Durchflusszytometrie - eine Einführung Woher kommt
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Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 1 von 11 Durchflusszytometrie - eine Einführung Maria Zeilinger, BMA / Univ.Doz.Dr.med. Wolfgang Hübl Zusammenfassung Die Durchflusszytometrie ist eine relativ junge Labortechnik, die in der Medizin meist für die Untersuchung von Zellen des Blutes oder Knochenmarks eingesetzt wird. Die dabei gewonnenen Informationen dienen vor allem der Diagnose und Verlaufsbeobachtung von Leukämien (Blutkrebs) und Immunschwächekrankheiten (HIV-Infektion). Woher kommt der Name? Links zu Spezialseiten Das Streulicht Leukämie & Lymphomdiagnostik Das Fluoreszenzsignal Apoptosedetektion mittels Annexin V Das Gaten Bestimmung von HLA-B27 (PDF-File) 2 Fallbeispiele Woher kommt der Name? Der Name Durchflusszytometrie kommt daher, dass bei dieser Technik verschiedene Eigenschaften von Zellen oder anderen Teilchen untersucht werden, während diese Zellen hintereinander (im "Gänsemarsch") durch eine dünne Messkammer fließen. Im Englischen heißt die Technik "Flow Cytometry" und die Messkammer "Flow Cell", also Flusszelle. Für die meisten Anwendungen der Durchflusszytometrie ist diese Flusszelle aus Glas und die zu untersuchenden Zellen werden beim Durchfließen von der Seite von einem Laserlicht angestrahlt. Durchflusszellenblock eines Durchflusszytometers Die Zellen kommen von oben (grauer Pfeil) und fließen hintereinander durch die eigentliche Flusszelle (die Strecke innerhalb der Flusszelle ist durch einen grauen Strich gekennzeichnet). Dabei werden die Zellen von einem Laser von der Seite bestrahlt (blau eingezeichnet). Der dargestellte Block ist etwa 4 cm x 7 cm groß. Die Geräte, mit denen man durchflusszytometrische Analysen durchführt, heißen Durchflusszytometer, auch "FACS-Geräte" oder kurz "FACS" genannt, die Analysen "FACSAnalysen". Der Ausdruck "FACS" ist ein registriertes Markenzeichen der Firma Becton-Dickinson und steht eigentlich für www.med4you.at 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 2 von 11 Fluorescence Activated Cell Sorting. Er hat sich aber inzwischen als Ausdruck für Durchflusszytometrie eingebürgert, wie "Tixo" für Klebeband. Durchflusszytometer der Firma Beckman-Coulter mit Computer zur Datenauswertung (Foto Firma Beckman-Coulter) 1. Das Streulicht (engl. Light Scatter) Eine Eigenschaft einer Zelle, die in der Durchflusszytometrie gemessen wird, ist das Streulicht. Eine den Laserstrahl kreuzende Zelle verursacht Streulicht. Je größer eine Zelle ist und je mehr Strukturen in ihrem Inneren sind, desto größer ist das entstehende Streulicht. Somit erhält man durch Messung des Streulichts auf einfache Weise wichtige Informationen über die Zelle. Die Zelle streut das Licht in verschiedene Richtungen. Je nachdem in welchem Winkel man das Streulicht misst, erhält man unterschiedliche Informationen. Streulichtmessung Solange der Laserstrahl ungehindert durch die Flusszelle geht, entsteht kein Streulicht. Quert hingegen eine Zelle den Strahl, wird das Licht in verschiedenste Richtungen gestreut. Gemessen wird das Streulicht meist an 2 Stellen: a) (fast) in Richtung des ursprünglichen Strahls (Vorwärtsstreulicht) und b) etwa im 90° Winkel zum ursprünglichen Strahl (Seitwärtsstreulicht) www.med4you.at 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 3 von 11 a) Das Vorwärtsstreulicht (engl. Forward Light Scatter oder Low Angle Scatter) Das Vorwärtsstreulicht hängt vor allem von der Größe einer Zelle ab. Das heißt, kleine Zellen verursachen ein kleines Vorwärtsstreulichtsignal, große Zellen ein großes. Vorwärtsstreulicht (Forward-Scatter) Das (fast) in Vorwärtsrichtung des Laserstrahl gestreute Licht gibt Auskunft über die Größe der Zelle. b) Das Seitwärtsstreulicht (engl. Side Scatter, Orthogonal Scatter oder Right Angle Scatter) Das Seitwärtsstreulicht