385,3 35,0 19600,0 20,0 149,7 7,3 749,0 37,0 68,8 0,5 Alixan 35,0 336,1 31,3 24100,0 22,5 181,4 4,3 940,0 37,5 70,0 0,7 ALLEZ Y 55,0 537,0 32,5 25900,0 27,5 240,7 8,0 2489,0 40,0 81,3 0,8 Altigo 40,0 412,1 30,0 24800,0 35,0 275,7 17,5 3328,0 35,3 80,0 0,8 AMBELLO 22,5 176,2 21,3 21000,0 15,0 83,2 5,0 1021,0 31,0 71,3 1,0 Apache 30,0 279,3 28,8 20800,0 22,5 151,8 6,8 1263,0 34,8 68,8 0,1 AREZZO 27,5 246,0 27,5 22800,0 20,0 144,4 5,0 954,0 35,3 65,0 1,0 ARKEOS 50,0 473,4 40,0 24500,0 27,5 216,5 15,0 3653,0 34,0 70,0 0,8 Arlequin 35,0 365,3 25,0 20500,0 25,0 176,4 11,8 1052,0 37,5 68,8 0,4 As de cœur 35,0 332,1 20,0 18300,0 12,5 72,2 8,8 606,0 39,0 76,3 0,2 ASCOTT 45,0 447,0 32,5 26200,0 20,0 122,0 8,0 1153,0 34,5 65,0 0,8 88 ATHLON 30,0 246,4 30,0 21100,0 20,0 143,6 8,5 1528,0 30,3 68,8 0,6 AZZERTI 50,0 485,3 30,0 39900,0 20,0 204,7 10,0 1873,0 40,0 71,3 0,7 Azzuro 30,0 279,3 25,0 16100,0 25,0 189,7 6,3 605,0 41,0 78,8 0,4 Bagou 45,0 571,0 40,0 41100,0 30,0 274,1 11,3 3662,0 36,0 66,3 0,8 Balance 60,0 508,8 55,0 29500,0 32,5 207,8 5,0 2027,0 41,5 70,0 0,7 Barok 27,5 261,4 15,0 17300,0 25,0 200,9 3,5 1258,0 36,8 70,0 0,3 BASMATI 40,0 300,4 47,5 30800,0 15,0 100,6 7,5 2223,0 31,0 66,3 0,7 BERGAMO 30,0 275,3 12,5 12300,0 25,0 155,9 8,8 916,0 42,5 76,3 0,5 Bermude 35,0 346,7 35,0 26500,0 25,0 180,1 10,5 1923,0 41,0 76,3 0,7 BIO 4036 25,0 215,4 15,0 14800,0 17,5 98,0 3,8 764,0 31,0 72,5 0,3 BIO 5019 27,5 260,7 27,5 25600,0 17,5 126,4 10,0 2595,0 39,0 73,8 0,6 BIO 719 25,0 190,4 26,3 24700,0 12,5 102,6 6,3 775,0 30,8 71,3 0,6 Bio110 25,0 269,0 22,5 17700,0 15,0 93,4 4,5 881,0 36,5 73,8 0,6 BONIFACIO 45,0 394,1 30,0 22500,0 20,0 162,0 9,3 1020,0 32,8 71,3 0,7 Boregar 45,0 493,9 41,3 33800,0 20,0 143,7 16,8 2066,0 37,0 68,8 0,6 CALABRO 55,0 467,7 46,3 29200,0 32,5 311,4 17,5 1763,0 33,8 63,8 1,0 Capo 27,5 218,4 15,0 10800,0 10,0 48,2 4,3 503,0 39,0 95,0 0,3 CAVALINO 30,0 310,4 27,5 24100,0 20,0 162,4 10,5 1363,0 35,3 72,5 0,9 Centrum 20,0 163,1 8,8 8000,0 17,5 101,6 1,5 610,0 43,5 88,8 0,4 CH761525 40,0 304,1 33,8 20300,0 25,0 174,7 3,0 753,0 39,0 87,5 0,4 Charger 45,0 487,0 37,5 33900,0 27,5 220,1 7,8 2707,0 40,0 66,3 0,8 Chevalier 35,0 333,5 20,0 13500,0 