Durchflusszytometrie - eine Einführung Woher kommt

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Einführung in die Durchflusszytometrie
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Durchflusszytometrie - eine Einführung
Maria Zeilinger, BMA
/ Univ.Doz.Dr.med. Wolfgang Hübl
Zusammenfassung
Die Durchflusszytometrie ist eine relativ junge Labortechnik, die in der Medizin meist für die
Untersuchung von Zellen des Blutes oder Knochenmarks eingesetzt wird. Die dabei
gewonnenen Informationen dienen vor allem der Diagnose und Verlaufsbeobachtung von
Leukämien (Blutkrebs) und Immunschwächekrankheiten (HIV-Infektion).
Woher kommt der Name?
Links zu Spezialseiten
Das Streulicht
Leukämie & Lymphomdiagnostik
Das Fluoreszenzsignal
Apoptosedetektion mittels Annexin V
Das Gaten
Bestimmung von HLA-B27 (PDF-File)
2 Fallbeispiele
Woher kommt der Name?
Der Name Durchflusszytometrie kommt daher, dass bei dieser Technik verschiedene
Eigenschaften von Zellen oder anderen Teilchen untersucht werden, während diese Zellen
hintereinander (im "Gänsemarsch") durch eine dünne Messkammer fließen. Im Englischen
heißt die Technik "Flow Cytometry" und die Messkammer "Flow Cell", also Flusszelle. Für die
meisten Anwendungen der Durchflusszytometrie ist diese Flusszelle aus Glas und die zu
untersuchenden Zellen werden beim Durchfließen von der Seite von einem Laserlicht
angestrahlt.
Durchflusszellenblock eines Durchflusszytometers
Die Zellen kommen von oben (grauer Pfeil) und fließen hintereinander durch
die eigentliche Flusszelle (die Strecke innerhalb der Flusszelle ist durch einen
grauen Strich gekennzeichnet). Dabei werden die Zellen von einem Laser von
der Seite bestrahlt (blau eingezeichnet).
Der dargestellte Block ist etwa 4 cm x 7 cm groß.
Die Geräte, mit denen man durchflusszytometrische Analysen durchführt, heißen
Durchflusszytometer, auch "FACS-Geräte" oder kurz "FACS" genannt, die Analysen "FACSAnalysen".
Der Ausdruck "FACS" ist ein registriertes Markenzeichen der Firma Becton-Dickinson und steht eigentlich für
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24.9.2005
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Fluorescence Activated Cell Sorting. Er hat sich aber inzwischen als Ausdruck für Durchflusszytometrie
eingebürgert, wie "Tixo" für Klebeband.
Durchflusszytometer der Firma Beckman-Coulter
mit Computer zur Datenauswertung
(Foto Firma Beckman-Coulter)
1. Das Streulicht (engl. Light Scatter)
Eine Eigenschaft einer Zelle, die in der Durchflusszytometrie gemessen wird, ist das Streulicht.
Eine den Laserstrahl kreuzende Zelle verursacht Streulicht. Je größer eine Zelle ist und je
mehr Strukturen in ihrem Inneren sind, desto größer ist das entstehende Streulicht. Somit
erhält man durch Messung des Streulichts auf einfache Weise wichtige Informationen über die
Zelle.
Die Zelle streut das Licht in verschiedene Richtungen. Je nachdem in welchem Winkel man
das Streulicht misst, erhält man unterschiedliche Informationen.
Streulichtmessung
Solange der Laserstrahl ungehindert
durch die Flusszelle geht, entsteht
kein Streulicht.
Quert hingegen eine Zelle den Strahl,
wird das Licht in verschiedenste
Richtungen gestreut.
Gemessen wird das Streulicht meist
an 2 Stellen:
a) (fast) in Richtung des
ursprünglichen Strahls
(Vorwärtsstreulicht) und
b) etwa im 90° Winkel zum
ursprünglichen Strahl
(Seitwärtsstreulicht)
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a) Das Vorwärtsstreulicht
(engl. Forward Light Scatter oder Low Angle Scatter)
Das Vorwärtsstreulicht hängt vor allem von der Größe einer Zelle ab. Das heißt, kleine Zellen
verursachen ein kleines Vorwärtsstreulichtsignal, große Zellen ein großes.
