HIV-Infektion: Diagnostik
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HIV-Infektion: Diagnostik Hartwig Klinker Schwerpunkt Infektiologie Medizinische Klinik und Poliklinik II der Universität Würzburg HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung Virologische Diagnostik - Wann was? Abhängig von • Virus und Krankheitsbild • Fragestellung • Untersuchungsmaterial • Krankheitsbeginn • Testkosten und Testdauer Virologische Diagnostik Antikörpernachweise Virusdirektnachweise • Nachweis der Immunantwort: – IgG, IgM, IgA • • Methoden: • – Enzymimmunoassay – Immunfluoreszenztest – Westernblot, Immunoblot – Komplementbindungsreaktion – Hämagglutinationshemmtest – Neutralisationstest Nachweis von Virusbestandteilen: – Partikel – Antigene – Genom Infektiosität? Methoden: – Zellkultur – Elektronenmikroskopie – Enzymimmunoassay – Immunfluoreszenztest – PCR Virologische Diagnostik: Wann was? Antikörpernachweise • bei generalisierten Infektionen • bei langer Inkubationszeit • nicht bei Immunsuppression Virusdirektnachweise • • • • bei lokalen Infektionen bei kurzer Inkubationszeit bei Reaktivierungen bei Immunsuppression Virologische Diagnostik: Antikörpernachweise • Material: Serum (oder Plasma) • Lagerung: bei 4°C für einige Tage, bei -20°C für Jahre • Nachweis einer akuten Infektion – durch IgM-Nachweis in Einzelprobe – durch Titeranstieg in Serumpaar • Keine „Normalwerte“ für IgG-Antikörpertiter • Antikörperteste bisher wenig standardisiert Antikörpernachweise Konventionelle biologische Methoden (Flüssigphasenteste) • • • • Hämagglutinationshemmtest (HHT) Neutralisationstest (NT) Komplementbindungsreaktion (KBR) Hämolysis-in-Gel (HIG)-Test Immunoassays (Festphasenteste) • • • • Immunfluoreszenztest (IFT) Enzymimmunoassay (EIA) Immunoblot, Western Blot Radioimmunoassay (RIA) Virologische Diagnostik: Virusdirektnachweise • Aus jeder Körperflüssigkeit und jedem Gewebe • Nach Möglichkeit Material von betroffenem Organ, z. B.: – Enzephalitis/Meningitis - Liquor – Pneumonie - Respirationstraktmaterial – Durchfall - Stuhlprobe • Lagerung: kurzzeitig bei 4°C Virologische Diagnostik: Virusdirektnachweise Methode Nachweis von Lichtmikroskopie Einschlußkörper Elektronenmikroskopie Viruspartikel, Virusbestandteile Virusanzucht in Zellkultur Infektiöses Virus Kurzzeitzellkultur mit Antigennachweis Infektiöses Virus EIA, IFT im Originalmaterial Virusantigene (z. B. Proteine) PCR, Hybridisierung Virusgenom Resistenzteste (phänotypisch, genotypisch) Medikamentenresistenz Indikationen für Virus-PCR Indikation Material Virus ZNS-Infektionen Liquor HSV, VZV, Enteroviren Hepatitis B/C Plasma/Serum HBV, HCV (qual. und Viruslast) HIV Plasma HIV (Viruslast) Immunsuppression Plasma, etc. CMV (qual. und Viruslast) Auge Konjunktivalabstrich Adenoviren, HSV Kammerwasser HSV, VZV, CMV Fruchtwasser, Amnionzottenbiopsie Rötelnvirus, CMV, VZV, Parvovirus B19, etc. Schwangerschaft CMV-Infektion nach Transplantation HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung HIV-Diagnostik pro m u r e S ängige ! n e h c u s r ben unte abh n u 2 r e Imm • HIV-Antikörpersuchteste (Elisa) zur Abklärung der Frage, ob eine HIV-Infektion vorliegt • Suchteste der 4. Generation erfassen sowohl Antikörper als auch HIV-Antigen • Sehr hohe Sensitivität und Spezifität (>99,9 %) • Westernblots zur Bestätigung von reaktiven