Abortive Replikation des Respiratory Syncytial Virus in

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
des St. Josef-Hospitals Bochum – Universitätsklinik –
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. E. Hamelmann
Abortive Replikation des Respiratory Syncytial Virus
in Langerhanszell-ähnlichen
dendritischen Zellen nach Differenzierung
mit Transforming-growth-factor-β
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrads der Medizin
einer
hohen medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Marita Horstkemper
aus Hagen (Westf.)
2010
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. U. Schauer
Koreferent: Prof. Dr. med. A. Bufe
Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2010
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung................................................................................................
8
1.1 Das Immunsystem......................................................................................
8
1.2 Dendritische Zellen.....................................................................................
1.2.1 Herkunft dendritischer Zellen...........................................................
8
9
1.2.2 Unreife dendritische Zellen..............................................................
10
1.2.3 Reife dendritische Zellen.................................................................. 11
1.2.4 Antigenpräsentation.......................................................................... 11
1.2.5 Einteilung dendritischer Zellen........................................................
12
1.2.5.1 Myeloide dendritische Zellen.............................................. 12
1.2.5.2 Plasmazytoide dendritische Zellen...................................... 12
1.2.5.3 Langerhanszellen................................................................. 13
1.3 Zytokine...................................................................................................... 15
1.3.1 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor........................ 15
1.3.2 Tumuor-necrosis-factor α................................................................. 15
1.3.3 Transforming-growth-factor β.......................................................... 16
1.3.4 Interleukin-4.....................................................................................
17
1.4 Respiratory Syncytial Virus........................................................................ 18
1.4.1 Epidemiologie................................................................................... 18
1.4.2 Klinik................................................................................................ 18
1.4.3 Therapie............................................................................................ 19
1.4.4 Prophylaxe........................................................................................ 19
1.4.5 Aufbau des RS-Virus........................................................................ 20
1.5 Methoden zum Virusnachweis in dendritischen Zellen.............................
22
1.6 Fragestellung..............................................................................................
24
3
2 Material, Methoden und Probanden.................................................... 25
2.1 Methoden...................................................................................................
25
2.1.1 Stammzellspender............................................................................. 25
2.1.2 Isolierung der Zellen......................................................................... 25
2.1.2.1 Isolierung der mononukleären Zellen über den
Ficoll-Gradienten................................................................. 25
2.1.2.2 Isolierung von CD34+ Zellen über die MiniMACS-Säule... 26
2.1.2.2.1 Prinzip der MiniMACS-Säule.............................
2.1.2.2.2
26
Durchführung...................................................... 26
2.1.3 Kultivierung und Anzucht von dendritischen Zellen.......................
27
2.1.3.1 Anzucht bis Tag 7................................................................ 27
2.1.3.2 Ernten und Einfrieren angezüchteter Zellen........................ 27
2.1.3.3 Weiterkultur von Tag 7 bis Tag 14...................................... 28
2.1.4 Infektion der dendritischen Zellen mit RSV..................................... 28
2.1.5 RSV-spezifische Real-Time PCR..................................................... 29
2.1.6 Untersuchung der dendritischen Zellen im Fluoreszenzmikroskop.
30
2.1.6.1 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen.......................
30
2.1.6.2 Färbung der Zellen............................................................... 30
2.1.6.3 Immunfluoreszenzmikroskopie...........................................
30
2.1.7 Messung des intrazellulären RSV-Antigens im
Durchflusszytometer......................................................................... 31
2.1.7.1 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen.......................
31
2.1.7.2 Messung im FACScanTM..................................................... 31
2.1.8 Bestimmung des Virustiters im Überstand....................................... 32
2.2 Material....................................................................................................... 33
3 Ergebnisse................................................................................................ 37
3.1 Die RSV-Replikation ist in TGF-β-Zellen vermindert............................... 37
3.2 Untersuchung des P-Proteins...................................................................... 38
3.2.1 Das P-Protein liegt als Vakuole im Zytoplasma............................... 38
3.2.2 Der Durchmesser der P-Protein Vakuole ist bei den
TGF-β-Zellen größer....................................................................... 40
4
3.3 TGF-β-Zellen enthalten weniger RSV-Proteine als IL-4-Zellen...............
40
3.4 Die Virusfreisetzung ist in TGF-β-Zellen geringer als in IL-4-Zellen....... 41
4 Diskussion................................................................................................ 43
4.1 Verteilung der Langerhanszellen in Haut und Lunge................................. 43
4.2 P-Proteinexpression in dendritischen Zellen.............................................. 44
4.3 Infektion dendritischer Zellen mit RSV.....................................................
45
4.4 Infektion von Makrophagen mit RSV........................................................
46
4.5 Infektion dendritischer Zellen mit dem Masernvirus.................................
47
4.6 Infektion dendritischer Zellen mit HIV...................................................... 47
4.7 Bedeutung von Langerhanszellen für die Abwehr von Pathogenen........... 48
4.8 Langerhanszellen sind in der Lunge erst nach dem ersten Lebensjahr
vorhanden..................................................................................................
48
5 Zusammenfassung.................................................................................. 51
6
Literaturverzeichnis.............................................................................. 53
5
Verzeichnis der Abkürzungen
Ak
Antikörper
CBMC
cord blood mononuclear cells
CCR
CC chemokine receptor
CD-
cluster of differentiation
CD40L
CD40 Ligand
CPD
Citrat-Phosphat-Dextrose
DAPI
Diamidinphenylindoldihydrochlorid
DC
dendritische Zelle
DMEM
dulbecco´s modified eagle´s medium
DMSO
Dimethyl Sulfoxid
DNA
deoxyribonucleic acid
FACS
fluorescence activated cell sorter
FcR
Fc-Rezeptor (für den Fc-Bereich von Immunglobulinen)
FCS
fetal calf serum
GM-CSF
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
HEPES
Hydroxyethylpiperacinethansulfonsäure
HEp-2
human epithelial cells
HIV
human immunodeficiency virus
IFN
Interferon
IL
Interleukin
LPS
Lipopolysaccharid
MACS
magnetic associated cell sorting
MALT
mucosa associated lymphatic tissue
M-CSF
macrophage-colony stimulating factor
MHC
major histocompatibility complex
MOI
multiplicity of infection
NK-Zelle
Natürliche Killerzelle
PBMC
peripheral blood mononuclear cells
PBS
phosphat buffered saline
PCR
polymerase chain reaction
6
pfu
plaque forming units
Protein F
Fusionsprotein
Protein G
Glykoprotein
Protein L
Largeprotein
Protein N
Nukleoprotein
Protein P
Phosphoprotein
RNA
ribonucleic acid
RPMI
Rothwell Park Memorial Institut 1640 Kulturmedium
RSV
respiratory syncytial virus
SCF
stem cell factor
TGF-β
transforming-growth-factor β
TNF-α
tumuor-necrosis-factor α
7
1 Einleitung
1.1 Das Immunsystem
Bei den Abwehrmechanismen unseres Körpers unterscheidet man die angeborene
(unspezifische) und die adaptive (spezifische) Immunantwort.
Die angeborene
Immunantwort
beruht
auf
mechanischen
Barrieren,
dem
Komplementsystem und phagozytierenden Zellen, z.B. Makrophagen, neutrophilen
Granulozyten und Monozyten.
Die adaptive Immunantwort lässt sich unterteilen in das zelluläre Abwehrsystem,
bestehend aus T- und NK-Zellen und antigenpräsentierenden Zellen, und das
humorale Abwehrsystem, zu dem man die Immunglobuline zählt. Diese werden von
Plasmazellen produziert, die sich aus B-Lymphozyten entwickeln. Eingeleitet wird
die adaptive Immunität durch antigenpräsentierende Zellen, zu denen dendritische
Zellen, Makrophagen und B-Lymphozyten gehören (Janeway et al, 2002). Da TLymphozyten nicht in der Lage sind, Antigene direkt zu erkennen, benötigen sie
antigenpräsentierende Zellen, welche die Antigene prozessieren und ihnen
präsentieren. Nach wiederholtem Kontakt mit dem gleichen Antigen, wird dieses von
T-Memoryzellen erkannt und die Immunantwort kann schneller ablaufen.
1.2 Dendritische Zellen
Dendritische Zellen sind die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen des
Immunsystems. Die Expression von MHC-Antigen-Komplexen ist auf dendritischen
Zellen deutlich höher ist als auf anderen antigenpräsentierenden Zellen (Inaba et al,
1997).
Zum ersten mal wurden dendritische Zellen im Jahr 1868 in der Epidermis gesehen
und nach Langerhans, ihrem Entdecker, benannt. Erst ca. hundert Jahre später
wurden dendritische Zellen auch in anderen Geweben entdeckt, zunächst in der Maus
und später auch beim Menschen, und ihre Bedeutung für das Immunsystem erkannt.
Mittlerweile lassen sich dendritische Zellen in den meisten lymphatischen und nichtlymphatischen Organen nachweisen (Shortman und Liu, 2002). Ihren Namen
8
erhielten sie aufgrund ihrer zahlreichen Zellmembranfortsätze, den Dendriten
(Steinman und Cohn, 1973). Auch bei der Erkennung und Präsentation des RS-Virus
haben dendritische Zellen eine wichtige Funktion, die wir in dieser Studie genauer
untersuchen werden.
1.2.1 Herkunft dendritischer Zellen
In vivo entstehen dendritische Zellen aus hämatopoietischen Stammzellen im
Knochenmark, die sich zunächst zu lymphatischen und myeloiden Vorläuferzellen
entwickeln. Aus letzteren gehen gemeinsame Vorläuferzellen für Granulozyten,
Monozyten und unreife dendritische Zellen hervor (Janeway et al, 2002; Inaba et al,
1993). Mehrere Subpopulationen können aus verschiedenen Vorläuferzellen
hervorgehen, aus der selben Vorläuferzelle können aber auch verschiedene
dendritische Zellen entstehen.