Vorwärtsstreulicht
(Forward-Scatter)
Das (fast) in Vorwärtsrichtung des
Laserstrahl gestreute Licht gibt
Auskunft über die Größe der Zelle.
b) Das Seitwärtsstreulicht
(engl. Side Scatter, Orthogonal Scatter oder Right Angle Scatter)
Das Seitwärtsstreulicht hängt neben der Größe auch sehr stark vom Inhalt einer Zelle ab.
Finden sich in der Zelle sehr viele Lysosomen (das sind kleine, Enzym-speichernde Bläschen),
dann hat sie ein großes Seitwärtsstreulicht, finden sich nur wenige, dann ist ihr
Seitwärtsstreulicht gering.
Im Lichtmikroskop, nach Anfärbung der weißen Blutkörperchen, werden die Lysosomen als
körnige Strukturen sichtbar. Daher kann man auch sagen: ist eine Zelle im Lichtmikroskop
körnig aussehend, dann wird sie in der Durchflusszytometrie im allgemeinen ein hohes
Seitwärtsstreulicht erzeugen. Sieht sie nicht körnig aus, hat sie ein niedrigeres
Seitwärtsstreulicht.
Weiße Blutkörperchen
Lymphozyt
Monozyt
klein, kaum Granula groß, kaum Granula
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Neutrophiler
Granulozyt
groß, Granula
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In der Fachsprache nennt man diese Körner in der Zelle Granula und die Körnigkeit einer Zelle
Granularität.
Man spricht dann also davon, dass das Seitwärtsstreulicht von der Granularität der Zelle
abhängt. Hohe Granularität ("viele Körner in der Zelle") hohes Seitwärtsstreulicht, niedrige
Granularität ("wenige oder gar keine Körner in der Zelle") niedriges Seitwärtsstreulicht.
Seitwärtsstreulicht
(Side Scatter, Right Angle Scatter)
Das etwa im rechten Winkel zum
Laserstrahl entstehende Streulicht
hängt sowohl von der Größe der
Zellen, aber auch sehr stark von der
Granularität (der "Körnigkeit") der
Zellen ab.
Um die Streulicht-Messergebnisse anschaulich darzustellen, werden die Zellen in einer
Graphik, einem sog. Dot-Plot, dargestellt. Dabei wird meist auf der x-Achse das Vorwärts- und
auf der y-Achse das Seitwärtsstreulicht aufgetragen.
Streulicht-Dot-Plot
(schematische Darstellung)
Die Zellen werden nach ihrem
Vorwärtsstreulicht und ihrem
Seitwärtsstreulicht im Diagramm dargestellt
(Dot-Plot).
Man erkennt Anhäufungen von Zellen, die
offenbar ähnliche Streulichteigenschaften
haben. Die grüne Ansammlung entspricht
den Lymphozyten (klein, kaum Granula), die
blaue den Monozyten (groß, kaum Granula),
die rosa-farbene den Neutrophilen
Granulozyten (groß, viel Granula).
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Streulicht-Dot-Plot
(reale Darstellung)
So sieht ein Dot-Plot in Wirklichkeit aus.
Jeder Punkt entspricht einer gemessenen
Zelle (bzw. allgemein gesagt, einem
gemessenen Ereignis, denn es müssen
nicht immer Zellen sein, die man misst).
Die Farben kann man den einzelnen Zellen
bei der Auswertung zuordnen. Sie haben
nichts mit der Farbe oder Fluoreszenz der
Zellen zu tun.
Anmerkung: der Übersichtlichkeit halber wurde auf die Basophilen und Eosinophilen Granulozyten nicht näher
eingegangen.
2. Das Fluoreszenzsignal
Das Durchflusszytometer kann mehr
Im vorigen Abschnitt wurde dargestellt, wie man durch Auswertung des Streulichts die
wichtigsten Untergruppen der weißen Blutkörperchen (Granulozyten, Monozyten und
Lymphozyten) unterscheiden kann. Das wäre aber noch nichts Besonderes, das kann fast
jedes einfache Blutbild-Analysengerät. Ein modernes Durchflusszytometer kann aber mehr: es
kann auch Fluoreszenzlicht messen und erlaubt dadurch, eine Vielzahl von Merkmalen auf den
Blutzellen zu untersuchen.
Zellen müssen markiert werden
Will man eine bestimmtes Merkmal einer Zelle untersuchen, muss man dieses Merkmal zuerst
einmal markieren. Und das geschieht mit einem Antikörper, der gegen dieses Merkmal
gerichtet ist. Außerdem trägt dieser Antikörper eine fluoreszierende Gruppe. Das ist ein
Molekül, das aufleuchtet, wenn es mit einem Laser oder einer anderen Lichtquelle bestrahlt
wird. Solche Antikörper kann man bei verschiedenen Firmen kaufen. Und es gibt sie bereits
gegen eine große Zahl von Zellmerkmalen.
