Molekulargenetische und biochemische

Molekulargenetische und biochemische
Untersuchungen zur Funktion und Struktur
des Enzym IIMtl aus Escherichia coli K-12
Dissertation
Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
des Fachbereichs Biologie/Chemie
der
Universität Osnabrück
Vorgelegt von
Şevket Turgut
Osnabrück 2003
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis .......................................................................................... I
Abbildungsverzeichnis .................................................................................. II
Tabellenverzeichnis ..................................................................................... III
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................ IV
I. Einleitung .............................................................................................1
II. Material und Methoden ....................................................................11
II.1.
II.2.
II.3.
II.4.
II.5.
II.6.
II.7.
II.8.
II.9.
Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und Oligonukleotide ....................... 11
Chemikalien, Isotope und Enzyme ......................................................... 19
Nährmedien ........................................................................................ 20
Anzuchtverfahren ................................................................................. 22
Herstellung von Zellextrakten ................................................................ 24
Genetische Techniken .......................................................................... 25
DNA-Techniken ................................................................................... 27
Chemische und biochemisch-analytische Techniken ................................. 34
Computerprogramme ........................................................................... 49
III. Ergebnisse .......................................................................................50
III.1. Selektion und Untersuchung entkoppelter Mutanten ....................... 50
III.1.1. Konstruktion von Stämmen zur Selektion entkoppelter Mutanten ......... 50
III.1.2. Entkoppelte Mutanten aus den Selektionen ....................................... 65
III.1.3. Entkoppelte Mutanten aus lokalisierter Mutagenese ........................... 69
III.1.4. Selektion von Suppressormutanten ................................................... 72
III.1.5. Charakterisierung der Mutanten ...................................................... 74
III.2. Topologieuntersuchungen am EIIMtl ................................................. 95
III.2.1. Konstruktion der erforderlichen Plasmide und Mutanten ..................... 96
III.2.2. Markierung der Einzel-Cystein MtlA-Mutanten ................................... 99
III.2.3. Reinigung und immunologischer Nachweis des MtlA-6His ............... 100
III.2.4. Ergebnisse der Biotinmaleimid-Markierungen ................................. 102
IV. Diskussion ......................................................................................107
IV.1. Für Transport und Phosphorylierung relevante AS im EIICMtl .......... 108
IV.1.1. Vergleich der Mutationen E218A, E218V und H256P ...................... 108
IV.1.2. Die AS 218 und 256 im Translokationsmodell ................................ 113
IV.2. Untersuchung der Sekundärstruktur des EIICMtl .............................. 121
IV.2.1. Mögliche Strukturen des EIICMtl ...................................................... 121
V. Zusammenfassung ..........................................................................133
VI. Literaturverzeichnis .......................................................................135
VII. Anhang .............................................................................................1
II
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
I. Einleitung .............................................................................................1
Abb.I.1. Transport und Phosphorylierung eines Substrats über ein PTS ............... 4
Abb.I.2. Modell der Sekundärstruktur des IICMtl-Transporters aus E.coli .............. 7
Abb.I.3. Modell der essentiellen Strukturelemente des PTS Transport-Systems
am Beispiel des EIIMtl ........................................................................ 9
II. Material und Methoden ....................................................................11
Abb.II.8.1. Substrataufnahme von D-Mtl ....................................................... 35
Abb.II.8.2. Schematische Darstellung eines Lineweaver-Burk-Diagramms ........ 37
Abb.II.8.3. Exemplarische Bindekurve ........................................................... 42
III. Ergebnisse .......................................................................................50
Abb.III.1.1. Wildtyp- und semisynthetischer Stoffwechselweg für den D-MtlAbbau in E.coli ......................................................................... 51
Abb.III.1.2. Schematische Darstellung der Konstruktion von F’lac::dalD ............. 52
Abb.III.1.3. Alternativer semisynthetischer Stoffwechselweg für den D-MtlAbbau in E.coli ......................................................................... 58
Abb.III.1.4. Sequenz des Gens mtlA aus E.coli K-12 ...................................... 67
Abb.III.1.5. mtlA-Plasmid pGJ9 ................................................................... 70
Abb.III.1.6. SDS-Gel der Vesikel nach der Überexpression ............................. 83
Abb.III.1.7. Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel mit 1mM [14C]-D-Mtl ....... 84
Abb.III.1.8. Phos.-Aktivitäten von H256P-Mutanten mit 500µM [14C]-D-Mtl ..... 85
Abb.III.1.9. KMapp-Wert Messungen des WT-Stamms LGS322/pGJ9 für D-Mtl ... 88
Abb.III.1.10. KMapp-Wert Messungen von LGS322/pGJT9-5 für D-Mtl ............... 88
Abb.III.1.11. KMapp-Wert Messungen von LGS322/pDSM1 für D-Mtl ................. 89
Abb.III.1.12. KMapp-Wert Messungen von LGS322/pDSM2 für D-Mtl ................. 89
Abb.III.1.13. Nichtlineare Kinetik der KMapp-Messung von LGS322/pDSM2 ........ 91
Abb.III.2.1.
Abb.III.2.2.
Abb.III.2.3.
Abb.III.2.4.
SDS-Gel einer MtlA(His)6-Reinigung ........................................... 100
SDS-Gel nach dem Proteintransfer auf Membran ........................ 101
Immunologischer Nachweis des MtlA(His)6 .................................. 101
Biotinmaleimidmarkierungen und Nachweise des MtlA(His)6 ........ 103
IV. Diskussion ......................................................................................107
Abb.IV.1.
Abb.IV.2.
Abb.IV.3.
Abb.IV.4.
Abb.IV.5.
Abb.IV.6.
Abb.IV.7.
Abb.IV.8.
Abb.IV.9.
Interpretation der nichtlinearen Kinetik von LGS322/pDSM2 .......... 111
Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen aus E. coli und K. pneumoniae . 112
Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen verschiedener Stämme ............. 114
Bindung eines Phosphats bzw. Maleimids an ein Cystein ................ 122
Ergebnisse aus Sequenz- und Strukturuntersuchungen
im Sekundärstrukturmodell des EIICMtl-Transporters aus E.coli ......... 123
Vergleich der postulierten transmembranen Helices von
EIICMtl und EIICGlc ....................................................................... 126
TMHMM-Vorhersage der Topologien von EIICMtl und EIICGlc .......... 128
Mögliche 2D-Strukturen des IICMtl-Transporters aus E.coli .............. 130
Mögliche 3D-Strukturen des IICMtl-Transporters aus E.coli .............. 131
Tabellenverzeichnis
III
Tabellenverzeichnis
II. Material und Methoden ....................................................................11
Tab.II.1.1.
Tab.II.1.2.
Tab.II.1.3.
Tab.II.1.4.
Tab.II.1.5.
Tab.II.2.
Tab.II.8.1.
Tab.II.8.2.
Bakterienstämme ......................................................................... 11
Phagen ....................................................................................... 12
Plasmide ..................................................................................... 13
Neukonstruierte und -isolierte Plasmide .......................................... 14
Oligonukleotide .......................................................................... 16
Häufig verwendete Puffer und Lösungen ......................................... 20
Zelltiter und Proteinmenge ............................................................ 34
Eingesetzte Zuckerkonzentrationen und dazugehörige cpm .............. 36
III. Ergebnisse .......................................................................................50
Tab.III.1.1.
Tab.III.1.2.
Tab.III.1.3.
Tab.III.1.4.
Tab.III.1.5.
Tab.III.1.6.
Tab.III.1.7.
Tab.III.1.8.
Tab.III.1.9.
Tab.III.1.10.
Tab.III.1.11.
Tab.III.1.12.
Tab.III.1.13.
Tab.III.1.14.
Tab.III.1.15.
Tab.III.1.16.
Tab.III.1.17.
Tab.III.1.18.
Tab.III.1.19.
Tab.III.1.20.
Tab.III.1.21.
Tab.III.1.22.
Tab.III.1.23.
Plattentest zum Nachweis einer funktionellen DalD aus pHEXD ..... 54
Plattentest zum Nachweis einer funktionellen DalD aus pLSD101 . 55
Plattentest der Exkonjuganten aus der Kreuzung
CSH36 /F’lac::dalD /pLSD101 /pPSO110 X S136∆ ................... 56
Plattentest des Selektionsstammes LTK31 .................................... 57
Plattentest LTK31-1 und LTK31-2 .............................................. 59
Plattenmarkertest LTK32 und LTK32-1 ....................................... 60
Ursprüngliche AtlR- und AtlS-Phänotypen ..................................... 61
Neu beobachtete AtlR- und AtlS-Phänotypen ................................ 62
Plattentest P1.∆(crr)::kan X LGS31 ........................................... 63
Entkoppelnde Mutationen aus LGS322-1 /pGJ9∆137
und LGS324-1 /pGJ9∆137 ...................................................... 68
Phänotypen der entkoppelten Mutanten ..................................... 69
Austausche bei pGAL3-1, pGAL3-2 und pGAL3-3 ...................... 71
Austausche bei pGAL3-4 und pGAL3-5 ..................................... 72
Mutationen aus LGS322 /pGJT9-3 und LGS322 /pGJT9-4 ......... 74
Markertest entkoppelnder Mutanten in LGS322 und LGS322-1 ... 76
Plattentest der Stämmen LGS322, LGS322-1 und LTK31-2
mit den „Suppressormutationen“ ............................................... 78
Zellerträge und Generationszeiten der Stämme LGS322 und
LGS322-1 mit verschiedenen mtlA-Plasmiden ............................. 79
Mutanten aus dem Plasmid pMaHisMtlAPr ................................. 82
Gesamtproteinkonzentrationen der Vesikel ................................. 83
Spezifische Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel .................... 86
KMapp-Werte und V der mtlA-Mutanten für D-Mtl in LGS322 .......... 90
Stammabhängige Phänotypen von mtlA-Mutanten ...................... 92
Zusammengefasste Ergebnisse der EIIMtl-Mutanten
im Stamm LGS322 .................................................................. 94
Tab.III.2.1. Plasmide der Reihen pMMX5-3x und pMMX5-4x .......................... 98
Tab.III.2.2. Aktivitäten der „Cys-Scanning“-MtlA-Derivate ............................... 98
Tab.III.2.3. Ergebnisse der Biotinmaleimid-Markierungen ............................. 104
IV
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
α-Me-Glc
AB
Amp
Atl
AMHB1
B
Biotinmaleimid
bp
CAA
Cam
Che
cpm
C-Quelle
DMSO
DOC
DTT
EI
EII XY
EDTA
EK
Fru
α-Methyl-Glukose
Antibiotikum
Ampicillin
D-Arabinitol
Arginin/Methionin/Histidin/Thiamin-Lösung
Bakterien
„Nα-(3-maleimidylpropionyl) biocytin“
Basenpaare
Casa Amino Acids
Chloramphenicol
Chemotaxisreaktion (auf Chemotaxisschwärmplatten)
Counts (radioaktive Impulse) pro Minute
Kohlenstoffquelle
Dimethylsulfoxid
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate
Dithiothreitol
Enzym I der PTS
Domäne X des Enzym II, spezifisch für Kohlenhydrat Y
Ethylendiamintetraacetat
Einzelkolonie
D-Fruktose
Gal
Glc
GLB
Gly
Gt
D-Galaktose
D(+)-Glucose
Gel-Lade-Puffer („gel loading buffer“)
Glycerin
Generationszeit
HPr
Histidinprotein des PTS
IPTG
Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid
Kan
k.W.
Kanamycin
kein Wachstum
Lac
LKS
D-Laktose
Laborkultursammlung
Abkürzungsverzeichnis
Man
McC
MKS
MM
m.o.i.
Mtl
V
D-Mannose
MacConkey
Multiple Klonierungsstelle
Minimalmedium
multiplicity of infection
Mannitol
n.b.
n.g.
n.m.
n.z.
nicht bestimmbar
nicht getestet
nicht messbar
nicht zugänglich
ODX
Optische Dichte bei einer Wellenlänge von X nm
PCR
PEP
PMSF
PTS
RT
SDS
Spc
Stilben
Str
TEMED
Tet
Tp
Polymerase-Kettenreaktion
Phosphoenolpyruvat
Phenylmethylsulfonylfluorid
PEP-abhängiges Kohlenhydrat : Phosphotransferasesystem
Raumtemperatur
Natriumdodecylsulfat („Sodium dodecyl sulfat“)
Spectinomycin
“4-acetamido-4’-maleimidylstilbene-2,2’-disulfonic acid,
disodium salt”
Streptomycin
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine
Tetracyklin
Transport
U
ÜK
ÜN
UZ
Units
Übernachtkultur
Über Nacht
Ultra-Zentrifuge
VM
Vollmedium
WB
Wasserbad
X-Gal
Xul
Xyl
5-bromo-4-chloro-indoyl-β-D-galaktosid
D-Xylulose
D-Xylose
I. Einleitung
1
I. Einleitung
I.1. Die Zelle
Die Kompartimentierung von Reaktionsräumen war einer der ersten Schritte bei
der Entstehung des Lebens. Dies wird sowohl bei Eukaryonten als auch bei Prokaryonten
durch die Abgrenzung von Zellen von der Umwelt mit Hilfe der Zytoplasmamembran
verwirklicht. In dieser Membran sorgen eine Lipid-Doppelschicht und Proteinmoleküle,
die
hauptsächlich
durch
nicht-kovalente,
kooperative
Wechselwirkungen
zusammengehalten werden, nicht nur für die räumliche Trennung des Zellinneren von
der Umgebung, sondern auch für eine selektive Permeabilität, welche den Zellen die
Aufnahme und das Ausschleusen verschiedenster Substanzen ermöglicht. Die
Nährstoffaufnahme und das Ausschleusen giftiger Substanzen sind essentielle
Funktionen aber auch der bidirektionale Transfer von Proteinen, von DNA und von
Signalmolekülen ist erforderlich. Hinzu kommen die Fähigkeiten, Signale aus der
Umgebung zu erkennen und weiterzuleiten, Membran-assoziierte Reaktionen zu
katalysieren und Zell-Zell Kontakte herzustellen.
Zusätzlich zur Zytoplasmamembran findet man bei Bakterienzellen in der Regel
noch die Zellwand, die allerdings für hydrophile Verbindungen wie Ionen, Vitamine,
Kohlenhydrate, Aminosäuren und Peptide mit einem Molekulargewicht bis ca. 600
Dalton (Payne & Gilvarg, 1968; Decad & Nikaido, 1976) permeabel ist. Neben der
zusätzlichen Stabilität erfüllt sie daher den Zweck eines Molekularsiebs, wobei die
Substrattranslokation typischerweise durch erleichterte Diffusion über spezifische und
unspezifische Porine erfolgt. Bei der Aufnahme über die Zytoplasmamembran gibt es
nur in wenigen Fällen wie bei Glyzerin (Richey & Lin, 1972; Heller et al., 1980) oder
langkettigen Fettsäuren (Overath et al., 1969; Frerman & Bennet, 1973; Maloy et al.,
1980) Hinweise für passive erleichterte Diffusion über substratspezifische „Facilitatoren“.
Der Grossteil an Substraten passiert die Zytoplasmamembran durch aktiven Transport.
2
I. Einleitung
I.2. Aktive Transportsysteme
Aktive Transportsysteme sind durch die Fähigkeit charakterisiert, unter
Energieverbrauch entgegen eines Konzentrationsgefälles spezifische Substrate zu
transportieren,
wodurch
z.B.
Wachstum
bei
niedrigen
Substratkonzentrationen
ermöglicht wird. Bei Bakterien kann man drei Gruppen von aktiven Transportsystemen
unterscheiden:
Primäre
Transportsysteme,
zu
denen
die
ABC-Transporter
gehören,
katalysieren die Aufnahme einer großen Zahl unterschiedlicher Substrate wie
Oligopeptide, Aminosäuren, Kohlenhydrate und Vitamine (Übersicht bei Furlong,
1987), wobei Licht- oder chemische Energie in Konzentrationsgradienten aus Ionen
oder gelösten Stoffen umgewandelt wird. Bei Bakterien ist die Abhängigkeit dieser
Transportsysteme von einem periplasmatischen Bindeprotein, einer relativ hohen
Substrataffinität und ATP als Energiequelle charakteristisch (Ames, 1986; Davidson,
2002). Systeme, die den Transport von Ionen ausschließlich mit der Energetisierung
durch ATP betreiben, werden ebenfalls zu dieser Gruppe gezählt (Übersicht bei
Pederson & Carafoli, 1987).
Bei sekundären Transportsystemen ist die Translokation des Substrates mit
dem Fluss von Ionen (H+, Na+, K+) entlang ihres elektrochemischen Gradienten
gekoppelt (Mitchell, 1963; West, 1970). Dazu gehören Antiportsysteme, welche
Substrat und Ionen in entgegengesetzter Richtung transportieren (z.B. Tetrazykline/H+Antiporter, TetA(C), Sutcliffe, 1978; TetA(A), Waters et al., 1983; Griffith et al., 1994).
Die Laktose-Permease aus E. coli (West, 1970; West & Mitchell, 1973; Kaback, 1990;
King et al., 1991) transportiert Substrat und Ionen in die gleiche Richtung und gehört
damit zu den Symportsystemen. Charakteristisch für diese Gruppe ist die meist aus 12
transmembranen
α-Helices
bestehende
Topologie.
Beiden
genannten
Transportsystemen ist gemeinsam, dass das Substrat unmodifiziert in die Zelle gelangt.
Bei
dem
Transport
über
ein
PTS
(PEP-abhängiges
Kohlenhydrat
:
Phosphotransferasesystem) gelangt das Substrat phosphoryliert in die Zelle. Allerdings
ist für den Transport des Substrats eine Phosphorylierung nicht zwingend notwendig.
Vorangegangene Arbeiten sowie die vorliegende konnten zeigen, dass die chemische
Modifikation erst nach der Translokation erfolgt und der Transport von der
Phosphorylierung entkoppelt werden kann (Lolkema et al., 1990; Lolkema et al.,
1991a; Postma et al., 1993; Lengeler & Jahreis, 1996; Otte, 2000). Der eigentliche
I. Einleitung
3
Transportschritt zeigt Gemeinsamkeiten zwischen den PTSs, den ABC-Transportern
sowie den sekundären Uniportern („Facilitatoren“; Lengeler et al., 1994).
I.3. PTS vermittelter Transport in Bakterien
Kundig, Gosh und Roseman (Kundig et al. 1964) konnten 1964 erstmals PTSs
biochemisch beschreiben. Weiterführende genetische (Murphy & Rosenblum, 1964a, b;
Egan & Morse, 1966; Tanaka & Lin, 1967) und biochemische Untersuchungen (Kundig
et al., 1966) zeigten bei einer Vielzahl von Kohlenhydraten die Beteiligung dieser
Systeme. Die der Phosphorylierung von Kohlenhydraten zu Grunde liegende allgemeine
Gesamtreaktion lautet:
Als weitere Besonderheit der PTSs wird deutlich, dass nicht ATP sondern
Phosphonenolpyruvat (PEP) als Phophorylgruppendonor dient. PEP steht dabei am
Anfang
einer
Phosphorylierungskaskade,
an
der
folgend
eine
lösliche
Histidinproteinkinase EnzymI (EI; Gen ptsI) und das Histidin-Protein (HPr; Gen ptsH)
beteiligt sind. Die Gene ptsH und ptsI (und crr; Genprodukt EIIACrr) bilden ein Operon
(De Reuse & Danchin, 1988). Sie werden mit Ausnahme des Fruktose-PTS von allen
PTSs benötigt und daher zu den allgemeinen, substratunspezifischen Komponenten
gezählt. Die Übertragung der Phosphatgruppe vom PEP auf EI erfolgt durch
Autophosphorylierung des EI-Dimers an einem Histidin-Rest (Misset et al., 1980; Weigel
et al., 1982), welches seinerseits die Phosphorylgruppe auf einen Histidin-Rest des HPr
überträgt. Diesen allgemeinen PTS Komponenten stehen die Kohlenhydrat-spezifischen
EnzymeII
(EIIs)
gegenüber,
mit
denen
das
P~HPr
in
der
Folge
der
Phosphorylierungskaskade reagiert (Abb. I.1.).
Die bakteriellen PTSs sind aber nicht nur Kohlenhydrat-Transportsysteme,
vielmehr sind sie Teil eines zentralen Signaltransduktionssystems mit wichtigen
regulatorischen Funktionen, die sich über Katabolitenrepression, Induktorausschluss,
Chemotaxis und globale Regulation erstrecken (Postma et al., 1993; Lengeler &
Jahreis, 1996). Bisher sind bei E. coli K-12 über 20 verschiedene PTSs beschrieben, die
eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate in die Zelle transportieren (Saier, 1993;
Lengeler et al., 1994; Postma et al., 1996; Tchieu et al., 2001).
4
I. Einleitung
Abb. I.1. Transport und Phosphorylierung eines Substrates über ein PTS
In der Abbildung sind die biochemischen Reaktionen dargestellt, die an der
Gruppentranslokation während des Transports und der Phosphorylierung eines Substrates
über ein PTS beteiligt sind. Dargestellt sind ein membrangebundenes, substratspezifisches
EnzymII, mit den speziellen Domänen IIC, IIB, IIA, sowie die allgemeinen PTSKomponenten, EnzymI und HPr, mit den entsprechenden Phosphorylierungsstellen (nach
Lengeler & Jahreis, 1996).
I.4. Strukturelle und funktionelle Domänen der
EII-Permeasen
Auf der Grundlage von Sequenzvergleichen und Komplementationsstudien
lassen sich die Permeasen in fünf genetische Familien einteilen (Lengeler et al., 1994;
Lengeler & Jahreis, 1996). Ihnen liegt ein modularer Aufbau zu Grunde, der die drei
funktionell autonomen Domänen IIA, IIB und IIC (bzw. IIC und IID bei der Mannose
Familie) umfasst. Die Expression der EIIBMtl-Domäne von E. coli zeigte, dass EIIBMtl als
enzymatisch aktives Protein existieren kann und die in vitro Phosphorylierungsaktivität
zusammen mit EIIAMtl und EIICMtl wiederherstellen kann (Robillard et al., 1993).
Grundlegende Arbeiten hatte dabei vorher den einzelnen Domänen eine biochemische
Funktion zugewiesen (Grisafi et al., 1989; Van Weeghel et al., 1991a; Van Weeghel
et al., 1991b). In den jeweiligen Familien sind die Domänen in unterschiedlicher
Reihenfolge angeordnet und können frei oder fusioniert bzw. durch „Linker“ verbunden
vorliegen. Einander entsprechende Domänen aus einer PTS-Familie können sich
funktionell ersetzen. Die funktionelle Abhängigkeit des EIIScr von Crr (Lengeler et al.,
1982) sowie die Wiederherstellung des Glc+-Phänotyps in einer Crr--Mutante durch
Synthese eines intakten EIINag (Vogler et al., 1988) gehören zu den ersten Beispielen
funktioneller
Übereinstimmung
der
strukturellen
Domänen
der
PTS-
I. Einleitung
5
Transportkomponenten. Ein Grund dafür ist, dass innerhalb einer Familie die strukturell
und katalytisch relevanten Reste konserviert sind. Die Ähnlichkeit (% identische
Aminosäuren) innerhalb einer Familie in den relevanten Regionen reicht von nahezu
identisch (>98%) bis zu wenigen, lokal begrenzten Motiven. In funktionellen Bereichen
der einzelnen Domänen können die hochkonservierten Bereiche teilweise durch ein bis
zwei Aminosäuren definiert werden (Lengeler, 1990; Lengeler et al., 1994). Die aus
etwa 100 AS bestehende hydrophile IIA-Domäne enthält einen konservierten HistidinRest, der durch P~HPr phosphoryliert werden kann. Ein konserviertes Cystein wird in der
etwa gleichlangen hydrophilen IIB-Domäne von IIA phosphoryliert. Mit etwa 350 AS
bildet die membrangebundene IIC-Domäne den größten Teil des EnzymII-Proteins. Der
hydrophobe Bereich dieser Domäne kann 6-8 transmembrane Helices ausbilden, die
eine große hydrophobe, zytoplasmatische Schleife flankieren. In dieser Schleife findet
man oft ein GXXE-Motiv, wobei der Glutaminsäure-Rest (E) in allen bisher bekannten EII
konserviert ist und in vergleichbarem Abstand immer durch einen hochkonservierten
hydrophilen Rest (His, Asn oder Gln) begleitet wird. Im Gegensatz zu der variablen
modularen Anordnung der Domänen untereinander, weist eine auffällig hohe
Konservierung bestimmter Strukturen und Motive auf relevante Bereiche in dem Enzym
hin (Lengeler & Jahreis, 1996). Es ist offensichtlich, dass man sich bei der Beantwortung
der vielfältigen Fragen nach Substratspezifität, Mechanismus und Kopplung des PTSabhängigen Transports auf diese konservierten Bereiche konzentrieren sollte.
I.5. Der EIIMtl-Transporter
Das E. coli EIIMtl besteht aus einer einzigen Polypeptidkette von 637 Aminosäuren
Länge, die durch das mtlA-Gen (Solomon & Lin, 1972; Jacobson et al., 1979; Lee &
Saier, 1983) kodiert wird. Mit den Genen mtlD (Mtl 1-P-Dehydrogenase; Davis et al.,
1988; Jiang et al., 1990) und mtlR (Repressor; Figge et al., 1994) bildet das mtlA-Gen
ein Operon (Genreihenfolge mtlA, D, R), welches bei 80,7min auf dem E. coliChromosom kartiert (Solomon & Lin, 1972; Lengeler, 1975a). Nach Transport und
Phosphorylierung des D-Mannitols (Mtl) durch das EIIMtl wird Mtl-1-P durch die NADabhängige Mtl-1-P-Dehydrogenase zu D-Fruktose-6-P umgewandelt (Wolff & Kaplan,
1956; Klungsöyr, 1966; Solomon & Lin, 1972). Die Regulation des Systems unterliegt
dem Mtl-Repressor (MtlR), der molekulare Induktor ist ausschließlich Mtl (Tanaka et al.,
1967; Lengeler & Steinberger, 1978).
6
I. Einleitung
Das EIIMtl-Protein lässt sich in drei funktionelle Domänen unterteilen (Abb. I.1.).
Die meist hydrophoben aminoterminalen AS der Position 1 bis 334 bilden die
membranüberspannende EIIC-Domäne (Abb. I.2.) mit der Substratbindestelle und der
Transporterfunktion (Grisafi et al., 1989; Lolkema et al., 1990; Briggs et al., 1992).
Das für die Übertragung der Phosphorylgruppe essentielle Cys-384 (Pas & Robillard,
1988a; Pas & Robillard, 1988b; Grisafi et al., 1989; Pas et al., 1991) befindet sich in
der folgenden hydrophilen EIIB-Domäne (AS 335 bis 457). Die AS 458 bis 637
gehören zur EIIA-Domäne, die ihrerseits das in der Phosphorylierungskette essentielle
konservierte His-554 enthält (Pas & Robillard, 1988b; Pas et al., 1991; van Weeghel et
al., 1991b, 1991c).
Die exakte Topologie der EIIC-Domäne wurde bisher noch nicht bestimmt.
Zahlreiche Untersuchungen deuten darauf hin, dass die funktionell aktive Form des
Proteins eine dimere Konformation aufweist (Übersicht bei Jacobson, 1992; Boer et al.,
1994; Boer et al., 1996; Koning et al., 1999; Heuberger et al., 2002). Hinsichtlich der
Sekundärstruktur wurde anhand von Hydropathiestudien ein Model mit sieben
transmembranen Segmente und einem periplasmatischen N-Terminus vorgeschlagen
(Lee & Saier, 1983). Dagegen führten die Ergebnisse von MtlA-PhoA-Fusionsstudien zu
einem Sekundärstrukturmodell mit sechs transmembranen α-Helices und einem
zytoplasmatischen N-Terminus (Sugiyama et al., 1991). Ergebnisse aus TryptophanFluoreszenzstudien unterstützen dieses Modell (Dijkstra et al., 1996). Weitere
Untersuchungen, deren Kern Hydrophobizitätsstudien und die Ermittlung einer
Konsensussequenz aus den EIICMtl verschiedener Stämme bildete, führten unter der
Berücksichtigung
verschiedener
Methoden
zur
Vorhersage
von
Membranproteinstrukturen (Kyte & Doolittle, 1982; Engelman et al., 1986; von Heijne
& Gavel, 1988; von Heijne, 1992) zu einem EIIC-Modell aus 6 transmembranen
Helices, drei kurzen periplasmatischen und zwei großen zytoplasmatischen Schleifen
sowie einem zytoplasmatischen N-Terminus (Lengeler et al., 1994; Lengeler & Jahreis,
1996). Dieses Modell ist in Abbildung I.2., basierend auf einem Vergleich der aktiven
und näher charakterisierten EIICMtl-Aminosäueresequenzen von E. coli (Lee & Saier,
1983), S. carnosus (Fischer & Hengstenberg, 1992; Reiche et al., 1996), K.
pneumoniae (Otte & Lengeler, 2001), S. mutans (Honeyman & Curtiss, 2000) und B.
stearothermophilus (Henstra et al. 1996), dargestellt.
I. Einleitung
7
Abb. I.2. Modell der Sekundärstruktur des IICMtl-Transporters aus E. coli
(nach Sugiyama et al., 1991 und Lengeler et al., 1994; verändert)
Dem Modell liegen die Ergebnisse aus Sequenzvergleichen und mtlA-phoA Fusionsstudien
zu Grunde. Periplasmatische und zytoplasmatische Schleifen sind durch arabische Zahlen
gekennzeichnet. Die postulierten transmembranen α-Helices sind durch römische Zahlen
gekennzeichnet. In den verglichenen Sequenzen identische Proteine sind schwarz unterlegt.
Blaue Kreise zeigen Lücken bzw. Insertionen in den verglichenen AS-Sequenzen an.
Wichtige am Transportmechanismus beteiligte AS sind rot hervorgehoben. Leere Kreise
stellen Aminosäuresequenzen unbestimmter Länge dar. Weitere Erläuterungen sind im Text
zu finden.
Bereits die Betrachtung der Sequenzvergleiche lässt eine besondere Funktion der
Schleife 5 aufgrund der sehr hohen Konservierung der AS vermuten. Die Ähnlichkeit
liegt in dem 87 AS langen Bereich zwischen den vermuteten Helices IV und V bei 55,2%
identischen AS, während die Konservierung über das gesamte EIICMtl (AS 1-344) bei
8
I. Einleitung
38,4% liegt. Zudem befinden sich in der Schleife 5 mehrere konservierte Aminosäuren
die nachweislich eine wichtige Funktion beim Transportprozess haben. Dazu gehört im
EIIMtl das His195, welches essentiell für die Substratbindung zu sein scheint (Weng &
Jacobson, 1993). Darüber hinaus findet man in der Schleife 5 bei AS 254-257 mit der
Aminosäure-Folge -G-I-H-E- das in EII-Transportern hochkonservierte GXXE-Motiv
(Lengeler et al., 1990). Mutationen in diesem Bereich führten zum Verlust von
Bindungs- und Phosphorylierungsaktivität (Saraceni-Richards & Jacobson, 1997), zum
Verlust der Transportaktivität bei verbleibender Phosphorylierungsaktivität (Manayan et
al., 1988) oder zu einer Entkopplung von Transport und Phosphorylierung (Otte, 2000;
Turgut, diese Arbeit). Diese Ergebnisse deuten auf eine maßgebliche Beteiligung der
Aminosäuren
des
GIHE-Motivs
an
den
komplexen
Transport-
und
Phosphorylierungsprozessen hin. Allerdings führten auch Austausche an dem
konservierten E218 (E218A, E218V) des EIICMtl zu einer funktionellen Entkopplung von
Transport und Phosphorylierung (Klawitter, 1992; Scholle, 1993; Heuel, 1997; Otte,
2000; Turgut, diese Arbeit), womit die gesamte Schleife 5 eine zentrale Struktur des
gekoppelten Transportprozesses zu sein scheint. Da dieser Prozess neben Transport und
Phosphorylierung auch die Bindung des Substrates beinhaltet, würde die Lokalisation
der oben genannten wichtigen Aminosäuren in einer zytoplasmatischen Schleife
widersinnig erscheinen. Überträgt man ein 1993 von Buhr & Erni für die Struktur vom
EIIGlc vorgeschlagenes Modell auf das EIIMtl, so würde ein Teil der Schleife 5 zu einem
transmembranen Bereich werden und das E257 des GIHE-Motivs im Periplasma liegen
(Lengeler et al., 1994). Allerdings gibt es auch für das von Lengeler vorgeschlagene
Sekundärstrukturmodell vom EIICMtl (Lengeler et al., 1994; Lengeler & Jahreis, 1996)
ein
dreidimensionales
Modell,
das
den
Ergebnissen
aus
Sequenzanalysen,
Fusionsstudien und Hydrophobizitätstests entspricht. Nach diesem Modell von Lengeler
(Lengeler, 1990; Lengeler et al., 1994) faltet sich die Schleife 5 in das Innere des
EIICMtl-Transporters und bildet ein hydrophiles, katalytisches Zentrum (Abb. I.3.).
Da eine genaue Kenntnis der Struktur des EIICMtl einen wichtigen Fortschritt im
Verständnis der Funktion des Transportmechanismus bedeuten würde, wurde in dieser
Arbeit versucht, mit weiteren Experimenten zusätzliche Informationen zur Topologie zu
erhalten. Mit der gezielten Markierung von Cysteinen („Cystein-Scanning“) sollte vor
allem die relative Lage der offensichtlich funktionell sehr bedeutsamen Schleife 5
ermittelt werden.
I. Einleitung
9
Abb. I.3. Modell der essentiellen Strukturelemente des PTS Transport-Systems am
Beispiel des EIIMtl (nach Lengeler, 1990)
Es sind die allgemeinen Komponenten der PTS (EnzymI, HPr) sowie das substratspezifische
IIMtl aus E. coli schematisch dargestellt. Für EIIC werden sechs transmembrane α-Helices
mit einer Schleife 5 postuliert, die sich in den von den α-Helices gebildeten Kanal
hineinfaltet. In dem hydrophilen Kern befinden sich die für den Transport essentiellen
Aminosäuren (siehe Text).
Aber auch die Selektion von Mutationen, die den Transport entkoppeln, kann für
den
Transport
wichtige
Aminosäuren
identifizieren.
Zusätzlich
isolierte
Suppressormutanten könnten zudem noch Informationen über die relative Lage
einzelner Aminosäuren zueinander liefern. Wie bereits erwähnt, wurden schon einige
Mutationen
charakterisiert,
die
zur
Entkopplung
des
Transports
von
der
Phosphorylierung führten (Ruijter et al., 1992; Klawitter, 1992; Scholle, 1993; Heuel,
1997; Otte, 2000; Turgut, diese Arbeit). Ergänzend konnte gezeigt werden, dass das
Vorhandensein der EIIC-Domäne ausreicht, um einen funktionellen Transporter mit
intakter Substratbindestelle zu bilden (Grisafi et al., 1989; Briggs et al., 1992; Lolkema
et al., 1990). Beide Beobachtungen entsprechen der gängigen Theorie, dass es sich
beim Transport und der Phosphorylierung des Substrats über ein EII um zwei getrennte,
nacheinander ablaufende Reaktionen handelt, die nicht strikt gekoppelt sind (Lolkema
et al., 1990; Lolkema et al., 1991a; Postma et al., 1993; Lengeler & Jahreis, 1996).
Niedrigaffine
Substrate
wie
D-Arabinitol
können
auch
ohne
gleichzeitige
Phosphorylierung durch das EIIMtl aufgenommen werden (Lengeler et al., 1994). So
10
I. Einleitung
konnte nach dem Transport des niedrigaffinen Substrates D-Glucitol über EIIMtl sowie
des hochaffinen Substrates D-Mannitol über ein mutiertes EIIMtl, intrazellulär freies
Substrat nachgewiesen werden (Otte, 2000). Somit scheint der Grad der Kopplung von
der Affinität der Bindestelle zum Substrat abhängig zu sein. Hochaffine Substrate werden
im
Wildtyp-EII
so
stark
gekoppelt
transportiert,
dass
ein
Wachstum
auf
unphosphoryliertem Substrat nicht möglich ist (Postma & Stock, 1980). Die erleichterte
Diffusion von niedrigaffinen Substraten wurde dagegen für die Aufnahme von
Galaktose über EIIGlc (Kornberg & Riordan, 1976), für Glukose über EIIBgl (Schnetz et
al., 1987) oder EIIScr (Schmid, 1988) sowie für D-Atl und Xyl über EIIGat (Reiner, 1977)
beschrieben.
Demnach vermitteln die entkoppelnden Mutationen eine Reduktion der Affinität
der zum Substrat. Durch diesen strukturellen oder funktionellen Effekt arbeitet der
Transporter als „Facilitator“ und katalysiert in einem energie-unabhängigen Prozess die
erleichterte Diffusion des Substrats über die Membran. Das Hauptsubstrat verhält sich
bei den veränderten Proteinen somit wie ein Nebensubstrat. Ein umgekehrt
proportionales Verhältnis zwischen Affinitätskonstante und Flussrate ist denkbar
(Lengeler et al., 1994; Lengeler & Jahreis, 1996), zumal entkoppelte EII einen teilweise
drastisch erhöhten KM-Wert haben (Ruijter et al., 1991; Ruijter et al., 1992; Scholle,
1993; Lengeler et al., 1994; Otte, 2000).
Neben den direkten strukturellen Untersuchungen mittels „Cystein-Scanning“
sollten in dieser Arbeit weitere EIIMtl-Varianten isoliert und charakterisiert werden, die
den
Transport
von
Mannitol
entkoppeln.
Durch
die
Konstruktion
neuer
Selektionssysteme wurde eine Selektion mit einem vollständigen EIIMtl (EIIMtlABC)
ermöglicht.
Darüber
hinaus
wurde
die
Selektion
von
Suppressormutationen
durchgeführt. Durch die Kombination unterschiedlicher Mutationen mit Hilfe gezielter
Mutagenese wurde versucht, die erhaltenen Mutanten weiter zu charakterisieren. Bei der
Charakterisierung wurden verschiedene genetische und biochemische Methoden
angewendet.
II. Material und Methoden
11
II. Material und Methoden
II.1. Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und
Oligonukleotide
In den folgenden Tabellen (II.1.1. - II.1.5.) sind die in dieser Arbeit verwendeten
Bakterienstämme,
Phagen,
Plasmide
und
Oligonukleotide
beschrieben.
Die
Nomenklatur richtet sich nach Berlyn et al. (1996). Abweichend hiervon wurden die
Gene der PTS-abhängigen Stoffwechselwege nach Postma et al. (1996) benannt.
Tab. II.1.1. Bakterienstämme
STAMM
RELEVANTER GENO-/PHÄNOTYP
REFERENZ
Escherichia coli K-12 Derivate
BMH71-18
thi-1 supE44 ∆(lac-proAB) [mutS::Tn10]
/F‘ [proA+B+ lacIq Z∆M15]
CSH36 /F’
thi-1 ∆(lac-pro) supE44 /F’lac
CSH36-1
CSH36 /F’lac::TnLSD101 (dalD dalK‘)
diese Arbeit
HB101
F- ara-14 galK2 hsdS20 lacY1 mtlA1
proA2 recA13 rpsL20 supE44 thi-1 xyl-5
Leu- Thr-
Boyer et al.
(1969)
JM109
thi-1 gutD::Tn10 ∆(lac-proA,B) recA1
endA1 gyrA1,96 hsdR17 supE44 relA1 /F’
[traD36 proA+B+ lacIq Z∆M15]
Yanisch-Perron et
al. (1985)
JM109 (λDE3)
JM109
int ::lacUV5-
Yanisch-Perron et
al. (1985)
JWL191
F- thi-1 metB1 argG6 hisG1 galT6 galP63
lacY1 Mak0 malT1 ∆(mtlAP,O50) gatR49
gutAP,O49 ptsI191 rpsL104 supE44 tonA2
Lengeler (1980)
JWL300
JWL191 Mak+
LGS31
F- thi-1 metB1 argG6 hisG1 galT6 lacY1
malT1 ∆(mtlAPA‘) MtlD+ gatR49 gatA50
gutAP,O49 gutA50 rpsL104 supE44 tonA2
[λDE3
(BamHI)
Wallace et al.
(1981); Kramer
et al. (1984)
Miller (1972)
T7gene1.0]
Aulkemeyer et al.
(1991)
Scholle (1993)
12
II. Material und Methoden
Tab. II.1.1. Bakterienstämme (Fortsetzung)
STAMM
RELEVANTER GENO-/PHÄNOTYP
REFERENZ
LGS322
LGS31 ∆(gutR’MDBAP,O-recA)
Scholle (1993)
LGS324
LGS322 Atlr
diese Arbeit
LGS31-1
LGS31 /F‘lac::dalD
diese Arbeit
LGS322-1
LGS322 /F‘lac::dalD
diese Arbeit
LGS324-1
LGS323 /F‘lac::dalD
diese Arbeit
LLR103
F- thi-1 metB1 argG6 hisG1 galT6 lacY1
∆(mtlAP,O50) gatR49 gutAP,O49 ∆(crr)::kan
rpsL104 supE44
LGT31
LGS31 ∆(crr)::kann
diese Arbeit
LTK31
LGS31 ∆(ptsH ptsI crr)::kan
diese Arbeit
LTK31-1
LTK31 /F‘lac::dalD
diese Arbeit
LTK31-2
LTK31 /F‘lac::dalD /pUR404
diese Arbeit
LTK32
LTK31 Mak+
diese Arbeit
LTK32-1
LTK32 /F‘lac::dalD
diese Arbeit
S136
F- lac-85 malA1 mel-2 rpsL Mtl-
S136-3
S136 ∆(ptsH ptsI crr)::kan
STL136
S136-3 /F‘lac::dalD
TP2811
F- xyl-5 argH1 ∆lacX74 aroB ilvA ∆(ptsH
ptsI crr)::kann
Lévy et al. (1990)
XL1 Blue
thi-1 recA1 endA1 gyrA96 hsdR17
supE44 relA1 /F‘lac [proAB lacIqZ∆M15
Tn10 (Tetr)]
Bullock et al.
(1987)
Lux (1995)
Schmitt (1968)
Schmid (LKS)
diese Arbeit
Tab. II.1.2. Phagen
Phagen
Herkunft
P1.kc
Lennox (1955)
R408
Dotto et al.
(1981)
II. Material und Methoden
13
Tab. II.1.3. Plasmide
Aminosäureaustausche
in
WT-Proteinen
sind
in
den
Ein-Buchstaben-
Abkürzungen der Aminosäuren sowie der numerischen Position der Aminosäure im
Protein dargestellt (Bsp.: E218A = Glutaminsäure an Position 218 mit Alanin
substituiert).
Plasmide
Relevanter Geno-/Phänotyp
Referenz
pALTER-1
Tcr Mutagenese-Vektor
pGHL3
Apr dalD+ K+ T+ in pACYC177
pGJ9
Cmr pACYC184 mtlA+ (2,1kb SalI/EcoRV)
Grisafi et al.
(1989)
pGJ9∆137
pGJ9 mtlA’ ∆137AS
Grisafi et al.
(1989)
pHEX3/5
Cmr lacZP α-lacZ, Klonierungsvektoren
(MCS aus pBlueskript KS+; SK+)
Heuel (1997)
pJOE637
Apr Tcr scrK+Y+A+B+R+
Schmid et al.
(1988)
pPSO110
Cmr Tcr tnpA
Schmid (LKS)
pSOL300
pHEX3 mtlAKAY2026
Otte (2000)
pSOL313
pSOL300 mtlA E218A
Otte (2000)
pTIM101
Apr Scr, In vivo Klonierungsvektor
pUR404
Tcr scrK+Y+A+B+R∆
pMaHisMtlAPr
Überexpressionsvektor 6His-mtlA
Smith (1985)
Heilenmann,
unveröffentlicht
Zeppenfeld et al.
(2000)
Schmid et al.
(1982)
Montfort et al.
(2001)
14
II. Material und Methoden
Tab. II.1.4. Neukonstruierte und -isolierte Plasmide
Bei den Eigenschaften der Plasmidserie pMMX5-x wurde zur Veranschaulichung
der Mutation die Veränderung der vier WT-Cysteine von MtlA in eckigen Klammern
angegeben: [CCCC] = [CAS110 CAS320 CAS384 CAS571].
