Microarray-basierte DNA-Analyse in der klinischen Diagnostik

Special
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Microarray-basierte DNA-Analyse
in der klinischen Diagnostik
Michael Bonin und Olaf Riess
Microarray Facility Tübingen, Institut für
Anthropologie und Humangenetik,
Abteilung Medizinische Genetik, Tübingen
Einleitung
Einhergehend mit der vollständigen Sequenzierung des humanen Genoms sind
neueste Technologien für die DNA-Analyse entwickelt worden, die in unmittelbarer
Zukunft die klinisch-genetische Diagnostik
maßgeblich beeinflussen werden. Dabei
wird es zu einer umfassenden Ausweitung
des Anwendungsspektrums genetischer
Analysemethoden kommen, wodurch die
Einbeziehung der genetische Konstitution
des Patienten (genetische Variabilität) in
Fragestellungen einer individuellen Therapie möglich wird. Hierbei soll insbesondere
auf die individuelle Reaktion von Patienten
auf Medikamentengabe hingewiesen werden (Arzneimittelnebeneffekte, Arzneimittelwirksamkeit). Erste bahnbrechende Erkenntnisse in dieser Richtung sind auf dem
Gebiet der Tumortherapie, die mit Genexpressionsprofilen aus Tumorgewebe verglichen werden, zu verzeichnen (siehe Beitrag von Herrn Hoheisel). In unserem Beitrag möchten wir insbesondere auf die Chancen der umfassenden individuellen DNAAnalyse hinweisen.
Seit etwa drei Jahren drängen für diese
weitergehende Herausforderung microarraybasierte Technologien auf den Markt, die es
ermöglichen, bekannte Sequenzbereiche
mithilfe von Oligonukleotiden zu resequenzieren und damit Licht in das Dunkel
der genetischen Variabilität des Menschen
zu bringen[1, 2]. Maßgeblich beteiligt ist dabei die Firma Perlegen (www.perlegen.com),
eine Tochterfirma von Affymetrix, die mit
großformatigen Oligonukleotidarrays innerhalb von 18 Monaten insgesamt 50 menschliche Genome resequenziert hat und damit
erstmals einen Eindruck über die Variabilität
der ca. 3 Mrd. Basenpaaren vermitteln möchte. Insgesamt im Zuge dieser MicroarrayEntwicklungen wurde es über das so genannte CustomSeq™-Programm der Firma
Affymetrix für akademische Anwender mögBIOspektrum · 4/04 · 10. Jahrgang
Abb. 1: Bei der Entwicklung von Resequenzierungsarrays werden zu jedem Basenpaar acht Oligonukleotide photolithographisch synthetisiert. Dabei wird an der zentralen Position jedes Oligonukleotids
die vier alternativen Nukleotide eingebaut. Auf diese Weise sind für die Resequenzierung von 30.000
Basenpaaren 240.000 Sonden auf dem Array nötig. Bei der Auswertung werden die Hybridisierungssignale der 4 korrespondierenden Oligonukleotide eines Stranges bewertet und gegebenenfalls
Heterozygotien bzw. Mutationen festgestellt (Pfeil).
lich, selbst gewählte Sequenzbereiche in der
Größenordnung von 30.000 bp Doppelstrang
bzw. 60.000 nt Einzelstrang DNA zu definieren und auf der herkömmlichen GeneChip®-Platform von Affymetrix zu resequenzieren. Diese Methode der Sequenzierung durch Hybridisierung hält gegenwärtig
bereits in einigen wenigen Zentren in der
Molekularen Diagnostik Einzug und wird
zukünftig die sequenzorientierte Diagnostik nachhaltig verändern. Wir sehen dafür
insbesondere folgende Anwendungsgebiete:
• Komplexe Analyse polygener Erkrankungen (z.B. Bluthochdruck, idiopathische neurodegenerative Erkrankungen),
• Erfassung von genetisch-modifizierenden
Faktoren (Penetranz),
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• umfassende Analyse individualisierter genetischer Konstitutionen für pharmakogenomische Fragestellungen (z.B. Tumortherapie),
• genomweite Erfassung von Mikrodeletionen bei der Syndromdiagnostik,
• gezieltes Screening nach Mutationen kosten- und zeiteffizient für stark heterogene Erkrankungen (Resequenzierung, beispielsweise bei genetischen Ursachen
geistiger Retardierung, Polyneuropathien
usw.), und die
• genomweite Erfassung uniparentaler Disomien.