In vitro werden nach Protokoll von Caux et al (1990 und 1996) zunächst CD34+
Zellen aus hämatopoietischen Stammzellen isoliert. Anschließend werden sie mit
GM-CSF und TNF-α stimuliert (Caux et al, 1992; Reid et al, 1992; SantiagoSchwarz et al, 1992). Die zusätzliche Gabe von Stammzellfaktor (SCF) verspricht
einen größeren Zellgewinn (Young et al, 1995). Nach fünf Tagen entwickeln sich
zwei Populationen von dendritischen Vorläuferzellen, die sich in ihrer Expression
von CD1a und CD14 unterscheiden (Caux et al, 1996). Es gibt CD1a+ CD14- Zellen
und CD1a- CD14+ Zellen. Beide Vorläuferzellen reifen nach weiteren neun Tagen zu
Zellen mit dendritischer Morphologie und bestimmten Oberflächenmarkern (MHC
II, CD1a, CD80, CD83, CD86) heran (Caux und Banchereau, 1996). Die CD1aCD14+ Zellen sind monozytenähnliche Zellen und differenzieren mit M-CSF in
Makrophagen und mit GM-CSF, TNFα und IL-4 in CD1a+ dendritische Zellen
(Sallusto et al, 1994). Sie sind vergleichbar mit dendritischen Zellen, die von
Monozyten abstammen (Villadangos und Schnorrer, 2007; Shortman und Naik,
2007). Die CD1a+CD14- Vorläuferzellen entwickeln sich bei Zugabe von TGF-β in
langerhanszellähnliche Zellen mit Birbeck-Granula, E-Cadherin und Langerin
(Strobl et al, 1996; Caux et al, 1999; Bartz et al, 2003).
9
In unserer Studie arbeiten wir mit CD1a+ dendritischen Zellen, die zuvor entweder
mit GM-CSF, TNFα und IL-4 oder mit GM-CSF, TNFα und TGF-β stimuliert
worden sind. Wir nennen sie deshalb IL-4-Zellen und TGF-β-Zellen.
Abbildung 1: Bedeutung von IL-4 und TGF-β
β für die Entwicklung dendritischer Zellen (Caux
et al, 1999). IL-4 begünstigt die Differenzierung von Monozyten in Richtung interstitieller
dendritischer Zellen. TGF-β
β fördert die Entwicklung der Stammzellen in Langerhanszellen.
1.2.2 Unreife dendritische Zellen
Unreife dendritische Zellen sind charakterisiert durch niedrige Level von MHC
Klasse II Molekülen und T-Zell stimulierenden Molekülen, sowie der Abwesenheit
von CD83 (Zhou und Tedder, 1996). Weiterhin sind sie nur schwache T-ZellStimulatoren. Unreife dendritische Zellen zirkulieren im Blut und gelangen in nichtlymphatische Organe in denen sie aufgrund von exprimierten Adhäsionsmolekülen
verbleiben. Die Aktivierung von Rezeptoren für inflammatorische Zytokine (CCR1,
CCR2 und CCR5) führt zur Mobilisierung der Zellen und zur Migration in
entzündetes Gewebe (Sallusto und Lanzavecchia, 1999; Gill et al, 2005). Dort
nehmen sie Antigene auf.
Es sind verschiedene Aufnahmemechanismen bekannt, darunter Phagozytose,
Makropinozytose (Sallusto et al, 1995), Endozytose über den Mannoserezeptor (CTyp-Lectinrezeptor) (Sallusto et al, 1995; Engering et al, 1997) oder über Fc-
10
Rezeptoren (Sallusto und Lanzavecchia, 1994) und die Aufnahme apoptotischer
Zellen über den Vitronectinrezeptor (Rubartelli et al, 1997). Auf dem Weg in T-Zell
reiche Gebiete in sekundären Lymphgeweben, reifen dendritische Zellen und können
den T-Lymphozyten die prozessierten Antigene präsentieren (Xia et al, 1995).
Besondere Reifungsmediatoren sind die Zytokine GM-CSF, IL-1 und TNF-α aber
auch bakterielle Produkte wie LPS.
1.2.3 Reife dendritische Zellen
Reife, dendritische Zellen verändern ihren Phänotyp und ihre Funktion. Sie können
nicht mehr phagozytieren, dafür exprimieren sie vermehrt MHC Klasse-I- und MHC
Klasse-II-Moleküle (Cella et al, 1997) sowie kostimulierende Moleküle wie CD80,
CD83 (Zhou und Tedder, 1995) und CD86 an ihrer Oberfläche. CD80 und CD86
interagieren mit CD28 auf T-Lymphozyten (Janeway et al, 2002).
1.2.4 Antigenpräsentation
Peptide
von
extrazellulär
aufgenommenen
Bakterien
werden
in
antigenpräsentierenden Zellen an MHC-II-Moleküle gebunden und den CD4+ TLymphozyten präsentiert (Ingulli et al, 1997). Aus ihnen können verschiedene Arten
von Effektorzellen hervorgehen. Die Antigene können eine Differenzierung in IFN-γ
produzierende TH1-Lymphozyten
und
damit
eine zelluläre
Immunantwort
induzieren, oder die Entwicklung von IL-4 produzierenden TH2-Lymphozyten und
somit die humorale Antwort unterstützen. Eine weitere Gruppe von CD4+ TLymphozyten
sind
die
regulatorischen
T-Zellen.
Diese
sezernieren
nach
Antigenkontakt Zytokine (z.B. IL-10), welche die Immunantwort hemmen.
Peptide von intrazellulären Pathogenen, die sich im Zytoplasma vermehren, werden
von MHC-I-Molekülen an der Oberfläche präsentiert. Sie veranlassen die
Entwicklung von CD8+-T-Lymphozyten in zytotoxische T-Lymphozyten, welche die
infizierten Zellen vernichten (Janeway et al, 2002).
11
1.2.5 Einteilung dendritischer Zellen
Eine klare Einteilung der dendritischen Zellen ist nicht einfach, da sie sich einerseits
nach ihrem Ursprung aber andererseits auch nach ihrer Reifungsstufe unterscheiden
lassen.
Nach einer Einteilung von Demedts et al (2005) lassen sich dendritische Zellen nach
ihrer Entstehung, aber auch funktionell in myeloide dendritische Zellen, zu denen
auch Langerhanszellen gehören, und in plasmazytoide dendritische Zellen
unterteilen. Alle dendritische Zellen haben gemeinsam, dass sie MHC-II-Moleküle in
hoher Dichte tragen und keine Marker von Lymphozyten, Granulozyten und
Monozyten zeigen.
1.2.5.1 Myeloide dendritische Zellen
Die myeloiden dendritischen Zellen, zu denen sowohl die IL-4-Zellen als auch die
TGF-β-Zellen gehören, sind bedeutend für die Abwehr von pathogenen Keimen. Sie
induzieren eine stärkere T-Zell-Antwort als die plasmazytoiden dendritischen Zellen
(deHeer et al, 2004), aber es gibt unterschiedliche Aussagen bezüglich der Art der
ausgelösten Immunantwort. Eine These ist, dass die myeloiden dendritischen Zellen
IL-12 produzieren und eine TH-1-Antwort auslösen (Rissoan et al, 1999), doch
Studien von Langenkamp et al (2000) und Bartz et al (2003b) zeigen, dass dies nicht
immer der Fall ist, und myeloide dendritische Zellen durchaus auch eine TH2Antwort
auslösen
können.
Werden
myeloide
dendritische
Zellen
durch
proinflammatorische Zytokine wie z.B. IL-1 oder IL-6 stimuliert, nennt man sie
inflammatorische dendritische Zellen.
1.2.5.2 Plasmazytoide dendritische Zellen
Es gibt Hinweise, dass plasmazytoide dendritische Zellen einer lymphatischen
Vorläuferzelle entstammen und sich schon zu einem frühen Zeitpunkt getrennt von
den myeloiden dendritischen Zellen entwickeln (Ardavin et al, 1993; Izon et al,
12
2001). Über ihre funktionelle Rolle wird noch diskutiert. Demedts und Kollegen
(2005) haben herausgefunden, dass plasmazytoide dendritische Zellen in der Lunge
keine myeloiden Marker CD1a, CD11c, CD14 und CD16 produzieren und dass die
Expression von MHC-Klasse II und kostimulierenden Molekülen wie CD80 und
CD86 geringer ist als bei den myeloiden dendritischen Zellen. Dies spricht dafür,
dass plasmazytoide dendritische Zellen unreifer sind als myeloide dendritische
Zellen. Trotzdem sind sie nur zu einer geringen Antigenaufnahme fähig (Wang, H, et
al, 2006).
Zwar produzieren plasmazytoide dendritische Zellen nach bakterieller oder viraler
Stimulation große Mengen IFN-α und IFN-β (Cella et al, 1999; Asselin-Paturel et al,
2001), doch konnten Schlender und Kollegen (2005) eine Hemmung von IFN-α nach
RSV-Infektion beobachten. In einer Studie von Gill et al (2005) wurde während einer
RSV-Infektion ein Anstieg der plasmazytoiden dendritischen Zellen in der Nasenund Lungenschleimhaut beobachtet, der mit der RSV-Last korrelierte. Insgesamt
waren aber weniger plasmazytoide als myeloide dendritische Zellen vorhanden, was
ihre Bedeutung für die RSV-Abwehr wieder verringert. Tiermodelle zeigen, dass
plasmazytoide dendritische Zellen vor RSV-induzierten Gewebeschäden in der
Lunge schützen (Smit et al, 2006; Wang, H. et al, 2006) und inflammatorische
Immunantworten auf Allergene verhindern können (de Heer et al, 2004), was zu der
Annahme führt, dass sie eher eine schwache antigenpräsentierende Wirkung haben
und hauptsächlich eine tolerante Rolle übernehmen.
Die plasmazytoiden dendritischen Zellen wurden in diese Studie nicht mit
einbezogen, da sie einerseits nur langsam und nicht effektiv gezüchtet werden
können (Blom et al, 2000; Spits et al, 2000) und andererseits ihre Aufgabe eher
tolerogener als immunogener Art zu sein scheint.
1.2.5.3 Langerhanszellen
Die Langerhanszellen stammen von der gleichen myeloiden Vorläuferzelle ab wie
die myeloiden dendritischen Zellen (Georgopoulos et al, 1994; Mende et al, 2006). In
vitro entstehen unreife Langerhanszellen nach der Stimulation von myeloiden
dendritischen Zellen mit TGF-β und GM-CSF (Strobl et al, 1996; Borkowski et al,
13
1996). Diese sind CD1a+ (Strobl et al, 1998) und enthalten Langerin (CD 207)
(Valladeau et al, 1999), das Adhäsionsmolekül E-Cadherin (Blauvelt et al, 1995) und
Birbeck Granula (Birbeck, 1961).