Bringt man Antikörper und Zellen zusammen, setzt sich der Antikörper auf diejenigen Zellen,
die das Merkmal auf der Oberfläche tragen. Die Zelle ist dadurch markiert und wird bei
Durchqueren des Laserstrahls des Durchflusszytometers aufleuchten.
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Darstellung der Fluoreszenzmessung anhand eines Beispiels: die Bestimmung der Tund der B-Lymphozyten
Die Lymphozyten des Blutes sehen im Mikroskop zwar recht einheitlich aus, bestehen aber
aus verschiedenen Untergruppen. Die wichtigsten sind die T-Lymphozyten, B-Lymphozyten
und die Natural-Killer-Zellen. Diese Gruppen sind aber weder im Mikroskop noch mit einem
normalen Blutbild-Analysegerät eindeutig zu unterscheiden.
Einem Lymphozyten sieht man auch im Mikroskop (meist) nicht an, ob er ein B- oder TLymphozyt ist oder ob er eine Helper-Zelle, eine Natural-Killer-Zelle oder eine zytotoxische
Zelle ist. Die Durchflusszytometrie kann dies abklären.
Will man wissen, wieviel T-Zellen und B-Zellen im Blut eines Patienten sind, führt man eine
durchflusszytometrische Analyse durch.
Dazu braucht man einmal einen Antikörper, der uns die T-Lymphozyten markiert. Diese tragen
ein Merkmal an ihrer Oberfläche, das man CD3 nennt. Also brauchen wir einen Antikörper
gegen CD3. Damit wir im Durchflusszytometer auch etwas sehen, nehmen wir einen CD3Antikörper, an den ein Fluoreszenzmolekül gekoppelt ist. Nehmen wir z.B. einen FITCgekoppelten Antikörper. FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat) ist ein grünfluoreszierendes Molekül.
Kurz gesagt, wir nehmen einen CD3-FITC Antikörper.
Antikörper gegen T- und B-Lymphozyten
Grün-fluoreszierender Antikörper gegen T-Lymphozyten (CD3-FITC) und
gelbrot-fluoreszierender Antikörper gegen B-Lymphozyten (CD19-PE). In den
Fläschchen sind je 2 ml Flüssigkeit, in der die Antikörper gelöst sind.
Die B-Zellen müssen wir aber auch markieren. Diese haben ein anderes Merkmal an ihrer
Oberfläche. Das Merkmal nennt man CD19. Wir nehmen also einen Antikörper gegen CD19.
Diesmal aber keinen an FITC gekoppelten sondern einen, der an einen anderen Farbstoff
gekoppelt ist. Z.B. einen an PE gekoppelten. PE (=Phycorythrin) ist ein gelbrot
fluoreszierendes Molekül. Wir verwenden also den Antikörper CD19-PE.
Jetzt müssen wir das Blut des Patienten mit den Antikörpern zusammenbringen. Dazu gibt
man eine sehr kleine Flüssigkeitsmenge (5 - 20 µl) aus beiden Antikörperfläschchen in ein
Plastikröhrchen. Danach wird eine bestimmte Menge Blut (25 - 100 µl) dazugegeben. Das lässt
man dann eine Zeit stehen (Inkubation).
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Inkubation der Zellen mit den Antikörpern
Aus beiden Antikörperfläschchen wurden je 10 µl Antikörper in das Röhrchen pipettiert. Danach
wurden 50 µl Blut des Patienten hinzugefügt. Nach dem Vermischen lässt man das ganze 10 bis
30 Minuten bei Raumtemperatur am besten lichtgeschützt stehen. Das nennt man auch
Inkubation, vom lateinischen incubare: auf etwas liegen, brüten. Die Zellen werden
gewissermaßen mit dem Antikörper bebrütet.
Während der Inkubation setzen sich die CD3-FITC Antikörper auf die T-Lymphozyten und die
CD19-PE Antikörper auf die B-Lymphozyten. Die T-Lymphozyten werden also mit einem
grünem Fluoreszenzfarbstoff, die B-Lymphozyten mit einem gelbroten Fluoreszenzfarbstoff
markiert.
Markierung der T- und B-Lymphozyten
Während der Inkubation (Bebrütung) der Blutzellen mit
den Antikörpern setzen sich die CD3-FITC Antikörper
auf die T-Lymphozyten und die CD19-PE Antikörper auf
die B-Lymphozyten. Dies ist links schematisch
dargestellt.
