1 Einleitung

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1.1 Die Bedeutung von Verteilungskoeffizienten an biologischen Membranen
Die biologische Membran trennt lebende von nicht lebender Materie. Sie reguliert den Stoff- und
Informationsaustausch mit der Umgebung. Da biologische Membranen als Transportbarriere für
Arzneistoffe fungieren, ist die Untersuchung der Arzneistoff-Membran-Wechselwirkungen von großer
Bedeutung.
Die passive Diffusion stellt den häufigsten Transportweg für Arzneistoffe durch biologische
Membranen dar. Sie ist von der Lipophilie der Moleküle abhängig, aber stoffunspezifisch (Pidgeon und
Venkataram 1989). Nach dem Fick’schen Diffusionsgesetz ist der Stofftransport bei einem zeitlich
konstanten Konzentrationsunterschied direkt proportional zum Konzentrationsgradienten, der
Membranfläche sowie dem Verteilungskoeffizienten der betreffenden Substanz und umgekehrt
proportional zur Membrandicke. Demnach ist die Permeationsgeschwindigkeit durch eine Membran
bei einem durch passive Diffusion resorbierten Arzneistoff direkt proportional zu dem MembranVerteilungskoeffizienten. Der Hydrophobieeffekt gilt als die Antriebskraft für die passive Diffusion von
Arzneistoffen durch biologische Membranen (Kaliszan et al. 1994). Die Fähigkeit einer Verbindung,
Membranen zu durchdringen, steigt mit zunehmender Lipophilie. Allerdings gilt dieses nur unter steady
state-Bedingungen, während man sonst ein Ansteigen bis zu einem Grenzwert beobachtet. Oberhalb
dieses Grenzwertes nimmt das Permeationsvermögen wieder ab, da bei sehr hoher Lipophilie die
Verbindungen nur eine geringe Rückverteilung in das wässrige Kompartiment jenseits der Membran
aufweisen.
Die biologische Wirkung einer Substanz ist unter anderem abhängig von diversen chemischen und
physikalischen Eigenschaften wie der Löslichkeit, den Dissoziationskonstanten und dem Verteilungskoeffizienten. Der Zusammenhang zwischen biologischer Aktivität und physikochemischen Parametern
spielt eine nicht unerhebliche Rolle bei der Analyse von Beziehungen zwischen Struktur und Wirkung
(Seydel et al. 1994). Hansch und Mitarbeiter brachten erstmals in einem extra-thermodynamischen
Modell die biologische Aktivität eines Wirkstoffs mit dessen chemischer Struktur bzw. den
zugehörigen physikochemischen Eigenschaften wie dem Verteilungskoeffizienten in Beziehung
(Hansch und Dunn 1972).
Der Membran-Verteilungskoeffizient ist zur Erklärung biologischer Prozesse von großer Wichtigkeit,
aber in vivo schlecht zu bestimmen. Deshalb wurden in vitro-Messsysteme entwickelt, um die
Verteilungsvorgänge zu modellieren. Dabei sind Prozesse von gegenseitigen Effekten zwischen den
Bausteinen der Membranen und den Arzneistoffmolekülen bei der Interpretation von pharmakologischen Wirkungen zu berücksichtigen (Seydel et al. 1994).
Der Verteilungskoeffizient P ist definiert als das Konzentrationsverhältnis eines Stoffes zwischen zwei
nicht mischbaren Phasen, die sich im Gleichgewicht befinden. Dies kommt im Nernst’schen
Verteilungssatz zum Ausdruck (Nernst 1891). Er gilt bei konstantem Druck, konstanter Temperatur
und strenggenommen nur für verdünnte Lösungen. Um Verteilungskoeffizienten zu bestimmen,
verwendet man üblicherweise ein organisches Lösungsmittel und Wasser bzw. eine wässrige Pufferlösung. Weiterhin existiert eine Vielzahl an Verteilungskoeffizienten mit unterschiedlichen Definitionen.
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Grundsätzlich muss aber in beiden Phasen die gleiche Ladungsform der Substanz vorliegen. Die
klassische Definition bezieht sich auf die Verteilung einer elektrisch neutralen Substanz zwischen einer
homogenen organischen Phase und Wasser (Nernst 1891). Der Verteilungskoeffizient wird herangezogen, um Aussagen zu treffen, wie hydrophil oder lipophil ein Wirkstoff ist. Bei ionisierbaren
Arzneistoffen ist der Verteilungskoeffizient der Neutralform oft von geringer Bedeutung, da die
Arzneistoffmoleküle unter physiologischen Bedingungen mehr oder weniger stark ionisiert vorliegen.