Antikörpersuchtesten • Viruslastbestimmungen (z. B. PCR) als prognostischer Parameter und als Verlaufskontrolle zur Überwachung des Therapieerfolgs HIV Westernblot HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung Diagnostik bei HIV-Erstdiagnose Blutbild, Leberwerte, Nierenwerte, Elektrolyte, Gesamteiweiß, Elektrophorese, IgA, IgM, IgG, CRP Hepatitis-Serologie (HBV, HCV), Lues-Serologie, Toxoplasmose-Serologie, CMV-Serologie HIV-Viruslast Lymphozytendifferenzierung Sonographie Röntgen-Thorax Konsile Dermatologie, Neurologie, Ophtalmologie HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung Verlauf der HIV - Infektion Labor- Helfer-Zellen Stadium (/µl) Gürtelrose Mundsoor 1 Tuberkulose Kaposisarkom 500 Pneumocystose Geschwindigkeit wird bestimmt durch: 2 Toxoplasmose AIDS Kryptokokkose Kryptosporidiose Viruslast Atyp. Mykobak. Cytomegalie Lymphom 200 3 5 A Jahre 10 B Klinisches Stadium 12 C AIDS-free survival by human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) RNA category among groups with different baseline CD4+ lymphocyte counts I = < 500 copies/ml II = 500 – 3.000 III = 3.000 – 10.000 IV = 10.000 – 30.000 V = > 30.000 copies/ml Mellors et al., Ann Int Med 1997;126: 946-954 Bedeutung von HI-Viruslast und Helferzellen Geschwindigkeit Entfernung Helfer - Zellen Viruslast im Blut 1 Zeit bis zum Vollbild AIDS Vi ru sve rung ellproduktio rmeh Helferz Ä n HIV Jahre Ä H e l f e r zell produktion Therapie der HIV-Infektion Therapieziele: ÄMinimierung der HI-Virusmenge Ä Stabilisierung/Erhöhung der T-Helferzellzahl Ä Vermeidung HIV-bedingter Erkrankungen Ä Erhaltung/Verbesserung der Lebensqualität Ä Verbesserung der Lebenserwartung HIV-Diagnostik • HIV-Antikörpersuchteste (Elisa) zur Abklärung der Frage, ob eine HIV-Infektion vorliegt • Suchteste der 4. Generation erfassen sowohl Antikörper als auch HIV-Antigen • Sehr hohe Sensitivität und Spezifität (>99,9 %) • Westernblots zur Bestätigung von reaktiven Antikörpersuchtesten • Viruslastbestimmungen (z. B. PCR) als prognostischer Parameter und als Verlaufskontrolle zur Überwachung des Therapieerfolgs HIV-Diagnostik Viruslastbestimmung mittels quantitativer PCR Vermehrung von HIV in der Helferzelle Ausgangs-Viruslast 50.000 – 1.000.000 Kopien/ml Therapieziel:Viruslast < 50 (20) Kopien/ml HIV HIV HIV- Eintritt und Fusion Fusionshemmer/FI X X X NRTI, NNRTI HIV Protease Reverse Transkriptase Reverse Transkriptasehemmer/ X HIV Helfer - Zelle Integrase Proteasehemmer/PI HIV-Diagnostik T-Helferzellbestimmung mittels Durchflusszytometrie HIV-Diagnostik T-Helferzellbestimmung mittels Durchflusszytometrie Helferzellen nach 3 Jahren (Änderung zum Ausgangswert, Lopinavir/r + d4T + 3TC) 356 cells/mm3 400 3 cells/mm 300 200 All Patients 100 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 Week Week A Landay, et al., XIV Intl. AIDS Conf., Barcelona, 2002, Poster #B4439 Behandlung der HIV-Infektion Rückgang opportunistischer Infektionen Neu aufgetretene Erkrankungen pro 100 Patientenjahre 9 Atypische Mykobakteriose Zytomegalievirus-Infektion 8 7 6 89% 88% Die Behandlung der HIV-Infektion erfolgt weit überwiegend ambulant! 