In Wirklichkeit sind die Antikörper im Vergleich zu den
Lymphozyten viel kleiner und es setzen sich tausende
Antikörper auf eine Zelle.
Bevor man die weißen Blutkörperchen im Durchflusszytometer messen kann, muss man noch
die roten Blutkörperchen entfernen. Zu diesem Zweck gibt man ein spezielle Flüssigkeit dazu,
die die roten Blutkörperchen zerstört.
Lyse (Zerstörung) der roten Blutkörperchen
Im Blut sind etwa 1000 mal mehr rote als weiße Blutkörperchen. Es erleichtert daher die
durchflusszytometrische Messung der weißen Blutkörperchen, wenn man die roten
Blutkörperchen vorher entfernt. Dazu gibt man ein spezielles Mittel, ein sog. Lyse-Reagenz dazu.
Die Lyse der roten Blutkörperchen dauert etwa 10 Minuten.
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Nach der Lyse der roten Blutkörperchen kann man die weißen Blutkörperchen der Probe
ungestört am Durchflusszytometer messen. Die Probe wird in das Gerät gesaugt (genau
genommen wird sie mit Hilfe von Druck ins Gerät gedrückt, man spricht aber trotzdem meist
vom Ansaugen) und die Zellen fließen durch die Flusszelle des Geräts. Beim Queren des
Laserstrahls werden die T-Lymphozyten grün und die B-Lymphozyten gelb-rot aufleuchten.
Messung der T- und B-Lymphozyten
Quert eine Zelle den Laserstrahl, die
mit dem FITC-Antikörper markiert ist,
leuchtet sie grün auf.
Da wir CD3-FITC verwendet haben,
können wir schließen, dass dies ein TLymphozyt sein wird.
Eine (gelb)rot aufleuchtende Zelle wird
ein B-Lymphozyt sein, da wir CD19-PE
verwendet haben und PE gelbrot
fluoresziert.
Wie bei den Streulichtsignalen stellt man auch die Ergebnisse der Fluoreszenzmessungen in
einer anschaulichen Graphik, einem Dot-Plot dar.
Dot-Plot Graphik der Ergebnisse der
Fluoreszenzmessung
Jeder Punkt entspricht einer Zelle.
Die FITC-Fluoreszenz (grün) ist auf der X-Achse, die
PE-Fluoreszenz (gelbrot) auf der Y-Achse
aufgetragen.
Grün aufleuchtende Zellen sind daher rechts unten
zu finden. Sie sind mit dem T-Lymphozytenmarker
CD3-FITC markiert, also die T-Lymphozyten.
Gelbrot aufleuchtende Zellen sind links oben. Sie
sind mit dem B-Lymphozytenmarker CD19-PE
markiert, also B-Lymphozyten.
Die Punkte sind nur der Anschaulichkeit wegen grün oder rot
gefärbt. Das hat direkt nichts mit der Fluoreszenzfarbe zu tun.
In der obigen Abbildung sieht man, dass im Blut des Patienten mehr T-Lymphozyten (grün) als
B-Lymphozyten (rot) waren. Das ist durchaus normal. Das obige Bild entspricht den normalen
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Verhältnissen beim Gesunden.
Die schwarzen Punkte entsprechen ungefärbten Zellen, also Zellen, die weder B- noch TLymphozyten sind. Die Mehrzahl dieser Zellen sind die sog. Natural-Killer Zellen.
4-Farben sind Standard
Für das Beispiel wurden 2 verschiedene Fluoreszenzmarker eingesetzt. Tatsächlich gibt es sehr viele
verschiedene Fluoreszenzmarker, die in den verschiedensten Farben leuchten können und durch verschiedene
Lichtwellenlängen anregbar sind.
Moderne Durchflusszytometer für den Routineeinsatz können neben den Streulichteigenschaften heute meist 4
verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden. Man kann also neben dem Streulicht 4 Merkmale der Zelle
gleichzeitig in einem Röhrchen färben und bestimmen. Inzwischen kommen Durchflusszytometer für den
Routineeinsatz auf den Markt, die 6 Farben gleichzeitig messen können. Dies wird die Möglichkeiten der Analytik
ganz wesentlich erweitern.
Experimentelle Geräte können schon seit einiger Zeit 10 oder mehr Farben messen, sind aber für den RoutineEinsatz ungeeignet.