In diesen Fällen wird als hydrophile Phase ein Puffer bestimmten pH-Wertes verwendet, um den
Einfluss der Ionisation auf das Verteilungsverhalten zu berücksichtigen.
Die Logarithmen der Verteilungskoeffizienten von ungeladenen Verbindungen sind nach Collander in
unterschiedlichen Verteilungssystemen linear miteinander verknüpft, allerdings gilt dies nur für ähnliche
Verbindungen und ähnliche lipophile Phasen (Collander 1951). Verteilungskoeffizienten erlauben
relative Aussagen über die Resorption einer Verbindung, deren Bindung an Plasmaproteine, Transportwege (Glasser und Kriegelstein 1970; Rojratanakiat und Hansch 1990) sowie die Verteilung im
Organismus (van de Waterbeemd und Kansy 1992).
1.2 Die Bestimmung von Verteilungskoeffizienten
Die Bestimmung von Verteilungskoeffizienten ist ein wesentlicher Beitrag zur Entwicklung neuer
Arzneistoffmoleküle. Heute werden vier Modell-Verteilungssysteme vom Typ homogene organische
Phase und Wasser als „kritisches Quartett“ angesehen, um sowohl das spezifische Verteilungsverhalten
einer Verbindung als auch dessen Ursachen zu analysieren. Die Systeme mit Angabe des charakteristischen Merkmals des organischen Lösungsmittels sind (Leahy et al. 1989):
1.
n-Octanol/Wasser (amphiphil, amphiprotisch);
2.
Propylenglycoldipelargonat/Wasser (Wasserstoffbrücken-Akzeptor);
3.
Chloroform/Wasser (Wasserstoffbrücken-Donor);
4.
Cyclohexan/Wasser (rein hydrophob).
Die homogenen organischen Phasen haben verschiedene Dielektrizitätskonstanten und unterschiedliches Löslichkeitsvermögen von Wasser (Leahy et al. 1989). Das mit Wasser gesättigte n-Octanol
besitzt eine spektroskopisch nachweisbare Clusterstruktur, bei der vier zentrale Wassermoleküle von
16 Octanol-Molekülen mit nach innen gerichteten Hydroxylgruppen umgeben sind (Smith et al. 1975;
Franks et al. 1993).
Das n-Octanol/Wasser System gilt als Methode der Wahl zur Analyse des Verteilungsverhaltens einer
Verbindung und hat sich seit den Arbeiten von Hansch als allgemeines Referenzsystem in der
Medizinischen Chemie und der Molekularpharmakologie durchgesetzt (Hansch und Dunn 1972;
Hansch und Leo 1979). In einigen Fällen wurden Beziehungen zwischen biologischer Aktivität und den
Differenzwerten der Logarithmen von Koeffizienten in zwei Verteilungssystemen gefunden, die
allerdings nicht allgemeingültig sind, beispielsweise als ein Modell zur Blut-Hirn-Schranke (Leahy et
al. 1991; van de Waterbeemd und Kansy 1992).
Liposomen wurden als neueres Verteilungsmodell vorgeschlagen, da deren Aufbau einer biologischen
Membran am nächsten kommt. Sie eignen sich gut zur Bestimmung von biologisch relevanten
Verteilungskoeffizienten (Alcorn et al. 1993; Pauletti und Wunderli-Allenspach 1994) und zur Unter-
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suchung von Arzneistoff-Membran-Wechselwirkungen (Fruttero et al. 1998). Die räumliche Trennung
von van-der-Waals- und elektrostatischen Wechselwirkungsbereichen des Phosphatidylcholins sind für
das Verteilungsverhalten von Molekülen entscheidend (Katz und Diamond 1974 a-c; Diamond und
Katz 1974). Der Vorteil von Liposomen besteht insbesondere in der gleichzeitigen Berücksichtigung
von polaren und unpolaren Wechselwirkungen.
Als Methode zur Bestimmung von Verteilungskoeffizienten wird häufig das shake flask-Verfahren
eingesetzt. Da die shake flask-Methode einen hohen Zeitaufwand erfordert und die Reproduzierbarkeit
der Verteilungskoeffizienten nicht optimal ist, suchte man nach weiteren einfachen und leicht zu
handhabenden Bestimmungsmethoden für die Verteilungskoeffizienten.
Diese wurden in der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gefunden
(Kaliszan et al. 1994). Allerdings sind die Ergebnisse nur für homologe Reihen mit den Verteilungskoeffizienten in n-Octanol/Wasser vergleichbar. Ein Ausweg stellt die Beschichtung der RP-Säule mit
n-Octanol dar, wobei aber nur Verbindungen mit einem Verteilungskoeffizienten zwischen 0.1 und
1000 sicher vermessen werden können.
