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6.4 Bakteriophagen
Aber nicht nur die Stabilität von mRNA, sondern auch die
Stabilität von Proteinen steht im Dienste der Regulation
genetischer Aktivität. Als Beispiel verweisen wir auf den
Abbau des σ32-Proteins bei der Regulation von Hitzeschock-Genen (▶ Abb. 6.19). Andere Beispiele lernen wir
kennen, wenn auf den folgenden Seiten die Regulation
der Gene des Bakteriophagen Lambda zur Sprache
kommt.
Methode 6.1
6.4 Exkurs: Bakteriophagen
Wie die Viren, die Tier- oder Pflanzenzellen infizieren,
bestehen Bakteriophagen, die Bakterien infizieren, aus
zwei Komponenten, aus einem Nucleinsäuremolekül und
einer Hülle aus zahlreichen Proteinbausteinen. Man
kennt viele verschiedene Bakteriophagen, die E. coli-Zellen infizieren. Eine erste Einteilung orientiert sich nach
der Art der Nucleinsäure:
● DNA-haltige Bakteriophagen wie T 2, T 4, T 7, Lambda
(λ), M13 oder fd.
● RNA-haltige Bakteriophagen wie f2, MS 2, R17 und Qβ.
Definition
L
●
Bakteriophagen – oder kurz: Phagen – sind Viren, die
Bakterien infizieren.
6
Grundsätzlich können Bakteriophagen mit dem Elektronenmikroskop sichtbar gemacht und gezählt werden. Das
wäre aber für Routinemessungen viel zu umständlich
und praktisch nicht durchführbar. Stattdessen benutzt
man das einfache Plattierungsverfahren (Methode 6.1)
(S. 127).
d
●
Der Plaque-Assay
Eine Agarplatte wird mit einer großen Menge Bakterien
(108) besät, sodass die zahlreich entstehenden Kolonien
vollständig die Oberfläche bedecken. Gibt man zusammen
mit den Bakterien einige wenige (1–200) Phagen auf die
Agarplatte, dann bildet sich dort, wo ein intaktes Phagenpartikel hingelangt ist, ein Plaque (Loch) im Bakterienrasen
(▶ Abb. 6.34). Der ursprüngliche Phage infiziert eine günstig gelegene Bakterienzelle; diese Zelle lysiert nach einer
gewissen Zeit, gibt 100–200 Phagennachkommen frei, die
ihrerseits benachbart gelegene neue Zellen angreifen usw.
Schließlich sind so viele Bakterienzellen lysiert, dass ein
deutlich sichtbares Loch im sonst trüben Bakterienrasen erscheint. Die Größe und Art (trübe, klar oder gesprenkelt)
des Plaques sind oft typisch für eine Phagenart. Manche
Phagenmutanten haben eine vom Wildtyp verschiedene
Plaquemorphologie.
Abb. 6.34 Plaques, entstanden durch die Infektion von
E. coli mit dem Bakteriophagen T 7. Etwa 20 infektiöse
Partikel des Bakteriophagen T 7 wurden mit etwa 100
Millionen Zellen des Bakterienstammes E. coli-B auf der
Oberfläche einer Agarplatte verteilt. Nach 10–12-stündiger
Bebrütung sieht man Plaques im trüben Bakterienrasen. Jeder
Plaque ist durch ein einziges infektiöses Phagenpartikel
entstanden.
127
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●
die Synthese der mRNA zum Halt bringen. Auch kann
von entsprechend gefalteten 5′-Nicht-Codierungssequenzen und unter bestimmten Bedingungen eine ribozymartige Spaltung der eigenen mRNA ausgehen.
In einigen Genen kann unter bestimmten Bedingungen
auch der Gegenstrang transkribiert werden. Es entsteht
eine Antisense-RNA, die sich mit der mRNA zu einem
RNA-Doppelstrang zusammenlegt und dadurch die Einleitung der Translation verhindert. Solche RNA-Doppelstrang-Strukturen begünstigen den Abbau der mRNA.
Überhaupt kann die Stabilität von mRNAs über eine
Aktivierung oder Hemmung spezieller RNA-abbauender Enzyme (RNasen) reguliert werden. Nebenbei bemerkt, ist die (posttranskriptionelle) Regulation der
Genaktivität über komplementäre (Antisense-)RNA und
den darauffolgenden Abbau von mRNA ein Mechanismus, der bei Eukaryoten eine große Bedeutung hat und
ein erhebliches Interesse unter Molekular- und Zellbiologen findet (s. Kap. 18).
Genetik von E. coli
6
Temperente Phagen können alternative Infektionswege
einschlagen (▶ Abb. 6.36):
● Vermehrung innerhalb der Wirtszelle und Zerstörung
der Zelle durch Lyse (lytischer Zyklus)
● Einbau der Phagen-DNA in das Genom der Wirtszelle
(lysogener Zyklus)
Wird die Phagen-DNA in das Bakterien-Chromosom eingebaut, wird sie von Bakterien-Generation zu BakterienGeneration weitergegeben wie ein authentisches Stück
des bakteriellen Genoms (Temperenz). Aber die eingebaute Phagen-DNA bleibt eine Gefahr für die Wirtszelle,
denn ultraviolette Strahlen, bestimmte Arten von Chemikalien und andere Einflüsse induzieren den Übergang
in den lytischen Zyklus und somit ihre Freisetzung. Darauf folgen die Expression der Phagen-Gene, die Replikation der Phagen-DNA, der Zusammenbau von Phagennachkommen und schließlich die Lyse der Wirtszelle. Aus
diesem Grund bezeichnet man die eingebaute LambdaDNA auch als Prophage. Bakterien mit (induzierbaren)
Prophagen heißen lysogene Bakterien.
Merke
H
●
Beim lytischen Zyklus vermehrt sich der Phage unmittelbar nach der Infektion in der infizierten Wirtszelle und
die Phagennachkommen werden durch Lyse der Wirtszelle freigesetzt.
Beim lysogenen Zyklus wird die Phagen-DNA in das
Genom der infizierten Zelle eingebaut (Prophage) und so
an die nächsten Bakteriengenerationen weitergegeben.
Durch äußere Einflüsse kann der lysogene Zyklus in den
lytischen übergehen.
Noch einige Worte zu den anderen Phagenarten, die in
der ▶ Abb. 6.36 gezeigt sind.
Basisplatte
mit Spikes
DNA
(doppelsträngig)
168 903 bp
DNA
(doppelsträngig)
48 502 bp
DNA
(einzelsträngig)
ringförmig
6407 Nucleotide
RNA
(linear)
3569 Nucleotide
Abb. 6.35 Einige E. coli-Phagen. Die Zeichnungen vermitteln
einen Eindruck von der Vielfalt der Formen. Sie sind nicht
maßstabsgerecht.
128
▶ M13. Die lang gestreckten – oder, wie man sagt, filamentösen (fadenförmigen) – Phagen wie M13 oder fd
enthalten ringförmige und – als bemerkenswerte Ausnahme – einzelsträngige DNA als genetisches Material.
Der Phage M13 wurde zu einem besonders wichtigen
Hilfsmittel der Gentechnik entwickelt. Aus diesem Grund
erfahren wir mehr über M13 im Kap. 26.3.
