Mutation, Rekombination und Kartierung - Ruhr
Werbung
Mutationen Mutation, Rekombination und Kartierung Sind sprunghaft auftretende Veränderung der Erbinformation in Körperzellen (somatische Mutation) oder Keimzellen, die vererbbar ist. Diese Veränderung prägt sich phänotypisch unterschiedlich stark aus. Die durch eine Mutation verursachte Merkmalsänderung kann rezessiv sein und bei Individuen mit diploiden Chromosomensatz im Erscheinungsbild ohne sichtbare Auswirkung bleiben. Formen der Mutation: n Mutationen in Körperzellen werden bei der Mitose an alle folgenden Zellgenerationen weitervererbt. Ein solches Individuum hat dann neben Zellen mit dem Ausgangsgenotyp auch solche mit der Mutation. Der Umfang der Veränderung des Individuums hängt von dem Entwicklungsstadium ab, in dem die Mutation aufgetreten ist. n Mutationen in Keimzellen wirken sich auf das ganze, sich aus der befruchteten Eizelle entwickelnde Individuum aus. Durch die Mitosen während der Individualentwicklung wird die veränderte Erbinformation auf alle Körperzellen übertragen und bei der Fortpflanzung auf die Nachkommen vererbt. n Mutationen außerhalb des Zellkerns: Veränderungen der DNA in Plastiden und Mitochondrien. Sie äußern sich in Funktionsstörungen der Plastiden oder in komplexen Störungen des Organismus (z.B. Auftreten panaschierter Blätter, Atmungsdefekte). Mutagene sind Faktoren, die die Mutationen auslösen (z.B. physikalische Einflüsse, chemische Stoffe). Mutagene wirken nicht zielgerichtet. Mutation Beispiele für Mutagene • - radioaktive Strahlung, Röntgenstrahlen, UV-Strahlen • - Temperatur, hohe Temperaturen, Kälteschocks • - Gifte (Colchizin, Nikotin) • - anorganische Gase Säuren • - Industrieabgase, Nahrungsmittel, ….. Mutationen Mutationstypen n Genmutationen (Veränderungen der Erbinformation eines Gens) n Chromosomenmutationen (Veränderungen an Chromosomen, die mehrere Gene betreffen, z. B. Chromosomenbrüche - führen zum Strukturumbau der Chromosomen) n Genommutationen (Veränderungen im Chromosomenbestand; häufig auf Störungen des Kernspindelapparates zurückzuführen) Reparatur von Mutationen n Da spontane Mutationen relativ häufig sind und in jeder Zelle auftreten können, werden sie durch spezifische Enzyme zum großen Teil repariert. Dabei werden fehlerhafte Strukturen der DNA herausgeschnitten und durch eine neue Basenpaarung ersetzt. Mutationen… n erhöhen die Variabilität einer Population n sind eine Grundlage der Evolution n sind häufig Ursache für Krankheiten und Fehlbildungen n sind für die Pflanzenzüchtung von Bedeutung Mutationsraten ungerichtete Mutationen Sind Mutationen eines Gens (DNA-Mutationen oder Gen -Mutationen als Folge von DNA-Mutationen im Regulatorbereich eines Operons ) also sehr unwahrscheinlich? - bei Bakterien beträgt die Mutationsrate ca. 1/10.000.000 - von 1.000.000.000 Bakterien, der Art E.coli , besitzen 100 eine Mutation E. colis teilen sich unter optimalen Bedingungen alle 20 Minuten. Die Tabelle rechts zeigt die Vermehrung einer Ausgangszelle sowie die Zahl der Zellen mit einem mutierten X-Gen. Bereits nach zwölf Stunden sind in der 36. Generation über 3000 mutierte Zellen anzutreffen. Bei Eukaryoten muß man zwischen somatischen Mutationen und Keimbahnmutationen unterscheiden. Somatische Mutationen betreffen