An Stelle von Untersuchungen an Liposomen ist die Verwendung von künstlichen immobilisierten
Membranen als stationäre Phase in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (IAM-HPLC) eine
einfache und genaue Alternative zur Bestimmung von Membran-Verteilungskoeffizienten sowohl für
ionisierbare als auch für nichtionisierbare Verbindungen (Ong et al. 1996). Weiterhin wurden IAMSäulen (immobilized artificial membrane = IAM) erfolgreich angewendet zur Trennung, Analyse und
Reinigung von Biomolekülen (Pidgeon et al. 1991), zur Vorhersage des Arzneistoffstransportes durch
die Haut (Ong et al. 1996) und zur Vorhersage von n-Octanol/Wasser- oder Membran-Verteilungskoeffizienten (Ong et al. 1996; Barbato et al. 1996; Barbato et al. 1997).
Eine neue Methode stellt die potentiometrische Titration dar, die es mit geringerem Aufwand
ermöglicht, Membran-Verteilungskoeffizienten für ionisierbare Verbindungen zu bestimmen (Avdeef
et al. 1998).
1.3 Die Lokalisation der Arzneistoffmoleküle in Membranen und
Diffusionsprozesse an Membranen
Für das Auffinden von intramolekularen Wechselwirkungsstellen in Molekülen und intermolekularen
Wechselwirkungsstellen von Molekülen mit ihrer Umgebung ist die Kern-Magnet-ResonanzSpektroskopie (Nuclear Magnetic Resonance = NMR) die am weitesten entwickelte und universellste
Methode. Intra- und intermolekulare Abstände zwischen NMR-aktiven Kernen können unter
Ausnutzung von homo- und heteronuklearen Kern-Overhauser-Effekt-Messungen (nuclear Overhauser effect = NOE) bestimmt werden. Durch spezielle 19F1H-NOE-NMR-Experimenten sind die
Beträge von internuklearen Abständen und die Regionen von intermolekularen Wechselwirkungen bei
fluorierten Verbindungen in Lösung zugänglich (Gerig et al. 1979; Jones et al. 1995; Huber et al.
1997).
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Für einige Phenothiazine (Frenzel et al. 1978, Kitamura et al. 1979; Kuroda und Kitamura 1984,
Pajeva et al. 1996) und Calcium-Kanal-Blocker (Gaggelli et al. 1990; Bäuerle und Seelig 1991)
wurden bereits Interaktionen mit Phosphatidylcholin-Molekülen der biologischen Membranen über
NMR-Experimente gefunden. Auch konnte die Existenz einer starken Bindung zwischen den polaren
Phospholipid-Molekülen und den catamphiphilen Substanzen bewiesen werden, die mit einer höheren
Lipophilie einer Substanz zunimmt (Seydel et al. 1989; Seydel et al. 1992; Fruttero et al. 1998).
Allerdings gibt es keine konkreten Aussagen über die intermolekularen Wechselwirkungsstellen in der
Membran auf atomarer Ebene. Die zum Teil geringe Löslichkeit der ausgewählten Arzneistoffe
erschwert dabei die Untersuchungen in wässrigen Lösungen.
Weiterhin wird heute die NMR-Spektroskopie zur Analyse von Transport- oder Diffusionsphänomenen
von Molekülen durch Membranen angewendet (King und Kuchel 1990). Durch eine Signalaufspaltung
im 19F-Spektrum von Substanzen können Zweiseiten-Austauschprozesse an der Membran von roten
Blutkörperchen (red blood cells = RBC) untersucht werden, da bei dieser Art von Zellen eine
komplizierte Trennung aus ihrer natürlichen Umgebung und weitere Aufbereitungen des biologischen
Materials entfallen (Potts et al. 1990; Xu et al. 1991; Potts und Kuchel 1992; Xu und Kuchel 1993; Xu
et al. 1998). Die Ein- und Austrittsgeschwindigkeiten von Molekülen können durch PhospholipidArzneistoff-Wechselwirkungen auf molekularer Ebene beeinflusst werden.
1.4 Pharmakologische Eigenschaften der untersuchten Arzneistoffe
Neuroleptika von Phenothiazin- und Thioxanthen-Typ werden bei psychomotorischer Erregtheit,
psychotischen Syndromen und Schizophrenie angewendet und bewirken ein Anstoßen von antipsychotischen Effekten über eine reversible Blockade von dopaminergen D2-Rezeptoren.