▶ MS 2. Der Phage MS 2 ist ein Beispiel einer längeren
Reihe von Phagen, die RNA als genetisches Material besitzen. Die genomische RNA mit ihren 3 569 Nucleotiden codiert vier Proteine: das Haupthüllprotein, von denen 180
Exemplare die icosahedrale Virushülle bilden, ein zweites
Hüllprotein, das für die Bindung an die Zelloberfläche
verantwortlich ist und vermutlich eine Funktion beim Viruszusammenbau hat, eine RNA-abhängige RNA-Polymerase zur Replikation des Virusgenoms und ein Protein für
die Lyse der Wirtszelle.
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Experimente mit Bakteriophagen, insbesondere mit den
beiden sehr nahe verwandten Phagen T 2 und T 4 (T steht
für Typ), haben in den Jahren zwischen 1945 und 1965
sehr entscheidend zur Entwicklung der modernen Genetik beigetragen. Bis heute bleiben sie ein faszinierendes
Objekt molekularbiologischer Forschung, das wir aber in
diesem Buch nicht nachzeichnen können. Einige Bemerkungen müssen genügen.
Die Phagen T 2 und T 4 sind kompliziert aufgebaut: Sie
bestehen aus einem Kopfteil, der die Form eines Icosahedrons (20 gleiche Flächen) hat, und einem aus vielen verschiedenen Proteinen zusammengesetzten Schwanzteil
mit Fasern (▶ Abb. 6.35). Der Kopf umschließt das Phagen-Genom, eine doppelsträngige DNA aus etwa
170 000 bp mit ungefähr 300 Genen. Bei der Infektion
nehmen die Schwanzfasern ersten Kontakt mit der Bakterienoberfäche auf. Dadurch werden strukturelle Veränderungen im gesamten Schwanzteil induziert, der eine Röhre bildet, durch die die DNA aus dem Kopf in das Innere
der Wirtszelle gelangt. Innerhalb von 20–30 min werden
dort Phagen-Gene exprimiert, Phagen-DNA repliziert
und schließlich neue Phagen aus den Strukturproteinen
und der Phagen-DNA zusammengesetzt. Die Infektion endet mit der Auflösung der Zellwand (Lyse) und dem Freisetzen von bis zu 200 Nachkommen. Phagen, deren Infektionsweg immer mit der Lyse der Wirtszelle endet, bezeichnet man als virulente Phagen.
Der Unterschied zu virulenten Phagen sind temperente
Phagen, zu denen der Bakteriophage Lambda gehört.
Über Lambda wird ausführlich auf den folgenden Seiten
berichtet. Deswegen folgt hier nur ein Abriss des Infektionswegs als Illustration des Unterschieds zur lytischen
Infektion von T 2 und T 4.
lytischer Weg
lysogener Weg
Abb. 6.36 Infektionsablauf bei temperenten Phagen. Weitere
Erläuterungen s. Text.
Nach dem Eindringen in die Wirtszelle dient die Phagen-RNA direkt als mRNA. Wenn dann genügend viel virale RNA-Polymerase gebildet wurde, beginnt der eigentliche Vermehrungsprozess mit der Bereitstellung immer
größerer Mengen an RNA für die Translation und als Genome für Phagennachkommen. Übrigens verfolgt das Poliovirus in infizierten menschlichen Zellen eine im Prinzip
ähnliche Vermehrungsstrategie (S. 401).
Trotz aller drastischen molekularbiologischen Unterschiede haben filamentöse DNA-Phagen wie M13 und
icosahedrale RNA-Phagen wie MS 2 eine Gemeinsamkeit:
Sie infizieren ausschließlich Bakterien mit F-Pili. Anders
gesagt, nur F+- und Hfr-Bakterien sind Wirtszellen, weil
sowohl M13 und andere filamentöse DNA-Phagen als
auch MS 2 und andere verwandte RNA-Phagen ihre Anheftungsstellen auf Strukturelementen eines F-Pilus finden.
6.4.1 Ausblick
Wie eingangs zu diesem Abschnitt gesagt, kann man die
Bedeutung der Phagenforschung für die frühe Geschichte
der molekularen Genetik nicht hoch genug einschätzen.
Aber Phagenforschung ist für Molekularbiologen auch
weiterhin interessant. Ein Beispiel für eine ungelöste Frage ist, wie die langen DNA-Fäden in den engen Raum der
Phagenköpfe gelangen. Weiterhin lassen sich an Phagen
gut die komplizierten Wechselwirkungen zwischen den
einzelnen Komponenten der genetischen Regulation untersuchen. Das ist für das Design genetischer Schaltkreise
interessant, ein Gebiet der Biotechnologie und der synthetischen Biologie.
Ein anderes aktuelles Forschungsgebiet betrifft die Evolution von Viren. Alle Viren und damit auch alle Bakteriophagen haben einen Lebenszweck, nämlich sich so
schnell und so oft zu vermehren wie möglich. Aber warum haben sie dann so unterschiedliche Genome – einige
nur mit einem halben Dutzend Genen ausgestattet, andere mit Hunderten von Genen? Entstammen sie unterschiedlichen Evolutionswegen? Überhaupt – wie sind
Phagen entstanden?
Schließlich das weite Feld der Ökologie. Erst seit einigen Jahren ist deutlich geworden, wie weit Phagen verbreitet sind. Die Weltmeere wimmeln nur so von Phagen.
Je nach Geografie und Jahreszeit können 103 bis über 106
Phagen in einem Milliliter Meerwasser vorkommen. Womit Phagen die häufigste Form irdischen Lebens sind.
Phagen im Meer haben übrigens nichts mit Umweltverschmutzung und dergleichen zu tun, sondern sind eine
natürliche Konsequenz aus dem Aufbau des Mikroplanktons, zu dem auch Bakterien und Archaeen gehören. Aber
was machen die vielen Phagen im Meer, haben sie eine
ökologische Funktion und, wenn ja, welche?
6
6.5 Der Bakteriophage Lambda
und seine Gene
Seit Anfang der 1950er-Jahre erforschen Mikrobiologen
und Genetiker den Bakteriophagen Lambda (▶ Abb. 6.37).
So hat sich viel Wissen angesammelt. Das ist der Grund,
warum Lambda als handliches experimentelles System
für Untersuchungen grundsätzlicher Fragen zu Genexpression, Replikation und Rekombination eingesetzt
wird, warum Lambda schon früh als wichtiges Werkzeug
in der Gentechnik gedient hat und immer noch dient und
warum heute Elemente des Lambda-Genoms für Schaltkreise in der synthetischen Biologie verwendet werden.
Aber darüber hinaus bleibt Lambda auch ein eigener Gegenstand molekularbiologischer Arbeiten, denn trotz der
langen Forschungsgeschichte sind mehrere Phagen-Gene
noch wenig oder gar nicht charakterisiert.
In diesem Abschnitt geht es um einige grundlegende
Mechanismen der genetischen Regulation der LambdaGene.
Die Infektion beginnt mit der Anheftung des Phagen
an ein spezifisches Protein (Rezeptor) auf der Oberfläche
und dem Eindringen der DNA in die Bakterienzelle. Die
bakterielle RNA-Polymerase liest dann die genetische Information einiger Gene des Phagengenoms ab. Daraufhin
wird einer der beiden Entwicklungswege eingeschlagen:
entweder die lytische Vermehrung oder der lysogene Zy-
129
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6.5 Bakteriophage Lambda
Genetik von E. coli
Lambda-DNA nach Extraktion
aus Phagenpartikeln
lockerer Ringschluss durch
Wasserstoffbrücken zwischen
den komplementären Basen
der Einzelstrangenden
kovalente Bindung zwischen
den Nucleotiden am 3'- und
am 5'-Ende eines der Stränge
durch das Enzym
Polynucleotid-Ligase
Abb. 6.37 Der Bakteriophage Lambda.
a Elektronenmikroskopisches Bild (Kopfdurchmesser: 50–
60 nm). (Aufnahme: U. Ramsperger, Konstanz)
b Interpretationsskizze: Kopf, Schwanz und Schwanzfaser sind
bezeichnet.