hängt neben der Größe auch sehr stark vom Inhalt einer Zelle ab. Finden sich in der Zelle sehr viele Lysosomen (das sind kleine, Enzym-speichernde Bläschen), dann hat sie ein großes Seitwärtsstreulicht, finden sich nur wenige, dann ist ihr Seitwärtsstreulicht gering. Im Lichtmikroskop, nach Anfärbung der weißen Blutkörperchen, werden die Lysosomen als körnige Strukturen sichtbar. Daher kann man auch sagen: ist eine Zelle im Lichtmikroskop körnig aussehend, dann wird sie in der Durchflusszytometrie im allgemeinen ein hohes Seitwärtsstreulicht erzeugen. Sieht sie nicht körnig aus, hat sie ein niedrigeres Seitwärtsstreulicht. Weiße Blutkörperchen Lymphozyt Monozyt klein, kaum Granula groß, kaum Granula www.med4you.at Neutrophiler Granulozyt groß, Granula 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 4 von 11 In der Fachsprache nennt man diese Körner in der Zelle Granula und die Körnigkeit einer Zelle Granularität. Man spricht dann also davon, dass das Seitwärtsstreulicht von der Granularität der Zelle abhängt. Hohe Granularität ("viele Körner in der Zelle") hohes Seitwärtsstreulicht, niedrige Granularität ("wenige oder gar keine Körner in der Zelle") niedriges Seitwärtsstreulicht. Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, Right Angle Scatter) Das etwa im rechten Winkel zum Laserstrahl entstehende Streulicht hängt sowohl von der Größe der Zellen, aber auch sehr stark von der Granularität (der "Körnigkeit") der Zellen ab. Um die Streulicht-Messergebnisse anschaulich darzustellen, werden die Zellen in einer Graphik, einem sog. Dot-Plot, dargestellt. Dabei wird meist auf der x-Achse das Vorwärts- und auf der y-Achse das Seitwärtsstreulicht aufgetragen. Streulicht-Dot-Plot (schematische Darstellung) Die Zellen werden nach ihrem Vorwärtsstreulicht und ihrem Seitwärtsstreulicht im Diagramm dargestellt (Dot-Plot). Man erkennt Anhäufungen von Zellen, die offenbar ähnliche Streulichteigenschaften haben. Die grüne Ansammlung entspricht den Lymphozyten (klein, kaum Granula), die blaue den Monozyten (groß, kaum Granula), die rosa-farbene den Neutrophilen Granulozyten (groß, viel Granula). www.med4you.at 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 5 von 11 Streulicht-Dot-Plot (reale Darstellung) So sieht ein Dot-Plot in Wirklichkeit aus. Jeder Punkt entspricht einer gemessenen Zelle (bzw. allgemein gesagt, einem gemessenen Ereignis, denn es müssen nicht immer Zellen sein, die man misst). Die Farben kann man den einzelnen Zellen bei der Auswertung zuordnen. Sie haben nichts mit der Farbe oder Fluoreszenz der Zellen zu tun. Anmerkung: der Übersichtlichkeit halber wurde auf die Basophilen und Eosinophilen Granulozyten nicht näher eingegangen. 2. Das Fluoreszenzsignal Das Durchflusszytometer kann mehr Im vorigen Abschnitt wurde dargestellt, wie man durch Auswertung des Streulichts die wichtigsten Untergruppen der weißen Blutkörperchen (Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten) unterscheiden kann. Das wäre aber noch nichts Besonderes, das kann fast jedes einfache Blutbild-Analysengerät. Ein modernes Durchflusszytometer kann aber mehr: es kann auch Fluoreszenzlicht messen und erlaubt dadurch, eine Vielzahl von Merkmalen auf den Blutzellen zu untersuchen. Zellen müssen markiert werden Will man eine bestimmtes Merkmal einer Zelle untersuchen, muss man dieses Merkmal zuerst einmal markieren. Und das geschieht mit einem Antikörper, der gegen dieses Merkmal gerichtet ist. Außerdem trägt dieser Antikörper eine fluoreszierende Gruppe. Das ist ein Molekül, das aufleuchtet, wenn es mit einem Laser oder einer anderen Lichtquelle bestrahlt wird. Solche Antikörper kann man bei verschiedenen Firmen kaufen. Und es gibt sie bereits gegen eine große Zahl von Zellmerkmalen. Bringt man Antikörper und Zellen zusammen, setzt sich der Antikörper auf diejenigen Zellen, die das Merkmal auf der Oberfläche tragen. Die