Orale Applikation von Taurolidin in der chronischen DSS

Ruhr-Universität Bochum
Prof. Dr. med. U. Mittelkötter
Dienstort: Katharinenhospital Unna
Abt. Chirurgie
Orale Applikation von Taurolidin in der chronischen DSS-Colitis der
Maus:
Abschwächung der Krankheitsaktivität und Mortalität
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Sabrina Rottmann
aus Steinhagen
2011
Dekan:
Prof. Dr. med. Klaus Überla
Referent:
Prof. Dr. med. U. Mittelkötter
Korreferent:
Prof. Dr. med. L. Steinsträßer
Tag der mündlichen Prüfung:
03.07.2012
Meinen Eltern und meinen Großeltern
in tiefer Dankbarkeit gewidmet
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG........................................................................... 9
1.1 Allgemeines zu CED........................................................................ 9
1.1.1
Definition CED......................................................................... 9
1.1.2
Epidemiologie von CU und MC............................................. 11
1.1.3
Pathopyhsiologie von CED .................................................... 12
1.1.4
Heutige Therapiemöglichkeiten ............................................. 15
1.2 Taurolidin als antimikrobielle Substanz ............................................. 17
1.2.1
Struktur von Taurolidin, chemische Eigenschaften ............... 17
1.2.2
Pharmakokinetik..................................................................... 18
1.2.3
Wirkmechanismus .................................................................. 20
1.2.4
Klinischer Einsatz von TRD bisher........................................ 21
1.2.5
TRD in der CED-Therapie als neues Behandlungskonzept... 22
1.3 DSS-Colitis als Tiermodell für CED .................................................. 23
1.3.1
Beschreibung des Modells, DAI ............................................ 23
1.3.2
Pathophysologie des DSS Modells ........................................ 23
2.
FRAGESTELLUNG............................................................... 25
3.
MATERIAL UND METHODEN.............................................. 26
3.1 Toxizität von TRD .............................................................................. 26
3.1.1
Applikation von TRD, Dosierungen ...................................... 26
3.1.2
Klinisches Scoring, DAI......................................................... 27
3.1.3
Organentnahme....................................................................... 28
3.1.4
Histologische Auswertung, CDS............................................ 28
1
3.2 TRD in der DSS-Colitis ..................................................................... 29
3.2.1
Induktion der DSS-Colitis ...................................................... 29
3.2.2
Applikation von TRD während der DSS-Colitis ................... 29
3.2.3
Klinisches Scoring.................................................................. 30
3.2.4
Organ-Entnahme, Serum-Entnahme, Mikrobielle Proben ..... 30
3.2.5
Histologische Aufbereitung (Kryo, H&E) ............................. 31
3.2.6
Histo-Scoring.......................................................................... 32
3.3 Statistik................................................................................................ 36
4.
ERGEBNISSE....................................................................... 37
4.1 Orale Langzeitapplikation von TRD................................................... 37
4.2 Toxizitätsstudie: histologische Ergebnisse ......................................... 39
4.3 Taurolidin verbessert den klinischen Verlauf der DSS Colitis........... 39
4.4 Taurolidin verbessert die histologischen Kennzeichen einer DSS ........
Colitis .................................................................................................. 40
4.5 Taurolidin verändert die bakterielle Zusammensetzung von
mesenterialen Lymphknoten nicht...................................................... 42
5.
DISKUSSION ........................................................................ 45
5.1 Wahl des DSS-Modells, Warum dieses Modell?................................ 45
5.2 Histoscoring nach Egger, Warum dieses Scoring-Modell?............... 48
5.3 Kurze Zusammenfassung der Ergebnisse .......................................... 49
5.4 Hat TRD eine antimikrobielle Wirkung auf die intraluminale
bakterielle Flora?................................................................................ 50
5.4.1
Funktion der Darmflora in der CED und in der DSS-Colitis. 50
5.4.2
Einordnung der eigenen Ergebnisse....................................... 52
5.5 Hemmung der Zytokinfreisetzung durch TRD................................... 54
2
5.5.1
Systemische Wirkung während der SIRS-/Sepsis-Phase
der DSS-Colitis....................................................................... 54
5.6 Induktion der Apoptose in Immunzellen/Epithelzellen durch TRD... 57
6.
ZUSAMMENFASSUNG ........................................................ 59
7.
LITERATURVERZEICHNIS .................................................. 61
3
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN
a
Anno
Abb.
Abbildung
AK
Antikörper
al.
alii
ANOVA
analysis of variance
BHI
brain heart infusion medium
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
ca.
circa
CD
cluster of differentation
CDS
Crypt Damage Score
CED
chronisch entzündliche Darmerkrankungen
CH2
Mehthylengruppe
cm
Zentimeter
CO2
Kohlendioxid
CU
Colitis ulcerosa
DAI
Desease Activity Index
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DSS
Dextran-Sulfat-Sodium
E.coli
Escherichia coli
EMEA
European Medicines Agency
H2O
Wasser
HE
Hämatoxylin-Eosin
IgG1
Immunglobulin G1
IL
Interleukin
kDa
Kilodalton
4
kg
Kilogramm
LD50
mittlere letale Dosis
LPS
Lipopolysaccharid
MC
Morbus Crohn
MDP
Muramyl-Dipeptid
mg
Milligramm
mm
Millimeter
n
Anzahl
neg.
negativ
NIH
National Institutes of Health
NOD2/CARD 15 nucleotide-binding oligomerization domain
containing 2 / caspase recruitment domain family,
member 15
NW
Nebenwirkungen
pos.
positiv
PRR
pattern recognition receptors
SCID
Schwerer komibinierter Immundefekt
SEM
Standard Error of the Mean
SIRS
systemical inflammatory response syndrom
Staph.
Staphylococcus
SPP.
species pluralis
Th1
T-Helfer-Zelle Typ 1
Th2
T-Helfer-Zelle Typ 2
TLRs
toll-like receptors
TNBS
Trinitrobenzolsulfonsäure
TNF-α
Tumornekrosefaktor Alpha
TRD
Taurolidin
z.B.
zum Beispiel
5
VERZEICHNIS DER TABELLEN
SEITE
Tabelle 1:
Applikation und Dosierung von Taurolidin
26
Tabelle 2:
Bestimmung des Desease Activity Index
27
Tabelle 3:
Inzidenz von bakteriellen Translokationen
in mesenterialen Lymphknoten
42
Tabelle 4: Zusammensetzung bakterieller Translokationen in
mesenterialen Lymphknoten
43
Tabelle 5:
Übersicht über experimentelle Tiermodelle
46
Tabelle 6:
Fachinformation des Arzneimittels Taurolin.
Arzneimittel-Kompendium der Schweiz, 2003
6
52
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN
Abb. 1:
SEITE
Lokalisation der Entzündung bei M. Crohn
und Colitis ulcerosa
Abb. 2:
10
Mukosale Entzündung bei Colitis ulcerosa und
transmurale Entzündung bei Morbus Crohn
10
Abb. 3:
Struktur von Taurolidin und seinen Metaboliten
18
Abb. 4:
Zyklische Applikation von DSS und H2O
bzw. DSS und Taurolidin
Abb. 5:
30
Schemazeichnung der verschiedenen Entzündungsgrade
im Querschnitt des Colon
Abb. 6:
34
Mikroskopischer Querschnittes des distalen Colon mit
entzündlichen Infiltraten in der Mucosa und Submucosa
bei erhaltener Kryptenarchitektur
Abb. 7:
35
Mikroskopischer Querschnitt des distalen Colon mit
Entzündungsinfiltraten sowie Verformung bzw.
Verkürzung der Krypten bei vorhandenem
Epithelbesatz
Abb. 8:
35
Toxizität von Taurolidin
– Änderung des Körpergewichtes
Abb. 9:
Der Disease Activity Index der Taurolidin-Gruppen
im Vergleich mit der Kontrollgruppe
Abb. 10:
38
Das Überleben in der mit Taurolidin behandelten
Colitis-Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe
Abb. 11:
37
39
Der Disease Activity Index in der mit Taurolidin
behandelten Gruppe im Vergleich mit der
Kontrollgruppe
40
7
Abb. 12:
Der Crypt Damage Score der Taurolidin-Gruppe
im Vergleich mit der Kontrollgruppe im Coecum
und im distalen Colon
41
8
1 Einleitung
1.1 Allgemeines zu CED
1.1.1 Definition CED
Colitis ulcerosa (CU) und Morbus Crohn (MC) stellen die Hauptvertreter
der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) dar. Sie sind
gekennzeichnet
durch
eine
chronische
Entzündungsreaktion
der
Darmwand, die den gesamten Gastrointestinaltrakt betreffen kann.
Klinische Symptome sind je nach Erkrankung abdominelle Schmerzen,
teils blutige Diarrhoen und Gewichtsverlust. Bei MC können
Darmstenosen und Fisteln auftreten, bei CU besteht ein erhöhtes
Carcinomrisiko.
Der MC ist durch eine diskontinuierlich segmental auftretende
transmurale Entzündung auch der tieferen Wandschichten des gesamten
Gastrointestinaltraktes mit häufigster Lokalisation im terminalen Ileum
und proximalen Colon gekennzeichnet.
Die CU hingegen ist eine Dickdarmerkrankung mit kontinuierlicher
Ausbreitung und mit Ausbildung von Ulzerationen der oberflächlichen
Schleimhautschichten [59].
9
Abbildung 1:
Lokalisation der Entzündung bei Morbus Crohn und
Colitis ulcerosa
Das Krankheitsbild der Colitis ulcerosa unterscheidet sich von dem des
Morbus Crohn maßgeblich dadurch, dass die Entzündung in über 95 %
der Fälle auf den Bereich des Colons begrenzt ist. Dieser ist
kontinuierlich entzündet. Beim Morbus Crohn kann der gesamte
Gastrointestinaltrakt betroffen sein [59].
Abbildung 2:
Mukosale Entzündung bei Colitis ulcerosa und
transmurale Entzündung bei Morbus Crohn
10
1.1.2 Epidemiologie von CU und MC
In Deutschland leiden ca. 320.000 Menschen an chronischen
entzündlichen Darmerkrankungen. Die Inzidenz für MC liegt in
Deutschland bei ca. 3/100.000/a, für CU bei 4/100.000/a [135]. In einer
europaweiten Studie wurde für MC eine Indzidenz von 5,6/100.000/a
und für CU eine Inzidenz von 10,4/100.000/a angegeben. Hier zeigte
sich weiterhin ein ausgeprägtes Nord-Süd-Gefälle. In Nordeuropa lag die
Inzidenz für CU 40% über der Rate in Südeuropa, wobei sich maximale
Inzidenzraten in Island ergaben. Für MC betrug dieses Nord-Süd-Gefälle
sogar 80% [120]. Weltweit konnte außerdem ein West-Ost-Gefälle
beschrieben werden [70]. In Regionen mit einer hohen Prävalenz von
chronisch
entzündlichen
Darmerkrankungen
wie
beispielsweise
Nordamerika und Europa konnte zwischen den 60iger und 80iger Jahren
ein deutlicher Anstieg dieser Erkrankungen verzeichnet werden. In den
meisten Industriestaaten steigt die Inzidenz entweder weiterhin an oder
aber sie stabilisiert sich, wohingegen die Inzidenz für CED in den
Gebieten, in denen sie weniger verbreitet ist, ansteigt [79].