6
klus (▶ Abb. 6.36). Der größte Teil des folgenden Textes
betrifft die Frage nach den genetischen Grundlagen für
die Entscheidung zwischen Lyse und Lysogenie. Dies ist
eine komplexe Angelegenheit, die hier nur in Umrissen
skizziert werden kann.
Eine ausgezeichnete Einführung in die Biologie des
Phagen Lambda bietet das klassische Buch von Mark
Ptashne „A Genetic Switch“ (2004) [7].
6.5.1 Das Lambda-Genom
Die DNA im Phagenpartikel ist linear und doppelsträngig
mit überstehenden, kurzen, einzelsträngigen Enden aus
je 12 Nucleotiden. Die Einzelstrangenden sind komplementär: Sie können sich über Wasserstoffbrücken aneinander binden und die lineare DNA zu einem Ring schließen. Bald nach der Infektion werden die Enden durch ein
Enzym namens Ligase (S. 172) kovalent verknüpft. Der
entstandene DNA-Ring wird mithilfe des Enzyms Gyrase
(S. 185) verdrillt (▶ Abb. 6.38).
So ist das genetisch aktive Lambda-Genom ringförmig
geschlossen und die Lambda-Genkarte wird als Kreis abgebildet (▶ Abb. 6.39). Die Enden der ursprünglich linearen DNA befinden sich an der mit m/m’ bezeichneten
Stelle – man spricht auch von der cos-Stelle als Abkürzung für cohesive, also kohäsiv oder klebrig, weil hier die
beiden komplementären Einzelstrangenden aneinanderbinden.
Durch die Pionierarbeiten von Fred Sanger und Mitarbeitern ist die vollständige Sequenz der ringförmigen
Lambda-DNA schon seit 1982 bekannt. Sie besteht aus
48 502 bp mit 73 offenen Leserastern und zahlreichen
130
Abb. 6.38 Bildung von Lambda-DNA-Ringen.
Kontrollregionen wie Promotoren und Operatoren dazwischen.
Zunächst ein Überblick über die wichtigsten proteincodierenden Gene.
Proteincodierende Gene
Die Gene wurden ursprünglich über Mutanten identifiziert, von denen man zunächst nicht mehr wusste, als
dass sie sich unter den üblichen Bedingungen des PlaqueTests auf Wildtyp-Bakterien nicht vermehren können.
Diese Gene wurden einfach durch Großbuchstaben gekennzeichnet: A, B, C, … N, O, P usw. Obwohl man inzwischen die Funktion der Gene kennt, nutzt man weiterhin
die ursprüngliche Bezeichnung. Man spricht also vom
Gen-A-Protein, Gen-B-Protein, Gen-N-Protein oder kurz:
vom A-Protein, B-Protein, N-Protein usw.
Andere Gene erhielten ihre Bezeichnung von der Besonderheit des Phänotyps. Die wichtigen Gene cI, cII und
cIII wurden über Mutanten identifiziert, die statt der normalen trüben Plaques unter den üblichen Bedingungen
klare (clear) Plaques bilden. Die Produkte der drei Gene
cI, cII und cIII haben Funktionen bei der Regulation der
Lyse-Lysogenie-Entscheidung. Ihr Fehlen treibt die Entwicklung in Richtung Lyse. Deswegen sind die Plaques
klar, weil jeder begonnene Infektionsprozess mit einer Lyse endet. Auch das Protein, das vom Gen cro codiert wird
(cro, control of repressor and other genes) (S. 65), greift in
die Lyse-Lysogenie-Entscheidung ein.
Die red-Gene haben ihre Bezeichnungen von dem beobachteten Phänotyp: reduction of recombination. Über
diese Gene wird hier nichts Weiteres gesagt, denn Re-
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ringförmige DNA als
Superhelix
6.5 Bakteriophage Lambda
Replikation
PL
N
att
cI
cIII
gam
red
Rekombination
PI
PM
„späte“ Regulation
PE
cII OP
cro
Regulation
Lyse
Q
PR
Abb. 6.39 Eine Genkarte des Phagen Lambda.
Erläuterungen s. Text.
S
R
PR'
m' (cos)
m
A
xis
int
B
C
D
Phagenkopf
E
J
K L
MH
T
G
V
U
Z
6
Phagenschwanz
kombination ist ein Thema, das ausführlich und zusammenhängend im Kap. 10 zur Sprache kommt.
Die Produkte der Gene int und xis sind für die Integration und für die Exzision (das Ausschneiden) der Lambda-DNA notwendig.
In der Genkarte der ▶ Abb. 6.39 ist die b-Region als
„stumm“ eingetragen. Das deutet an, dass sich in diesem
Bereich Gene befinden, die für die Vermehrung des
Lambda-Phagen unter Laborbedingungen entbehrlich
sind. Diese Tatsache wird in der Gentechnik ausgenutzt,
denn die b-Region kann ohne Nachteile für den Infektionsprozess durch ein gleichlanges Stück artfremder DNA
ersetzt werden. Die Gene der b-Region sowie anderer
Teile des Lambda-Genoms werden hier nicht weiter erwähnt.
Kontrollelemente
Promotoren, die die Transkription nach links leiten, sind
in ▶ Abb. 6.39 außerhalb des Doppelkreises angegeben.
So erfolgt von den Promotoren PE und PM die Transkription des Gens cI. Von PL aus wird eine lange mRNA (mit
etwa 7 500 Nucleotiden) bis zum Ende des int-Gens transkribiert. PI ist ein spezieller Promotor für das int-Gen.
Von PR und PR′ verläuft die Transkription nach rechts,
von PR maximal bis zum Gen Q, während von PR′ aus die
Transkription der Gene für die Lyse und für die Strukturproteine von Phagenkopf und -schwanz erfolgt.
Integration und Exzision
An der Stelle att (attachment) wird die Lambda-DNA mit
dem Genom der Wirtszelle verknüpft. Für die Integration
ist das Lambda-Gen int notwendig.
Die ▶ Abb. 6.40 informiert über den formellen Ablauf
der Integration und die Anordnung des Prophagengenoms. Die Abbildung entspricht einem Vorschlag von
Allan M. Campbell aus dem Jahr 1968. In dieser allgemeinen Form hat sein Modell den Test der Zeit gut überstanden. Im Campbell-Modell besteht die att-Stelle des Lambda-Genoms aus zwei Teilbereichen, P und P′, ebenso wie
die entsprechende Stelle im Bakteriengenom aus zwei
Teilen besteht, B und B′. Die bakterielle Integrationsstelle
attBB′ liegt zwischen dem Galactose(gal)-Operon und
dem Biotin(bio)-Operon. Im Verlauf der Integration werden die att-Stellen auf beiden Genomen geöffnet und die
Enden der viralen P- und P′-Elemente mit den Enden der
bakteriellen B′- und B-Elemente verbunden. Der Vorgang
ist umkehrbar: Das Lambda-Genom kann wieder ausgeschnitten werden. Dafür sind die Produkte der Gene
int und xis notwendig.