20,0 143,1 6,5 967,0 42,0 80,0 0,6 COMPIL 40,0 355,3 33,8 33800,0 25,0 239,1 8,8 1003,0 38,0 67,5 0,7 Cordiale 40,0 365,3 35,0 26600,0 20,0 194,4 12,5 1189,0 39,0 66,3 0,6 CROISADE 30,0 235,4 36,3 26500,0 15,0 98,4 11,3 1817,0 31,0 68,8 0,2 Dakter 65,0 614,4 52,5 49100,0 25,0 137,2 18,8 3065,0 32,3 71,3 1,0 E044/119-1 20,0 146,6 10,0 14400,0 7,5 46,4 2,0 833,0 36,0 86,3 0,3 Enno 25,0 214,7 6,5 11200,0 15,0 113,6 3,5 419,0 40,0 86,3 0,1 F046/16-1 12,5 103,3 2,5 5350,0 15,0 99,6 1,8 292,0 36,3 92,5 0,6 FAIRPLAY 50,0 471,0 30,0 26200,0 20,0 147,4 4,3 951,0 43,5 73,8 0,8 FD 07170 = Oregrain FD 08114 = Cellule 30,0 231,2 31,3 27200,0 20,0 102,6 16,3 29,5 65,0 0,3 37,5 334,4 46,5 34400,0 27,5 215,0 13,8 2841,0 37,0 73,8 0,5 FD09153 40,0 350,4 37,5 30200,0 25,0 177,9 12,5 1638,0 35,3 66,3 0,9 FD09160 27,5 286,7 32,5 25600,0 17,5 136,6 7,3 1404,0 36,5 76,3 0,7 FD11049 40,0 363,8 13,0 12300,0 17,5 97,0 2,0 384,0 40,0 77,5 0,5 FD11067 55,0 518,8 45,0 31200,0 25,0 168,7 7,3 1350,0 39,5 73,8 0,7 FD11084 45,0 380,6 47,5 30400,0 20,0 161,8 9,3 1293,0 31,5 70,0 0,8 FD11097 45,0 397,9 36,3 26100,0 30,0 224,9 10,0 2031,0 36,5 72,5 0,9 FD11139 55,0 498,9 55,0 40800,0 20,0 105,6 12,5 1447,0 32,0 63,8 0,7 FD11172 35,0 327,8 18,0 20500,0 27,5 204,6 15,5 1327,0 38,0 72,5 0,7 FD11175 40,0 380,6 36,3 25100,0 30,0 159,2 20,0 1482,0 34,5 65,0 0,7 FD12 30,0 292,1 28,8 22700,0 15,0 98,6 6,0 2265,0 39,5 75,0 0,5 FD12002 40,0 371,4 27,5 21800,0 27,5 221,4 7,3 875,0 35,8 68,8 0,7 FD12008 30,0 251,4 32,5 21000,0 17,5 113,4 9,3 511,0 40,5 73,8 0,4 FD12009 25,0 196,6 25,0 21600,0 17,5 122,6 6,8 1523,0 31,5 66,3 0,4 FD12029 35,0 340,5 22,5 20500,0 22,5 194,1 5,8 1369,0 43,0 73,8 0,7 1080,0 89 FD12030 50,0 498,8 50,0 31300,0 27,5 194,7 9,8 1362,0 41,5 67,5 0,6 FD12035 30,0 378,8 40,0 28100,0 22,5 167,6 12,5 2039,0 34,5 66,3 1,0 FD12039 32,5 303,9 26,3 19900,0 17,5 157,8 7,0 1633,0 40,5 70,0 0,9 FD12062 50,0 422,0 35,0 37200,0 22,5 181,6 11,3 1673,0 34,5 67,5 0,8 FD12065 40,0 362,7 25,0 31900,0 27,5 192,9 9,3 1232,0 34,0 66,3 0,9 FD12067 45,0 462,1 46,3 34500,0 32,5 263,7 15,0 2376,0 36,0 71,3 0,6 FD12073 40,0 432,1 32,5 21900,0 25,0 142,4 6,5 1143,0 33,0 65,0 0,3 FD12077 40,0 405,3 