Elektronenziehende Substituenten am Trizyklus wie Chlor und CF3 verstärken die Wirkung,
elektronenschiebende Substituenten wie OCH3 und SCH3 führen zum Gegenteil. Die Unterschiede in
den Wirkstärken werden über die schnellere Biotransformation nicht halogenhaltiger Verbindungen
erklärt. Die neuroleptische Potenz der Verbindungen nimmt weiterhin mit der Verlängerung der
Seitenkette vom N,N-Dimethylpropylamin zum 2-(4-Propylpiperazin)-ethanol zu. Bei einigen
Derivaten (Promethazin, Levomepromazin, Thioridazin) ist eine ausgeprägte antidepressive Aktivität
therapeutisch nutzbar. Die Phenothiazine unterliegen einer Radikalbildung bei dauerhafter Licht- und
Lufteinwirkung.
Calcium-Kanal-Blocker der Klassen der 1,4-Dihydropyridine und der Phenylalkylamine wirken über
eine Hemmung des membranständigen und spannungsabhängigen Calcium-Kanals von L-Typ. Die
Verbindungen vom Nifedipin-Typ beeinflussen das Membranpotential und vermindern die Öffnungswahrscheinlichkeit des Ionenkanals, so dass der Calcium-Einstrom in die Zelle verzögert wird. Da die
verringerte Kontraktionsfähigkeit besonders bei Myokard- und Muskelzellen der Blutgefäße ausgeprägt
ist, sind die klassischen Einsatzgebiete der Calcium-Kanal-Blocker die Therapie von koronarer
Herzkrankheit und Hypertonie. Unter Lichteinfluss aromatisiert der 1,4-Dihydropyridinring. Die
Phenylalkylamine (Verapamil) wirken über eine allosterische Blockade an der 1,4-DihydropyridinBindungsstelle. Die S-(-)-Form von Verapamil ist therapeutisch stärker wirksam als das andere
Enantiomer.
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Ein völlig neues Anwendungsgebiet von R-(+)-Verapamil ergibt sich aus dessen Fähigkeit, die
Zytostatikaresistenz von Krebszellen aufzuheben (Zamora et al. 1988). Die Expression eines
Transportproteins ist verantwortlich für das Auftreten der Resistenzen. Es wurde für beide
Enantiomere des Verapamils ein Angriff am membranständigen P-Glykoprotein und dessen Blockade
nachgewiesen (Toffoli et al. 1995; Döppenschmidt et al. 1999). Mit Triflupromazin, Trifluoperazin und
beiden Flupenthixol-Isomeren fand man ebenso Zytostatikaresistenz aufhebende Effekte an Krebszellen
(Ford et al. 1989; Ford et al. 1990). Neben der Bindung an das P-Glykoprotein wurde ein weiterer
Wirkmechanismus der neuroleptisch aktiven Substanzen postuliert, indem sie die Membranstruktur
unspezifisch verändern können und damit eine verbesserte Membrangängigkeit der eigentlichen
Zytostatika nach sich ziehen (Pajeva et al. 1996; Dey et al. 1997).
1.5 Ansatz und Zielstellung
Bevor die ausgewählten Arzneistoffe die molekulare Ordnung einer biologischen Membran beeinflussen, müssen sie sich an oder in die Membran einlagern. Bislang fehlen systematische Bestimmungen
von Verteilungskoeffizienten der Verbindungen an biologischen Membranen oder in verwandten in
vitro-Modellen unter Berücksichtigung von physiologischen Bedingungen.
Das Ziel der vorliegenden Dissertation besteht in der
quantitativen Analyse des Verteilungsverhaltens;
Lokalisation von intermolekularen Wechselwirkungsstellen in Membranen und
Interpretation des Verteilungsverhaltens durch statistisch ausgewählte Molekül-Deskriptoren.
Dazu werden zuerst die Verteilungskoeffizienten der Neutralformen und der Ionen potentiometrisch
in n-Octanol/Wasser, in Propylenglycoldipelargonat/Wasser und an Phosphatidylcholin-Liposomen
bestimmt sowie die Interaktionen mit künstlichen Membranoberflächen chromatografisch an einer
IAM-Säule untersucht. Die Wechselwirkungen auf molekularer Ebene in Membranen werden mit Hilfe
der NMR-Spektroskopie analysiert.
Statistische und Molecular Modeling-Verfahren ermöglichen einen Vergleich der experimentellen
Ergebnisse, um die wesentlichen Gemeinsamkeiten und Unterschiede im Verteilungsverhalten der
Verbindungen und die strukturellen Ursachen herauszustellen. Eine besondere Eignung der verwendeten in vitro-Modellsysteme soll zum Schluss abgeleitet werden.