Den Vorgang der Integration bezeichnet man gelegentlich auch als integrative und ortsspezifische Rekombination. Unter diesem Stichwort kommen wir im Kap. 10.3
auf die molekularen Vorgänge zu sprechen, während wir
uns hier mit der einfachen Skizze der ▶ Abb. 6.40 begnügen. Übrigens ist „Ortsspezifität“ nicht unbedingt für
die Integration erforderlich, denn wenn die natürliche
attBB′-Stelle im Bakteriengenom durch Mutation verloren
gegangen ist, kann die Lambda-DNA auch an anderen
Stellen eingebaut werden, allerdings mit geringerer Effizienz.
131
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„stumme
Region“
b
Genetik von E. coli
Frühe Transkription
●
Bald nach Infektion und Ringschluss beginnt die Transkription der Lambda-DNA durch die RNA-Polymerase
der Wirtszelle (▶ Abb. 6.40):
● Die Transkription vom Promotor PR aus endet meist an
der Terminationsstelle tR1. Aber diese Termination ist
nicht immer erfolgreich, sodass eine zweite, seltenere
6
mRNA gebildet wird, die vom Promotor PR bis zur Termination bei tR2 reicht.
Etwa gleichzeitig erfolgt vom Promotor PL die Transkription nach „links“, die an der Stelle tL endet.
Die Terminationen werden durch den Faktor Rho (S. 74)
vermittelt.
Der ▶ Abb. 6.41 kann man entnehmen, dass nach der
frühen Transkription die Produkte der Gene cro, cII, O und
P sowie das Gen-N-Protein vorliegen. Diese Genprodukte
sind für den weiteren Verlauf der Infektion entscheidend.
Das CI- und das Cro-Protein sind Repressoren, die Proteine O und P sind für die Einleitung der DNA-Replikation
notwendig und das N-Protein wirkt als Antiterminator
(Plus 6.7) (S. 136) und ermöglicht der RNA-Polymerase
eine Fortsetzung der Transkription über die Terminationsstellen tR1, tR2 und tL hinaus. Über all diese Proteine
gleich mehr.
Entscheidung zwischen Lyse und Lysogenie
Nach der frühen Transkription fällt die Entscheidung über
den weiteren Infektionsweg:
● DNA-Replikation, Expression der Gene für Strukturproteine, Zusammenbau der Phagennachkommen und Lyse
der Wirtszelle oder
● Integration der Lambda-DNA in das Genom der Bakterienzelle.
Abb. 6.40 Schema der Integration (von unten nach oben) und
Exzision (von oben nach unten) der Lambda-DNA.
Im Mittelpunkt steht dabei das CII-Protein, ein Transkriptionsfaktor (▶ Abb. 6.42). Die Menge an CII-Protein in der
infizierten Zelle wird auf komplizierte Weise durch zelluläre und virale Proteine reguliert:
● Bakterielle Proteasen zerstören das CII-Protein. Die am
besten untersuchte Protease benötigt ATP für ihre Aktivität und hat die Bezeichnung HflB (high frequency of
Nucleotidnr.
Origin
Abb. 6.41 Regulationsgene auf dem Lambda-Genom. Das Lambda-Genom besteht aus 48 502 bp. Die Nucleotidpaare werden von der
m′/m-Stelle (▶ Abb. 6.39) aus im Uhrzeigersinn gezählt. Die Zahlen über der oberen Linie in dieser Abbildung geben die
Basenpaarkoordinaten nach dieser Konvention an. Wir sehen also einen Abschnitt von etwa 12 000 bp, entsprechend ungefähr einem
Viertel des gesamten Genoms. Einige Genorte sind innerhalb der Doppellinie notiert. Promotorbereiche sind hervorgehoben. Die ca.
3 600 bp zwischen dem Ende des P-Gens und dem Anfang des Q-Gens enthalten neun offene, von Start- und Stoppcodons eingerahmte
Leseraster. Sie codieren also neun Proteine, die für die Lambda-Entwicklung in den üblichen E. coli-Wirtsstämmen entbehrlich sind und
im Text nicht weiter erwähnt werden. Auch im Bereich zwischen dem N- und dem cIII-Gen befinden sich zwei Gene, die wir hier
übergehen. Eine Kuriosität ist, dass das cro-Gen in beiden Richtungen transkribiert werden kann: von PR aus nach rechts und von PE nach
links. Die PR-mRNA enthält das Transkript des Sinnstrangs. Beachte: Es gibt zwei Promotoren für das cI-Gen: zu Beginn des lysogenen
Infektionswegs der Promotor PE (establishment of lysogeny); später der Promotor PM (maintenance of lysogeny).
132
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6.5.2 Expression der Lambda-Gene
6.5 Bakteriophage Lambda
●
Auch das Protein IHF (integration host factor) (S. 102)
beteiligt sich an der Kontrolle der CII-Konzentration in
der Zelle: Es erhöht die Syntheserate von CII. Zudem hat
das Protein IHF noch eine weitere wichtige Funktion im
Lysogenieweg: Es ist ein notwendiger Faktor bei der Integration der Lambda-DNA in das Wirtszellgenom.
●V
Plus 6.6
Regulationen durch gezielten Abbau
Wie im Text beschrieben, wird die Expression von CII
hauptsächlich über die ATP-abhängige Protease HflB reguliert. Die Protease greift nicht nur das CII-Protein an, sondern auch das Lambda-Protein Xis. Xis bildet mit dem IntProtein ein funktionell zusammengehörendes Paar. Das IntProtein allein reicht für die Integration der Lambda-DNA
aus, aber beide, Int und Xis, sind für die Exzision notwendig. Die Halbwertszeit beider Proteine ist deutlich verschieden: ca. 60 min für Int, aber nur 4–6 min für Xis. Wenn die
abbauende Protease, HflB, nicht gesondert blockiert wird,
bleiben nur genügende Mengen des Int-Proteins übrig, sodass eine Integration mit viel größerer Wahrscheinlichkeit
erfolgt. Diese Situation liegt vor bei der Einleitung des lysogenen Infektionswegs. Wie wir sehen werden, ist eine Regulation durch Proteinabbau auch im späteren Verlauf der
Lambda-Infektion bedeutsam: eine kurze Halbwertszeit für
Die Funktionen der Phagen- und Wirtszellfaktoren werden von Umweltbedingungen beeinflusst. So wird die
HflB-Protease beim Wachstum in einem nährstoffreichen
Medium aktiviert. Deswegen ist der lytische Infektionsweg bevorzugt, wenn sich Bakterien gut vermehren. Umgekehrt wird in weniger gut wachsenden Bakterien eher
der lysogene Weg eingeschlagen.
Weiterhin ist bekannt, dass eine Bakterienzelle, die nur
von einem einzigen Phagen infiziert ist, viel eher den lytischen Infektionsweg einschlägt, als eine Bakterienzelle,
die zwei oder mehr infizierende Phagen erhalten hat.
Dann kommt es eher zur Lysogenie, vielleicht weil dann
mehr CII-Aktivator gebildet werden kann.
das N-Protein bei der Genexpression und für das O-Protein
bei der Replikation.
Übrigens ist die HflB-Protease auch unter einem anderen
Namen bekannt (und uns so schon in der ▶ Tab. 6.3 begegnet): FtsH (filamentation temperature sensitive). Wie die
Bezeichnung sagt, wurde die Protease bei der Untersuchung einer Bakterienmutante entdeckt, die sich bei höherer Temperatur nicht mehr richtig teilen kann und deswegen langgestreckte, „filamentöse“ Formen annimmt.
Tatsächlich ist das Enzym für die korrekte Struktur von
Membranproteinen zuständig. Überdies wird es im Zuge
einer Hitzeschock- oder Stressreaktion vermehrt gebildet
und baut dann eine Gruppe von Bakterienproteinen ab.