CD1a weist Ähnlichkeiten zu MHC-Klasse-I-Molekülen auf, ist mit dem β2Mikroglobulin assoziiert (Janeway et al, 2002) und kann u.a. lipidhaltige und
mikrobielle Peptide präsentieren (Maher et al, 1997). Langerin ist ein Glykoprotein,
induziert die Bildung von Birbeck Granula und ist notwendig für die
Antigenaufnahme (Valladeau et al, 2000). Es ist sowohl in vivo als auch in vitro ein
charakteristischer Marker für Langerhanszellen (Valladeau et al, 1999).
Die Aufnahme von Antigenen erfolgt bei Langerhanszellen über Makropinozytose
oder über rezeptorvermittelte Endozytose (Engering et al, 1997). Sie besitzen keinen
Mannoserezeptor wie die myeloiden dendritischen Zellen, dafür aber Langerin und
verschiedene Fc-Rezeptoren (Valladeau et al, 2000). Nach der Reifung durch
inflammatorische Zytokine wie TNF-α in vivo oder durch CD40 Ligand in vitro,
sinkt der Gehalt an Langerin (Valladeau et al, 1999) und Birbeck Granula, dafür
produzieren die Langerhanszellen nun die kostimulierenden Moleküle CD80 und
CD86 (Rattis et al, 1996). Durch Verlust von E-Cadherin können sie sich von den
Keratinozyten lösen (Tang et al, 1993) und in Lymphknoten wandern, wo sie eine TZellantwort auslösen.
Die Langerhanszellen sind in der nicht-entzündlichen Haut (Novak und Bieber,
2000) und im Epithel großer und kleiner Bronchien ständig präsent (Demedts et al,
2005), wobei ihre Dichte mit der Tiefe der Atemwege abnimmt (Nelson et al, 1994).
Sie bilden ein dichtes Netzwerk in der suprabasalen Schicht der Epidermis. Weil sie
somit eine der ersten Zellen sind, auf die das RS-Virus im Körper trifft, haben wir
die langerhanszell-ähnlichen TGF-β-Zellen für unsere Studie ausgewählt.
14
1.3 Zytokine
Die Entwicklung der dendritischen Zellen in vivo und in vitro wird von
verschiedenen Zytokinen beeinflusst.
Zytokine sind Polypeptide mit Molekulargewichten von ca. 15-25 kiloDalton (kDa).
Sie werden von Körperzellen unter dem Einfluss verschiedener Noxen synthetisiert
und freigesetzt. In der Regel wirken sie lokal über Oberflächenrezeptoren und
aktivieren Signaltransduktionskaskaden, die verschiedene Zellantworten hervorrufen
können (Löffler und Petrides, 2003).
1.3.1 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)
GM-CSF ist der Hauptstimulator für das Wachstum und die Reifung der myeloiden
dendritischen Zellen (Steinman et al, 1991), sowie aller myelomonozytischen
Vorläuferzellen (Janeway et al, 2002). Nach Aktivierung durch inflammatorische
oder lokale Stimuli wird GM-CSF u.a. von Epithelzellen der Lunge (Stämpfli et al,
1998), Makrophagen, lymphatischen Zellen und Mastzellen produziert. Im
Lungenepithel von Asthmatikern lässt sich besonders viel GM-CSF finden (Poston et
al, 1992), was zu einer Einwanderung von dendritischen Zellen führt (Wang, J.,
2000).
GM-CSF
aktiviert
Makrophagen,
induziert
die
Expression
von
Wachstumsfaktoren und MHC-Klasse-II und hemmt die Freisetzung von INFγ,
TNFα und Prostaglandinen (Hamilton et al, 1991).
1.3.2 Tumuor-necrosis-factor α (TNF-α
α)
TNF-α gehört zur Gruppe der proinflammatorischen Zytokine und führt zu einer
Reifung der dendritischen Zellen (Sallusto et al, 1995; Jonuleit et al, 1997).
TNF-α wurde zunächst als Sekretionsprodukt einiger Tumorzellen identifiziert
(Beutler und Cerami, 1989). Später stellte sich heraus, dass vorwiegend
Makrophagen, aber auch Lymphozyten und natürliche Killerzellen, TNF-α als
15
Antwort auf bakterielle Toxine, Viren, Parasiten, Pilze und inflammatorische
Zytokine produzieren (Janeway et al, 2002). Bei Entzündungs- und Immunreaktionen
spielt TNF-α eine große Rolle (Spranger et al, 1995). Er stimuliert die
Leukozytenadhäsion ans Endothel, die Proliferation von Fibroblasten, die Produktion
weiterer proinflammatorischer Zytokine wie IL-1 und IL-6 und indirekt die
Freisetzung von Hormonen wie Adrenalin und Kortisol. TNF-α hat zwar eine große
Bedeutung für die Eindämmung von lokalen Entzündungen, doch wenn eine
unkontrollierte
systemische
Bakterieninfektion
(Sepsis)
entsteht,
führt
die
übermäßige Freisetzung von TNF-α zu einer Gefäßerweiterung, dem Verlust von
Blutplasma und schließlich zum Gesamtbild eines septischen Schocks (Janeway et al,
2002). Auf antigenpräsentierenden Zellen wie den dendritischen Zellen bewirkt
TNF-α eine Hochregulation des MHC-Komplexes.
1.3.3 Transforming-growth-factor-β
β (TGF-β
β)
Der
Transforming-Growth-Factor
β
(TGF-β)
wurde
zuerst
aus
humanen
Thrombozyten (Assoian et al, 1983), Plazenten (Frolik et al, 1983) und Rindernieren
gewonnen (Roberts et al, 1983). Er ist in zahlreiche physiologische und
pathologische Prozesse involviert, z.B. in die Wundheilung (Wahl, 1994). Es
existieren die drei Isoformen TGF-β1, -2 und –3, die strukturell und funktionell eng
verwandt sind.
TGF-β1 ist die häufigste Form und wird von allen Zellen, u.a. von Keratinozyten
und Langerhanszellen, sezerniert (Borkowski et al, 1996). Er moduliert die
Produktion weiterer Zytokine (Shull et al, 1992) und induziert Wachstumsfaktoren
(Keller et al, 1991). Auf CD34+ dendritischen Zellen erhöht TGF-β1 in vitro die
Langerinexpression und ist damit bedeutend für ihre Differenzierung in
Langerhanszellen (Valladeau et al, 1999).
16
1.3.4 Interleukin-4 (IL-4)
IL-4 wird von T-Zellen, basophilen Granulozyten und Mastzellen produziert (Brown
und Hural, 1997). Es bewirkt eine T-Zell-Differenzierung in Richtung TH2 und ist
damit der wichtigste Gegenspieler von IL-12, das eine TH1- Antwort fördert
(Janeway et al, 2002). Weiterhin unterdrückt IL-4 die Synthese von IFN-γ und die
zelluläre Antwort. In B-Lymphozyten bewirkt IL-4 einen Immunglobulinswitch von
IgM nach IgE und somit eine Aktivierung von Mastzellen und Förderung einer
Entzündungsreaktion.
IL-4
begünstigt
die
Differenzierung
dendritischer
Vorläuferzellen in Richtung interstitieller dendritischer Zellen (Caux et al, 1999).
17
1.4 Respiratory Syncytial Virus (RSV)
1.4.1 Epidemiologie
Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist neben dem Parainfluenza- und
Adenovirus der häufigste Erreger für Atemwegsinfektionen im Säuglings- und
Kleinkindesalter. RSV ist bei Kindern mit viraler Bronchiolitis in 70% der Fälle der
verantwortliche Erreger (McCarthy und Hall, 1998) und ein häufiger Grund für
stationäre Aufenthalte (Simoes, 1999). 90% der Kinder unter zwei Jahren sind schon
einmal mit RSV infiziert worden (Glezen et al, 1986).
RSV-Infektionen treten
gehäuft in den Wintermonaten auf und betreffen besonders Säuglinge zwischen sechs
Wochen und sechs Monaten. Die RSV-Infektion führt zu keiner anhaltenden
Immunität, so dass wiederkehrende Infektionen nicht selten sind (Hall, 2001).
Zu den Risikogruppen gehören Frühgeborene (auch ehemalige) (Church et al, 1984),
Kinder mit bronchopulmonaler Dysplasie, cystischer Fibrose, Herzerkrankungen
(MacDonald et al, 1982) und Immundefizienz (Hall et al, 1986). Ungünstig sind auch
familiäres Asthma (Trefny et al, 2000), Exposition mit Zigarettenrauch (Bradley et
al, 2005), fehlende Ernährung mit Muttermilch (Simoes, 2003), ein niedriger sozialer
Standard (Margolis et al, 1992) und eine Infektion mit dem RSV-Subtyp A. Es
erkranken aber auch ältere oder immunsupprimierte Menschen an RSV (Morales et
al, 1983).
In mehreren Studien wurde der Zusammenhang zwischen viralen Infektionen und
Asthma bronchiale untersucht. Vor allem wiederholte Infektionen mit RSV stehen im
Verdacht, über die Erkrankung einer schweren Bronchiolitis im Säuglingsalter die
Entstehung von Asthma bronchiale zu begünstigen (Sigurs et al, 2000 und 2005;
Hirose, 2008).
1.4.2 Klinik
Die Übertragung der Viren erfolgt durch Tröpfchen- oder Schmierinfektion. Die
oberen Atemwege stellen die Eintrittspforte für RSV dar. Nach einer Inkubationszeit
18
von drei bis fünf Tagen findet man eine Entzündung der Mukosa, submuköse Ödeme
in den Bronchien und Nekrosen der Epithelzellen (Lugo et al, 1993; Simoes et al,
1999).
Während die Mehrzahl der Kinder und Erwachsenen an leichten Infekten der oberen
Atemwege leidet, kann RSV bei Säuglingen und Risikopatienten schwere
Bronchiolitiden und Pneumonien auslösen. Im Prodromalstadium der Erkrankung
haben die Kinder eine Rhinitis, Husten und eventuell febrile Temperaturen, bei
Säuglingen kann sich RSV durch eine Apnoe manifestieren.
Bei der klinischen Untersuchung können neben feinblasigen Rasselgeräuschen,
einem Giemen und einem hypersonoren Klopfschall auch Zeichen einer Dyspnoe
auffallen, z.B. eine Zyanose, interkostale Einziehungen oder Nasenflügeln.