CU und MC können in jedem Lebensalter auftreten, wobei sich eine
Häufung in der Altersgruppe von 15 bis 40 Jahren ergibt. Ungefähr 10%
der Fälle sind im Alter von unter 18 Jahren zu verzeichen [3]. Die
höchste altersspezifische Inzidenzrate für MC liegt zwischen 20 und 29
Jahren, für CU zwischen dem 20. und 39. Lebensjahr [53]. Beide
Erkrankungen weisen eine bimodale Altersverteilung mit einem zweiten,
etwas geringeren Gipfel zwischen 50 und 70 Jahren, auf [3]. CU tritt
gehäufter bei männlichen, MC bei weiblichen Geschlecht auf. Beide
Krankheiten tendieren dazu, in höheren sozioökonomischen Gruppen
und in Industriestaaten aufzutreten [42].
11
1.1.3 Pathopyhsiologie von CED
Die Ätiologie von CU und MC ist bisher noch nicht vollständig
aufgeklärt, jedoch scheint für ihre Entstehung die komplexe Interaktion
verschiedener
genetischer,
mikrobieller,
umweltbedingter
und
immunregulatorischer Faktoren verantwortlich zu sein. Dabei kommt es
durch das komplexe Zuammenspiel dieser Faktoren zu einer anhaltenden
Aktivierung des mukosalen Immunsystems mit einer überschießenden
inflammatorischen
luminale
Reaktion
Antigene.
gekennzeichnet
durch
gegen
normalerweise
Die
Entzündungsreaktion
ein
ausgeprägtes
ungefährliche
im
Darm
entzündliches
ist
Infiltrat
(Makrophagen, Leukozyten), eine verstärkte Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen (IL-1, TNFalpha, IL-6 und IL-12) und eine
intestinale Barriere-Störung [2, 4, 6, 25, 33, 43, 106, 118].
- Genetische FaktorenEs existieren zahlreiche Hinweise darauf, dass MC und CU aus einer
genetischen Prädisposition heraus entstehen. In diesem Zusammenhang
konnten mehrere Suszeptibilitäts-Gene identifiziert werden. Zunächst
konnte gezeigt werden, dass Mutationen im NOD2/CARD15 Gen
(Chromosom 16) mit der Entstehung des MC verbunden sind. Die NODProteine gehören zur Familie der sog. PRR (pattern recognition
receptors), die intrazellulär bakterielle Zellwandbestandteile, wie das
Lipopolysaccharid
(LPS)
grampositiven und
oder
Muramyl-Dipeptid
(MDP)
aus
-negativen Bakterien detektieren [49, 50, 61].
Sie sind Bestandteil der angeborenen Immunität des Darmtraktes, die es
ermöglicht,
zwischen
physiologischer
12
Flora
und
pathogenen
Mikroorganismen
zu
unterscheiden.
Bei
MC
scheint
dieser
Mechanismus gestört zu sein. Im Falle einer Mutation findet so eine
fehlerhafte Erkennung der Muramyl-Dipeptide statt [95].
Zusätzlich existieren weitere Signalwege der angeborenen Immunität,
über die Bakterien direkt mit Zellen der intestinalen Mukosa interagieren
können wie beispielsweise die toll-like Rezeptoren (TLRs). TLRs
schützen als transmembranäre PRRs die intestinale Epithelbarriere,
indem sie extrazellulär luminale Antigene erkennen, die Sekretion von
inflammatorischen
Cytokinen
induzieren
und
als
Aktivator
antimikrobieller Signalwege fungieren [24].
-mikrobielle FaktorenEin weiterer wichtiger Aspekt, der die Pathophysiologie der CED zu
erklären versucht, stellt die Beteiligung der Darmflora dar. Man geht
davon aus, dass CED durch eine überschiessende Immunantwort auf
nicht-pathogene Bakterien der normalen Darmflora – besonders bei
genetisch prädisponierten Menschen – verursacht werden [34, 41, 114,
115]. Der Entzündungsprozess führt zu Störungen der Integrität der
intestinalen Mukosa und somit zu einer Beeinträchtigung der epithelialen
Barrierefunktion.
Dieser
Bakterienbesiedelung
der
Vorgang
begünstigt
Darmwand,
was
die
vermehrte
wiederum
den
Entzündungsprozess beschleunigt. In diesem Zusammenhang spielen
Probiotika eine wichtige Rolle, da sie die intestinale Mikroflora
modulieren und die mikrobielle intestinale Ballance verbessern können
[31, 114, 117].
In der CED-Behandlung konnten beispielsweise einige Erfolge mit
einem genetisch modifizierten Bakterienstamm, dem E.coli NissleStamm (Mutaflor) erzielt werden. Er wirkt protektiv auf die CU. Ein
Vorteil der Probiotika-Behandlung besteht darin, dass sie keine
13
bedeutenden Nebenwirkungen aufweist [44, 45, 60, 129, 131].
-umweltbedingte FaktorenDie höheren Inzidenzraten von CED in Industriestaaten unterstützen die
These, dass umweltbedingte Faktoren zu der Entwicklung der
Erkrankung beitragen könnten. Dieses könnte das Ergebnis des
westlichen Lebensstandards bzw. Lebensstils darstellen, der Faktoren
wie
die
Ernährung
(z.B.
fast
food),
den
Tabakkonsum,
die
Luftverschmutzung und Industriechemikalien beinhaltet [58]. Von
diesen exogenen Faktoren kommt dem Tabakkonsum eine besondere
Bedeutung zu. Es wird ein negativer Einfluss des Tabakkonsums auf den
Krankheitsverlauf des MC und eine protektive Wirkung auf den Verlauf
der CU diskutiert [109].
-immunregulatorische FaktorenEs gibt sichere Hinweise darauf, dass der zellvermittelte Arm der
adaptiven Immunantwort, der im Falle der chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen in einer Dysbalance abläuft, einem von zwei
möglichen Wegen folgt: einer exzessiven T-Helfer-1-Antwort (Th1Antwort), die mit dem MC in Zusammenhang steht oder einer
überschiessenden Th2-Antwort, die mit der Entwicklung der CU in
Verbindung steht. Die Th1-Antwort ist durch ansteigende Produktion
von Interferon-γ, TNF-α, IL-1, IL-2 und IL-6 gekennzeichnet. Die Th2Antwort steht mit zunehmender Sekretion von IL-4, IL-5, IL-10 und IL13 in Verbindung. Diese proinflammatorischen Zytokine kommen so bei
CED vermehrt vor und tragen zur verstärkten Ausbreitung dieser
Erkrankung bei. TNF führt zu einer Zerstörung der mukosalen
Epithelbarriere, induziert die Apoptose der Darmzottenepithelien,
bewirkt die Sekretion von Chemokinen aus den intestinalen Zellen und
aktiviert zusätzlich neutrophile Granulozyten, Makrophagen und B14
Zellen [2, 4, 111, 128]. TNF löst auf diese Weise zusammen mit IL-1
und IL-6 die charakteristischen Symptome der CED aus. Diese
Feststellung führte zur Entwicklung und Einführung der anti-TNFTherapie.
1.1.4 Heutige Therapiemöglichkeiten
Die Arzneimitteltherapie stellt die Basisbehandlung der CED dar. Eine
chirurgische Intervention im Rahmen der CED ist bei speziellen
Komplikationen (Ileus, toxisches Megacolon, komplizierte Fisteln) oder
therapierefraktärem
konventionellen
Sulfasalazin,
Krankheitsverlauf
Therapie
Mesalazin
der
CED
indiziert
In
der
Substanzen
wie
Corticosteroide
und
kommen
(5-Aminosalicylat),
[57].
Immunsuppressiva wie Azathioprin, Mercaptopurin, Methotrexat oder
Ciclosporin zum Einatz [4, 54, 55, 98].
Sulfasalazine und 5-Aminosalicylate wie Mesalazin werden als Therapie
der ersten Wahl bei mild bis moderat verlaufender CU und MC, also bei
geringer bis mittlerer Krankheitsaktivität beschrieben [122]. Bei
moderater bis schwerer Krankheitsausprägung ist die Applikation von
Corticosteroiden indiziert. Sie werden bei akuten Schüben der
Erkrankung eingesetzt, als Langzeitmedikation sind sie unwirksam und
aufgrund der schwerwiegenden Nebenwirkungen nicht anzuwenden [57].
Dieses führte zum vermehrten Einsatz von Immunmodulatoren als
Behandlungsstrategie von steroid-abhängigen und steroid-resistenten
Krankheitsverläufen [122].
Eine weitere Substanzklasse repräsentieren die Cytokin-Inhibitoren, wie
15
beispielsweise Infliximab. Dabei handelt es sich um einen chimären
monoklonalen IgG1-Antikörper, der TNF-α mit hoher Spezifität bindet
und neutralisiert [110]. TNF-α kann als zentrales Cytokin in der
Entzündungskaskade bezeichnet werden [113]. Infliximab wird zur
Behandlung von moderaten bis schweren Schüben des MC bei Patienten,
die inadäquat auf die konventionelle Therapie mit Corticosteroiden und
Immunsuppressiva reagieren oder die Kontraindikationen für diese
Therapien aufzeigen eingesetzt [4, 112]. Für den fistulierenden MC ist
der Einsatz von Infliximab ebenfalls zugelassen [112].
Weitere TNF-α-Antikörper neben Infliximab sind beispielsweise
Adalimumab und Certolizumab. Bei CED und vor allem beim MC findet
man im entzündlich veränderten Gewebe aktivierte Makrophagen, die
den Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) freisetzen. TNF-α ist an
inflammatorischen Reaktionen beteiligt und spielt bei der zellulären
Immunantwort eine Rolle. Als wichtige Nebenwirkungen der anti-TNF-α
Therapie sind schwere, opportunistische Infektionen, wie auch die
Möglichkeit der Reaktivierung einer Tuberkulose zu nennen. Weiterhin
sind Sepsis, Bronchitis, Pneumonie, Dyspnoe, Sinusitis, Kopfschmerz,
Schwindel,
Übelkeit,
Diarrhoe,
Abdominalschmerzen,
Leberfunktionsstörungen, Urtikaria und Pruritis beschrieben.
Seit Juni 2007 ist Adalimumab europaweit für die Therapie des
schwergradigen, aktiven MC zugelassen. Adalimumab ist der erste rein
humane rekombinante monoklonale anti-TNF-α-Antikörper. Er hemmt
die sowohl von löslichem als auch membrangebundenem TNF- α
abhängigen Entzündungsprozesse und induziert die Apoptose von
Monozyten. Da er die oben erwähnten NW eines chimären AK nicht
aufweist, kann er bei Patienten mit MC und Unwirksamkeit bzw.