Die ATP-abhängige HflB/FtsH-Protease hat also eine zentral wichtige Funktion in der Bakterienzelle. Ihr Angriff auf
das CII-Protein des Lambda-Phagen ist nur so etwas wie
eine Nebenbeschäftigung.
6
PaQ. Gebundenes CII macht aus den an sich schwachen
Promotoren bevorzugte Bindungsstellen für die RNA-Polymerase. So werden das Gen cI (bis zum Terminator ti)
und das Gen int kräftig transkribiert (▶ Abb. 6.42). Darüber gleich mehr.
Hier ein Wort zum dritten, CII-kontrollierten Promotor
PaQ. Das dazugehörende Transkript ist eine RNA mit einer
HflB
Der CII-Aktivator
Das aktive CII-Protein ist ein Tetramer aus vier gleichen
Untereinheiten mit je 97 Aminosäuren. Jede Untereinheit
besitzt die Helix-Turn-Helix-Domäne DNA-bindender
Proteine (s. ▶ Abb. 6.30). Mithilfe der Erkennungshelix
im Helix-Turn-Helix-Motiv bindet das CII-Protein spezifisch an DNA-Sequenzen mit direkten Wiederholungen:
TTGC-N6-TTGC (wobei N6 eine beliebige Folge von sechs
Nucleotiden ist). Diese Sequenz erscheint nur dreimal im
Lambda-Genom, nämlich in den Promotoren PE, PI und
Abb. 6.42 Regulation und Funktion des CII-Proteins. Die
Menge an CII wird durch Bakterien- und Phagenproteine
reguliert. CII ist ein Genaktivator und bindet an spezielle
Promotoren (PE und PI) und leitet die Expression nachgeschalteter Gene ein.
133
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●
lysogenization) (Plus 6.6) (S. 133). Es ist ein membrangebundenes Enzym aus sechs identischen Untereinheiten. Wie der Name andeutet, wurde das HflB-Protein
bei der Analyse von Bakterienmutanten entdeckt, bei
denen eine Lambda-Infektion häufiger als normal zur
Lysogenie führt.
Das Lambda-Protein CIII stabilisiert CII. Es ist ein kleines dimeres Protein aus gerade einmal 54 Aminosäuren. CIII bindet und hemmt die HflB-Protease.
Genetik von E. coli
a
C-terminale Domäne
(für Dimerisierung)
1
Der Lambda-Repressor
Das Produkt des cI-Gens ist der Lambda-Repressor, ein
Dimer aus zwei identischen Untereinheiten mit je 236
Aminosäuren. Jede Untereinheit besteht aus zwei Domänen:
Die aminoterminale Domäne (Aminosäuren 1–92)
kann sich zu α-Helices anordnen, von denen drei die typische Helix-Turn-Helix-Struktur DNA-bindender Proteine
bilden (▶ Abb. 6.43). Die „Erkennungshelix“ legt sich in
die große Rinne der DNA und bildet spezifische Wasserstoffbrücken zwischen ihren Aminosäureseitenketten
und den funktionellen Gruppen der Basenpaare in der einen Hälfte des Operatorelements (Abb. 5.45). Die andere
Hälfte des Operators wird durch die Erkennungshelix des
Dimerpartners besetzt.
Die carboxyterminale Domäne (Aminosäuren 132–
236) dient der Wechselwirkung zwischen den Dimerpartnern und mit benachbart gebundenen Repressormolekülen.
Der Repressor bindet mit hoher Affinität an drei Bindungsstellen, Operatoren, im Bereich der Promotoren PR
und PL (▶ Abb. 6.44). Ein Operatorelement überlappt mit
der –35-Region und ein anderes mit der –10-Region eines
Promotors und blockiert damit sehr effizient die Eintrittsstelle für die RNA-Polymerase. Damit wird der größte Teil
des Lambda-Genoms stillgelegt.
Aber auch die Transkription des cI-Gens vom Promotor PE aus ist nicht mehr möglich, weil der Repressor
im Weg der RNA-Polymerase liegt. Der ständige Nachschub an Repressor wird in dieser Situation durch Transkription vom Promotor PM aus gewährleistet. Die Lage
dieses Promotors, relativ zu den Operatorelementen,
kann der Übersichtsskizze (▶ Abb. 6.44) oder genauer der
Nucleotidsequenz (▶ Abb. 6.45) entnommen werden.
Beachte also, dass es zwei Promotoren für das cI-Gen
gibt: zu Beginn des lysogenen Infektionswegs der Pro-
6
4
5
N-terminale Domäne
(mit Helix-Turn-Helix-Motiv
für die DNA-Bindung)
b
N-terminale Domäne
Dimer
N-terminale Domäne
Abb. 6.43 Der Lambda-Repressor. (nach Lewis M (2011): A
tale of two repressors. J Mol Biol 409: 14–27)
a Schema der Domänenstruktur mit α-helikalen Abschnitten
in der N-terminalen Domäne.
b Das Helix-Turn-Helix-Motiv für die DNA-Bindung. Eine α-Helix
liegt in der großen Rinne der DNA, eine zweite quer dazu.
motor PE (establishment of lysogeny); später der Promotor PM (maintenance of lysogeny) (▶ Abb. 6.41).
Die sechs Repressorbindungsstellen im Lambda-Genom haben ähnliche, aber nicht identische palindromische Sequenzen. Sie binden den Repressor nicht mit
der gleichen Affinität, sondern in einer Reihenfolge abnehmender Affinität, wie in der ▶ Abb. 6.45 angegeben.
Demnach sind die Elemente OL1 und OR1 starke Operato-
ca. 80 bp
Abb. 6.44 Schematische Darstellung der Regulationsorte für die links- und rechtsgerichtete Transkription. Jeder Regulationsort hat
drei Repressorbindungsstellen: die Operatoren OR1, OR2, OR3 bzw. OL1, OL2, OL3. Jedes dieser Elemente ist 17 Nucleotidpaare lang. Die
Zwischenräume sind AT-reiche Abschnitte mit einer Länge von 2–7 Nucleotidpaaren. Die Promotoren mit ihren orangefarben
gezeichneten –10- und –35-Regionen liegen im Bereich der Repressorbindungsstellen. Von PR aus erfolgt die Transkription des cro-Gens,
von PM aus die des cI-Gens. Die PR-Transkription wird durch Repressoren an OR1 und OR2, die PM-Transkription durch Repressoren an OR3
blockiert.
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Länge von 60 Nucleotiden, komplementär zu einem Abschnitt der Gen-Q-mRNA. Es ist also eine sogenannte Antisense-RNA, die mit Abschnitten der passenden mRNA
Basenpaarungen eingeht. Dadurch wird die Ribosomenbindungsstelle blockiert und schließlich der Abbau der
mRNA eingeleitet – ein Beispiel für genetische Regulation
über die Stabilität von mRNA.
6.5 Bakteriophage Lambda
6
Abb. 6.45 Die Struktur der Promotoren PR und PM und die Bindungsstellen des Lambda-Repressors.
ren, an die der Lambda-Repressor bevorzugt bindet, mit
der Konsequenz, dass OL1 und OR1 schon bei niedrigen
Repressorkonzentrationen besetzt sind. Ein gebundener
Repressor erleichtert dann die Bindung weiterer Repressormoleküle an die Stellen OL2 und OR2 (kooperative Bindung).