Radiologische Zeichen, z.B. peribronchiale Verdichtungen, Überblähungszeichen,
Atelektasen oder pneumonische Infiltrate, sind unspezifisch.
Im Verlauf kommt es bei mehr als 90% der Säuglinge unter 6 Monaten wegen
vermehrter Schleimbildung zu einer obstruktiven Bronchitis oder Bronchiolitis
(Lugo et al, 1993), bei älteren Kindern vermehrt zu einer Pneumonie.
1.4.3
Therapie
Eine Therapie erfolgt meist nur symptomatisch. Die Atemluft sollte angefeuchtet
werden und mit Sauerstoff angereichert sein (Simoes, 1999), so dass eine
hochnormale
Sauerstoffsättigung
erreicht
wird.
Die
Inhalation
von
Sympathikomimetika kann versucht werden, während die Gabe von Ribavirin
umstritten ist. Kinder mit kardiopulmonalen Vorerkrankungen sollten Kortison
verabreicht bekommen (Simoes, 1999). Kommt es zu einer bakteriellen
Superinfektion, kommen auch Antibiotika zum Einsatz.
1.4.4 Prophylaxe
Eine RSV-Infektion bietet keinen Schutz vor wiederholten Infektionen und auch eine
aktive Impfung mit Formalin-inaktivierten RS-Viren brachte keinen Erfolg. Im
19
Gegenteil, geimpfte Kinder litten nach Kontakt mit RSV an schwerere Infektionen
als ungeimpfte Kinder (Fulginiti et al, 1969). Einziger Schutz ist eine passive
Impfung mit Palivizumab, einem humanisierten monoklonalen Antikörper, den
Risikopatienten einmal monatlich während der RSV-Saison i.m. gespritzt bekommen
(Simoes et al, 1996).
Dendritische Zellen spielen bei der Erkennung und Präsentation von RSV eine
wichtige Rolle, sodass hier ein breiter Forschungsansatz besteht.
1.4.5
Aufbau des RS-Virus
RSV ist ein RNA-Virus mit einer negativen Einzelstrang-RNA und wird zum Genus
Pneumovirus und zu der Familie der Paramyxoviren gezählt (Huang und Wertz,
1982). Man unterscheidet aufgrund von unterschiedlichen Reaktionen auf
monoklonale Antikörper die beiden Typen A und B (Mufson et al, 1985).
Bei dem RS-Virus sind elf Gene mit entsprechenden Genprodukten, d.h. Proteinen,
bekannt (Dickens et al, 1984).
Die wichtigsten Oberflächenantigene und Ziele der neutralisierenden Antikörper sind
die Glykoproteine F und G. Das G-Protein ist von Bedeutung für das Anheften des
Virus an die Zelle (Collins et al, 1984). Das F-Protein ist ein integrales
Membranprotein (Collins et al, 1984) und für die Penetration des Virus in die Zelle
verantwortlich (Schlender et al, 2003). Nach der RSV-Infektion, wird es über einen
sekretorischen Weg prozessiert und an die Zelloberfläche transportiert (Anderson et
al, 1992). Dort führt das F-Protein zu einer Fusion infizierter Zellen, einem
Synzytium, was ein besonderes Merkmal der RSV-Infektion ist (Brock et al, 2005).
Als weitere Proteine liegen im Zytoplasma das L-Protein, das N-Protein und das PProtein (Grosfeld et al, 1995). Zusammen mit viraler RNA bilden sie den
Nukleokapsid-Kern des Virions, welcher den Transkriptionskomplex darstellt, der
für die Replikation und Transkription viraler RNA verantwortlich ist (Barik, 1992;
Huang et al, 1993). Das L-Protein ist eine katalytische RNA-Polymerase und dient
gleichzeitig zur Stabilisation des Transkriptionskomplexes (Horikami et al, 1992).
Das P-Protein nimmt eine Schlüsselrolle bei der Regulation von Replikation und
Transkription ein (Leonov et al, 1994; Grosfeld et al, 1995; Hall et al, 2001; Garcia-
20
Barreno et al, 1996), weshalb wir in dieser Studie das P-Protein in infizierten
dendritischen Zellen mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops genauer untersuchen
werden.
Zusätzlich sind noch weitere Nukleokapsid-Proteine, nicht-strukturelle Proteine,
sowie verschiedene Matrixproteine bekannt (Dickens et al, 1984; Bermingham und
Collins, 1999).
21
1.5 Methoden zum Virusnachweis in dendritischen Zellen
In mehreren Studien wird eine Infektion dendritischer Zellen mit RSV nachgewiesen
(Bartz et al, 2003b; deGraaf et al, 2005; Guerrero-Plata et al, 2005; Jones et al,
2006). Dafür können verschiedene Methoden angewandt werden.
In einer Studie von Bartz und Kollegen (2003b) wird das Verfahren der
Durchflusszytometrie angewandt, um intrazelluläre RSV-Proteine nach einer RSVInfektion nachzuweisen. Dort werden aus Nabelschnurblut gewonnene, unreife
dendritische Zellen mit durch CD40L gereiften dendritischen Zellen verglichen,
wobei die unreifen dendritischen Zellen weniger Virusprotein enthalten.
In weiteren Studien wird eine intrazelluläre RSV-Protein-Expression unreifer
dendritischer Zellen im Fluoreszenzmikroskop und mittels Durchflusszytometrie
untersucht (deGraaff et al, 2005; Guerrero-Plata et al, 2005; Jones et al, 2006). Mit
der Durchführung einer Real-Time PCR kann intrazelluläre virale RNA
nachgewiesen werden (Lukens et al, 2009). Die Produktion von RS-Viren kann
durch Messung des Virustiters im Überstand der infizierten dendritischen Zellen
beurteilt werden (Guerrero-Plata et al, 2005).
Auch bei anderen Viren gelingt der Nachweis einer Infektion dendritischer Zellen.
Das Masernvirus gehört wie das RS-Virus zur Familie der Paramyxoviren und
infiziert ähnlich wie diese den Respirationstrakt. In vitro Studien zeigen mittels
Durchflusszytometrie, dass sich dendritische Zellen, die entweder aus CD34+
Vorläuferzellen des Nabelschnurbluts oder aus Monozyten des peripheren Blutes
stammen, und epidermale Langerhanszellen mit dem Masernvirus infizieren lassen
(Schnorr et al, 1997; Fugier-Vivier et al, 1997; Grosjean et al, 1997).
Dabei kann eine zuvor erfolgte Reifung der dendritischen Zellen zu einer leicht
gesteigerten Virusreplikation führen (Servet-Delprat et al, 1999). Langerhanszellen
hingegen enthalten nach Maserninfektion weniger Proteine als die übrigen
dendritischen Zellen, was Vergleiche der intrazellulären Virusproteinlast zeigen
(Watari et al, 2005).
Durch Messung des Virustiters im Überstand kann die Freisetzung neuer
Masernviren aus Langerhanszellen nachgewiesen werden (Steineur et al, 1998).
Die Infektion dendritischer Zellen mit HIV wurde schon mehrfach untersucht.
22
In
einer
Studie
Durchflusszytometrie
von
Kawamura
und
und
Kollegen
Fluoreszenzmikroskopie
(2001)
die
wird
mittels
Proteinexpression
dendritischer Zellen und Langerhanszellen nach einer HIV-Infektion bestimmt, eine
Aussage über die Virusfreisetzung erfolgt nach Messung des Virustiters im
Überstand. In der Gruppe der Langerhanszellen lassen sich weniger virale Proteine
nachweisen als bei anderen dendritischen Zellen, und sie produzieren auch weniger
HI-Viren.
Blauvelt und Kollegen (1997) überprüfen in einer ähnlichen Studie die Infektion
dendritischer Zellen zusätzlich noch mit einer PCR.
Eine Steigerung der HIV-Produktion wird mit erhöhter Oberflächenexpression von
CD4, CCR5 und CXCR4 in Verbindung gebracht (Blauvelt et al, 1997; Kawamura et
al, 2001]. Zusätzlich scheint der Reifegrad der dendritischen Zellen wie auch bei der
Infektion mit dem Masernvirus von Bedeutung zu sein. So nimmt mit zunehmender
Reife die HIV-Replikation zu (Granelli-Piperno et al, 1999) und auch die
Virusproduktion der Langerhanszellen steigt nach Induktion einer Reifung mit
TNF-α (Ludewig et al, 1995).
23
1.6 Fragestellung
Das RS-Virus verursacht bei Säuglingen und Kleinkindern in vielen Fällen eine
schwere Bronchiolitis und bisher gibt es nur wenige Möglichkeiten zur Prophylaxe
und nur eine symptomatische Therapie. Dendritische Zellen spielen bei der
Erkennung von RSV eine wichtige Rolle. Wie zuvor beschrieben, ist es mittlerweile
möglich, dendritische Zellen in großem Umfang in vitro zu erzeugen und ihre
Infektion mit RSV zu untersuchen.
Es gibt mehrere Studien, in denen RSV-Infektionen unreifer und reifer dendritischer
Zellen verglichen werden. Ob sich Langerhanszellen ähnlich infizieren lassen, wurde
bisher
noch
nicht
untersucht.
Hinweise,
dass
Langerhanszellen aber vermindert ablaufen kann,
die
Virusproduktion
in
gibt es aus Studien mit dem
Masern- oder HI-Virus.
Deshalb fragen wir uns in dieser Studie ob Langerin exprimierende dendritische
Zellen (TGF-β-Zellen), die aus CD34+ Stammzellen unter dem Einfluss von TGF-β
entstehen, sich mit RSV infizieren lassen und ob die Infektion produktiv ist.
Anschließend vergleichen wir die Ergebnisse mit dendritischen Zellen (IL-4-Zellen),
die aus CD34+ Stammzellen nach Zugabe von IL-4 gewonnen werden.
Um intrazelluläre Virus-RNA nachzuweisen, führen wir eine Real-time PCR durch.
Mit
Hilfe
von
Fluoreszenzmikroskopie
und
Durchflusszytometrie
können
intrazelluläre virale Proteine nachgewiesen werden. Die Freisetzung infektiöser
viraler Partikel wird durch Bestimmung des Virustiters im Zellüberstand untersucht.