Technologie und Prozessierung
Die Microarray-basierte Resequenzierung
mithilfe der Affymetrix-Technologie beruht
auf der Verwendung photolithographischer
Techniken, kombinatorischer Synthese und
mittels molekularer Hybridisierung hochdichter Microarrays. Dabei werden, identisch zu der Fabrikation von Microarrays für
Genexpressionsanalysen, 25 Nukleotide lange Oligonukleotide auf einer Glasoberfläche
hoch geordnet synthetisiert. Für den zu analysierenden DNA-Strang werden vier Oligonukleotide für eine zu sequenzierende Base synthetisiert. An die zentrale Position (13.
Base) eines jeden Oligonukleotids werden
die vier alternativen Nukleotide A, C, G oder
T eingebaut (siehe Abb. 1). Insgesamt sind
somit für die Analyse eines Basenpaares
(Doppelstrang) acht unterschiedliche Oligonukleotide notwendig.
Die Prozessierung der Resequenzierungsarrays teilt sich in verschiedene Teilprozesse auf (Abb. 2). Zu Beginn findet eine
Amplifikation der zu resequenzierenden genomischen DNA in Form einer PCR statt.
Dabei ist es nicht relevant, ob diese Vervielfältigung als Long-Range oder Short-PCR
durchgeführt wird. Die anschließende
Quantifizierung kann in Form einer Doppelstrang-spezifischen Farbstoffmessung,
z.B. Picogreen erfolgen. Die verschiedenen
PCR-Produkte werden daraufhin äquimolar
vereinigt und unter zuhilfenahme einer
Nuklease fragmentiert. Die Markierung der
entstandenen Fragmente wird durch eine
Terminale Desoxynukleotidyl Transferase
mit biotinylierten Nukleotiden vorgenommen. Abschließend erfolgen die Hybridisierung auf den Array, ein Waschschritt sowie
die Färbung der biotinylierten Fragmente
mittels Streptavidin-Phycoerythrin. Das
Auslesen und die Auswertung der Hybridisierungssignale geschehen mit dem neuesten Affymetrix-Scanner 3000 und der entsprechenden GDAS Software. Dabei wird
die dem Array-Design zugrunde gelegte Sequenz mit den gemessenen Signalverteilungen verglichen und die ermittelte Ba-
Abb. 2: Die Prozessierung von ResequenzierungsMicroarrays gliedert sich in verschiedene Teilprozesse. Die verschiedenen Stufen der Präparation
sind aufgrund der Kontaminationsgefahr örtlich
zu trennen.
senabfolge dargestellt. Verglichen mit derzeitiger Sequenzier-Software gestalten sich
die bisher verfügbaren Microarray-basierten
Auswertungsroutinen als noch ausbaufähig.
Vielfach müssen sie durch eigens entwickelte Tools ergänzt werden.
Applikationen
Resequenzierungsarrays eröffnen eine Reihe von Einsatzmöglichkeiten in der grundlagenorientierten Forschung, wie auch in der
medizinischen Diagnostik. Ein Meilenstein
dieser Arbeit wurde bereits 2001 durch Patil und Kollegen mit der kompletten Rese-
quenzierung des Chromosoms 21 veröffentlicht[2]. Mit dem Ziel die SNP- und Haplotypen-Kollektion des vollständigen Chromosoms zu erhalten, wurden über 21 Mb von
20 ethnisch unterschiedlichen Individuen
resequenziert. Dabei konnten 35.989 SNPs
detektiert werden. Diese Ergebnisse besitzen u. a. besondere Relevanz für zukünftige
Assoziationsstudien zur Identifikation von
krankheitsrelevanten Genen bis hin zu
Untersuchungen von Suszeptibilität bei häufigen Erkrankungen.