5 4 3 2 1 0 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Jahr der Diagnose Cohn D, et al. XIV Int AIDS Conference, Barcelona 2002, #1443 HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung HIV- Behandlung 2007: - Bewährtes und Neues - Therapiebegleitende Diagnostik Blutbild, Blutsalze, Leber-/Nierenwerte etc. HI-Viruslast T-Helferzellen Medikamentenspiegel Ggf. Resistenztest Eine lange Halbwertszeit der Medikamente hat große Vorteile Plasmakonzentration Phar m a k ok Medikament B Medikament A inetik Bereich potentieller Virusvermehrung 0 6 12 18 24 48 Zeit (Stunden) Nach David Back, Lissabon ECCATH 1999 Pharmakologische NRTI < NNRTI < PI Wechselwirkungen Pharmakologische Interaktionen in der HIV-Therapie Dezember 2004: Atazanavir/rtv 300/100 mg darf aufgrund der Reduktion der AtazanavirExpositionsspiegel nicht gleichzeitig mit Omeprazol angewendet werden Februar 2005: Wegen medikamenteninduzierter Hepatitiden soll Rifampicin nicht bei Patienten angewendet werden, die gleichzeitig Saquinavir/rtv als Teil ihrer antiretroviralen Therapie erhalten Häufigkeit der Einnahme von Säureblockern bei Patienten unter PI-haltiger HAART Inzidenz ösophagogastraler Beschwerden/Erkrankungen bei Patienten mit HIV-Infektion: Sodbrennen 62% Refluxösophagitis 29,5% Ulcera 13% Interaction Between Atazanavir + Omeprazole • • • N = 48 HIV- subjects ATV exposures substantially reduced by coadministration with OMP Not corrected by increased ATV dose or 8 oz cola OMP exposures not significantly altered Do not coadminister ATV/RTV 300/100 ATV/RTV 300/100 + 40 mg omeprazole 10,000 ATV/RTV 300/100 + 40 mg omeprazole + cola ATV/RTV 400/100 + 40 mg omeprazole Atazanavir Trough (ng/mL) • • 1000 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Time (h) Agarwala S, et al. , CROI 2005, Abstract 658. Johanniskraut Süddeutsche Zeitung, 25.02.2005 Protease-Inhibitoren - Kontraindizierte Medikamente - Therapeutisches Drug-Monitoring (TDM) von Protease-Inhibitoren (PI) und Nicht-Nucleosidischen Reverse Transcriptase-Inhibitoren (NNRTI) Schwierigkeiten mit der regelmäßigen Medikamenteneinnahme Gestörte Darmfunktion (z. B. Durchfall), gestörte Leberfunktion Einnahme vieler Medikamente (Wechselwirkungen) Unzureichender Therapieeffekt HAART bei Kindern, HAART während der Schwangerschaft PI-/NNRTI-bedingte Nebenwirkungen „once daily“ Therapien, klinische Studien Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universität Würzburg, Infektiologie HPLC/GC-Analysis of protease-inhibitors and non-nucleoside-reverse-transcriptase-inhibitors Medical Policlinic, University of Würzburg, Division of Infectious Diseases Therapeutisches Drug-Monitoring (TDM) HIV-Infektion: Diagnostik Grundzüge virologischer Diagnostik Diagnostik der HIV-Infektion Erweiterte Basisdiagnostik Diagnostik ausgewählter opportunistischer Infektionen Spezielle therapiebegleitende Diagnostik Therapeutisches Drug Monitoring Resistenztestung HIV- Behandlung 2007: - Bewährtes und Neues - Blutbild, Blutsalze, Leber-/Nierenwerte etc. HI-Viruslast T-Helferzellen Medikamentenspiegel Ggf. Resistenztest Resistenz ist das Ergebnis aus viraler Replikation, Mutationen und Selektionsdruck Viruslast Neue VirusPopulation Ursprüngliche Virus-Population Selektionsdruck durch Medikamente Resistenter Klon Zeit Viral dynamics and drug resistance “wild” type virus (drug susceptible) VIRAL LOAD “mutant” virus (drug resistant) TIME Viral dynamics and drug resistance VIRAL LOAD DRUG PRESSURE “wild” type virus (drug susceptible) “mutant” virus (drug resistant) TIME Clinical applications? VIRAL