24
2 Methoden und Material
2.1. Methoden
2.1.1 Stammzellspender
Das Nabelschnurblut stammte von gesunden Neugeborenen aus dem Kreißsaal des
Augusta-Krankenhauses in Bochum. Die Eltern hatten zuvor ihr schriftliches
Einverständnis zur Nutzung des Nabelschnurbluts für unsere Studie gegeben. Die
Studie wurde von der Ethikkomission der medizinischen Fakultät geprüft und es gab
keine Einwände.
Das Nabelschnurblut wurde von den Hebammen unter sterilen Bedingungen
entnommen. Sie punktierten die Vena umbilicalis der Plazenta und fingen das Blut in
einem sterilen 50 ml Reagenzröhrchen mit Schraubverschluss auf. Dieses enthielt zur
Hemmung der Gerinnung und Keimbildung 7 ml einer Pufferlösung, bestehend aus
94 % Citrat-Phosphat-Dextrose Lösung (CPD), 2 % HEPES-Puffer, 2 % Partricin
und 2 % Kanamycin.
2.1.2 Isolierung der Zellen
2.1.2.1 Isolierung der mononukleären Zellen über den Ficoll-Gradienten
Entnommenes Nabelschnurblut, das nicht älter als 24 Stunden war, wurde mit PBS
im Verhältnis 1:4 verdünnt, dann mit 15 ml Ficoll (1,077 g/ml) pro Röhrchen
unterschichtet und für 35 min bei 400 x g und ausgeschalteter Bremse zentrifugiert.
Bei dieser Zentrifugation wurden Erythrozyten und polymorphkernige Leukozyten
von den mononukleären Zellen getrennt. Die entstandene Interphase, welche die
CBMC enthielt, wurde abpipettiert und in neuen Reagenzröhrchen aufgefangen.
25
Anschließend wurden die Zellen dreimal gewaschen, das heißt mit neuem PBS
zunächst für 10 min bei 300 x g zentrifugiert, dann für 15 min bei 200 x g und noch
einmal für 10 min bei 300 x g. Nach Anfärben einer Probe von 10 µl in 90 µl
Türck’scher Lösung wurde die Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer unter dem
Lichtmikroskop bestimmt.
2.1.2.2 Isolierung von CD34+ Zellen über die MiniMACS-Säule
2.1.2.2.1 Prinzip der MiniMACS-Säule
Mit der MACS-Säule (magnetic associated cell sorting) lassen sich verschiedene
Zellpopulationen
nach
magnetischer
Markierung
von
Oberflächenantigenen
voneinander trennen. Dazu werden sie auf eine Säule gegeben, die sich in einem
Magnetfeld befindet. Während die nicht-markierten Zellen durch die Säule
hindurchlaufen, werden die magnetisch markierten Zellen zurückgehalten und
können anschließend aufgefangen werden. Waren die markierten Zellen die
Zielzellen, so wird dieses Verfahren positive Selektion genannt. Bei der negativen
Selektion werden die unerwünschten Zellen markiert und zurückgehalten..
2.1.2.2.2 Durchführung
Zu je 1 x 108 Zellen wurden 100 µl FcR Blockingreagenz (humanes IgG) und 100 µl
hapten-konjugierte CD34 Antikörper gegeben, mit PBS auf 500 µl aufgefüllt und 30
min bei 4°C im Kühlschrank inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension mit
PBS bei 300 x g für 10 min gewaschen. Das Pellet wurde mit 1 ml PBS-Lösung
resuspendiert und auf eine kalte Magnetsäule (MACS) gegeben, die vorher und
nachher mit PBS gespült wurde. In der Magnetsäule wurden die CD34+ Zellen
zurückgehalten (positive Selektion). Die Säule wurde auf ein 15 ml Reagenzröhrchen
gesetzt und die CD34+ Zellen wurden mit 1 ml PBS aus der Säule gedrückt. Die so
erzeugte Zellsuspension wurde auf die vorgespülte zweite Säule gegeben und mit
26
PBS nachgespült. Eliminiert wurden die Zellen diesmal mit 1 ml Kulturmedium
RPMI 1640, welches zusätzlich noch 10 % fetales Kälberserum (FCS), 1 %
Kanamycin sowie 4 % einer Mischung aus 100 mM Sodium Pyruvat, nicht
essentiellen Aminosäuren (100x) und 200 mM L-Glutamin enthielt. Die mit diesem
Verfahren isolierten Zellen waren zu 95-99 % CD34 positiv. Die mit Türck’scher
Lösung gefärbten CD34+ Zellen wurden in der Fuchs-Rosenthal-Kammer unter dem
Lichtmikroskop gezählt.
2.1.3 Kultivierung und Anzucht von dendritischen Zellen
2.1.3.1 Anzucht bis Tag 7
Die Zellen wurden in einer Konzentration von 1,5 x 105 Zellen/ml in Kulturmedium
RPMI 1640 aufgenommen und mit 100 ng/ml Granulocyte-Macrophage Colonystimulating factor (GM-CSF), 100 ng/ml Stammzellfaktor (SCF) und 2,5 ng/ml
Tumuor-necrosis-factor
α
(TNF-α)
stimuliert.
Sie
wurden
auf
24-Well-
Microtiterplatten verteilt und für sieben Tage bei 37 °C und 5 % CO2-haltiger
Atmosphäre im Brutschrank inkubiert. Nach Ansicht im Lichtmikroskop wurden die
Zellen bei Bedarf geteilt und mit frischem Kulturmedium versorgt.
2.1.3.2 Ernten und Einfrieren angezüchteter Zellen
Zum „Ernten“ der dendritischen Zellen wurde der Inhalt aller zuvor gekühlten Wells
in einem 50 ml Reagenzröhrchen gesammelt und für 10 min bei 300 x g zentrifugiert.
Nach dem Zählen der mit Türk’scher Lösung gefärbten Zellen in der
Neubauerkammer, wurden sie mit PBS für 10 min bei 300 x g gewaschen. Zur
Resuspension wurde 1 ml Einfriermedium verwendet, bestehend aus 45 % fetalem
Kälberserum (FCS), 44 % RPMI 1640 Medium, 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO)
und 1 % Kanamycin. Die dendritischen Zellen wurden in einer Konzentration von
maximal 2 x 107 Zellen/ml in Einfriermedium aufgenommen, auf gekühlte Kryotubes
27
verteilt, so dass jedes 1 ml enthielt, und für mindestens 24 h bei -70 °C eingefroren.
Anschließend wurden sie in flüssigem Stickstoff bei –196 °C längerfristig
aufbewahrt.
2.1.3.3 Weiterkultur von Tag 7 bis Tag 14
Die dendritischen Zellen von Tag 7 wurden aufgetaut und dreimal mit PBS
gewaschen. Nach Anfärben in Türck’scher Lösung und dem Zählen in der
Neubauerkammer wurden sie in einer Konzentration von 4 x 105 Zellen/ml in
Kulturmedium aufgenommen. Die dendritischen Zellen wurden mit 1 ml/well auf
eine 24-Well-Microtiterplatte verteilt, stimuliert und bei 37 °C und 5 % CO2 im
Brutschrank inkubiert.
Um TGF-β-Zellen zu erhalten, wurde den dendritischen Zellen für sieben Tage
10 ng/ml transforming-growth-factor β (TGF-β) und 100 ng/ml GM-CSF
hinzugegeben.
IL-4-Zellen entwickelten sich nach sieben Tagen Stimulation der Kulturen mit
37,5 ng/ml IL-4, sowie 2,5 ng/ml TNF-α und 100 ng/ml GM-CSF.
2.1.4 Infektion der dendritischen Zellen mit RSV
Dendritische Zellen, die zuvor entweder mit TGF-β oder mit IL-4 polarisiert worden
waren, wurden jeweils in Reagenzröhrchen gesammelt und für 10 min bei 300 x g
zentrifugiert. Die Pellets wurden mit 1 ml Medium DMEM resuspendiert. Mit
Türck’scher Lösung gefärbte dendritische Zellen wurden in der Neubauerkammer
gezählt und in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/ml/Well auf eine 24-WellMicrotiterplatte verteilt.
Es wurde ein Virus-Stock (RSV Long strain) gezüchtet, indem HEp-2 Zellen mit
einer niedrigen MOI (multiplicity of infection) des Virus infiziert wurden. Die
Herstellung einer Verdünnungsreihe gab Auskunft über den Infektionstiter des
Virusstocks. Das Viruswachstum wurde durch typische zytopathische Effekte
untersucht, und durch immunzytochemische Färbung infizierter Zellen.
28
TGF-β-Zellen und IL-4-Zellen wurden mit RSV-longstrain mit einer MOI von 20
kultiviert. Nach 3 h Inkubation im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 wurden die
Überstände abgenommen, durch RPMI 1640 Medium ersetzt und die dendritischen
Zellen weiter inkubiert.
2.1.5 RSV-spezifische Real-Time PCR (RT-PCR)
Virale RNA wurde mit OLAamp® Viral RNA Mini Kit gemäß den Anweisungen
des Herstellers isoliert. Die RNA wurde in 50 µl Elutions-Puffer gelöst. Für den
ersten Schritt der RT-PCR wurde das Quanti TectIM Probe RT-PCR Kit mit SYBRGreen benutzt. Durch Klonen des PCR-Produkts wurde, mit Hilfe von TOPO-TA
cloning kit und dem PCR®-TOPO Vektor, sowie durch in vitro Transkription mit T7
RNA-Polymerase, ein RNA-Standard hergestellt. Die Menge der in vitro
transkribierten RNA wurde durch das Molecular Probes Ribo-Green RNA Verfahren
bestimmt, welches einen Rückschluss auf die Anzahl der Kopien des RNA-Standards
zuließ. Jede RT-PCR-Untersuchung enthielt 10fache Verdünnungen des RNAStandards.
Für
die
RT-PCR
wurden
der
Vorwärts-Primer
RSA-1
5´-
AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA und der Rückwärts-Primer RSA-2 5´ GCACATCATAATTAGGAGTATCAAT verwendet (van Elden, 2003). Die
Vermehrung und Erkennung wurden unter folgenden Bedingungen mit Hilfe des
Rotorgene detection system durchgeführt: eine Stunde Inkubation bei 50 °C und 15
min bei 95 °C, um die DNA-Polymerase zu aktivieren, zusätzlich 45 Zyklen mit 15
sec auf 95 °C und 1 min auf 60°C. Während der Amplifikationsschritte wurde die
Konzentration des PCR-Produkts mit dem Rotorgene detection system gemessen.