26,3 25300,0 12,5 94,4 5,8 1943,0 39,5 73,8 0,9 FD12105 32,5 323,5 18,8 15100,0 15,0 154,1 8,8 1177,0 41,0 71,3 0,4 FD12117 35,0 357,0 26,3 18400,0 22,5 152,9 5,0 1654,0 40,0 73,8 0,7 FD12120 35,0 361,9 32,5 27200,0 20,0 148,8 10,8 1767,0 33,8 66,3 0,9 FD12125 40,0 397,0 27,5 28100,0 22,5 174,7 9,8 2103,0 39,5 65,0 0,9 FD12148 30,0 302,1 35,0 26600,0 22,5 166,8 12,5 1643,0 35,3 67,5 0,8 FD12158 55,0 527,4 56,3 27400,0 30,0 241,4 13,8 2999,0 35,3 67,5 0,5 FD12164 35,0 270,4 42,5 28600,0 25,0 177,2 9,3 1303,0 29,5 65,0 0,6 FD3 40,0 397,0 33,8 26700,0 27,5 194,1 15,0 2486,0 43,0 76,3 0,5 FLUOR 40,0 345,5 21,3 15700,0 27,5 174,9 5,5 753,0 38,0 77,5 0,3 Fr1E1_1 27,5 228,6 18,8 19100,0 15,0 89,2 5,0 819,0 30,3 70,0 0,2 Fr1E2_2 35,0 257,2 21,3 21700,0 22,5 124,2 4,5 516,0 29,5 68,8 0,2 Furore 32,5 327,0 22,5 21800,0 20,0 166,4 5,3 988,0 39,0 80,0 0,7 Golden Spike 35,0 311,8 20,0 32800,0 25,0 184,0 1,3 1040,0 39,0 93,8 0,6 Goncourt 50,0 468,0 46,3 31900,0 30,0 242,4 11,0 1282,0 34,5 67,5 1,0 GRAINDOR 25,0 220,6 25,0 21300,0 20,0 120,4 6,8 723,0 31,0 71,3 0,2 H5-169_B 20,0 163,0 4,5 7310,0 6,0 30,2 1,3 348,0 39,0 98,8 0,3 H5-363_B 27,5 244,7 7,5 9980,0 12,5 77,4 1,5 698,0 37,0 91,3 0,5 Illico 35,0 313,7 32,5 20600,0 15,0 91,2 5,8 854,0 33,8 73,8 0,3 Isengrain 40,0 483,5 40,0 34800,0 27,5 248,7 12,3 1751,0 36,0 68,8 0,9 J3326 27,5 273,9 25,0 23200,0 12,5 106,9 5,5 1009,0 41,5 67,5 0,7 JB ASANO 40,0 435,3 25,0 20800,0 30,0 166,0 6,0 1583,0 40,5 82,5 1,0 Joker 27,5 267,8 17,5 11900,0 20,0 132,7 5,0 1313,0 42,0 80,0 0,7 K_9_21AB 22,5 134,4 10,0 15200,0 12,5 61,2 4,5 394,0 29,5 66,3 0,5 K_9_21Ab 20,0 152,2 25,0 14100,0 12,5 103,0 5,5 570,0 31,5 80,0 0,3 K_9_21aB 20,0 172,0 11,8 15100,0 20,0 108,2 2,5 671,0 30,8 65,0 0,2 K_9_21ab 15,0 96,4 21,3 18300,0 20,0 116,6 5,8 1376,0 31,0 73,8 0,3 K11_16_AB.9 27,5 192,4 4,8 4280,0 22,5 138,2 4,0 574,0 40,0 86,3 0,3 K6_7_AB.7 22,5 185,4 9,3 8470,0 30,0 236,4 3,3 544,0 37,5 77,5 0,2 K9_21_AB.16 25,0 205,4 9,0 8060,0 20,0 142,6 2,0 318,0 33,8 71,3 0,3 K9_21_AB.18 20,0 134,4 10,0 11500,0 22,5 180,4 3,0 531,0 31,5 72,5 0,3 KALYSTAR 25,0 238,1 12,5 14600,0 27,5 182,7 4,0 564,0 41,0 72,5 0,2 KARILLON 50,0 447,5 41,3 48400,0 