Plasmid
Eigenschaften
pGAL3
pALTER-1 mtlA‘
pGAL3-1
pALTER-1 mtlA‘ E218A
pGAL3-2
pALTER-1 mtlA‘ E218V
pGAL3-3
pALTER-1 mtlA‘ H256P
pGAL3-4
pALTER-1 mtlA‘ E218A, L229Q, H256P
pGAL3-5
pALTER-1 mtlA‘ E218V, H256P
pGJ9dEA
pGJ9∆137 E218A (Selektion)
pGJ9dEV
pGJ9∆137 E218V (Selektion)
pGJ9dHP
pGJ9∆137 H256P (Selektion)
pGJ9dHindIII
pGJ9 ohne HindIII-Fragment in mtlA
pGJT9-1
pGJ9 E218A (ortsspez. Mut.)
pGJT9-1d
pGJT9-1 mtlA‘ (∆ SnaBI-ClaI -Fragment)
pGJT9-2
pGJ9 E218V (ortsspez. Mut.)
pGJT9-2d
pGJT9-2 mtlA‘ (∆ SnaBI-ClaI -Fragment)
pGJT9-3
pGJ9 H256P (ortsspez. Mut.)
pGJT9-3d
pGJT9-3 mtlA‘ (∆ SnaBI-ClaI -Fragment)
pGJT9-4
pGJ9 E218A, L229Q, H256P
(ortsspez. Mut.)
pGJT9-4d
pGJT9-4 mtlA‘ (∆ SnaBI-ClaI -Fragment)
pGJT9-5
pGJ9 E218V, H256P (ortsspez. Mut.)
pGJT9-5d
pGJT9-5 mtlA‘ (∆ SnaBI-ClaI -Fragment)
pGJT9-6
pGJ9 H256A (ortsspez. Mut.)
pDSM1
pGJT9-3 P256Q
pDSM2
pGJT9-3 P256S
pDSM3
pGJT9-4 P256A
pDSM4
pGJT9-4 P256Q
Beschreibung
III.1.3.1.
Seiten 69-71
III.1.2.1.
S. 67-69
III.1.3.2.
S. 72
III.1.5.3. S. 87
III.1.4.1.
S. 73-74
II. Material und Methoden
15
Tab. II.1.4. Neukonstruierte und -isolierte Plasmide (Fortsetzung)
Plasmid
Eigenschaften
Beschreibung
pHEX5d
pHEX5 ∆HindIII-Erkennungssequenz
III.2.1.1. S. 96
pHEXD
pHEX3 dalD dalK‘
III.1.1.1. S. 53
pLSD101
pTIM101 dalD dalK‘
III.1.1.1. S. 54
pMMX5
pHEX5d mtlA-6xHis [CCCC]
pMMX5-1
pMMX5 mtlA-6xHis C320A [CACC]
pMMX5-2
pMMX5-1 C110S [SACC]
pMMX5-3
pMMX5-2 C571S [SACS]
pMMX5-4
pMMX5-3 C384S [SASS]
pMMX5-31
pMMX5-3 [SACS] S3C
pMMX5-32
pMMX5-3 [SACS] S110C
pMMX5-33
pMMX5-3 [SACS] S158C
pMMX5-34
pMMX5-3 [SACS] S199C
pMMX5-35
pMMX5-3 [SACS] S212C
pMMX5-36
pMMX5-3 [SACS] S242C
pMMX5-37
pMMX5-3 [SACS] S299C
pMMX5-41
pMMX5-4 [SASS] S3C
pMMX5-42
pMMX5-4 [SASS] S110C
pMMX5-43
pMMX5-4 [SASS] S158C
pMMX5-44
pMMX5-4 [SASS] S199C
pMMX5-45
pMMX5-4 [SASS] S212C
pMMX5-46
pMMX5-4 [SASS] S242C
pMMX5-47
pMMX5-4 [SASS] S299C
pMMX5-4HP
pMMX5-4 H256P
III.2.1.3. S.99
pMMX5-EA
pMMX5 mtlA E218A
III.1.5.3. S. 92
pRUG1
pMaHisMtlAPr mtlA E218A
pRUG2
pMaHisMtlAPr mtlA E218V
pRUG3
pMaHisMtlAPr mtlA H256P
pRUG4
pMaHisMtlAPr mtlA E218A H256P
III.2.1.1.
S. 96-97
III.2.1.2. /
III.2.1.3.
S. 97-99
III.1.5.2.
S. 81-82
16
II. Material und Methoden
Tab. II.1.4. Neukonstruierte und -isolierte Plasmide (Fortsetzung)
Plasmid
Eigenschaften
Beschreibung
pRUG5
pMaHisMtlAPr mtlA E218A H256P
pRUG6
pMaHisMtlAPr mtlA H256A
pRUG7
pMaHisMtlAPr mtlA H256Q
pRUG8
pMaHisMtlAPr mtlA H256S
F‘lac::dalD
F’lac::TnLSD101 dalD ScR
III.1.5.2.
S. 81-82
III.1.1.1. S. 53
Tab. II.1.5. Oligonukleotide
In
den
Primern
zur
Mutagenese
sind
die
Mutageneseziele
farblich
hervorgehoben. Rot bezeichnet das Triplet der mutagenisierten Aminosäure. Bei der
HisTag-Konstruktion ist das Stop-Kodon dunkelrot, die Erkennungssequenzen für
Restriktionsenzyme blau und die Kodone für die sechs His blaugrün gefärbt.
Primer
Sequenz
Beschreibung
mtlA-A-Cy5
5‘- ACC TCT GCC GCC ACA TTA AC -3‘
mtlA-2A-Cy5
5‘- GAT GAT CAC TTA TCT CCT GCC -3‘
mtlA-B-Cy5
5‘- TGC TGG TGA ATA ACT TCT CC -3‘
mtlA-2B-Cy5
5‘- GTT CTT TGG TCG TGG TAG CGC -3‘
„
mtlA-C-Cy5
5‘- GCT TAC TTC GCT AAC ATC GC -3‘
„
mtlA-2C-Cy5
5‘- GAG TCT AAA GGC GCA TCT CCG -3‘
„
mtlA-D-Cy5
5‘- TGA CCA ACT TCC TCG ACA GC -3‘
„
mtlA-2D-Cy5
5‘- AGC TGG TGA AAG GCG GTT ACG -3‘
„
mtlA-EH-Cy5
5‘- TCC TGT TCC TCA ACA ACG CC -3‘
„
mtlA-HE-Cy5
5‘- GAT AGT CAG CGT GAA CAC GC -3‘
„
mtlA-1-Cy5
5‘- ACC CCA CCT TCT CCA TGT GG -3‘
„
mtlA-2-Cy5
5‘- CTT TGC GAC CGA GGA AGA TG -3‘
„
mtlA-3-Cy5
5‘- TTC ATG TCC TGC ATA CGA CG -3‘
„
mtlA-4-Cy5
5‘- AAG AAC ATG TAC GCC AGC AG -3‘
„
mtlA-5-Cy5
5‘- CGA TAA CGC CCA TGG TGG TG -3‘
„
Cy5-markierte
SequenzierPrimer
II. Material und Methoden
17
Tab. II.1.5. Oligonukleotide (Fortsetzung)
Primer
Sequenz
Beschreibung
E218A (+)
5‘- CAA TCT TCT TCC TGA TTG CCG CTA
ACC CAG GTC CAG G -3‘
E218A (-)
5‘- CCT GGA CCT GGG TTA GCG GCA
ATC AGG AAG AAG ATT G -3‘
„
E218V (+)
5‘- CAA TCT TCT TCC TGA TTG TCG CTA
ACC CAG GTC CAG G -3‘
„
E218A (-)
5‘- CCT GGA CCT GGG TTA GCG ACA
ATC AGG AAG AAG ATT G -3‘
„
H256P (+)
5‘- CTT CCT GGG GGG TAT CCC AGA
AAT CTA CTT CCC G -3‘
„
H256P (-)
5‘- CGG GAA GTA GAT TTC TGG GAT
ACC CCC CAG GAA G -3‘
„
H256A (+)
5‘- CTT CCT GGG GGG TAT CGC CGA
AAT CTA CTT CCC G -3‘
„
H256A (-)
5‘- CGG GAA GTA GAT TTC GGC GAT
ACC CCC CAG GAA G -3‘
„
H256Q (+)
5‘- CTT CCT GGG GGG TAT CCA GGA
AAT CTA CTT CCC G -3‘
„
H256Q (-)
5‘- CGG GAA GTA GAT TTC CTG GAT ACC
CCC CAG GAA G -3‘
„
H256S (+)
5‘- CTT CCT GGG GGG TAT CAG CGA
AAT CTA CTT CCC G -3‘
„
H256S (-)
5‘- CGG GAA GTA GAT TTC GCT GAT ACC
CCC CAG GAA G -3‘
„
MtlA-HIS 1
5‘- GGA ATT CCC GTC GAC TGG ACA
GTT AAC CGA TTC AGT G -3‘
MtlA-HIS 2
5‘- TTG GAT CCT TAG TGG TGG TGG
TGG TGG TGC TTA CGA CCT GCC AGC
AGT TCC AGC ACT TC -3‘
C110S (+)
5‘- CGC TGG GCG GCT GGT CTA TTA
AGC ACT TCG AC -3‘
C110S (-)
5‘- GTC GAA GTG CTT AAT AGA CCA GCC
GCC CAG CG -3‘
MutagenesePrimer
Konstruktion
eines mtlA6xHisTag
„
MutagenesePrimer
„
18
II. Material und Methoden
Tab. II.1.5. Oligonukleotide (Fortsetzung)
Primer
Sequenz
Beschreibung
C320A (+)
5‘- CAT CGC GGG TGT GGC TGC GGC
GAT GGC TGT C -3‘
MutagenesePrimer
C320A (-)
5‘- GAC AGC CAT CGC CGC AGC CAC
ACC CGC GAT G -3‘
„
C384S (+)
5‘- CGT AAA ATC ATC GTT GCC TCT GAC
GCC GGT ATG GG -3‘
„
C384S (-)
5‘- CCC ATA CCG GCG TCA GAG GCA
ACG ATG ATT TTA CG -3‘
„
C571S (+)
5‘- GGG CGT CGT GTT CTC TCA GTA
CCC GGA AGG CG -3‘
„
C571S (-)
5‘- CGC CTT CCG GGT ACT GAG AGA
ACA CGA CGC CC -3‘
“
S3C (+)
5‘- GGT GTT TTT ATG TCA TGC GAT ATT
AAG ATC AA -3‘
“
S3C (-)
5‘- TTG ATC TTA ATA TCG CAT GAC ATA
AAA ACA CC -3‘
“
S110C (+)
5’- CTG GGC GGC TGG TGC ATT AAG
CAC TTC G -3’
“
S110C (-)
5’- CGA AGT GCT TAA TGC ACC AGC
CGC CCA G -3’
5‘- GAT TGT TGA AGC CCT GTG CAA AAT
GCT GGC TGC GG -3‘
“
S158C (-)
5‘- CCG CAG CCA GCA TTT TGC ACA
GGG CTT CAA CAA TC -3‘
“
S199C (+)
5‘- CCA CGG TAT CTT CTG CCC GCT
GGG TAT TCA G -3‘
“
S199C (-)
5‘- CTG AAT ACC CAG CGG GCA GAA
GAT ACC GTG G -3‘
“
S212C (+)
5‘- CCA TGA ACT GGG TAA ATG CAT CTT
CTT CCT GAT TG -3‘
“
S212C (-)
5‘- CAA TCA GGA AGA AGA TGC ATT TAC
CCA GTT CAT GG -3‘
“
S242C (+)
5‘- GGT AGC GCT AAA CAG TGC GCG
GGC GGT GCG GC -3‘
“
S242C (-)
5‘- GCC GCA CCG CCC GCG CAC TGT
TTA GCG CTA CC -3‘
“
S158C (+)
“
II. Material und Methoden
19
Tab. II.1.5. Oligonukleotide (Fortsetzung)
Primer
Sequenz
Beschreibung
S299C (+)
5‘- CGG CAT CTC CGG GTT GCA TCC
TTG CTG TAC TGG -3‘
“
S299C (-)
5‘- CCA GTA CAG CAA GGA TGC AAC
CCG GAG ATG CCG -3‘
“
II.2. Chemikalien, Isotope und Enzyme
Handelsübliche
Grundchemikalien,
Detergenzien,
Lösungsmittel,
Puffersubstanzen, Kohlenhydrate, Vitamine, Antibiotika und Aminosäuren wurden von
den Firmen Boehringer (Mannheim), Difco (Michigan, USA), Life Technologies und Roth
(Karlsruhe), Merck (Darmstadt), Amersham Pharmacia (Freiburg, Braunschweig), Riedel
de Haën (Seelze), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen) bzw. der Sigma-Aldrich
Firmengruppe bezogen. Radioaktive Isotope stammten von Amersham LIFE SCIENCE
(Buckinghamshire, England). DNA-modifizierende Enzyme und Feinchemikalien für
DNA-Techniken stammten von den Firmen Genomed (Bad Oeynhausen), Boehringer
(Mannheim) und Life Technologies (Karlsruhe). Bei der Sequenzierung wurden das
“T7SequencingTM-Kit“, das ‘‘Cy5TM AutoRead Sequencing Kit‘‘ der Firma Pharmacia
Biotech (Freiburg) und das „Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle
sequencing kit with 7-deaza-dGTP“ der Firma Amersham Pharmacia Biotech
(Buckinghamshire, England) eingesetzt. Spezifische DNA-Primer für die Sequenzierung,
PCR-Amplifikation und Mutagenese wurden von der Firma Interactiva (Ulm) und TIB
MOLBIOL (Berlin) synthetisiert. Sulfhydrylreagenzien (Biotinmaleimid und Stilben)
wurden von Molecular Probes Inc. (Eugene, OR 97402-0469) geliefert. Eingesetztes
H2O stammte aus der hauseigenen VE-Anlage, zweifach entsalztes H2O wurde mit der
„Seradest LFM 20“-Anlage von Seral (D-56235, Ransbach) hergestellt.
20
II. Material und Methoden
Tab.II.2. Häufig verwendete Puffer und Lösungen
ABKÜRZUNG
ZUSAMMENSETZUNG
GLB, 5fach
Glyzerin
TBE
Bromphenolblau
Xylencyanolblau
TBE, 10fach
Tris-Base
Borat
EDTA 0,5M pH 8,0
H2O
TE 10.1
Tris-HCl pH 8,0
EDTA pH 8,0
KONZENTRATION
50%
0,5fach
0,25%
0,25%
108g
55g
40ml
ad 1000ml
10mM
10mM
KPi [X M, pH Y] Kaliumdihydrogenphosphat, X M
di-Kaliumhydrogenphosphat, X M
In der Tabelle sind häufig verwendeter Puffer und Lösungen und deren
Zusammensetzung angegeben.
II.3. Nährmedien
II.3.1. Minimalmedium
Als Minimalmedium wurde ein Standard-Phosphatmedium nach Tanaka et al.
(1967)
verwendet.
Nach
dem
Autoklavieren
wurde
die
entsprechende
Kohlenstoffquelle, soweit nicht anders angegeben, in einer Endkonzentration von
0,2% (w/v) zugegeben. Bei Bedarf erfolgte eine Supplementierung mit Aminosäuren
(20mg/l der L-Form; Methionin und Cystein 40mg/l) und Thiamin (B1) (50mg/l). Bei
Derivaten des Stammes JWL181 wurde Thiamin mit 100mg/l eingesetzt, da eine
Wachstumslimitierung bei den Stämmen LGS322 und LGS323 mit nur 50mg/l Thiamin
beobachtet wurde. Vitamine (5mg/l) wurden je nach Verwendung dem Medium
entsprechend zugegeben. MM-Platten enthielten zusätzlich 12g/l Gibco-Agar.
II.3.2. Vollmedien (LB0, LB und 2xTY)
LB0-Vollmedium setzte sich aus 10g Bacto-Trypton (Difco), 10g Hefeextrakt und
5g NaCl auf 1000ml H2O bidest zusammen. Zur Herstellung von LB-Medium (Lennox
1955) wurde LB0-Medium nach dem Autoklavieren zu einer Konzentration von
II. Material und Methoden
21
0,2% (w/v) und CaCl2 (2,5 mM) steril zugesetzt. 2xTY-Medium bestand aus 13g BactoTrypton (Difco), 5g NaCl und 10g Hefeextrakt auf 1000ml H2O. Zur Herstellung von
LB0-Platten wurden zu 1l LB0-Medium 12g Gibco-Agar zugegeben.
II.3.3. MacConkey (McC) - Indikatorplatten
Als
Selektionsplatten
wurden
MacConkey-Indikatorplatten
verwendet
(MacConkey, 1905). Sie bestanden aus 40g MacConkey-Agar Base (Difco) in 1000ml
H2O. Die zu testende Kohlenstoffquelle wurde nach dem Autoklavieren in einer
Endkonzentration von 1% (w/v) steril zugegeben. Zuckeralkohole wurden in gleicher
Konzentration vor dem Autoklavieren eingewogen. Die Konzentration bei D-Mannitol
Platten lag dementsprechend bei 55mM.
II.3.4. IPTG/X-Gal-Indikatorplatten
In diesem Vollmedium war zusätzlich zu dem selektionierenden Antibiotikum
1mM IPTG und 0,02% (w/v) X-Gal enthalten. X-Gal-Platten können bei bestimmten
Klonierungen das Vorhandensein eines Inserts anzeigen. Alle Vektoren, die ein α-lacZ
mit einer integrierten multiplen Klonierungsstelle (mks) tragen, sind dafür geeignet. Auf
X-Gal-Indikatorplatten erscheinen Kolonien, die einen Vektor mit Insert erhalten haben
weiß. Diejenigen, die nur den Vektor tragen, erscheinen blau.
II.3.5. P1-Weichagar
P1-Weichagar diente zur Herstellung und Titration von P1-Phagenlysaten. Nach
der Vorschrift von Arber (1960) setzte er sich aus 8g Nutrient Broth, 5g NaCl, 6,5g
Difco-Agar auf 1000ml H2O zusammen.
II.3.6. Chemotaxis-Schwärmplatten
Die Herstellung von Chemotaxis-Schwärmplatten (ohne EDTA) erfolgte nach
einer von Grübl (1989) modifizierten Vorschrift nach Adler (1973). Die Platten
enthielten 3,9ml KH2PO4 (1M); 6,1ml K2HPO4 (1M); 1,0ml (NH4)2SO4 (1M); 1,0ml
MgSO4 (1M; nach den Autoklavieren steril zugegeben) und 2,7g Difco-Agar auf 1l
zweifach entsalztes H2O. Kohlenhydrate wurden in Endkonzentrationen zwischen
100µM und 1mM zugegeben.
22
II. Material und Methoden
II.3.7. Medien mit Antibiotikazusatz
Antibiotika
wurden,
wenn
nicht
anders
angegeben,
in
folgenden
Endkonzentrationen steril zugesetzt: Ampicillin (Amp/Ap) 100µg/ml; Chloramphenicol
(Cam/Cp) 25µg/ml; Tetracyklin (Tet/Tc) 10µg/ml (alle in 50% Ethanol gelöst);
Kanamycin (Kan/Kn) 25µg/ml; Spectinomycin (Spc/Sp) 100µg/ml; Streptomycin
(Str/Sm) 50µg/ml (alle in H2O gelöst).
II.3.8. Medium zum Anlegen von Dauerkulturen (nach Lengeler)
Ein salzarmes Medium (Slant) enthielt 20g Bacto-Trypton, 10g Hefeextrakt und
0,2% (v/v) Glyzerin auf 1l Wasser. Eine getestete Einzelkolonie wurde ÜN in 8ml
Medium angezogen. Die Kultur wurden abzentrifugiert und in 4ml Slant 50:50 (10g
Bacto-Trypton, 5g Hefeextrakt in 500ml Wasser und 500ml Glyzerin 87%)
resuspendiert. Je 2ml wurden in sterile Wheaton-Röhrchen überführt und getrennt bei 20°C gelagert.
II.4. Anzuchtverfahren
Die für die Anzucht von Stämmen der JWL-Stammreihe verwendeten
Minimalmedien wurden mit Thiamin, L-Arginin, L-Methionin und L-Histidin (B1AMH)
supplementiert.
Sollten
plasmidkodierte
Funktionen
erhalten
bleiben,
wurden
entsprechende Antibiotika in den bereits genannten Konzentrationen zugegeben.
II.4.1. Wachstumskurven
Wachstumskurven wurden in Erlenmeyerkolben mit dem 10fachen Volumen des
zu messenden Kulturvolumens durchgeführt. Aus einer gut gewachsenen ÜK wurden die
Zellen zu einem Titer von 2,5-5x107 Bakterien/ml angeimpft und bei 37oC im
Schüttelwasserbad inkubiert. Bei Wachstum in Minimalmedien erfolgte die Messung bei
OD420 (1=5x108 B/ml), die Trübungszunahme in Vollmedien wurde bei OD650
(1=1x109 B/ml) gemessen. Die Generationszeiten wurden rechnerisch aus der
Kurvengleichung der Wachstumskurve in der exponentiellen Phase ermittelt, wobei in
der halb-logarithmischen Darstellung eine exponentielle Trendlinie mit der Gleichung
II. Material und Methoden
23
y = m ∗ eb
∗x
erstellt wurde. Der Wert b ergab durch
G = ln2 / b
den Wert für die Generationszeit G.
II.4.2. Anzucht der Bakterien für Transportmessungen
Die Anzucht der Stämme erfolgte aerob in LB0-Medium und falls erforderlich mit
den entsprechenden Antibiotika. Nach dem Animpfen der Kultur aus einer ÜK zu einem
Titer von 5x107 B/ml (OD420=0.1) wurden die Zellen bis zum Erreichen eines Titers von
5x108
B/ml
im
Schüttelwasserbad
bei
37°C
inkubiert.
Eine
Induktion
des
Transportsystems war nicht erforderlich, da nur mit konstitutiv exprimierten Systemen
gearbeitet
wurde.
Anschließend
wurden
die
Zellen
abzentrifugiert
(Hettich-
Tischzentrifuge), in MM gewaschen und zu einem Titer von ca. 1x108 B/ml in MM
aufgenommen. Nach Bestimmung der genauen Test-OD erfolgte der Transporttest.
II.4.3. Anzucht der Bakterien für Proteinüberexpressionen
Eine Überexpression wurde bei der Herstellung von EIIMtl-Membranvesikeln
angewandt und in zwei unterschiedlichen Systemen durchgeführt:
1. An der Reichsuniversität in Groningen (RUG) wurde das Plasmid
pMaHisMtlAPr benutzt, dass eine Induktion über Hitze ermöglichte. In diesem Plasmid
ist das mtlA hinter den starken λ PR Promotor kloniert, der unter der Kontrolle des auf
dem Plasmid vorhandenen thermolabilen (cI875) λ-Repressors steht (Davison et al.,
1987). Hierzu wurde eine getestete EK in 2ml LB0-Medium+Cam unter Schütteln 7h bei
30°C im WB inkubiert um anschließend 100ml LB0-Medium+Cam anzuimpfen. Diese
Kultur wurde ÜN bei 30°C im WB inkubiert. Mit je 25ml ÜK wurden 3x 1l LB0Medium+Cam angeimpft und bei 30°C und 250Upm im Inkubator (New Brunswick
Scientific Co. Inc. - Model G25 Incubator Shaker) bis zu einer OD650=ca. 0,8
angezogen. Für die Hitzeinduktion wurde der Inkubator 10min auf 65°C, 20min auf
45°C und dann 2h auf 42°C eingestellt. Anschließend wurden die Zellen durch
Zentrifugation geerntet.
24
II. Material und Methoden
2. In pMMX5-Derivaten wurde die Überexpression nach der veränderten
Methode von Tabor und Richardson (1985) mit Hilfe des T7-RNA-Polymerasesystems
von Studier und Moffat (1986) durchgeführt. Bei dieser Methode wird die Eigenschaft
der T7-RNA-Polymerase genutzt, im Wesentlichen spezifische T7-Promotoren zu
erkennen. Durch Insertion des mtlA-Genes hinter den T7-Promotor in pHEX5 (Heuel,
1997) und gezielter Induktion der T7-RNA-Polymerase-Synthese mit Isopropyl-ß-Dthiogalactopyranosid (IPTG) konnte MtlA in erhöhter Menge in dem Stamm
JM109(λDE3) (Yanisch-Perron et al.,1985) produziert werden. Das Gen für die T7RNA-Polymerase liegt in Stamm JM109(λDE3) chromosomal unter Kontrolle des durch
IPTG induzierbaren lacUV5-Promotors vor. Durch Induktion mit IPTG kommt es zur
Expression der T7-RNA-Polymerase, welche dann die hinter den T7-Promotor klonierten
Gene transkribiert.
Mit dem entsprechenden Plasmid frisch transformierte JM109(λDE3)-Zellen
wurden als ÜK bei 37°C angezogen und am nächsten Morgen zu einem Titer von
ungefähr 5x107 B/ml in LB0-Medium+Cam angeimpft. Bei einer Zelldichte von ca.
7x108 B/ml erfolgte die Induktion der Überproduktion mit 2mM IPTG. Nach 1,5-2h
wurden die Zellen geerntet.
II.4.4. Anzucht der Bakterien zur Herstellung von Zellextrakten
War eine Proteinüberexpression bei der Herstellung von Zellextrakten nicht
möglich oder notwendig, wurde bei der Anzucht wie folgt verfahren. Aus einer ÜK in
2xTY-Medium wurde zu einem Titer von 3-5x107 B/ml angeimpft und bei 37°C im
Schüttler bis zur spätexponentiellen Phase (ca. 1x109 B/ml) inkubiert. Anschließend
wurde die Kultur durch Zentrifugation geerntet dann zweimal in 1%-igem NaCl
gewaschen und direkt weiter verarbeitet oder bei -20°C aufbewahrt.
II.5 Herstellung von Zellextrakten
II.5.1. Präparation von Zellextrakten mit der „French Press“
Nach der Ernte wurden die Zellen mit Tris [20mM; pH 7,6], NaN3 [1mM]
gewaschen und das Sediment mit 5ml Puffer (Tris [20mM; pH 7,6], NaN3 [1mM], DTT
[5mM]) je Gramm Nassgewicht der Zellen überschichtet und auf Eis ÜN im Kühlraum
gelagert.
II. Material und Methoden
25
Anschließend wurde dem Puffer 1mM PMSF, 1mM MgCl2 und je eine Spatelspitze
DNAse und RNAse zugegeben und die Zellen darin vorsichtig resuspendiert. Der
Aufschluss der Zellen erfolgte bei >10.000psi in der „French Press“. Der Zellaufschluss
wurde mit 2mM EDTA versetzt, anschließend 10min bei 15.000Upm zentrifugiert und
der Überstand weitere 90min bei 48.000Upm zentrifugiert. Die Membranvesikel
wurden in 2ml Puffer (Tris [25mM; pH 8,4], NaN3 [1mM], DTT [5mM]) je Nassgewicht
der Zellen resuspendiert und in flüssigem N2 gelagert.
II.5.2. Präparation von Zellextrakten durch Ultraschallbehandlung
Die Anzucht der Kulturen erfolgte wie unter II.4. beschrieben. Nach
Zentrifugation wurde das Sediment zweimal in 1/5 Volumen 1%iger (w/v) NaCl-Lösung
gewaschen. Die Zellen wurden in gekühltem Tris [0,1M; pH 7,6] auf einen Titer von ca.
1x1011 B/ml eingestellt und während des Aufschlusses durch Ultraschall in EtOHEiswasser
gekühlt.
Beschallt
wurde
in
Intervallen
von
20s/20s
(Ultraschall/Abkühlungsphase) bis das Extrakt klarer wurde. Nach der Kontrolle des
Extraktes unter dem Mikroskop wurden Zelltrümmer und nicht aufgeschlossene Zellen
durch 20-minütige Zentrifugation bei 14.000Upm/4°C entfernt. Zur weiteren
Auftrennung von Membranen und Zellinhalt wurde der Überstand in der Mini-UZ 30min
bei 80.000Upm/4°C zentrifugiert und das Membranpellet anschließend in 1/50
Volumen geeigneten Puffers resuspendiert.
II.6. Genetische Techniken
II.6.1. Strichkreuzungen
Donor und Rezipient wurden in 5ml LB0-Medium angeimpft und in der
exponentiellen Wachstumsphase geerntet. Nach zweimaligem Waschen in MM wurden
die Zellen in 0,2ml MM aufgenommen. Mit einer Pipette wurde zuerst der Donor auf
die entsprechende Selektionsplatte aufgetragen und nach dem Eintrocknen senkrecht
dazu der Rezipient.
26
II. Material und Methoden
II.6.2. Flüssigkreuzungen
Donor und Rezipient wurden in Vollmedium angezogen und nach dem Erreichen
der exponentiellen Phase in einem Verhältnis von 1:10 (Donor:Rezipient) in einem
Erlenmeyerkolben unter sehr langsamem Schütteln gemeinsam inkubiert. Die Kreuzung
wurde durch Resuspendieren in MM und eine kurze Vortexbehandlung unterbrochen.
Entsprechende Verdünnungen wurden auf Selektionsplatten ausplattiert.
II.6.3. Transformation von E. coli
Plasmid-DNA wurde nach der CaCl2-Methode (Sambrook et al., 1989) in die
Bakterienzellen
transformiert.
Alternativ
dazu
wurde
eine
vereinfachte
Transformationsmethode eingesetzt, bei der 5ml 2xTy-Medium mit 0,2ml einer
Übernachtkultur der zu transformierenden Bakterien angeimpft und 2 Stunden bei 37°C
im Roller inkubiert wurde. Nach Zentrifugation der Zellen wurde das Sediment in 0,2ml
kaltem CaCl2 (0,1M) resuspendiert und für 30min auf Eis gestellt. Mit den kompetenten
Zellen wurde die Transformation wie bei Sambrook et al. (1989) beschrieben
durchgeführt.
II.6.4. Transformation von E. coli durch Elektroporation
Bei Versuchen in denen eine höhere Transformationsrate erforderlich war, wurde
die Elektroporation eingesetzt. Dazu wurden E.coli-Zellen wie in dem Handbuch zum
ELEKTRO CELL MANIPULATOR 600 von BTX beschrieben in LB0-Medium bis zu einer
OD650 von 0,5-1 bei 37°C unter Schütteln angezogen. Die Zellen wurden dann viermal
mit
kaltem,
sterilem
Wasser
gewaschen
und
schließlich
auf
1/2000
des
Ausgangsvolumens in 10% (v/v) Glyzerin resuspendiert. Während des gesamten
Vorgangs wurden die Zellen auf 4°C gehalten. Die Zellen konnten portioniert und bei 80°C
aufbewahrt
werden.
50µl
der
Zellsuspension
wurden
in
eine
Elektroporationsküvette mit 2mm Schlitz (Eurogenetech) gegeben. Nach der Zugabe der
DNA wurde gemischt, das Gerät auf 2,5kV und R5 eingestellt und die Zellen dadurch
für ungefähr 5ms der Spannung ausgesetzt. Anschließend wurden die Zellen sofort in
eiskaltes Medium gegeben und dort für ca. 5min inkubiert. Dann wurden sie für 3090min unter Schütteln bei 37°C inkubiert und anschließend auf Selektionsplatten
plattiert.
II. Material und Methoden
27
II.6.5. P1-Transduktion
Zur Durchführung von P1-Transduktionen wurde die von Lengeler (1966)
modifizierte Methode nach Arber (1960) angewendet.
II.6.5.1. Herstellung von Plattenlysaten
P1-Weichagar wurde aufgekocht und im Wasserbad auf 55°C temperiert. Auf
3ml Weichagar wurden 0,25ml einer in LB-Medium angezogenen, gut gewachsenen
ÜK des Donorstammes und etwa 106 P1.kc-Phagen gegeben. Der zur Infektion benutzte
P1.kc sollte dabei möglichst auf einem WT-ähnlichen E. coli K-12-Stamm vermehrt
worden sein. Dieser Ansatz wurde rasch gemischt, auf eine vorgewärmte LB-Platte
gegossen und gleichmäßig verteilt. Die Platte wurde nach Erstarren des Weichagars bei
37°C bis zum Einsetzen der konfluenten Lyse inkubiert und dann zwecks Ernte der
Phagen mit 3ml LB-Medium überschichtet. Abgeschwemmt wurden die Phagen indem
der Ansatz ungefähr 30-60min vorsichtig bei RT geschwenkt oder ÜN bei 4°C
aufbewahrt wurde. Die Phagensuspension wurde mit einer Pipette von der Platte
abgezogen und zur Entfernung von Bakterien und Agarresten 15min bei 5.000Upm
zentrifugiert. Das Phagenlysat wurde nach Zugabe von einigen Tropfen CHCl3
geschüttelt und anschließend bei 4°C aufbewahrt. Zur Bestimmung des Phagentiters
wurden entsprechende Verdünnungen des Lysats (10-6, 10-7, 10-8, 10-9) wie oben
beschrieben mit Bakterien und Weichagar gemischt und ÜN auf Platten inkubiert.
II.6.5.2. Transduktion
Für eine P1-Transduktion wird eine m.o.i. von 0,2 als geeignet angesehen. Dazu
wurde eine in LB angezogene ÜK des Rezipientenstammes zunächst verdünnt (meistens
1:5) und mit 108 der auf dem Donorstamm vermehrten Phagen infiziert. Dieser Ansatz
wurde 20min bei 37°C inkubiert. Eine Neuinfektion der Zellen wurde durch Zugabe von
P1-Saline (7,5g Na-Citrat, 5g NaCl auf 1000ml H2O) und vortexen gestoppt. Die
Bakterien wurden noch einmal mit P1-Saline gewaschen und - je nachdem welche Art
von Markern übertragen werden sollte - direkt auf Selektionsplatten plattiert oder zur
Etablierung von Antibiotikaresistenzen vorher 1h bei 37°C in 3-4ml LB0 inkubiert.
28
II. Material und Methoden
II.7. DNA-Techniken
II.7.1. Analytische Agarosegele
Für die Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden Agarosegel-Elektrophoresen
nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Je nach Größe der Fragmente wurden
0,7%ige (w/v) bzw. bei kleinen DNA-Fragmenten 1,5%ige (w/v) Agarosegele in 1xTBEPuffer benutzt. Die Elektrophorese erfolgte in einem mit 0,5µg/ml Ehtidiumbromid
versetzten TBE-Puffer bei einer Spannung von 100V und einer Stromstärke von 100 bis
160mA. Das in die DNA interkalierende Ethidiumbromid konnte auf einem UVLeuchttisch
bei
Videodruckanlage
254nm
(UVP,
sichtbar
Herolab,
gemacht
und
Wiesloch)
zur
Auswertung
dokumentiert
mit
einer
werden.
Zur
Größenzuordnung der aufgetrennten Fragmente wurde ein Standard („1kb-ladder“) der
Firma Life Technologies benutzt.
II.7.2. Präparative Agarosegele und DNA-Fragmentisolierungen
Die präparative Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte wie oben
beschrieben. Um Beschädigungen der DNA durch UV-Strahlung möglichst gering zu
halten, wurden die gesuchten DNA-Fragmente mit einer UV-Handlampe (λ = 302nm)
sichtbar gemacht und mit einem Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Die
Isolation der aus den präparativen Gelen ausgeschnittenen DNA-Fragmente erfolgte
mit Hilfe des Qiaex Gel Extraction Kits von Qiagen nach Angaben des Herstellers.
II.7.3. Präparation von Plasmid-DNA
Die Isolierung kleinerer Mengen von Plasmid-DNA (Miniplasmidisolierung)
erfolgte durch alkalische Lyse (Birnboim &. Doly, 1979) nach dem Protokoll von
Sambrook et al. (1989). Abweichend von dieser Vorschrift wurde der GET-Lösung
(50mM Glukose; 10mM EDTA; 25mM Tris-HCl, pH 8,0) 4mg/ml Lysozym zugesetzt.
Bei Plasmiden mit geringer Kopienzahl wurde bei gleichem Ansatzvolumen die doppelte
Zellmenge eingesetzt. Zur Isolierung hochreiner Plasmid-DNA für Sequenzierungen
wurden das „Jet Star-Kit“ (Genomed) oder das ‚‚Flexi-Prep-Kit‘‘ (Pharmacia Biotech)
nach Angaben der Hersteller benutzt.
II. Material und Methoden
29
II.7.4. Bestimmung der DNA-Konzentration
Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte nach Sambrook et al. (1989)
durch die photometrische Messung der Extinktion der DNA-Proben bei 260nm. Dabei
entspricht OD260=1 etwa 50 µg/ml doppelsträngiger DNA. Um den Grad der
Verunreinigung durch Proteine zu ermitteln, wurde die Extinktion der Proben bei einer
Wellenlänge von 280nm gemessen. Reine Präparationen sollten einen Quotienten
OD260 / OD280 von 1,8 bis 2,0 aufweisen. Werte unter 1,8 erlauben keine exakte
Konzentrationsbestimmung.
II.7.5. DNA-Restriktion
Für die analytische oder präparative Spaltung von DNA wurden entsprechend
den Herstellerangaben 1-3 Einheiten des Restriktionsenzyms pro µg DNA (DNAKonzentration einer Miniplasmidisolierung: 0,5 bis 1,5µg/µl) zugegeben und bei der für
das Enzym optimalen Reaktionstemperatur im vom Hersteller empfohlenen Puffer
inkubiert. Zur Analyse wurde etwa eine Stunde, für Präparationen 2-3 Stunden und bei
Restriktionen mit chromosomaler DNA über Nacht verdaut. Bei Restriktionen mit mehr
als einem Enzym wurde der für alle Enzyme günstigste Inkubationspuffer oder der
‘‘One-Phor-All‘‘-Puffer
PLUS
(Pharmacia
Biotech)
verwendet.
Vor
der
gelelektrophoretischen Auftrennung wurde den Reaktionen 5xGLB zugegeben.
II.7.6. “Klenowbehandlung“ von DNA-Fragmenten
Zum Auffüllen 5’-überstehender Enden bzw. Abbau 3’-überstehender Enden
wurde eine Behandlung der DNA mit der Klenow-Polymerase nach Ausubel et al.
(1990) durchgeführt. Dieses Enzym besteht aus der großen Untereinheit der DNAPolymerase I (ohne 5’→3’ Exonuklease-Aktivität), die in Abwesenheit von dNTP
überstehende 3’-Enden abverdaut und 5’-überstehende Enden bei Zugabe eines dNTPMixes auffüllen kann. Die entstehenden „glatten“ Enden wurden für Klonierungen von
PCR-Produkten oder zur Ligation von DNA-Enden, die mit unterschiedlichen Enzymen
geschnitten wurden, benötigt. Pro µg DNA wurden 0,5 Einheiten Klenow-Enzym und der
vom Hersteller empfohlene Puffer zugegeben und bei 30°C für 5min inkubiert.
Anschließend wurde der dNTP-Mix (50mM Tris-HCl, pH7,0 und je 125µM dATP, dCTP,
dGTP sowie dTTP) in einer Endkonzentration von 6,25µM zugegeben und der Ansatz
30
II. Material und Methoden
weitere 15min bei 30°C inkubiert. Nach Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 70°C für
15min wurde die DNA direkt zur Ligation eingesetzt.
II.7.7. Ligation von DNA-Fragmenten
DNA-Fragmente wurden durch Zugabe von 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Life
Technologies oder Boehringer) je µg DNA und dem entsprechenden Ligase-Puffer
ligiert. Das zu ligierende Fragment wurde bei 3’- oder 5’-überhängenden Enden in etwa
5-fachem, bei der Ligation „glatter“ Enden in ca. 10-fachem Überschuß gegenüber
dem Vektor eingesetzt. Der Ligationsansatz, mit einem maximalen Volumen von 20µl,
wurde über Nacht bei 14°C inkubiert und konnte danach direkt zur Transformation
entsprechender Zellen eingesetzt werden.
II.7.8. DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung der DNA erfolgte entsprechend der Kettenabbruchmethode
nach Sanger (Sanger et al., 1977; Sanger 1981). Dabei wurde nach den Angaben des
Herstellers des „T7-SequencingTM-Kit“ der Firma Pharmacia vorgegangen. Zur
radioaktiven Markierung der DNA wurde [35S]-ATP eingesetzt. Um Kompressionen zu
beseitigen, wurde dem Ansatz falls erforderlich während der Primeranlagerung 1µl T4Gen32-Protein zugegeben (Kaspar et al. 1989). Je nach Stärke der radioaktiven
Markierung erfolgte die Exposition des Röntgenfilms für 12-24h. Beim Einsatz der
markierten Primer wurde das „Cy5TM AutoReadTM Sequencing Kit“ oder das „Thermo
Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP“ und
beim Gebrauch spezifischer, unmarkierter Primer der „Cy5TM-dATP Labelling Mix“
verwendet. Die Sequenzreaktion für das „Thermo Sequenase fluorescent labelled primer
cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP“ wurden in dem „1605 Air Thermo-Cycler“ der
Firma Idaho Technology Inc. (Idaho Falls, USA) nach folgendem Ansatz durchgeführt:
1,6µl
2µl
Cy5-Primer [5µM]
BSA [2,5mg/ml]
ca. 2ng
DNA
ad 24µl
H2O
II. Material und Methoden
31
Je 6µl wurden auf jeweils 2µl A-, C-, G-, T-Mix gegeben und in eine 10µl Glaskapillare
gezogen. Die Glaskapillaren wurden in den Thermocycler getan und folgendes
Programm gestartet.
4min
95°C
Denaturierung
10sec
98°C
Denaturierung
15sec
X°C1
Anlagerung
30sec
72°C
Elongation
4min
95°C
Denaturierung
1 Zyklus
25 Zyklen
1 Zyklus
1
Die Anlagerungstemperatur X richtete sich nach der Tm
(Schmelztemperatur) der Primer. Erfahrungsgemäß eignete sich als
Anlagerungstemperatur die von Interaktiva angegebene Tm nach der
„nearest neighbour“-Methode (Giesen et al. 1998).
Anschließend wurde 6µl des Gel-Lade-Puffers zugegeben. Die Auftrennung der Cy5Proben erfolgte mit Hilfe des ALFExpressTM der Firma Pharmacia (Freiburg).
II.7.9. Amplifikation von DNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgte nach einem Protokoll von Saiki et
al. (1985). Hierfür wurde der „1605 Air Thermo-Cycler“ der Firma Idaho Technology
Inc. (Idaho Falls, USA) verwendet. Dabei wurde nach Vorschrift der Firma gearbeitet
und folgender Standardansatz (50µl Gesamtvolumen) gewählt:
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
5 µl
15 µl
Template-DNA (1:50 verd. pGJ9 MPI)
Reaktionspuffer (10-fach)
MgCl2 (30mM)
dNTP-Mix (je 2mM)
Primer 1 (5µM)
Primer 2 (5µM)
Goldstar-Polymerase (0,4u)
H2O
Die Proben wurden in eine Glaskappilare gezogen, versiegelt und nach einmaliger
Denaturierung für 2min bei 95°C wurde folgender Temperaturzyklus 30 Mal
durchlaufen:
32
II. Material und Methoden
10sec
95°C
20sec
50/60°C Anlagerung der Primer
1,5min
72°C
Denaturierung
Elongation
Nach Beendigung des Laufes wurden 2µl des Ansatzes auf ein Kontrollgel
aufgetragen und Produkte bei dem 50°C- und 60°C-Ansatz festgestellt. Zur weiteren
Verwendung des PCR-Produktes wurden eine Gelelektrophorese und anschließend eine
Fragmentisolierung (II.7.2.) durchgeführt. Das isolierte Fragment wurde in einen
entsprechend geschnittenen Vektor, wie unter II.7.7. beschrieben, kloniert.
II.7.10. Entsalzen und Reinigen von DNA durch Ethanol-Fällung
Um DNA zu entsalzen bzw. von Enzymen zu reinigen, wurde eine EthanolFällung nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Dabei wurde zur DNA 0,1
Volumenteile (VT) 3M NaAc (pH6,0) und 2,5 VT 100% Ethanol gegeben, 30min
zentrifugiert und das getrocknete Sediment in einer adäquaten Menge H2O
aufgenommen.