Durch die Besetzung der Operatorelemente OR1 und
OR2 ist der Promotor PR dicht verschlossen, nicht dagegen
der Promotor PM. Tatsächlich erhöht der am OR2-gebundene Repressor sogar die Affinität der RNA-Polymerase
zum Promotor PM. So dient der Repressor als Aktivator
seines eigenen Gens. Dazu ist ein direkter Kontakt zwischen dem gebundenen Repressor und der RNA-Polymerase notwendig. Der Kontakt erfolgt in dem Zwei-Basenpaar-Bereich zwischen dem OR2-Element und der –35Region des Promotors PM (▶ Abb. 6.45). Der Promotor PM
ist normalerweise ein schwacher Promotor, der sowohl in
der –35-Region als auch in der –10-Region von der Sequenz des Standardpromotors abweicht. Aber ähnlich
wie wir es zuvor beim CRP-Protein am lac-Promotor gesehen hatten (Plus 4.2) (S. 65), wird ein schwacher Promotor durch ein gebundenes Protein zu einem starken
Promotor (was bedeutet, dass die RNA-Polymerase mit
hoher Affinität an den Promotor bindet).
Das Besondere des PM-Promotors ist die Autoregulation. Wenn relativ wenige Repressormoleküle vorhanden
sind, bleibt OR3 frei und der an OR2-gebundene Repressor
kann seine Aufgabe als Aktivator der cI-Gen-Transkription erfüllen. Aber wenn die Repressorkonzentration einen
Schwellenwert überschreitet, bindet er auch an OR3, verschließt damit den Promotor PM und verhindert eine
überschüssige Transkription des cI-Gens.
Eine lysogene Bakterienzelle enthält bis zu 100 Moleküle des Lambda-Repressors, mehr als für die Blockade
der Promotoren PR und PL notwendig sind. Eine lysogene
Zelle ist gegen eine Infektion mit Lambda-Phagen immun,
denn die überschüssigen Repressormoleküle binden an
die Kontrollelemente der infizierenden Phagen-DNA und
verhindern die Expression ihrer Gene. Über die Immunität lassen sich temperente Phagen klassifizieren:
Lambdoide (lambdaähnliche) Phagen mit regulatorischen
Elementen, die denen des Lambda-Phagen entsprechen,
können sich nicht vermehren, im Gegensatz zu Phagen,
die nicht mit Lambda verwandt sind.
Transkription des int-Gens
Das Produkt des int-Gens ist sowohl für die Integration
als auch für die Exzision des Lambda-Genoms notwendig.
Dagegen wird das xis-Gen nur für die Exzision benötigt.
Auf dem Weg zur Lysogenie sollte deswegen nur das intGen aktiv sein.
Dies wird auf zweierlei Art gewährleistet:
● über die unterschiedliche Stabilität der beiden Proteine.
Wie schon beschrieben, ist das Int-Protein erheblich
stabiler als das Xis-Protein (S. 133).
● durch eine merkwürdige Verschachtelung der beiden
benachbarten Gene. Das xis-Gen überlappt nämlich
teilweise mit dem Beginn des int-Gens und der Promotor PI liegt zum Teil innerhalb des xis-Gens
(▶ Abb. 6.46). Die Transkription vom Promotor PI aus
liefert also eine komplette int-mRNA, aber keine vollständige xis-mRNA.
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Cl-Bindungsstellen im Lambda-Genom
Genetik von E. coli
29000
29350
29700
PI
int-Gen
xis
Abb. 6.46 Unter der Kontrolle des Promotors PI. Oben:
Basenpaarkoordinaten wie in der ▶ Abb. 6.41 beschrieben.
Unten: Schema der Gene xis und int. Beachte: Teile des
Promotors PI liegen innerhalb des xis-Gens und das Ende des xisGens ragt um 20 bp in das int-Gen hinein. Daraus folgt, dass von
der betreffenden mRNA ein intaktes Int-Protein, aber kein XisProtein codiert wird.
Für die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor PI
ist die Anwesenheit des Aktivatorproteins CII unbedingt
erforderlich. Da das CII-Protein labil ist und der Nachschub durch die Blockade des PR-Promotors ausfällt,
bleibt die PI-Aktivierung eine kurze Episode bei der Einrichtung des lysogenen Zustands.
6
Merke
H
●
Nach gelungenem Einbau der Lambda-DNA in das Bakteriengenom wird das int-Gen nicht mehr benötigt. Es
bleibt verschlossen wie das gesamte Lambda-Genom mit
Ausnahme des kleinen Abschnitts, der unter der Kontrolle des Promotors PM steht und den CI-Repressor codiert.
6.5.3 Induktion und lytischer Infektionsweg
Eine Schädigung der bakteriellen DNA, beispielsweise
nach Bestrahlung durch ultraviolettes Licht, leitet eine
Reaktion ein, die als SOS-Antwort der Zelle bezeichnet
Plus 6.7
Das N-Protein, das Q-Protein und die Antitermination
Die Antitermination als Mechanismus der Genregulation
wurde bei Untersuchungen über die Wirkungsweise des NProteins entdeckt. Dann stellte sich bald heraus, dass sie
ein verbreitetes Regulationsprinzip bei Bakterien und Viren
ist. Die Antitermination wurde weithin bekannt, weil sie
eine wichtige Funktion ausübt bei der Vermehrung des humanen Immunschwächevirus (human immunodeficiency virus, HIV), des Erregers der Krankheit AIDS.
Das N-Protein entfaltet seine Antiterminatoraktivität,
nachdem die RNA-Polymerase während der Transkription
bestimmte DNA-Sequenzen passiert hat, die als nutL und
nutR bezeichnet werden und in der Nähe der Promotoren
PL und PR liegen (nut, N utilization). Die RNA, die bei der
Transkription solcher DNA-Sequenzen gebildet wird, nimmt
136
wird. Im Zuge der SOS-Antwort wird das RecA-Protein
der Wirtszelle so verändert (aktiviert), dass es die Zerstörung bestimmter Proteine einleiten kann. Darunter ist
auch der Lambda-Repressor. Ohne aktiven Lambda-Repressor werden die Promotoren PR und PL frei. Der lytische Infektionsweg steht offen und als Erstes werden die
Gene cro und N exprimiert (s. ▶ Abb. 6.41).
▶ Cro-Protein. Wir haben es in der ▶ Abb. 4.12 als kleines (Molekulargewicht 7,4 kDa) und kompaktes Protein
kennengelernt. Es besteht im Wesentlichen aus einer einzigen Domäne mit dem Helix-Turn-Helix-Motiv DNA-bindender Proteine. Das Cro-Protein bindet an die Operatorsequenzen OR1, OR2 und OR3, die ja nach der Induktion
(und Spaltung des CI-Repressors) frei und offen da liegen.
Allerdings bindet das Cro-Protein mit einer Affinitätsreihenfolge, die der des Repressors genau entgegengesetzt
ist (▶ Abb. 6.45). Für den Repressor gilt, wie gezeigt,
OR1 = OR2 > OR3; dagegen gilt für das Cro-Protein
OR3 > OR1, OR2. Aufgrund dieser Eigenschaften blockiert
das Cro-Protein die Expression des cI-Gens und damit
eine weitere Synthese von Repressormolekülen.
▶ N-Protein (Antiterminator). Das erste Gen im Bereich,
der von PL aus bis zum Terminator tL transkribiert wird
(▶ Abb. 6.41), codiert das N-Protein. Das ist ein sogenannter Antiterminator (Plus 6.7). Er ermöglicht die Transkription nach links über tL hinaus, sodass die Gene cIII, gam,
red und die für die folgenden Schritte notwendigen Gene
xis und int exprimiert werden können. Beide Funktionen,
int und xis, werden für das Ausschneiden, die Exzision
des Lambda-Prophagen benötigt. Beachte, dass in dieser
Phase der Lambda-Entwicklung ein aktives Xis-Protein
gebildet werden kann, weil nun die Transkription vom
PL-Promotor ausgeht und deswegen ein vollständiges
Transkript des xis-Gens vorliegt.