Zelle ist dadurch markiert und wird bei Durchqueren des Laserstrahls des Durchflusszytometers aufleuchten. www.med4you.at 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 6 von 11 Darstellung der Fluoreszenzmessung anhand eines Beispiels: die Bestimmung der Tund der B-Lymphozyten Die Lymphozyten des Blutes sehen im Mikroskop zwar recht einheitlich aus, bestehen aber aus verschiedenen Untergruppen. Die wichtigsten sind die T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und die Natural-Killer-Zellen. Diese Gruppen sind aber weder im Mikroskop noch mit einem normalen Blutbild-Analysegerät eindeutig zu unterscheiden. Einem Lymphozyten sieht man auch im Mikroskop (meist) nicht an, ob er ein B- oder TLymphozyt ist oder ob er eine Helper-Zelle, eine Natural-Killer-Zelle oder eine zytotoxische Zelle ist. Die Durchflusszytometrie kann dies abklären. Will man wissen, wieviel T-Zellen und B-Zellen im Blut eines Patienten sind, führt man eine durchflusszytometrische Analyse durch. Dazu braucht man einmal einen Antikörper, der uns die T-Lymphozyten markiert. Diese tragen ein Merkmal an ihrer Oberfläche, das man CD3 nennt. Also brauchen wir einen Antikörper gegen CD3. Damit wir im Durchflusszytometer auch etwas sehen, nehmen wir einen CD3Antikörper, an den ein Fluoreszenzmolekül gekoppelt ist. Nehmen wir z.B. einen FITCgekoppelten Antikörper. FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat) ist ein grünfluoreszierendes Molekül. Kurz gesagt, wir nehmen einen CD3-FITC Antikörper. Antikörper gegen T- und B-Lymphozyten Grün-fluoreszierender Antikörper gegen T-Lymphozyten (CD3-FITC) und gelbrot-fluoreszierender Antikörper gegen B-Lymphozyten (CD19-PE). In den Fläschchen sind je 2 ml Flüssigkeit, in der die Antikörper gelöst sind. Die B-Zellen müssen wir aber auch markieren. Diese haben ein anderes Merkmal an ihrer Oberfläche. Das Merkmal nennt man CD19. Wir nehmen also einen Antikörper gegen CD19. Diesmal aber keinen an FITC gekoppelten sondern einen, der an einen anderen Farbstoff gekoppelt ist. Z.B. einen an PE gekoppelten. PE (=Phycorythrin) ist ein gelbrot fluoreszierendes Molekül. Wir verwenden also den Antikörper CD19-PE. Jetzt müssen wir das Blut des Patienten mit den Antikörpern zusammenbringen. Dazu gibt man eine sehr kleine Flüssigkeitsmenge (5 - 20 µl) aus beiden Antikörperfläschchen in ein Plastikröhrchen. Danach wird eine bestimmte Menge Blut (25 - 100 µl) dazugegeben. Das lässt man dann eine Zeit stehen (Inkubation). www.med4you.at 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 7 von 11 Inkubation der Zellen mit den Antikörpern Aus beiden Antikörperfläschchen wurden je 10 µl Antikörper in das Röhrchen pipettiert. Danach wurden 50 µl Blut des Patienten hinzugefügt. Nach dem Vermischen lässt man das ganze 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur am besten lichtgeschützt stehen. Das nennt man auch Inkubation, vom lateinischen incubare: auf etwas liegen, brüten. Die Zellen werden gewissermaßen mit dem Antikörper bebrütet. Während der Inkubation setzen sich die CD3-FITC Antikörper auf die T-Lymphozyten und die CD19-PE Antikörper auf die B-Lymphozyten. Die T-Lymphozyten werden also mit einem grünem Fluoreszenzfarbstoff, die B-Lymphozyten mit einem gelbroten Fluoreszenzfarbstoff markiert. Markierung der T- und B-Lymphozyten Während der Inkubation (Bebrütung) der Blutzellen mit den Antikörpern setzen sich die CD3-FITC Antikörper auf die T-Lymphozyten und die CD19-PE Antikörper auf die B-Lymphozyten. Dies ist links schematisch dargestellt. In Wirklichkeit sind die Antikörper im Vergleich zu den Lymphozyten viel kleiner und es setzen sich tausende Antikörper auf eine Zelle. Bevor man die weißen Blutkörperchen im Durchflusszytometer messen kann, muss man noch die roten Blutkörperchen entfernen. Zu diesem Zweck gibt man ein spezielle Flüssigkeit dazu, die die roten Blutkörperchen zerstört. Lyse (Zerstörung) der roten Blutkörperchen Im Blut sind etwa 1000 mal mehr rote als weiße Blutkörperchen. Es erleichtert daher die durchflusszytometrische Messung der weißen Blutkörperchen, wenn man die roten Blutkörperchen vorher entfernt. Dazu gibt man ein spezielles Mittel, ein sog. Lyse-Reagenz dazu. Die Lyse der roten Blutkörperchen dauert etwa 10 Minuten. www.med4you.at 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 8 von 11 Nach der Lyse der roten Blutkörperchen kann man die weißen Blutkörperchen der Probe ungestört am Durchflusszytometer messen. Die Probe wird in das Gerät gesaugt (genau genommen wird sie mit Hilfe von Druck ins Gerät gedrückt, man spricht aber trotzdem meist vom Ansaugen) und die Zellen fließen durch die Flusszelle des Geräts. Beim Queren des Laserstrahls werden die T-Lymphozyten grün und die B-Lymphozyten gelb-rot aufleuchten. Messung der T- und B-Lymphozyten Quert eine Zelle den Laserstrahl, die mit dem FITC-Antikörper markiert ist, leuchtet sie grün auf. Da wir CD3-FITC verwendet haben, können wir schließen, dass dies ein TLymphozyt sein wird. Eine (gelb)rot aufleuchtende Zelle wird ein B-Lymphozyt sein, da wir CD19-PE verwendet haben und PE gelbrot fluoresziert. Wie bei den Streulichtsignalen stellt man auch die Ergebnisse der Fluoreszenzmessungen in einer anschaulichen Graphik, einem Dot-Plot dar. Dot-Plot Graphik der Ergebnisse der Fluoreszenzmessung Jeder Punkt entspricht einer Zelle. Die FITC-Fluoreszenz (grün) ist auf der X-Achse, die PE-Fluoreszenz (gelbrot) auf der Y-Achse aufgetragen. Grün aufleuchtende Zellen sind daher rechts unten zu finden. Sie sind mit dem T-Lymphozytenmarker CD3-FITC markiert, also die T-Lymphozyten. Gelbrot aufleuchtende Zellen sind links oben. Sie sind mit dem B-Lymphozytenmarker CD19-PE markiert, also B-Lymphozyten. Die Punkte sind nur der Anschaulichkeit wegen grün oder rot gefärbt. Das hat direkt nichts mit der Fluoreszenzfarbe zu tun. In der obigen Abbildung sieht man, dass im Blut des Patienten mehr T-Lymphozyten (grün) als B-Lymphozyten (rot) waren. Das ist durchaus normal. Das obige Bild entspricht den normalen www.med4you.at 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 9 von 11 Verhältnissen beim Gesunden. Die schwarzen Punkte entsprechen ungefärbten Zellen, also Zellen, die weder B- noch TLymphozyten sind. Die Mehrzahl dieser Zellen sind die sog. Natural-Killer Zellen. 4-Farben sind Standard Für das Beispiel wurden 2 verschiedene Fluoreszenzmarker eingesetzt. Tatsächlich gibt es sehr viele verschiedene Fluoreszenzmarker, die in den verschiedensten Farben leuchten können und durch verschiedene Lichtwellenlängen anregbar sind. Moderne Durchflusszytometer für den Routineeinsatz können neben den Streulichteigenschaften heute meist 4 verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden. Man kann also neben dem Streulicht 4 Merkmale der Zelle gleichzeitig in einem Röhrchen färben und bestimmen. Inzwischen kommen Durchflusszytometer für den Routineeinsatz auf den Markt, die 6 Farben gleichzeitig messen können. Dies wird die Möglichkeiten der Analytik ganz wesentlich erweitern. Experimentelle Geräte können schon seit einiger Zeit 10 oder mehr Farben messen, sind aber für den RoutineEinsatz ungeeignet. 3. Das Gaten ("Schleusen") Im obigen Beispiel, bei der Darstellung der B- und T-Lymphozyten im Fluoreszenz-Dot-Plot CD3-FITC/CD19-PE wurde etwas verschwiegen. Ohne es extra zu erwähnen, wurde eine wichtige Auswertetechnik der Durchflusszytometrie eingesetzt: das Gaten. Denn in diesem Dot-Plot sind nur die Lymphozyten dargestellt und Sie könnten sich fragen, wo sind die Granulozyten und Monozyten geblieben? Die wurden durch das Gaten schon vorher ausgeschlossen. Ziel des Gaten ist es meist, die Zellen auszuwählen, die einen wirklich interessieren. Bleiben wir bei dem obigen Beispiel. Wir wollten wissen, wie viele der Lymphozyten