II.7.11. Inaktivierung von Enzymen
Die Inaktivierung von Enzymen erfolgte einerseits durch 10min Hitzebehandlung
bei
65°C
oder,
falls
erforderlich,
durch
dreimaliges
Schockgefrieren
in
Ethanol/Trockeneis mit anschließendem Auftauen in einem 70°C WB. Alternativ wurde
eine Phenolextraktion mit anschließender Ethanolfällung durchgeführt.
II.7.12. Primer-Phosphorylierung
Wenn es erforderlich war wurden Primer nach folgender Methode mit der T4Polynukleotid-Kinase von Boehringer phosphoryliert:
10µl
2,5µl
0,5µl
2,5µl
9,5µl
Primer [10pmol/µl]
Kinase-Puffer [10fach]
T4-Polynukleotid-Kinase [10U/µl]
ATP [10mM]
H2O
II. Material und Methoden
33
Der 25µl-Ansatz wurde 30min bei 37°C im WB inkubiert. Die Reaktion wurde
anschließend durch 10min bei 70°C im WB beendet und anschließend bei -20°C
gelagert.
II.7.13. Gerichtete „Altered Sites II“-Mutagenese
Die Mutagenese mit dem „Altered Sites II in vitro Mutagenesis System“ von
Promega erfolgte nach Angabe des Herstellers mit phosphorylierten MutagenesePrimern. Dabei wurde die Variante unter Einsatz der Einzelstrang-DNA mit dem Stamm
BMH71-18 aus dem „Altered Sites I“-System verwendet.
II.7.14. Gerichtete „QuikChange™“-Mutagenese
Neuere
Mutagenesen
wurden
mit
dem
„QuikChange™
Site-Directed
Mutagenesis Kit“ der Firma Stratagene durchgeführt. Hierfür wurde der „T-Gradient
Thermo-Cycler“ der Firma Biometra verwendet und nach Vorschrift der Firma folgender
Standardansatz (50µl Gesamtvolumen) gewählt:
5µl
10xPCR-Puffer
1µl
Plasmid [10ng/µl]
1µl
Primer (+) [10µM]
1µl
Primer (-) [10µM]
1µl
dNTP [je 2,5mM]
1µl
Pfu-Turbo-Polymerase [2,5Units/µl]
40µl
H2O
Für den Austausch von maximal zwei Basen wurde folgendes Programm in dem
Thermocycler durchgeführt.
10min
94°C
Denaturierung
1min
94°C
Denaturierung
1min
50°C
Anlagerung
16min
68°C
Elongation
10min
68°C
Elongation
4°C
Kühlung
∞
1 Zyklus
18 Zyklen
1 Zyklus
34
II. Material und Methoden
Anschließend wurde durch Zugabe von 1µl des Restriktionsenzyms DpnI die
methylierte Matrizen-DNA 1,5h bei 37°C im WB abgebaut und 50µl superkompetente
XL1blue-Zellen mit 1µl der verdauten DANN transformiert.
II.8 Chemische und biochemisch-analytische Techniken
II.8.1. Bestimmung der Proteinkonzentration
Der Proteingehalt einer Probe wurde mit Hilfe des „Bio-Rad Protein Assay Dye
Reagent Concentrate“ nach Bradford (1976) den Angaben des Herstellers entsprechend
durchgeführt. Die Eichkurve wurde mit im Probenpuffer gelöstem Rinderserumalbumin
(BSA) aufgenommen.
II.8.2. Bestimmung der Zellzahl
Die Trübung des Mediums wurde photometrisch verfolgt. In MM wurde mit einer
Wellenlänge von 420nm gemessen, in LB0 bei einer Wellenlänge von 650nm. Zellzahl
und Proteinmenge ließen sich entsprechend einer Absorptionseinheit (OD=1) des
Spektralphotometers bei der entsprechenden Wellenlänge wie folgt bestimmen:
Tab.II.8.1. Zelltiter und Proteinmenge
WELLENLÄNGE (nm)
ZELLTITER
PROTEINMENGE (mg/ml)
650
1 x 109
0,25
420
5 x 108
0,125
Angegeben ist das Verhältnis von Proteinmenge und Zelltiter zu einer
Absorptionseinheit bei verschiedenen Wellenlängen für Kulturen von
E. coli K-12.
II.8.3. Bestimmung der spezifischen Transportaktivitäten
Zur Bestimmung der Transportaktivitäten wurden Transporttests nach Schmid et
al. (1982), durchgeführt. Die in vivo Bestimmungen der Transportaktivitäten wurden bei
25oC in Minimalmedium durchgeführt. Dazu wurden 1ml einer exponentiell
gewachsenen Zellsuspension mit einem Titer von 5x108 B/ml und 100µl radioaktives
Substrat in separaten Reagenzgläsern für 5min im Wasserbad bei 25oC äquilibriert. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von 900ml Zellsuspension zum radioaktiven Substrat
II. Material und Methoden
35
gestartet. Zu verschiedenen Zeitpunkten (in der Regel: 10s, 20s, 30s, 40s) wurden
jeweils 200µl aus dem Teströhrchen entnommen, sofort über ein Membranfilter
(Schleicher und Schuell, Porengröße 0,6µm) abgesaugt und zweimal mit 1ml
raumtemperiertem MM+ gewaschen. Die Filter wurden anschließend getrocknet und in
5ml Szintillationsflüssigkeit Quicksafe N von Zinsser Analytic (Frankfurt/M) gegeben. Als
Nullwert galten Zellen, die plasmidkodiert kein zu untersuchendes Transportsystem
enthielten. Transportunabhängige, unspezifische Anlagerungen des radioaktiven
Substrates an diese Zellen wurden auf Eis gemessen. Die Bestimmung der cpm-Rate
erfolgte im Szintillationszähler „Liquid Scintillation Analyzer 1600TR“ von Canberra
Packard (Illinois). Vier zeitabhängige Werte einer Probe wurden graphisch aufgetragen.
Dabei zeigte sich, dass die Aufnahme des Substrates schon nach 10s nicht mehr linear
erfolgte (s. Abb.II.8.1. Substrataufnahme von D-Mtl). Daher wurde der Wert nach zehn
Sekunden für die Berechnung der spezifischen Transportaktivität auf eine Minute
hochgerechnet. Die Auswertung erfolgte nach folgender Formel:
spezifische Transportaktivität =
∆cpm =
K=
OD650 =
t=
4 ⋅ VA ⋅ ∆cpm ⋅ K
OD650 ⋅ t ⋅ VF ⋅ cpm
⋅ VB
ml


nmol


 min ⋅ mg Protein 
Gezählte Impulse pro Minute abzüglich Nullwert
Substratkonzentration der radioaktiven Stammlösung [mol/l]
gemessene Extinktion der eingesetzten Zellsuspension bei 650nm
Zeitpunkt der Probenentnahme [min]
VA =
Volumen des Ansatzes [ml] (hier: 1)
VB =
Volumen der eingesetzten Bakteriensuspension [ml] (hier: 0,9)
VF =
auf den Filter gegebenes Probenvolumen [ml] (hier: 0,2)
Z=
radioaktive Zerfallsrate der Stammlösung [cpm/ml]
4=
Umrechnungsfaktor für die Berechnung der Proteinmenge aus der
Extinktion (OD650=1 entspricht 0,25mg Protein/ml)
36
II. Material und Methoden
18
16
-3
cpm [10 ]
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
20
t [sec]
30
40
Abb.II.8.1. Substrataufnahme von D-Mtl
Exemplarisch ist die Aufnahme von Mannitol in LGS322/pGJ9 dargestellt
(Š = LGS322/pGJ9; Š = Nullwert). Es ist zu sehen, dass die lineare
Aufnahme spätestens nach zehn Sekunden endet.
Um aus den spezifischen Transportaktivitäten KM-Werte ermitteln zu können,
wurden die Messungen bei unterschiedlichen Substratkonzentrationen durchgeführt. Die
jeweiligen Konzentrationen und radioaktiven Zerfallsraten der in einem Verhältnis von
1:10 im Test eingesetzten Zuckerlösungen sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Tab. II.8.2. Eingesetzte Zuckerkonzentrationen und dazugehörige cpm
D-Mtl Konz. [µM]
-3
cpm [x10 ]
3
5
7
10
15
20
30
50
100
31
53
78
107
168
210
197
210
236
II.8.4. Ermittlung des KM-Wertes und Vmax nach der „Lineweaver-Burk“Transformationsvorschrift
Bei Enzymen variiert die Katalysegeschwindigkeit V mit der Substratkonzentration
[S]. V ist definiert als die Anzahl der pro Sekunde entstehenden Mole eines Produkts.
Die Maximalgeschwindigkeit Vmax wird erreicht, wenn alle Bindungsstellen am Enzym mit
II. Material und Methoden
37
Substrat gesättigt sind. Die Bedeutung des KM-Wertes geht aus der Michaelis-MentenGleichung hervor:
V = V max
S 
 
 S  + KM


Bei sehr kleinen Substratkonzentrationen – wenn [S] viel kleiner als KM – gilt:
V = [S]Vmax/KM; das heißt, die Geschwindigkeit ist der Substratkonzentration direkt
proportional. Bei hohen Substratkonzentrationen wird V = Vmax; das bedeutet, dass die
Geschwindigkeit maximal ist, unabhängig von der Substratkonzentration. Bei [S] = KM
ist V = Kmax/2. Der KM-Wert entspricht daher der Substratkonzentration, bei der die
Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte ihres Maximalwertes erreicht. Um die MichaelisMenten-Beziehung in Form einer Geraden wiederzugeben, nimmt man von beiden
Seiten der Gleichung den Kehrwert:
1 = 1 + KM ∗ 1
V V max V max [S ]
Trägt man 1/V gegen 1/[S] auf, so ergibt sich ein Lineweaver-Burk-Diagramm
mit dem Ordinatenabschnitt 1/Vmax und der Steigung KM/Vmax.
1/V
=
ng
u
ig
Ste
K
/V
m
M
a
x
y-Achsenabschnitt = 1/V
m a x
x-Achsenabschnitt =
-1/K
M
0
1/[S]
Abb.II.8.2. Schematische Darstellung eines Lineweaver-Burk-Diagramms
Der Schnittpunkt der x- und y-Achse entspricht dem Nullpunkt beider Achsen
38
II. Material und Methoden
Durch Variation der Substratkonzentration bei den Transportmessungen konnten
über die oben angegebenen Grundlagen die Größen KMapp und Vmax in den einzelnen
Fällen ermittelt werden. Mittelwerte mehrerer Messungen wurden durch die Formel
∑x
n
ermittelt, wobei x die Werte der einzelnen Messungen und n die Anzahl der
Messungen sind. Die Standardabweichung als Maß dafür, wie weit die jeweiligen Werte
um den Mittelwert streuen, wurde nach folgender Formel berechnet:
n∑ x 2 − (∑ x )
2
n(n − 1)
.
II.8.5. Ermittlung des Kd-Wertes
Die Ermittlung des Kd-Wertes der Bindekinetik von dem EIIMtl und dessen
Varianten wurde mit der Fluss-Dialyse („flow dialysis“; Vos et al., nicht veröffentlicht) an
der Reichsuniversität in Groningen (RUG) durchgeführt. Dabei wird das aus einer
Dialysekammer austretende freie radioaktive D-Mtl in Abhängigkeit von vorhandenen
EIIMtl-Vesikeln bei steigender D-Mtl-Konzentration gemessen. Das freie D-Mtl diffundiert
bei 25°C durch eine Dialysemembran aus der Dialysekammer in die Flusskammer. Dort
wird ein Fluss-Puffer (25mM Tris, pH 7,6) mit einer Rate von 230µl pro Minute durch
die Flusskammer geleitet und in Fraktionen gesammelt. Die zu diesem Zweck
eingesetzten Vesikel wurden mit der „French-Press“ hergestellt. Im Einzelnen wurde der
Versuch wie folgt durchgeführt.
ΠBindetest mit Vesikeln
430µl Reaktionsmix wurden mit 20µl Vesikeln zu einer Endkonzentration von
25mM Tris [pH 7,6], 5mM DTT, 5mM MgCl2 und 0,25% dPEG (v/v) gemischt und
10min bei 25°C equilibriert. Anschließend wurden 380µl des Reaktionsmix in die
dreimal mit H2O gewaschene Dialysekammer pipettiert. Zu dem Zeitpunkt t=0min
wurde 1µl [3H]-D-Mtl [10µM] zugegeben. Bei t=1min wurden in fünf Fraktionen jeweils
6 Tropfen aufgenommen. Im Folgenden wurde zu bestimmten Zeitpunkten weiteres
[3H]-D-Mtl zugegeben und weitere Fraktionen aufgenommen:
II. Material und Methoden
39
t = 3min
+ 2µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 4min
je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 6min
+ 2µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 7min
je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 9min
+ 2µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 10min
je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 12min
+ 2µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 13min
je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 15min
+ 4µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 16min
je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
t = 18min
+ 8µl [3H]-D-Mtl [10µM]
t = 19min
je 6 Tropfen in 5 Fraktionen aufnehmen
Die aufgenommenen Fraktionen wurden mit 2ml Scintillationsflüssigkeit versetzt
und in dem Scintillationszähler gemessen. Über die kontinuierliche Zugabe erreicht man
annähernd einen Konzentrationsgradienten von 26nM - 524nM [3H]-D-Mtl in der
Dialysekammer. Allerdings muss die gleichzeitige unabhängige Diffusion des Mannitols
aus der Kammer („leakage“) berücksichtigt werden. Zu diesem Zweck wurden zwei
„Leerwertmessungen“ durchgeführt, die später in die Berechnung des Kd-Wertes
eingebunden wurden.
ΠErmittlung des Leerwertes
Leerwert 1: 380µl Reaktionsmix ohne Vesikel (25mM Tris, pH 7,6; 5mM DTT;
5mM MgCl2; 0,25% (v/v) dPEG) wurden in die dreimal mit H2O gewaschene
Dialysekammer pipettiert und 10min bei 25°C äquilibriert. Bei t.=.0min wurden 10µl
[3H]-D-Mtl [10µM] zu einer Endkonzentration von 256nM zugegeben. Nach 20sec
wurden in fünf Fraktionen jeweils sechs Tropfen aufgenommen. Die aufgenommenen
Fraktionen
wurden
mit
2ml
Scintillationsflüssigkeit
versetzt
und
in
dem
Scintillationszähler gemessen.
Leerwert 2: 380µl Reaktionsmix ohne Vesikel (25mM Tris, pH 7,6; 5mM DTT;
5mM MgCl2; 0,25% dPEG) wurden in die dreimal mit H2O gewaschene Dialysekammer
pipettiert und 10min bei 25°C äquilibriert. Bei t.=.0min wurden 20µl [3H]-D-Mtl
[10µM] zu einer Endkonzentration von 500nM zugegeben. Nach 20sec wurden in fünf
40
II. Material und Methoden
Fraktionen jeweils sechs Tropfen aufgenommen. Die Aufnahme der Fraktionen wurde
jeweils nach 5min:20sec und 10min:20sec wiederholt. Die aufgenommenen Fraktionen
wurden mit 2ml Scintillationsflüssigkeit versetzt und in dem Scintillationszähler
gemessen.
ΠBerechnung des Kd-Wertes (pers. Mitteilung E. Voss / RUG)
Für die mathematische Umsetzung der erhaltenen Werte wurden drei
Gleichungen zu Grunde gelegt, die in ihrer Kombination mit Hilfe eines
Näherungsprogramms zu der Berechnung des Kd-Wertes führen:
c
n = n0 ∗
(s0 - x)
s0
n = Konzentration der Bindestellen in Dialysekammer [nM]
n0 = Anfängliche Konzentration der Bindestellen in Dialysekammer [nM]
s0 = Konzentration der [3H]-D-Mtl Stocklösung [nM]
x = Menge des zugegebenen [3H]-D-Mtl [nM]
Diese Gleichung korrigiert die Konzentration der vorhandenen Bindestellen, die
durch Zugabe von weiterem Mannitol verdünnt wird. Je mehr Mannitol (x) zugegeben
wird, desto kleiner wird die Konzentration der freien Bindestellen.
d
(k + x + n) 2 - 4 ∗ n ∗ x
(k + x + n)
b=
2
2
(1)
b = Menge des an das Enzym gebundenen [3H]-D-Mtl [nM]
k = Kd-Wert des Enzyms
x = Menge des zugegebenen [3H]-D-Mtl [nM]
n = Konzentration der Bindestellen in Dialysekammer [nM]
Dieser Gleichung liegt das Verhältnis zwischen Enzym (E), Substrat (S) und
Enzym-Substrat-Komplex (ES) zugrunde. Im chemischen Gleichgewicht gilt:
E + S ⇔ ES
II. Material und Methoden
41
Für den Kd-Wert ergibt sich folgende Gleichung: Kd =
[E] [S]
[ES]
(2)
In der Gleichung entspricht die Menge des an das Enzym gebundenen [3H]-DMtl dem Enzym-Substrat-Komplex: [ES]x=xb. Die Anzahl der Bindestellen in der
Dialysekammer ergibt sich aus der Summe von freiem Enzym und mit Substrat
gebundenem
Enzym:
[E]x+x[ES]x=xn.
Ähnlich
verhält
es
sich
bei
der
Substartkonzentration. Sie ist die Summe aus freiem Substrat und Enzym-SubstratKomplex: [S]x+x[ES]x=xx. Ersetzt man in den letzten beiden Gleichungen [ES] durch b,
so ergibt sich für Ex=xn-b und Sx=xx-b. Wenn man die neuen Parameter in die
Gleichung für den Kd-Wert (1) einsetzt; erhält man:
k=
(n - b) (x - b)
b
(3)
Über die Umstellung der Gleichung (3) nach null ergibt sich:
b 2 - (x + n + k) ∗ b + n ∗ x = 0
(4)
Die Auflösung der Gleichung (4) nach b ergibt wiederum die Gleichung (1) mit
der es möglich ist, die Menge des an das Enzym gebundenen [3H]-D-Mtl zu berechnen.
e
y = r1 + r2 ∗ (x - b) + r3 ∗ (x - b) 2
y = freies [3H]-D-Mtl, dass durch die Membran dialysiert ist [cpm]
x = Menge des zugegebenen [3H]-D-Mtl [nM]
b = Menge des an das Enzym gebundenen [3H]-D-Mtl [nM]
r1 = 0
r2 = wird über die Leerwerte ermittelt
r3 = 0
Diese Gleichung berechnet die Menge an freiem [3H]-D-Mtl [nM], dass durch
die Membran dialysiert ist. Dieser Wert steht natürlich in Zusammenhang mit dem in der
Dialysekammer vorhandenen Enzym, dass eine Bindung eingehen kann (b) und dem
zugegebenen [3H]-D-Mtl (x). Weiterhin wird die Hintergrundstrahlung durch r1
42
II. Material und Methoden
einbezogen, wurde aber hier gleich null gesetzt, da dies schon bei den Messwerten
berücksichtigt wurde. Gleiches gilt für den Wert r3, der die Bindung an die
Dialysekammer darstellt. Diese Bindung konnte nicht festgestellt werden und somit
wurde dieser Wert ebenfalls gleich null gesetzt. Der Wert r2 ergibt sich aus der
Auswertung der Leerwertmessungen.
Aus den Werten der zweiten Leerwertmessung wurde eine lineare Regression
erstellt aus deren Geradengleichung (y=mx+b) die „leakage“-Rate (-m/b ∗ 100%)
berechnet wurde. Um r2 zu ermitteln, wurde in einer Kombination aller drei
Gleichungen unter Eingabe der ersten Leerwertmessung und des ersten Wertes der
zweiten
Leerwertmessung
eine
Näherungsrechnung
durchgeführt.
Alle
enzymabhängigen Werte (n, n0, k, b) wurden in dieser Rechnung gleich null gesetzt, da
cpm
kein Enzym vorhanden ist.
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
100
200 300 400
3
H-Mtl [nM]
500
600
Abb. II.8.3. Exemplarische Bindekurve
Dargestellt ist eine Bindekurve für die Bindung von [3H]-D-Mtl
an das 6His-Tag EIIMtl (H6wt). (z = Leerwertmesspunkte;
gepunktete Linie = lineare Regression der Leerwertmesspunkte;
„ = Bindekurve H6wt).
Mit Hilfe der „leakage rate“ und des r2-Wertes konnte die Referenzgerade für
die enzymunabhängigen [3H]-D-Mtl-Dialyse erstellt werden. Diese grafische Darstellung
der [3H]-D-Mtl-Dialyse verläuft nicht mehr linear, wenn bindendes Enzym vorhanden ist
(siehe Abb. II.8.3.). Die Bindekurve wird unter Berücksichtigung der gemessenen cpm
und den Werten r2 und „leakage-rate“ abgeleitet. Aus der Abweichung dieser Kurve
II. Material und Methoden
43
von der Leerwertgeraden lassen sich über ein Computerprogramm die Konzentration
und der Kd-Wert des untersuchten Enzyms berechnen.
II.8.6. Test der PTS-abhängigen in vitro Phosphorylierung
Die in den Kd-Wert-Bestimmungen eingesetzten Vesikel wurden vorher auf ihre
Phosphorylierungsaktivität getestet. Dazu wurde an der RUG der PEP-abhängige
Phosphorylierungs-Test nach Robillard und Blaauw (1987) durchgeführt. Die
spezifischen Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel wurden in 25mM Tris-HCl (pH
7,6), 5mM MgCl2, 5mM DTT, 5mM PEP, 0,25% (v/v) decylPEG, 10µM HPr und 0,1µM
EnzymI bei 30°C gemessen. Die Menge an [14C]-D-Mtl und Enzym variierten in den
einzelnen Versuchsansätzen. Die Versuchsansätze wurden 10min bei 30°C inkubiert
bevor die Reaktion mit radioaktivem D-Mannitol gestartet wurde. Das Volumen der
Ansätze betrug 100µl wovon in verschiedenen Zeitabständen vier mal jeweils 20µl
Probe auf eine Dowex AG1-X2-Säule geladen wurde. 10µl des Ansatzes wurden zur
Bestimmung der Radioaktivität in dem Ansatz verwendet. Anschließend wurden die
Säulen dreimal mit H2O gespült und das gebundene D-Mannitol-P mit zwei mal 1,8ml
HCl [0,2M] eluiert. Nach Zugabe der „Scint-Flüssigkeit“ wurde die Radioaktivität in
einem Scintillationszähler gemessen. Die spezifische Aktivität wurde nach folgender
Formel berechnet:
spez. Akt. =
∆ cpm ∗ F
t ∗ VA ∗ P


nmol


 min ⋅ mg Protein 
∆cpm = gezählte Impulse pro min abzüglich Nullwert
F
= spez. Radioaktivität des Substrates [nmol/cpm]
t
= Reaktionszeit [min]
P
= eingesetzte Proteinmenge [mg/ml]
VA
= Gesamtvolumen des Ansatzes [ml]
II.8.7. SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Zur Auftrennung von Proteinen wurde eine SDS-Gelelektrophorese nach
Laemmli (1970) durchgeführt, bei der die durch SDS denaturierten Proteine
44
II. Material und Methoden
entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden. Die Proteingele hatten
folgende Zusammensetzung:
Trenngel:
4ml
4,9ml
3ml
Acrylamid-Bisacrylamid (30%/0,8% (w/v))-Lösung
H2O
1,5M Tris pH8,8
120µl
10% (w/v) SDS
120µl
10% (w/v) Ammoniumpersulfat
Sammelgel:
1ml
6,3ml
3ml
100µl
65µl
Acrylamid-Bisacrylamid (30%/0,8% (w/v))-Lösung
H2O
1,5M Tris pH8,8
10% (w/v)SDS
10% (w/v) Ammoniumpersulfat
Die Lösungen wurden vermischt und 5min entgast. Nach Zugabe von 40 bzw.
5µl TEMED-Lösung zum Trenn- bzw. Sammelgel wurden 10x8cm große und 1,5mm
dicke Gele gegossen. Die Proben wurden in einem Puffer nach Laemmli (1970) (60mM
Tris-HCl, pH6,8; 1% (w/v) SDS; 1% (v/v) 2-Mercaptoethanol; 10% (v/v) Glyzerin;
0,01% (w/v) Bromphenolblau) resuspendiert und vor dem Auftragen 3min bei 95oC
hitzedenaturiert. Als Größenstandart wurde ein nichtradioaktiver Proteinstandard (Biorad
low range, Biorad Laboratories) verwendet. Der verwendete Laufpuffer bestand aus
25mM Tris-HCl; 0,2% (v/v) Glyzerin und 0,1% (w/v) SDS mit einem pH-Wert von 6,8.
Bei der Elektrophorese erfolgte im Sammelgel bei 15 bis 20mA die Fokussierung
der Proteinproben auf eine scharfe Lauffront und im Trenngel bei 25 bis 30mA die
Auftrennung der Proben. Hatte die Lauffront das untere Gelende erreicht wurde der
Lauf beendet. Das Trenngel wurde mit einer Lösung (0,1% (w/v) Serva BlauG; 10% (v/v)
Essigsäure; 24% (v/v) Methanol) gefärbt, entfärbt (10% (v/v) Essigsäure, 25% (v/v)
Methanol) bis der Standard zu erkennen war und unter Vakuum bei 65°C getrocknet
(LKB Bromma, 2003 Slab Gel Dryer). Um radioaktiv markierten Substanzen sichtbar zu
machen, wurde nach dem Trocknen eine Autoradiographie durchgeführt.
II. Material und Methoden
45
II.8.8. Gezielte Markierung von Cysteinen („Cystein-Scanning“)
Die Methode des Cystein-Scannings, wie sie hier angewendet wurde, dient zur
Lokalisierung der relativen Lage von definierten Aminosäuren zur Zytoplasmamembran
in Membranproteinen. Dazu wird ein Membranprotein konstruiert, das an einer
definierten Position einen einzelnen Cysteinrest enthält. Durch den Einsatz von
membranpermeablen
(hier:
Biotinmaleimid)
und
membranimpermeablen
Sulfhydrylreagenzien (hier: Stilben) kann im Idealfall ermittelt werden, ob dieser
definierte Cysteinrest im Peri- oder Zytoplasma lokalisiert ist. Dabei wird mit einem
membranimpermeablen Sulfhydrylreagenz vorinkubiert, um im Periplasma befindliche
Cysteine zu identifizieren. Im Zytoplasma und unter Umständen in der Membran
liegende Cysteine werden bei diesem Vorgang nicht belegt. Eine anschließende
Markierung mit dem membranpermeablen Biotinmaleimid erreicht theoretisch alle
Cysteine unabhängig von ihrer Lage. Es kann aber nicht an Cysteinen binden, die
bereits mit Stilben abgedeckt oder membranständig sind. Allerdings ist die
Membranpermeabilität von Biotinmaleimid stark von dem pH-Wert, der Temperatur,
Konzentration und Inkubationszeit abhängig (Loo und Clarke, 1994). In der hier
beschriebenen Versuchsdurchführung erwies sich das Biotinmaleimid als weitgehend
membranimpermeabel. Folglich können im Zytoplasma oder in der Membran liegende
Cysteine in keinem Fall markiert werden. Im Periplasma befindliche Cysteine werden
nach einer Vorinkubation mit Stilben nicht durch Biotinmaleimid markiert, wohl aber bei
alleiniger Inkubation mit Biotinmaleimid. Da in diesem Test gebundenes Biotinmaleimid
nachgewiesen wird, kann durch unterschiedliche Kombination der eingesetzten
Sulfhydrylreagenzien in ganzen Zellen und in Membranpräparationen die allgemeine
Zugänglichkeit von Cysteinen und deren Lage im Membranprotein ermittelt werden.
II.8.8.1. Markierung ganzer Zellen mit Biotinmaleimid
300ml Kultur des Stammes JM109(λDE3) mit den entsprechenden pMMX5Derivaten wurden wie in II.4.3. beschrieben angezogen und zentrifugiert. Das Sediment
wurde aufgeteilt wobei ein Teil eingefroren und der andere in 3ml KPi-Puffer [100mM;
pH 7,5] resuspendiert wurde. Die 3ml Kultur wurden wiederum in je 1,5 ml aufgeteilt.
Ein Teil wurde mit 1mM Stilben aus einer 50mM Stocklösung 15min bei
Raumtemperatur vorinkubiert. Nach der Inkubation wurde der Ansatz zweimal mit KPiPuffer [100mM; pH 7,5] gewaschen. Anschließend wurden beide Teile 30min mit
46
II. Material und Methoden
200µM Biotinmaleimid aus einer 30mM Stocklösung bei RT markiert. Die Reaktion
wurde mit 50mM β-Mercapto-EtOH abgestoppt, die Kulturen zweimal mit KPi-Puffer
[100mM; pH 7,5] gewaschen und die Sedimente eingefroren.
II.8.8.2. Markierung von Membranvesikeln mit Biotinmaleimid
In diesem Schritt wurde die allgemeine Zugänglichkeit der Cysteine im
Membranprotein überprüft. Zur Herstellung von Membranvesikeln wurde das
unmarkierte Sediment aus II.8.7.1. in je 3ml KPi-Puffer [100mM; pH 7,5] resuspendiert.
In der praktischen Durchführung wurden aus den beiden markierten Sedimenten
parallel Membranvesikel hergestellt. Die somit vier Ansätze wurden jeweils in COREXRöhrchen überführt und mit je 10µl Protease-Inhibitor-Cocktail (SIGMA, P-8849)
versetzt. Die folgende Ultraschallbehandlung der Zellen wurde wie in II.5.2.
beschrieben durchgeführt. Die Sedimente wurden in 150µl KPi-Puffer [100mM; pH 7,5]
resuspendiert. Die bereits als ganze Zellen markierten Membranvesikel wurden in der
Zwischenzeit auf Eis gelagert. 150µl der unmarkierten Membranvesikel wurde wieder
mit 1mM Stilben 15min bei RT vorinkubiert. Um eine Permeabilität der Vesikel zu
gewährleisten, wurde der Ansatz zweimal in EtOH-Trockeneis gefroren und in dem
Ultraschallbad (RT) aufgetaut. Im nächsten Schritt wurden beide Ansätze 30min mit
200µM Biotinmaleimid bei RT markiert. Im Folgenden wurden alle vier Ansätze in
Lösung gebracht („solubilisiert“).
II.8.8.3. Solubilisierung von Membranvesikeln
Die
vier
Ansätze
wurden
in
den
Zentrifugenröhrchen
mit
DOC-
Solubilisierungspuffer [20mM Tris, pH8; 300mM NaCl; 10mM β-Mercapto-EtOH;
0,5% (w/v) DOC (Deoxycholic acid sodium salt monohydrate (SIGMA-ALDRICH; D89552) 100µM D-Mannitol] auf 1500µl aufgefüllt und 45min auf Eiswasser gerührt.
Der Anteil an DOC wurde in vier Portionen alle fünf Minuten hinzugegeben. Nach einer
Zentrifugation
von
45min
bei
45.000Umin/4°C
wurde
das
solubilisierte
Membranprotein über eine Ni-NTA-Säule gereinigt. Dies war erforderlich, damit die
übrigen ebenfalls am Cystein markierten Proteine der Zelle möglichst vollständig aus
dem Hintergrund entfernt wurden.
II. Material und Methoden
47
II.8.9. Reinigung von MtlA über eine Ni-NTA-Säule
Da das MtlA für die Reinigung mit einem His-Tag versehen wurde, konnte es
über Ni-NTA-Säulen gereinigt werden. Alle Zentrifugationsschritte mit den Säulen
wurden bei 2.000Upm 2min mit geschlossenem Deckel durchgeführt. Vor dem Beladen
der Säulen mit dem Überstand wurden diese mit 600µl DOC-Solubilisierungspuffer
equilibriert. Der Überstand aus II.8.7.3. wurde mit 10mM Imidazol versehen und mit
zweimal 600µl wurden die Säulen beladen. Der Waschschritt erfolgte mit 600µl DOCWaschpuffer [20mM Tris, pH8; 300mM NaCl; 30mM Imidazol; 0,1% (w/v) DOC;
100µM D-Mannitol]. Das Protein wurde mit 200µl DOC-Elutionspuffer [20mM Tris,
pH7,6; 200mM Imidazol; 100µM D-Mannitol] eluiert und das Eluat bei -20°C gelagert.
II.8.10. Immuno-Nachweis von Proteinen mit spezifischen Antikörpern
Nach der Reinigung wurden die Proteine und deren Markierung mit
Biotinmaleimid in einer Western-Hybridisierung nachgewiesen. Die Durchführung und
die verwendeten Antikörper werden folgend beschrieben.
II.8.10.1. Nachweis des His-Tag
Um festzustellen, ob mit den Ni-NTA-Säulen das richtige Protein gereinigt wurde,
wurde eine „Semidry“-Western-Hybridisierung in der „TRANS-BLOT SD SEMI-DRY
TRANSFER CELL“ von BIO-RAD (USA, CA 54547) mit Anti-His Antikörpern
durchgeführt. Der Aufbau der Hybridisierung erfolgte mit folgenden auf Gelgröße
zugeschnittenen Komponenten:
[Deckel (Kathode)]
2x Filterpapier (GB 004 GEL-BLOTTING Paper. Schleicher & Schuell, D-37582)
SDS-Gel
Nitrocellulose Transfer-Membran (PROTRAN. Schleicher & Schuell, D-37582)
2x Filterpapier (GB 004 GEL-BLOTTING Paper. Schleicher & Schuell, D-37582)
[Boden (Anode)]
Die Nitrocellulose wurde 5sec in Wasser inkubiert, bevor sie wie alle anderen
Hybridisierungs-Komponenten 30min bei RT in dem Hybridisierungspuffer (25mM Tris,
192mM Glycin, 20% (v/v) Methanol [pH 8,3]) equilibriert wurde. Die Hybridisierung
48
II. Material und Methoden
wurde wie oben beschrieben aufgebaut und die Transferparameter abhängig von der
Gelgröße eingestellt. Bei zwei kleinen Gelen (jeweils ca. 8,5cm x 5cm x 1,5mm) wurden
60min Transfer bei 20V gewählt. Die Membran wurde anschließend mit Ponceau S
(0,2% (w/v) in 3% (v/v) TCA) gefärbt um die Übertragung zu bestätigen. Nachdem die
Membran mit H2O entfärbt wurde, erfolgte ein 20minütiger Waschschritt in TNT (20mM
Tris/HCl [pH 7,5], 0,5M NaCl, 0,05% (v/v) Tween 20) bei RT. Anschließend wurde die
Membran ÜN bei 4°C in TNT/3% (w/v) BSA (Albumine Bovine Fraction V, BIOMOL, D22769) geblockt.
In dem folgenden Schritt wurde die Reaktion mit dem Penta-His Antikörper von
QIAGEN (mouse anti-(H)5, Cat. No. 34660) durchgeführt. Dazu wurde die Membran
1h bei RT mit 6ml Antikörper-Lösung (TNT, 1% (w/v) BSA, 0,067µg/ml Penta-His AK) in
einer verschweißten Plastiktasche inkubiert. Die Membran wurde dann drei mal 10min
bei Raumtemperatur in TNT gewaschen.
Anschließend
wurde
die
Membran
mit
der
Meerrettich-Peroxidase
(„Horseradishperoxidase“, N31430. Pierce, Rockford, IL 61105), die 1:10000 in
TNT/1% (w/v) BSA verdünnt wurde, 1,5h bei RT in einer verschweißten Plastiktasche
inkubiert. Die Membran wurde dann wieder drei mal 10min bei Raumtemperatur in
TNT gewaschen.
Die darauf folgende Chemilumineszens-Reaktion wurde nach Angaben des
Herstellers mit der „Western Blot Chemiluminescence Reagent“ (NEN Life Science
Products,
Boston,
MA
02118-2512)
durchgeführt.
Der
Nachweis
der
Chemilumineszens wurde bei unterschiedlichen Expositionszeiten zwischen 10 und
60sec auf dem „Hyperfilm ECL“ (Amersham Pharmacia Biotech UK Limited)
durchgeführt.
II.8.10.2. Nachweis der Biotinmaleimid-Markierung
Der Nachweis der Biotinmaleimid-Markierung erfolgte ähnlich wie unter
II.8.10.1. beschrieben. Es wurden lediglich andere spezifische Antikörper eingesetzt. Da
bei der Methode des Cystein-Scanning das Biotinmaleimid den ersten Antikörper
darstellt und die Bindung schon während der Markierung erfolgte, fiel dieser
Inkubationsschritt weg. In der zweiten Antikörperreaktion wurde das StreptavidinMeerrettich-Peroxidase-Konjugat (RPN 1231)“ (SHRPC) von Amersham Pharmacia
Biotech UK Limited statt HRP eingesetzt. Die Membran wurde in 10ml Antikörperlösung
II. Material und Methoden
49
(TNT, 1% (w/v) BSA, 2µl SHRPC) bei 4°C in einer verschweißten Plastiktasche inkubiert.
Alle folgenden Schritte wurden wie beschrieben durchgeführt.
II.9. Computerprogramme
Die Auswertung der DNA- und Protein-Sequenzen erfolgte mit Hilfe folgender
Programme:
BLAST, The NCBI BLAST family of programs (Altschul et al., 1997)
DNASIS for Windows, Version 2 (Hitachi Software; San Bruno)
AlLIGN, Version 1.01 (Scientific u. Educational Software, 1989)
Vector NTI Suite, Version 6.0 (InforMax, Inc.; No. Bethesda, MD 20852)
TMHMM (Transmembrane Hidden Markov Model, Sonnhammer et al., 1998)
50
III. Ergebnisse
III. Ergebnisse
III.1. Selektion und Untersuchung entkoppelter Mutanten
Während des Transportvorganges eines hochaffinen Substrates über das
Phosphoenolpyruvat-abhängige
Kohlenhydrat:Phosphotransferasesystem
wird
das
Substrat normalerweise durch eine Phosphorylierung chemisch modifiziert. Dabei wird
davon ausgegangen, dass bei hochaffinen Substraten der Transport über die
Zytoplasmamembran und die anschließende Phosphorylierung gekoppelt ablaufen. Es
sind sowohl bei Escherichia coli als auch bei Klebsiella pneumoniae entkoppelte EIIMtl
Mutanten beschrieben worden (Klawitter, 1992; Scholle 1993; Heuel, 1997; Otte,
2000), bei denen Transport und Freisetzung des Substrates in das Zytoplasma
unabhängig von der Phosphorylierung ablaufen. Diese Mutanten geben Hinweise auf
wichtige am Transportprozess beteiligte Aminosäuren und deren Einfluss auf die
Kopplung von Translokation des Substrates und Energetisierung des Transporters.
Daher war es von großem Interesse, die Selektionssysteme zu optimieren, um weitere
Mutanten zu selektionieren und diese anschließend zu charakterisieren.
III.1.1. Konstruktion von Stämmen zur Selektion entkoppelter Mutanten
Die früheren und in dieser Arbeit verwendeten Selektionssysteme benutzen einen
semisynthetischen Stoffwechsel, der es E. coli ermöglicht, unphosphoryliertes („freies“)
D-Mannitol zu verstoffwechseln. Da die Mtl.1P-Dehydrogenase nicht in der Lage ist,
unphosphoryliertes Mtl umzusetzen, wurde in früheren Ansätzen der Stamm LGS323
(∆(mtlAPA‘) MtlD+) mit den Plasmiden pGJ9∆137 (mtlAPA’) und pASL14 (dalD+K+)
transformiert (Scholle, 1993). Die carboxyterminale Deletion des mtlA in dem Plasmid
pGJ9∆137 beinhaltet die Nukleotidsequenz, welche für die AS His554 der IIAMtlDomäne kodiert, wodurch ein gekoppelter Transport von Mtl verhindert wird. Eine
direkte Phosphatgruppenübertragung von HPr auf das Cys384 der IIBMtl-Domäne ist
nicht möglich (Scholle, 1993). Das Gen dalD codiert für die D-ArabinitolDehydrogenase (DalD) aus Klebsiella oxytoca M5a1, welche sowohl unphosphoryliertes
D-Arabinitol (Atl) als auch unphosphoryliertes D-Mannitol (Mtl) als Substrat erkennt und
III. Ergebnisse
51
eine Umsetzung zu D-Xylulose (Xul) bzw. D-Fructose (Fru) katalysiert (Wood et al.,
1961; Tanaka et al., 1967; Charnetzky & Mortlock, 1974; Lengeler 1975b; Heuel et
al., 1998). Bei der Selektion auf Wachstum mit D-Mtl erhält man Mutanten, die den
entkoppelten
Transport
von
D-Mtl
ermöglichen
(siehe
Abb.
III.1.1.).
Die
Reproduzierbarkeit dieses Systems scheiterte jedoch an der starken Kurierung des
Plasmides pASL14. Um eine Kurierung und somit den Verlust der Fähigkeit, freies
Mannitol umzusetzen, zu verhindern, musste dalD auf stabilere Plasmide kloniert
werden.
Abb.III.1.1. Wildtyp- und semisynthetischer Stoffwechselweg für den D-Mtl-Abbau
in E. coli
Unter I. WT ist der D-Mtl-Abbau im WT und unter II. mtlA∆137 der semisynthetische DMtl-Abbau in LGS322-1 /pGJ9∆137 dargestellt.
Rote Pfeile: Stoffwechselweg für den normalen, d.h. gekoppelten Transport von D-Mtl über
ein Wild-Typ II.CBAMtl. Unterbrochene rote Pfeile (): kein Transport. Grüne Pfeile:
Stoffwechselweg bei entkoppeltem Transport von D-Mtl. Die IIC-Domäne mit entkoppeltem
Transport ist mit einem Stern versehen (IICMtl*). Orangefarbene Pfeile:
Phosphatgruppenübertragung über allgemeine PTS-Komponenten. Unterbrochene
orangefarbene Pfeile (): keine Phosphatgruppenübertragung. Grau schattiert: Deletierte
Domäne des II.CBAMtl. Ⓟ~AS: An der Phosphatgruppenübertragung beteiligte
Aminosäuren. MtlD: Mtl.1P-Dehydrogenase. DalD: D-Arabinitol-Dehydrogenase. Weitere
Erläuterungen siehe Text und Abkürzungsverzeichnis.
52
III. Ergebnisse
Abb. III.1.2. Schematische Darstellung der Konstruktion von F’lac::dalD
Die einzelnen Schritte der Konstruktion werden im nachfolgendenText näher beschrieben.
Die grafisch hervorgehobenen genetischen Elemente sind nicht maßstabsgetreu dargestellt.
bla = Gen für eine β-Lactamase (Ampicillin-Resistenz, ApR). IR = zwei sich invertiert
wiederholende Sequenzen (ermöglichen die Transposition von TnLSD101). mks = multiple
Klonierungsstelle. ori = Replikationsursprung des Plasmides pBR322. spc = Gen für eine
Spectinomycin-Resistenz (SpR).
III. Ergebnisse
53
III.1.1.1. In vivo Klonierung von dalD auf ein F’-Plasmid
In einem ersten Ansatz wurde das Gen dalD in den Niedrigkopien-Vektor pHEX3
(Heuel, 1997) kloniert. Das resultierende Plasmid pHEXD zeigte jedoch eine für das
Selektionssystem zu hohe Kurierungsrate. Da F’-Plasmide eine hohe Stabilität in
Bakterien zeigen, wurde anschließend das F’lac als Träger des Gens dalD gewählt.
Bei der Konstruktion des F’lac::dalD -Plasmides wurde nach Schmid et. al. (1991)
und Zeppenfeld et. al. (2000) das Gen zwischen zwei sich invertiert wiederholende
Sequenzen („inverted repeats“ = IR) kloniert, um es so als Transposon springen zu
lassen. Das verwendete Plasmid pTIM101 erlaubt zusätzlich eine „Blau/Weiß-Selektion“
durch α-Komplementation, trägt eine multiple Klonierungsstelle aus dem pHEX3, ein ΩFragment zur Verhinderung unphysiologischer Expression durch einen fremden,
stromaufwärts liegenden Promotor und eine Spectinomycin-Resistenz. Das Gen für die
Transposase (tnpA), welche das Springen des Transposons ermöglicht, wird von einem
weiterem Plasmid pPSO110 exprimiert, wodurch eine Stabilisierung des Transposons in
einem pPSO110-freien Stamm gewährleistet ist. Im folgenden werden die Einzelschritte
beschrieben, welche zur Konstruktion des Plasmides F’lac::dalD durchgeführt wurden
(siehe Abb. III.1.2.).