Unverträglichkeit von Infliximab eingesezt werden. Die laufenden
16
klinischen Studien zeigen ein klinisches Ansprechen in 80% der Fälle
bei guter klinischer Verträglichkeit [29, 133].
Für Certolizumab pegol wurde von der Europäischen Zulassungsbehörde
EMEA (European Medicines Agency) im März 2008 ein negatives
Votum zum Antrag zur Zulassung für die Therapie des aktiven MC
abgegeben [134]. In der Schweiz wurde Certolizumab im September
2007 zur Therapie des MC zugelassen. Certolizumab kann, wie auch
Adalimumab, subcutan appliziert werden.
1.2 Taurolidin als antimikrobielle Substanz
1.2.1 Struktur von Taurolidin, chemische Eigenschaften
Taurolidin ist ein Derivat der Aminosulfonsäure Taurin, welche als
ubiquitäre Substanz im menschlichen Organismus verbreitet ist. Die
chemische Bezeichnung dieser Substanz lautet Bis-(1,1-dioxoperhydro1,2,4-thiadiazynol-4)methan, die Summenformel C7H16N4O4S2. Mit
einem Molekulargewicht von 284,37 besteht Taurolidin aus zwei
aromatischen Ringen, die über eine CH2(Methylen)-Gruppe miteinander
in Verbindung stehen [23, 64-67, 130].
17
Abbildung 3:
Struktur von Taurolidin und seinen Metaboliten
1.2.2 Pharmakokinetik
In wässriger Lösung wird die Doppelringstruktur des Taurolidins durch
den Vorgang der Hydrolyse aufgehoben. Taurolidin liegt dann im
Gleichgewicht mit Taurultam und Methyloltaurultam vor, welches
wiederum zu Taurultam hydrolysiert wird [96]. Diese Metaboliten
wirken als Überträger von Methylol-Gruppen [67, 130]. Taurultam hat
eine biologische Halbwertszeit von ca. 7 Stunden, Taurolidin hingegen
besitzt im Organismus eine kürzere Halbwertszeit von nur einer Stunde.
Taurultam
wird
durch
den
Vorgang
der
Hydrolyse
über
Methyloltaurinamid zu Taurin und letzten Endes zu CO2 abgebaut.
Während dieser Hydrolyseschritte wird wiederum eine reaktive
Methylol-Gruppe freigesetzt. Aus einem Molekül Taurolidin können
also zwei Moleküle Taurultam und insgesamt drei Methylolgruppen
freigesetzt werden. Diese reaktiven Gruppen stellen durch CH2 bzw.
Methylol-Übertragung
auf andere Reaktionspartner vermutlich das
18
molekulare Wirkprinzip von Taurolidin dar. TRD erreicht unabhängig
von der Applikationsform nach geringer zeitlicher Verzögerung ungefähr
identische Blutspiegel. Ca. 3,5 Stunden nach oraler Applikation erlangt
die Konzentration im Blut einen Maximalwert [67, 130]. Da TRD und
seine Metaboliten polare Substanzen darstellen, sind sie nicht oder nur
kaum dazu in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke zu überschreiten, was
das vollständige Fehlen zentralnervöser Wirkungen von TRD erklärt
[123].
Die LD50 liegt bei peroraler Applikation bei der Maus bei ca. 4300
mg/kg, bei intravenöser Gabe bei über 4000 mg/kg, so dass TRD als sehr
geringe toxische Substanz einzustufen ist. Dieses konnte in zahlreichen
Studien bestätigt werden [16, 35, 67, 130]. Es konnte gezeigt werden,
dass, bezogen auf die Toxizität, kein Unterschied zwischen einer
intravenösen Langzeitbehandlung und einer Bolusgabe bei Ratten
besteht [14,15]. Weiterhin konnte keine Schädigung von Leber und
Niere und auch keine Blutbildveränderungen in der Ratte nach
intraperitonealer und intravenöser Applikation vermerkt werden [16, 6466]. Im klinischen Gebrauch beim Menschen als intraperitoneal
instilliertes Antiinfektivum, wurde beobachtet, dass TRD in niedrigen
Dosen eine effektive Wirkung zeigt, in denen keine Toxizität
nachweisbar ist [8, 48, 74, 78, 80, 87, 101, 102, 121]. Zusätzlich wurden
durch eine direkte intravenöse Injektion von TRD keine systemischen
Nebenwirkungen beobachtet [72, 73]. Somit gilt Taurolidin als ein gut
verträgliches Pharmakon, wie zahlreiche pharmakokinetische Studien
belegen [50, 124].
19
1.2.3 Wirkmechanismus
Eine bemerkenswerte Eigenschaft des TRD liegt darin, dass es über
chemische Reaktionen seine Wirkungen erzielt. Die reaktiven MethylolGruppen
des
TRD
und
seiner
Metabolite,
die
während
der
Hydrolyseschritte entstehen, sind vermutlich das aktive Wirkprinzip. Sie
binden an Bestandteile der bakteriellen Zellwand so z.B. an
Lipopolysaccharide (LPS) von Endotoxinen und Polypeptide von
Exotoxinen und führen auf diese Weise zu deren Inaktivierung [46, 47,
67]. Es handelt sich dabei um eine irreversible inter- und intramolekulare
Vernetzung der primären Aminogruppen, was sich in Versuchen mit
14C-radiomarkiertem TRD zeigen ließ. Weiterhin reagieren die
Methylol enthaltenden Moleküle mit bakteriellen Wandbestandteilen wie
beispielsweise Fimbrien oder Flagellen, um die Adhärenz von
Mikroorganismen auf biologischen Oberflächen zu verhindern [51, 52].
So besitzt TRD die Eigenschaft, die Oberflächenstruktur und die
Funktion von Zellen zu beeinflussen. Auf diese Weise lässt sich die
antimikrobielle Wirkung von TRD erklären.
Zusätzlich zu diesem Effekt hemmt TRD die Synthese und Freisetzung
von proinflammatorischen Zytokinen aus Immunzellen. So konnte
gezeigt werden, dass TRD die LPS-induzierte Synthese von TNF-α und
IL-1
in
peripheren
Blutzellen
inhibiert
[7,
77].
Hierbei
ist
hervorzuheben, dass diese Zytokine – wie bereits erwähnt – eine
entscheidende Rolle in der CED-Pathophysiologie spielen.
Weiterhin
konnte
für
Taurolidin
ein
antiproliferativer
und
antineoplastischer Effekt gezeigt werden. In unterschiedlichen humanen
20
und murinen Tumor-Zelllinien konnte in vitro gezeigt werden, dass TRD
eine Tumorzellapoptose bewirkt. Diese konnte auch in Tierversuchen
bestätigt werden. Es ist noch nicht klar, ob es sich bei der Apoptose um
den intrinsischen Weg – über die Cytochrom C-Freisetzung – oder den
extrinsischen Weg – über Death-Rezeptoren und Caspase-Aktivierung –
handelt [21, 22, 28, 32, 56, 63, 84, 93, 103, 104].
1.2.4 Klinischer Einsatz von TRD bisher
Taurolidin, in den 70er Jahren von Geistlich-Pharma synthetisiert, wird
seit 1975 in der septischen Abdominalchirurgie als intraperitoneale
Spüllösung zur Behandlung der Peritonitis eingesetzt [8, 64-66]. Dabei
zeigt TRD eine bakterizide Wirkung gegen ein breites Spektrum von
aeroben und anaeroben Bakterien wie auch gegen klinisch relevante
Pilzarten [9, 10, 17, 18, 20, 51, 52, 83, 100]. Taurolidin vermindert das
Ausmass und die Schwere von postoperativen peritonealen Adhäsionen
und verbessert den klinischen Verlauf der Peritonitis [19, 64-66, 98].
Eine weitere Indikation liegt in der Behandlung von Infektionen
zentraler Venenkatheter. Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation
von TRD gegen katheter-assoziierte Infektionen wirksam ist [76].
Weiterhin wird Taurolidin bereits im Rahmen von Studien in der
Onkologie eingesetzt. Bei Patienten mit einem malignem Glioblastom
als auch bei Patienten mit Magencarcinom, die intravenös mit TRD
behandelt wurden, konnte eine partielle Tumorremission beobachtet
werden [14, 15, 124].
21
1.2.5 TRD in der CED-Therapie als neues Behandlungskonzept
Taurolidin stellt eine Substanz mit einer Vielzahl verschiedenster
Eigenschaften dar, die auch in der Therapie der CED nützlich sein
könnten. Die pharmakokinetischen Eigenschaften von TRD erlauben
neben der intravenösen oder intraperitonealen Applikation auch eine
orale Verabreichung [123]. Oral appliziertes TRD könnte die bakterielle
Mikroflora des Darmes verändern und durch diesen Prozess den
Krankheitsverlauf beeinflussen. Dieses therapeutische Prinzip wird
weitgehend in der Behandlung der CED durch Probiotika angewendet
[44, 60 ,114]. Hervorgehoben sei an dieser Stelle die Fähigkeit dieser
Substanz, die systemische Zytokinfreisetzung zu verändern und dadurch
die systemische Endotoxämie und den Entzündungsprozess zu
verringern, zusätzlich zu einer Veränderung der Mikroflora des Darms.
Vorarbeiten zu diesem neuen Behandlungskonzept in der Therapie der
CED lieferten Gardiner et al. im Jahre 1994 [46]. Sie zeigten, dass eine
intravenöse Injektion von TRD bei Ratten eine signifikante Verringerung
der Endotoxin-Konzentration in einem Colitis-Modell erzielt. In diesem
Colitis-Modell wurde gezeigt, dass TRD die Endotoxine dosisabhängig
inaktiviert und dass es über neutralisierende endotoxische Eigenschaften
verfügt [47].
TRD könnte eine neue Möglichkeit darstellen, chronisch entzündliche
Darmerkrankungen zu behandeln. Jedoch liegen bisher noch keine oralen
Therapieversuche mit Taurolidin vor.
22
1.3 DSS-Colitis als Tiermodell für CED
1.3.1 Beschreibung des Modells, DAI
Bei der DSS-Colitis handelt es sich um ein experimentelles Tiermodell
für chronisch entzündliche Darmerkrankungen in der Maus. Durch die
zyklische Applikation von DSS (Dextran-Sulfat-Sodium) über das
Trinkwasser ad libitum für einen definierten Zeitraum gefolgt von einem
DSS freien Intervall mit Wasser, wird eine chronische Colitis bei den
Versuchstieren induziert. Die Erstbeschreibung dieses Modells erfolgte
im Jahre 1990 durch Okayasu [96]. Durch die zyklische Applikation von
DSS wird ein Krankheitsverlauf hervorgerufen, der den klinischen
beobachteten Rekurrenz-Remissions-Phasen der CU ähnlich ist [97].