Unmittelbare Produkte, welche aus diesen Arbeiten generiert wurden, stellen die
so genannten 100K SNP-Arrays (Affymetrix)
dar, welche es ermöglichen, mehr als 100.000
nahezu gleichmäßig über das Genom verteilte Polymorphismen, auch Einzelbasenaustausche (SNPs) genannt, innerhalb von
1–2 Tagen zu analysieren. Diese bereits jetzt
kommerziell erhältlichen Arrays finden bereits bei der Auffindung von kleinsten Deletionen (Mikrodeletionen) im Erbmaterial
beispielsweise bei der Diagnostik von Kindern mit Syndromverdacht ihre Anwendung.
Darüber hinaus kann dieselbe Technologie
zur genomweiten Erfassung der so genannten uniparentalen Disomie (Zustand, bei der
die homologen Chromosomen eines Kindes nicht von beiden Eltern, sondern nur von
einem Elternteil weitergegeben wurden) als
Ursache einer Entwicklungsverzögerung bei
Kindern angewandt werden (Abb. 3).
Neben diesen genomweiten Analysen
bekannter Polymorphismen zeichnen sich
bereits jetzt schon Einsatzmöglichkeiten für
Resequenzierungsarrays mit kleinerer Kapazität in der klinischen Diagnostik ab. Ein
herausragender Sektor wird die Sequenzierung durch Hybridiserung bei der schnellen
Identifikation von Krankheitserregern darstellen und Diagnosezeiten und damit Kosten für das Gesundheitssystem drastisch senken. Unlängst wurde auf dem Human Genome Meeting 2004 in Berlin durch Guiver
und Mitarbeiter ein Microarray-Design vorgestellt, das die Möglichkeit eröffnet, zwischen verschiedenen Neisseria meningococcus
Subtypen zu unterscheiden[3]. Die Zeit bis
zur Feststellung des Sub-Serotyps beträgt
bei der Verwendung von herkömmlichen
Methoden, wie Immunoassays in Kombination mit Kapillar-Sequenzierung 4–5 Tage. In Zukunft könnte diese Zeit auf etwa
einen Tag verkürzt und damit die medizinisch notwendige Serotyp-spezifische Behandlung bedeutend früher angewandt werden.
Eine weitere medizinisch-diagnostische
Verwendungsmöglichkeit besteht in der
schnellen und kostengünstigen Resequenzierung von großen krankheitsrelevanten
Genen oder Gengruppen. Unter Einsatz des
p53-Resequenzierungsarrays von Affymetrix
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Abb. 3: Schematische Darstellung einer segmentalen paternalen uniparentalen Disomie
(UPD). Die aufgeführten SNPs sind gemäß ihrer chromosomalen Lokalisation mit ihren
Genotypen aufgeführt. Die Buchstaben A und B repräsentieren die alternativen Allele. Die
segmentale UPD ist durch die mit Pfeilen besetzten SNPs begrenzt. Die SNPs im Kasten
demonstrieren die angrenzende eindeutig biparentale Vererbung.
wurde an 70 Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Brustkrebs-Geweben Mutationsanalysen an p53 durchgeführt[4]. Das
p53 Gen ist eine der zentralen Komponenten der Carcinogenese bei Brustkrebs, wie
auch bei anderen Krebsarten[5]. Der p53Microarray konnte in dieser Studie insgesamt 26 Mutationen in 24 Geweben nachweisen. Obwohl der Microarray im Vergleich
zur herkömmliche Sequenzierung nicht alle
Veränderungen detektierte, kann doch festgehalten werden, dass dieses Microarray-Design eine exzellente Ergänzung zur herkömmlichen Mutationsanalyse darstellt.