Œ Konstruktion des Plasmids pHEXD (dalDK’)
Das erste für den semisynthetischen Stoffwechsel benötigte Gen dalD stammt aus
Klebsiella oxytoca M5a1. Es kodiert für eine D-Arabinitol-Dehydrogenase (DalD) und
wurde aus dem Plasmid pGHL3 (Heilenmann, unveröffentlicht) in die mks des
Niedrigkopie-Vektors pHEX3 subkloniert. Ein Doppelverdau von pGHL3 mit den
Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI ergab u.a. ein 2,7kb großes dalD/dalK‘Fragment, welches anschließend mit dem entsprechend verdauten Vektor pHEX3 zum
neuen Plasmid pHEXD ligiert wurde. Die Funktionalität der D-Arabinitol-Dehydrogenase
(DalD) aus pHEXD wurde in dem Stamm LGS322 getestet. Der Stamm LGS322 kann
über das Glukose-PTS (II.CBAGlc) freies D-Arabinitol transportieren (Budde, 1991),
welches ohne DalD nicht verstoffwechselt wird.
54
III. Ergebnisse
Tab. III.1.1. Plattentest zum Nachweis einer funktionellen DalD aus pHEXD
Platten1
McC Atl
MM Atl
LB0
LGS322 /pHEX3
s
-
+
LGS322 /pHEXD
2+
+
+
Stamm
1
Supplementation mit den entsprechenden Antibiotika, Kohlenhydraten und
Aminosäuren (siehe Abkürzungsverzeichnis) wie im Teil II der Arbeit angegeben.
Phänotyp der Kolonien auf McC-Platten: 3+ = dunkelrot mit trübem Hof; 2+
= dunkelrot; + = rot; (+) = rosa ; (w) = rosa mit weißem Rand; w = weiß; s =
sensitiv; - = kein Wachstum. Phänotyp der Kolonien auf MM-Platten: + =
Wachstum; (+) = schwaches Wachstum, auf den Platten erst nach 2-3 Tagen
sichtbar; - = kein Wachstum. Phänotyp auf LB0-Platten: + = Wachstum; (+) =
schwaches Wachstum; - = kein Wachstum.
Der Markertest zeigt, dass dalD vom Plasmid pHEXD in ausreichender Menge
exprimiert wird, und somit ein schnelles Wachstum auf freiem D-Arabinitol ermöglicht
(Phänotyp Atl2+). LGS322/pHEX3 ist ohne dalD auf D-Arabinitol sensitiv Phänotyp, was
vermutlich auf eine intrazelluläre Anhäufung von D-Atl 5-P zurückzuführen ist.
ΠKonstruktion des Plasmids pLSD101 mit dem Transposon TnLSD101
Um das dalD+/dalK‘-Fragment des Plasmids pHEXD auf ein F’lac-Plasmid
springen zu lassen, musste es vorher in ein künstliches Transposon kloniert werden.
Dieses Transposon wurde durch die beiden IRs auf dem Plasmid pTIM101 gebildet. Das
dalD+/dalK‘-Fragment wurde folglich mit den Restriktionsenzymen ClaI und SacI (SstI)
aus dem Plasmid pHEXD geschnitten und in die entsprechenden Stellen der mks des
Plasmides pTIM101 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pLSD101 genannt.
Die Funktionalität von pLSD101 wurde in dem Stamm LGS322/pGJ9∆137
E218A überprüft. Der Austausch E218A, der in mtlA∆137 kodiert wird, ermöglicht den
Transport von freiem D-Mannitol in die Zelle (Klawitter, 1992; Scholle 1993; Otte,
2000) und eine funktionelle DalD den zum Wachstum notwendigen Abbau von
D-Mannitol. Folglich wurde das Plasmid in den benannten Stamm transformiert und das
Wachstum auf D-Mtl und D-Atl getestet (Tab. III.1.2.).
III. Ergebnisse
55
Tab. III.1.2. Plattentest zum Nachweis funktioneller DalD aus pLSD101
Platten1
McC Mtl
Cam/Spc
McC Mtl
Cam
McC Mtl
Spc
/pGJ9∆137
E218A
-
w
-
-
-
/pLSD101
-
-
w
-
-
2+
2+
2+
+
+
Stamm
LGS322
/pGJ9∆137
E218A
/pLSD101
1
MM Mtl
MM Atl
Cam/Spc Cam/Spc
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
Der neue Stamm LGS322 /pGJ9∆137 E218A /pLSD101 zeigt ausreichende
Expression von DalD, um eine entkoppelte IIMtl-Mutante auf freiem D-Mannitol bzw.
D-Arabinitol wachsen zu lassen.
Œ Konstruktion des Kreuzungs-Stammes STL136 mit dem Plasmid F’lac::dalD
Der Stamm CSH36 mit den Plasmiden F’lac, pLSD101 (TnLSD101) und
pPSO110 (tnpA+) wurde benötigt, um das Transposon TnLSD101 mit dalD+/dalK‘ auf
das F’lac -Plasmid springen zu lassen. Kompetente Zellen des Stammes CSH36 /F’lac
wurden parallel mit den beiden Plasmiden pLSD101 und pPSO110 transformiert und
die Selektion auf LB0Cam/Spc-Platten durchgeführt. Gereinigte und getestete Kolonien
der gesuchten Exkonjuganten (CSH36 /F’lac /pLSD101 /pPSO110) wurden in
LB0Cam/Spc angeimpft, über Nacht bei 37°C und anschließend für 3 Tage jeweils bei
RT oder im Kühlschrank inkubiert. In dieser Zeit sollte die Transposition F’lac::TnLSD101
ermöglicht werden. Darauffolgend wurden die Kulturen in LB0 gewaschen und eine
Flüssigkreuzung mit dem Stamm S136-3 durchgeführt. Das Ausstreichen auf
LB0Spc/Kan - Platten selektionierte die S136-3-Stämme, welche das F’lac::TnLSD101
erhalten hatten. 56 Exkonjuganten wurden auf LB0-Platten gereinigt und anschließend
getestet, wovon sechs Kolonien den folgenden Phänotyp zeigten (Tab. III.1.3.).
56
III. Ergebnisse
Tab. III.1.3. Plattentest der Exkonjuganten aus der Kreuzung
CSH36 /F’lac::dalD /pLSD101 /pPSO110 X S136∆
Platten1
McC
Glc
McC
Lac
McC
Mtl
LB0
Amp
LB0
Cam
LB0
Spc
LB0
Kann
2+
+
2+
+
+
+
-
S136-3
w
w
w
-
-
-
+
S136-3
F’lac::TnLSD101
w
+
w
-
-
+
+
Stamm
CSH36
/F’lac::TnLSD101
/pPSO110 /pLSD101
1
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. Angegeben sind die
Ergebnisse vom Donor, Rezipienten und Exkonjuganten.
Der neue Stamm S136-3/F’lac::TnLSD101 zeigt die gewünschten Phänotypen und
wurde STL136 genannt. Mit Hilfe dieses Stammes konnte das F’lac::TnLSD101 (im
folgenden kurz F’lac::dalD genannt) in die verschiedenen Stämme zur Mutantenselektion
und -Charakterisierung gekreuzt werden.
III.1.1.2. Konstruktion der Selektions-Stämme LGS31-1, LGS322-1 und
LGS323-1
Für die Verstoffwechselung von D-Mannitol wurde das F’lac::dalD in die
gewünschten
Selektionsstämme
LGS31,
LGS322
und
LGS323
gekreuzt.
Zur
Gegenselektion wurden die Rezipientenstämme mit dem Plasmid pGJ9∆137E218A
transformiert. Dies ermöglichte in Verbindung mit F’lac::dalD eine Gegenselektion auf
MM Mtl-Platten. Zudem kodiert das Plasmid eine Chloramphenicol-Resistenz, die
ebenfalls zur Selektion genutzt werden konnte.
Die Stämme LGS31/pGJ9∆137 E218A, LGS322/pGJ9∆137 E218A und
LGS322/pGJ9∆137E218A wurden jeweils mit dem Stamm STL136 gekreuzt und auf
MM-Mtl.Cam- und MM-Mtl.Cam/Spc-Platten ausgestrichen. Gereinigte und getestete
Exkonjuganten wurden in MM.Gly-Medium angeimpft und die ÜK dreimal in neues
Medium überimpft. Anschließend wurde eine geeignete Verdünnung der Kulturen auf
LB0-Platten ausgestrichen. Dabei zeigte sich bei etwa 2% der getesteten EK ein Verlust
des Plasmides. Die kurierten Stämme LGS31./F’lac::dalD, LGS322-/F’lac::dalD und
LGS323./F’lac::dalD wurden entsprechend LGS31-1, LGS322-1 und LGS323-1
genannt.
III. Ergebnisse
57
III.1.1.3. Konstruktion des Selektions-Stammes LTK31 (∆mtlA MtlD+
recA+ ∆(ptsHIcrr)::kan)
In einem zweiten Selektionssystem wurde die Phosphorylierungskette nicht in dem
EIIMtl-Transporter sondern an den allgemeinen PTS-Komponenten des Stammes LGS31
unterbrochen (Abb.III.1.3.). Mit Hilfe einer P1-Transduktion wurde eine ∆(ptsH ptsI
crr)::kan-Kasette aus dem Stamm TP2811 in den Stamm LGS31 gekreuzt. Die
Integration der ∆(ptsH ptsI crr)::kan-Kasette in das Chromosom von LGS31 bewirkt eine
Deletion der Gene ptsH, ptsI und crr. Folglich werden das HPr (ptsH) und EI (ptsI) der
allgemeinen PTS-Komponenten sowie das EIIAGlc (crr) nicht mehr exprimiert. Da die
Methode eine Rekombination in vivo erfordert, wurde der Stamm LGS31 (recA+) den
∆recA-Stämmen LGS322 und LGS323 vorgezogen. Die Selektion erfolgte auf
LB0Kan/Str-Platten und ergab eine für diese Methode hohe Transduktionsrate. Nach der
Reinigung auf LB0-Platten wurden 56 EK in einem Plattentest überprüft, wovon 51 das
gewünschte Ergebnis zeigten (Tab. III.1.4.).
Tab. III.1.4. Plattentest des Selektionsstammes LTK31
Stamm
Platten1 McC
Mtl
McC
Glc
McC
Fru
McC
Gal
LB0
Str
LB0
Kan
LB0
Tet
LB0
Spc
LGS31
w
3+
3+
s
+
-
-
-
LTK31
w
w
w
s
+
+
-
-
1
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
Die gewünschten Transduktanten zeigten einen KnR/Pts--Phänotyp (Glc-, Fru-).
Der resultierende Stamm wurde LTK31 genannt.
Œ Konstruktion der Selektions-Stämme LTK31-1 und LTK31-2 mit den Plasmiden
F’lac::dalD (DalD+ SpcR) u. pUR404 (scr+ ScrR- TetR)
Für die Selektion von entkoppelten Mutanten war es erforderlich, dass im Stamm
LTK31 die Gene dalD und scrK vorhanden waren (Abb.III.1.3.). Nach der Reduktion
von D-Mannitol durch DalD muss die entstandene D-Fruktose für eine weitere
Verstoffwechselung phosphoryliert werden. Da das EIIFru als Folge der Deletion der
Gene für die allgemeinen PTS-Komponenten inaktiviert wurde, erhielt LTK31 alternativ
das konjugierbare Plasmid pUR404. Dieses exprimiert aufgrund einer Deletion in scrR
58
III. Ergebnisse
konstitutiv scrK, welches für die ATP-abhängige D-Fruktose-Kinase ScrK kodiert (Schmid
et al. 1988, Aulkemeyer et al. 1991).
Abb.III.1.3. Alternativer semisynthetischer Stoffwechselweg für den D-Mtl-Abbau
in E. coli
III. WT ∆ptsHIcrr: Semisynthetischer D-Mtl-Abbau in LTK31-1/pGJ9.
Unterbrochene rote Pfeile (): kein normaler Transport. Grüne Pfeile(¼): Stoffwechselweg
bei entkoppeltem Transport von D-Mtl. IICMtl*: IICMtl mit entkoppeltem Transport. Grau
schattiert: Allgemeine PTS-Komponenten, deren Gene deletiert wurden. DalD: DArabinitol-Dehydrogenase. ScrK: D-Fruktose-Kinase. Weitere Erläuterungen siehe Text und
Abkürzungsverzeichnis.
In den Stamm LTK31 wurde deshalb zunächst das F‘lac::dalD aus LGS31-1
gekreuzt
und
auf
LB0Kan/Spc-Platten
selektioniert.
Gereinigte
und
getestete
Exkonjuganten (LTK31./F‘lac::dalD) wurden LTK31-1 genannt. Der Rezipient LTK31-1
wurde anschließend mit dem Donorstamm PS5 /pUR404 gekreuzt und auf
LB0Kan/Spc/Tet-Platten ausgestrichen. Nach Reinigung auf LB0-Platten wurde der
Exkonjugations-Stamm LTK31-1./pUR404 in einem Plattentest identifiziert und LTK31-2
genannt.
III. Ergebnisse
59
Tab. III.1.5. Plattentest LTK31-1 und LTK31-2
Platten1
Stamm
MM Fru MM Scr
LB0
Kan
LB0
Spc
LB0
Tet
PS5 /pUR404
( scr+ ScrR- TetR )
+
+
-
-
+
LTK31
( ∆(ptsHI crr)::kan )
-
-
+
-
-
LTK31-1
( DalD+ SpcR
∆(ptsHI crr)::kan )
-
-
+
+
-
LTK31-2
( DalD+ SpcR
∆(ptsHI crr)::kan
scr+ ScrR- TetR )
-
-
+
+
+
1
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
Der Stamm LTK31-1 zeigte die durch das F‘lac::dalD vermittelte SpectinomycinResistenz und LTK31-2 zusätzlich die von pUR404 kodierte Tetracyklin-Resistenz. Das
Plasmid pUR404 vermittelte keinen Scr+-Phänotyp in LTK31-2, da das EIIScr die EIIAGlcDomäne (crr) benötigt (Tab. III.1.5.).
Œ Konstruktion des Stammes LTK32-1 ( ∆(ptsHI crr)::kan Mak+ )
Der Stamm JWL300 zeigt eine erhöhte Expression (Mak+) des normalerweise
kryptisch vorliegenden mak-Lokus. Diese Mutation ermöglicht dem PtsI--Stamm JWL300
das Wachstum auf D-Fruktose (Aulkemeyer et al. 1991). Ein P1-Phagenlysat aus dem
Donor JWL300 wurde zur Transduktion in den Rezipienten LTK31 eingesetzt und die
Transduktanten auf MM Fru-Platten selektioniert. Dabei waren nach sechs Tagen ca. 50
Kolonien auf der Selektionsplatte zu sehen. Auf der Platte mit der negativen Kontrolle
wuchsen ebenfalls nach sechs Tagen 3 Kolonien, die als Spontanmutationen klassifiziert
aber nicht genauer charakterisiert wurden. Nach Reinigung und Identifizierung wurde
der LTK31 Mak+-Stamm LTK32 genannt. Über eine Konjugation mit LGS322-1 wurde
das F‘lac::dalD in den Rezipienten LTK32 gekreuzt. LTK32-/F‘lac::dalD wurde LTK32-1
genannt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Phänotypen, die bei der Konstruktion und
Kontrolle der Stämme betrachtet wurden.
60
III. Ergebnisse
Tab. III.1.6. Plattenmarkertest LTK32 und LTK32-1
Platten1
Stamm
JWL300 Mak+
MM Fru MM Scr
LB0
Kann
LB0
Spc
(+)
-
-
-
-
-
+
-
LTK32 ∆(ptsHI crr) Mak+
(+)
-
+
-
LGS322-1 F‘lac::dalD
+
-
-
+
LTK32-1 F‘lac::dalD
∆(ptsHI crr) Mak+
(+)
-
+
+
LTK31 ∆(ptsHI crr)
1
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
LTK32 zeigt die Fähigkeit auf Fructose (MM Fru = (+)) zu wachsen, welche aus
dem Stamm JWL300 in LTK31 tranzduziert werden konnte. Es bestätigte sich das
erwartete sehr langsame Wachstum auf dieser Kohlenstoffquelle. Das für die Selektion
erforderliche DalD konnte mit dem Plasmid F‘lac::dalD aus LGS322-1 in LTK32 gekreuzt
werden (LTK32-1 auf LB0Spc = +), (Tab. III.1.6.).
III.1.1.4. Vergleich der eingesetzten Selektionssysteme
In erster Linie sollte bei der Konstruktion der neuen Systeme eine hohe
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erreicht werde, die bei pASL14 als Folge starker
Plasmidkurierung nicht gegeben war. Das stabile Einzelkopieplasmid F‘lac::dalD erlaubte
sowohl die Selektionen neuer Mutationsarten bzw. -orte als auch die Bestätigung der
erhalten Mutationen.
Œ Vergleich der Stämme LGS322 und LGS323 (nach Scholle, 1993)
Der Transport von Atl über das EIIMtl weist auf einen funktionellen Einbau der
Translokationsdomäne des EIIMtl hin. Dieser Hinweis ist besonders bei Mtl--Mutanten
hilfreich, die den Transport betreffen. Mit dem Stamm LGS323 sollte der Transport von
D-Arabinitol über ein plasmidkodiertes, verkürztes EIIMtl getestet werden. Dazu musste
der WT-Transport von D-Atl in LGS322 ausgeschaltet werden. Der Stamm LGS323
wurde als AtlR Variante von LGS322 selektioniert (Scholle, 1993). LGS322 ist auf McC
Atl sensitiv, kann aber mit einem DalD+-Plasmid zu Atl+ transformiert werden. Die
Sensitivität von LGS322 wird auf eine cytoplasmatische Anhäufung von D-Atl-P
III. Ergebnisse
61
zurückgeführt, die mit der Verstoffwechselung von D-Atl oder D-Atl-P durch DalD
verhindert werden kann (Scholle, 1993). Der Stamm LGS323 erschien dagegen sowohl
mit als auch ohne DalD auf McC Atl weiß. 1991 zeigte Budde, dass auch das GlukosePTS (IICBAGlc) Atl transportieren kann, wohingegen alle anderen bekannten AtlTransportsysteme (Gat-PTS, Gut-PTS, Fru-PTS, Mtl-PTS) in LGS322 inaktiviert sind. Der
Stamm LGS323 zeigte bei Transporttests mit α-Methyl-Glukose, welches bei einer
Testkonzentration von 25µl über ein aktives Glc-PTS aufgenommen wird, keine
Transportaktivität, wohingegen der Elternstamm LGS322 eine Transportaktivität von 14
[nmol pro mg Protein pro Minute] aufwies. Weiterhin war LGS322/pJOE637 Scr+
während LGS323/pJOE637 einen Scr—Phänotyp zeigte. Das Plasmid pJOE637 (scr+)
vermittelt nur bei Vorhandensein eines intakten EIIAGlc (crr+) einen Scr+-Phänotyp. Die
AtlR von LGS323 wurde daraufhin auf eine Mutation in crr (crr-) zurückgeführt.
Tab. III.1.7. Ursprüngliche AtlR- und AtlS-Phänotypen (nach Scholle, 1993)
Platten1
Stamm
Relevanter
Genotyp
LGS322
∆mtlA ptsG+crr+
s
w
3+
14
LGS323
∆mtlA ptsG+
w
w
2-3+
0
LGS322 /pASL14
∆mtlA ptsG+crr+
/dalD
3+
n.g.
3+
n.g.
LGS323 /pASL14
∆mtlA ptsG+
/dalD
w
n.g.
2-3+
n.g.
LGS322
/pJOE637
∆mtlA ptsG+crr+
/scr+
s
3+
n.g.
n.g.
LGS323
/pJOE637
∆mtlA ptsG+
/scr+
w
w
n.g.
n.g.
McC Atl
McC Scr McC Glc
α-Me-Glc Tp2
1
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
Die Anzucht der Zellen für den α-Me-Glc-Transporttest erfolgte zur Messung des
uninduzierten Basalniveaus in MM CAA (0,1%) ohne Zugabe von Glukose. 14C-α-MeGlc wurde in einer Endkonzentration von 25µM zugegeben. Die Messwerte sind in
[nmol × min-1 × mg Protein-1] angegeben.
2
Der in dieser Arbeit eingesetzte LGS323 aus der Glyzerinkultur von Scholle
zeigte jedoch auf Atl und Scr einen abweichenden Phänotyp. Diese Variante von
LGS323 wurde LGS324 genannt.
62
III. Ergebnisse
LGS324 zeigte mit DalD einen 2+ Phänotyp auf McC Atl, war aber ohne DalD
noch AtlR. Zudem war LGS324./pJOE637 Scr+. Eine Mutation in crr konnte damit
weitestgehend ausgeschlossen werden (WT-Expression von NagE vorausgesetzt; Vogler
et al., 1988). Um die Auswirkungen einer authentischen crr--Mutation auf den AtlPhänotyp festzustellen, wurden mit Hilfe einer Genkassette eine crr-Deletionen in den
Stamm LGS31 eingeführt. In den RecA--Stämmen LGS322 und LGS324 konnte keine
eindeutige Insertion der Genkassette erreicht werden (Tab. III.1.8.).
Tab. III.1.8. Neu beobachtete AtlR- und AtlS-Phänotypen
Stamm
Genotyp
LGS322
LGS324
Platten1
McC Atl
McC Scr
ptsG+crr+
s
w
ptsG+crr+
w
w
LGS322 /pHEXD
ptsG+crr+ /dalD
2+
w
LGS324 /pHEXD
ptsG+crr+ /dalD
2+
w
LGS322 /pJOE637
ptsG+crr+/scr+
s
3+
LGS324 /pJOE637
ptsG+crr+/scr+
w
3+
1
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
Mit Hilfe einer P1-Transduktion wurde die ∆(crr)::kan-Kasette aus LLR103 in
LGS31 gekreuzt. Die Selektion erfolgte auf LB0Kan/Str-Platten. Nach Ausplattierung des
halben Transduktionsansatzes und Inkubation ÜN wurden 400 EK gezählt. Nach der
Reinigung auf LB0-Platten wurden 14 EK in einem Plattentest auf Kan- und Str-Resistenz
überprüft. Der transduzierte Stamm LGS31 wurde LGT31 genannt. Außerdem wurden
die Transduktanten mit den Plasmiden pJOE637 (scr+) bzw. pHEXD (dalD) transformiert,
um eine Kontrolle auf den Scr- und Atl-Phänotyp zu ermöglichen. Der Stamm LTK31
(∆(ptsH ptsI crr)::kan) wurde ebenfalls eingesetzt.
Aus dem Markertest (Tab. III.1.9.) ergaben sich folgende Beobachtungen: Eine
crr-Deletion konnte keine vollständige Atl-Resistenz bewirken. LGT31/pJOE637 (scr+)
war Scr-, was auf eine korrekte Insertion der Genkassette hinweist. LGT31 war weniger
sensitiv als der Elternstamm LGS31, wies aber mit dalD einen Atl+-Phänotyp auf. Die
crr-Deletion reduzierte die Sensitivität, wobei allerdings immer noch Atl in die Zelle
III. Ergebnisse
63
transportiert werden konnte. Folglich war die Atl-Resistenz von LLR103 nicht alleine auf
∆crr zurückzuführen.
Tab. III.1.9. Plattentest P1.∆(crr)::kan X LGS31
Platten
Stamm
LGS322 ∆mtlA ∆recA
1
McC Atl MM Xyl
LB0Kan
+ dalD 3
+ scr 2
McC Scr Tet McC Atl Cam
s
2+
-
3+
2+
w
2+
-
w
W
LGS324 ∆mtlA ∆recA Atlr
w
2+
-
3+
2+
LLR103 ∆crr ∆mtlAP,O
w
2+
+
(w)
W
ss 5
2+
-
3+
2+
LGT31 ∆mtlA ∆crr
s
2+
+
(w)
2+
LTK31 ∆mtlA ∆(ptsHI crr)
w
2+
+
w
2+
LGS323 ∆mtlA ∆recA Atlr
LGS31 ∆mtlA
4
1
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. 2 Die Stämme der jeweiligen Zeile
wurden mit dem Plasmid pJOE637 (scr+) transformiert. 3 Die Stämme der jeweiligen Zeile
wurden mit dem Plasmid pHEXD (dalD) transformiert (Ausnahme: 4 Die Daten für LGS323
wurden aus der Tabelle III.1.8. übernommen). 5 ss = supersensitiv: kein Wachstum auf der
Platte, kein Papillenwachstum.
Die Phänotypen aller Stämme auf McC Atl mit und ohne dalD zeigten, dass der
Transport von Atl nicht zwangsläufig zu einer Sensitivität führte. Die Stämme LGS324
und LTK31 waren ohne dalD AtlR aber mit dalD Atl+.
Aus den Beobachtungen geht hervor, dass mehrere Faktoren zu einer Resistenz
bzw. Sensitivität führen. In Bakterien ist die Anhäufung von phosphorylierten
Zwischenprodukten häufig die Ursache toxischer Effekte (Ferenci und Kornberg, 1973;
Lengeler, 1975; Solomon und Lin, 1972). D-Atl-P kann von E. coli K-12 nicht weiter
verstoffwechselt werden und wirkt so auf die Zellen toxisch. Der Transport von D-Atl
kann über das EIIGlc erfolgen. Ob bei dem Transport eine teilweise oder vollständige
Phosphorylierung des Substrates stattfindet, ist nicht bekannt. Die Phosphorylierung von
D-Atl könnte daher durch das EIIGlc, der Xylulose-Kinase XylB (Scangos und Reiner,
1979) oder eine weitere unbekannten Kinase erfolgen. Eine Deletion von crr verhindert
in jedem Fall den gekoppelten Transport von D-Atl über das EIIGlc durch die Repression
der Expression des EIIGlc. Ein entkoppelter Transport würde aber immer noch freies D-Atl
in die Zelle bringen. Bei einer Anhäufung von Arabinitol kann XylB D-Atl
phosphorylieren und zu einer Sensitivität führen (Scangos und Reiner, 1979). Dagegen
64
III. Ergebnisse
wird in Gegenwart von dalD D-Atl zu D-Xylulose (Charnetzky und Mortlock, 1974a) und
D-Xylulose durch XylB zu D-Xylulose-5iP verstoffwechselt (Lawlis et al., 1984), welches in
den Pentosephosphat-Zyklus eingespeist werden kann. Eine Resistenz kann vorliegen,
wenn der Transport von D-Atl oder dessen Phosphorylierung verhindert wird. Eine XylB-Mutante mit dalD würde dementsprechend zu einer nicht toxischen Anhäufung von DXylulose und einem Atl--Phänotyp führen. Alle AtlR- und AtlS-Stämme zeigten jedoch den
gleichen Xyl+-Phänotyp. Eine durch die beschriebenen Ergebnisse nicht ersichtliche
Kombination dieser Faktoren ist in dem Stamm LGS323 zu erwarten.
Für die Selektionssysteme konnte kein Stamm konstruiert werden, der die
relevanten Eigenschaften von LGS323 besaß. Die weiteren Versuche wurden
hauptsächlich mit dem Stamm LGS322 durchgeführt.
Œ LGS322-1 (∆mtlA ∆gut DalD+) /pGJ9∆137 (mtlAPA’)
Von den oben genannten Selektionssystemen wurde im Lauf der Arbeit
hauptsächlich der Stamm LGS322-1./pGJ9∆137 benutzt. Parallel durchgeführte
Selektionen mit den Stämmen LGS31-1.(∆mtlA dalD+)./pGJ9∆137 und LGS324-1
(∆mtlA ∆gut dalD+ AtlR) /pGJ9∆137 ergaben keine neuen Mutationsarten.
Œ LTK32-1 (∆mtlA ∆(ptsH ptsI crr)::kan DalD+ Mak+) /pGJ9 (mtlA)
Im Stamm LTK32-1./pGJ9 erfolgt die Phosphorylierung der D-Fruktose über die
Mannofruktokinase (Mak). Der Stamm LTK32-1-/pGJT9-1 zeigte wie erwartet nur sehr
schlechtes Wachstum auf MM-Mtl-Cam-Platten und keinen deutlichen + Phänotyp auf
McC-Mtl-Cam-Platten. Die Aktivität der Mannofruktokinase war in diesem System nur
sehr gering zumal sie schon dem Donorstamm JWL300 nur eine Generationszeit von
160min auf MM mit 1% Fru ermöglichte (Aulkemeyer et al., 1991). Um die Selektion zu
beschleunigen, wurde in einem weiteren System die Fruktokinase aus dem SucroseOperon eingesetzt.
Œ LTK31-2 (∆mtlA ∆(ptsH ptsI crr)::kan DalD+ ScrK+) /pGJ9 (mtlA)
Um festzustellen, ob das System LTK31-2-/pGJ9 grundsätzlich zu einer Selektion
von entkoppelten mtlA-Mutanten geeignet war, wurde der Stamm LTK31-2 mit dem
Plasmid pGJT9-1 transformiert. Dieses Plasmid entstand aus pGJ9, in das die
III. Ergebnisse
65
entkoppelnde Mutation E218A mit Hilfe der lokalisierten Mutagenese eingeführt wurde
(siehe III.1.3.2.). Der Stamm LTK31-2-/pGJT9-1 zeigte gutes Wachstum auf MM-MtlCam-Platten. In einer 1:107 Mischung mit LGS31 (Mtl-) wuchs der Stamm mit
deutlichem 2+ Phänotyp auf McC-Mtl-Cam-Platten durch den Bakterienrasen. Damit
konnte gezeigt werden, dass dieses System das Wachstum von entkoppelten Mutanten
der E218A-Art ermöglicht.
III.1.2. Entkoppelte Mutanten aus den Selektionen
Die Selektion der entkoppelten Mutanten erfolgte in den beschriebenen
Selektions-Systemen nach gleichem Vorgehen. Eine EK des eingesetzten Stammes wurde
in einem Reagenzglas in 5ml LB0Cam angeimpft und über Nacht bei 37°C in einem
Roller (bzw. Schüttelwasserbad bei 30°C und 42°C) inkubiert. Von der ÜK wurden
0,3ml (≈ 6 x 108 Zellen bei einer durchschnittlichen OD650.=.2 der ÜN-Kulturen) direkt
auf einer Selektionsplatte ausgestrichen. Die Selektion konnte sowohl auf MM-MtlCam- als auch auf McC-Mtl-Cam-Platten durchgeführt werden. Aufgrund der
deutlicheren Identifikation von Mutanten wurden hauptsächlich MM-Platten verwendet.
Die Zellen wurden vor dem Ausplattieren nicht gewaschen, um durch das LB0-Medium
noch etwas Wachstum auf dem MM-Medium und damit weitere Mutationen zu
ermöglichen. Um ein Austrocknen des Agars zu verhindern, wurden die Platten in
Plastiktüten luftdicht verschlossen und anschließend mehrere Tage inkubiert bis Einzelbzw. rote Kolonien zu sehen waren. Die Inkubationstemperatur wurde je Ansatz
zusätzlich variiert (30°C, 37°C bzw. 42°C).
Die so erhaltenen Kolonien wurden gereinigt und anschließend noch einmal auf
ihren
Mtl-Phänotyp
überprüft.
Bei
einem
positiven
Phänotyp
wurde
eine
Plasmidisolierung durchgeführt und der entsprechende Selektionsstamm mit dem
erhaltenen Plasmid transformiert. Damit konnte sichergestellt werden, dass der
beobachtete Phänotyp nicht chromosomal kodiert war. Aus den mutierten Plasmiden
wurde das HindIII-SnaB1-Fragment des mtlA-Gens ausgeschnitten (siehe Abb. III.1.4.)
und an Stelle des entsprechenden Fragments in das Plasmid pGJ9∆137 kloniert. Nach
Retransformation des entsprechenden Selektionsstamms konnte bei einem Mtl+Phänotyp davon ausgegangen werden, dass die Mutation in dem HindIII-SnaB1Fragment des mtlA-Gens lag. Dieses Fragment wurde anschließend doppelsträngig
sequenziert, um die Mutation zu ermitteln.
66
III. Ergebnisse
Die erhaltenen Mutanten und Ihre Phänotypen werden in Teil III.1.5. dieser
Arbeit näher beschrieben. Zum besseren Verständnis folgender Punkte des Ergebnisteils
wird nachstehend die mtlA-Sequenz aus E. coli mit für diese Arbeit relevanten
Informationen angegeben.
Abb. III.1.4.
Sequenz des Genes mtlA aus E. coli K-12
-35
-10
SalI TTGACA
TAT AAT
+1
CCCGTCG ACTGGACAGT TAACCGATTC AGTGCCAGAT TTCGCAGTAT CTACAAGGTC CGGCTACCTC
RBS
AGGAG G
TGCCGCCACA TTAACAAAAA ACCTCGGGCT TCCAGCCTGC GCGACAGCAA ACATAAGAAG GGGTGTTTTT
mtlA-Start
1
S3
20
HindIII
40
50
60
70
ATGTCATCCG ATATTAAGAT CAAAGTGCAA AGCTTTGGTC GTTTCCTCAG CAACATGGTG ATGCCAAATA
80
90
100
110
120
130
140
TCGGCGCGTT TATCGCGTGG GGTATCATCA CCGCGTTATT TATTCCAACA GGGTGGTTAC CGAACGAGAC
150
160
170
180
190
200
210
GCTGGCGAAG CTGGTCGGGC CGATGATCAC TTATCTCCTG CCGCTGCTGA TCGGTTATAC CGGTGGTAAG
220
230
240
250
260
270
280
CTGGTAGGCG GCGAACGTGG CGGCGTAGTC GGTGCCATCA CCACCATGGG CGTTATCGTC GGCGCAGACA
290
300
310
320
C110
340
350
TGCCGATGTT CCTCGGTTCT ATGATTGCAG GTCCGCTGGG CGGCTGGTGC ATTAAGCACT TCGACCGCTG
360
370
380
390
400
410
420
GGTAGACGGT AAGATCAAAT CCGGTTTTGA GATGCTGGTG AATAACTTCT CCGCAGGCAT CATCGGGATG
430
440
450
460
470 S158 480
490
ATCCTCGCTA TTCTGGCATT CCTCGGCATT GGCCCGATTG TTGAAGCCCT GTCCAAAATG CTGGCTGCGG
500
510
520
530
540
550
560
GCGTTAACTT CATGGTTGTC CATGACATGC TGCCGCTGGC GTCTATCTTT GTTGAACCGG CGAAAATCCT
570
580
590
S199
610
620
630
GTTCCTCAAC AACGCCATTA ACCACGGTAT CTTCTCGCCG CTGGGTATTC AGCAGTCCCA TGAACTGGGT
S212
650 E218 660
670
680
690
700
AAATCAATCT TCTTCCTGAT TGAAGCTAAC CCAGGTCCAG GTATGGGCGT GCTGCTGGCG TACATGTTCT
710
720
S242
740
750
760
H256
TTGGTCGTGG TAGCGCTAAA CAGTCTGCGG GCGGTGCGGC AATCATCCAC TTCCTGGGGG GTATCCACGA
780
790
800
810
820
830
840
AATCTACTTC CCGTATGTGC TGATGAATCC GCGTCTGATC CTCGCAGTCA TCCTCGGCGG TATGACTGGC
850
860
870
880
890
S299
910
GTGTTCACGC TGACTATCCT GGGCGGTGGT CTGGTTTCTC CGGCATCTCC GGGTTCTATC CTTGCTGTAC
920
930
940
950
C320
970
980
TGGCGATGAC ACCAAAAGGT GCTTACTTCG CTAACATCGC GGGTGTGTGT GCGGCGATGG CTGTCTCCTT
990
1000
1010
1020
1030
1040
1050
CGTTGTCTCT GCTATTTTGC TGAAAACCAG CAAAGTGAAA GAAGAAGATG ATATTGAAGC AGCAACTCGT
1060
1070
1080
1090
1100
1110
1120
CGTATGCAGG ACATGAAAGC TGAGTCTAAA GGCGCATCTC CGCTGTCTGC TGGCGATGTG ACTAACGACC
III. Ergebnisse
67
SnaBI 1140
C384
1160
1170
1180
1190
TGAGCCACGT ACGTAAAATC ATCGTTGCCT GTGACGCCGG TATGGGTTCC AGTGCGATGG GCGCAGGCGT
1200
1210
1220
1230
1240
1250
1260
TCTGCGTAAG AAAATTCAGG ATGCAGGTCT GTCGCAGATT TCTGTTACTA ACAGCGCGAT CAACAACCTG
1270
1280
1290
1300
1310
1320
1330
CCGCCAGATG TGGACCTCGT CATCACTCAC CGTGACCTGA CCGAACGCGC TATGCGCCAG GTTCCGCAGG
1340
1350
1360
1370
1380
1390
1400
CACAGCATAT TTCGCTGACC AACTTCCTCG ACAGCGGCCT GTACACCAGC CTGACCGAAC GTCTGGTTGC
1410
1420
1430
1440
1450
1460
1470
TGCCCAACGC CACACGGCAA ACGAAGAGAA AGTAAAAGAC AGCCTGAAAG ACAGCTTTGA CGATTCCAGT
1480
1490
1500
1510
1520
1530
∆137
GCTAACCTGT TCAAGCTAGG CGCGGAGAAC ATCTTCCTCG GTCGCAAAGC GGCAACCAAA GAAGAAGCGA
1550
1560
1570
1580
1590
1600
1610
TTCGTTTTGC TGGCGAGCAG CTGGTGAAAG GCGGTTACGT TGAGCCGGAA TACGTTCAGG CGATGCTGGA
1620
1630
1640
1650
H554
1670
1680
TCGTGAAAAA CTGACCCCGA CTTATCTGGG TGAGTCTATC GCGGTGCCAC ACGGTACGGT TGAAGCGAAA
1690
1700
1710 C571 1720
1730
1740
1750
GATCGCGTAC TGAAAACGGG CGTCGTGTTC TGCCAGTACC CGGAAGGCGT GCGCTTCGGT GAAGAAGAAG
1760
1770
1780
1790
1800
1810
1820
ATGACATTGC CCGTCTGGTG ATTGGTATTG CTGCCCGTAA CAACGAGCAC ATTCAGGTTA TCACCAGCCT
1830
1840
1850
1860
1870
1880
1890
GACCAATGCA CTGGATGATG AGTCCGTCAT CGAGCGTCTG GCACACACCA CCAGCGTGGA TGAAGTGCTG
1900
1910 mtlA-Stopp
GAACTGCTGG CAGGTCGTAA GTAATCCAAT CCCACCCTCT CCACATGGAG AAGGTGGGGT TAATTGCCTG
BamHI
ATGCGCTACG CTTATCAGGA TCCCAGGATG CATCACAATT TGTTGAATTT GCACGTTCTT GTAGG
Abb. III.1.4. Sequenz des Genes mtlA aus E. coli K-12
(nach Lee & Saier, 1983 - korrigiert 1993)
Dargestellt ist die Nukleotidsequenz in dem Bereich deslA in E. coli K-12. Die vermuteten -35
und -10-Regionen (Davis et al., 1988; Jiang et al., 1990) und die mögliche
Ribosomenbindestelle (RBS) sind in Boxen mit darüber angegebenen Konsensussequenzen
dargestellt. Der mögliche Transkriptionsstartpunkt der mRNA-Synthese ist mit +1
gekennzeichnet (Davis et al., 1988). Die Zählung beginnt mit dem Adenin des ATGStartcodons. Farblich hervorgehoben sind folgende Sequenzteile: blau = Start- und
Stoppkodon; grün = Erkennungssequenzen relevanter Restriktionsenzyme; rot = relevante
Tripletts für wichtige AS; orange = Ende des mtlA∆137-Fragmentes.
III.1.2.1. Entkoppelte Mutanten aus den Selektionen
LGS322-1 (∆mtlA ∆gut DalD+) /pGJ9∆137 (mtlAPA’) und
LGS324-1 (∆mtlA ∆gut DalD+ AtlR) /pGJ9∆137 (mtlAPA’)
Bei den Selektionen in den beiden oben genannten Stämmen waren nach 4-6
Tagen wenige (0-5) mögliche Mutanten auf den Platten zu erkennen. Erwartungsgemäß
dauerte es bei 30°C und 42°C 2-3 Tage länger bis Kolonien zu erkennen waren. Mit
68
III. Ergebnisse
Ausnahme der Mutation E218V wurden die erhaltenen Mutationsarten bei allen
Temperaturen isoliert. Die Variante E218V konnte nur einmal bei 37°C isoliert werden.
Temperaturabhängige Wachstumsunterschiede stellten sich in allen untersuchten Fällen
als chromosomal codiert heraus. Bei 22 unabhängig voneinander isolierten Mutanten
wurden folgende entkoppelte Mutationen identifiziert:
Tab. III.1.10. Entkoppelnde Mutationen aus LGS322-1 /pGJ9∆137
und LGS324-1 /pGJ9∆137
Phänotyp
E218A
Selektionstemp.
E218V
H256P
Mutation in
bp 653
bp 653
bp 767
GAA Ö GCA GAA Ö GTA CAC Ö CCC
30 [°C]
2
-
3
37 [°C]
5 (2)
1
6 (3)
42 [°C]
2
-
3
Gesamt
9
1
12
Die Tabelle gibt die Art und Anzahl der erhaltenen Mutationen bei
unterschiedlichen Temperaturen wieder. Die betroffenen Nukleotide und
deren Nummern sind blau hervorgehoben (Zählung wie in Abb. III.1.4.).
In Klammern ist der Anteil der Mutanten aus LGS324-1 angegeben.
In neun Fällen führte die Transversion des zweiten Adenins in dem Triplett 218
(GAA) zu Cytosin zu dem Aminosäureaustausch E218A (Glutaminsäure zu Alanin). Eine
weitere Transversion in demselben Nukleotid zu Thymin führte zu dem AS-Austausch
E218V (Glutaminsäure zu Valin). Zwölf Mutationen betrafen das Adenin in dem Triplett
256 (CAC). Diese bewirkten eine Transversion zu Cytosin und damit den AS-Austausch
H256P (Histidin zu Prolin). Bei der Selektion mit den beiden Stämmen zeigte sich, dass
die Inkubationstemperatur vermutlich keinen Einfluss auf die Art der Mutation hatte. Die
Plasmide mit den jeweiligen Mutationen wurden folgendermaßen benannt:
Plasmid
resultierender AS-Austausch
pGJ9∆EA =
pGJ9∆EV =
pGJ9∆HP =
E218A
E218V
H256P
Die Eigenschaften der Plasmide sind nachfolgend in der Tab. III.1.11.
dargestellt.
III. Ergebnisse
69
III.1.2.2. Entkoppelte Mutanten aus der Selektion
LTK31-2 (∆mtlA ∆(ptsH ptsI crr)::kan DalD+ ScrK+) /pGJ9 (mtlA)
Die Selektionen mit diesem Stamm wurden bei 37°C auf MM-Mtl-Cam-Platten
durchgeführt. Dabei wurden nach 3 Tagen 3-6 Kolonien je Platte beobachtet. Von acht
unabhängig isolierten und untersuchten Mutanten zeigten sechs den Austausch E218A
(Transversion GAA Ö GCA) und zwei den Austausch H256P (Transversion CAC Ö
CCC). Somit wurde mit diesem System keine neue Mutation selektioniert, allerdings
konnten die Ergebnisse aus dem vorangegangenen System bestätigt werden. Die
Phänotypen aller entkoppelten Mutanten sind in der folgenden Tabelle III.1.11.
dargestellt. Die verwendeten Plasmide sind wie oben beschrieben aus den originalen
Mutanten konstruiert worden und entsprechen den Phänotypen der ursprünglich
isolierten Mutanten.
Tab. III.1.11. Phänotypen der entkoppelten Mutanten
Markerplatten1
Stamm
McC Mtl
MM Mtl
LB0Cam
LB0Spc
LGS322-1
w
-
-
+
LGS322-1 /pGJ9∆137
w
-
+
+
LGS322-1 /pGJ9∆EA
2+
+
+
+
LGS322-1 /pGJ9∆EV
2+
+
+
+
LGS322-1 /pGJ9∆HP
2+
+
+
+
1
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1.