Für die Dokumentation der Krankheitsaktivität wird der Disease Activity
Index (DAI) nach Cooper et al. herangezogen. Die Beurteilung des
Schweregrades der Colitis erfolgt im DAI durch Erfassung des
Körpergewichts, des Vorhandenseins von occultem oder makroskopisch
sichtbarem Blut im Stuhl und der Stuhlkonsistenz [30, 91]. Für die
histologische Auswertung existieren unterschiedliche Scoring-Systeme,
anhand derer der Grad der mukosalen Beschädigung durch die induzierte
Colitis eingestuft und ausgewertet werden kann [37, 38, 41].
1.3.2 Pathophysologie des DSS- Modells
In mehreren Studien wurden die klinischen und histopathologischen
Veränderungen, die während des DSS-Modells durch die Colitis
entstehen, charakterisiert. Zu den frühen histologischen Veränderungen
23
zählt der Verlust des basalen Drittels der Krypten, welche bis zum
vollständigen Verlust der Kryptenarchitektur fortschreitet. Diese
Veränderungen stellen ein fokales Geschehen dar und sind nicht direkt
mit Entzündungszeichen assoziiert. Die inflammatorischen Prozesse
scheinen ein sekundäres Phänomen zu sein, das sich erst nach dem
Verlust der Kryptenarchitektur entwickelt [30, 36, 40]. Die initiale
Schädigung scheint auf der Ebene der Epithelzellen stattzufinden, wobei
die Entzündung nur als sekundärer Prozess angesehen werden könnte.
Neben der direkten Toxizität von DSS auf die Epithelzellen wurden auch
Effekte auf intestinale Lymphozyten bzw. deren Interaktion mit
Epithelzellen diskutiert [92]. In jedem Fall spielt die vermehrte
Exposition der intestinalen Zellen gegenüber luminaler Antigene – wie
z.B. der Mikroflora – eine entscheidende Rolle. So zeigt z.B. die DSS
Colitis unter Probiotika-Gabe eine Besserung [39, 114].
24
2 Fragestellung / Zielsetzung
Die vorliegende Arbeit untersucht qualitativ die orale Applikation von
Taurolidin im Tiermodell der chronischen DSS-Colitis als möglichen
neuen Therapieansatz in der Behandlung von chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen.
Nach der Auswertung der Toxizität von oral applizierten TRD in
verschiedenen Konzentrationen über einen Zeitraum von 60 Tagen
wurde der Einfluss von 0,2% TRD in der chronischen DSS Colitis
untersucht.
Zu Beginn der Versuchsreihe stellten sich folgende Fragen:
1. Ist Taurolidin in oraler Applikation toxisch?
2. Schützt Taurolidin in dieser Applikationsform vor der
Entwicklung einer DSS-Colits?
25
3 Material und Methoden
3.1 Toxizität von TRD
3.1.1 Applikation von TRD, Dosierungen
Der Einfluss einer oralen Langzeittherapie mit TRD wurde in weiblichen
C57/BL6 Mäusen (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) untersucht.
Alle
Experimente
wurden
gemäss
der
deutschen
Tierschutzbestimmungen und der NIH-Richtlinien für die Haltung und
Pflege von Labortieren durchgeführt und sind vom Ministerium für
Landwirtschaft und Naturschutz, Kiel (V742-72241.121-22(10-2(05))
genehmigt worden. Die insgesamt 20 Tiere dieser Versuchsreihe wurden
im Tierstall des pharmakologischen Institutes der Universität Kiel in
Polycarbonkäfigen (Fläche: 825 cm2, Käfighöhe: 15 cm) gehalten. In
diesem Tierstall herrschte ein 12-Stunden hell-dunkel Rhythmus bei
22°C und 46% Luftfeuchtigkeit. Die Tiere erhielten ein Standard-Futter
(ssniff M-Z, 10 mm, ssniff Spezialdiäten, Soest) ad libitum über einen
Zeitraum von 60 Tagen hinweg (n = 5 Tiere pro Gruppe). Die
unbehandelte Kontrollgruppe
(n = 5) erhielt demineralisiertes
Wasser für weitere histologische und mikrobiologische Untersuchungen,
die Behandlungsgruppen erhielten Taurolidin in wässriger Lösung in
unterschiedlichen Konzentrationen.
Tabelle 1: Applikation und Dosierung von Taurolidin
Gruppe
Behandlung
Anzahl
Kontrolle
H 2O
5
TRD 0,1
Taurolidin 0,1%
5
TRD 0,2
Taurolidin 0,2%
5
TRD 0,4
Taurolidin 0,4%
5
26
3.1.2 Klinisches Scoring, DAI
Während der oralen Verabreichung von TRD wurden die Tiere täglich
zur selben Tageszeit klinisch untersucht. An den Tagen 2-15, 24, 25, 35,
36 und 60 wurde das Körpergewicht der Tiere dokumentiert und mit
ihrem initialen Gewicht am Tag 1 in Korrelation gesetzt. Die Daten
wurden als prozentualer Anteil des Ausgangsgewicht ausgedrückt (+/SEM). Zusätzlich wurde eine Stuhluntersuchung der Tiere in Bezug auf
die Konsistenz und occultes Blut (Hemoccult, Sprothen, Stolberg) oder
makroskopisch sichtbares Blut durchgeführt. Dieses geschah an den
Tagen 2, 3, 13, 14, 24, 25, 35, 36 und 60. Aus der Gesamtheit der
erhobenen Daten wurde der Disease Activity Index (DAI) bestimmt, der
die entstandene Toxizität im Gastrointestinaltrakt quantifizierte.
Der DAI setzt sich in Anlehnung an die von Cooper et al. im Jahre 1993
[30] formulierte Publikation wie folgt zusammen:
Tabelle 2: Bestimmung des Desease Activity Index
Stuhlkonsistenz
hart (0 Punkte)
weich (2 Punkte)
Diarrhoe (4 Punkte)
Blut im Stuhl
okkult negativ (0 Punkte)
okkult positiv (2 Punkte)
makroskopisch positiv (4 Punkte)
Gewichtsverlust (%)
< 1% (0 Punkte)
27
1% – 5% (1 Punkt)
5% - 10% (2 Punkte)
10% - 15% (3 Punkte)
> 15% (4 Punkte)
Summe = DAI
0 – 12 Punkte
3.1.3 Organentnahme
Nach einer Zeitspanne von 60 Tagen wurden alle Tiere unter tiefer
Aethernarkose getötet. Nach der Eröffnung von Thorax und Abdomen
wurden die Organe herauspräpariert und für weitere histologische
Untersuchungen in Formalin fixiert.
3.1.4 Histologische Auswertung
Die systemische Toxizität durch oral verabreichtes TRD in ansteigenden
Dosen über einen Zeitraum von 60 Tagen wurde anhand der
parenchymatösen
Organe
(Leber,
Niere,
Milz,
Herz,
Lunge)
einschließlich des Intestinums ermittelt. Von diesen Organen wurden
nach Paraffineinbettung histologische Schnitte angefertigt, die dann
mittels HE-Färbung eingefärbt wurden. Alle Schnitte wurden von zwei
Untersuchern (S.R. und A.M., letztere eine Pathologin) „in Verblindung“
beurteilt.
28
3.2 TRD in der DSS-Colitis
3.2.1 Induktion der DSS-Colitis
Die Induktion der Colitis erfolgte ebenfalls in weiblichen C57/BL6
Mäusen (Charles River, Sulzfeld). Von diesem Stamm ist bekannt, dass
er auf die orale Verabreichung des DSS mit der Entwicklung einer
Colitis reagiert [85]. Es erfolgte eine zyklische Verabreichung von DSS
(Molekulargewicht 36 – 44 kDa, MP Biomedicals, Aurora, OH, USA).
Die Mäuse erhielten über drei Zyklen DSS in demineralisiertem
Trinkwasser gelöst ad libitum über einen Zeitraum von jeweils 5 Tagen
in absteigenden Konzentrationen. Diesen 5 Tagen schlossen sich 5 DSSfreie Tage an, was einem Zyklus von 10 Tagen entsprach. Der erste
Zyklus bestand aus der Applikation von 1,5%igen DSS, der zweite
Zyklus aus 1,0%igen DSS und der dritte Zyklus aus 0,5%igen DSS.
3.2.2 Applikation von TRD während der DSS-Colitis
In den DSS-freien Intervallen wurde einer Gruppe (n = 10) eine 0,2%ige
Taurolidin-lösung (Taurolin, Boehringer Ingelheim Pharma, Ingelheim
am Rhein) ad libitum verabreicht (Taurolidin-Gruppe). Eine zweite
Gruppe (unbehandelte Colitis, n = 9) erhielt nur demineralisiertes
Trinkwasser während der DSS-freien Tage.
29
DSS
1,5%
25
H2O/
TRD
0
30 Tage
Abbildung 4:
DSS
1,0%
5
H2O/
TRD
10
DSS
0,5%
H2O/
TRD
15
20
Zyklische Applikation von DSS und H2O bzw. DSS
und Taurolidin
3.2.3 Klinisches Scoring
An jedem der insgesamt 30 Versuchstage wurde zum gleichen Zeitpunkt
das oben beschriebene klinische Scoring durchgeführt und der DAI
ermittelt. Zusätzlich erfolgte täglich die Erhebung von Mortalitätsdaten
und eine Beurteilung des Verhaltens der Versuchstiere.
3.2.4 Organ-Entnahme, Serum-Entnahme, Mikrobielle Proben
Nach 30 Tagen erfolgte analog zur ersten Versuchsreihe die Eröffnung
von Thorax und Abdomen und das Freiprärarieren des Intestinums unter
Narkose. Das entnommene Colon wurde mit normaler Kochsalzlösung
gereinigt und in vier anatomische Bereiche, das proximale, mittlere,
distale Colon sowie in das Coecum unterteilt. Alle Präparationsschritte
wurden auf Eis durchgeführt und die einzelnen Proben direkt in flüssigen
Stickstoff tiefgefroren.
30
Zusätzlich wurden die mesenterialen Lymphknoten aus dem Bereich des
Coecum
unter
sterilen
Bedingungen
mikrobiologische
Beurteilung
Mikroorganismen
auf
wurden
Kulturmedien
entfernt.
zur
Proben
für
Identifikation
gegeben.
Als
die
von
flüssiges
Kulturmedium wurde eine Gehirn-Herz-Infusionsbouillon (BHI: brain
heart infusion medium) benutzt, die sich dadurch auszeichnet, dass sie
ein effektives Medium zur Anzucht von aeroben Bakterien und klinisch
relevanten Pilzen bietet. Diese Proben wurden über mehr als zehn Tage
hinweg kultiviert. Die Bouillon wurde anschließend auf Blut- und
Schokolodenagar-Platten für die Identifizierung der Mikroorganismen
subkultiviert. Die Bakterien wurden durch übliche manuelle oder
mechanisierte biochemische Methoden identifiziert. Gramnegative
Bakterienstämme wurden mit der GNS-Karte über das Vitek 2
Identifikations- und Suszeptibilitätssystem identifiziert (bioMerieux, St.