irgendwelche Körperzellen des Individuums und werden nicht auf d ie nachfolgende Generation übertragen. Für die Evolution spielen so lche somatischen Mutationen also keine Rolle. Anders sieht es bei den Keimbahnmutationen aus, also bei Mutationen in den Keimzellen (Ei-und Samenzellen). Die Mutationsrate beträgt bei Eukaryoten etwa 1/1.000.000, ist also zehnmal höher als bei Prokaryoten . Da Eukaryoten sehr viel mehr Gene haben als Prokaryoten, ist die Wahrscheinlichkeit, eine mutierte Keimzelle anzutreffen, ziemlich hoch. Ein Organismus mit 100.000 Genen hätte bei der Mutationsrate von 1/1.000.000 also 10% mutierte Keimzellen. Man nimmt an, daß beim Menschen ca. 10% bis 40% der Keimzellen mindestens ein mutiertes Gen besitzen. n n n n n Chemische Mutagenese Kassetten Mutagenese Misincorporation Mutagenese Spiked Oligonucleotide Primers … 1 chemische Mutagenese Nitrose Säuren Reagiert mit den Aminen der Purine und Pyrimidine und es entstehen Diazonium -Derivate - Guanidin -> Xanthine (paart mit T) - Adenin -> Hypoxanthine (paart mit C) - Cytosin -> Uracil (paart mit A) Es werden Transitionen generiert (Purine <-> Purine und Pyrimidine <-> Pyrimidine) Reaktivität: C > A > G 6:2:1 Hydroxylamine Deaminiert Cytosin zur Uracil (pH < 2,5) me5-Cytosin ist geschützt Bei pH >6,0 werden stabile Intermediate gebildet (Hydroxyaminocytosin), welche sich mit Adenin paaren In beiden Fällen findet eine Transition statt (C-G Basenpaare werden in A-T konvertiert) Kassetten Mutagenese Es wird ein Pool an Oligonucleotiden synthetisiert, die in gleichen Mengen aus allen vier Basen in den ersten beiden Positionen bestehen und in der dritten nur aus G oder C (auch in gleichen Mengen) Dabei entstehen 32 Codons. Der zweite Strang der Kassette besteht aus Tri-Inosin (paart mit allen Basen) 5‘- NNG/C-3‘ Die entstandenen 3‘- I I I -5‘ Kassetten werden dann in Gen, Plasmid, Promotor, … durch Restriktion und Ligation eingesetzt. Spiked Oligonucleotide Primers n n n Beim DNADNA-Synthetisieren werden die einzelnen Nukleosid--Substrate mit den anderen Nukleosid Nukleosiden verunreinigt. Dadurch können bis zu 80 Basen große Zufalls Primer entstehen Die Primer werden dann in das Genom durch Restriktion und Ligation oder mittels PCR eingebaut chemische Mutagenese 2 Bisulfite Reagiert nur mit C, welches zu Uracil deaminiert Es werden die gleichen Transitionen gebildet wie bei Hydroxylaminen Hydrazine Die heterocyclischen Ringe von C und T werden aufgebrochen, wodurch es zu „Fehlpaarungen“ während der Replikation der DNA kommt. Misincorporation Mutagenese In vivo oder in vitro (PCR) werden Nukleosid Nukleosid-Analoga zu den „normalen“ Nukleosiden angeboten (1(1-10% im Verhältnis zu den normalen). Die Analoga können dann zu Fehl Fehl-paarungen,, nachdem sie in die DNA eingebaut paarungen wurden, führen. Mutation im Laboralltag PCR mit einer Polymerase ohne Proofreading Funktion z.B. Taq Taq--Polymerase sie macht alle 5x104 Basen einen Fehler 2 Gerichtete Mutation n n n n n n site-directed Mutagenese klassische site-directed Mutagenese Megaprimer Methode (single Tube) Primer Extension Methode Generation von Sets an Deletionsmutanten mit Exonuclease III bzw BAL 31 Linker-scanning Mutagenese In vitro Mutagenese Megaprimer Methode Primer Extension Methode Sets