III.1.3. Entkoppelte Mutanten aus lokalisierter Mutagenese
Um auf einem weiteren Weg zeigen zu können, dass die beobachteten
Phänotypen von der beschriebenen Mutation abhängen, wurden die entsprechenden
Mutationen durch lokalisierte Mutagenese in das Plasmid pGJ9 eingeführt. Dadurch
konnten auch die Auswirkungen der Mutationen in einem nicht deletierten mtlA
(EIIMtlABC)
untersucht
werden.
Um
ein
mit
dem
pGJ9∆137
vergleichbares
Deletionsplasmid zu erhalten, wurde anschließend über vorhandene RestriktionsenzymSchnittstellen eine Deletion eingeführt (siehe III.1.3.2.). Weiterhin bot sich die
Möglichkeit einen Doppelaustausch in den betroffenen Tripletts einzuführen, um bei
Wachstumsuntersuchungen und der Selektion von Suppressormutanten Reversionen zu
erschweren.
70
III. Ergebnisse
III.1.3.1. Konstruktion des Plasmides pGAL3 (mtlA’) und seiner
mutierten Derivate
Die lokalisierte Mutagenese wurde nach dem „Altered Sites“ in vitro
Mutagenese System von Promega ausgeführt. Dazu musste ein Fragment aus mtlA,
welches das zu mutierende Triplett enthält, in den Mutagenese-Vektor pALTER-1
kloniert werden. Das Plasmid pGJ9 (Abb. III.1.5.) wurde mit HindIII verdaut und das
resultierende
2,1kb-mtlA’-Fragment
in
die
entsprechende
HindIII-Restriktionsschnittstelle
von
pALTER-1 kloniert. Die korrekte Ausrichtung des Fragments wurde mit einer BamHIRestriktionsanalyse überprüft und die beiden Enden des Fragments über Sequenzanalyse
identifiziert. Das Plasmid wurde pGAL3 genannt. Das System mit dem MutageneseVektor pALTER-1 verwendet zur Erhöhung der Mutagenese-Ausbeute ein AmpicillinReperatur-Oligonukleotid. Nach durchgeführter Mutagenese besitzt der Vektor die
Antibiotikaresistenzen gegen Tetracyklin und Ampicillin. Während der Mutagenese
wurde festgestellt, dass es eine Tandem-Duplikation einer 11bp langen Sequenz (5’GGCGTGCTGCT-3’) in mtlA (Basen 676-686) und in der Tet-Resistenz von pALTER-1
(876-886) gibt, die häufiger zu Deletionen führte. Daher wurde im Folgenden immer
eine Selektion mit Tetracyklin durchgeführt, um das Vorkommen deletierter Plasmide zu
mtlA
tet’ p15A ori
(5746)
BamHI (1978)
HindIII (2135)
ClaI (2141)
∆137 (1532)
SnaBI (1132)
HindIII (30)
pGJ9
SalI (5750)
unterdrücken.
cat
‘tet
ATG (1/5882)
Abb. III.1.5. mtlA-Plasmid pGJ9 (nach Grisafi et al., 1989)
Schematische
Darstellung
des
mtlA-Plasmids
pGJ9.
Die
Position
der
Erkennungssequenzen der relevanten Restriktionsenzyme und die Deletion ∆137 sind in
Klammern angegeben. Die Zählung beginnt mit dem Adenin des ATG-Startcodons
(1/5882).
III. Ergebnisse
71
ΠKonstruktion der Plasmide pGAL3-1, pGAL3-2 und pGAL3-3 mit zweifachem
Basenaustausch
Die Konstruktion der Plasmide erfolgte durch den Einsatz der Mutagenese-Primer
E218A (+), E218V (+) und H256P (+). Bei der Auswahl der neuen Codone wurde
nach zwei Kriterien vorgegangen:
1. Es mussten mindestens zwei Basenaustausche im Codon für eine Reversion zu
der WT-Aminosäure an der jeweiligen Stelle erforderlich sein.
2. Von den verbleibenden Codonen wurde das mit der häufigsten Verwendung
(„codon usage“) in mtlA in E. coli gewählt.
In der folgenden Tabelle sind die aus der Mutagenese resultierenden
Doppelaustausche
dargestellt,
wie
sie
durch
einzelsträngige
Sequenzierung
nachgewiesen wurden.
Tab. III.1.12. Austausche bei pGAL3-1, pGAL3-2 und pGAL3-3
Plasmidname
MutagenesePrimer
1
Basenaustausch Basennummern2
pGAL3-1
E218A (+)
GAA Ö GCC
652-654
pGAL3-2
E218V (+)
GAA Ö GTC
652-654
pGAL3-3
H256P (+)
CAC Ö CCA
766-768
1
Phänotypen in Teil III.1.5.1. 2 Zählung wie in Abb. III.1.4.
ΠKonstruktion der Plasmide pGAL3-4 und pGAL3-5 mit zweifachen
AS-Austauschen
Die Konstruktion dieser Plasmide erfolgte durch den gleichzeitigen Einsatz zweier
Mutagenese-Primer in einem Mutageneseansatz. Damit konnten die unterschiedlichen
Mutationen, die einen entkoppelten Transport von D-Mannitol ermöglichen, kombiniert
und ihr Phänotyp untersucht werden. Dabei wurden die Kombinationen, die für die ASAustausche E218A (+)/H256P(+) und E218V(+)/H256P(+) kodieren, gewählt. In der
folgenden Tabelle sind die resultierenden Nukleotid-Austausche dargestellt, wie sie
durch einzelsträngige Sequenzierung nachgewiesen wurden.
72
III. Ergebnisse
Tab. III.1.13. Austausche bei pGAL3-4 und pGAL3-51
Plasmidname
MutagenesePrimer
H256P (+)
GAA Ö GCC
(CTG Ö CAG)3
CAC Ö CCA
652-654
685-687
766-768
E218V (+)
H256P (+)
GAA Ö GTC
CAC Ö CCA
652-654
766-768
E218A (+)
pGAL3-4
pGAL3-5
1
3
Basenaustausch Basennummern2
.Phänotypen in Teil III.1.5.1. 2.Zählung wie in Abb. III.1.4.
-unbeabsichtigter Austausch L229Q (Leucin zu Glutamin).
III.1.3.2. Klonierung der Plasmidreihe pGJT9 mit einem vollständigen
mtlA-Gen
Die mutierten mtlA-Fragmente mussten aus den vorangehend beschriebenen
pGAL3-Plasmiden über einen HindIII-Verdau zurück in den mtlA-Vektor pGJ9 kloniert
werden. Dafür wurde zur Vereinfachung das Plasmid pGJ9dHindIII konstruiert, dem das
entsprechende HindIII-Fragment fehlte. Die mtlA HindIII-Fragmente aus den mutierten
pGAL3-Plasmiden wurden nach der Klonierung in pGJ9dHindIII einzelsträngig
sequenziert und die neu konstruierten wie in Tab.II.1.4. Plasmide benannt.
Um ein dem pGJ9∆137 entsprechendes Deletionsplasmid zu erhalten, wurden
die neuen Plasmide mit SnaBI und ClaI verdaut. Anschließend wurde der um ca. 1kb
verkürzte Vektor nach einer Klenow-Behandlung religiert. Die dadurch entstandenen
Plasmide trugen mtlA’-Gene, die eine Deletion des für das Cys384 aus Domäne IIBMtl
und das His554 aus IIAMtl kodierenden Bereiches aufwiesen (Vgl. Abb. III.1.4.). Die
Klonierungen ergaben folgende Plasmide.
pGJT9-1
= pGJ9∆HindIII + mtlA HindIII-Fragmente aus pGAL3-1 =
pGJT9-1d
= pGJT9-1 mtlA‘ (SnaBI/ClaI-Deletion)
pGJT9-2
= pGJ9∆HindIII + mtlA HindIII-Fragmente aus pGAL3-2 =
pGJT9-2d
= pGJT9-2 mtlA‘ (SnaBI/ClaI-Deletion)
pGJT9-3
= pGJ9∆HindIII + mtlA HindIII-Fragmente aus pGAL3-3 = pGJ9 H256P
pGJT9-3d
= pGJT9-3 mtlA‘ (SnaBI/ClaI-Deletion)
pGJT9-4
= pGJ9∆HindIII + mtlA HindIII-Fragmente aus pGAL3-4 = pGJ9 E218A,
L229Q,
H256P
pGJ9 E218A
pGJ9 E218V
III. Ergebnisse
73
pGJT9-4d
= pGJT9-4 mtlA‘ (SnaBI/ClaI-Deletion)
pGJT9-5
= pGJ9∆HindIII + mtlA HindIII-Fragmente aus pGAL3-5 = pGJ9 E218V,
H256P
pGJT9-5d
= pGJT9-5 mtlA‘ (SnaBI/ClaI-Deletion)
III.1.4. Selektion von Suppressormutanten
Aus der Selektion von Suppressormutanten in Stämmen mit entkoppeltem aber
vollständigem EIIMtl sollten Mutationen an anderer Stelle im mtlA gesucht werden, die
entkoppelte Mutanten wieder in den Mtl+-Phänotyp umwandeln. Die entkoppelnden
Mutationen E218A und E218V (pGJT9-1 und pGJT9-2) zeigten in dem vollständigen
MtlA keine Beeinträchtigung des Wachstums auf D-Mannitol (siehe Teil III.1.5.1.),
können also nicht zur Suppressor-Selektion eingesetzt werden. Dagegen verursachten
die Mutationen H256P, E218A/L229Q/H256P und E218V/H256P im Stamm LGS322
einen Mtl--Phänotyp. Mit den Stämmen LGS322 /pGJT9-3 /pGJT9-4 und /pGJT9-5
konnte so eine Selektion auf Supressormutanten durchgeführt werden. Eine ÜK des
jeweiligen Stammes wurde auf MM Mtl-Cam-Platten ausgestrichen und bei 30°C bzw.
37°C
inkubiert.
Erhaltene
Kolonien
wurden
gereinigt,
getestet,
Zellen
der
entsprechenden Kolonien mit dem Plasmid transformiert, das HindIII-SnaB1-Fragment
neu kloniert und anschließend sequenziert.
III.1.4.1. Suppressormutanten aus den Stämmen LGS322 /pGJT9-3 (H256P),
/pGJT9-4 (E218A/H256P) und /pGJT9-5 (E218V/H256P)
Nach vier Tagen Inkubation waren bei den Selektionen mit LGS322 /pGJT9-3
unabhängig von der Inkubationstemperatur 8-16 Kolonien pro Platte zu sehen. Es
wurden jeweils sechs bzw. fünf (30°C/37°C) Kolonien untersucht und die Mutationen
identifiziert (siehe Tab. III.1.14.). Die Selektionen von Suppressormutationen aus
LGS322 /pGJT9-4 ergaben 3 Kolonien pro Platte, wobei die Kolonien erst nach sieben
Tagen Inkubation unabhängig von der Inkubationstemperatur zu sehen waren. Zwei
Kolonien aus der 30°C- und eine Kolonie aus der 37°C-Selektion wurden untersucht.
Die folgenden Tabellen III.1.14a. und III.1.14b. fassen die erhaltenen Mutationen
zusammen.
74
III. Ergebnisse
Tab. III.1.14. Mutationen aus LGS322 /pGJT9-3 und
LGS322 /pGJT9-4
LGS322 /pGJT9-3
Genotyp der Mutation
Phänotyp der Mutation
Anzahl der Mutationen bei
30°C
37°C
C766CA Ö T766CA
Pro256 Ö Ser256
3
0
CC767A Ö CA767A
Pro256 Ö Gln256
3
5
LGS322 /pGJT9-4
C766CA Ö G766CA
Pro256 Ö Ala256
1
0
CC767A Ö CA767A
Pro256 Ö Gln256
1
1
Die Tabelle gibt Ort, Art und Anzahl der Mutationen bei 30°C
und 37°C wieder. Die mutierten Basen und resultierenden AS
der betroffenen Tripletts sind nach Abb. III.1.4. nummeriert.
Mit dem Ansatz LGS322-/pGJT9-5 wurden keine Mutanten gefunden. Die
neuen Plasmide wurden folgendermaßen benannt:
pDSM1
= pGJT9-3 P256Q
pDSM2
= pGJT9-3 P256S
pDSM3
= pGJT9-4 E218A/L229Q/P256A
pDSM4
= pGJT9-4 E218A/L229Q/P256Q
III.1.5. Charakterisierung der Mutanten
Anhand der Selektion in den jeweiligen Stämmen wurde lediglich die Fähigkeit
des Wachstums auf D-Mannitol ohne DalD festgestellt. Die entkoppelten Mutanten
waren darauf angewiesen, freies, das heißt unphosphoryliertes D-Mannitol zu
transportieren und zu verstoffwechseln. Bei den „Supressormutanten“ dagegen
erforderte die Selektion in Abwesenheit des DalD eine Wiederherstellung des Transports
und der Phosphorylierung. Dabei war nicht auszuschließen, dass Anteile des
D-Mannitols unphosphoryliert in die Suppressor-Zelle gelangen. Um einen Vergleich
des Wachstums aller Mutanten und des WT auf D-Mannitol zu erstellen, wurden weitere
III. Ergebnisse
75
Untersuchungen mit den Mutanten in unterschiedlichen Stamm/Plasmid-Kombinationen
durchgeführt. Dabei wurden der Transport und einzelne Komponenten des Transports
wie Phosphorylierung und Substratbindung untersucht. Weil die relevanten Phänotypen
der Mutanten aus der ortspezifischen Mutagenese und den Selektionen keine
ersichtlichen Unterschiede zeigten, wurde, wenn nicht anders beschrieben, bei allen
Tests mit Plasmiden aus der gerichteten Mutagenese gearbeitet.
III.1.5.1. Phänotypen der verschiedenen Mutanten
Der von den Mutationen vermittelte Phänotyp wurde zunächst mit Hilfe von
Plattentests und Wuchskurven untersucht. Dabei war es für die Feststellung der Ursache
und des Grades der Entkopplung erforderlich, in unterschiedlichen Stammhintergründen
und mit unterschiedlichen Plasmidkonstruktionen zu arbeiten. Vor allem der Einfluss des
F’dalD auf das Wachstum sollte Hinweise auf freies D-Mannitol in der Zelle geben. In
der Darstellung der Markertests wurde versucht, die Ergebnisse so gut wie möglich zu
gliedern bzw. zu bündeln, um den Vergleich der verschiedenen Mutanten untereinander
zu erleichtern.
Œ Markertests und Wachstumskurven entkoppelter Mutanten in den Stämmen
LGS322 und LGS322-1
Im folgenden wurden in den Stämmen LGS322 und LGS322-1 (F’lac::dalD+) nur
Plasmide aus der gerichteten Mutagenese verwendet, womit weitere unerkannte
Mutationen ausgeschlossen werden konnten.
Unterschiede in der Fähigkeit, D-Mannitol in Abhängigkeit des Vorhandenseins
von dem F’lac::dalD zu verstoffwechseln, fielen bereits bei diesem, in der Tab. III.1.15.
dargestellten, qualitativen Test auf. Im Allgemeinen verbessert DalD das Wachstum der
Mutanten auf D-Mannitol. Eine Ausnahme stellten die Mutationskombinationen
E218A/L229Q/H256P und E218V/H256P sowie das deletierte WT-Protein dar, welche
kein Wachstum auf D-Mtl ermöglichten. Zellen mit dem WT-Plasmid pGJ9 zeigten auf
McC Mtl mit und ohne DalD einen 3+-Phänotyp. Eventuelle Wachstums-Unterschiede
sind in diesem Fall auf McC-Platten nicht ersichtlich. Auf D-Arabinitol unterdrückte DalD
bei allen Stämmen die Sensitivität und ermöglichte die Verstoffwechslung des
Zuckeralkohols.
76
III. Ergebnisse
Tab. III.1.15. Markertest entkoppelnder Mutanten in LGS322 und LGS322-1
Stamm
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
LGS322
LGS322-1
Plasmid
relevante
Austausche
Markerplatten1,2
McC Mtl
MM Mtl
McCAtl
/pGJ9∆137
w
-
S
”
w
-
2+
/pGJ9
3+
+
S
”
3+
+
2+
/pGJT9-1∆
w
-
S
+
+
2+
2+
+
S
”
3+
+
2+
/pGJT9-2∆
w
-
S
+
+
2+
+
+
S
”
3+
+
2+
/pGJT9-3∆
w
-
S
+
+
2+
w
-
S
”
2+
+
2+
/pGJT9-4∆
w
-
S
w
-
2+
w
-
S
”
w
-
2+
/pGJT9-5∆
w
-
S
w
-
2+
w
-
S
w
-
2+
”
/pGJT9-1
”
/pGJT9-2
”
/pGJT9-3
”
/pGJT9-4
”
/pGJT9-5
”
E218A
E218V
H256P
E218A/
L229Q/
H256P
E218V/
H256P
1
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. 2Phänotyp aller
Stämme auf McC Glc = 3+, McC Gut = w, LB0Str = +, LB0Cam = +.
Die AS-Austausche E218A, E218V und H256P ermöglichten im verkürzten EIIMtl
(LGS322-1 /pGJT9-1∆, /pGJT9-2∆, pGJT9-3∆) nur mit DalD Wachstum auf D-Mtl. In
diesen Mutanten fand entkoppelter Transport statt. In einem vollständigen EIIMtl ohne
DalD konnten nur die Mutanten mit den Austauschen E218A und E218V auf D-Mtl
wachsen (LGS322 /pGJT9-1, /pGJT9-2). Das Wachstum war in beiden Fällen
III. Ergebnisse
77
schwächer als beim WT. Mit DalD zeigen die Mutanten wieder WT-Aktivität. In einem
vollständigen EIIMtl wurde das Substrat durch die Mutationen E218A und E218V nur
teilweise phosphoryliert und somit ein unterschiedlich großer Anteil an D-Mtl
unphosphoryliert transportiert. Die Mutation H256P verhinderte in einem vollständigen
EIIMtl ohne DalD das Wachstum der Zellen auf D-Mtl vollständig (LGS322 /pGJT9-3),
während mit DalD ein Mtl+-Phänotyp erreicht wurde (LGS322-1 /pGJT9-3). Mit dem
AS-Austausch H256P war der gekoppelte Transport für ein Wachstum auf MM Mtl nicht
ausreichend, es fand hauptsächlich oder nur entkoppelter Transport statt. Die
Mutations-Kombinationen E218A/L229Q/H256P und E218V/H256P verhinderten mit
und ohne DalD Wachstum auf D-Mtl. Diese Kombinationen hatten entweder eine große
Einwirkung auf Bindung und/oder Transport, oder eine funktionelle Faltung der
Translokationsdomäne wurde beeinträchtigt.
Œ Markertest der „Suppressormutanten“ in LGS322 (∆mtlA), LGS322-1 (∆mtlA
DalD+) und LTK31-2 (∆mtlA ∆(ptsH ptsI crr)::kan DalD+ ScrK+)
In
der
folgenden
Tabelle
(Tab.
III.1.16.)
sind
die
relevanten
Markertesteigenschaften der Suppressormutanten in dem Stamm LGS322 und
LGS322-1 dargestellt. Um festzustellen, ob diese Aminosäureaustausche auch zu einer
Entkopplung führen können, wurden die Mutationen zusätzlich in einem Stamm ohne
allgemeine PTS-Komponenten getestet. Hierfür wurde der Stamm LTK31-2 eingesetzt.
Als Referenz wurden die Stämmen LTK31-2, LGS322 bzw. LGS322-1 mit den
Plasmiden pGJ9 und pGJT9-1 angeführt.
In den Stämmen LGS322 und LGS322-1 vermittelten die Plasmide pDSM1
(P256Q) und pDSM2 (P256S) wieder eine WT-Aktivität auf McC Mtl-Platten. In
LTK31-2 war mit diesen Plasmiden keine Entkoppelung mehr zu erkennen. Dagegen
zeigten
die
Plasmide
pDSM3
(E218A/L229Q/P256A)
und
pDSM4
(E218A/L229Q/P256Q) in LTK31-2 entkoppelten Transport sowie einen schwächeren
Phänotyp in dem Stamm LGS322, was auf die noch vorhandene entkoppelnde
Mutation E218A zurückgeführt werden kann. Die bessere Verstoffwechselung von DMannitol in dem Stamm LGS322-1 zeigte, dass auch bei diesen Mutanten entkoppelter
und gekoppelter Transport stattfindet. Allerdings führten beide Plasmide in den
Stämmen LGS322 und LGS322-1 zu schwächeren Phänotypen auf D-Mannitol als das
78
III. Ergebnisse
Plasmid pGJT9-1 mit der einfachen E218A-Mutation. Dadurch wird ein weiterer Einfluss
der Mutationen L229Q und/oder P256A bzw. P256Q beim Wachstum auf D-Mannitol
deutlich. Besonders im Hinblick auf die scheinbaren WT-Aktivitäten der einfachen
Mutationen P256Q und P256S sind weitere Untersuchungen erforderlich. Grundsätzlich
fielen bei entkoppelten Mutanten die Phänotypen der D-Mannitol-Verstoffwechselung in
dem Stamm LTK31-2 schwächer aus als in dem Stamm LGS322-1. Die Ursache hierfür
ist aber eher im grundsätzlich abweichenden Stammhintergrund als in funktionellen
Unterschieden in dem Transportmechanismus zu suchen.
Tab. III.1.16. Plattentest der Stämme LGS322, LGS322-1 und LTK31-2
mit den „Suppressor-Mutationen“
Stamm
Plasmid
LTK31-2
/pGJ9
LGS322
/pGJT9-1
relevante
Austausche
E218A
Markerplatten1,2
McC Mtl
MM Mtl
Mc Atl
w
-
2+
2+
+
S
3+
+
2+
LGS322-1
”
LTK31-2
”
+
+
2+
LGS322
/pDSM1
3+
+
S
3+
+
2+
P256Q
LGS322-1
“
LTK31-2
”
w
-
2+
LGS322
/pDSM2
3+
+
S
3+
+
2+
w
-
2+
(+)
(+)
S
2+
+
2+
+
+
2+
(+)
(+)
S
2+
+
2+
+
+
2+
LGS322-1
“
LTK31-2
”
LGS322
/pDSM3
LGS322-1
“
LTK31-2
”
LGS322
/pDSM4
LGS322-1
“
LTK31-2
”
1,2
P256S
E218A/
L229Q/
P256A
E218A/
L229Q/
P256Q
siehe Tabelle III.1.15.
Œ Zellerträge und Generationszeiten mit verschiedenen mtlA-Plasmiden
Über Wuchskurven können die Wachstums-Vergleiche der unterschiedlichen
Mutanten auf D-Mannitol in quantitativer Weise bestimmt werden. Da die Ergebnisse
der Plattentests schon zeigten, dass es nach dem Transport über die veränderten
III. Ergebnisse
79
IIC*BA-Domänen zu einer Freisetzung von teilweise und nicht phosphoryliertem DMannitol kommen kann, wurden das Wachstum von Zellen mit und ohne DalD in
einem vollständigem EIIMtlC*BA verglichen.
Tab. III.1.17. Zellerträge und Generationszeiten der Stämme LGS322 und
LGS322-1 mit verschiedenen mtlA-Plasmiden
Stamm
LGS322-1 (F’lac::dalD+)
LGS322
Gt1 [min]
Zellertrag2
[∗108 B/ml]
Gt1 [min]
Zellertrag2
[∗108 B/ml]
83 - 88
8 - 8,5
81 - 87
7,5 - 8
k.W.
k.W.
k.W.
k.W.
/pGJT9-1
E218A
180 - 200
4 - 4,4
110 - 125
6–8
/pGJT9-2
E218V
230 - 380
2,5 - 3
105 - 115
6 - 7,5
/pGJT9-3
H256P
k.W.
k.W.
220 - 345
3,5 – 4,3
/pGJT9-4
E218A/L229Q/H256P
k.W.
k.W.
k.W.
k.W.
/pGJT9-5
E218V/H256P
k.W.
k.W.
k.W.
k.W.
/pDSM1
P256Q
82 - 87
7,5 - 8
86 - 88
7
/pDSM2
P256S
84 - 87
7-8
84 - 86
7
/pDSM3
E218A/L229Q/P256A
580 - 900
0,3 - 1
140 - 150
5,5 - 6
/pDSM4
E218A/L229Q/P256Q
330 - 360
2 - 2,5
145 - 155
5 - 5,5
/Plasmid
relevante Austausche
/pGJ9
/pGJ9∆HindIII
Die Stämme wurden in MM Mtl/Glc Cam angeimpft und über Nacht bei 37°C in einem
Roller inkubiert. Die ÜK wurden in MM+ gewaschen und in vorgewärmtes Medium (MM
Mtl [0,2%] Cam) zu einer Zellzahl von 5x107 B/ml überimpft. Alle Wuchskurven wurden
im Schüttelwasserbad bei 37°C mindestens dreimal unabhängig voneinander
aufgenommen. 1Generationszeiten (Gt) wurden aus der Steigung der Wuchskurven in
der exponentiellen Wachstumsphase berechnet. 2Zellerträge wurden aus der Differenz
der anfänglichen (t0) und der maximal gemessenen OD420 in einem Zeitraum von 24h
ermittelt. k.W. = kein Wachstum.
Als Kontrolle für das Wachstum unter WT-Bedingungen wurden die Messungen
mit
den
Stämmen
LGS322/pGJ9,
LGS322-1/pGJ9
durchgeführt.
Die
80
III. Ergebnisse
Generationszeiten für Zellen mit dem WT-MtlA (pGJ9) in einem Stamm mit und ohne
DalD (LGS322-1 bzw. LGS322) lagen bei den Messungen in beiden Fällen
reproduzierbar in einem Bereich zwischen 80 und 90 Minuten. Ein etwas geringerer
Zellertrag wurde lediglich bei den Stämmen mit dem F’-Plasmid beobachtet (ca.
0,5∗108 B/ml weniger Zellen).
Um einen pleiotropen Effekt der Mutationen auf das Wachstum ausschließen zu
können, wurden Wachstumsmessungen in MMGlc [0,2%] mit den entsprechenden
Antibiotika und Aminosäuren durchgeführt. Dadurch sollte der Einfluss des F’-Plasmids,
eines zusätzlichen Plasmids und des Chloramphenicols berücksichtigt werden. Die
Messungen wurden jeweils dreimal durchgeführt.
Der Stamm LGS322 zeigte dabei eine Generationszeit von 66.±3 min., LGS3221 wuchs mit 70.±3 min. etwas langsamer. Auch der Zellertrag war beim LGS322-1
etwas schwächer (9.±0,5 ∗108 B/ml) als beim LGS322 (9,5.±0,5 ∗108 B/ml). Beide
Effekte könnten auf das zusätzliche F’-Plasmid in dem Stamm LGS322-1 zurückgeführt
werden. Wuchsen die beiden Stämme mit dem Plasmid pGJ9∆HindIII, welches um den
Großteil von mtlA deletiert ist, auf Chloramphenicol, verlangsamte sich das Wachstum
in beiden Fällen um etwa 7min. (LGS322: 73.±3 min.) bzw. 5 min. (LGS322-1: 75.±3
min.) und auch der Zellertrag reduzierte sich (LGS322: 9.±0,5 ∗108 B/ml; LGS322-1:
7,5.±0,5 ∗108 B/ml). Im Vergleich zu diesen Ergebnissen wurde bei allen anderen in
der Tab. III.1.17. aufgeführten Plasmiden in dem Stamm LGS322 eine Generationszeit
von 75.±3 min (Zellertrag 7,5 ±0,5 ∗108 B/ml) und in dem Stamm LGS322-1 eine
Generationszeit von 80.±3 min (Zellertrag 7 ±0,5 ∗108 B/ml) gemessen. Lediglich bei
Stämmen mit dem Plasmid pGJT9-2 (E218V) wurde eine verlängerte Anlaufphase im
Wachstum festgestellt, die sich allerdings nicht in der Generationszeit bemerkbar
machte. Aufgrund der lediglich geringfügigen Abweichungen im Wachstum der Stämme
mit den verschiedenen mtlA-Plasmiden wurde ein pleiotroper Effekt der Mutationen in
mtlA ausgeschlossen.
Bei der Betrachtung des Wachstums von Zellen mit den unterschiedlichen MtlAVarianten auf D-Mannitol lassen sich die Phänotypen in einer ersten Betrachtung in vier
Gruppen unterteilen.
Dabei wird die erste Gruppe aus Mutanten mit den Mutationen P256Q, und
P256S gebildet, die mit und ohne DalD eine Generationszeit und einen Zellertrag im
Bereich des Wildtyps zeigten. Die Messungen deuten darauf hin, dass die Mutationen
III. Ergebnisse
81
bei der untersuchten D-Mtl-Konzentration keinen großen Einfluss auf das Wachstum
haben. Ferner scheint der Anteil an freiem D-Mannitol in der Zelle in allen Fällen so
gering zu sein, dass ein Vorteil eines Wachstums mit DalD nicht zu erkennen ist.
Bei
der
zweiten
Gruppe
von
Mutationen
(E218A,
E218V,
E218A/L229Q/P256Q) war das Wachstum auf D-Mannitol in dem Stamm LGS322
deutlich langsamer als das Wachstum des Wildtyps. Der Zellertrag reduzierte sich in
diesen Fällen entsprechend der sich verlängernden Generationszeit. Das Vorhandensein
von DalD führte dagegen zu einer deutlichen Verbesserung des Zellertrags und der
Generationszeiten. Der Zellertrag steigerte sich in allen Fällen um etwa 100%. Eine
Sonderstellung nimmt in dieser Gruppe die Mutation in dem Plasmid pDSM3
(E218A/L229Q/P256A) ein. Diese Mutation ermöglichte auch Wachstum in LGS322,
dieses war jedoch drastisch verlangsamt und auch der Zellertrag war reduziert. In dem
Stamm LGS322-1 kam es wiederum zu einer Verbesserung des Wachstums, wie es
schon bei den anderen Mutationen dieser Gruppe beobachtet wurde. Der Ertrag
steigerte sich von 0,3-1 auf 5,5-6 [∗108 B/ml]. Dies deutet auf einen sehr hohen Anteil
unphosphorylierten, dass bedeutet entkoppelt transportierten D-Mannitols hin.
Die dritte Gruppe wird durch das Plasmid pGJT9-3 (H256P) gebildet. In dem
Stamm LGS322 ermöglichte es kein Wachstum auf D-Mannitol, wogegen mit DalD
Wachstum zu sehen war. Die Mutation H256P ermöglichte lediglich Wachstum auf
freiem D-Mannitol durch entkoppelten Transport.
Die Mutationen der vierten Gruppe (E218A/H256P, E218V/P256A) schalteten
jeden Transport aus. Es war weder Wachstum im Stamm LGS322 noch im Stamm
LGS322-1 möglich.
III.1.5.2. Bindekinetik der Mutanten
Alle Daten zu den Bindekinetiken wurden Dank der freundlichen Unterstützung
von G.T. Robillard und seinen Mitarbeitern (E. Vos, J. Broos, R.H. Duurkens, G.K.
Schuurman-Wolters) in deren Laboratorien an der Reichsuniversität Groningen
selbstständig ermittelt.
ΠOrtsspezifische Mutagenese in dem Plasmid pMaHisMtlAPr
Um eine Überexpression von mtlA mit Hilfe der Hitzeinduktion durchzuführen,
mussten die bekannten Mutationen in das über Hitze induzierbare Plasmid
82
III. Ergebnisse
pMaHisMtlAPr eingeführt werden. Die Mutagenesen wurden mit dem „QuikChange™
Site-Directed Mutagenesis Kit“ der Firma Stratagene und den im Ergebnisteil erwähnten
Mutagenese-Primern
(.E218A(+/-),
E218V(+/-),
H256P(+/-),
H256A(+/-),
H256Q(+/-), H256S(+/-.)) durchgeführt. Die daraus resultierenden Derivate des
Plasmides pMaHisMtlAPr (WT) sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Tab. III.1.18. Mutanten aus dem Plasmid pMaHisMtlAPr
Plasmid
Phänotyp (AS-Austausch in MtlA)
pRUG1
pMaHisMtlAPr mtlA E218A
pRUG2
pMaHisMtlAPr mtlA E218V
pRUG3
pMaHisMtlAPr mtlA H256P
pRUG4
pMaHisMtlAPr mtlA E218A/H256P
pRUG5
pMaHisMtlAPr mtlA E218V/H256P
pRUG6
pMaHisMtlAPr mtlA H256A
pRUG7
pMaHisMtlAPr mtlA H256Q
pRUG8
pMaHisMtlAPr mtlA H256S
Bei der weiterführenden Untersuchung der „Supressormutanten“ wurden
lediglich die Auswirkungen der AS-Austausche in dem His256 untersucht. Das bedeutet,
dass der zusätzliche Austausch E218A (sowie der unspezifische Austausch L229Q), wie
er in pDSM3 und pDSM4 kodiert vorkommt, nicht eingefügt wurde. Die Phänotypen der
Mutationen mit den neuen Konstrukten entsprachen den Phänotypen der zuvor
beschrieben pGJ9-Reihe. Dabei zeigte der Stamm LGS322./pRUG4 (E218A/H256P)
den gleichen Phänotyp auf D-Mtl wie LGS322./pGJT9-4 (E218A/L229Q/H256P). Bei
der Untersuchung der einfachen AS-Austausche H256A, H256Q und H256S mit dem
Stamm LTK31-2 wurde keine Entkopplung festgestellt.
ΠHerstellung der Vesikel
Die Phosphorylierungstests und Bindestudien wurden mit Vesikeln durchgeführt.
Als Teststamm wurde LGS322 verwendet, der mit den oben beschriebenen Plasmiden
der Reihe pRUGx transformiert wurde. Die eingesetzten Vesikel wurden mit der „French
Press“ wie in dem Teil II.5.1. der Arbeit beschrieben hergestellt. Die Abb.III.1.6. zeigt
III. Ergebnisse
83
ein Coomassie-gefärbtes SDS-Gel, dass mit den Vesikeln nach der Überexpression
beladen wurde.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
116 kDa
80 kDa
Í MtlA(His)6
52,5 kDa
34,9 kDa
Abb. III.1.6. SDS-Gel der Vesikel nach der Überexpression
10µl der Vesikel wurden in einer 1:10 Verdünnung auf ein 12,5%iges
Acryl-Amid-Gel aufgetragen. Auf das Gel wurden die Vesikel der
jeweiligen Mutanten aufgetragen (LGS322/pRUGx). Bahn 1= E218A
(13,6); 2= E218V; 3= H256P; 4= E218A/H256P; 5= E218V/H256P;
6= LGS322; 7= H256Q; 8= H256A; 9= H256S; letzte Bahn= „BIORAD SDS-PAGE Standard, Low Range“. Die Größen der Standard-Banden
sind neben dem Bild angegeben. Mit einem Pfeil ist die Laufhöhe des
MtlA(His)6 angegeben (~60 kDa. Montfort et al., 2001).
In Bahn 6 ist das Gesamtmembranprotein aus dem Stamm LGS322 ohne
Plasmid aufgetragen und zeigt daher keine Expression von MtlA.
Die Gesamtproteinkonzentrationen der Vesikel wurden wie in Teil II.8.1.
beschrieben gemessen. Bei der Messung wurden jeweils 10µl und 30µl einer 1:50
Verdünnung der Vesikel eingesetzt. Die folgende Tabelle III.1.19. gibt die
durchschnittlich gemessenen Werte wieder.
Tab. III.1.19. Gesamtproteinkonzentrationen der Vesikel
Gesamtproteinkonzentration der Vesikel [mg/ml]
E218A
E218V
H256P
E218A
H256P
E218V
H256P
13,6
20,5
13,7
12,5
14,1
H256S H256Q H256A LGS322
18,4
16,7
15,7
5,1
WT
21,9
84
III. Ergebnisse
ΠPhosphorylierungstests mit den Vesikeln
Mit den Vesikeln wurden Tests der PTS-abhängigen in vitro Phosphorylierung
durchgeführt um festzustellen, ob und wie viel aktives Protein isoliert werden konnte.
Eine Testreihe untersuchte die Phosphorylierungsaktivität bei einer D-Mtl Konzentration
von 1mM nach 220sec, 440sec, 660sec und 880sec. Jeder Ansatz von 100µl enthielt
ca. 33000cpm. Die Vesikel wurden abhängig von den eingesetzten Mutanten in
unterschiedlichen Verdünnungen eingesetzt. Als Kontrollen wurde ein Ansatz mit
Vesikeln aus dem ∆mtlA-Stamm LGS322 und ein Ansatz mit H2O getestet. Die
Kontrollen überschritten unabhängig von der Vesikelverdünnung (bei LGS322) nie den
Wert von 200cpm. Die folgende Abb. III.1.7. zeigt typische Phosphorylierungsaktivitäten
der verschiedenen MtlA-Derivate in Vesikeln nach rechnerischem Abgleich der
unterschiedlichen Verdünnungen.
140.000
120.000
100.000
cpm
E218A
E218V
80.000
H256P
H256Q
60.000
H256A
H256S
WT
40.000
20.000
0
0
200
400
600
800
1000
t [sec]
Abb. III.1.7. Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel mit 1mM [14C]-D-Mtl
Die ursprünglichen Verdünnungen (1:4000 bei dem WT; 1:1000 bei E218A, E218V, H256Q,
H256S und H256A; 1:250 bei H256P, E218A/H256P und E218V/H256P) sind rechnerisch auf
1:250 angeglichen worden. Die Kontrollen durch den ∆mtlA-Stamm LGS322 und dem Ansatz mit
Wasser sind nicht dargestellt.
III. Ergebnisse
85
Um die scheinbar nicht vorhandene Phosphorylierungsaktivität der Mutante
H256P
näher
zu
untersuchen,
wurden
Phosphorylierungstests
bei
geringerer
Verdünnung der Vesikel (1:10) und einer Konzentration von 500µM [14C]-D-Mtl
durchgeführt. Jeder Ansatz von 100µl enthielt ca. 120000cpm. In diesem Test wurden
auch die Doppelmutanten E218A/H256P und E218V/H256P untersucht. Die folgende
Abb. III.1.8. zeigt einen beispielhaften Verlauf der Phosphorylierung.
8000
7000
6000
cpm
5000
H256P
4000
EA/HP
EV/HP
3000
H2O
2000
1000
0
0
5
10
15
20
25
30
t [min]
Abb. III.1.8. Phos.-Aktivitäten von H256P-Mutanten mit 500µM [14C]-D-Mtl
Die Vesikel sind in dem Test in einem Verhältnis von 1:10 verdünnt worden.
Zusätzlich ist der Leerwert (H2O) dargestellt, bei dem statt der Vesikel Wasser
eingesetzt wurde.
Anhand der gemessenen Phosphorylierungsaktivitäten wurden die spezifischen
Aktivitäten der Mutanten bei einer Konzentration von 1mM bzw. 500µM D-Mtl
berechnet. Die spezifischen Aktivitäten beziehen sich hierbei auf die gemessenen
Gesamtproteinkonzentrationen. Die nur minimal über dem Leerwert liegenden
Aktivitäten der Doppelmutanten E218A/H256P und E218V/H256P wurden nicht als
Phosphorylierungsaktivität gewertet.
86
III. Ergebnisse
Tab. III.1.20. Spezifische Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel

nmol

Spezifische Phosphorylierungsaktivitäten der Vesikel 

 min ⋅ mg Gesamtprotein 
WT
LGS322
E218A
E218V
H256P
E218A/
H256P
E218V/
H256P
H256S
H256Q
H256A
278
0
307
32
2
0
0
339
303
253
Die Ergebnisse lassen die Mutanten hinsichtlich der Phosphorylierungsaktivität in
drei Klassen einteilen. Die Mutationen E218A, H256S, H256Q und H256A lagen in
einem Aktivitätsbereich, die dem WT-Protein entsprechen. Keine Aktivität zeigten die
Doppelmutanten E218A/H256P und E218V/H256P. Eine nur geringe Aktivität zeigten
die Mutanten E218V und H256P. Während der AS-Austausch E218V eine ca. 10%ige
WT-Aktivität zeigte, lag der AS-Austausch H256P mit <1% Aktivität nahe der Inaktivität.
Allerdings konnte in einem direkten Vergleich mit den Doppelmutanten und den
Leerwerten diese Minimalaktivität bestätigt werden. Für die weiteren Bindestudien
konnte allgemein gezeigt werden, dass mit der Methode aktives Protein in den Vesikeln
isoliert wurde. Die nicht vorhandene oder schwache Aktivität bei einzelnen Mutanten
(E218V, H256P, E218A/H256P, E218V/H256P) deckte sich mit den vorherigen
Beobachtungen (Tab. III.1.15. - III.1.17.) und ist nicht auf die Art der VesikelPräparation zurückzuführen.
ΠBindestudien der MtlA-Derivate in Vesikeln
Bei diesen Bindestudien wurde die Bindung von D-Mtl an das jeweilige EIIMtl in
einem Konzentrationsbereich von 26nM - 524nM untersucht. Für die Vesikel mit WTMtlA wurde ein Kd-Wert von ~40nM ermittelt. In mehrfachen Versuchen konnte für alle
getesteten Mutanten (E218A, E218V, H256P, E218A/H256P, E218V/H256P, H256S,
H256Q, H256A) keine Bindeaktivität gemessen werden. Dieses Ergebnis war für die in
den Phosphorylierungsuntersuchungen nicht (E218A/H256P, E218V/H256P) oder nur
schwach aktiven (E218V, H256P) Mutanten mit Einschränkungen zu Erwarten gewesen.
Jedoch war eine fehlende Bindeaktivität bei den Mutanten, die bei der Phosphorylierung
im Bereich der WT-Aktivität lagen (E218A, H256S, H256Q, H256A), überraschend.
Folglich musste eine mit dieser Methode messbare Bindeaktivität in einem
Konzentrationsbereich von 26nM - 524nM für alle Mutanten ausgeschlossen werden.
III. Ergebnisse
87
III.1.5.3. Transport-Kinetiken der Mutanten
Um weitere Aussagen über die Auswirkungen der AS-Austausche auf den
Transportprozess
von
D-Mtl
machen
zu
können,
wurden
anhand
von
Transportmessungen bei unterschiedlichen Konzentrationen (0,3µM; 0,5µM; 0,7µM;
1µM; 1,5µM; 2µM; 3µM; 5µM; 10µM) die KMapp-Werte [µM] und Vmax [nmol∗min-1∗mg
Protein-1] (in den Abbildungen = [nmol]*) ermittelt. Die Testkulturen wurden wie unter
II.4.2. beschrieben in LB0Cam angezogen. Die spezifischen Transportaktivitäten der
einzelnen Mutanten wurden für die jeweiligen Konzentrationen aus einer Kultur in
demselben Versuchsansatz gemessen. Die Messungen sind mit mindestens fünf (0,5µM;
1µM; 2µM; 5µM; 10µM) bzw. allen neun unterschiedlichen Konzentrationen
durchgeführt worden. In den folgenden Abbildungen (Abb.III.1.9-12) sind nur die
Messpunkte dargestellt, welche bei der Berechnung auch berücksichtigt wurden. Alle
Mutanten wurden mindestens dreimal unabhängig getestet. Der Plasmidhintergrund der
Mutationen war in allen Fällen pGJ9 und der Wirtsstamm LGS322. Die Mutation für
den
Austausch
ortsspezifische
beschriebenen
H256A
wurde
Mutagenese
Fällen
mit
den
(pGJT9-6)
wurden
die
Primern
konstruiert.
KMapp-Werte
H256A(+)/H256A(-)
In
einzelnen,
zusätzlich
mit
durch
gesondert
anderen
Plasmidhintergründen und Stämmen gemessen. In dem Stamm LGS322 mit den
Plasmiden pGJT9-1 (E218A), pGJT9-2 (E218V), pGJT9-3 (H256P), pGJT9-4
(E218A/H256P) oder pGJT9-5 (E218V/H256P) konnte keine Transportaktivität
gemessen werden. Die anderen aus den folgenden „Lineweaver-Burk“-Diagrammen
ermittelten Werte sind im Anschluss in der Tabelle III.1.21. zusammengefasst.