Louis,
MO).
Die
mikroskopische
Beurteilung
der
bakteriellen
Gramfärbungen war Teil der mikrobiellen Untersuchungen, um die
Bakterienpopulation zu bestimmen.
3.2.5 Histologische Aufbereitung (Kryostat, HE)
Die histologische Aufbereitung der gefrorenen Proben bestand zunächst
in der Herstellung von 5µm dicken Transversalschnitten durch das
distale Colon und das Coecum aller Versuchstiere. Dieses erfolgte in
einem Kryostat-Mikrotom (Leica CM 1900, Leica Microsystems,
Nussloch) bei -21°C. Jeweils drei Schnitte einer anatomischen Region
wurden auf einen Objektträger aufgebracht und über Nacht bei
Raumtemperatur getrocknet. Alle Gewebeschnitte wurden anschließend
31
mit Hämatoxylin/Eosin eingefärbt.
3.2.6 Histo-Scoring
Die gefärbten Präparate wurden unter einem Leica DM 4000 B
Mikroskop betrachtet. Die histologische Auswertung der Schnitte
erfolgte durch den Crypt Damage Score (CDS) nach Egger [40]. Der
Grad der Zerstörung wurde von Egger et al. als ein prozentualer Anteil
jedes einzelnen Abschnittes am gesamten Colon ausgedrückt. Der
Schweregrad der mukosalen Zerstörung wurde anhand einer Skala
zwischen Grad 0 und Grad III eingestuft. Grad 0 stellte die normale
Architektur des Darmes dar. In Grad I waren die Krypten soweit
verkürzt, dass sie maximal zwei Drittel der ursprünglichen Kryptenlänge
ausmachten. In Grad II waren die Krypten derart verkürzt, dass sie
lediglich in den oberen zwei Dritteln der Mukosa gelegen waren. Ein
Epithelbesatz war noch vorhanden. Grad III kennzeichnete sich durch
den Verlust der Kryptenarchitektur, oberflächlich war nur ein
regeneratepithelartiger Epithelbesatz vorhanden [40]. Da in diesem
Score jedoch ausschließlich die Länge der Krypten als Maß für die
Ausprägung der Krankheit eingesetzt wurde, wurde dieser Score in der
vorliegenden Studie dadurch modifiziert, dass ein zusätzliches Kriterium
mit einbezogen wurde, nämlich das Auftreten von Entzündungszeichen
in Form von Entzündungszellen und entzündlichen Infiltraten in dem zu
bewertenden histologischen Abschnitt. Die Bewertung der Kryptenlänge
plus der Entzündungszeichen in einem definierten Präparatabschnitt
erlaubte die Einteilung in verschiedene Gradabstufungen, die in
Anlehnung an den Egger-Score wie folgt definiert wurden:
32
Grad 0:
Physiologische Verhältnisse
Grad 0,5:
Die Krypten reichen bis zur Tunica muscularis mucosae. In
der Mucosa sowie Submucosa sind jedoch Entzündungsinfiltrate nachweisbar.
Grad 1:
Verformung und/oder Zerstörung des unteren Drittels der
Krypte.
Grad 1,5:
Die Krypten sind soweit verkürzt, dass sie maximal zwei
Drittel der ursprünglichen
Krytenlänge
ausmachen.
Zusätzlich sind reichlich Entzündungszellen in der Mucosa
nachweisbar.
Grad 2:
Zerstörung der unteren zwei Drittel oder Verlust der
Kryptenarchitektur, Epithelbesatz ist vorhanden.
Grad 2,5:
Die Krypten sind derart verkürzt, dass sie lediglich im
oberen Drittel der Mucosa gelegen sind. Zusätzlich sind
dichte Entzüngsinfiltrate nachweisbar.
Grad 3:
Verlust der Kryptenarchitektur, oberflächlich ist ein
regeneratepithelartiger Epithelbesatz vorhanden.
Grad 3,5:
Die
Mucosa
oberflächlich
besitzt
keine
findet
sich
Kryptenarchitektur
ein
mehr,
regeneratepithelartiger
Epithelbesatzt. Im Interstitium sind dichte Entzündungsinfiltrate nachweisbar.
Pro Präparat wurde jeweils ein gesamter Darmquerschnitt untersucht.
Dabei wurden Abschnitte mit wechselnden pathomorphologischen
Befunden jeweils den entsprechenden, oben aufgeführten Scorekriterien
zugeordnet. Die Auswertung erfolgte unabhängig voneinander durch
zwei verblindete Untersucher. Mittels des Statistikprogrammes SPSS
33
Version 12.0 wurde dann für jedes Präparat ein Mittelwert pro
Querschnitt errechnet.
Darmlumen
Krypte
Tunica
muscularis
mucosae
Submucosa
Grad 0
Abbildung 5:
Grad 1
Grad 2
Schemazeichnung der verschiedenen
Entzündungsgrade im Querschnitt des Colon
34
Grad 3
Abbildung 6:
Mikroskopischer Querschnittes des distalen Colon mit
entzündlichen Infiltraten in der Mucosa und Submucosa bei
erhaltener Krypten-architektur (Grad 0,5).
Abbildung 7:
Mikroskopischer Querschnitt des distalen Colon mit
Entzündungs-infiltraten sowie Verformung bzw. Verkürzung
der Krypten bei vorhandenem Epithelbesatz (Grad 1,5).
35
3.3 Statistik
Die Ergebnisse des Disease Activity Index (DAI) und des Crypt Damage
Score (CDS)
wurden als Mittelwerte +/- SEM (Standardfehler)
angegeben. Die DAI-Werte wurden unter dem Gebrauch von
wiederholten Analyseeinheiten der Varianz über alle Zeitpunkte hinweg
ausgewertet (ANOVA mit Meßwiederholung). Der Vergleich der CDSWerte zwischen den Gruppen erfolgte ebenfalls über ANOVA. Mögliche
Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen wurden mit einer
statistischen
Varianzanalyse
und
anschließenden
multiplen
Paarvergleichen nach Tukey ermittelt. Ein p-Wert ≤ 0.05 wurde als
statistisch signifikant bewertet. Überlebensraten und hazard ratio wurden
durch den Log Rank Test analysiert. P-Werte ≤ 0.05 wurden als
statistisch signifikant eingestuft. Das Statistikprogramm SPSS Version
12.0 wurde für die Berechnungen verwendet.
36
4 Ergebnisse
4.1 Orale Langzeitapplikation von TRD
Während der oralen
Langzeittoxizitätsstudie
mit
Taurolidin
in
unterschiedlichen Dosierungen (0,1%; 0,2%; 0,4%) über 60 Tage starb
keines der Tiere. Die prozentuale Gewichtszunahme der Tiere betrug in
allen Gruppen über die 60 Versuchstage hinweg ca. 13% - 20% des
Ausgangsgewichtes (Abbildung 8).
Abbildung 8:
Toxizität
von
Taurolidin
–
Änderung
des
Körpergewichtes
Die Gewichtszunahme war in den Gruppen, die 0,1% und 0,4% TRD
erhielten signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe, die Wasser
37
erhielt (p ≤ 0.05 TRD 0,4% vs. H2O und TRD 0,1% vs. H2O, ANOVA
mit Meßwiederholung über alle Zeitpunkte). Die Applikation von 0,2%
TRD verglichen mit der Kontrollgruppe (H2O) bewirkte keine
signifikante Änderung des Gewichtes.
Weiterhin zeigte die orale Applikation von TRD keine Zeichen der
Toxizität im Gastrointestinaltrakt, wie an den DAI-Werten zu ersehen
ist. Die DAI-Werte unterschieden sich nicht signifikant zwischen den
Gruppen (0.1%, 0.2%, 0.4%) und der Kontrollgruppe, wie mittels
ANOVA gezeigt werden konnte (Abbildung 9).
Abbildung 9:
Der Disease Activity Index der Taurolidin-Gruppen
im Vergleich mit der Kontrollgruppe
Es tauchten weiterhin auch keine eindeutigen Nebenwirkungen von TRD
wie z.B. verändertes Sozialverhalten, Ess- oder Trinkverhalten über den
Versuchszeitraum auf.
38
4.2 Toxizitätsstudie: histologische Ergebnisse
Sämtliche Organe aus den parenchymatösen Organen (Leber, Niere,
Pankreas, Herz, Lunge, Milz, Darm) zeigten keine histologische
Unterschiede zwischen den TRD-behandelten und unbehandelten Tieren.
4.3 Taurolidin verbessert den klinischen Verlauf der DSSColitis
Das Überleben der mit 0.2% Taurolidin behandelten Colitis-Gruppe
betrug 100%. Im Vergleich dazu überlebten in der unbehandelten
Colitis-Gruppe nur 33% (p ≤ 0.005, Log Rank Test, Abbildung 10).
Abbildung 10:
Das Überleben in der mit Taurolidin behandelten
Colitis-Gruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe
Die Abbildung 11 zeigt den typischen triphasischen Verlauf einer DAIKurve einer chronischen DSS Colitis mit einem Maximum der DAI39
Werte am Ende eines DSS-Zyklus. Es zeigt sich jedoch ein deutlicher
Unterschied im Kurvenverlauf zwischen der mit 0,2% Taurolidin
behandelten Colitis-Gruppe und der unbehandelten Gruppe. Für die
Taurolidin-Gruppe lagen die mittleren DAI-Werte mit 3.50 (+/- 0.96)
signifikant
niedriger als die der unbehandelten Colitis-Gruppe mit 7.06 (+/- 0.26) (p
≤ 0.005, t-Test).
Abbildung 11:
Der Disease Activity Index der Taurolidin-Gruppe
(0,2%) im Vergleich mit der Kontrollgruppe
4.4 Taurolidin verbessert die histologischen Kennzeichen
einer DSS- Colitis
Die histologische Auswertung erfolgte anhand des Crypt Damage Score
(CDS) nach Egger [40]. Hier zeigte sich in der unbehandelten ColitisGruppe, dass die zyklische Verabreichung von DSS zu einer schweren
Colitis im Bereich des Coecums und des distalen Colons führt. Die CDS40
Werte im Coecum lagen mit 4.96 (+/- 1.95) und im distalen Colon mit
7.03 (+/- 2.53) signifikant höher als die der gesunden unbehandelten
Kontrolltiere (p ≤ 0.001 distaler Colon; p ≤ 0.05 Coecum ANOVA).
Die orale Applikation von Taurolidin (0,2%) führte mit 0.18 (+/- 0.17)
zu einem signifikant erniedrigten CDS im Coecum verglichen mit der
Gruppe der unbehandelten DSS-Colitis Tiere (p ≤ 0.001 ANOVA).