an Deletionsmutanten mit Exonuclease III bzw BAL 31 Rekombination 3 Mechanismus der homologen Rekombination Rekombination Homologe Rekombination während der Meiose Horizontaler Gentransfer: „sexuelles“ Verhalten bei Bakterien - horizontaler Gentransfer - Reparatur von DNA Läsionen ( TT TT-- Dimere , Doppelstrangbrüche… ) TT--Dimere TT 1. Ausrichten von 2 homologen DNA Fragmenten 4. Strangbruch, Einwanderung, Exonuklease 2. Strangbruch 5. Polymerase , Ligase 3. Eindringen von Einzelstrang (3‘ Ende) in benachbarten Duplex -> D loop Mechanismus der homologen Rekombination 6. Schenkelwanderung (branch migration) Fehlpaarungen stoppen Rekombination Welche Enzyme sind an der homologen Rekombination beteiligt? Komponenten wurden genetisch identifiziert: Mutationen, welche Rekombinationsfrequenz bei der Konjugation herabsetzen Gene erhielten den Namen rec (recombination recombination)) n RecA Protein n recA Gen n recAmutiertes Allel 4 Enzyme der homologen Rekombination n n n n Komplementärer Strangaustausch durch RecA RecA:: 352 AS, funktioniert als Multimer Multimer.. Bindung an Einzelstrang Einzelstrang--DNA in Gegenwart von ATP RecBCD:: Exonuclease RecBCD Exonuclease,, Helicase und Endonuclease an chi chi-Sequenzen Branch migration wird durch das RuvAB Protein stimuliert. Bindung von ruvA (2 Tetramere an Überkreuzungsstelle), dann Ausbildung des ruvAB Komplexes, der unter ATP Verbrauch branch migration vorantreibt Auflösung der Hollidaystruktur durch RuvC RecA--DNA Nucleoprotein Filament RecA Funktion von recA RecA i st ein multifunktionelles und ubiquitäres Enzym, reguliert Synthese und Aktivität der Enzyme der DNA DNA--Reparatur (SOS (SOS-- Induktion, umuD umuD), ), katalysiert die homologe Rekombination und rekombinative Mutagenese . Ein homologes Protein Rad51 wurde in Eukaryoten – einschließlich des Menschen entdeckt. Homologe Paarung: Paarung: Das recA recA--Protein Protein,, MGW 380 000, bindet zuerst an eine Region einzelsträngiger DNA (ssDNA ssDNA). ). Ein Filament von recA recA--Proteinen ordnet sich um die ssDNA an. Das recA recA--ssDNA ssDNA--Filament bindet dann an die DNA DNA--Doppelhelix . Das recA Protein sucht die DNA Doppehelix schnell nach einer Sequenz ab, die komplementär zu ssDNA ist. Die ssDNA paart jetzt mit dem komplementären Strang der Doppelhelix . recA katalysiert die Strangassimilation recAkatalysiert Strangassimilation,, die von der ATPATP-Hydrolyse angetrieben wird. Das Produkt der Reaktion "Heteroduplex "Heteroduplex"" besteht aus einem Dopppelstrang und einer einzelsträngigen Schleife und hat die Gestalt des Buchstabens D ( D-loop structure ). RecA RecAMutanten Mutanten haben eine um 10-4 herabgesetzte Rekombinationshäufigkeit. Branchmigration:: Wanderung der Kreuzungsstelle (branch Branchmigration (branchmigration migration)) durch Verdrängung des gepaarten Bereichs eines Stranges durch den bisher ungepaarten Bereich des assimilierten Einzelstrangs. Phasen: Die durch RecA Phasen: RecAkatalysierte katalysierte Reaktion läßt sich in drei Schritte einteilen: · Eine langsame präsynaptische Phase in der RecA RecAan an Einzelstrang Einzelstrang--DNA polymerisiert · Eine schnelle Paarungsreaktion zwischen Einzelstrangregion und komplementärer Doppelstrang Doppelstrang--DNA DNA.. Ausbildung einer