88
III. Ergebnisse
LGS322/pGJ9
1/V [nmol]*
0.2
WT I
WT II
0.2
WT III
0.1
0.1
0.0
-0.1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
1/S [µM]
Abb. III.1.9. KMapp-Wert Messungen des WT-Stamms LGS322/pGJ9 für D-Mtl
Dargestellt sind drei „Lineweaver-Burk“-Diagramme unabhängiger Messungen. Zu den
Messpunkten der D-Mannitol-Konzentrationen wurde eine lineare Regressiongerade
ermittelt und dargestellt. Die KMapp-Werte und V wurden anschließend wie in Teil II.8.4.
beschrieben berechnet.
1/V [nM]*
LGS322/pGJT9-5 (H256A)
0.4
0.4
0.3
0.3
H256A I
H256A II
H256A III
0.2
0.2
0.1
0.1
0.0
-0.1
-0.1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
1/S [µM]
Abb. III.1.10. KMapp-Wert Messungen von LGS322/pGJT9-5 für D-Mtl
siehe Abb. III.1.7.
III. Ergebnisse
89
LGS322/pDSM1 (P256Q)
1/V [nM]*
0.2
P256Q I
0.2
P256Q II
P256Q III
0.1
0.1
0.0
-0.1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
1/S [µM]
Abb. III.1.11. KMapp-Wert Messungen von LGS322/pDSM1 für D-Mtl
siehe Abb. III.1.7.
1/V [nM]*
LGS322/pDSM2 (P256S)
1.2
1.0
P256S I
P256S II
0.8
P256S III
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
1/S [µM]
Abb. III.1.12. KMapp-Wert Messungen von LGS322/pDSM2 für D-Mtl
siehe Abb. III.1.7.
90
III. Ergebnisse
Tab. III.1.21. KMapp-Werte und V der MtlA-Mutanten für D-Mtl in LGS322
V [nmol∗min-1∗mg Protein-1]
KMapp [µM]1
1
ASAustausch
I
II
III
Ø2
I
II
III
Ø2
-
3,9
4
4
4 ±0,1
102
92
53
82 ±26
pGJT9-6
H256A
7,4
10,9
8,2
8,2 ±1,8
78
107
100
95 ±15
pDSM1
P256Q
3,8
6,4
5,5
5,2 ±1,3
76
135
103
105 ±30
pDSM2
P256S
5,1
7
7,2
6,4 ±1,2
25
22
28
25 ±3
Plasmid
pGJ9
1
Angegeben sind die jeweiligen Werte der einzelnen Messungen (I-III). 2 Ø = Mittelwerte
der drei Messungen mit Angabe der Standardabweichungen (±) wie in II.8.4. beschrieben.
Bei der Betrachtung der Daten fällt auf, dass die Werte für V innerhalb einer
Mutation voneinander abwichen. Dies ist auf verschiedene MtlA-Konzentrationen
innerhalb der Testkulturen zurückzuführen. Da die Expression von mtlA in dem
verwendeten Testsystem konstitutiv erfolgte, liegt eine variierende Plasmidkopienzahl
nahe. Bei Überprüfungen von EK getesteter Kulturen auf McMtl und LB0cam (Daten
nicht angegeben) wurde eine 30-70%ige Kurierung des Plasmides (bzw. des Mtl+Phänotyps) festgestellt. Die KMapp-Werte zeigten in der Tendenz, dass alle Mutationen
einen gegenüber dem WT erhöhten KMapp-Wert bewirken. Diese Werte sprechen für eine
geringfügig verringerte Affinität von D-Mtl zu der Bindestelle in MtlA, die allerdings nicht
für die in III.1.5.2. beschriebene fehlende Bindung ausschlaggebend sein kann.
Trotz der eingeschränkten Bewertungsmöglichkeiten der V-Werte, fällt der
konstant bis zu einem Faktor 6 niedrigere V der Variante P256S auf. Mit diesem Protein
wurde bei sieben Messungen immer ein V zwischen 19 und 28 [nM] und eine KMappWert zwischen 4,9 und 7,2 [µM] gemessen. Bei weiteren sieben Messungen wurden mit
dem Stamm LGS22/pDSM2 nichtlineare Kinetiken erhalten (siehe Abb. III.1.13.). In
verschiedenen Versuchsansätzen konnte nicht festgestellt werden welche Parameter
lineare und nichtlineare Kinetiken verursachen. Variierende MtlA-Konzentrationen bei
den Transportmessungen sind als Ursache auszuschließen, da diese keine Auswirkung
auf den KM-Wert haben.
III. Ergebnisse
91
1/V [nM]*
LGS322/pDSM2 (P256S)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-0.1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
1/S [µM]
Abb. III.1.13. Nichtlineare Kinetik der KMapp-Messung von LGS322/pDSM2
Die Abbildung zeigt die Messpunkte einer nichtlinear verlaufenden KMappMessung.
Die fehlende Transportaktivität in dem Stamm LGS322 mit den Plasmiden
pGJT9-1
(E218A)
(McCMtl
=
2+;)
und
LGS322/
pRUG1
(E218A)
(Phosphorylierungsaktivität [1mM D-Mtl] = 307 [nmol], WT= 278 [nmol]) ist aufgrund
der beschriebenen Ergebnisse unerwartet. Zudem konnte für die gleiche Mutation in
aus
mtlA
K. pneumoniae Transport (KM = 2,9µM, V = 59nmol) gemessen werden (Otte, 2000).
Diese Messungen wurde allerdings in dem Stamm LGS324 und mit dem NiedrigkopienVektor pHEX3 als mtlA-Plasmid durchgeführt.
Daraufhin
wurde
in
dieser
Arbeit
untersucht
ob
der
Stamm-
oder
Plasmidhintergrund Auswirkung auf die Messbarkeit der Transportaktivitäten des MtlA
haben könnte. In einem Markertest wurde festgestellt wie sich der Stammhintergrund auf
den Phänotyp auswirkt. Dazu wurden die äquivalenten Plasmide pSOL300 (mtlAKAY2026)
und pSOL313 (mtlAKAY2026 E218A), bzw. pGJ9 und pGJT9-1 (E218A) in den Stämmen
LGS322 und LGS324 auf McCMtl getestet und die spezifische Transportaktivität der
entsprechenden Proteine erneut gemessen.
92
III. Ergebnisse
Tab. III.1.22. Stammabhängige Phänotypen von mtlA-Mutanten
Stamm
LGS322/
LGS324/
McC Mtl1
spez.
Transportaktivität2
pGJ9
3+
5,2
pGJT9-1
2+
0
pSOL300
3+
2,5
pSOL313
1+
0
pGJ9
3+
5,7
pGJT9-1
2+
0
pSOL300
3+
3,8
pSOL313
3+
3,4
Plasmid
1.
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. 2.Angaben
in [nmol∗min-1∗mg Protein-1], gemessen mit 10µM [14C]-D-Mtl. Die
Testkulturen wurden in LB0Cam angezogen.
Aus den Tests geht hervor, dass der Stammhintergrund in dem Fall des pSOL313
(mtlAKAY2026 E218A) sowohl einen Einfluss auf den Phänotyp auf Platte (LGS322 1+,
LGS324 3+) als auch auf die messbare Transportaktivität hat. Keine stammabhängigen
Unterschiede wurden bei den beiden Wildtypen (pGJ9, pSOL300) und bei der E218AMutante aus E. coli (pGJT9-1) festgestellt. Daraufhin wurde mit den Primern E218A
(+/-) durch ortspezifische Mutagenese erneut die E218A-mtlA-Mutation in das Plasmid
pMMX5 eingefügt (Um eventuelle Reversionen oder Suppressionen in pSOL313
auszuschließen, wurde zur Kontrolle die E218A auch in pSOL300 eingefügt. Die
Ergebnisse aus der Tab. III.1.22. konnten mit diesem Plasmid bestätigt werden). Das
Plasmid pMMX5 ist ein Niedrigkopieplasmid mit einem mtlA(His)6. Dadurch sollte
festgestellt werden, welchen Einfluss das Plasmid auf die Transportaktivität hat. Das
resultierende Plasmid pMMX5-EA zeigte in dem Stamm LGS324 auf McMtl einen 3+Phänotyp und eine spezifische Transportaktivität von 11,3 und 11,8 [nmol]. In dem
Stamm LGS322 war der Phänotyp auf McMtl unverändert 3+, allerdings konnte
wiederum keine Transportaktivität gemessen werden. Weitere Transportmessungen mit
dem Stamm LGS324 /pMMX5-EA erwiesen sich dennoch als schwierig, da die
Transportaktivität nicht regelmäßig zu messen war. Die erfolgreiche Messung einer
Transport-Kinetik ergab einen V von 25 [nmol∗min-1∗mg Protein-1] und einen KMapp von
4,9 [µM] für LGS324./pMMX5-EA. Die Mindestvoraussetzungen für eine erfolgreiche
III. Ergebnisse
93
Transportmessung scheinen in dem beschriebenen Fall der Stamm LGS323 und ein
Niedrigkopienvektor wie der pHEX3/5 zu sein. Was die genauen Gründe für diese
Beobachtungen sein können, war im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr zu bestimmen.
Erschwerend ist dabei der nicht genau bekannte Genotyp des Stammes LGS324 im
Vergleich zu dem Stamm LGS322 (siehe III.1.1.4.). An den Mutationen E218A und
P256S wird ersichtlich, dass sich E. coli MtlA in diesen Fällen in Grenzbereichen der
Messbarkeit bewegt. Inwiefern dies an der Konformation, Dimerisierung, oder der
Expressionsstärke liegt, lässt sich anhand der vorliegenden Daten nicht genau
bestimmen. In der Kinetik scheint die E218A-Mutation gegenüber dem WT
(LGS322/pMMX5: V 83-84 [nmol∗min-1∗mg Protein-1], KMapp 4,8-6,3.[µM]) einen
niedrigeren V (25 [nmol∗min-1∗mg Protein-1]) und einen ähnlichen KMapp (4,9 [µM]) zu
haben.
In
der
Tabelle
III.1.23.
sind
die
wesentlichen
Ergebnisse
der
molekularbiologischen und biochemischen Untersuchungen an den mtlA-Mutanten
zusammengefasst.
Die Messungen zeigten, dass mit einem Selektionsprinzip (Wachstum auf DMannitol mit unterbrochener Phosphorylierungskette) drei entkoppelte Mutationen
(E218A, E218V, H256P) mit unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften isoliert
werden konnten. Alle drei Mutanten zeigten in MtlA’ (EIIC) den gleichen Phänotyp auf
McC Mtl. Die Menge des entkoppelt transportierten D-Mtl scheint gleich zu sein. Die
Mutationen E218A und E218V führten in einem vollständigem MtlA (EIICBA) zu
gleichzeitigem ge- und entkoppelten Transport. Dabei hatte E218V im Vergleich mit
E218A nur 10% Phosphorylierungsaktivität, erreichte aber mit DalD gleiche
Generationszeiten auf D-Mtl. Das weist auf einen höheren Anteil an entkoppeltem
Transport mit der Mutation E218V hin. Mit der Mutation H256P wurde die
Phosphorylierungsaktivität fast vollständig ausgeschaltet, Wachstum mit gekoppeltem
Transport fand nicht mehr statt. Es wart nur noch Wachstum mit DalD möglich, welches
aber schwächer als bei den Mutationen E218A und E218V ausfiel. Die Mutation
H256P entkoppelte den Transport von D-Mtl vollständig. Die Kombination der
Austausche (E218A/H256P und E218V/H256P) führte zu einem vollständigen Ausfall
der Phosphorylierungs- und Transportaktivitäten.
94
III. Ergebnisse
Tab. III.1.23. Zusammengefasste Ergebnisse der EIIMtl-Mutanten im Stamm LGS322
IIMtl
I
IICBA (WT)
IICBA +DalD
IIC
IIC +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IIC
IIC +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IIC
IIC +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IIC
IIC +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IIC
IIC +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IIC
IIC +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IICBA
IICBA +DalD
IICBA
IICBA +DalD
ASAustausch
II
WT
E218A
E218V
H256P
E218A/
H256P
E218A/
L229Q/
H256P
E218V/
H256P
H256A
P256Q
P256S
E218A/
L229Q/
P256A
E218A/
L229Q/
P256Q
Gt
[min]
IV
83-88
81-87
k.W.
k.W.
180-200
110-125
Tp KMapp
[µM]
V
4 ±0,1
Tp V
[nM]*
VI
82 ±26
Pho
[nM]*
VII
278
Kd
[nM]*
VIII
40
[4,9]1
[25]1
307
n.m.
230-380
105-115
n.m.
n.m.
32
n.m.
k.W.
220-345
n.m.
n.m.
2
n.m.
k.W.
k.W.
k.W.
k.W.
n.m.
n.m.
0
n.m.
n.m.
n.m.
k.W.
k.W.
n.m.
n.m.
0
n.m.
8,2 ±1,8
95 ±15
253
n.m.
82-87 5,2 ±1,3 105 ±30
86-88
84-87 6,4 ±1,2 25 ±3
84-86
580-900
n.m.
n.m.
140-150
303
n.m.
339
n.m.
McC
Mtl
III
3+
3+
w
w
2+
3+
w
+
+
3+
w
+
w
2+
w
+
w
w
w
w
w
w
w
w
w
w
3+
3+
3+
3+
3+
3+
(+)
2+
(+)
2+
330-360
145-155
n.m.
n.m.
Kopplung
IX
+
+
k.T.
k.T.
+/+/+/+/k.T.
k.T.
k.T.
k.T.
k.T.
k.T.
k.T.
k.T.
k.T.
k.T.
+
+
+
+
+
+
+/+/+/+/-
Die Tabelle fasst wesentliche Ergebnisse der Mutanten-Untersuchungen zusammen. Die
Mutationen wurden in verschiedenen Plasmid-Hintergründen gemessen. Für schattierte
Felder liegen keine Messungen vor. [nM]*=[nmol∗min-1∗mg Protein-1]. Spalte I:
IICBA=MtlA, IIC=MtlA’. II: AS-Austausche. III: Phänotyp auf McC Mtl (siehe Tab.III.I.15.
u.16.). IV: Gt=Generationszeit auf D-Mtl (s. Tab.III.I.17.). V u VI: Tp=Transport (s.
Tab.III.I.21.). VII: Pho=spez. Phosphorylierungsaktivität. (s. Tab.III.I.20.). IX: Art des DMtl-Transports: +=gekoppelter Tp, -=entkoppelter Tp, +/-=ge- und entkoppelter Tp,
k.T.=kein Tp. [ ]1 = Messung im Stamm LGS324.
III. Ergebnisse
95
Bei der Selektion von Supressormutanten wurden nur Mutationen der AS256
gefunden. Die daraus resultierenden Derivate H256A, P256Q und P256S stellten in
den Zellen annähernd den WT-Phänotyp auf D-Mtl wieder her. Eine zusätzliche den
Transport
entkoppelnde
Mutation
E218A,
wie
sie
in
den
Kombinationen
E218A/L229Q/P256A und E218A/L229Q/P256Q untersucht wurde, bewirkt wie auch
allein ge- und entkoppelten Transport. Das Wachstum auf D-Mtl fiel allerdings in
beiden Fällen schwächer aus als mit der E218A-Mutation.
Die Selektionen und Messungen zeigen, dass die Aminosäuren E218 und H256
maßgeblich am Transport- und Phosphorylierungsprozess beteiligt sein müssen.
Mutationen wurden nur an diesen Stellen gefunden und beeinflussten den D-MtlTransport auf unterschiedliche Weise.
III.2. Topologieuntersuchungen am EIIMtl
Die oben gezeigten Ergebnisse haben eine deutliche Beteiligung der
Aminosäuren E218 und H256 am eigentlichen Transportprozess von D-Mtl durch das
EIIMtl gezeigt. In dem bisherigen 2D-Modell von MtlA (Abb. I.3.) sind diese in der
vermuteten zytoplasmatischen Schleife 5 zu finden. Die in dem WT-Transporter
beobachtete Kopplung von Transport und Phosphorylierung setzt eine lokale
Nachbarschaft zwischen den an der Bindung und Phosphorylierung beteiligten
Aminosäuren voraus. Da Mutationen/Austausche der genannten AS eine Entkopplung
bewirken, ist es wahrscheinlich, dass diese in der Nähe oder in der Bindestelle liegen.
Daher war die genauere Kenntnis der Topologie der Schleife 5 des EIIMtl wichtig. Das
bisherige Modell stützt sich überwiegend auf Untersuchungen von Sugiyama et al.
(1991), in denen ausschließlich über φ(mtlA’-phoA)-Fusionen Teile des MtlA dem Zytooder Periplasma zugeordnet wurden. Die Methode beruht darauf, dass PhoA im
Periplasma Aktivität zeigt, nicht aber in dem Zytoplasma. Dabei fehlten jedoch die
notwendigen φ(mtlA’-lacZ), deren Aktivitäten sich hinsichtlich der Lage genau
gegensätzlich verhalten, sowie Versuche mit sogenannten „Sandwich“-Fusionen
(φ(mtlA’-lacZ-mtl’A)) und vollständigen, korrekt gefalteten IICBAMtl-Komplexen. Solche
langen AS-Insertionen können allerdings die Faltung beeinflussen und falsch positive
sowie falsch negative Ergebnisse hervorrufen. Im Gegensatz dazu bietet das „Cystein-
96
III. Ergebnisse
Scanning“ die Möglichkeit, mit einem aktiven Protein zu arbeiten, dass zudem nur in
wenigen Aminosäuren verändert ist.
III.2.1. Konstruktion der erforderlichen Plasmide und Mutanten
Die Voraussetzung für das „Cystein-Scanning“ sind MtlA-Komplexe, welche
jeweils an definierter Stelle nur ein Cystein besitzen. Die erforderliche T7Überexpression des Membran-Proteins wurde mit dem Niedrigkopieplasmid pHEX5 als
Klonierungs- und Überexpressionsvektor in dem Stamm JM109(λDE3) durchgeführt. Für
die Trennung der zu untersuchenden Proteine von den restlichen markierten Proteinen in
der Zelle war zudem eine effektive MtlA-Reinigung notwendig. In dieser Arbeit wurden
Proteine mit carboxyterminalem „His-Tag“ aus sechs Histidinen verwendet. Die
Reinigung erfolgte mit Hilfe von Ni-NTA-Säulen.
III.2.1.1. Konstruktion der Plasmide pMMX5 und pMMX5-1 bis
pMMX5-4
Um eventuelle Klonierungen über die HindIII-Erkennungssequenz in mtlA zu
ermöglichen, wurde zuerst die HindIII-Erkennungssequenz in pHEX5 über einen HindIIIVerdau mit anschließender Klenow-Auffüllung und Ligation entfernt. Das resultierende
Plasmid wurde pHEX5d genannt. Mit einer PCR wurde das vollständige mtlA von dem
Plasmid pGJ9 amplifiziert. Der erste verwendete Primer MtlA-HIS1 (5‘- GGA ATT CCC
GTC GAC TGG ACA GTT AAC CGA TTC AGT G -3‘; in blau: EcoRI, in rot: SalI)
enthielt an seinem 5’-Ende die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI.
Dadurch entstand hinter der natürlich vorkommenden SalI-Schnittstelle eine BamHISchnittstelle. Der Primer lagert sich ca. 135bp stromaufwärts des ATG-Startcodons von
mtlA an und amplifiziert somit auch die Promotorregion von mtlA. Der zweite Primer
MtlA-HIS2 (5‘- TTG GAT CCT TAG TGG TGG TGG TGG TGG TGC TTA CGA CCT
GCC AGC AGT TCC AGC ACT TC -3‘; blau: BamHI, rot: Stopp, grün: His-Tag) hängt
hinter dem letzten Codon von mtlA sechs Codone für Histidin, ein Stopp-Codon und
eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym BamHI an. Die zusätzlichen
Nukleotide an den 5’-Enden der beiden Primer sind für eine effektivere Funktion der
Restriktionsenzyme nötig. Die PCR wurde mit dem Plasmid pGJ9 als Matrize wie in
II.7.9.
beschrieben
durchgeführt,
das
PCR-Produkt
mit
den
entsprechenden
Restriktionsenzymen geschnitten und in den ebenso geschnittenen Vektor pHEX5d
III. Ergebnisse
97
kloniert. Die korrekte Sequenz wurde durch einzelsträngige Sequenzierung festgestellt
und das neue Ausgangsplasmid pMMX5 genannt.
Die Plasmide pMMX5-1 bis pMMX5-4 wurden durch nacheinander erfolgte
Mutagenesen der vier Kodone für die im WT vorhandenen Cysteine (C110, C320,
C384, C571) hergestellt. Das Ziel dieser Mutagenesen war ein Cystein-freies MtlA aus
dem die weiteren „Einzel-Cystein“-Mutanten abgeleitet wurden. Die Cysteine wurden
durch Serine ersetzt, lediglich das vermutlich in einer transmembranen Helix liegende
Cys320 wurde gegen ein Alanin ausgetauscht. Über ortspezifische Mutagenese (Primer
in runden Klammern) entstanden, ausgehend von pMMX5, nacheinander folgende
Plasmide (In eckigen Klammern ist zur Vereinfachung der veränderte Phänotyp
hinsichtlich der vier Cysteine angegeben):
pMMX5
WT
= [CCCC]
xx¬pMMX5-1
(C320A (+/-)) = [CACC]
xxxx¬pMMX5-2
(C110S (+/-)) = [SACC]
xxxxxx¬pMMX5-3
(C571S (+/-)) =
[SACS]
xxxxxxxx¬pMMX5-4 (C384S (+/-)) =
[SASS]
III.2.1.2. Konstruktion der zu untersuchenden „Einzel-Cys“-Mutanten
Die zu untersuchenden „Einzel-Cystein“-Mutanten wurden auch in Kombination
mit
dem
Cys384
für
die
Aktivitätskontrolle
konstruiert.
Dabei
wurden
die
Mutageneseansätze parallel mit dem Plasmid pMMX5-3 [SACS] und dem Plasmid
pMMX5-4 [SASS] als Matrize durchgeführt. Für die gezielten Austausche zu Cystein
wurden Serine an unterschiedlichen Stellen auch außerhalb der zytoplasmatischen
Schleife 5 ausgewählt. Die Austauschstellen, benutzten Primer und neuen Konstrukte
sind in der folgenden Tabelle III.2.1. aufgelistet und wurden durch einzelsträngige
Sequenzierung des mtlA überprüft.
Die Auswahl der Untersuchungsorte stützte sich auf das 2D-Modell von
Sugiyama et al. (1991) und Lengeler et al. (1994), dargestellt in Abb.I.2. Als sichere
Innenkontrolle wurde das Plasmid pMMX5-3 [SACS] eingesetzt, da das Cystein384 in
der zytoplasmatischen Domäne EIIBMtl liegt (Stephan und Jacobson, 1986). Die
negative Kontrolle stellte das cysteinfreie MtlA (pMMX5-4 [SASS]) dar.
98
III. Ergebnisse
Tab. III.2.1. Plasmide der Reihen pMMX5-3x und pMMX5-4x
in pMMX5-3
[SACS]
in pMMX5-4
[SASS]
⇓
⇓
zp Schleife 1 (IK)
pMMX5-31
pMMX5-41
S110C (+/-)
zp Schleife 3 (IK)
pMMX5-32
pMMX5-42
S158C
S158C (+/-)
pp Schleife 4 (AK)
pMMX5-33
pMMX5-43
S199C
S199C (+/-)
zp Schleife 5
pMMX5-34
pMMX5-44
S212C
S212C (+/-)
zp Schleife 5
pMMX5-35
pMMX5-45
S242C
S242C (+/-)
zp Schleife 5
pMMX5-36
pMMX5-46
S299C
S299C (+/-)
pp Schleife 6 (AK)
pMMX5-37
pMMX5-47
verwendete
Primer
postulierte Topologie der
Austauschstelle 1
S3C (+/-)
S110C
Mutation
S3C
1
zp = zytoplasmatisch, pp = periplasmatisch, IK = Innenkontrolle, AK = Außenkontrolle
III.2.1.3. Untersuchung der Funktionalität der MtlA-Derivate
Da Transportaktivität eine korrekte Faltung der Proteine voraussetzt, wurden zur
Überprüfung die resultierenden Phänotypen der Plasmide im Stamm LGS322 auf McMtl
und die Transportaktivitäten mit 10µM D-Mtl untersucht (Tab. III.2.2.). MtlA-Varianten
mit dem Austausch C384S (pMMX5-4 und seine Derivate) zeigten erwartungsgemäß
keine Aktivität.
Tab. III.2.2. Aktivitäten der „Cys-Scanning“-MtlA-Derivate
Plasmid
relevante
Austausche
McMtl1
spezifische
Transportaktivität2
pMMX5d
WT
3+
26
pMMX5-4
Cys-frei [SASS]
W
0
pMMX5-31
[SACS]+ S3C
3+
23,6
pMMX5-32
[SACS]+ S110C
3+
21,3
pMMX5-33
[SACS]+ S158C
3+
30,5
pMMX5-34
[SACS]+ S199C
3+
14,2
pMMX5-35
[SACS]+ S212C
3+
20,6
pMMX5-36
[SACS]+ S242C
3+
27,2
pMMX5-37
[SACS]+ S299C
3+
15,2
1.
Für Symbole und sonstige Erklärungen siehe Tab. III.1.1. 2.Werte in
[nmol∗min-1∗mg Protein-1], gemessen mit 10µM [14C]-D-Mtl. Die
LGS322-Testkulturen wurden in 2xTY Cam angezogen.
III. Ergebnisse
99
Um eine stark abweichende Faltung des cysteinfreien MtlA (pMMX5-4)
auszuschließen, wurde durch ortspezifische Mutagenese mit den Primern H256P (+/-)
der entkoppelnde Austausch H256P eingefügt. Zellen des Stammes LTK31-2 mit dem
daraus resultierenden Plasmid pMMX5-4HP zeigten einen 1+-Phänotyp auf McMtl und
Wachstum auf MM Mtl Cam (Alle anderen Derivate wurden ebenfalls auf Entkopplung
getestet, diese wurde aber in keinem Fall festgestellt). Dies ist ein guter Hinweis darauf,
dass die Faltung im cysteinfreien MtlA Transport erlaubt und vermutlich der des WT
entspricht. Die Transportaktivitäten der „Cys-Scanning“-MtlA-Derivate (Tab. III.2.2.) und
der Nachweis, dass eine MtlA-Mutante mit C384S-Austausch immer noch mit hoher
Affinität (Kd = 107nM, WT Kd = 45nM) D-Mannitol bindet (Boer et al. 1995), stützen
diese Annahme.
III.2.2. Markierung der Einzel-Cystein MtlA-Derivate
Die Markierung der Cysteine erfolgte wie unter Material und Methoden
beschrieben.
Dazu
wurde
der
mit
den
jeweiligen
„Einzel-Cystein“-Plasmiden
transformierte Stamm JM109(λDE3) in Flüssigkultur angezogen. Nach Induktion der
T7-Polymerase wurde mtlA überexprimiert und das Protein in ganzen Zellen zu einem
Teil mit Stilben und folgend mit Biotinmaleimid sowie nur mit Biotinmaleimid markiert.
Aus
den
markierten
Zellen
wurden
Membranpräparationen
gewonnen,
die
anschließend gelöst wurden. Das MtlA(His)6 wurde aus den Lösungen gereinigt und bei
den SDS-Gelen und folgenden immunologischen Nachweisen eingesetzt. Diese beiden
Proben aus den Markierungen mit ganzen Zellen (Probe1: Stilben.+.Biotinmaleimid;
Probe 2: Biotinmaleimid) ergaben die Aussage über die Lokalisation der Cysteine.
Aus dem anderen Teil der ganzen Zellen wurde ebenfalls mittels Ultraschall
Membranpräparationen erstellt, die danach zu einem Teil mit Stilben + Biotinmaleimid
sowie nur mit Biotinmaleimid markiert wurden. Die Präparationen wurden gelöst und
das MtlA(His)6 gereinigt. Diese Proben 3 (Stilben + Biotinmaleimid) und 4
(Biotinmaleimid) überprüften die allgemeine Zugänglichkeit der Cysteine für die
Sulfhydrylreagenzien.
100
III. Ergebnisse
III.2.3. Reinigung und immunologischer Nachweis des MtlA-6His
Da bei der Markierung der Cysteine auch alle anderen cysteinhaltigen Proteine
einer Zelle markiert werden, war eine Reinigung des Zielproteins notwendig. Dazu
wurde das MtlA(His)6 aus der gelösten Gesamtproteinfraktion mit Hilfe von Ni-NTASäulen gereinigt. Die Abbildung III.2.1. zeigt das Coomassie-gefärbte SDS-Gel einer
Reinigung.
St 1.1 5.1 1.2 5.2 1.3 5.3 1.4 5.4 St
116 kDa
80 kDa
Í MtlA(His)6
52,5 kDa
34,9 kDa
Abb. III.2.1. SDS-Gel einer MtlA(His)6-Reinigung
Auf dem Gel sind die Proben 1-4 zu sehen wobei jeweils das
gelöste Gesamtmembranprotein vor der Beladung der Säulen
(Bahn: 1.1-1.4) und nach der Elution (Bahn: 5.1-5.4)
aufgetragen worden sind. Bahn St.: „BIO-RAD SDS-PAGE
Standard, Low Range“. Die Größen der Standard-Banden sind
neben dem Bild angegeben. Mit einem Pfeil ist die Laufhöhe des
MtlA(His)6 angegeben (~60 kDa, Montfort et al., 2001).
Die Laufhöhe von ca. 60 kDa des gereinigten Proteins entspricht der
beschriebenen Höhe für MtlA(His)6 in Laemmli (1970)-Gelsystemen (Montfort et al.,
2001). Im weiteren Verlauf des Versuchs wurden die Eluate der Proben 1-4 aus zwei
unterschiedlichen Markierungsansätzen auf ein SDS-Gel aufgetragen. Um die
Wirksamkeit der Bindung des MtlA(His)6 an die Ni-NTA-Säule zu testen, wurde die
Gesamtproteinfraktion nach dem ersten Säulendurchlauf mit auf das Gel aufgetragen.
Zur genauen Identifizierung und ungefähren Quantifizierung des MtlA(His)6 wurden bei
dem ersten Gel in einem Western-Blot die aminoterminalen (His)6 immunologisch
nachgewiesen (Abb.III.2.3.). Die Abb.III.2.2. zeigt das mit Coomassie-Lösung
nachgefärbte Gel im Anschluss an den Proteintransfer.
III. Ergebnisse
101
Ansatz 1
GP 1
2
3
4
Ansatz 2
GP 1
2
3
4
Í MtlA(His)6
Abb. III.2.2. SDS-Gel nach dem Proteintransfer auf Membran
Abgebildet ist das nachgefärbte SDS-Gel nach dem Proteintransfer
auf die Nitrocellulose-Membran. GP: Gesamtprotein nach dem
ersten Säulendurchlauf. 1-4: die jeweiligen Proben 1-4 der
Markierungsansätze 1 und 2. Mit einem Pfeil ist die Laufhöhe des
MtlA(His)6 angegeben (~60 kDa, Montfort et al., 2001).
Die noch deutlich zu erkennenden MtlA(His)6-Banden weisen darauf hin, dass
ein großer Teil des gereinigten Proteins nicht auf die Nitrocellulose-Membran
übertragen wurde. Allerdings ist in Abbildung III.2.3. zu sehen, dass für den Nachweis
im „Western-Blot“ ausreichend Protein auf der Membran vorhanden war.
Ansatz 1
GP 1
2 3
Ansatz 2
4 GP 1
2 3
4
Í MtlA(His)6
Abb. III.2.3. Immunologischer Nachweis des MtlA(His)6
Abgebildet ist ein Film, der die Chemilumineszens-Reaktion
nach dem Western-Blot gegen das (His)6 nachweist. GP:
Gesamtprotein nach dem ersten Säulendurchlauf. 1-4: die
jeweiligen Proben 1-4 der Markierungsansätze 1 und 2. Mit
einem Pfeil ist die Laufhöhe des MtlA(His)6 angegeben (~60
kDa, Montfort et al., 2001).
102
III. Ergebnisse
Das gereinigte Protein konnte eindeutig als das MtlA(His)6 identifiziert werden.
Unterhalb der ~60 kDa MtlA-Bande sind drei schwächere scharfe Banden zu erkennen,
die möglicherweise aus dem Abbau der zytoplasmatischen Domänen IIB und IIA
stammen. Die untere Bande entspricht dem 34 kDa-Fragment, die von Stephan und
Jacobson (1986) als carboxyterminaler, zytoplasmatischer Teil des EIIMtl identifiziert
wurde. Da das (His)6 carboxyterminal inseriert wurde, geben diese Abbauprodukte
ebenfalls ein Signal. In der Gesamtproteinfraktion wurde kein MtlA(His)6 nachgewiesen,
was für eine effiziente Bindung an die Säulenmatrix spricht.
III.2.4. Ergebnisse der Biotinmaleimid-Markierungen
Ein zweites Gel, dass die identischen Proben 1-4 des immunologischen
Nachweises von MtlA(His)6 enthielt, wurde parallel ebenfalls einem „Western-Blot“
unterzogen,
und
eine
Biotinmaleimid-Markierung
mit
„Streptavidin-Meerrettich
Peroxidase Konjugat“ und anschließendem Chemilumineszens-Nachweis detektiert. Das
an die Sulfhydrylgruppe des Cysteins gebundene Biotinmaleimid zeigte so ein Signal,
wobei die Auswertung der Signale qualitativ erfolgte. In Abbildung III.2.4. sind die
Ergebnisse der Markierungen zusammengefasst. Die mehrfach durchgeführten Versuche
ergaben für die jeweiligen MtlA-Derivate vergleichbare Ergebnisse. Die Auswertungen
setzten Membraninpermeabilität des Biotinmaleimids unter den gewählten Bedingungen
voraus. Unabhängig davon wurde in den Membranvesikeln der Kontrollen zur
allgemeinen Zugänglichkeit der Sulfhydrylreagenzien immer ein negatives Signal bei der
Probe 3 und ein positives bei der Probe 4 angenommen. In jedem Fall sollte das Stilben
bei der Probe 3 nach der Vorinkubation ein weiteres Binden des Biotinmaleimids
verhindern. Ebenso sollte das Biotinmaleimid in der Probe 4 ohne Blockierung der
Cysteine durch Stilben eine Bindung und somit ein positives Signal bewirken.
Dementsprechend bedeuten die fehlenden Signale der Proben 1 und 2 bei den
Markierungen in den ganzen Zellen, dass das untersuchte Cystein im Zytoplasma liegen
muss, da das Biotinmaleimid unabhängig von einer Vorinkubation mit Stilben das
Cystein nicht erreichen und somit auch nicht daran binden kann. Kein Signal bei der
Probe 1 und eines bei der Probe 2 deuten darauf hin, dass das Cystein in dem
Periplasma liegt. In dem Fall ist es für beide Sulfhydrylreagenzien zugänglich, so dass
das gleiche Muster wie bei der allgemeinen Zugänglichkeit zu erwarten ist.
III. Ergebnisse
103
Cys-frei
1
2
3
S3C
4
1
2
S110C
3
4
1 2
A)
A)
A)
B)
B)
B)
S158C
1 2
3
S199C
4
1
2
3
4
1 2
A)
A)
B)
B)
B)
1
2
3
S299C
4
1
2
3
4
S212C
A)
S242C
3
3
4
C384
4
1
A)
A)
A)
B)
B)
B)
2
3
4
Abb. III.2.4. Biotinmaleimid-Markierungen und Nachweise des MtlA(His)6
Die Markierungen sind einmal für die „Einzel-Cysteine“ S110C und S299C, zweimal für die
Mutanten S3C, S158C, S199C, S212C und S242C und dreimal für die cysteinfreie Mutante
([SASS]) sowie die Einzel-Cys384-Mutante ([SACS]) durchgeführt worden. Abgebildet sind die
Filme zu dem Nachweis der Chemilumineszens-Reaktionen. Die jeweiligen Tests sind nach
den relevanten Mutationen betitelt. 1-4: Proben 1-4. Film A) Nachweis der BiotinmaleimidBindung. Film B) Nachweis des MtlA(His)6. Weitere Erläuterungen im Text.
104
III. Ergebnisse
Die Ergebnisse aus den Biotinmaleimid-Markierungen sind in der Tabelle III.2.3.
und den folgenden Erläuterungen zusammengefasst.
Tab. III.2.3. Ergebnisse der Biotinmaleimid-Markierungen
Markierung der
ganzen Zellen
MembranPräparationen
relevante
AS
SB
B
SB
B
(1)
(2)
(3)
(4)
pMMX5-4
Cys-frei
-
-
-
-
pMMX5-41
S3C
-
-
-
+
Zytoplasma
pMMX5-42
S110C
-
-
-
-
n. z.
pMMX5-43
S158C
-
+
-
+
Periplasma
pMMX5-44
S199C
-
+
-
+
Periplasma
pMMX5-45
S212C
-
+
-
+
Periplasma
pMMX5-46
S242C
-
-
-
+
Zytoplasma
pMMX5-47
S299C
-
-
-
-
n. z.
pMMX5-3
C384
+
+
-
+
n. b.
Plasmid
Lokalisation
In der Tabelle sind die eingesetzten Plasmide und die relevanten AS-Austausche
dargestellt. Die Ergebnisse der Markierungen von ganzen Zellen und
Membranpräparationen mit Stilben und Biotinmaleimid (SB) sowie nur mit
Biotinmaleimid (B) sind wie die Proben 1-4 in den Versuchen geordnet (Zahlen in
Klammern). + = Markierung durch Biotinmaleimid. - = keine Markierung durch
Biotinmaleimid. Aus den Markierungen wurden die Lokalisationen der AS oder
andere Schlussfolgerungen abgeleitet. n.z. = nicht zugänglich. n.b. = nicht
bestimmbar.
1. Cys-frei (pMMX5-4): A) Erwartungsgemäß ist bei keiner Probe ein Signal zu
erkennen. Bei den Proben 3 und 4 sind lediglich sehr schwache Banden zu sehen, die
auf unspezifische Anlagerungen des Biotinmaleimid zurückzuführen sind. B) Der
Nachweis des Proteins über das (His)6 zeigt, dass ausreichend Protein vorhanden war.
Mit den gewählten Versuchsbedingungen waren keine unspezifischen Signale zu
erwarten.
2. S3C (pMMX5-41): A) Bei den Proben 1 und 2 ist kein Signal zu erkennen.
Die schwache Bande bei der Probe 1 ist als unspezifisch anzusehen, zumal bei einer
Vorinkubation mit Stilben eher schwächere Banden zu erwarten sind. Die Proben 3 und
4 zeigen eine allgemeine Zugänglichkeit für beide Reagenzien. B) Bei allen Proben war
III. Ergebnisse
105
eine vergleichbare Menge Protein vorhanden. Das Cys3 wurde dem Modell
entsprechend im Zytoplasma nachgewiesen.
3. S110C (pMMX5-42): A) Keine der Proben gab ein Signal. B) Der Nachweis
des Proteins zeigt, dass ausreichend Protein vorhanden war. Daher ist davon
auszugehen, dass das Cys110 zumindest für Biotinmaleimid nicht zugänglich ist. Die
Ursache kann eine unzugängliche Faltung des Proteins oder eine Lokalisation des
Cys110 in einer transmembranen Helix sein.
4. S158C (pMMX5-43): A) In der ersten Probe ist kein und in der zweiten ist ein
Signal zu sehen. Die allgemeine Zugänglichkeit wird mit den Proben 3 und 4 bestätigt.
B) Bei allen Proben war eine vergleichbare Menge Protein vorhanden. Anhand dieser
Ergebnisse liegt das Cys158 im Periplasma.
5. S199C (pMMX5-44): A) In der ersten Probe ist kein und in der zweiten ist ein
Signal zu sehen. Die allgemeine Zugänglichkeit wird mit den Proben 3 und 4 bestätigt.
B) Bei allen Proben war eine vergleichbare Menge Protein vorhanden. Die Ergebnisse
sprechen dafür, dass das Cys199 in einer periplasmatischen Schleife liegen muss.
6. S212C (pMMX5-45): A) Eine schwache Bande ist bei Probe 1 zu sehen und
eine deutliches Signal bei der Probe 2. Ähnlich verhält es sich bei den Proben 3 und 4.
B) Die Proben 1 und 3 enthielten scheinbar mehr Protein als die Proben 2 und 4.
Dadurch lassen sich die schwachen Banden bei den Proben 1 und 3 erklären. Diese
können eindeutig als negativ bewertet werden, wodurch das Cys212 einer
periplasmatischen Schleife zugeordnet werden muss.
7. S242C (pMMX5-46): A) Die Proben 1 und 2 sind negativ, bei einer in den
Proben 3 und 4 gezeigten allgemeinen Zugänglichkeit für die Sulfhydrylreagenzien. B)
Die Probe 1 hatte deutlich weniger Protein als die anderen Proben, beeinträchtigt in
diesem Fall aber nicht das Ergebnis. Das Cys242 liegt dementsprechend im
Zytoplasma.
8. S299C (pMMX5-47): A) Keine der Proben zeigt ein Signal. B) Der Nachweis
des Proteins zeigt, dass bei allen Proben ausreichend Protein vorhanden war. Folglich
ist davon auszugehen, dass das Cys299 zumindest für Biotinmaleimid nicht zugänglich
ist. Die Ursache kann eine unzugängliche Faltung des Proteins oder eine Lokalisation
des Cys299 in einer transmembranen Helix sein.
106
III. Ergebnisse
9. C384 (pMMX5-3): A) Die Proben 1 und 2 zeigen ein Signal, während die
Proben 3 und 4 die allgemeine Zugänglichkeit für Stilben und Biotinmaleimid
bestätigen. B) Bei allen Proben war eine vergleichbare Menge an Protein vorhanden.
Dieses Ergebnis wäre bei einer Membranpermeabilität von Biotinmaleimid zu erwarten.
Dies konnte jedoch in mehreren Versuchen mit den gewählten Bedingungen nicht
gezeigt werden. Eine Erklärung für diese Abweichung könnte eher in der Sonderstellung
des Cys384 liegen. Es ist Teil der Phosphorylierungskette, die dafür verantwortlich ist,
dass das Phosphat von dem PEP auf das D-Mtl übertragen wird (Pas & Robillard,
1988a und 1988b).
IV. Diskussion
107
IV. Diskussion
Beim substratspezifischen Transport über ein EnzymII werden der Transportschritt
und die darauf folgende Phosphorylierung als voneinander unabhängig ablaufende
Reaktionen betrachtet (Lolkema et al., 1990; Lolkema et al., 1991a; Postma et al.,
1993; Lengeler & Jahreis, 1996). Die erfolgreiche Teilung des EII in eine aktive
membrangebundene EIICMtl-Domäne und zwei aktive Phosphatüberträger EIIAMtl und
EIIBMtl zeigten, dass Transport und Phosphorylierung als zwei aufeinander folgende
Prozesse zu sehen sind, die voneinander getrennt werden können (Grisafi et al., 1989;
Lolkema et al., 1990). Unphosphorylierte EII transportieren ihr Substrat nicht in
Mengen, die Wachstum ermöglichen (Postma & Stock, 1980). Folglich müssen
Transport und Phosphorylierung gekoppelt sein. Das EIICMtl kann als isolierter
Transporter seine Substrate mit normaler Affinität binden (Grisafi et al., 1989; Briggs et
al., 1992) und einen aktiven transmembranen Transporter bilden (Lolkema et al.,
1990), aber das hochaffine D-Mannitol (KMapp 1-2µM) nicht transportieren. Dagegen
wird das niedrigaffine C5-Isomer D-Arabinitol (KMapp ≥ 500µM) in einer für das
Wachstum ausreichenden Menge durch EIICMtl transportiert (Klawitter, 1992; Otte et
al., 2003). Die Stärke der Kopplung von Transport und Phosphorylierung scheint durch
die Affinität der Bindestelle zum Substrat beeinflusst zu werden (Otte, 2000, Otte et al.