Im distalen Colon erreichten die Unterschiede zwischen Taurolidinbehandelter und unbehandelter Colitis keine statistische Signifikanz
(Abbildung 12).
Abbildung 12:
Der Crypt Damage Score der Taurolidin-Gruppe
(0,2%) im Vergleich mit der Kontrollgruppe im Coecum und
im distalen Colon
41
4.5 Taurolidin verändert die bakterielle Zusammensetzung
von mesenterialen Lymphknoten nicht
Die folgende Tabelle zeigt, dass Taurolidin keinen Einfluss auf die
bakterielle Zusammensetzung mesenterialer Lymphknoten hat, was im
Vergleich mit der unbehandelten Gruppe deutlich wird. Die Inzidenz
bakterieller Translokationen in der Kontrollgruppe wich nur um wenige
Prozentpunkte von der in der Taurolidingruppe ab, wobei die geringe
Fallzahl in der unbehandelten Kontrollgruppe zu berücksichtigen ist.
Tabelle 3: Inzidenz von bakteriellen Translokationen in mesenteriale
Lymphknoten
Steril #
Gram neg.
Stäbchen ‡
1/3 (33%)
1/3 (33%)
DSS colitis
unbehandelt (n = 3)
3/10 (30%) 3/10 (30%)
DSS colitis + TRD
(n = 10)
6/6 (100%) 0 (0%)
Gesunde
Kontrollgruppe (n = 6)
#
Gram pos.
Kokken °
1/3 (33%)
4/10 (40%)
0 (0%)
: Wachstum von typischen Bakterien der Hautflora z.B. Staph.
epidermidis, Staph. warneri, welches als Kontamination durch die
Biopsieentnahme einzustufen ist.
‡
: Gramnegative Stäbchen einschliesslich Proteus mirabilis und E. coli
° : Grampositive Kokken wie Leuconostoc spp.
42
Tabelle 4: Zusammensetzung
bakterieller
Translokationen
in
mesenterialen Lymphknoten
Nr.
Gruppe
1
DSS
Colitis E. coli
Gram-neg. Stäbchen
Colitis Leuconostoc spp.
Gram-pos. Kokken,
unbehandelt
2
DSS
unbehandelt
3
DSS
anaerob
Colitis Steril
unbehandelt
4
DSS Colitis + TRD
Prot. mirabilis
Gram-neg. Stäbchen,
fakultativ anaerob
5
DSS Colitis + TRD
Prot. mirabilis
Gram-neg. Stäbchen,
fakultativ anaerob
6
DSS Colitis + TRD
Leuconostoc spp.
Gram-pos. Kokken,
fakultativ anaerob
7
DSS Colitis + TRD
Steril
8
DSS Colitis + TRD
Prot. mirabilis
Gram-neg. Stäbchen,
fakultativ anaerob
9
DSS Colitis + TRD
Steril
10
DSS Colitis + TRD
Staph. epidermidis
Gram-pos. Kokken, aerob,
Koagulase neg.
11
DSS Colitis + TRD
Leuconostoc spp.
Gram-pos. Kokken, anaerob
12
DSS Colitis + TRD
Leuconostoc spp.
Gram-pos. Kokken, anaerob
13
DSS Colitis + TRD
Leuconostoc spp.
Gram-pos. Kokken, anaerob
14
Gesunde
Steril
Kontrollgruppe
43
15
16
Gesunde
Gemella
Gram-pos. Kokken
Kontrollgruppe
haemolysans
Gesunde
Steril
Kontrollgruppe
17
Gesunde
Staph. warneri
Kontrollgruppe
18
Gesunde
Gram-pos. Kokken, aerob,
Koagulase neg.
Steril
Kontrollgruppe
19
Gesunde
Pasteurella
Kontrollgruppe
haemolytica
Gram-neg. Stäbchen, aerob
E. coli:
gramnegatives begeißeltes Stäbchenbakterium
Leuconostoc spp.:
Gruppe der Milchsäure-Bakterien;
grampositive, katalasenegative Kokken mit
positiver Äsculin-Reaktion,
Vorkommen: Pflanzenmaterial, Nahrung
Proteus mirabilis:
Gattung gramnegativer, begeißelter,
pleomorpher Stäbchenbakterien der Familie
Enterobacteriaceae;
Vorkommen: Gastrointestinaltrakt von Mensch
und Tier
Staph. epidermidis:
Plasmakoagulase-negativer Saprophyt;
Vorkommen: Haut und Schleimhaut
Gemella haemolysans:
Gruppe der nicht-β-hämolysierenden Bakterien;
Vorkommen: Normalflora der Mundhöhle und
oberen Atmwege
Staph. warneri:
Aerobe, grampositive, koagulase-negative
Kokken;
44
Vorkommen: Hautflora von Mensch und Tier
Pasteurella haemolytica: Gattung gramnegativer, unbeweglicher,
fakultativ anaerobe Stäbchenbakterien der
Familie Pasteurellaceae;
Vorkommen: normale oropharyngeale Flora
von Tieren
5 Diskussion
5.1 Wahl des DSS-Modells, Warum dieses Modell?
Die beschriebenen experimentellen Tiermodelle in der CED-Forschung
zur Induktion einer gastrointestinalen mukosalen Inflammation werden
in chemisch induzierte, genetisch manipulierte, Zelltransfer- und spontan
auftretende Modelle eingeteilt. Die folgende Tabelle gibt eine kleine
Übersicht über derzeit gängige Tiermodelle.
45
Tabelle 5: Übersicht über experimentelle Tiermodelle
1.) Chemische Induktion:
-
Entwicklung
vergleichbarer
Symptome wie bei der CU des
Menschen
- gute Reproduzierbarkeit
- einfache Verfügbarkeit
- kostenoptimiert
z.B. DSS (Dextran-SulfatSodium) und TNBS
(Trinitrobenzolsulfonsäure)
induzierte Colitis
[96, 126]
2.) Genetische Manipulation:
- Modelle mit Manipulationen des
Zytokingleichgewichtes
z.B. IL2-, IL-10 knock out
Mausmodell
[5, 11, 90]
3.) Tansfercolitis:
- T-Zellen werden in SCID-Mäuse
transferriert
- Spender und Empfänger werden
benötigt
z.B. CD4-T-Zell-Subpopulation
in eine SCID-Maus
[37, 125]
Unsere Arbeitsgruppe hat sich für das Tiermodell der DSS-Colitis zur
Durchführung der Versuche entschieden. Primär sollte ein ideales
46
Tiermodell
für
Voraussetzung
chronisch
erfüllen,
entzündliche
den
Darmerkrankungen
pathophysiologischen
Zustand
die
der
menschlichen Darmentzündung so exakt wie möglich nachzuarmen. So
ergibt
sich
die
Möglichkeit,
dass
Schlussfolgerungen
auf
inflammatorische Mediatoren sowie genetische und immunologische
Prozesse vom Tiermodell auf den Menschen übertragen werden können.
Dieses ist beim Modell der DSS-Colitis gegeben.
Als weiterer Punkt sei erwähnt, dass dieses Modell nicht zuletzt auch
durch
seine
unkomplizierte
Durchführbarkeit
und
finanzielle
Überschaubarkeit überzeugte. Für die Zukunft wurde in unserer
Arbeitsgruppe bereits angedacht, Taurolidin auch in anderen Modellen
wie beispielsweise in der Transfer Colitis zu untersuchen. Das
Dextransulfat -Modell der Maus lässt sich mit den morphologischen
Veränderungen, welche im Menschen bei der Colitis Ulcerosa auftreten,
schon sehr gut in Korrelation setzen.
Als histologischer Modus operandi der DSS-Colitis könnte die
epitheliale Schädigung angeführt werden, also die leukozytäre
Infiltration von Entzündungszellen wie Monozyten bzw. Makrophagen
in die Lamina propria mit fokaler Kryptenzerstörung, lymphoider
Hyperplasie und epithelialen Ulzerationen, sowie Erosionen, Dysplasien,
der Verlust von Becherzellen und die Ausbildung von Lymphfollikeln.
Diese Schäden sind vermutlich auf einen toxischen Effekt von DSS
zurückzuführen, der einen Epithelschaden verursacht, verstärkt durch die
Phagozytose von DSS durch Zellen der Lamina propria und die
Ausschüttung von IFN-γ und TNF-α [30, 38, 96, 126]. Nur sekundär ist
die Beteiligung von T-Zellen zu nennen, da die DSS-Colitis auch T-Zellunabhängig
ausgelöst
werden
kann
und
zwar
in
schwer
immundefizienten SCID-Mäusen, die über keine funktionalen T- und B47
Zellen verfügen [38, 125]. Neben der akuten DSS-Colitis gibt es auch
Modelle zur Induktion einer chronischen DSS-Colitis, besonders
etabliert bei dem von uns eingesetzten Stamm C57/BL6 [85].
Die primären Vorteile der DSS-Colitis bestehen in der guten
Reproduzierbarkeit, dem geringen Kostenaufwand und der Entwicklung
vergleichbarer klinischer Symptome wie bei der CU des Menschen.
5.2 Histoscoring nach Egger, Warum dieses Scoring-Modell?
Das Tiermodell der DSS – Colitis ist durch die beschriebenen
histomorphologischen Veränderungen wie leukozytäre Infiltrationen,
besonders Makrophagen / Monozyten, Erosionen, Dysplasien, Verluste
von Becherzellen und Krypten, Schädigung von Epithelzellen,
Ulzerationen und die Ausbildung von Lymphfollikeln charakterisiert.
Wir entschieden uns im Rahmen der histologischen Auswertung für den
histopathologischen Score nach Egger [40], da zum einen bereits
Erfahrungen in unserer Arbeitsgruppe mit diesem Score vorlagen [28],
zum anderen die beschriebenen morphologischen Verändeungen
teilweise berücksichtigt werden. Dieser Score legt sein Hauptaugenmerk
auf die Veränderung der Kryptenarchitektur [40]. Der Schweregrad der
mukosalen Zerstörung wurde anhand einer Skala zwischen Grad 0 und
Grad III eingestuft.
Da dieser Score nur die Veränderungen der Krypten berücksichtigt,
modifizierten wir diesen, indem wir das Auftreten entzündlicher Infiltate
zusätzlich mitberücksichtigten und in den Score integrierten.
Das Auftreten entzündlicher Infiltrate spielt auch in weiteren
histologischen Scores eine entscheidende Rolle: das von Dielemann
48
beschriebene Schema berücksichtigt die entzündliche Infiltration der
Darmwand sowie das Ausmaß der Gewebezerstörung [37]. In diesem
Zusammenhang werden für jeden der beiden Parameter Punkte von 0 bis
3 (0 keine Zellinfiltration bzw. kein Gewebeschaden bis 3 starke
Entzündungsreaktion bzw. starker Gewebeschaden) vergeben. Die
Scorepunkte werden addiert und der histologische Score von 0 bis 6
gebildet.