●V
eine charakteristische Sekundärstrukturfaltung an, die in
der Zeichnung als Box B bezeichnet ist (▶ Abb. 6.47). An
diese RNA-Schleife bindet das N-Protein und nimmt zugleich Kontakt zur RNA-Polymerase auf. Allerdings benötigt
das N-Protein zur vollen Entfaltung seiner Funktion einige
bakterielle Proteine, vor allem NusA, aber auch NusB und
NusE (nus, N utilization substance) sowie das ribosomale
Protein S 10. Mit diesen Proteinen beladen, kann die RNAPolymerase den Weg der Transkription entlang der DNA
fortsetzen, unbeeinflusst durch den Terminationsfaktor
Rho.
Das Lambda-Genom codiert noch einen zweiten Antiterminator, das Q-Protein. Dieses Protein benötigt zur Aktivierung seiner Funktion ebenfalls eine spezielle DNA-Sequenz, genannt qut (im Bereich des Promotors PR′;
▶ Abb. 6.39). Aber anders als das N-Protein bindet das Q-
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28600
6.5 Bakteriophage Lambda
Die Antiterminatorwirkung des N-Proteins ermöglicht
auch die Transkription vom Promotor PR aus nach rechts
(über tR1 und tR2 hinaus) bis zum Ende des Q-Gens. Dabei
wird mehr Cro-Protein gebildet. Es bindet an die OL-Elemente und schaltet damit die PL-gerichtete Transkription
ab. Aber zu diesem Zeitpunkt sind schon genügende
Mengen an Xis- und Int-Proteinen für die Exzision vorhanden.
Das Cro-Protein schaltet – bei einer höheren intrazellulären Konzentration – auch die PR-gerichtete Transkription ab. Aber dann liegen die O- und P-Proteine in Mengen
vor, die ausreichend für die Einleitung der DNA-Replikation sind. Entscheidend ist nun die Expression des QProteins, das als positives Kontrollelement die Transkription vom stärksten Lambda-Promotor PR′ (▶ Abb. 6.39)
ermöglicht. Damit werden die Lyse-Gene R und S und alle
Gene für die Strukturproteine der Phagenhülle exprimiert. Damit sind dann alle Voraussetzungen für einen
erfolgreichen lytischen Infektionsweg geschaffen.
Die Entwicklungswege des Bakteriophagen Lambda
werden hier nur in groben Zügen skizziert. Viele, teilweise auch genetisch wichtige Einzelheiten haben wir nicht
erwähnt, um im Rahmen eines einführenden Berichts zu
bleiben und die schon in den Grundzügen komplizierten
Entwicklungswege von Lambda auch einem Nicht„Lambdalogen“ verständlich zu machen. Aber gerade wegen der verschachtelten und verzweigten Mechanismen
der Genregulation ist Lambda auch viele Jahre nach seiner Entdeckung durch Esther Lederberg 1951 noch immer ein beliebtes Untersuchungsobjekt der Molekularbiologen. Lambda dient aber auch als Modellsystem zur Untersuchung weiterer molekulargenetischer Prozesse, beispielsweise der DNA-Replikation und der Bildung der
Phagenform, der Morphogenese. Dazu geben wir im Folgenden eine kurze Beschreibung.
6.5.4 Wege der Lambda-Replikation
Die Replikation von DNA ist ein genetischer Prozess von
fundamentaler Bedeutung. Wir werden in Kap. 8 ausführlicher darüber berichten. Hier folgen nur einige Bemer-
NusE
Abb. 6.47 Das N-Protein als Antiterminator. Das N-Protein
hilft der RNA-Polymerase über Stoppstellen hinweg.
kungen, die das weitere Geschehen im Verlauf des Lambda-Infektionswegs verständlich machen sollen.
Ähnlich wie es DNA-Abschnitte – Promotoren – zur
Einleitung der Transkription gibt, gibt es auch spezielle
DNA-Abschnitte zur Einleitung der Replikation. Ein solcher Abschnitt wird Startpunkt der Replikation oder, in
der genetischen Fachsprache, Origin (Replikationsursprung; origin of replication) genannt (▶ Abb. 6.48). Auf
dem Lambda-Genom existiert ein Origin, der im Bereich
6
1
2
3
4
Abb. 6.48 Replikation der Lambda-DNA. In den ersten 10–
15 min eines lytischen Infektionswegs wird die parentale DNA
mehrfach nach dem Schema der Ring-zu-Ring-Replikation
repliziert. Normalerweise folgt dann die Umschaltung auf die
Replikation nach Art des rolling circle: ① und ② Ein Strang des
DNA-Ringes wird endonucleolytisch gespalten. ③ An das 3′OH-Ende werden Nucleotide angeheftet und dabei das 5′-Ende
vom Partnerstrang verdrängt. Am 3′-OH-Ende findet eine
„kontinuierliche“ DNA-Synthese statt, auf dem abgehobenen
5′-Ende dagegen eine diskontinuierliche DNA-Synthese in Form
kurzer DNA-Fragmente, die später verknüpft werden. ④ Der
innere intakte Ring dreht oder „rollt“ ständig und bietet dem
Replikationsapparat immer wieder Nucleotidsequenzen zum
Kopieren an. So können lange Abschnitte concatemerer DNA
entstehen.
137
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Protein an die qut-Sequenz der DNA (und nicht an Box-BRNA) und springt von dort auf die RNA-Polymerase, die
nun, beladen mit dem Q-Protein, die Pausen- und Terminationssignale auf ihrem Weg ignorieren kann.
In E. coli wird die Expression der rRNA-Gene u. a. auch
durch Antitermination reguliert. Bald nach Beginn der
Transkription der rRNA-Gene entsteht eine RNA-Sequenz,
an die sich ein Komplex aus Nus-Proteinen bindet. Die
RNA-Polymerase wird mit diesen Proteinen beladen und
kann eine promotornahe (vom Rho-Faktor kontrollierte)
Terminationsstelle passieren. Zu den Nus-Proteinen gehört
das ribosomale Protein S 10. Das ist eine interessante Ergänzung zu unserer Besprechung der Expression bakterieller rRNA-Gene: Ein Überschuss an ribosomalem Protein
S 10 stimuliert die Synthese von rRNA.
Genetik von E. coli
6
Vorgang bei der Infektion, die Bildung der Phagennachkommen.
6.5.5 Das Ende des lytischen Infektionswegs
Entstehung der Phagenpartikel
Mehr als ein Drittel des Lambda-Genoms (▶ Abb. 6.39) ist
mit Genen ausgefüllt, die die Strukturproteine des Viruspartikels codieren. Wir betrachten hier die Bedeutung
dieser Proteine für den Aufbau der Virusstruktur. In den
Zusammenbau des Partikels greifen steuernd einige weitere Phagenproteine ein, aber auch zelluläre Proteine, wie
wir gleich sehen werden.
Am Anfang der Forschungen über die Morphogenese
von Lambda stand die grundlegende Entdeckung, dass
die beiden wichtigsten Strukturelemente des Phagen,
Kopf und Schwanz, unabhängig voneinander gebildet
und schließlich als eigene Bauelemente zusammengefügt
werden. Plus 6.8 (S. 138) skizziert die morphogenetischen
Wege der Phagenentstehung.