Hetero Hetero--Duplex Duplex--Verbindung · Langsamer Ersatz eines Strangs aus Duplex unter Ausbildung einer langen Heteroduplex Heteroduplex--Region Region.. Der RecBCD RecBCD-- Endonuklease Endonuklease-- Komplex 28 kD recBCD Komplex: 3 UE mit relativen Molmassen von 140, 130, und 60 k D; D; kodiert von recB ecB,, recC recC,, recD . Er wird auch als Exonuclease V bezeichnet, weil er in Gegenwart von niedrigen Konzentrationen ATP sowohl einzelsträngige als doppelsträngige DNA DNA von den Enden her abbaut. DNA-Helicase Funktio DNAFunktionn (kodiert durch recB recB), ), d.h. Fähigkeit Doppelstränge unter Spaltung von ATP zu entwinden. Während das Enzym an der DNA entlangwandert , entwindet es den vor ihm liegenden Teil des Doppelstrangs. Da es den gebundenen DNA -Strang relativ langsam entläßt entläßt,, entstehen DNADNAMoleküle mit 2 Einzelstrangschleifen. Endonuclease -Funktion bevorzugt, wenn in einem der beiden Stränge die Sequenz 5´ CTGGTGG (chi -Sequenz ) vorkommt. Die Spaltung erfolgt 44-6 Nukleotide auf der 3´ Seite der chi chi--Sequenz Sequenz.. Solche Sequenzen sind bevorzugt alle 5000 bp im E.coli Genom vorhanden. Chi Chi-- Sequenzen sind bevorzugte Orte (hot spots) der Rekombination Rekombination.. RecA ? bindet spezifisch an ssDNA ? 1 RecA Monomer per 5-6 Nukleotide ? Bindung an DNA ist nicht sequenzspezifisch (Rückgrat) Modell der Funktion von recBCD recBCD:: 1. Bindung an ein DoppelstrangDoppelstrang-Ende 2. Entwindung und Windung mit unterschiedlichen Raten, so daß zwei Einzellstrangschlaufen entstehen 3. endonukleolytische Spaltung eines Einzelstrangs in der Nähe der chi chi--Sequenz 4. Fortschreiten des Enzyms, so daß sich das 5´Ende der geschnittenen Schleife zum Doppelstrang zurückbilden kann, während das 3´Ende als Einzelstrang Einzelstrang freibleibt und verlängert wird. Beachte, daß alle einzelsträngigen Abschnitte mit ssb ssb--Protein bedeckt sind. RecBCD Pathway Modell der generellen Rekombination durch den recBCD pathway DNA- Fragment rekombiniert mit einem circulären Chromosom. Dabei wird eine gerade Zahl von DNAStrangaustauschen benötigt um den Ring wiederherzustellen. RecBCD (Exonuclease V) bindet an ds DNA Enden und entwindet die DNA unter Ausbildung einer Schleife ("looptail ("looptail") ") und dann einer Doppelschleifenstruktur, die sich an der DNA entlang entlang bewegt. Nach Erreichen einer richtig orientierten chi site (recombinational hotspot hotspot)) schneidet das Enzym einen DNADNAStrang, unter Bildung eines Einzelstrang 3´Endes. 3´Endes. Dieses EinzelstrangEinzelstrang-Ende wird elongiert unter weiterer Entwindung. D-loop loop--Bildung und Strangassimilation: Strangassimilation: Unterstützt von RecA und ssb Proteinen Proteinen,, das 3´Ende dringt in eine homologe ds DNA ein und bildet einen D-loop aus. Spaltung des D-loops loops,, möglicherweise durch Exonuclease V; Durch Strangpaarung unterstützt durch recA und ssb Proteinen wird eine Holliday Verbindung erzeugt. Auflösung der Holliday Holliday--Struktur , wahrscheinlich durch recG (oder ruvAB ruvAB). ). Ein Paar rekombinanter Moleküle mit hybrider DNA flankiert mit DNA mit parentaler (links oder rekombinativer (rechts) Konfiguration wird gebildet. Die Produkte von ruvA und ruvB verstärken die Bildung der von RecA katalysierten 