Die Spezifität der PCR-Produkte wurde über Schmelzpunktanalysen von 45 °C bis
95 °C geprüft.
29
2.1.6 Untersuchung der dendritischen Zellen im Fluoreszenzmikroskop
2.1.6.1 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen
Die dendritischen Zellen wurden für 30 min bei 37 °C inkubiert und mit Poly-LLysin (0,01% in Wasser) bedeckt. Für die Immunfärbung wurden die Zellen mit
4%iger Paraformaldehydlösung fixiert. Für die Färbung von F-Actin wurden die
Zellen mit 0,1%igem Saponinpuffer gewaschen und für die Färbung von Fascin mit
Aceton. Um möglichst wenige unspezifische Bindungen zu erhalten, wurden die
Proben mit 0,5% v/v cold water fish-skin gelatine geblockt.
2.1.6.2 Färbung
Actin wurde mit Alexa 555 gefärbt, das mit Phalloidin verbunden war. Das an Actin
gebundene Protein Fascin wurde mit einem Anti-Fascin Ak (55K-2, Dako) mit Alexa
488, unter Benutzung der Zenon-Technologie, versehen. Die Zellkerne wurden mit
DAPI gefärbt. Das RSV P-Protein wurde an monoklonale Maus-Antikörpern
gebunden und mit Alexa 488 oder 555 mit Hilfe der Zenon-Technologie gefärbt.
2.1.6.3 Immunfluoreszenzmikroskopie
Die optischen Schnitte wurden mit einem Zeiss Axioplan 2 Fluoreszenzmikroskop
durchgeführt. Dieses ist mit einer 63 x 1,4 Blende, Öl-Immersions-Objektiv und
einem Axiocam MRc im monochromen Modus ausgestattet.
Serien von xy-Schnitten wurden mit einem Abstand von 0,35 µm in z-Richtung
gemacht. Die dendritischen Zellen wurden mit der Software Axiovision 4.4
analysiert.
Die P-Protein-Vakuolen wurden in zufällig ausgesuchten Bereichen gemessen. Wir
zählten mindestens 40 Zellen in jedem Bereich.
30
2.1.7 Messung des intrazellulären RSV-Antigens im Durchflusszytometer
2.1.7.1 Fixierung und Permeabilisierung der Zellen
Die unterschiedlich stimulierten und anschließend mit RSV infizierten dendritischen
Zellen wurden in Reagenzröhrchen aufgenommen und mit PBS für 10 min bei
300 x g gewaschen. Nach Abgießen des Überstands wurden sie für 10 min mit
eiskaltem, frischen 4%igen Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurde das
Paraformaldehyd mit PBS für 10 min bei 500 x g ausgewaschen. Zur
Permeabilisierung der dendritischen Zellmembran wurden sie mit 1 ml/Röhrchen
Saponinpuffer, bestehend aus PBS, 0,1 % Saponin und 0,01 M HEPES-Puffer,
5 min bei 200 x g zentrifugiert. Danach wurden den dendritischen Zellen 0,5
µg/Röhrchen polyklonale und mit Biotin gekoppelte RSV-Antikörper beigegeben.
Nach 15 min Inkubation bei 4 °C im Kühlschrank wurden die nicht gebundenen
Antikörper mit 1 ml Saponinpuffer für 5 min bei 200 x g ausgewaschen. Nach
Zugabe von 0,5 µl/Röhrchen Streptavidin Tricolor und 15 min Inkubation bei 4 °C,
wurden die dendritischen Zellen noch einmal mit 1 ml Saponinpuffer für 5 min bei
200 x g gewaschen.
2.1.7.2 Messung im FACScanTM
Zur Messung im FACScanTM wurden die Proben in 200 µl PBS aufgenommen. Die
dendritischen Zellen wurden durch Überdruck in die Messküvette eingeführt, wo sie
den Analysepunkt nacheinander passierten. Dort wurden die Fluoreszenzfarbstoffe
durch einen Argon-Laser mit 488 nm Wellenlänge angeregt. Aufgrund der Messung
von
Fluoreszenz-
und
Streulichtsignalen
konnten
die
relative
Zellgröße
(Vorwärtsstreulicht) und Granularität einer Zelle (Seitwärtsstreulicht), sowie die
Fluoreszenzintensität bestimmt werden. Die Ergebnisse wurden mit dem Programm
Cellquest analysiert.
31
2.1.8 Bestimmung des Virustiters im Überstand
HEp-2-Zellen wurden in einer Konzentration von 2 x 104 Zellen/100µl/well auf eine
96-Well-Microtiterplatte verteilt. Aus RS-Viren, welche aus dem Überstand der
dendritischen Zellen 6 h, 24 h und 48 h nach der Infektion gewonnen worden waren,
wurde mit DMEM eine Verdünnungsreihe hergestellt. Die HEp-2-Zellen wurden mit
100 µl/well aus jeder Verdünnungsstufe infiziert und 24 h bei 37 °C und 5 % CO2
inkubiert. Es wurde der Titer bestimmt, bei dem im Lichtmikroskop die letzte
infizierte Zelle zu sehen war.
32
2.2
Material
Aceton
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Aminosäuren, nicht essentielle
Biochrom, Berlin
Anti-Fascin Ab
Dako, Glostrup (Dänemark)
Auflichtmikroskop:
1. Zeiss, 2. K2, Olympus Optical Co.
Biocoll Separation Solution, Dichte 1,077g/ml, isoton:
Biochrom, Berlin
Brutschrank (CO2-Inkubator):
Heraeus, Düsseldorf
CPD:
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Cold water fish-skin gelatine:
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
DAPI:
Invitrogen, Karlsruhe
DMEM:
Gibco, Karlsruhe
DMSO (>99,5%):
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Durchflusszytometer:
FACScanTM, Becton Dickinson, Heidelberg
FcR Blocking Reagenz:
Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach
FCS:
Biochrom, Berlin
Fluoreszenzmikroskop:
Axioplan 2, ZEISS
33
GM-CSF:
PromoCell, Heidelberg
HEPES-Puffer 1 M:
Biochrom , Berlin
HEp-2-Zellen:
ATCC-LGC Standards, Wesel
IL-4:
PeproTech, London, über TEBU, Offenbach
Kanamycin:
Biochrom, Berlin
Kryotube:
Nunc, Roskilde (Dänemark)
L-Glutamin 200mM:
Biochrom, Berlin
Microbeads, anti-CD34:
Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach
Microtiterplatte mit Flachboden, 24-well:
Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg
Microtiterplatte mit Flachboden, 96-well:
Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg
MiniMACS-Säule:
Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach
Monoklonale Maus-Antikörper:
DS Diagnostics, Witten
OLAamp® Viral RNA Mini Kit:
Qiagen, Hilden
Paraformaldehyd:
Riedel-de Haen, Seelze
Partricin:
Biochrom, Berlin
PBS-Dulbecco:
Biochrom, Berlin
PCR®-TOPO Vektor:
Invitrogen, Karlsruhe
34
Phalloidin:
Invitrogen, Karlsruhe
Pipetten 10ml, steril:
Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg
Poly-L-Lysin:
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Polystyren Reagenzgläser mit Rundboden, 5,0 ml:
Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg
Quanti TectIM Probe RT-PCR Kit:
Qiagen, Hilden
Reagenzgläser mit Schraubverschluss 15 ml:
Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg
Reagenzgläser mit Schraubverschluss 50 ml:
Falcon/Becton Dickinson, Heidelberg
RNA-Polymerase T7:
Invitrogen, Karlsruhe
RNA-Standard :
Invitrogen, Karlsruhe
RPMI 1640 Medium:
Biochrom, Berlin
Rotorgene detection system
Corbett Life Science
RSV-Antikörper, polyklonal:
Biodesign über Dunn Labortechnik, Asbach
Saponin:
Riedel-de Haen, Seelze
SCF:
PeproTech Inc. über TEBU Offenbach
Sodium Pyruvat 100mM:
Biochrom, Berlin
Stickstoffbehälter:
Messer, Chronos Biosafe, Krefeld
Streptavidin Tricolor:
Medac, Hamburg
35
SYBR-Green:
Invitrogen, Karlsruhe
TGF-β
β:
Peprotech, London, über TEBU, Offenbach
TNF-α
α:
R&D Systems, Wiesbaden
TOPO-TA Cloning Kit:
Invitrogen, Karlsruhe
Türk’sche Lösung:
Fluca Chemie, Steinheim
Zenon-Technologie:
Invitrogen, Karlsruhe
Zentrifuge:
Omnifuge 2,0RS, Heraeus, Düsseldorf
36
3. Ergebnisse
In dieser Studie wurden CD34+ Zellen aus hämatopoietischen Stammzellen des
humanen Nabelschnurbluts isoliert, zunächst mit GM-CSF, TNF-α und SCF
stimuliert und für sieben Tage inkubiert, so dass sie sich zu myeloiden dendritischen
Zellen entwickelten. Um TGF-β-Zellen zu erhalten, wurde den dendritischen Zellen
TGF-β und GM-CSF hinzugegeben. IL-4-Zellen entwickelten sich nach Stimulation
der Kulturen mit IL-4, sowie TNF-α und GM-CSF.
Alle Zellen wurden mit dem Laborvirus RSV long strain mit einer MOI (multiplicity
of infection) von 20 infiziert.
Der Nachweis für eine erfolgreiche Infektion mit RSV erfolgte bei den beiden
Subpopulationen über den Nachweis von RSV-RNA in der Real-Time PCR und
durch die Identifikation intrazellulärer viraler Proteine im Fluoreszenzmikroskop und
in der Durchflusszytometrie. Mit der Bestimmung des Virustiters im Überstand
wurde die Freisetzung infektiöser viraler Partikel untersucht.
3.1 Die RSV-Replikation ist in TGF-β
β-Zellen vermindert
Mit der Real-Time PCR wurde 6 h, 24 h und 48 h nach der RSV-Infektion die Zahl
der RSV RNA-Kopien pro µg RNA gemessen.