3. Das Gaten ("Schleusen")
Im obigen Beispiel, bei der Darstellung der B- und T-Lymphozyten im Fluoreszenz-Dot-Plot
CD3-FITC/CD19-PE wurde etwas verschwiegen. Ohne es extra zu erwähnen, wurde eine
wichtige Auswertetechnik der Durchflusszytometrie eingesetzt: das Gaten.
Denn in diesem Dot-Plot sind nur die Lymphozyten dargestellt und Sie könnten sich fragen, wo
sind die Granulozyten und Monozyten geblieben? Die wurden durch das Gaten schon vorher
ausgeschlossen.
Ziel des Gaten ist es meist, die Zellen auszuwählen, die einen wirklich interessieren. Bleiben
wir bei dem obigen Beispiel. Wir wollten wissen, wie viele der Lymphozyten T-Lymphozyten
und wie viele B-Lymphozyten sind. Die Monozyten und Granulozyten haben uns in diesem Fall
nicht interessiert. Ja sie würden sogar die Darstellung der Lymphozyten stören. Wir mussten
sie ausgrenzen. In der Praxis funktioniert das durch Gaten sehr einfach: man zeichnet mit der
Computer-Maus eine Region in das Streulichtdiagramm ein, die nur die Lymphozyten enthält.
Man nennt diese Region R1. Und dann "sagt man" dem Fluoreszenz-Dot-Plot: "Zeig mir nur
die Zellen aus R1". Und das geschieht dann auch. Das Computerprogramm lässt ("schleust",
"gatet") nur die Zellen aus R1 in den Fluoreszenz-Dot-Plot.
Region R1 im Streulicht-Dot-Plot links definiert die Lymphozyten. Und nur diese werden in den FluoreszenzDot-Plot rechts gegatet (geschleust). Dadurch hat man im rechten Dot-Plot nur mehr die Zellen, die einen
interessieren, die man näher untersuchen möchte.
Bei einer anderen Aufgabe könnten das natürlich auch andere Zellen sein, z.B. die Monozyten (blaue Punkte
links). Dann müsste man R1 um diese Zellen zeichnen.
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Sehr komplexe Auswertungen sind möglich
Oben ist das einfachste Beispiel von Gaten dargestellt: man definiert eine Gruppe von Zellen und gatet sie in ein
anderes Diagramm. Moderne Auswerte-Programme können aber viel mehr.
Meist lassen sich bis zu 16 verschiedenen Regionen und 16 Gates definieren, die auch noch mit logischen
Operatoren (UND, ODER, UND NICHT) untereinander verknüpft werden können.
4. Beispiele der Anwendung
Fall 1.
70-jähriger Patient zeigt eine erhöhte Anzahl weißer Blutkörperchen (14000/µl). Bei der
mikroskopischen Untersuchung des Blutes sieht man, dass von den verschiedenen weißen
Blutkörperchen die Lymphozyten vermehrt sind.
Bei der mikroskopischen Untersuchung zeigt sich eine Vermehrung auffälliger
Lymphozyten.
Das kann verschiedene Ursachen haben. Man führt eine Bestimmung der T- und BLymphozyten durch.
Bei der durchflusszytometrischen Analyse der Lymphozyten fällt auf, dass es sich fast ausschließlich um BLymphozyten (rot dargestellt) handelt. Beim Gesunden (rechts) ist das ganz anders, da überwiegen die TLymphozyten (grün dargestellt).
Dieser Befund lässt auf einen Blutkrebs (Leukämie) der B-Lymphozyten schließen. In einem
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solchen Fall werden noch zahlreiche andere Marker auf den Zellen untersucht. Unter
Berücksichtigung des Aussehens der Zellen im Mikroskop und der Beschwerden und Zeichen
des Patienten sprachen die Marker für das Vorliegen einer CLL, also einer chronisch
lymphatischen Leukämie.
Fall 2.
30-jähriger Patient mit bekannter HIV-Infektion. Um sich ein Bild von der Leistungsfähigkeit
seiner Abwehr zu machen, bestimmt man die CD4-positiven T-Lymphozyten, die sog.
Helperzellen.
Grün eingezeichnet sind die Helperzellen. Man erkennt, dass bei dem HIV-infizierten Patienten eine deutliche
Verminderung der Helperzellen vorliegt. Unterschreitet die Anzahl der Helperzellen bestimmte Grenzen, dann
wird eine vorbeugende Behandlung mit Antibiotika empfohlen.
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