2003). In ∆ptsHI-Stämmen von Salmonella enterica serovar typhimurium und
Escherichia coli wurden Mutanten isoliert, die durch erleichterte Diffusion freie Glucose
über das EIIGlc aufnehmen konnten (Postma, 1981; Ruijter et al., 1992). Das Wachstum
konnte in diesen Mutanten mit einer ATP-abhängigen Glukokinase ermöglicht werden.
Transport und Phosphorylierung des Substrats waren demnach entkoppelt. Alle
mutierten EIIGlc zeigten eine stark verringerte Affinität für Glukose (≥100fach). Die
erfolgreiche Isolierung von diversen entkoppelten EIIGlc- und EIIMtl-Mutanten (EIIGlc:
Postma, 1981; Ruijter et al., 1990; Ruijter et al., 1992. EIIMtl: Klawitter, 1992; Scholle,
1993; Heuel, 1997; Otte, 2000; Turgut, diese Arbeit) ist ein weiterer Beweis dafür,
dass diese Kopplung nicht als strikt anzusehen ist. Ein Transport ohne gleichzeitige
Phosphorylierung ist scheinbar immer dann möglich, wenn ein geeignetes niedrigaffines
Substrat durch das EIIC transportiert werden soll, oder Mutationen die Affinität des
108
IV. Diskussion
Transporters für das hochaffine Substrat verringern. Um den Mechanismus der
Entkopplung weiterführend untersuchen zu können, wurden in dieser Arbeit entkoppelte
Mutanten mit verschiedenen Systemen isoliert.
IV.1. Für Transport und Phosphorylierung relevante AS
im EIICMtl
Von 30 untersuchten entkoppelnden Mutationen zeigten 15 den Austausch
E218A, eine den Austausch E218V und 14 den Austausch H256P. Untersuchungen von
Otte (Otte, 2000; Otte et al., 2003) ergaben weitere 40 aus K. pneumoniae, die die
Austausche E218A (16 Mutanten), H256P (21 Mutanten) und H256Y (3 Mutanten)
zeigten. Dadurch ergeben sich vier Substitutionen in zwei Aminosäuren, die eine
Entkopplung hervorrufen und sowohl in dem verkürzten (EIIC) als auch dem
vollständigen (EIICBA) MtlA zusammen mit DalD ein Wachstum auf D-Mannitol
ermöglichen (Tab. III.1.23.). Im Rahmen der Untersuchungen konnten keine
Unterschiede der Mutationsarten in Abhängigkeit des Selektionssystems beobachtet
werden. Weder die Selektionstemperatur, noch die Selektion mit vollständigem oder
verkürztem mtlA ergaben abweichende Mutationen. Lediglich das seltene Auftreten des
Austausches E218V konnte festgestellt werden. Die Tatsache, dass das Vorhandensein
der Domänen EIIA und EIIB keine Auswirkungen auf die Art der Mutationen hatte,
unterstützt die Feststellung, dass EIIC die für Bindung und Transport entscheidende
Domäne ist.
IV.1.1. Vergleich der Mutationen E218A, E218V und H256P
Anhand der in der Tabelle III.1.23. zusammengefassten Daten lassen sich
folgende Beobachtungen machen. Alle drei AS-Austausche (E218A, E218V und
H256P) führen zu einer Entkopplung des Transports von D-Mtl. In einem
phosphorylierten EIIMtl (IICBA) ist jedoch der Anteil des gekoppelten Transports sehr
verschieden. Das verbesserte Wachstum in Anwesenheit von DalD ist ein Hinweis
darauf, dass unphosphoryliertes D-Mtl in die Zelle transportiert wird und erst von einer
Dehydrogenase genutzt werden kann. Dieser Anteil ist beim Derivat mit dem Austausch
E218A am geringsten. Die Generationszeit auf D-Mtl wird jedoch um ca. 40% reduziert
und die spezifische Phosphorylierungsaktivität liegt im Bereich des WT. Der KMapp
IV. Diskussion
109
entspricht ebenfalls WT-Werten, lediglich V ist auf etwa 25% reduziert. Die TransportWerte waren jedoch nicht reproduzierbar und wurden in anderen Systemen gemessen.
Die starke Abhängigkeit der Transportmessungen von Vektor und Stamm (Teil III.1.5.3.
/ Tab. III.1.22.) zeigt, dass ein exakter Vergleich der einzelnen Messungen nur in
identischen Systemen möglich ist. Für diese Arbeit wird deshalb bei EIIMtlE218A von
einem
erhöhten
KM-Wert
außerhalb
der
Messbarkeit
und
einer
Phosphorylierungsaktivität im Bereich des WT ausgegangen. Deutlich größer ist der
Anteil an freiem D-Mtl bei E218V. Die Reduktion der Generationszeit liegt bei 52 bis
70% und die spezifische Phosphorylierungsaktivität erreicht nur noch ca. 12% des WT.
Der gekoppelte Transport ist nicht mehr messbar. Bei den Austauschen E218A und
E218V sieht man vergleichbare Effekte, die lediglich in Ihrer Intensität bei E218V stärker
sind. Bei dem Austausch H256P fällt sofort die nicht mehr zum Wachstum auf D-Mtl
ausreichende Phosphorylierung (<1% im Vergleich zum WT) auf. Ein Wachstum auf
Grund eines gekoppelten Transports ist nicht mehr möglich und auch mit DalD wird
lediglich eine Gt von 220-345min auf D-Mtl gemessen. In einem Vergleich mit den
vorher genannten MtlA-Derivaten kann man den Austausch H256P als neue Klasse für
die Entkopplung des Transports sehen oder als weitere Verstärkung der vorher
beobachteten Effekte beschreiben. Die in K.-pneumoniae charakterisierten Mutationen
der AS H256 (H256P und H256Y. Otte, 2000; Otte et al., 2003) zeigten im
Gegensatz zu der hier beschriebenen Mutante immer noch Phosphorylierungsaktivität in
einem vollständigen MtlA. Das K. pneumoniae-Derivat mit der Substitution H256P liegt
im Vergleich zum WT bei 14%, das mit dem Austausch H256Y jedoch noch bei nahezu
100%. Möglicherweise kann dies auf unterschiedliche Grade der Entkopplung
zurückgeführt werden, die durch die Messungen der Bindeaktivität nicht differenziert
werden konnten. Bei dem Vergleich von AS-Austauschen an zwei unterschiedlichen
Stellen des Proteins sollte man aber auch völlig abweichende Mechanismen der
Entkopplung in Betracht ziehen. Die Konzentration der isolierten AS-Substitutionen auf
zwei Stellen im Protein weist jedoch auf eine maßgebliche Beteiligung der AS 218 und
256 an dem Transport oder an der Substraterkennung hin. Kombiniert man die
entkoppelnden AS-Austausche der AS218 und AS256, so schaltet man jeglichen
Transport und Phosphorylierung aus. Hier besteht allerdings noch die Möglichkeit, dass
durch die Doppelmutationen das Protein nicht mehr mit der richtigen Faltung in der
110
IV. Diskussion
Membran
vorliegt.
Dass
es
in
der
Membran
zu
finden
ist,
zeigten
die
Überexpressionsgele der Vesikel (Abb.III.1.6.).
Auf der Suche nach Suppressormutationen mit den Mutanten P256 und
A218/P256 ergab die natürliche Selektion nur Mutationen kodierend für die AS256.
Dies kann ein Hinweis darauf sein, dass unter den gewählten Bedingungen keine
Suppressormutationen selektioniert werden können. Ebenfalls möglich ist, dass eine
essentielle Funktion der AS256 keine Suppressormutationen erlaubt. Wachstum mit
gekoppeltem Transport wurde bei A218/P256 durch die Austausche P256A und
P256Q wiederhergestellt. Aufgrund der noch vorhandenen Substitution E218A zeigten
Zellen mit diesen Kombinationen noch Wachstum mit entkoppeltem Transport. Jedoch
war das Wachstum sowohl mit gekoppeltem als auch entkoppeltem Transport
schwächer als bei einem alleinigem E218A-Austausch, was an dem ungewollten
zusätzlichen Austausch L229Q liegen kann oder ein Hinweis darauf ist, dass das Alanin
bzw. Glutamin an Position 256 die WT-Aktivität nicht wiederherstellt. Die einzelnen
Austausche Alanin, Glutamin sowie Serin an der AS-Position 256 führten annähernd zur
Wiederherstellung der WT-Eigenschaften. Bei der Substitution H256A wurden auch von
Weng et al. (1992) nach einem gezielten AS-Austausch keine signifikanten Unterschiede
der Transport- und Phosphorylierungsaktivitäten festgestellt. Daraufhin wurde diesem
Histidinrest keine besondere katalytische Funktion im EIIMtl zugesprochen. Ein Glutamin
an dieser Position führte ebenfalls zu keinen nennenswerten Veränderungen, bei einem
Serin fällt lediglich der niedrige V-Wert auf. Wie schon im Ergebnisteil beschrieben
(III.1.5.3.) wurden bei KM-Messungen mit MtlA*H256S auch nichtlineare Kinetiken
beobachtet. Tests mit unterschiedlichen Versuchsansätzen konnten jedoch nicht
darlegen, auf Grund welcher Parameter lineare und nichtlineare Kinetiken auftreten.
Variierende MtlA-Konzentrationen innerhalb der Testkulturen waren auszuschließen,
jedoch könnte der Grund in einer Beeinflussung der Dimerisierung von MtlA liegen
(Lolkema, pers. Mitteilung). Möglicherweise liegt so bei hohen Konzentrationen eine
erleichterte Diffusion vor, welche der grünen Gerade in der Abb.IV.1. entsprechen
würde. Eine Bindestelle für geringe Konzentrationen könnte durch eine erhöhte Affinität
die rote Gerade hervorrufen, was einem reduzierten V-Wert und KM-Wert entspräche. In
jedem Fall spiegelt sich der reduzierte V-Wert bei den linearen Messergebnissen wieder.
Sollte in Fällen linearer Messergebnisse die Dimerisierung nicht gestört sein, würde
auch eine Reduktion des KMapp-Werts durch Diffusion entfallen.
IV. Diskussion
111
LGS322/pDSM2 [P256S]
0.6
1/V [nM]
P256S
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-0.1
-0.5
1/S [µM]
0
0.5
1
1.5
2
2.5
Abb. IV.1. Interpretation der nichtlinearen Kinetik von LGS322/pDSM2
Die Abbildung zeigt die Messpunkte einer nichtlinear verlaufenden KMappMessung. Die rote und die grüne Linie deuten zwei unterschiedliche Kinetiken
an, die sich zu den abgebildeten Punkten überlagern.
Folglich könnte diese Mutation sowohl die Affinität der Bindestelle, als auch die
Verbindung der Monomere beeinflussen. Diese Beobachtungen sind ein weiteres Indiz
dafür, dass es sich bei H256, wie bei E218, durchaus um katalytisch und/oder
strukturell relevante AS handelt. Die Ergebnisse der Suche nach Suppressormutanten
bestärken durch das ausschließliche Vorkommen von AS-Austauschen in der der AS256
diese Aussage. Allerdings besitzt das MtlA*H256P aus K.-pneumoniae noch genügend
Phosphorylierungsaktivität, um ein Wachstum ohne DalD zu ermöglichen (Otte, 2000).
Die Ursache für diese Abweichung kann in den unterschiedlichen Stammhintergründen
und Vektoren liegen, so wie es im Ergebnisteil für die Variante E218A beschrieben
worden
ist
(Teil
III.1.5.3.
/
Tab.
III.1.22.).
Denkbar
ist
auch
eine
AS-
Sequenzabweichung in MtlAK.ipn. außerhalb der AS256, welche zu einem anderen
Phänotypen führt, da der Austausch H256P in E.-coli die Phosphorylierungsaktivität fast
vollständig verhindert. Im Vergleich zu dem MtlA aus E.vcoli (637AS) weist MtlA aus K.pneumoniae (635AS) 94% identische Aminosäuren auf. Dieser Wert steigt für die
Transportdomäne EIIC (AS 1-360) auf 96% (siehe Abb. IV.2.).
112
Ec
Kp
IV. Diskussion
1
TM1
TM2
70
MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNI GAFIAWGIITALFIPTGWLP NETLAK LVGPMITYLLPLLIGYTGG K
MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNI GAFIAWGIITALFIPTGWLP NETLAK LVGPMITYLLPLLIGYTGG K
Kon XSSXIKVKVQXFGRFLSNMVMPNI GAFIAWGIITALFIPTGWLP NETLAK LVGPMITYLLPLLIGYTGG K
Ec
Kp
140
LVGGERGGVVGAITTMGVIVGADMPMFLGSMIAGPLGGWCIKHFDRWVDGKIKSGFEMLVNNFS AGIIGM
LVGGERGGVVGAITTMGVIVGADMPMFLGSMIAGPLGGYCIKKFDNWVDGKIKSGFEMLVNNFS AGIIGM
Kon LIGGERGGVVGAIATMGVIVGADIPMFLGAMIXGPLGGWLIKKFDKXVDGKIKSGFEMLVNNFS AGIIGM
Ec
Kp
TM3
TM4
210
ILAILAFLGIGPIV EALSKMLAAGV NFMVVHDMLPLASIFVEPA KILFLNNAINHGIFSPLGIQQSHELG
ILAILAFLGIGPAV EVLSKILAAGV NFMVAHDMLPLASIFVEPA KILFLNNAINHGIFSPLGIQQSHELG
Kon ILAILAFXGIGPVV XXLSKXLAAGV EXIVXXXLLPLASIFVEPA KILFLNNAINHGIFSPLGIQQXXEXG
Ec
Kp
280
KSIFFLIEANPGPGMGVLLAYMFFGRGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHEIYFPYVLMNPRLIL AVILGGMTG
KSIFFLIEANPGPGMGVLLAYMFFGRGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHEIYFPYVLMNPRLIL AVILGGMTG
Kon KSIFFLIEANPGPGLGVLLAYMLFGKGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHEIYFPYVLMNPRLIL AVIAGGMTG
Ec
Kp
TM5
TM6
350
VFTLTILGGGL VSPASPGSILAVLAMTPKGAYF ANIAGVCAAMAVSFVVSAIL LKTSKVKEEDDIEAATR
VFTLTILNGGL VSPASPGSILAVLAMTPKGAYF ANIAAIIAAMAVSFVVSAVL FKTSKVKERSDIEAATR
Kon. VFTLTILNAGL VAPASPGSIIAVLAMTPKGAYL AVLAGVXVAAAVSFVVSAII LKTSKXXEEDDIEAATR
Ec
Kp
360...
RMQDMKAESK...
RMHDMKAESK...
Kon RMXXMKAXSK
Abb. IV.2. Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen aus E. coli und K. pneumoniae
Dargestellt sind die abgeleiteten EIIC-Aminosäuresequenzen der Gene mtlA aus Escherichia coli
K12 (Ec) (Lee & Saier, 1983) und Klebsiella pneumoniae (Kp) (Otte, 2000) und die
Konsensussequenz (Kon) aus einem Vergleich mit weiteren MtlA-Sequenzen (siehe Abb. IV.3.).
Die identischen AS aus der Konsensussequenz sind gelb unterlegt. Vermutete transmembrane
Helices (TM) sind eingerahmt und nummeriert. Abweichungen in den beiden Sequenzen sind
grau oder orangefarben hervorgehoben, dabei markiert Orange die Austausche, die relevant
sein könnten (weiteres siehe Text und Abb. IV.3.).
Im Bereich von EIIC gibt es 16 voneinander abweichende AS. Konservative ASAustausche (AS 318, 319, 332) und Austausche in Aminosäuren, die in der
Konsensussequenz verschiedener MtlA (Abb. IV.3.) keine Berücksichtigung finden (AS
156, 160, 170, 320, 353) haben mit geringerer Wahrscheinlichkeit Auswirkungen auf
IV. Diskussion
113
das Transportverhalten. Danach bleiben acht Aminosäuren (109, 113, 116, 153, 288,
334, 342, 343), die am ehesten für veränderte katalytische Merkmale verantwortlich
sein könnten, ohne die übrigen Aminosäuren völlig auszuschließen. Es fällt aber auf,
dass in dem hoch konservierten Bereich zwischen TM4 und TM5 keine Austausche zu
finden sind. Für eine genaue Beurteilung der unterschiedlichen Phänotypen sind weitere
Untersuchungen der Stammhintergründe, Vektoren und der hier benannten ASAustausche erforderlich.
IV.1.2. Die AS 218 und 256 im Translokationsmodell
Für die in dieser Arbeit näher untersuchten AS218 und AS256 lässt sich
feststellen, dass unterschiedliche Aminosäuren an diesen Stellen unterschiedliche
Einflüsse auf den gekoppelten Transport, die Phosphorylierung und Bindung haben.
Beide Aminosäuren liegen nach dem aktuellen Strukturmodell in der hochkonservierten
Schleife 5 (Abb.IV.3. und IV.5.) und sind in den MtlA-Sequenzen konserviert. Das H256
liegt zudem in dem GIHE-Motiv, welches aufgrund der sehr starken Konservierung
schon vorher als essentiell angesehen wurde (Lengeler, 1990). In einem Modell für den
katalytischen Mechanismus von EIIMtl (Lolkema et al., 1991a; 1992) wird eine Kopplung
zwischen
Transport
und
Phosphorylierung
mit
einer
Rate
<50%
festgelegt.
Untersuchungen mit Vesikelpräparationen des EIIMtl zeigten, dass freies und
phosphoryliertes D-Mannitol mit gleicher Wahrscheinlichkeit von der Bindestelle
freigesetzt werden (Lolkema et al., 1991b). Diese in vitro gemachten Beobachtungen
widersprechen
den
Ergebnissen
aus
in
vivo
Untersuchungen.
Anhand
dünnschichtchromatographischer Versuche konnte kein freies D-Mannitol nach einem
Transport durch EIIMtl nachgewiesen werden (Otte, 2000). Das geringe Vorkommen von
freiem D-Mtl wurde auf einen schwachen Transport durch das Gut-PTS sowie der
Hydrolyse von Mtl1P zurückgeführt. Untersuchungen mit EIIMtl und EIIMtl+DalD zeigten
dementsprechend keine relevanten Unterschiede im Wachstum von Zellen auf D-Mtl
(Tab.
III.1.23.).
Allerdings
könnte
das
freie
D-Mtl
sofort
wieder
an
der
Membraninnenseite gebunden und phosphoryliert werden, was mit den genannten
Methoden nicht nachweisbar wäre. Ist dagegen die interne Phosphorylierung
beeinträchtigt, steigt der Anteil des freien Substrates in der Zelle. Der resultierende
Anteil unphosphorylierten Substrats ist dadurch von der Phosphorylierungsaktivität bzw.
der Affinität der intrazellulären Bindestellen des EIIMtl-Komplexes abhängig. So zeigt sich
114
IV. Diskussion
bei den Mutationen dieser Arbeit, dass die am stärksten entkoppelten MtlA-Varianten
die geringste Phosphorylierungsaktivität zeigten (Tab. III.1.23.). Ähnliche Effekte wurden
auch bei den entkoppelten Derivaten aus EIIGlc beobachtet. Die entkoppelten EIIGlcMutanten zeigten eine Phosphorylierungsaktivität, die 0 bis 100% des Wildtyps
entsprach (Ruijter et al., 1992). Eine direkte Beziehung zu den KM-Werten der
verschiedenen Proteine zeigte sich hier jedoch nicht.
Abb. IV.3. Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen verschiedener Stämme
K12
O157:H7
CFT073
S.fle
S.ent
K.pne
Y.pes
V.cho
P.mul
C.ace
S.mut
L.lac
S.car
B.hal
B.ste
B.sub
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
1
70
----------MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETLAK-LVGPMITYL
----------MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETLAK-LVGPMITYL
----------MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETLAK-LVGPMITYL
----------MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETLAK-LVGPMITYL
----------MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETLAK-LVGPMITYL
----------MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETLAK-LVGPMITYL
---------MFSPDAKVRVQNFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETLAK-LVGPMITYL
---------MISSDAKVKIQNFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGFITALFIPTGWVPNETLAS-LVGPMITYL
MVILSTRLTMLSANAKVKVQNFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGFITALFIPTGWLPNETLAK-LVGPMITYL
METYKDSTQVSKSSLKKKIQGFGGFLSGMVMPNIGAFIAWGLITALFIKTGWLPNDNLSK-LVDPMIHYM
--------MERKSSLKVRVQKLGTSLSNMVMPNIGAFIAWGVAASLFIATGYLPNKALDTNVVGPMNKYV
--------MTDTVSLKVRVQKLGTALSNMVMPNIPVLIAWGVLTMFFIPDGFTPNKTFAA-MVSPMLPFL
-----MSNSQQNKGIGRKVQAFGSFLSSMIMPNIGAFIAWGFIAAIFIDNGWFPNKDLAQ-LAGPMITYL
--------MNNQPSFRARVQKFGSFLSGMIMPNIGAFIAWGLITALFIPTGWWPNEQLAE-LVGPMITYL
----MTHTSENQAGFRVKIQRFGSYLSGMIMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETFAK-LVGPMITYL
----MQQQEQQQGGMKVKVQRFGSYLSGMIMPNIGAFIAWGIITALFIPAGWFPNEQLNT-LVSPMITYL
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxTM1xxxxxxxx xxxxxxx xxxxxTM2x
Kons
(1) MVTYMXXXXXXSSXIKVKVQXFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETLAKNLVGPMITYL
K12
O157:H7
CFT073
S.fle
S.ent
K.pne
Y.pes
V.cho
P.mul
C.ace
S.mut
L.lac
S.car
B.hal
B.ste
B.sub
(60)
(60)
(60)
(60)
(60)
(60)
(61)
(61)
(70)
(70)
(63)
(62)
(65)
(62)
(66)
(66)
71
140
LPLLIGYTGGKLVGGERGGVVGAITTMGVIVGA------------DMPMFLGSMIAGPLGGWCIKHFDRW
LPLLIGYTGGKLVGGERGGVVGAITTMGVIVGA------------DMPMFLGSMIAGPLGGWCIKHFDRW
LPLLIGYTGGKLVGGERGGVVGAITTMGVIVGA------------DMPMFLGSMIAGPLGGWCIKHFDRW
LPLLIGYTGGKLVGGKRGGVVGAITTMGVIVGA------------DMPMFLGSMIAGPLGGWCIKHFDRW
LPLLIGYTGGRLVGGERGGVVGAITTMGVIVGA------------DMPMFLGSMIAGPLGGYCIKKFDSW
LPLLIGYTGGKLVGGERGGVVGAITTMGVIVGA------------DMPMFLGSMIAGPLGGYCIKKFDNW
LPLLIGFTGGRLVGGDRGGVVGAITTMGVIVGA------------DMPMFLGAMIVGPLGGWAIKHFDRW
LPLLIGYTGGKLAGGERGAVVGAITTMGVIVGT------------DIPMFMGAMIVGPMGGWAIKAFDKK
LPLLIGYSGGKLIAGERGAVVGAIATAGVIVGT------------DIPMFLGAMIAGPTGGWAIKRFDKW
LPMLIGYQGGKLVYDTRGGVVGAIATMGMIVGA------------SIPMFLGGMIIGPLGGYVIKKFDKA
LPLLIGYTGGYNIHKQRGGVIGAIASFGAIAGS------------TVTMFIGAMIMGPLSAWILKKFDEK
IPLMIGYTGGKNIYEHRGGVVGAIATFGSIIATASISVGGLNAKGNVPMILGAMILGPFGAWLIKKFDEY
IPLLIAFSGGRLIHDLRGGIIAATATMGVIVALP-----------DTPMLLGAMIMGPLVGWLMKKTDEF
LPLLIGYTGGKMIYDVRGGVVGAAATMGVVVGA------------DIPMFIGAMIMGPLGGFLIKKVDQV
LPLLIGYTGGKMIYDVRGGVVGATATMGVIVGS------------DIPMFLGAMIMGPLGGYLIKKFDQQ
LPLLIAYTGGKMIYDHRGGVVGATAAIGVIVGS------------DIPMFLGAMIMGPLGGYLIKQTDKL
xxxxxxxxxxxxxx xTM2xxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
Kons
(71) LPLLIGYTGGKLIGGERGGVVGAIATMGVIVGAPSISVGGLNAKGDIPMFLGAMIXGPLGGWLIKKFDKX
IV. Diskussion
K12
O157:H7
CFT073
S.fle
S.ent
K.pne
Y.pes
V.cho
P.mul
C.ace
S.mut
L.lac
S.car
B.hal
B.ste
B.sub
(118)
(118)
(118)
(118)
(118)
(118)
(119)
(119)
(128)
(128)
(121)
(132)
(124)
(120)
(124)
(124)
115
141
210
VDGKIKSGFEMLVNNFSAGIIGMILAILAFLGIGPIVEALSKMLAAGVNFMVVHDMLPLASIFVEPAKIL
VDGKIKSGFEMLVNNFSAGIIGMILAILAFLGIGPIVETLSKMLAAGVNFMVVHDMLPLASIFVEPAKIL
VDGKIKSGFEMLVNNFSAGIIGMILAILAFLGIGPVVEALSKMLAAGVNFMVVHDMLPLASIFVEPAKIL
VDGKIKSGFEMLVNNFSAGIIGMILAILAFLGIGPIVEALSKMLAAGVNFMVVHDMLPLASIFVEPAKIL
VDGKIKSGFEMLVNNFSAGIIGMILAILAFLGIGPAVEVLSKILAAGVNFMVAHDMLPLASIFVEPAKIL
VDGKIKSGFEMLVNNFSAGIIGMILAILAFLGIGPAVEVLSKILAAGVNFMVAHDMLPLASIFVEPAKIL
VEGKIKSGFEMLVNNFSSGIIGMLLALLAFMAIGPLVEVLSKGLAYGVDVMVQNNLLPLASIFVEPAKIL
IDGKVRSGFEMLVNNFSAGIIGMLCAIIAFFLIGPFVKVLSGALAAGVNFLVTAHLLPLTSIFVEPAKIL
ADGKIKSGFEMLVNNFSSGIIGMILAILFFWLIGPAVKALSTMLAAGVDILVKAHLLPLTSIFVEPAKIL
IENKIPTGFEMLVNNFSAGILGAALAIISYVAVGPVVAGASTGLGSIALAITNQGLLPLIAVVVEPAKIL
VQPKIRTGFEMLVNNFSLGLIGFALMVLAFFVIGPVVAQLTEWVGIGVEAIVKVHLLPLANLIIEPAKIL
IQPHIKAGLEMLINNFSAGLVGFGLSLFAVKVVGPLVAWLTDVMGHGVDFLISNHLIPLANLFIEPAKIL
VQPRTPQGFEMLFNNFSAGILGFIMTIFGFEVLAPIMKFIMHILSVGVEALVHAHLLPLVSILVEPAKIV
LQPKVRSGFEMLVNNFSAGILAAILAIVAFLGIGPVVVSFSNVLASGVEVIIGAGLLPLASIFIEPAKVL
IQGKVKQGFEMLVNNFSAGIIGGLLTLAAFKGVGPVVSAISKTLAAGVEKIVDLHLLPLANIFIEPGKVL
FKDKVKQGFGIRINNFTAGIVGAALTILAFYAIGPVVLTLNKLLAAGVEVIVHANLLPVASVFLEPAKVL
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxTM3xxxxxxxxx xxxxxxxxxxx xxxxxxxxTM4xxxxxxxx xxx
Kons
(141) VDGKIKSGFEMLVNNFSAGIIGMILAILAFXGIGPVVXXLSKXLAAGVEXIVXXXLLPLASIFVEPAKIL
211
280
FLNNAINHGIFSPLGIQQSHELGKSIFFLIEANPGPGMGVLLAYMFFGRGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHE
FLNNAINHGIFSPLGIQQSHELGKSIFFLIEANPGPGMGVLLAYMFFGRGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHE
FLNNAINHGIFSPLGIQQSHELGKSIFFLIEANPGPGMGVLLAYMFFGRGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHE
FLNNAINHGIFSPLGIQQSHELGKSIFFLIEANPGPGMGVLLAYMFFGRGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHE
FLNNAINHGIFSPLGIQQSHEMGKSIFFLIEANPGPGMGVLLAYMFFGRGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHE
FLNNAINHGIFSPLGIQQSHELGKSIFFLIEANPGPGMGVLLAYMFFGRGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHE
FLNNAINHGIFSPLGVQQAAETGKSIFFLIEANPGPGLGVLMAYMFFGKGNAKQSAGGAAIIHFFGGIHE
FLNNAINHGIFSPLGIQQASETGQSIFFLIEANPGPGLGILLAYMVFGKGTARQTAGGATIIHFFGGIHE
FLNNAINHGIFSPLGIQQSQEFGQSIFFLIEANPGPGLGVLLAYIIFGKGTAKQTAGGATIIHFFGGIHE
FLNNAINHGVFSPLGIEQVQHLGKSVFFLLEADPGPGLGILLAYSLYGKGSAKNSAPGAVIIHFLGGIHE
FLNNALNHGIFTPLGTEQVAKVGKSVLFLLEANPGPGLGVLIAYAMFGKGSAKSSSWGAMIIHFFGGIHE
FLNNAINQGILSPLGIQQVSENGKSLLFLLEANPGPGLGILIAFMLFGKGSAKATAPGAILIQFVGGIHE
FLNNAINHGVFTPLGADQAAHAGQSILYTIESNPGPGIGVLIAYMIFGKGTAKATSYGAGIIQFFGGIHE
FLNNAINHGILSPIGIDQAASAGKSILFLLETNPGPGLGVLLAFMVFGKGMAKQSAPGAAVIHFAGGIHE
FLNNAINHGILSPLGIEQAAKTGKSILFLLEPNPGPGLGILLAYWLFGKGMAKQSAPGAIIIHFLGGIHE
FLNNAINHGILSPIGIEQASQTGKSILFLVEANPGPGLGIFLAYMFFGKGSSKSTAPGAAIIHFFGGIHE
K12
O157:H7
CFT073
S.fle
S.ent
K.pne
Y.pes
V.cho
P.mul
C.ace
S.mut
L.lac
S.car
B.hal
B.ste
B.sub
(188)
(188)
(188)
(188)
(188)
(188)
(189)
(189)
(198)
(198)
(191)
(202)
(194)
(190)
(194)
(194)
Kons
H195
E218
GIHE
(211) FLNNAINHGIFSPLGIQQXXEXGKSIFFLIEANPGPGLGVLLAYMLFGKGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHE
K12
(258)
O157:H7 (258)
CFT073 (258)
S.fle...(258)
S.ent
(258)
K.pne
(258)
Y.pes
(259)
V.cho
(259)
P.mul
(268)
C.ace
(268)
S.mut
(261)
L.lac
(272)
S.car
(264)
B.hal
(260)
B.ste
(264)
B.sub
(264)
281
350
IYFPYVLMNPRLILAVILGGMTGVFTLTILGGGLVSPASPGSILAVLAMTPK------GAYFANIAGVCA
IYFPYVLMNPRLILAVILGGMTGVFTLTILGGGLVSPASPGSILAVLAMTPK------GAYFANIAGVCA
IYFPYVLMNPRLILAVILGGMTGVFTLTILGGGLVSPASPGSILAVLAMTPK------GAYFANIAGVCA
IYFPYVLMNPRLILAVILGGMTGVFTLTILGGGLVSPASPGSILAVLAMTPK------GAYFANIAGVCA
IYFPYVLMNPRLILAVILGGMTGVFTLTILNGGLVSPASPGSILAVLAMTPK------GAYFANIAAIVA
IYFPYVLMNPRLILAVILGGMTGVFTLTILNGGLVSPASPGSILAVLAMTPK------GAYFANIAAIIA
IYFPYVLMNPRLLLAVILGGMTGVFTLTLLNGGLVSAASPGSILAILAMTPK------GAYFANIAAVAT
IYFPYILMNPRLILAAIAGGMTGVFTLTVFNAGLVSPASPGSIFAVLLMTNK------GSILGVVCSIFA
IYFPYVLMNPRLLLAVIAGGVSGVFTLVLFNAGLVAPASPGSIIAVLLMTPQ------NAIVGVLASVAI
IYFPYVLMKPFLLLAVIAGGICADLTFVLLKAGLVAAASPGSIIAILAMSPK------GGQLPVLAGVAV
IYFPYVMMKPAMFLAVIAGGLTGTFTFQTLGAGLTAPASPGSIIAIMGMSPK----GWGPHLVVLAGVFA
IYFPYVMMKPALFFAVMAGGVSGTLTNNLLGSGLAAPASPGSIIAITGMASGKSAGGFANVLCVWAGIAV
IYFPYVLMRPLLFVSVILGGMTGVATYSLLDFGFKTPASPGSIIVYAINAPK------GEFLHMLTGVVL
IYFPYILMKPTLILAVIAGGMSGVFTFVLFNAGLVAVPSPGSIFALLAMTPR------GEYAGVLAGVII
IYFPYVLMRPILILAAIAGGVSGVLTFTIFDAGLVAVPSPGSIFALLAMTPK------GNYLGVLAGVLV
IYFPYILMKPGPDSRSHCRRSKRTLNITIFNAGLVAAASPGSIIALMAMTPR------GGYFGVLAGVLV
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxTM5xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxTM6x
Kons
(281) IYFPYVLMNPRLILAVIAGGMTGVFTLTILNAGLVAPASPGSIIAVLAMTPKKSAGGWGAYLAVLAGVXV
116
IV. Diskussion
K12
O157:H7
CFT073
S.fle
S.ent
K.pne
Y.pes
V.cho
P.mul
C.ace
S.mut
L.lac
S.car
B.hal
B.ste
B.sub
(322)
(322)
(322)
(322)
(322)
(322)
(323)
(323)
(332)
(332)
(327)
(342)
(328)
(324)
(328)
(328)
351
390...
AMAVSFVVSAILLKTSKVKE-EDDIEAATRRMQDMKAESK...(360)
AMAVSFVVSAILLKTSKVKE-EDDIEAATRRMQDMKAESK...(360)
AMAVSFVVSAILLKTSKVKE-EDDIEAAARRVQEMKAESK...(360)
AMAVSFVVSAILLKTSKVKE-EDDIEAATRRMQDMKAESK...(360)
AMAVSFVVSAILLKTSKVKE-EDDIEAATRRMHDMKAESK...(360)
AMAVSFVVSAVLFKTSKVKE-RSDIEAATRRMHDMKAESK...(360)
AFAVSFVVSAILLKSSKAKDDEEGLEGATRRMQDMKAQSK...(362)
AAAVSFTVAALLMKAQTSTEQDGDKDALVKATSIMQEMKA...(362)
AATVSFVIASFFLKIQ----KEENGHSLEKMQAASKAMKS...(367)
GAIVSFVVASIILKGSKE-KSKDNFEEAQNKMKEMKKESK...(370)
AAVASFLVASIILKSDN--SDDDSLETAQAVTQAAKAESK...(364)
AAIVSFLVAAFILKRDKSMIDDSAFENAKVGVATDKAVSK...(381)
AALVSFVVSALILKFTKDP--KQDLAEATAQMEATKGKKS...(365)
ATVVSFVIASIILKTSKAT--AEDLTEATSKMEGLKGKES...(361)
ATAVSFFVASIFLKSAKNN--EEDITKATEKMQQLKGKKS...(365)
AAAVSFIVSAVILKSSKAS--EEDLAAATEKMQSMKGKKS...(365)
xxxxxxxxxxxxxx xTM6xxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
Kons
(351) AAAVSFVVSAIILKTSKXXEDEDDIEAATRRMXXMKAXSK
Abb. IV.3. Vergleich der EIICMtl AS-Sequenzen verschiedener Stämme
Dargestellt sind die abgeleiteten EIIC-Aminosäuresequenzen der mtlA-Gene folgender
Organismen: K12, Escherichia coli K12 (IICBA; Lee & Saier, 1983); OH157:H7, E. coli
OH157:H7 (IICBA; Hayashi et al., 2001); CFT073, E. coli CFT073 (EIICBA; Welch et al.,
2002); S.fle, Shigella flexneri (IICBA; Jin et al., 2002); S.ent, Salmonella enterica serovar
typhimurium (EIICBA; McClelland et al., 2001); K.pne, Klebsiella pneumoniae (EIICBA; Otte,
2000); Y.pes, Yersinia pestis (EIICBA; Parkhill et al., 2001); V.cho, Vibrio cholerae (EIICBA;
Heidelberg et al., 2000); P.mul, Pasteurella multocida (EIICBA; May et al., 2001); C.ace,
Clostridium acetobutylicum (EIICB, EIIA; Behrens et al. 2001); S.mut, Streptococcus mutans
(EIICB, EIIA; Honeyman & Curtiss III., 2000); L.lac., Lactococcus lactis (Mansour et al., 2001);
S.car, Staphylococcus carnosus (IICB, IIA; Reiche et al., 1988; Fischer et al., 1989; Fischer &
Hengstenberg, 1992); B.hal, Bacillus halodurans (IICB, IIA; Takami et al., 2000); B.ste,
Bacillus stearothermophilus (IICB, IIA; Henstra et al., 1996); B.sub, Bacillus subtilis (IICBA;
Akagawa et al., 1995, geändert nach Henstra et al., 1996). Die Konsensussequenz (Kons)
wurde mit Hilfe des Programms „VectorNTI Suite“ ermittelt. Mit „X“ wurden Bereiche der
Konsensussequenz markiert, in denen keine AS zugeordnet werden konnte. Gruppen ähnlicher
AS wurden farblich hervorgehoben. Konservierte Aminosäuren sind gelb unterlegt. AS, die der
Konsensussequenz entsprechen, sind in Blau, dazu konservative Austausche in Rot dargestellt.
Als konservative Austausche wurden zugelassen: A¥G, D¥E, F¥Y, K¥R, N¥Q, S¥T, und
Austausche innerhalb der Gruppe I¥L¥V. Bei der Gesamtanalyse wurde nur die E.coliSequenz von K12 berücksichtigt, um die Aussage nicht durch drei fast identische E.coliSequenzen zu beeinträchtigen.
Ein weiterer Punkt des Modells besagt, dass nur phosphoryliertes EIIMtl eine
erleichterte Diffusion mit hoher Rate katalysiert. Dies bedeutet, dass der Grad der
Phosphorylierung der IIBAMtl-Domänen die Aktivität der Translokator-Domäne EIICMtl
beeinflusst, indem wahrscheinlich der Translokationsvorgang durch eine drastische
Senkung der Aktivierungsenergie erreicht wird. Das entspricht der Tatsache, dass ein
WT-EIIC nicht dazu in der Lage ist, D-Mtl ausreichend für ein Wachstum zu
transportieren. Dagegen sind in den entkoppelten Mutanten weder Phosphorylierung
IV. Diskussion
117
noch das Vorhandensein der EIIAB-Domänen für einen ausreichenden Transport
notwendig. Der Grund hierfür könnte eine der Phosphorylierung analoge Senkung der
Aktivierungsenergie durch die AS-Austausche sein. Es ist schon länger bekannt, dass
das niedrigaffine C5-Isomer D-Arabinitol (KMapp ≥ 500µM) mit einer hohen Rate
unphosphoryliert sowohl durch das WT- als auch das entkoppelte EIICMtl transportiert
wird,
unabhängig
von
dem
Phosphorylierungszustand
des
EIICMtl
und
dem
Vorhandensein der EIIBAMtl-Domänen (Klawitter, 1992; Scholle, 1993; Otte 2000).
Dies ist vergleichbar mit anderen nicht-PTS-Substraten, welche niedrigaffine StereoIsomere natürlicher PTS-Substrate sind und unphosphoryliert durch EII-Domänen
transportiert werden. Beispiele hierfür ist der Transport von D-Galaktose und Trehalose
durch EIIMan in S. enterica (Postma, 1976; Postma et al., 1986), der Transport von DGalaktose, D-Arabinitol, Ribitol und D-Fruktose durch EIIGlc in E. coli (Kornberg &
Riordan, 1976; Kornberg et al., 2000;; Zeppenfeld et al., 2000) und der Transport von
D-Arabinitol und Xylitol durch EIIGat (Lengeler, pers. Mitteilung). Da auch entkoppelnde
Mutationen oft die Affinität des Transporters zu seinen Hauptsubstraten verringern
(Ruijter et al., 1992; Otte, 2000; diese Arbeit), zeigt sich ein großer Einfluss der Stärke
der Substratbindung auf die Kopplung von Transport und Phosphorylierung (Lengeler et
al., 1994).
Man geht davon aus, dass im WT eine hohe Phosphorylierungsaktivität dazu
führt, dass freies intrazelluläres D-Mtl sofort wieder gebunden und phosphoryliert wird.
Effektiv ist in der Zelle nur D-Mtl-Phosphat vorhanden (Otte, 2000). Wie kann es aber
zum Transport von freiem D-Mtl in die Zelle kommen? Für ein EII-Dimer wird das
Vorhandensein zweier hochaffiner, zur periplasmatischen Seite orientierten Bindestellen
postuliert (Pas et al., 1988; Briggs et al., 1992; Lolkema et al., 1992). Durch die
Bindung
eines
Substrates
an
diese
hochaffine
Bindestelle
könnte
eine
Konformationsänderung induziert werden, die die Bindestelle in einen geschlossenen
Zustand überführt. Danach würde die Umwandlung in eine, dem Zytoplasma
zugewandte, niedrigaffine Bindestelle erfolgen. Bindestudien mit Vesikeln (Lolkema et
al., 1992) und Tryptophan Phosphoreszenz-Studien (Broos et al., 2000) lieferten
Hinweise
auf
solche
substratbindungs-
und
phosphorylierungsabhängige
Strukturveränderungen im EIIMtl.
Nach dem Modell von Lolkema moduliert der Phosphorylierungszustand der
zytoplasmatischen EIIB-Domäne die Aktivität der Translokationsdomäne EIIC (Lolkema
118
IV. Diskussion
et al., 1991b). In vitro Untersuchungen hatten gezeigt, dass sich die Transportrate in
Anwesenheit von Phospho-IIB drastisch erhöht (Elferink, et al., 1990; Lolkema et al.,
1991a). Demnach bewirke die Phosphorylierung von IIB eine Verringerung der
Aktivierungsenergie für den eigentlichen Translokationsschritt, also die Umlagerung der
geschlossenen in die niedrigaffine Bindestelle. Die Phosphorylierung von IIB würde
damit zu einer signifikanten Steigerung der Isomerisierungsrate der Bindestelle und
somit zum Anstieg der Transportraten führen. Nach diesem Modell wäre entkoppelter
Transport in einem nicht phosphorylierten oder isolierten EIIC nicht denkbar.
Nach dem Modell von Lengeler (Lengeler et al. 1994) gibt es im EIIMtl eine
Bindestelle mit drei Zuständen (hochaffin / geschlossen / niedrigaffin) zwischen denen
umgeschaltet werden kann. Das Substrat wird außen mit hoher Affinität gebunden und
nach einer durch die Substratbindung induzierten Konformationsänderung, die zu einer
Umlagerung der Bindestellen in einen „geschlossenen“ Zustand führt, erfolgt in einem
zweiten Schritt die Phosphorylierung des gebundenen Substrates. Die Affinität der
Bindestelle für das phosphorylierte Substrat ist so gering, dass es nun freigesetzt werden
kann. Somit würde durch die Phosphorylierung nicht die Mobilisierung der Bindestelle,
sondern das Ablösen des hochaffinen Substrates von der Bindestelle beschleunigt. Die
Ergebnisse aus in vitro Untersuchungen in Vesikeln weisen hingegen darauf hin, dass
freies und phosphoryliertes D-Mannitol mit gleicher Wahrscheinlichkeit von der
Bindestelle freigesetzt wird (Lolkema et al., 1991b). Die Durchlässigkeit von Vesikeln für
D-Mtl stellt jedoch ein Problem bei der Auswertung der Ergebnisse dar. In vivo
durchgeführte DC- und Wachstumsuntersuchungen haben gezeigt, dass nach dem
Transport von D-Mtl über EIIMtl das intrazelluläre Verhältnis von Substrat : SubstratPhosphat ganz auf der Seite des phosphorylierten Substrates liegt (Otte, 2000; diese
Arbeit). Für eine im Transport entkoppelte Mutante wäre in dem Lengeler-Modell
denkbar, dass die Affinität der Bindestelle durch den AS-Austausch grundsätzlich
herabgesetzt und freies D-Mtl in die Zelle abgegeben wird.