LOAD DRUG PRESSURE “wild” type virus (drug susceptible) “mutant” virus (drug resistant) TIME Wahrscheinlichkeit der Selektion resistenter HBV Mutanten Virale Resistenzentwicklung MINIMAL INKOMPLETT MAXIMAL Suppression der Virus-Replikation Combined Analysis of Baseline Abacavir Susceptibility vs HIV-1 RNA Response at Week 4 (n=92) 1 Change in HIV-1 RNA from Baseline (log10 copies/mL) 0 -1 -2 Treatment Status Experienced Naive -3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Baseline Abacavir Susceptibility (Fold-increase in IC50) ESTIMATED REGRESSION LINE:Change in Viral Load from Baseline (log copies/mL)=-1.4+0.18*Baseline Abacavir Susceptibility (R=0.51) Mutations selected by NRTIs/NTRTIs M Zidovudine Stavudine M E 41 44 L D Didanosine Abacavir Lamivudine E 44 D K 67 L T K 70 210 215 219 N R I W YF QE D K 65 67 R N 70 V 118 210 215 219 R I W YF QE K K L 65 74 R V K 65 R Zalcitabine D V 118 E 41 44 L D L T L M 69 74 V 184 V D K L Y M 65 R 74 V 115 F 184 V K 65 R K Emtricitabine 65 R K Tenofovir 65 R V 118 I T K M 184 VI M 184 VI V. A. Johnson et al., Topics HIV Med. 2004 Zeitlicher Verlauf der Resistenzentwicklung gegen HAART 10, 54, 71 L90M Viruslast 184 RT 400 50 Zeit Resistenztest-Methoden Phänotypischer Resistenztest • Direkte Messung der Replikation eines Virusisolates von einem Patienten oder der Funktion eines Virusenzyms in der Gegenwart von verschiedenen Medikamentenkonzentrationen in vitro Genotypischer Resistenztest • Bestimmung von genetischen Veränderungen (Mutationen) im Virusgenom, die mit einer verminderten Sensitivität gegenüber Medikamentenwirkungen assoziiert Vergleich der HIV-Resistenzverfahren Genotypische Teste Vorteile • • Nachteile Schneller, einfacher, billiger Standardmethoden • • • • • • Indirekte Resistenzmessung Komplexe Interpretation Limitierte Quantifizierbarkeit Erfordert Kenntnis der Mutationen Limitierte Erfassung von Interaktionen Limitierte Erfassung von Minoritätenpopulationen Phänotypische Teste Nachteile Vorteile • Direkte Messung der Resistenz • Aufwendig, langwierig • Verständliches Ergebnisformat (IC50) • Wenig standardisiert • Quantifizierbar • • Erfaßt auch unbekannte Mutationen Klinisch relevante Cut-offs noch nicht definiert • Erfaßt Interaktionen zwischen Mutationen • Limitierte Erfassung von Minoritätenpopulationen MultiResistenz Häufigkeit von Resistenzen gegen HIV- Medikamente (USA) Patienten vor Behandlung 100 Alle Klassen Häufigkeit von Mutationen (%) 18 14 NRTI 12 10 8 6 NNRTI 4 0 41% 40 25% 3c s las ug ug s las 2c I RT NN PI TI 165 0 NR 2001 13% dr 170 48% y An 156 At least 48% dr 2000 71% y An No. 1999 76% 80 60 Patienten mit HIV RNA >500 Kopien/mL 20 PI 2 % Drug resistance 16 te m sa tion e G ula p Po Drug resistance detected nach Novak RM et al. CID 2005;40:468-474 nach Richman D et al. AIDS 2004;18:1393-1401. HIV- Behandlung 2007: - Bewährtes und Neues - Durchführung von Resistenztests • Nach Primärinfektion • Vor Therapiebeginn • Therapieumstellung – Bei frühem Therapieversagen – Bei spätem Therapieversagen • Schwangerschaft • Postexpositionsprophylaxe HIV-Therapie 2007 Es gibt keine einfache HIV-Infektion: Strategie für alle Patienten, eine behandelbare, aber viele gute Möglichkeiten für den individuellen chronische Patienten! Infektion (-skrankheit) ostik!! n g ia D r e r e s s e b mer im k n a d t tz le u z t Nich