T-Lymphozyten und wie viele B-Lymphozyten sind. Die Monozyten und Granulozyten haben uns in diesem Fall nicht interessiert. Ja sie würden sogar die Darstellung der Lymphozyten stören. Wir mussten sie ausgrenzen. In der Praxis funktioniert das durch Gaten sehr einfach: man zeichnet mit der Computer-Maus eine Region in das Streulichtdiagramm ein, die nur die Lymphozyten enthält. Man nennt diese Region R1. Und dann "sagt man" dem Fluoreszenz-Dot-Plot: "Zeig mir nur die Zellen aus R1". Und das geschieht dann auch. Das Computerprogramm lässt ("schleust", "gatet") nur die Zellen aus R1 in den Fluoreszenz-Dot-Plot. Region R1 im Streulicht-Dot-Plot links definiert die Lymphozyten. Und nur diese werden in den FluoreszenzDot-Plot rechts gegatet (geschleust). Dadurch hat man im rechten Dot-Plot nur mehr die Zellen, die einen interessieren, die man näher untersuchen möchte. Bei einer anderen Aufgabe könnten das natürlich auch andere Zellen sein, z.B. die Monozyten (blaue Punkte links). Dann müsste man R1 um diese Zellen zeichnen. www.med4you.at 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 10 von 11 Sehr komplexe Auswertungen sind möglich Oben ist das einfachste Beispiel von Gaten dargestellt: man definiert eine Gruppe von Zellen und gatet sie in ein anderes Diagramm. Moderne Auswerte-Programme können aber viel mehr. Meist lassen sich bis zu 16 verschiedenen Regionen und 16 Gates definieren, die auch noch mit logischen Operatoren (UND, ODER, UND NICHT) untereinander verknüpft werden können. 4. Beispiele der Anwendung Fall 1. 70-jähriger Patient zeigt eine erhöhte Anzahl weißer Blutkörperchen (14000/µl). Bei der mikroskopischen Untersuchung des Blutes sieht man, dass von den verschiedenen weißen Blutkörperchen die Lymphozyten vermehrt sind. Bei der mikroskopischen Untersuchung zeigt sich eine Vermehrung auffälliger Lymphozyten. Das kann verschiedene Ursachen haben. Man führt eine Bestimmung der T- und BLymphozyten durch. Bei der durchflusszytometrischen Analyse der Lymphozyten fällt auf, dass es sich fast ausschließlich um BLymphozyten (rot dargestellt) handelt. Beim Gesunden (rechts) ist das ganz anders, da überwiegen die TLymphozyten (grün dargestellt). Dieser Befund lässt auf einen Blutkrebs (Leukämie) der B-Lymphozyten schließen. In einem www.med4you.at 24.9.2005 Einführung in die Durchflusszytometrie Seite 11 von 11 solchen Fall werden noch zahlreiche andere Marker auf den Zellen untersucht. Unter Berücksichtigung des Aussehens der Zellen im Mikroskop und der Beschwerden und Zeichen des Patienten sprachen die Marker für das Vorliegen einer CLL, also einer chronisch lymphatischen Leukämie. Fall 2. 30-jähriger Patient mit bekannter HIV-Infektion. Um sich ein Bild von der Leistungsfähigkeit seiner Abwehr zu machen, bestimmt man die CD4-positiven T-Lymphozyten, die sog. Helperzellen. Grün eingezeichnet sind die Helperzellen. Man erkennt, dass bei dem HIV-infizierten Patienten eine deutliche Verminderung der Helperzellen vorliegt. Unterschreitet die Anzahl der Helperzellen bestimmte Grenzen, dann wird eine vorbeugende Behandlung mit Antibiotika empfohlen. Wichtige Hinweise: Die Website kann Ihnen nur einen allgemeinen Überblick bieten und Orientierungshilfe sein. Allgemeine Informationen können Ihren Arzt nicht ersetzen, da nur er Ihre individuelle Situation beurteilen kann. Anregungen für Verbesserungen, Ergänzungen oder interessante Themen nehmen wir gerne an, individuelle Anfragen können leider nicht beantwortet werden. Alle Angaben erfolgen ohne Gewähr. Die in med4you dargestellten Informationen dürfen auf keinen Fall als Ersatz für professionelle Beratung oder Behandlung durch approbierte Ärzte angesehen werden. Der Inhalt von med4you kann und darf nicht zur Diagnosestellung oder zum Durchführen von Behandlungen verwendet werden. Bitte Nutzungsvereinbarungen lesen. 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