Diese Ergebnisse werden durch eigene
Untersuchungen auf dem Sektor der Mutationssuche krankheitsrelevanter Gene gestützt. Innerhalb der Microarray Facility Tübingen wurde ein Resequenzierungsarray
entwickelt, der den kompletten codierenden
Bereich sowie die Promoterregion des Gens
CFTR enthält. Dieses Gen ist in seiner mutierten Form für die Krankheit Mukoviszidose verantwortlich. Mukoviscidose oder
Cystische Fibrose (CF) ist eine der häufigsten autosomal-rezessiven Erkrankungen der
westlichen Welt. Die Häufigkeit wird durchschnittlich mit 1:2000 bis 1:3000 kaukasische
Neugeborene angegeben. Bisher wurden
über 1000 verschiedene CFTR-Allele mit
Mutationen identifiziert. Neben der häufigsten Mutation dF508 (72% in Deutschland)
existieren viele Mutationen mit einer geBIOspektrum · 4/04 · 10. Jahrgang
ringeren Häufigkeit bis hin zu privaten
Mutationen, welche nur in einer Familie zu
finden sind. Die herkömmliche Sequenzierung der 27 Exone von CFTR nimmt in
der klinischen Routine zwischen zwei und
vier Monate in Anspruch. Mit Hilfe
des von uns entwickelten Resequenzierungsarrays kann das gesamte Gen innerhalb
weniger Tage resequenziert werden. Bei der
Analyse von 33 bereits sequenzierten DNAProben, konnten bis auf eine 1-Basen Deletion alle Mutationen nachgewiesen und
bestätigt werden. Ferner wurden eine
Reihe bekannter Polymorphismen festgestellt.
Eine Entwicklung die ebenfalls große
medizinische Relevanz nach sich ziehen
kann, ist jüngst durch Maitra und Mitarbeitern in Genome Research publiziert worden[6]. Der dort beschriebene MitoChip enthält die komplette kodierende Sequenz des
humanen mitochondrialen Genoms. Für die
Resequenzierungsanalyse werden nur insgesamt 300 ng genomische DNA eingesetzt,
wobei die Amplifikation der zu analysierenden DNA nur drei überlappende Long-Range PCRs benötigt. Die Ergebnisse zeigen eine herausragende Reproduzierbarkeit mit
mehr als 99.99%. Somatische mitochondriale Mutationen sind häufig bei verschiedenen
Formen des Krebses detektierbar und können somit als Marker für die zukünftige
Früherkennung herangezogen werden.
Industrie-Applikationen
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Ausblick
Hochdichte Oligonukleotidmicroarrays werden seit Jahren als Werkzeug zur genomweiten Expressionsanalyse eingesetzt.
Durch die Verringerung der benötigten Synthesefläche und der Verbesserung von Auswertungsalgorithmen ist es gelungen, auch
Resequenzierungsarrays erfolgreich zu entwickeln. Die bisherige Limitierung für Akademiker auf 30.000 ist durch die neue 11µm
Technologie, verbunden mit dem neuen
hochauflösenden Scanner, nur der Anfang einer schnell voranschreitenden Entwicklung.
In der nächsten Generation von CustomSeq™-Arrays wird die Kapazität auf bis zu
300.000 Nukleotide ansteigen und damit die
Resequenzierung von kompletten Genclustern oder großen chromosomalen Regionen
ermöglichen, welche putativ krankheitsrelevante Gene enthalten. Daneben werden
in naher Zukunft eine Reihe von krankheitsspezifischen Resequenzierungsarrays
veröffentlicht werden, deren Testung der
Einsatzfähigkeit, im Gegensatz zu der sehr
aufwendigen Validierung von Expressionsanalysen, einfacher durchzuführen ist und
damit einen schnelleren Zugang zur diagnostischen Routine eröffnet.
Literatur
[1] Warrington et al. (2002): New Developments in
High-Throughput Resequencing ans Variation Detection
Using High Density Microarrays. Human Mutation 19:
402–409
[2] Patil et al. (2001): Blocks of Limited Haplotype Diversity Revealed by High-Resolution Scanning of Human
Chromosome 21. Science 294: 1719–1723
[3] Press Release Affymetrix 06.04.2004
[4] Cooper et al. (2004): Evaluation of Oligonucleotid
Arrays for Sequencing of p53 Gene in DNA from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Breast Cancer Specimens.
Clinical Chemistry 50: 3500–508
[5] Gasco et al. (2002): The p53 pathway in breast
cancer. Breast Cancer Res 4: 70–76
[6] Maitra et al. (2004): The Human MitoChip: a highthroughput sequencing Microarray for mitochrondrial
mutation detection. Genome Res 14: 812–819
Korrepondenzadresse:
Dr. Michael Bonin
Microarray Facility Tübingen
Service Provider Affymetrix
Institut für Anthropologie und Humangenetik
Abteilung Medizinische Genetik
Calwerstr. 7
D-72076 Tübingen
Tel.: 07071-29 72295
Fax: 07071-29 5172
[email protected]
www.microarray-facility.de