33-Strang Heteroduplex Strukturen: · RuvA erkennt die Struktur der Holliday junction junction;; · RuvB ist eine ATPase , die den Motor der branch migration darstellt. Die Geschwindigkeit der branch migration kann 1010-20 bp bp/sec /sec betragen. · RuvC kodiert für Endonuklease Endonuklease,, die Holliday junctions spezifisch erkennen und spalten kann. Dadurch Auflösung ("resolution ("resolution") ") der junction junction.. Unabhängig von recA. 5 Funktion von ruvAB und ruvC Involviert in späte Phasen der Rekombination Rekombination.. Die Produkte von ruvA und ruvB verstärken die Bildung der von RecA katalysierten, am 3´3´- Strangende lokalisierten Heteroduplex Strukturen. RuvA erkennt die Struktur der Holliday junction junction;; RuvB ist eine ATPase ATPase,, die den Motor der branch migration darstellt. Die Geschwindigkeit der branch migration kann 1010- 20 bp bp/sec /sec betragen. RuvC kodiert für Endonuklease Endonuklease,, die Holliday junctions spezifisch erkennen und spalten kann. Dadurch Auflösung („resolution („resolution“) “) der junction junction.. Unabhängig von recA recA.. RecA und RecBCD RecA-abhängiger Strangaustausch zwischen partieller und vollständiger Duplex-DNA. Ein verbundenes Molekül ("joint molecule ") mit der selben Struktur wie ein Rekombinations Intermediat wird gebildet RecBCD Endonuclease ereicht eine chi Sequenz. Dort wird ein endonukleolytischer Schnitt gemacht. Verlust von RecD, Verbleib der Helicase Aktivität RuvABC Komplex katalysiert Schenkelwanderung Wild-typ recArecBCD- Rekombinationsfrequenz während der Konjugation 1 10-5 - 10-4 10-2 Fusion zweier zirkulärer DNA Moleküle Austausch von DNA Fragmenten zwischen 2 DNA Molekülen 6 Homologe Rekombination D-Loop Cre loxP Entdeckt in der Bacphage P1 Anwendbar auch in Hefe und Säugetierzellen loxP Site ist 34 bp lang (zwei inverted repeats von je 13bp) Kartierung n n n n Kartierung Replika Plattierung Entstand in der Mikrobiologie zur Charakterisierung verschiedener Bakterien-Stämme Früher wurden Bakterien an Hand von biologischen Besonderheiten, Unterschiede im Phänotyp, eingeteilt und vom Wildtyp unterschieden Heute werden alle Organismen durch ihre NucleotidSequenz charakterisiert Heutzutage ist die Kartierung von Genomen eher ein Gebiet der Bioinformatik 7 Unterbrechung der Paarung n n n Unterbrechung der Paarung ein Hfr-Stamm mit den genetischen Eigenschaften thr+ , leu+ , gal+ , lac+ , ton R, aziR , strR wird mit einer F--Empfängerzelle kultiviert die thr-, leu-, gal-, lac-, ton S, aziS, strS ist Zu veschiedenen Zeitpunkten werden Proben der Kultur entnommen und auf verschiedene Mangelmedien ausplattiert So lässt sich ein zeitliche Auflösung der Anordnung der Genmarker ermitteln Kartierung in der Gegenwart n n n n n Das Genom eines Organismus wird kultiviert, eine cDNA-Bank wird angelegt Die cDNA-Bank wird mehrmals sequenziert Die Ergebnisse der Sequenzierung werden miteinander verglichen und am Computer werden die einzelnen Fragmente (halb-)automatisch zusammengefügt Die gewonnene Sequenz wird mit anderen bekannten Sequenzen auf Homologien verglichen, wodurch sich die ersten Gene bestimmen lassen Die weiteren Ergebnisse sind ein Zusammenspiel aus Forschung mit RNA und Proteinen, wodurch sich der Ort der Gene im Genom zurückverfolgen lässt 8