Unterschiedliche Klassen von Mutationen könnten durch zwei Faktoren
entstehen: 1. Die Stärke bzw. Schwäche der Bindestellen-Affinität und 2. Die Stärke der
internen Phosphorylierung des freien D-Mtl. Anhand der in dieser Arbeit ermittelten
Generationszeiten (Tab III.1.23.) wird deutlich, dass das Wachstum von Zellen auf DMtl mit EIIMtlE218A und DalD verbessert wird, was wiederum auf intrazelluläres freies DMtl hinweist. Das Transporttests mit den E218A-Derivatern nicht reproduzierbar waren,
IV. Diskussion
119
ist ein Hinweis darauf, dass der Austausch E218A im vollständigen EIIMtl den WTPhänotyp nicht wiederherstellt. Dennoch war eine hohe Phosphorylierungsrate messbar.
Bei diesem Protein ist die Entkopplung durch ein Herabsetzen der Bindestellen-Affinität
entstanden, wobei die Phosphorylierungsaktivität nicht eingeschränkt war. Ähnlich
verhält es sich bei MtlA*E218V, welches Zellen mit DalD fast eine WT-Generationszeit
auf D-Mtl vermittelt, aber nur noch 10% der Phosphorylierungsaktivität. Hier scheinen
beide Faktoren für eine Entkopplung vorzuliegen. In der Mutante H256P scheint die
Affinität der Bindestelle nicht wie bei E218A oder E218V herabgesetzt zu sein. Das
Wachstum von Zellen mit DalD ist im Vergleich mit beiden Mutanten schwächer und
eine Phosphorylierungsaktivität ist kaum mehr vorhanden. Dies weist auf eine stärkere
Entkopplung auf der Ebene der internen Phosphorylierung des freien D-Mtl hin.
In der Arbeit von Otte (2000) wurden entkoppelte Transporter aus
K.vpneumoniae und E. coli, sowie plasmidkodierte entkoppelte EIIGlc-Mutanten, die sich
bezüglich ihrer KM-Werte und der Phosphorylierungsaktivitäten unterscheiden (Ruijter et
al., 1992; Weng et al., 1992; Saraceni-Richards & Jacobson, 1997; Kessels, 1999),
beschrieben.
EIIMtlE218AK.pn., EIIMtlH195N, EIIMtlE257D, EIIGlcV206A und EIIGlcR203S
zeigen eine hohe Phosphorylierungsaktivität, der KM-Wert ist nicht deutlich erhöht und in
Anwesenheit von EIIBC~P findet kein entkoppelter Transport statt.
EIIMtlH256YKK.pn.,
Phosphorylierungsaktivität,
EIIMtlH195A
einen
und
erhöhten
EIIGlcI296N
KM-Wert
und
haben
gekoppelten
noch
sowie
entkoppelten Transport. Die in dieser Arbeit beschriebenen Mutationen EIIMtlE218AE.coli
und EIIMtlE218VE.coli zeigen entsprechende Werte und scheinen ähnliche Auswirkungen
auf den gekoppelten Transport zu haben.
Die Mutationen EIIMtlH256PxK.pn., EIIMtlE257A, EIIMtlE257Q und EIIGlcK257N
vermitteln wie die Mutation EIIMtlH256PxE.coli drastisch verringerte bzw. nicht vorhandene
Phosphorylierungsaktivitäten und erhöhte KM-Werte.
Auch bei der Selektion von Mutanten mit entkoppeltem EIIGlc aus Salmonella
typhimurium (Postma, 1981; Ruijter et al., 1991) sowie E. coli (Ruijter, 1992) wurde in
Pts--Stämmen einige gefunden, die sich durch einen erhöhten KM-Wert auszeichneten.
Die Isolierung weiterer Mutanten und die Untersuchung der Phänotypen mit den
Haupt- und Nebensubstraten sind für eine weiterführende Aufklärung des gekoppelten
120
IV. Diskussion
und entkoppelten Transports notwendig. Dabei müssen weiterhin die einzelnen
Komponenten aus Transport, Bindung, KM-Wert und Phosphorylierungsaktivität in
Zusammenhang gebracht werden. Die dafür benötigten Methoden sind in dieser Arbeit
beschrieben worden und sollten durch die von Otte (2000) durchgeführten
dünnschichtchromatographischen Versuche erweitert werden. Damit ist eine weitere
Methode gegeben, relativ einfach die Verhältnisse zwischen phosphoryliertem und
unphosphoryliertem Substrat darzustellen. Auch die Klassifizierung der PTSs neben den
ionenabhängigen Sym- und Antiportern sowie den ATP-abhängigen ABC-Transportern
ist zu überdenken. Unter Berücksichtigung der beschriebenen Untersuchungen werden
im Transportvorgang immer mehr Ähnlichkeiten mit den sehr substratspezifischen,
erleichterte Diffusion vermittelnden Uniportern und sogar den ABC-Transportern
deutlich (Lengeler et al., 1994). Bei den ABC-Transportern wird die freie Energie des
ATPs dazu verwendet, die Energiebarriere des an die hochaffine Bindestelle
gebundenen Substrats zu verringern und unter Bildung von ADP und Phosphat das
Substrat in der Zelle anzuhäufen (Davidson, 2002). Die Energiebarriere eines im EII
gebundenen Substrats muss ebenfalls durch die hohe freie Energie eines His~P oder
Cys~P verringert werden, wobei hier die Phosphorylgruppe direkt auf das Substrat
übertragen wird. Dies ermöglicht eine bessere Energieausbeute und eine nahezu
irreversible Anhäufung von Substrat~P.
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen bei der Suche nach Mutanten die
Fokussierung auf konservierte Bereiche im EIIMtl, insbesondere in der im Vergleich zum
gesamten EIIC (26%x=xkonserviert, 39%x=xkonserviert +xkonservativexAustausche)
stark konservierten Schleife 5 (44%x=xkonserviert, 63%x=xkonserviert +xkonservative
Austausche; Abb. IV.3. und IV.5.). Bisher wurden alle entkoppelnden Mutationen im
EIIMtl und EIIGlc (Buhr et al., 1992; Ruijter et al., 1992) in dieser Schleife und dem GIHEbzw. GITE-Motiv gefunden. Fluoreszenz-Studien zeigten zudem in zwei Bereichen
Reaktionen auf die Bindung von Mannitol. Dazu gehörten das Trp30 (Dijkstraa et al.,
1996) und die Aminosäuren im Bereich der Position 196 in der Schleife 5 (Boer et al.,
1996; Broos et al., 1999). Zudem führten zahlreiche ortgerichtete Mutagenesen auf der
Suche nach transportrelevanten AS ausschließlich zu dem AS-Bereich, welcher der
Schleife 5 und deren direkte Umgebung im EIIMtl-Modell entspricht (Buhr et al., 1992;
Weng et al., 1992; Saraceni-Richards & Jacobson, 1997; Lanz & Erni, 1998).
IV. Diskussion
121
IV.2. Untersuchung der Sekundärstruktur des EIICMtl
Für ein umfassendes Verständnis des Translokationsmechanismus im EIIMtl ist ein
genaues Wissen um die Sekundär- bzw. Tertiärstruktur unumgänglich. Aufgrund
zahlreicher Untersuchungen geht man heute von einer dimeren aktiven Konformation
des Proteins aus (Übersicht bei Jacobson, 1992, Boer et al., 1994; Boer et al., 1996;
Koning et al., 1999; Heuberger et al., 2002), die durch nicht-kovalente, hydrophobe
Wechselwirkung der C-Domänen vermittelt wird (Lolkema et al., 1993). Ein weiterer
Einfluss der AS378-465 auf die Dimerisierung ist aber nicht auszuschließen (Briggs et
al., 1992). Die Sekundärstruktur entwickelte sich aus den Erkenntnissen der Arbeiten
von Lee & Saier (1983), Sugiyama et al. (1991), Dijkstra et al. (1996) und Lengeler
(Lengeler et al., 1994; Lengeler & Jahreis, 1996) zu einem Modell aus mindestens
sechs transmembranen Helices, drei kurzen periplasmatischen und zwei großen
zytoplasmatischen Schleifen sowie einem zytoplasmatischen N-Terminus. Für das EIIGlc
wurde mittels PhoA-Fusionsstudien ein Modell mit acht transmembranen Helices
ermittelt (Buhr & Erni, 1993), obwohl die Hydrophobizitätsmuster von EIIGlc und EIIMtl
sehr ähnlich sind. Die Strukturprojektion eines 2D-EIIMtl-Kristalls mit einer Auflösung von
5 Å gibt Hinweise auf das EIIMtl-Modell mit sechs transmembranen Helices und schließt
dabei die Assoziation einer transmembranen Helix mit extramembranen Strukturen nicht
aus (Koning et al., 1999). Bei der Betrachtung des Sekundärstrukturmodells von EIICMtl
unter Berücksichtigung der Untersuchungen entkoppelter Transporter ist dies auch zu
fordern. Wichtige an der Kopplung beteiligte Aminosäuren (H195, E218, H256) liegen
in der zytoplasmatischen Schleife 5, während das Substrat ursprünglich im Periplasma
zu finden ist. Eine Assoziation der Schleife 5 mit transmembranen Elementen, wie es im
Modell von Lengeler (Lengeler 1990; Lengeler et al. 1994) vorgeschlagen wird, ist
daher durchaus denkbar. Unter Berücksichtigung dessen, wurde in dieser Arbeit eine
strukturelle Untersuchung mit dem Schwerpunkt auf der Schleife 5 durchgeführt.
IV.2.1. Mögliche Strukturen des EIICMtl
Mit der Methode der gezielten Biotinmaleimid-Markierung von Cysteinen in dem
Protein wurde die Lokalisation der Aminosäuren S3, C110, S158, S199, S212, S242,
S299 und C384 in EIICMtl untersucht (siehe III.2.4. und Abb. III.2.4.). Als positive
Innenkontrolle wurde anfänglich das Cys384 gewählt, das als essentielle Aminosäure
122
IV. Diskussion
bei der Phosphatgruppenübertragung in der EIIBMtl-Domäne fungiert (Pas & Robillard,
1988a, 1988b). Aus den Kontrollen geht hervor, dass Cys384 allgemein für Stilben
und Biotinmaleimid zugänglich ist. Unter den gewählten Bedingungen erwies sich
Biotinmaleimid jedoch in allen anderen Versuchen als membranimpermeabel und die
Kontrollmarkierungen mit einer cysteinfreien Mutante lassen unspezifische Bindungen
ausschließen. Dabei sollte in der Diskussion die Sonderstellung des Cys384 im EIIMtl
berücksichtigt werden. Man könnte zum einen eine schwächere Bindung für
Sulfhydrylreagenzien erwarten, da bei einem Wachstum in einem Medium ohne D-Mtl
das EIIMtl an der Phosphorylierungsstelle Cys384 größtenteils phosphoryliert ist.
Abb. IV.4. Bindung eines Phosphats bzw. Maleimids an ein Cystein
A) Bindung einer Phosphorylgruppe (grün) an die Sulfhydrylgruppe
des Cysteins (blau). B) Bildung des Thioethers durch Bindung des
Maleimids (rot) an die Sulfhydrylgruppe des Cysteins (blau).
Eine Blockierung der Bindestelle für Maleimid wäre denkbar (Abb. IV.4.), zeigte
sich jedoch nicht bei den Kontrollen auf allgemeine Zugänglichkeit. Zum anderen sollte
das Cys384 in der Nähe des D-Mtl-Transports durch die Membran sein, da es das
Phosphat auf das Substrat überträgt. Dort wären Membranstrukturen denkbar, die es
Biotinmaleimid, nicht aber Stilben ermöglichen, Cys384 zu erreichen, zumal die
Membranpermeabilität bzw. -impermeabilität von Biotinmaleimid zeitabhängig ist (Loo
und Clarke, 1994). Ein nahe oder in der Membran liegendes Cys384 könnte noch von
Biotinmaleimid erreicht werden, während zytoplasmatische Cysteine innerhalb der
Inkubationszeit unmarkiert bleiben. In jedem Fall ist es als sicher anzusehen, dass
Cys384 vom Zytoplasma erreichbar sein muss. Für eine „positive Innenkontrolle“ wurde
zudem der Austausch S3C gewählt, der nach dem derzeitigen Sekundärstrukturmodell
im Zytoplasma liegen soll (Abb. IV.5.).
IV. Diskussion
123
Abb.IV.5. Ergebnisse aus Sequenz- und Strukturuntersuchungen im Sekundärstrukturmodell des IICMtl-Transporters aus E. coli (nach Sugiyama et al., 1991 und
Lengeler et al., 1994; verändert)
Das Modell entspricht der Abb.I.2. erweitert durch den Sequenzvergleich aus Abb. IV.3.
Die Aminosäuren sind wie folgt markiert: In dem Sequenzvergleich konservierte AS haben
einen schwarzen Kasten, AS mit lediglich konservativen Austauschen einen schwarzen
Kreis, AS mit Konsensussequenz einen leeren Kreis und AS ohne Konsensus keine
Markierung. AS deren Position im Sekundärstrukturmodell in dieser Arbeit oder durch
aktuelle Struktur-Untersuchungen bestätigt worden sind, sind in Grün dargestellt.
Abweichende Positionen sind in Rot, unbestimmte Positionen in Blau dargestellt. Die
Messungen der PhoA-Aktivitäten einzelner AS (Sugiyama et al., 1991) sind in den Farben
Gelb (<20 Einheiten pro OD Einheit (= EpOD)), Orange (20-75 EpOD) und Braun
(>75 EpOD) angegeben. Blaue Kreise zeigen Lücken bzw. Insertionen in den
verglichenen AS-Sequenzen an. Leere Kreise stellen AS-Sequenzen unbestimmter Länge
dar. Weitere Erläuterungen sind im Text zu finden.
124
IV. Diskussion
Für die AS-Austausche S110C und S299C konnte keine allgemeine
Zugänglichkeit für Sulfhydrylreagenzien festgestellt werden. Im Falle des S110C sind
unzugängliche Strukturen denkbar, die durch eine Anlagerung der EIIBMtl-Domäne an
die Schleife 3 entstehen. So konnte gezeigt werden, dass zwischen zwei EIIMtl-Domänen
Disulfidbrücken durch Cys124-Cys124, Cys384-Cys384, Cys124-Cys384 sowie
innerhalb einer Domäne durch Cys124-Cys384 gebildet werden können (van Montfort
et al., 2001). Dadurch ergibt sich ein geringer Abstand der zwei Cys124 und Cys384 in
der B/C-Domäne und der Dimer-Verbindung, der mit maximal 5 Å vorgeschlagen wird.
Die Vielzahl der möglichen Disulfidkombinationen spiegelt hier die dynamischen
Prozesse der einzelnen Domänen in der Substrattranslokation wieder. Die EIIB-Domäne
muss dafür mit dem Cys384 in die Nähe der EIIA-Domäne gelangen, um die
Phosphorylgruppe vom His554 zu übernehmen und dann zur Phosphorylierung des
Substrats mit der EIIC-Domäne in Wechselwirkung treten. Des Weiteren kann die
Phosphatgruppe im Dimer zwischen den jeweiligen Monomeren von der EIIA- zur EIIBDomäne bzw. der EIIB-Domäne zum Substrat übertragen werden (van Weghel et al.,
1991a; Weng et al., 1992; Boer et al., 1996; Saraceni-Richards & Jacobson, 1997).
Dadurch wird deutlich, dass das aktive Zentrum der EIIB-Domäne unterschiedliche
Konformationen durchlaufen muss, die verschiedene Disulfidbrücken ermöglichen.
Der Grund für die Unzugänglichkeit des S299C-Austausches könnte eine
Lokalisation in der Membran sein. In diesem Bereich der Schleife 6 gibt es zwar drei
phoA-Fusionen, die für die Lage von I300, G310 und A311 im Periplasma sprechen
(Sugiyama et al., 1991). Hohe phoA-Aktivität kann aber auch erwartet werden, wenn
die drei AS in die Helix 6 gelegt werden würden. Für eine genaue Einordnung fehlen in
diesem Bereich weitere phoA-Fusionen. Grundsätzlich haben Deletionsfusionen den
Nachteil, dass das Protein nicht aktiv ist und carboxyterminale, für eine genaue Insertion
wichtige AS-Sequenzen deletiert sein können (Calamia & Manoil, 1990 und 1992).
Die Markierungs-Ergebnisse für die Austausche S158C, S199C und S212C
weisen deutlich auf periplasmatische Aminosäuren hin. Im Fall des Ser158 stützt dieses
Ergebnis das aktuelle Sekundärstruktur-Modell und die Messungen aus phoA-Fusionen
in diesem Bereich (Sugiyama et al., 1991), die Ser158 in die periplasmatische Schleife
4 legen. Widersprüchlich sind dagegen die Ergebnisse für S199C und S212C. Beide
Aminosäuren (Ser199 und Ser212) liegen in dem EIIMtl-Modell in der zytoplasmatischen
Schleife 5 und die Werte zahlreicher phoA-Fusionen bestätigen dies (Sugiyama et al.,
IV. Diskussion
125
1991). Es ist jedoch schon im ersten Teil der Arbeit auf die Besonderheit der Schleife 5
hingewiesen worden, die sich aus der relativ hohen Konservierung und den vielen
Mutationen, welche den Transport beeinflussen, ergibt. Dynamische Prozesse, die keine
Insertion von Teilen der Schleife 5 in die Membran erfordern, und Strukturen wie der
von Lengeler beschriebene hydrophile Kern vom EIICMtl (Lengeler 1990; Lengeler et al.
1994) könnten unter Umständen mit Deletionsfusionen nicht nachgewiesen werden.
Dies wäre der Fall, wenn die Schleife 5 für eine Faltung in die Membran die
Stabilisierung von weiteren, in dem jeweiligen Protein aber deletierten Strukturen
benötigte. Die nach den Markierungsversuchen periplasmatische Anordnung des
Ser199 und Ser212 ist ein starker Hinweis auf eine Faltung von Teilen der Schleife 5 in
die Membran, da die AS S242 nach Ergebnissen dieser Arbeit wiederum
zytoplasmatisch lokalisiert ist.
Das bisherige Sekundärstrukturmodell stützt sich lediglich auf die phoA-Fusionen
(Sugiyama et al., 1991) und mathematische und empirische Methoden zur Vorhersage
von Membranstrukturen in Proteinen (Kyte & Doolittle, 1982; Engelman et al., 1986;
von Heijne & Gavel, 1988; von Heijne, 1992; Lengeler et al., 1994). Weitere gezielte
Untersuchungen zur Lokalisation einzelner Aminosäuren im Protein gibt es nur wenige.
Als gesichert ist die Bestimmung des Ser124 in unmittelbarer Nähe zum Cys384
anzusehen
(van
Montfort
et
al.,
2000).
Ergebnisse
aus
Tryptophan-
Phosphoreszensstudien geben starke Hinweise auf das Vorkommen der AS Trp30 und
Trp42 in einer Membran-Helix, was der Helix 1 im Modell entsprechen sollte (Broos et
al., 2000). Die Studie gibt zudem noch gute Hinweise darauf, dass Trp109 und Trp117
im Zytoplasma liegen, so wie es im Modell vorgesehen ist.
Auf Grund der Ähnlichkeiten im Hydropathie-Muster und der Domänenstruktur,
wurden für das EIIMtl und EIIGlc ähnliche Topologien vermutet. Für EIIGlc wird allerdings in
einer Studie mit phoA- und lacZ-Deletionsfusionen ein Modell mit acht transmembranen
Helices vorgeschlagen (Buhr & Erni, 1993). Vergleicht man die Anordnung der
einzelnen Helices zwischen EIIMtl und EIIGlc (Abb. IV.6.), so sieht man annähernde
Übereinstimmungen bei den Schleifen Mtl1-Glc1, Mtl2-Glc2, Mtl3-Glc5, Mtl4-Glc6
und Mtl5-Glc8. Abweichungen gibt es durch die Schleifen Glc3, Glc4, Glc7 und Mtl6.
Glc3 und Glc4 stellen zwei Schleifen dar, die im Sekundärstrukturmodell von EIIMtl nicht
berücksichtigt werden.
126
IV. Diskussion
1
70
EIIGlcxxxxxxxxxxxxxxxxIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII xxxxxxxGlc1xxxxxxxxxx AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA xxxxGlc2x
TMHMMxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxBx
K12
(1) ----------MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNIGAFIAWGIITALFIPTGWLPNETLAK-LVGPMITYL
TMHMMxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxAxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxBx
EIIMtlxxxxxxxxxxxxxxxxIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII xxxxxxxxxMtl1xxxxxxx AAAAAAAAAAA xxxxMtl2x
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxS3x xxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxxW30xxxxxxxxxW42
71
140
EIIGlcxxxxxx xGlc2xxxxx II xxxxxxxGlc3xxxxxxxx AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA xxxxxxxxxGlc4xxxxxxx IIII
TMHMMxxxxxxxBxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxDxxxxxxxxxxxxx
K12
(60) LPLLIGYTGGKLVGGERGGVVGAITTMGVIVGA------------DMPMFLGSMIAGPLGGWCIKHFDRW
TMHMMxxxxxxxBxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxC/Dxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
EIIMtlxxxxxx xMtl2xxxxx IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
W109/C110 W117
141
210
EIIGlcxxxxxxIIIIIIIIIIIIII xxxxxxxxxGlc5xxxxxxxxx AAAAAAAAAAAAAAAAAAA xxxxxxxGlc6xxxxxxxx IIIIIIIIIIIIIII
TMHMMxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxExxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxFxxxxxxxxxxxxxxxxx
K12 (118) VDGKIKSGFEMLVNNFSAGIIGMILAILAFLGIGPIVEALSKMLAAGVNFMVVHDMLPLASIFVEPAKIL
TMHMMxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxExxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxFxxxxxxxxxxxxxxxx
EIIMtlxxxxxxIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII xxxxxxxxMtl3xxxxxxxx AAAAAAAAAAAAAAAAAA xxxxxxxxMtl4xxxxxxx IIIII
xxxxxxxxxxxxxxxxxS124
S158
211
280
EIIGlc xxxxxIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII xxxxxxxGlc7xxxxxx AA
TMHMMxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxHxx
K12 (188) FLNNAINHGIFSPLGIQQSHELGKSIFFLIEANPGPGMGVLLAYMFFGRGSAKQSAGGAAIIHFLGGIHE
TMHMMxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxixxxxxxxxxxxGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxHx
EIIMtlxxxxxxIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
S199
S212
S242
281
350
EIIGlcxxxxxxAAAAAAA xxxxxxxxGlc8xxxxxxxxx IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
TMHMMxxxxxxxHxxxxxxxxxxxxxxxxxxxIxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxJxxxxxxxxx
K12 (258) IYFPYVLMNPRLILAVILGGMTGVFTLTILGGGLVSPASPGSILAVLAMTPK------GAYFANIAGVCA
TMHMMxxxxxxxHxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxIxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxJx
EIIMtlxxxxxxIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII xxxxxxxxMtl5xxxxxxxx AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA xxxMtl6x
S158
351
390...
EIIGlcxxxxxxIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
TMHMMxxxxxxxJxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
K12 (322) AMAVSFVVSAILLKTSKVKE-EDDIEAATRRMQDMKAESK...(360)
TMHMMxxxxxxxJxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
EIIMtlxxxxxx xMtl6xxxxxxx IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
Abb. IV.6. Vergleich der postulierten transmembranen Helices von EIICMtl und EIICGlc
Die Abbildung zeigt die relative Lage postulierter Helices aus EIICGlc (Buhr & Erni, 1993) in
der AS-Sequenz von EIICMtl (K12; Lee & Saier, 1983). Die Helices aus EIICGlc sind mit einem
weißen Kasten versehen (Glc1 - Glc8), die Helices aus EIICMtl mit einem grauen Kasten (Mtl1
- Mtl6). AS-Bereiche im Zytoplasma sind mit grünen Is, die im Periplasma mit roten As
gekennzeichnet. Die dargestellte AS-Sequenz ist aus der Abb.IV.3. mit den Markierungen
übernommen worden. Transmembrane Bereiche nach der Vorhersage des Programms
TMHMM (Sonnhammer et al., 1998; Abb.V.7.) sind mit blauen (EIIMtl) bzw. grünen (EIIGlc)
Balken und alphabetisch markiert. Relevante AS sind hervorgehoben und nummeriert. Der
Abbildung liegt ein Sequenzvergleich zwischen EIICMtl und EIICGlc zu Grunde (weiteres siehe
Text).
IV. Diskussion
127
Die Tryptophan-Phosphoreszensstudien an W109 und W117 (Broos et al.,
2000), sowie die Cystein-Kreuzverbindungsstudien (van Montfort et al., 2000)
schränken das Vorkommen der Schleife Glc4 in EIICMtl stark ein. Damit entfällt aus
topologiesymmetrischen Gründen auch eine mögliche Schleife 3, zumal S158 in dieser
Arbeit im Periplasma lokalisiert wurde. Die Abweichungen der Schleifen Glc7 und Mtl6
erscheinen danach als eine Verschiebung der zwei aufeinander folgenden Helices in
den jeweiligen Proteinen.
Neben den experimentellen Möglichkeiten, die Topologie eines transmembranen
Proteins aufzuklären, gibt es noch zahlreiche Computerprogramme, die entsprechende
Vorhersagen berechnen. Allen Programmen ist gemein, dass die grundsätzlichen Regeln
der Ladungsverteilung und des bevorzugten Vorkommens bestimmter Aminosäuren
berücksichtigt wird (Kyte & Doolittle, 1982; Engelman et al., 1986; von Heijne &
Gavel, 1988; von Heijne, 1992). Das Programm TMHMM („transmembrane hidden
Markov model“) von Sonnhammer et al. (1998) hat in einem Vergleich mehrerer
Vorhersageprogramme am besten abgeschnitten (Möller et al., 2001). Das Prinzip von
TMHMM liegt in der dynamischen Berücksichtigung biologischer Besonderheiten bei der
Entstehung
transmembraner
Strukturen.
So
können
z.B.
Bereiche
geringer
Hydrophobizität dennoch als transmembrane Helix beurteilt werden, wenn umliegende
topogene Strukturen dies unterstützen. Solche Helices kommen oft vor, wenn
transmembrane
Helices
untereinander
hydrophile
Wechselwirkungen
ausüben.
Dennoch ist bei der Arbeit mit Vorhersage-Programmen immer zu berücksichtigen, dass
mögliche Strukturen nur vorgeschlagen werden und die angegebenen transmembranen
Bereiche variabel anzusehen sind. So wird eine Vorhersage als korrekt beurteilt, wenn
der angegebene Bereich für eine Helix mit dem der realen Helix überlappt. Daher
können die transmembranen Bereiche in variablen Größen angegeben werden.
Die Ergebnisse von TMHMM (Abb. IV.6. und IV.7.) bestätigen das
Sekundärstrukturmodell von EIIGlc in den acht postulierten transmembranen Helices,
insgesamt werden zehn mögliche Bereiche für Helices vorhergesagt. Diese zwei
zusätzlichen Helices würden in der Schleife 5 und hinter der Schleife 8 (Glc8) am Ort
der Schleife 6 (Mtl6) von EIICMtl liegen. Auch die Vorhersage für EIIMtl bestätigt das
entsprechende Sekundärstrukturmodell, obwohl die Helix 4 (Mtl4; hellblauer Balken in
Abb. IV.6.) nur bei der Berechnung für die Konsensussequenz von EIICMtl erkannt wird
(Für die Berechnung wurde die Konsensussequenz ohne Insertionen verwendet).
128
IV. Diskussion
Abb. IV.7. TMHMM-Vorhersage der Topologien von EIICMtl und EIICGlc
Die Abbildung zeigt die graphische Darstellung der Wahrscheinlichkeitsberechnungen des
Programms TMHMM (Sonnhammer et al., 1998; Abb.V.7.) für EIICGlc und EIICMtl. Den
Berechnungen für transmembrane, zytoplasmatische (innen) und periplasmatische (außen)
Bereiche liegen die Konsensussequenzen für EIICMtl (Abb. IV.3.), EIICBMtl (Lee & Saier,
1983) und EIICBGlc (Erni & Zanolari, 1986) zu Grunde. Über den jeweiligen
transmembranen Bereichen sind die ersten und letzten AS angegeben. Die zugehörigen
Helices der aktuellen Topologiemodelle (Sugiyama et al., 1991; Buhr & Erni, 1993) sind
mit römischen Ziffern gekennzeichnet. Einander im Sequenzvergleich entsprechende
transmembrane Bereiche (Abb. IV.6.) sind alphabetisch gekennzeichnet (Näheres siehe
Text).
IV. Diskussion
129
Die Ergebnisse für EIIMtl enthalten ebenfalls mehr Helices als das Modell
beinhaltet. Eine davon liegt in der Schleife 3 und zwei in der Schleife 5 des
Sekundärstrukturmodells von EIICMtl. Im Vergleich zwischen EIICGlc und EIICMtl fällt auf,
dass bei der Vorhersage, beiden Modellen entsprechend, mehr transmembrane
Bereiche für EIIGlc vorgeschlagen werden. Vieles weist darauf hin, dass EIIGlc und EIIMtl
Transporter gleichen Ursprungs sind, deren Funktion und Hydropathie-Muster ähnlicher
sind als die Topologie. Der Bereich für eine mögliche Helix in der Schleife 3 von EIIMtl
liegt dabei in einem Bereich, der im Sequenzvergleich eine Deletion bzw. Insertion
aufweist. Das kann auf eine Deletion im Bereich zweier transmembraner Helices in der
Schleife 3 von EIIMtl hinweisen. Mögliche transmembrane Bereiche in Schleife 5 von
EIICMtl weisen auf eine Membranassoziation der Schleife 5 hin. Sowohl in EIICMtl als
auch in EIICGlc gibt es auf die Schleife 5 folgend drei Bereiche für transmembrane
Helices in denen jeweils zwei Helices aus den Modellen eingeordnet werden. Die
Ergebnisse aus den zugehörigen phoA- bzw. phoA- und lacZ-Untersuchungen sprechen
für die Zuordnung wie sie in den Modellen erfolgt. Es sind allerdings bei dem Modell
für EIIMtl auf Grund weniger Daten in diesem Bereich Verschiebungen der
transmembranen Bereiche möglich. Anhand der in dieser Arbeit durchgeführten und
vorgestellten Untersuchungen sind verschiede Strukturen in EIICMtl denkbar (Abb. IV.8.).
Dabei wurden folgende Punkte gesondert berücksichtigt.
Die
Maleimid-Markierungen
des
Ser3
bestätigt
den
zytoplasmatischen
Aminoterminus von EIIMtl. Die Helix 1 wird durch Tryptophan Phosphoreszensstudien
(Broos et al., 2000) gestützt. Die AS W109 und W117 in der Schleife 3 werden durch
dieselben Phosphoreszensstudien zytoplasmatisch lokalisiert. Kreuzverbindungsstudien
am S124 weisen auf eine unmittelbare Nähe zum C384 hin (van Montfort et al., 2000).
Die Maleimid-Markierungen des C110 zeigten eine Unzugänglichkeit der Aminosäure.
Ein Vergleich der postulierten Helices in EIIMtl und EIIGlc sowie die phoA-Untersuchungen
an den AS G91, A92 und D93 geben Hinweise auf deletierte Membran-Helices. Die
Helices 2 und 3 resultieren aus den vorangegangenen Ergebnissen sowie der
periplasmatische Zuordnung des Ser158 in der Schleife 4. Die Helix 4 fällt in der
TMHMM-Vorhersage schwach aus und die Bestimmung von Ser199 und Ser212 im
Periplasma spricht für eine Helix nach den AS 199 und 212. Allerdings sind die Werte
der phoA-Studien in diesem Bereich sehr gut, womit die Helix 4 beibehalten wird. Die
Daten aus den Mutantenselektionen und die Bestimmung von Ser199 und Ser212
130
IV. Diskussion
sprechen für eine Faltung der Schleife 5 „in die Membran“, wie sie von Lengeler
(Lengeler 1990; Lengeler et al. 1994) vorgeschlagen wurde. Dabei sind die
dargestellten hellblauen Strukturen nicht zwingend als Helix anzusehen. Die in dieser
Arbeit nachgewiesene Relevanz von Glu218 für die Kopplung bestärkt die Verlegung
der AS in die Membran. Gleiches gilt für die AS His195 und Umgebung. Dabei wurde
die von TMHMM in der Schleife 5 vorgeschlagene Helix (AS212-234) eingebaut. Das
Ser242 liegt danach den Markierungen entsprechend im Zytoplasma. Das GIHE-Motiv
wird „nahe“ der Membran angeordnet, da seine zentrale Bedeutung in der Kopplung
von Transport und Phosphorylierung gezeigt werden konnte. Die Helices 5 und 6
werden dem ursprünglichen Modell entsprechend beibehalten.
Abb.IV.8. Mögliche 2D-Strukturen des IICMtl-Transporters aus E. coli
Die Darstellung entspricht der Abb. IV.5. Abweichend sind AS, die relevant am
Transportprozess beteiligt sind rot markiert. Mögliche Membran-Strukturen sind entsprechend
der Abb. IV.7. alphabetisch gekennzeichnet. Der hellblaue Bereich in der Membran stellt
eine hydrophile Struktur dar, in der nicht zwingend Helices liegen.
IV. Diskussion
131
Auf Grund der neuen Struktur, die eine Zurückfaltung der Schleife 5 nur im
kompletten
Protein
ermöglicht,
lassen
sich
auch
die
PhoA-Aktivitäten
der
Deletionsfusion L209 erklären, da in diesen Konstrukten die Faltung in die Membran
nicht erfolgt. Letztlich wurde in der Abbildung die nachgewiesene Nachbarschaft der AS
Ser124 aus der Schleife 3 und dem Cys384 aus EIIBMtl dargestellt.
Das abgebildete Modell (Abb. IV.8.) stellt nur mögliche Strukturen im EIICMtl dar.
Außerdem ist zu berücksichtigen, dass es sich dabei um eine von vielen möglichen
Konformationen handeln kann. Es sei aber darauf hingewiesen, dass das Modell alle
bisherigen Erkenntnisse über das EIIMtl vereinigt. Eine mögliche dreidimensionale
Anordnung der einzelnen Elemente zeigt die Abb.xIV.9. Dabei soll die Formung eines
hydrophilen Kerns wie in Abb.xI.3. dargestellt werden.
Abb.IV.9. Mögliche 3D-Strukturen des IICMtl-Transporters aus E. coli
Die Nummerierung der begrenzenden AS einer Struktur entspricht der Abb. IV.8. In rot sind
wichtige am Transportprozess beteiligte AS sowie das dem C384 benachbarte S124
hervorgehoben. Das C384 wurde in der phosphorylierten Form dargestellt (C384~P).
132
IV. Diskussion
Ein Dimer aus zwei solchen Anordnungen würde einen Ring aus stabilisierenden
transmembranen Helices formen, deren hydrophiler Kern das reaktive Zentrum bilden
würde. Dieses reaktive Zentrum entspricht dabei dem hochkonservierten Bereich
zwischen den AS L174 und P267 und würde nicht in der Membran, sondern in einem
Ring von transmembranen Helices liegen. In diesem Bereich befinden sich alle
Aminosäuren, die anhand der Mutantenselektion einen Einfluss auf den gekoppelten
Transport haben.
Weiterführende Untersuchungen sind erforderlich, um die vorgeschlagenen
Strukturen in dem Modell genauer bestimmen zu können. In dieser Arbeit konnte die
Methode der Biotinmaleimid Markierung in geeigneter Weise etabliert werden. Bei
folgenden Untersuchungen ist zu berücksichtigen, dass in dem aktiven Zentrum
dynamische Strukturen zu erwarten sind. Markierungen an einem phosphoryliertem EIIMtl
könnten diese aufzeigen.
V. Zusammenfassung
133
V. Zusammenfassung
Die Konstruktion des Plasmids F’lac::dalD ermöglichte die Entwicklung stabiler
Systeme zur Selektion entkoppelter EIIMtl-Mutanten. Semisynthetische Stoffwechselwege
für den D-Mtl-Abbau wurden durch die Stämme LGS322-1/pGJ9∆137 und
LTK31-2/pGJ9 etabliert und erfolgreich zur Selektion von Mutanten eingesetzt. Von 30
untersuchten entkoppelnden Mutationen zeigten 15 den Austausch E218A, eine den
Austausch E218V und 14 den Austausch H256P. Die Phänotypen der Mutanten wurden
nach
ortsspezifischer
Mutagenese
bestätigt
und
in
unterschiedlichen
Stammhintergründen untersucht. Alle Mutationen ermöglichten im EIICMtl nur noch
entkoppelten Transport. Im vollständigen MtlA (EIICBAMtl) wurde bei dem Austausch
E218A gekoppelter und entkoppelter Transport gemessen. Mit DalD lag die
Generationszeit bei ~118min, ohne DalD bei ~190min (WT-Gt = ~85min mit und
ohne DalD). Kinetische Transportmessungen waren bei der Mutation E218A nicht
reproduzierbar
und
zeigten
eine
starke
Abhängigkeit
vom
Plasmid-
und
Stammhintergrund. Die Phosphorylierungsaktivität lag mit 307 [nM]1 im Bereich des WT
(278 [nM]1). Die Mutation E218V zeigte stärkere Auswirkungen auf den Phänotyp. Im
EIICBAMtl wurde auch gekoppelter und entkoppelter Transport festgestellt. Mit DalD lag
die Generationszeit bei ~110min, ohne bei ~305min. Transportmessungen waren
nicht möglich, die Phosphorylierungsaktivität lag bei 32 [nM]1. Mit der Mutation H256P
war im EIICBAMtl nur noch entkoppelter Transport möglich (Gt mit DalD = 283min /
ohne DalD = k.W.). Transport war nicht mehr messbar, die Phosphorylierungsaktivität
lag bei 2 [nM]1. Die Ergebnisse geben Hinweise darauf, dass die Kopplung von
Transport und Phosphorylierung durch die Affinität des EIICMtl zum Substrat beeinflusst
wird. Durch ortsspezifische Mutagenese konstruierte Doppelmutationen E218A/H256P
und E218V/H256P konnten D-Mtl in keinem Stammhintergrund verstoffwechseln. Die
Proteine mit den Doppelmutationen wurden in der Membran nachgewiesen, nicht aber
deren korrekte Faltung.
1
[nM]= [nmol∗min-1∗mg Protein-1]
134
V. Zusammenfassung
Die Selektion von Suppressormutanten ergab lediglich Aminosäureaustausche in
der AS256. Die Mutationen H256A, P256Q und P256S zeigten in Generationszeit,
Transport- und Phosphorylierungsmessungen annähernd WT-Werte. Besonderheiten bei
den Messungen von P256S lassen jedoch eine Beeinflussung der Dimerisierung durch
Mutationen in H256 vermuten. Aufgrund des ausschließlichen Auftretens von
entkoppelten Mutanten in E218 und H256 und des starken Selektionsdrucks, der keine
Suppressormutationen in anderen AS ermöglichte, ergibt sich eine essentielle Funktion
dieser AS in der Kopplung von Transport und Phosphorylierung.
Zur Analyse der Sekundärstruktur des EIIMtl mittels „Cystein-Scanning“ wurde ein
MtlA(His)6
in
einem
Überexpressionsvektor
konstruiert.
Nach
ortsspezifischer
Mutagenese konnte die Aktivität des EIIMtl mit den Austauschen S3C, S110C, S158C,
S199C, S212C, S242C oder S299C gezeigt werden. Aus den BiotinmaleimidMarkierungen ergab sich die Lokalisation von C3 und C242 im Zytoplasma sowie von
C158, C199 und C212 im Periplasma. Keine oder unbestimmbare Zugänglichkeiten
für Sulfhydrylreagenzien zeigten die AS C110, C299 und C384. Aus diesen
Ergebnissen ergibt sich eine Anordnung von Teilen der ursprünglichen Schleife 5 in der
Membran. Diese Schleife 5 bildet das aktive Zentrum, in der sich alle AS befinden,
deren direkte Beteiligung an Transport und Phosphorylierung nachgewiesen wurden. Es
ist nahe liegend, dass solche Strukturen in der Nähe der Substratbindung und des
Transports liegen sollten. Ein Modell, das diesen Anforderungen und den bisherigen
Ergebnissen entspricht, wurde vorgeschlagen. Es stellt aber lediglich eine Anregung für
weitere Untersuchungen dar.
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VII. Anhang
151
LEBENSLAUF UND
AUSBILDUNGSGANG
Persönliche Daten
Şevket Turgut
geb. 16.03.1968 in Zürich
ledig
seit 07.1999 deutsche Staatsangehörigkeit,
davor türkische
von - bis
Schulbildung
1974 - 1978
Grundschule in Bad Pyrmont
1978 - 1988
Humboldt-Gymnasium in Bad Pyrmont
Abschluss: allgemeine Hochschulreife am 27.05.1988
von - bis
Hochschulstudien
10.1988 - 09.1989 Studium der Chemie an der Universität Paderborn, FB Chemie
Studium der Biologie an der Universität Osnabrück, FB Biologie / Chemie
Abschluss: Dipl. biol.
Titel der Diplomarbeitarbeit in der AG Genetik bei Herrn Professor J.W.
10.1989 - 07.1995
Lengeler: „Molekulargenetische Untersuchungen des rbt-Operons für den
Ribitol-Transport und -Stoffwechsel aus dem Bakterium Klebsiella
pneumoniae KAY2026“
10.1995 - 2003
Promotionsstudium in der AG Genetik an der Universität Osnabrück.
Thema der Arbeit: „Molekulargenetische und biochemische
Untersuchungen zur Funktion und Struktur des Enzym IIMtl aus Escherichia
coli K-12“
Veröffentlichungen
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Heuel, H., Turgut, S., Schmid, K., and Lengeler, J.W. Substrate
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Uncouple Transport and Phosphorylation in the D-Mannitol
Phosphotransferase System of Escherichia coli K-12 and Klebsiella
pneumoniae 1033-5P14. J. Bacteriol. 185(7): 2267-2276.
152
VII. Anhang
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Joseph W. Lengeler für die Bereitstellung
der Promotionsmöglichkeit an seinem Lehrstuhl. Ohne seine überdurchschnittliche
Unterstützung bei der Fertigstellung und die vielen anregenden und informativen
Gespräche wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Nicht zu vergessen ist die
Schulung der persönlichen Kritikfähigkeit, die sich auch außerhalb der Universität
als sehr hilfreich erweist.
Herrn Dr. Kurt Schmid danke ich ebenfalls für die Unterstützung während dieser
Arbeit und die vielen praktischen Tipps sowie unterhaltsamen und hilfreichen
Gespräche.
Bei Herrn Prof. Dr. Karlheinz Altendorf bedanke ich mich für die freundliche
Übernahme des Koreferats.
Herrn Prof. Dr. George T. Robillard danke ich für Ermöglichung der Versuche an
seinem Lehrstuhl der Reichsuniversität Groningen unter der freundlichen Mithilfe
von Erwin Vos.
Herrn Dr. Heinrich Jung danke ich für die informativen und sehr hilfreichen
Gespräche rund um das „Cystein-Scanning“ sowie seinen Einsatz in der
Prüfungskomission.
Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe danke ich für die hilfreichen Gespräche und das
sehr angenehme Arbeitsklima, insbesondere der Besatzung des Nordseite Angi,
Dana, Hedwig, Jens, Jörg und Knut.
Bei Georg Zimmermann möchte ich mich auch im Namen der Arbeitsgruppe
bedanken, da er mich jederzeit bei meiner Arbeit als Computerbeauftragter
unterstützt hat und die Systeme trotz Mr. Gates am Laufen gehalten wurden.
Nancy Tholema danke ich für die „Starthilfe“ beim Cystein-Scanning und das sehr
gewisenhafte Korrekturlesn dre Arbeit.
Ganz besonderer Dank gilt Dette, die nicht nur durch ihre Hilfe bei den
Markierungsversuchen zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
VII. Anhang
153
Eidesstattliche Erklärung
Ich versichere, dass die vorliegende Arbeit mein erster Promotionsversuch ist und ich die
beschriebenen Arbeiten selbst durchgeführt und keine anderen als die beschriebenen
Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Osnabrück, März 2003
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(Şevket Turgut)