35,0 350,7 15,0 3368,0 38,0 71,3 0,6 LAURIER 40,0 398,7 40,3 31800,0 27,5 202,4 9,8 2087,0 36,5 72,5 1,0 LYRIK 40,0 383,5 25,0 28300,0 22,5 158,9 7,3 1396,0 37,3 68,8 0,6 MANAGER 27,5 243,5 22,5 12000,0 20,0 130,6 4,5 1449,0 42,0 78,8 0,6 Mendel 50,0 535,0 52,5 38200,0 22,5 198,7 11,3 2217,0 39,5 65,0 0,9 Mercato 30,0 276,2 40,0 29600,0 20,0 139,4 15,0 1936,0 31,5 61,3 0,9 Midas 25,0 242,1 13,8 12600,0 17,5 115,0 2,0 988,0 39,0 81,3 0,5 90 MIROIR 35,0 266,2 17,5 22500,0 20,0 94,4 6,8 604,0 29,5 70,0 0,4 MUSIK 45,0 460,7 50,0 43900,0 30,0 260,6 17,5 3523,0 34,3 57,5 0,9 NOBLESKO 55,0 468,8 33,8 25700,0 17,5 144,4 8,5 1477,0 41,5 73,8 0,8 Nogal 50,0 356,4 46,3 32300,0 27,5 117,8 22,5 1078,0 28,8 67,5 0,9 Nuage 30,0 320,7 27,5 22400,0 17,5 137,7 10,0 632,0 39,0 72,5 0,5 OXEBO 27,5 222,1 22,5 14500,0 17,5 93,8 4,3 997,0 40,0 75,0 0,3 P1_1335.6 12,5 86,4 4,5 5190,0 15,0 71,2 3,0 292,0 39,5 83,8 0,2 P2_1351.5 12,5 84,4 3,0 2740,0 15,5 66,6 0,5 157,0 40,5 88,8 0,3 Pakito 37,5 318,0 46,3 27800,0 17,5 125,4 7,5 1247,0 32,0 70,0 0,5 PHARE 45,0 440,5 33,8 25600,0 25,0 222,1 4,5 738,0 41,0 71,3 0,8 Premio 45,0 462,1 43,8 27600,0 25,0 188,6 13,8 2869,0 36,0 71,3 0,9 R10923 27,5 308,8 30,0 18900,0 20,0 141,4 5,0 594,0 43,0 73,8 0,7 Renan 20,0 174,4 11,8 10600,0 17,5 108,0 5,8 953,0 37,5 76,3 0,4 RHT_216 12,5 84,4 2,5 3370,0 5,0 42,2 2,0 558,0 36,5 80,0 0,4 RHT_269 22,5 172,6 7,5 8330,0 22,5 111,4 1,8 609,0 34,5 80,0 0,5 RHT_423 12,5 83,2 2,8 5370,0 27,5 191,0 2,0 453,0 33,3 75,0 0,7 RONSARD 45,0 421,4 35,0 39000,0 20,0 153,2 8,0 1306,0 33,5 62,8 0,5 Royssac 50,0 413,0 56,5 43500,0 35,0 311,7 18,8 3357,0 32,0 63,8 0,8 RUBISKO 27,5 268,0 30,0 23000,0 15,0 96,2 8,0 1203,0 33,8 65,0 0,7 RW21013 40,0 440,7 37,5 24600,0 25,0 176,4 15,0 1212,0 33,8 67,5 1,0 RW21014 32,5 308,4 26,3 22000,0 22,5 198,4 11,8 1744,0 36,5 68,8 0,9 RW21016 30,0 316,7 22,5 21300,0 25,0 165,0 6,8 1432,0 36,5 76,3 0,6 RW21058 30,0 291,4 42,5 22300,0 17,5 122,8 12,5 1385,0 31,5 65,0 0,9 RW21101 65,0 533,2 50,0 40100,0 30,0 254,6 17,5 2490,0 33,8 65,0 0,8 RW21106 32,5 266,4 28,8 21400,0 20,0 154,2 5,0 818,0 36,0 71,3 0,7 RW21112 35,0 340,7 30,0 24000,0 27,5 223,7 12,5 1853,0 36,5 71,3 0,8 RW21124 