Wir erhielten unterschiedliche Ergebnisse, die vom Untersuchungszeitpunkt
abhängig waren. So beobachteten wir bei der ersten Messung nach 6 h sowohl bei
den TGF-β-Zellen als auch bei den IL-4-Zellen wenige RNA-Kopien (1,5x108/µg
RNA bzw. 2x108/µg RNA). Nach 24 h stieg die Zahl der RNA-Kopien in beiden
Gruppen sprunghaft auf 8x108/µg RNA an. Der größte Unterschied wurde nach 48 h
beobachtet, als die TGF-β-Zellen einen signifikanten Abfall auf 3x108/µg RNA
zeigten, während in der Gruppe der IL-4-Zellen zur gleichen Zeit ein weiterer
Anstieg der RNA-Kopien verzeichnet wurde (1x109 RSV-Kopien/µg RNA).
37
TGF-β
β-Zellen
IL-4-Zellen
Abbildung 2: RSV Replikation. Durchführung der Real-Time PCR nach RSV-Infektion.
Bestimmung der Zahl der viralen RNA-Kopien mit Hilfe des Rotorgene detection system.
3.2 Untersuchung des P-Proteins
Dendritische Zellen exprimieren nach Infektion mit RSV verschiedene virale
Proteine: u.a. das F-Protein, das G-Protein und das P-Protein (Collins et al, 1984;
Grosfeld et al, 1995). Das Vorhandensein von RSV-Proteinen, insbesondere des PProteins, wurde von uns in TGF-β-Zellen und in IL-4-Zellen nach Identifizierung
durch monoklonale Maus-Antikörper im Fluoreszenzmikroskop untersucht und ergab
einen ersten Hinweis auf eine RSV-Infektion. Weiterhin wurde überprüft, ob
zwischen den verschiedenen dendritischen Zellen Unterschiede in der Lokalisation
und bei der Expression der RSV-Proteine bestanden.
3.2.1 Das P-Protein liegt als Vakuole im Zytoplasma
Im Fluoreszenzmikroskop beobachteten wir, dass die Glykoproteine F und G auf der
Zelloberfläche und in der Zelle verteilt lagen. Ihre Menge ließ sich nicht
quantifizieren und vergleichen. Deshalb beschränkten wir uns auf die Untersuchung
38
des P-Proteins, das 24 h nach der Inkubation als runde Vakuole im Zytoplasma lag,
wie zuvor schon von Garcia et al. beschrieben (1993). Es war von den
Zytoskelettproteinen Aktin und Fascin umgeben, ging aber keine Verbindung mit
ihnen ein. Zwischen den beiden untersuchten Gruppen von dendritischen Zellen
waren Unterschiede in der Größe der Vakuole erkennbar. Um sie zu quantifizieren,
wurde der Radius der P-Proteinvakuolen bestimmt und die Ergebnisse im nächsten
Abschnitt miteinander verglichen.
TGF-β
β-Zelle
IL-4-Zelle
TGF-β
β-Zelle
IL-4-Zelle
Aktin (rot)
P-Protein (grün)
Zellkern (blau)
Fascin (grün)
P-Protein (rot)
Zellkern (blau)
Abbildung 3: Intrazelluläre Verteilung des P-Proteins. Vor der Färbung wurden die Zellen
fixiert und permeabilisiert. Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. Actin, Fascin und PProtein wurden an monoklonale Ak gebunden und mit Alexa 488 oder 555 gefärbt.
39
3.2.2 Der Durchmesser der P-Protein Vakuole ist bei den TGF-β
β-Zellen
größer
Da die P-Proteinvakuole im Fluoreszenzmikroskop bei den verschiedenen
dendritischen Zellen unterschiedlich groß aussah, haben wir, um diesen Unterschied
quantitativ zu bestimmen, den Durchmesser der Vakuolen gemessen.
Das P-Protein der TGF-β-Zellen zeigte einen Durchmesser von 3,0µm, gefolgt von
dem P-Protein der IL-4-Zellen mit einem kleineren Durchmesser von 2,5µm.
TGF-β
β-Zellen
IL-4-Zellen
Abbildung 4: Durchmesser der RSV P-Protein Vakuole 24 h nach einer RSV-Infektion. Der
Durchmesser wurde in 73 TGF-β
β-Zellen und 42 IL-4-Zellen aus drei verschiedenen
Experimenten mikroskopisch bestimmt.
3.3 TGF-β
β-Zellen enthalten weniger RSV-Proteine als IL-4-Zellen
Als weitere Nachweismethode für das Vorhandensein intrazellulärer Virusproteine
führten wir eine Durchflusszytometrie durch.
Nach Bindung von polyklonalen RSV-Antikörpern an RSV-Antigen in allen
dendritischen Zellen und nach Färbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Streptavidin
Tricolor wurden die Fluoreszenzen mit einem FACScanTM gemessen. Das Programm
Cellquest berechnete die Infektionsrate in Prozent.
40
Den ersten Nachweis von RSV Protein erhielten wir sowohl bei den TGF-β-Zellen
als auch bei den IL-4-Zellen 24 h nach der Infektion mit RSV (18% bzw. 14%). Bei
einer weiteren Messung nach 48 h zeigte sich, dass der Proteinanteil in der Gruppe
der TGF-β-Zellen auf 17% sank, während er bei den IL-4-Zellen auf 20% anstieg.
TGF-β
β -Zellen
IL-4-Zellen
Abbildung 5: Virale Proteinexpression in der Durchflusszytometrie.
Nach Fixierung und
Permeabilisierung wurden die DCs an polyklonale Ak gebunden und mit Streptavidin Tricolor
markiert. Die Messung erfolgte im FACScanTM.
3.4 Die Virusfreisetzung ist in TGF-β
β-Zellen geringer als in IL-4-Zellen
Um zu überprüfen, ob die RSV-Infektion zu einer Freisetzung infektiöser viraler
Partikel führte, wurde der Virustiter im Überstand bestimmt. Dazu wurden die
dendritischen Zellen nach RSV-Infektion mehrmals gewaschen, um ungebundene
Viren zu entfernen. Zur Messung des Virustiters wurde zu verschiedenen Zeiten nach
der Infektion der Überstand der dendritischen Zellen abgenommen. Anschließend
wurden HEp-2 Zellen mit verschiedenen Verdünnungsstufen des Überstands
infiziert. Nach 24 h wurde der Titer bestimmt, bei dem im Lichtmikroskop die letzte
infizierte HEp-2 Zelle zu sehen war. Je höher dieser Titer war, desto mehr Viren
befanden sich vorher im Überstand.
41
Bei beiden Gruppen von dendritischen Zellen konnten 6 h nach der Infektion mit
RSV im Überstand infektiöse RSV-Partikel nachgewiesen werden (1,5x105 pfu).
Nach 24 h gab es einen sprunghaften Anstieg in der Gruppe der IL-4-Zellen (2x107
pfu) während bei den TGF-β-Zellen nur ein geringer Anstieg sichtbar war (2x105
pfu), der sich nach 48 h nicht viel vergrößerte (3x105 pfu). Die IL-4-Zellen erreichten
nach 48 h ein Maximum von 4x107pfu, was somit mehr als das Hundertfache der
TGF-β-Zellen war.
TGF-β
β -Zellen
IL-4-Zellen
Abbildung 6: Messung des Virustiters. Aus RS-Viren, die aus dem Überstand der DCs
stammten, wurde mit DMEM eine Verdünnungsreihe hergestellt. Anschließend wurden HEp-2
Zellen mit diesen Viren infiziert und der Virustiter bestimmt.
42
4 Diskussion
In unserer Studie wurde die RSV-Infektion von TGF-β-Zellen mit der Infektion von
IL-4-Zellen verglichen. Dazu wurden die dendritischen Zellen mit RSV-longstrain
und einer MOI von 20 infiziert.
Die Bestimmung von RSV-Kopien/µg RNA mittels PCR ergab nach 48 h eine
geringere Replikationsrate in TGF-β-Zellen als in IL-4-Zellen. Die Ergebnisse, die
wir durch Untersuchungen im Fluoreszenzmikroskop und mit Hilfe der
Durchflusszytometrie erlangt haben, zeigten, dass beide Gruppen von dendritischen
Zellen virale Proteine bildeten, wobei der intrazelluläre Proteingehalt nach 48 h in
TGF-β-Zellen geringer war als in IL-4-Zellen. Die Freisetzung viraler Partikel war
zur gleichen Zeit bei den TGF-β-Zellen im Gegensatz zu den IL-4-Zellen auf ein
hundertstel reduziert, was wir aus der Berechnung der Viruslast im Überstand
schließen konnten.
4.1 Verteilung der Langerhanszellen in Haut und Lunge
Langerhanszellen sind dendritische Zellen, die in den großen Bronchien ein hoch
entwickeltes Netzwerk mit 600-800 Zellen /mm3 bilden (Schon-Hegrad et al, 1991).
Im Mukosaepithel der Atemwege sind sie die ersten Zellen, die mit RSV infiziert
werden. Sie sind vergleichbar mit Langerhanszellen in der Haut, doch ist noch
unklar, ob sie mit ihnen identisch sind. Die Langerhanszellen in der Lunge werden
z.B. viel häufiger erneuert (alle 48-72 h) als die epidermalen Langerhanszellen (alle
21 Tage) (Holt et al, 1999). Ein weiterer Unterschied besteht im ersten Auftreten der
Langerhanszellen, denn in der Epidermis von Ratten werden schon sieben Tage nach
der Geburt reife Langerhanszellen gefunden, während sie in der Lunge erst später
erscheinen (Nelson und Holt, 1995).
Demedts und Kollegen (2005) fanden heraus, dass sich im Lungenepithel
hauptsächlich CD1a+ dendritische Zellen befinden, die Langerin enthalten. Dieses ist
ein spezifischer Marker für Langerhanszellen (Valladeau et al, 1999), was wiederum
43
dafür spricht, dass Langerhanszellen der Haut und der Lunge identisch oder
zumindest sehr ähnlich sind und oben genannte Unterschiede eventuell auf
unterschiedliche Stimulationssignale von Lunge und Haut zurückzuführen sind.
Unsere in vitro gezüchteten TGF-β-Zellen entsprechen, laut Hinweisen aus der
Literatur, langerhansähnlichen Zellen. Strobl und Kollegen (1996) und Caux und
Kollegen (1999) haben CD34+ Stammzellen mit TGF-β stimuliert. In den
entstandenen Zellen ließ sich Birbeck Granula nachweisen, was für eine
Differenzierung in langerhansähnliche Zellen spricht. Bartz und Kollegen (2003a)
konnten zwar keine Birbeck Granula in TGF-β-Zellen nachweisen, aber die für
Langerhanszellen
typischen
Marker
CD
207
(Langerin)
und
kutanes
Leukozytenantigen.