Plus 6.8
Morphogenese der Phagenpartikel
Der folgende Text bezieht sich auf die ▶ Abb. 6.49, ohne
die die Beschreibung unverständlich bliebe.
Schauen wir uns zunächst die Bildung des Phagenkopfes
an:
● Der Hauptbaustein des Phagenkopfes ist das GenE-Protein, das sich mithilfe eines Gerüstes, dargestellt u. a.
durch das virale GenNu3-Protein, zunächst zu einem kugelförmigen Vorkopf zusammenlagert (▶ Abb. 6.49 ①).
Bestandteile des Vorkopfes sind außerdem GenB- und
GenC-Proteine, ohne die dieser erste Schritt der Morphogenese des Phagenkopfes nicht möglich wäre.
● Für den nächsten Schritt, die Bildung des fertigen Vorkopfes, wird das zelluläre Protein GroE benötigt
(▶ Abb. 6.49 ②). GroE ist eines der Hitzeschockproteine,
die vermehrt nach Temperaturerhöhung (S. 111) gebildet werden. Dabei wird das Nu3-Protein-Gerüst abgebaut, die GenB- und GenC-Proteine werden proteolytisch
gespalten.
● Der leere Vorkopf kann jetzt mit DNA gefüllt werden
(▶ Abb. 6.49 ③). Voraussetzung dafür ist das Vorhandensein von concatemerer DNA und das Produkt des Gens A,
das, in einem Komplex mit dem Protein Nu1, an die mm
′-Stellen (▶ Abb. 6.39) der Lambda-DNA bindet.
● Durch Wirkung des FI-Proteins und Aufnahme des zweiten Haupthüllproteins, des GenD-Proteins, wird aus dem
Vorkopf der fertige Phagenkopf (▶ Abb. 6.49 ④).
138
●
●
●V
Die Terminase, eine spezifische Endonucleaseaktivität
des Komplexes aus dem GenA- und dem GenNu1-Protein, schneidet die concatemere Lambda-DNA an den cos
(m/m′)-Stellen (▶ Abb. 6.49 ⑤).
Die FII- und W-Proteine bereiten nun die fertigen Köpfe
für die Kopplung an den Phagenschwanz vor
(▶ Abb. 6.49 ⑥).
Nun zur Bildung des Phagenschwanzes. Dieser Prozess erfolgt in zwei Schritten:
● Zuerst wird die sogenannte Basalstruktur gebildet, die
aus den Produkten der Gene J, I, L, K, G, H und M zusammengesetzt ist (▶ Abb. 6.49 ⑦). Dabei kommen das Iund das K-Protein nicht im fertigen Phagenpartikel vor.
Sie haben also eine Art Gerüstfunktion, wie andere Proteine bei den ersten Schritten der Kopfbildung.
● Zahlreiche Exemplare des Hauptproteins im Phagenschwanz, das Gen-V-Protein, lagern sich in Form einer
Röhre auf der Basalstruktur ab. Ein weiteres Protein,
das Gen-U-Protein, schließt die Struktur ab (▶ Abb. 6.49
⑧).
Kopf- und Schwanzteil der Phagenstruktur können nun
miteinander zum fertigen, reifen Phagenpartikel verbunden werden. Noch ein Wort zum J-Protein, aus dem die
Schwanzfaser besteht. Dieser Bestandteil des Viruspartikels
ist für den ersten Schritt des Infektionsprozesses wichtig,
für die Adsorption, bei dem ein Kontakt zwischen Rezepto-
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des O-Gens liegt. Als Voraussetzung für die Aktivierung
des Origins muss ein spezielles Lambda-Protein, das GenO-Protein, mit dem Origin in Wechselwirkung treten.
Dann kommt es unter Mitwirkung des P-Proteins und
von Proteinen der Wirtszelle zunächst im Origin-Bereich
zur Entwindung der DNA. Von dort aus schreitet die Entwindung in beide Richtungen entlang der DNA-Helix fort.
Gleichzeitig werden Nucleotidfolgen der entwundenen
Stränge als Matrize zur Synthese neuer, komplementärer
Stränge verwendet. Es entstehen zwei NachkommenDNA-Ringe, die genaue Kopien des ersten, „parentalen“
DNA-Moleküls sind.
Aber die Phase der Ring-zu-Ring-Replikation geht nach
den ersten 15 min des Infektionswegs zu Ende. Dann liegen etwa 50 Nachkommen-DNA-Ringe vor. Jetzt wird
weitere DNA nach dem Mechanismus des rolling circle
(„rollenden Ringes“) produziert, wie in der ▶ Abb. 6.48
beschrieben und uns schon bei der Konjugation von Bakterien (▶ Abb. 6.13) begegnet ist. Das Besondere an diesem Mechanismus ist die Produktion langer End-zu-Endverknüpfter Lambda-Moleküle, die oft bis zu acht einheitlich lange DNA-Moleküle umfassen. Man nennt diese
langen DNA-Formen Concatemere. Die Bildung der Concatemere ist die Voraussetzung für den abschließenden
6.5 Bakteriophage Lambda
ren auf der Zelloberfläche und dem Phagenschwanz hergestellt wird. Über diese Brücke kann dann die DNA in die
1
2
Zelle eindringen. Phagenpartikel ohne Schwanzfaser sind
nicht infektiös.
3
4
Wirtszellprotein
6
7
8
6
fertiges
Phagenpartikel
Abb. 6.49 Zusammenbau der Phagenpartikel. Diese monumentale Abbildung ist eine Neuzeichnung nach B. Hohn (1979) [8].
Erläuterung s. Text. (nach Hohn B (1997) In vitro packaging of λ and cosmid DNA. Methods Enzymol 68: 299–320)
Die Morphogenese von Lambda ist nicht allein von theoretischem Interesse. Sie hat eine praktische Bedeutung in
der Gentechnik. Artfremde DNA kann, wie schon gesagt,
anstelle der „stummen“ b-Region in das Lambda-Genom
eingebaut werden. Um diese DNA zu vermehren, muss sie
in die Phagenhülle verpackt werden. Dabei nutzt man die
Tatsache aus, dass die wichtigsten Teilschritte der Lambda-Morphogenese im Reagenzglas nachvollzogen werden
können.
Am Ende des lytischen Infektionswegs
Über DNA-Replikation, Expression der Strukturgene und
Morphogenese sind schließlich, etwa 60 min nach Beginn
des lytischen Infektionswegs, ungefähr 100 Nachkommenphagen pro Zelle entstanden. Die bakterielle Zellwand wird jetzt u. a. durch das Gen-S-Produkt und das
vom Gen R codierte Enzym Endolysin zerstört. Die intrazellulären Phagen werden frei und sind bereit, andere
Bakterien zu infizieren, um dort einen neuen Infektionsweg zu durchlaufen.
Literatur
▶ Zitierte Literatur
[1] Blattner FR, Plunkett G 3rd, Bloch CA et al (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K12. Science 277: 1453–1462
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comprehensive database of Escherichia coli biology. Nucleic Acids Res
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drug resistance factors and other transmissible bacterial plasmids.
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[8] Hohn B (1997) In vitro packaging of λ and cosmid DNA. Methods Enzymol 68: 299–320
▶ Weiterführende Literatur
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of bacteriophage lambda DNA. J Mol Biol 162: 729–773
[14] Knippers, R (2012) Eine kurze Geschichte der Genetik. Springer, Heidelberg, New York
139
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