45,0 440,7 52,5 36500,0 25,0 197,4 22,5 2469,0 36,0 67,5 0,5 RW21126 50,0 557,9 54,0 37200,0 35,0 293,8 17,5 2098,0 36,0 68,8 1,0 RW21127 22,5 193,6 26,3 22900,0 17,5 131,8 11,3 1458,0 31,5 66,3 0,7 RW21144 40,0 302,9 36,3 20900,0 20,0 160,8 6,5 1047,0 32,5 68,8 0,9 RW21201 30,0 290,7 37,5 22900,0 22,5 172,4 7,3 1103,0 39,0 75,0 0,7 RW21203 50,0 445,3 37,5 21700,0 22,5 154,6 12,5 1077,0 42,0 76,3 0,8 RW21208 45,0 380,6 37,5 23300,0 25,0 172,0 12,5 1102,0 31,8 66,3 0,6 RW21213 22,5 213,7 20,0 18100,0 20,0 166,6 6,8 991,0 37,0 72,5 0,7 RW21218 40,0 366,4 35,0 27400,0 22,5 154,4 6,0 1327,0 34,8 70,0 0,9 RW21232 50,0 492,7 31,3 27600,0 17,5 85,2 15,0 2125,0 33,0 66,3 0,7 RW21233 40,0 434,4 40,0 22000,0 27,5 224,6 7,3 1030,0 37,0 68,8 1,0 RW7730 27,5 273,5 25,0 16300,0 17,5 137,7 6,8 2351,0 40,5 73,8 0,5 RWJ3649BC 40,0 324,1 27,5 18000,0 17,5 114,0 3,8 740,0 39,5 71,3 0,5 SAINT EX 40,0 287,2 45,0 23700,0 22,5 116,4 7,3 929,0 29,5 63,8 0,8 SCENARIO 40,0 401,4 32,5 28000,0 22,5 199,0 4,0 1603,0 33,8 65,0 0,9 SD36311 45,0 340,4 40,0 22800,0 17,5 117,4 15,0 1461,0 30,3 68,8 0,7 SD41057 45,0 361,8 21,3 13500,0 17,5 117,6 5,0 877,0 41,5 80,0 0,7 SE11 50,0 552,3 49,0 39900,0 25,0 242,1 8,8 3234,0 40,0 75,0 0,7 SE3 (Robigus) 40,0 430,5 23,8 25700,0 20,0 148,1 4,0 1537,0 42,5 70,0 0,7 Soissons 30,0 265,6 22,5 26900,0 20,0 122,4 9,3 1303,0 31,0 71,3 0,8 91 SOKAL 27,5 278,1 22,5 16100,0 20,0 152,8 2,3 490,0 36,5 68,8 0,1 SWEET 40,0 393,5 45,0 30100,0 22,5 171,9 5,5 2293,0 36,5 71,3 0,8 SY ALTEO 30,0 224,4 31,3 23300,0 20,0 119,8 2,0 1142,0 30,3 71,3 0,4 SY MOISSON 35,0 347,8 30,0 23100,0 25,0 127,6 6,8 1105,0 35,3 70,0 0,9 SY TOLBIAC 30,0 288,1 23,8 20200,0 22,5 203,1 8,5 1422,0 39,8 76,3 0,7 T.macha-A 22,5 198,4 1,5 13100,0 1,8 8,2 0,0 314,0 38,8 103,8 0,3 Timber 50,0 555,0 40,0 31400,0 25,0 232,1 8,5 1468,0 43,0 70,0 0,8 TOBAK 45,0 474,0 36,3 32600,0 25,0 194,1 12,3 2027,0 42,0 77,5 0,9 Toisondor 60,0 537,0 54,0 39500,0 30,0 270,7 18,8 3059,0 39,0 62,5 1,0 TULIP 30,0 266,6 17,3 17500,0 30,0 192,4 6,8 527,0 32,8 76,3 0,5 215,0 36,0 90,0 0,0 760,0 37,8 84,1 0,4 UNG-136.16.7.4.7 4,0 25,4 0,3 2120,0 0,6 3,8 0,3 WW21356.1 21,7 187,3 7,6 9760,0 14,6 108,0 2,6 92