In jedem Fall ist festzuhalten, dass sämtliche Untersuchungen in der
vorliegenden Arbeit durch zwei unabhängige Untersucher erfolgten, die
verblindet waren.
5.3 Kurze Zusammenfassung der Ergebnisse
Unsere Arbeit zeigt zum ersten mal den signifikant protektiven Effekt
von oral applizierten Taurolidin (TRD) im Krankheitsverlauf des
experimentellen Modells der DSS induzierten Colitis auf.
TRD steigert signifikant die Überlebensrate in der DSS-Colitis von 33%
auf 100% und verbessert den klinischen Verlauf der Erkrankung im
Vergleich
zur
unbehandelten
DSS-Colitis.
Die
abnehmende
Krankheitsaktivität nach der oralen Behandlung mit TRD spiegelt sich in
der nahezu fehlenden Beeinträchtigung der Kryptenarchitektur auf der
einen Seite und fehlenden inflammatorischen Veränderungen auf der
anderen Seite, bezogen auf die Histologie im Bereich des Coecum,
wieder.
Interessanterweise
konnten
histomorphologischen
diese
verbesserten
Verhältnisse
nicht
im
inflammatorischen
distalen
Colon
nachgewiesen werden. Dieser von oral nach aboral hin abnehmende
49
Verlauf der anti-inflammatorischen Wirkung unterstützt die Annahme,
dass TRD seine Aktivität – wenigstens in einem gewissen Ausmass vom intraluminalen Raum her entfaltet. Folglich könnte die fehlende
Besserung der histologischen Veränderungen im Bereich des distalen
Colon auf zunehmende Abschwächung und Resorption des TRD
beruhen.
Die orale Gabe von TRD über 60 Tage hinweg zeigte, bezogen auf den
DAI und die histomorphologischen Veränderungen, keine toxischen
Effekte.
Wir konnten somit erstmals zeigen, dass die orale Applikation von TRD
zu einer Besserung des experimentellen CED-Modells führt. Wir gehen
davon aus, dass TRD direkte intraluminale Effekte besitzt und seine antiinflammatorische Wirkung während der Akut-Phase der DSS-Colitis
erzielt.
5.4 Hat TRD eine antimikrobielle Wirkung auf die
intraluminale bakterielle Flora?
5.4.1 Funktion der Darmflora in der CED und in der DSSColitis
In der Darmflora des Menschen finden sich
Bakteriengattungen
mit
einigen
hundert
mindestens 50
Arten,
wobei
die
Bakteriendichte von oral nach aboral konstant zunimmt. Die
Bakterienkonzentration im Colon beträgt etwa 1010 – 1012 Bakterien pro
Gramm Darminhalt, wobei 90% der bakteriellen Besiedlung der
Darmflora
obligate
Anaerobier
ausmachen.
Die
Bakterien
der
physiologischen Darmflora, die durch Rezeptoren des angeborenen
50
Immunsystems erkannt werden, sind an der Auslösung und Ausprägung
chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen beim Menschen und im
Tiermodell
ursächlich
beteiligt
[62, 114-116]. Die
besonderen
Charakteristika hinsichtlich der Zusammensetzung der intestinalen
Mikroflora bei CED haben deren Modifikation mit Hilfe von Probiotika
ins therapeutische Blickfeld gerückt. Die Erhaltungstherapie der Colitis
ulcerosa mit E. coli Nissle 1917 ist mit einem Evidenzgrad Ib
wissenschaftlich anerkannt [82, 132 ].
Der wichtige Beitrag der Colonflora konnte weiterhin durch die
Ansprechbarkeit von CED auf antibiotische Behandlung im akuten
Schub unterstrichen werden [62, 99, 132].
Ein
möglicher
Weg
der
direkten
bakterienvermittelten
Entzündungsreaktion in der DSS-Colitis könnte die Überwindung der
mukosalen Barriere durch Translokation von Bakterien in die Lamina
Propria sein, wodurch es zur ungehinderten Aufnahme von Antigenen
und proinflammatorischen Molekülen wie luminalen Bakterien und ihren
Produkten kommt. Die wichtige Funktion der Darmflora in der DSSColitis wird weiterhin durch die Beobachtung gestützt, dass eine
Behandlung mit E. coli Nissle 1917 eine DSS-Colitis abschwächen kann
[62, 114, 115]. Weiterhin konnte bei einem DSS-Colitis-Mausmodell
gezeigt werden, dass die DNA kommensaler Bakterien eine chronische
Dickdarmentzündung verstärkt [94]. Auch die experimentelle Colitis in
IL-10 defizienten Mäusen tritt unter keimfreien Bedingungen nicht auf
und ist auf die vorherige Etablierung einer intestinalen Mikroflora
angewiesen.
51
5.4.2 Einordnung der eigenen Ergebnisse
Wir können nur Vermutungen darüber aufstellen, auf welche Weise
TRD seine protektive Wirkung auf die DSS-Colitis ausübt, aber wir
nehmen an, dass diese Wirkung, wie weiter oben erstmals erwähnt, auf
immunmodulatorische Fähigkeiten von TRD gegen intraluminale
Bakterien zurückzuführen ist.
Ein möglicher Erklärungsansatz bieten die speziellen Eigenschaften der
aktiven Metabolite Taurultam und Methyl-Taurultam, welche in Lage
dazu sind, Hydroxymethyl-Gruppen auf verschiedene bakterielle
Makromoleküle oder Pathogenitätsfaktoren wie Lipopolysaccharide oder
Exotoxine zu übertragen. Dieser chemische Vorgang bewirkt die
irreversible Deaktivierung von LPS und Exotoxinen.
TRD wird seit 1975 in der septischen Abdominalchirurgie als
intraperitoneale Spüllösung zur Behandlung der Peritonitis eingesetzt
[64-67, 98, 121]. Dabei zeigt TRD eine bakterizide Wirkung gegen ein
breites Spektrum von aeroben und anaeroben Bakterien wie auch gegen
klinisch relevante Pilzarten [9, 10, 17, 18, 51, 52].
Ein Überblick über das Wirkspektrum von TRD ist in Tabelle 6
dargestellt:
Tabelle 6: Fachinformation des Arzneimittels Taurolin. ArzneimittelKompendium der Schweiz, 2003
Anaerobe Bakterien:
Bacteroides fragilis
Aerobe Bakterien:
Streptokokken (Gr. A
– D)
Bacteroides vulgatus
Staph. aureus
Bacteroides distarsonis koagulase-negative
Staphylokokken
52
Pilze:
Candida albicans
Aspergillus fumigatus
Aspergillus niger
Peptostreptococcus
anaerobicus
Clostridien-Arten
Pneumokokken
Trichophyton
Enterobakterien
einschl. E.coli, Klebs.
aerogenes, SerratiaArten, Proteus-Arten
Pseudomonas
aeuruginosa
Salmonella
tyhi/enteritidis
Bukholderi cepacia
Cryptococcus
neoformans
Epidermophyton
Eine weitere Indikation liegt in der Behandlung von Infektionen
zentraler Venenkatheter. Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation
von TRD gegen Katheter-assoziierte Infektionen wirksam ist [76].
Daraus resultierend könnte diese intraluminale Wirkung des TRD eine
Veränderung der intestinalen Mikroflora bewirken, welche wiederum die
Immunantwort direkt beeinflussen könnte. Es gibt zunehmend Hinweise
darauf, dass die ansässige Darmflora eine ausschlaggebende Rolle in der
Initiation und Aufrechterhaltung der chronischen Inflammation spielt,
was, wie bereits angeführt, in zahlreichen genetischen und chemisch
induzierten Mausmodellen der DSS-Colitis gezeigt werden konnte,
wohingegen eine Krankheitsentwicklung unter keimfreien Bedingungen
nicht gegeben war [114, 115].
Somit könnte der therapeutische Effekt des TRD und die damit
verbundene Veränderungen der Darmflora die Wirkweise des TRD der
Wirkungsweise eines Probiotikums nahe kommen. Die Applikation von
Probiotika, wie beispielsweise E. coli Nissle 1917 oder andere Stämme
des Bifidobacteriums erzielte positive Effekte in einigen experimentellen
CED-Modellen und resultierte in einer verminderten Translokation
pathogener Bakterien in mesenteriale Lymphknoten.
53
Damit wäre ein geringerer inflammatorischer Stimulus die konsekutive
Folge.
Die Versuchsreihen dieser Arbeit lieferten jedoch keinen Hinweis auf
signifikante Veränderungen der bakteriellen Translokation in die
mesenteriale Lymphknoten. Dieses ist am ehesten auf die geringe
Gruppengröße zurückzuführen, die sich aus der erhöhten Mortalität in
der unbehandelten Colitis-Gruppe (n=3) ergab, welche eine zuverlässige
Auswertung nicht zulässt.
Als Ausblick wären an dieser Stelle sicherlich weitere Untersuchungen
in Bezug auf Stuhlkulturen und die Analyse der mesenterialen
Lymphknoten bei einer milderen Colitis sinnvoll.
5.5 Hemmung der Zytokinfreisetzung durch TRD
5.5.1 Systemische Wirkung während der SIRS-/Sepsis-Phase
der DSS-Colitis
Ein anderer mögliche Erklärungsansatz für das anti-inflammatorische
Wirkpotenzial
von
TRD
könnte
aus
den
modulierenden Fähigkeiten dieser Substanz
bereits
bekannten
in Bezug auf die
Zytokinproduktion inflammatorischer Zellen während des Auftretens
eines SIRS (systemical inflammatory response syndrom) bzw. einer
Sepsis, also eines SIRS mit nachgewiesener Infektion, resultieren [81].
Die Entwicklung der Sepsis wird im zeitlichen Verlauf zum einen von
einer überschiessenden Immunantwort und zum anderen von der Anergie
des
Immunsystems
Hyperinflammation,
charakteriesiert.
in
der
Anfänglich
aktivierte
54
CD4
dominiert
eine
Th1-Lymphozyten
proinflammatorische Zytokine, wie TNF-α, Interferon-γ und Interleukin2,
sezernieren.
Zusätzlich
schütten
Th2-Lymphozyten
antinflammatorische Zytokine, wie Interleukin-1 und Interleukin-10 aus.
Im Verlauf der Sepsis kommt es konsekutiv zu einer Abnahme der
Lymphozytenzellzahlen und der Zytokinsekretion, welches zu einer
zunehmenden Anergie des Immunsystems führt.
Weitere Studien bezüglich der Bedeutung der T-Zellen folgten in einem
DSS-Colitis-assoziierten Coloncarcinom-Modell aus dem Jahre 2011
[136]. Einige Mitglieder der TNF-Familie, darunter auch vor allem TNFα, vermitteln also pathophysiologische Prozesse wie septischer Schock,
Kachexie, Kanzerogenese und Autoimmunität [1].
Die detektierbaren TNF-Mengen sind also häufig mit pathologischen
Zuständen
verbunden
[1].
So
führt
eine
Stimulation
mit
Lipopolysaccharid (LPS) oder anderen bakteriellen Produkten, sowie
gram-positiven und gram-negativen Bakterien zu einer dramatischen
Erhöhung der TNF-Konzentration im Serum. Im Zusammenspiel mit
anderen Zytokinen gilt TNF als zentrales Molekül bei der Entstehung
des septischen Schocks [13, 80].
Bei der Sepsis wirkt TNF im Sinne einer Multiplikation des
Endotoxineffektes und ist als essentieller Mediator für die klinischen
Symptome der Sepsis verantwortlich [12, 43, 86, 132]. Die relativ hohe
DSS-Dosierung von 1,5% bzw. 1,0%, die in dieser Studie genutzt wurde,
führte zu einer schweren Colitis mit hohen DAI-Werten und einer hohen
Mortalität
in
der
unbehandelten
Colitis-Gruppe,
während
die
Behandlung mit TRD zu einer erheblichen Verbesserung führte.
Wir können annehmen, dass die Mehrheit der Tiere in dieser
unbehandelten Colitis-Gruppe an den Folgen eines SIRS/einer Sepsis
verstarben – wie es bei fulminanten Exazerbationen im Verlauf einer
55
CED beim Menschen bekannt ist. Möglicherweise spielt auch hier das
proinflammatorische „Schlüssel-Zytokin“ TNF- α eine entscheidende
Rolle.
Die Funktion von TNF- α in der DSS – Colitis wurde bereits 1997
nachgewiesen . So konnte Kojouharoff et al. zeigen, dass in der
chronischen Phase einer DSS-induzierten Colitis die Neutralisierung von
TNF zu einer Verminderung der Darmentzündung führt [75].
Wie könnte TRD nun in die TNF- α Effekte bei der DSS – Colitis
eingreifen?
In einer experimentellen Untersuchung mit menschlichen Makrophagen
konnte TRD nach LPS-Stimulation die Synthese von TNF-α und IL-1b
in vitro [7, 38, 119] und in vivo in Tiermodellen der Sepsis und
Peritonitis reduzieren [108]. Unsere Hypothese geht davon aus, dass
TRD in der Lage ist, die DSS-Colitis getriggerte Sepsis/SIRS
einzudämmen oder sogar zu hemmen.
Wir konnten diese Hypothese nicht untermauern, da unserer Studie der
Beweis für eine Reduktion der Zytokinexpression von TNF-α im
Vergleich zwischen TRD-behandelter und unbehandelter DSS-Colitis
fehlt. Andere proinflammatorische Zytokine wie IL-1b, IL-6 und CCL- 2
wurden in der Colitis-Gruppe nicht erhoben. Auch wurde keine Analyse
der Zytokinspiegel im Serum durchgeführt, wo wir die Anti-ZytokinEffekte von TRD vermuten.
Weitere Studien, die sich mit akuten Modellen der DSS-Colitis
beschäftigen ( z.B. DSS-Colitis über 5 Tage anstatt über 30 Tage) und
begleitende Serum-ELISA-Analysen zur Bestimmung der TNFKonzentration und Bestimmungen von Zytokin-Konzentrationen im
Colon sind notwendig, um diese Hypothese zu bestätigen.
56
Aktuelle Studien aus dem Jahre 2011 untersuchten bereits die
intravenöse Applikation von anderen endogenen mikrobiellen
Komponenten und zeigten u.a. eine Reduktion der intestinalen und
systemischen proinflammatorischen Zytokine [127].
5.6 Induktion der Apoptose in Immunzellen/Epithelzellen
durch TRD
Über eine anti-neoplastische Eigenschaft von TRD wurde unlängst in
diversen experimentellen und präklinischen Studien berichtet. TRD ist
ein starker Induktor der Apoptose, wie in einigen humanen Tumor-ZellLinien gezeigt wurde [26].
Obwohl TRD seine pro-apoptotischen Eigenschaften vorzugsweise auf
Tumorzellen ausübt, ist es zusätzlich denkbar, dass auch Immunzellen
ein Target für die Induktion der Apoptose darstellen.
Die Relevanz der Apoptose von aktivierten T-Zellen im intestinalen
Epithel für die Beendigung der inflammatorischen Kaskade wurde
bereits in einigen experimentellen CED-Modellen und auch in der CED
beim Menschen veranschaulicht [5, 88-90].
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen sind durch eine Störung der
intestinalen Barriere charakterisiert. Diese Barrierestörung führt zu einer
permanenten Aktivierung des mukosalen Immunsystems, woraus die
persistierende chronische Entzündung resultiert. Die Lamina propria ist
der bedeutendesde Ort der intestinalen Immunantwort. Hier wandern
gereifte B- und T-Zellen nach Induktion durch ein Antigen in den
Peyer’schen Plaques ein [35]. Die sich hier anschliessende TZellaktivierung durch dendritische Zellen ist ein physiologischer
57
Prozess, der kontinuierlich stattfindet. Durch die Antigenpräsentation
wird in der gesunden Mukosa eine Toleranz induziert, vermittelt durch
die Polarisation von naiven T-Zellen zu regulatorischen, Th1- und Th2Zellen. Eine Entzündungsreaktion wird durch ein Gleichgewicht dieser
T-Zellpopulationen
verhindert.
Kommt
es
unter
bestimmten
prädisponierenden Faktoren zur Dominanz einer polarisierten TZellsubpopulation, resultiert eine Entzündung. Diese polarisierten TZellen vermitteln wiederum die Freisetzung verschiedenster Mediatoren
aus den benachbarten Zellen, aber auch die Rekrutierung weiterer
Entzündungszellen in dieses Areal [68, 71]. Patienten mit Colitis
ulcerosa weisen beispielsweise erhöhte Konzentrationen von Th2Zytokinen auf. Das Schlüsselzytokin für die Th2-Polarisation ist das IL4 [11, 107].
Die TRD getriggerte verstärkte Apoptose könnte möglicherweise eine
Unterbrechung der T-Zell-getriggerten pro-inflammatorischen Prozesse
während der DSS-Colitis bewirken und somit zu einer Verringerung des
inflammatorischen Stimulus führen.
Wie sich in späteren Untersuchungen der Arbeitsgruppe zeigte, hat oral
appliziertes Taurolidin jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die
Carcinogenese in Mäusen mit DSS-induzierter Colitis [27].
58
6 Zusammenfassung
Die Zielsetzung dieser Studie bestand darin, die Toxizität von oral
appliziertem Taurolidin darzustellen und die Auswirkungen dieser
Applikationsform auf den Krankheitsprozess anhand des DSS Modells
der experimentellen Colits in C57/BL6 Mäusen, einem Stamm, von dem
bekannt ist, dass er empfänglich für oral appliziertes DSS ist, zu
untersuchen.
Wir konnten erstmalig zeigen, dass die orale Applikation von Taurolidin
gut toleriert wird und zu einer signifikanten klinischen und
histologischen Besserung des experimentellen CED-Modells führt.
Die orale Gabe von Taurolidin über 60 Tage hinweg zeigte keine
toxischen Effekte bezüglich der histomorphologischen Veränderungen
und des DAI.
Desweiteren zeigt unsere Arbeit erstmals den signifikant protektiven
Effekt von oral appliziertem Taurolidin im Krankheitsverlauf des
experimentellen Modells der DSS induzierten Colitis auf. TRD steigert
signifikant die Überlebensrate in der DSS-Colitis von 33% auf 100%
und verbessert den klinischen Verlauf der Erkrankung im Vergleich zur
unbehandelten DSS-Colitis. Die abnehmende Krankheitsaktivität nach
der oralen Behandlung mit TRD spiegelt sich in der nahezu fehlenden
Beeinträchtigung der Kryptenarchitektur auf der einen Seite und
fehlenden inflammatorischen Veränderungen auf der anderen Seite
hinsichtlich der Histologie im Bereich des Coecum wieder.
Interessanterweise
konnten
histomorphologischen
diese
verbesserten
Verhältnisse
nicht
im
inflammatorischen
distalen
Colon
nachgewiesen werden. Dieser von oral nach aboral hin abnehmende
Verlauf der anti-inflammatorischen Wirkung unterstützt die Annahme,
59
dass TRD seine Aktivität – wenigstens in einem gewissen Ausmass vom intraluminalen Raum her entfaltet. Folglich könnte die fehlende
Besserung der histologischen Veränderungen im Bereich des distalen
Colon auf die enterale Resorptionskinetik des TRD beruhen. Der
Mechanismus, über den TRD seine Wirkung in der DSS-Colitis erzielt,
bleibt letzen Endes weiterhin aufzuklären. Inhibitorische Wirkungen auf
die Zytokinsekretion oder auf die Apoptoseinduktion von Immunzellen
wären
ebenfalls
denkbar.
Wir
vermuten
direkte
intraluminale
antimikrobielle Wirkungen des TRD, sowie anti-inflammatorische
Wirkungsweisen während der akuten Phase der DSS-Colitis.
60
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80
DANKSAGUNG
Für die Erstellung dieser Arbeit schulde ich sehr vielen Menschen einen
herzlichen Dank.
Zu allererst gilt mein Dank meinem Doktorvater, Prof. Dr. Mittelkötter,
ohne den das alles nicht möglich gewesen wäre.
Des Weitern möchte ich mich bei seiner Arbeitsgruppe für die
Unterstützung und Begleitung bedanken.
Ein grosser Dank geht auch an Prof. Dr. Herdegen und seine
Arbeitsgruppe in Kiel für den erfolgreichen Ablauf des praktischen Teils
und die herzliche Aufnahme in das Team und in diese schöne Stadt.
Weiterhin möchte ich mich bei Dr. Ansgar Chromik bedanken für die
stetige Betreuung und Unterstützung während der ganzen Zeit der
Dissertation, trotz genügend eigener Verpflichtungen und zeitlicher
Einschränkungen.
Mein besonderer Dank richtet sich an meine Eltern und meine Freunde,
die die ganze Zeit über an mich geglaubt haben und letztendlich die
Fertigstellung dieser Arbeit und auch des Studiums erst ermöglicht
haben.
Und zuletzt möchte ich mich bei all denen bedanken, die ich bisher
vergessen habe zu erwähnen.
Lebenslauf
Name
Rottmann, Sabrina
Religion
evangelisch
Familienstand
ledig
Geburtstag
28.03.1980
Geburtsort
Bielefeld, Nordrhein-Westfalen
Schulausbildung
1986 – 1990
Grundschule Steinhagen
1990 – 1999
Ratsgymnasium Bielefeld
1999
Abschluss Abitur
Berufsausbildung
2001
Immatrikulation an der
Ruhr Universität Bochum
2005
Ärztliche Vorprüfung
2008 - 2009
Praktisches Jahr im Spital Riggisberg, Schweiz
sowie im Marien-Hospital, Witten
2009
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2010
Assistenzärztin am EVK Herne in der
Abteilung für Innere Medizin