In unseren TGF-β-Zellen haben wir Langerin und den für Langerhanszellen
spezifischen Rezeptor CCR 6 nachgewiesen (Ergebnisse hier nicht dargestellt).
4.2. P-Proteinexpression in dendritischen Zellen
Die verminderte Freisetzung von Viruspartikeln bei den TGF-β-Zellen kann
verschiedene Ursachen haben. Um auszuschließen, dass die virale Proteinexpression
dafür
verantwortlich
ist,
untersuchten
wir
die
RSV-Proteine
im
Fluoreszenzmikroskop. Wir haben uns in unseren Untersuchungen hauptsächlich auf
das P-Protein beschränkt, da es als einziges im Fluoreszenzmikroskop zu
quantifizieren und somit zwischen den beiden Zelltypen vergleichbar war.
Über die Form und Ausmaße des P-Proteins in mit RSV infizierten Zellen findet man
in der Literatur nur wenige Informationen. Asenjo und Villanueva (2000) konnten
das P-Protein in infizierten HEp-2-Zellen als Homotetramer darstellen, Castagne und
Kollegen (2004) untersuchten das P-Protein in infizierten E.coli und beschreiben es
als Oligomer, das meistens ein Tetramer, selten ein Dimer darstellt. In anderen
Studien wird das P-Protein als zytoplasmatisches Einschlusskörperchen oder
Vakuole beschrieben (Garcia et al, 1993; Philippou et al, 1996), so wie wir es auch in
unserer Studie gesehen haben. Einige Autoren sind der Ansicht, dass es sich bei den
44
Einschlusskörperchen nicht nur um das P-Protein alleine handelt, sondern um eine
Verbindung von P-Protein und N-Protein (Spehner et al, 1997), oder sogar um den
gesamten Ribonukleinproteinkomplex (Garcia et al, 1993). In unseren Experimenten
haben wir nur das P-Protein dargestellt, sodass wir über die Verteilung von N- und
L-Protein keine Aussage treffen können.
Am Beispiel der TGF-β-Zellen zeigte sich, dass der Nachweis der P-Protein-Vakuole
zwar ein Hinweis auf eine RSV-Infektion war, der Durchmesser der Vakuole aber
nicht mit der Zahl der freigesetzten Viruspartikel korrelierte. Trotz geringerer
Virusfreisetzung zeigten die durchgeführten Messungen des P-Proteins nach 24 h
einen größeren Durchmesser in TGF-β-Zellen als in IL-4-Zellen. Dies lässt darauf
schließen, dass die Ursache für die verminderte Virusproduktion von TGF-β-Zellen
in der viralen Morphogenese zu suchen ist.
Das Mikrofilament Actin ist ein Grundbaustein des Cytoskeletts und kommt in allen
Zellen vor. Es ist ein globuläres Protein (G-Actin), das unter physiologischen
Bedingungen zu langen, fadenförmigen Ketten (F-Actin) polymerisiert. Actin ist u.a.
an der Zellbewegung, der Endozytose, der Exozytose und an der Bewegung der
Mikrovilli beteiligt (Löffler et al, 2003). Philippou und Kollegen (1996) schreiben
zur Lokalisation des P-Proteins, dass es sich zwischen den Filamenten des
Zytoskeletts befindet. Wir konnten zeigen, dass sowohl in TGF-β-Zellen als auch in
IL-4-Zellen, das P-Protein in unmittelbarer Nähe zu Actin und Fascin liegt, es aber
keine Interaktion zwischen ihnen gibt.
Die Polymerisation von Actin scheint aber eine wichtige Rolle bei der Bildung von
RSV-Bestandteilen zu spielen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass
verschiedene dendritische Zellen sich in der Organisation ihres Zytoskelettes und
somit auch in ihrer RSV Partikelbildung unterscheiden.
4.3 Infektion dendritischer Zellen mit RSV
In Studien mit unreifen dendritischen Zellen (aus PBMC) werden nach RSVInfektion wie in unserer Studie mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops und der
45
Durchflusszytometrie intrazelluläre virale Proteine nachgewiesen (de Graaff et al,
2005). Die Virusproduktion ist geringer als in Epithelzellen (Guerrero-Plata A et al,
2005).
In einer Studie von Bartz und Kollegen (2003) (mit aus Stammzellen gewonnenen
dendritischen Zellen) werden die Infektionsraten von unreifen dendritischen Zellen
und von dendritischen Zellen, die mit CD40L gereift sind, im Durchflusszytometer
bestimmt. Es zeigt sich, dass die reifen dendritischen Zellen mehr RSV-Protein
enthalten und dass insgesamt die Zahl der infizierten Zellen mit ansteigender MOI
zunimmt.
Dabei sind die Ergebnisse der unreifen dendritischen Zellen (12%) bei einer MOI
von 20 nach 24 h ähnlich unseren Ergebnissen bei IL-4-Zellen (14%). Die reifen
dendritischen Zellen zeigen dagegen eine höhere Infektionsrate (20%).
4.4 Infektion von Makrophagen mit RSV
Mehrere Studien zeigen, dass sich Makrophagen mit RSV infizieren lassen (Panuska
et al, 1990; Cirino et al, 1993; Miller et al, 2004). Cirino et al (1993) beobachtet 1296 h nach einer Infektion eine maximale Infektionsrate von 40% bei einer MOI von
3, die sich weder durch eine höhere MOI, noch durch Reinfektionen steigern lässt.
Die Replikationsrate beträgt aber nur 5%. Senft und Kollegen (2009) fanden heraus,
dass RSV die interferongesteuerte Transkriptionsaktivität in Makrophagen hemmt.
Dies wird durch andere Studien bestätigt, in denen nach Infektion mit RSV in
Alveolarmakrophagen virale Proteine nachgewiesen werden, aber nur wenige
freigesetzte Viren (Hegele et al, 1994; Franke-Ullmann et al, 1995).
Die Ergebnisse sind vergleichbar mit den TGF-β-Zellen aus unserer Studie, bei
denen ebenfalls virale Proteine gefunden wurden, aber die Replikationsaktivität und
die Freisetzung viraler Partikel niedrig waren. Vergleicht man die Replikation der
Makrophagen mit Epithelzellen der Atemwege, so stellt man fest, dass die
Replikation in den Makrophagen 10-100x geringer ist (Miller et al, 2004).
Andere Studien lassen darauf schließen, dass die Replikation in Makrophagen
langsam, aber kontinuierlich, abläuft (Sarmiento et al, 2002; Hegele et al, 1994). In
46
einer Studie von Panuska und Kollegen (1990) ist die Produktion infektiöser RSViren durch Makrophagen zunächst noch niedrig, steigt aber nach 24 h an und kann
bis zu 25 Tagen andauern.
Im Gegensatz dazu zeigten unsere TGF-β-Zellen einen kurzen Anstieg der
Replikationsrate bis zu 24 h nach der Infektion mit RSV, um danach sofort
abzufallen. Bei der Bestimmung des Virustiters beobachteten wir einen langsamen
Anstieg in der Gruppe der TGF-β-Zellen bis 48 h nach der Infektion. Allerdings
führten wir das Experiment nicht weiter fort, sodass wir über den weiteren Verlauf
des Virustiters über diesen Zeitraum hinaus keine Aussage treffen können.
4.5
Infektion dendritischer Zellen mit dem Masernvirus
Vergleiche der intrazellulären Virusproteinlast zwischen Langerhanszellen und
weiteren
dendritischen
Zellen
zeigen,
dass
Langerhanszellen
weniger
Masernproteine enthalten als die übrigen dendritischen Zellen (Watari et al, 2005).
Besonders deutlich wird dies in einer Studie von Servet-Delprat und Kollegen
(1999), wo nach 72 h 50% der dendritischen Zellen das Nukleoprotein des
Masernvirus enthalten, aber nur 12% der Langerhanszellen.
In unsere Studie wurde die Messung der intrazellulären RSV-Protein-Expression
nach 48 h beendet, zu diesem Zeitpunkt betrug der Proteinanteil in den IL-4- Zellen
20% und in den TGF-β-Zellen 17%. Wenn man davon ausgeht, dass sich der
Proteinanteil in unseren IL-4- Zellen nach 72 h noch vergrößert und in den TGF-βZellen weiter verringert, sind die Ergebnisse von Servet-Delprat und Kollegen
durchaus vergleichbar mit unseren Daten.
4.6
Infektion dendritischer Zellen mit HIV
In einer Studie mit HIV von Kawamura und Kollegen (2001) wird, ähnlich wie in
unserer Studie, die Infektion von TGF-β-Zellen mit der Infektion von IL-4-Zellen
47
verglichen, als dritte Vergleichsgruppe untersucht Kawamura mit CD40L gereifte
TGF-β-Zellen. In der Gruppe der unreifen TGF-β-Zellen lassen sich sowohl
intrazellulär als auch im Überstand deutlich weniger virale Proteine nachweisen als
in den anderen Zellgruppen.
Die Aussagen lassen sich auch auf unsere Studie übertragen. Hier sind sowohl die
intrazelluläre Proteinexpression als auch die Freisetzung neuer RS-Viren in TGF-βZellen ebenfalls niedriger als in IL-4- Zellen.
4.7 Bedeutung von Langerhanszellen für die Abwehr von Pathogenen
Borkowski und Kollegen (1996) zeigen in einer Studie an Mäusen, bei denen durch
Gendeletion die TGF-β Produktion gehemmt wird, dass dadurch die Bildung von
Langerhanszellen in der Epidermis verhindert wird. Die Mäuse, die kein TGF-β und
keine Langerhanszellen produzieren, leiden ab ihrem 10. Lebenstag an multifokalen
Entzündungen, die zu Gewebsnekrosen, Organversagen, und schließlich zum Tod
führen (Shull et al, 1992; Kulkarni et al, 1993). Durch ein Immunsuppressivum
(Rapamycin) können die Entzündungen gelindert werden (Borkowski et al, 1996).
Eine mögliche Erklärung für diese letalen Verläufe ist, dass Langerhanszellen eine
wichtige Rolle bei der Eindämmung von Entzündungen spielen, indem sie die
systemische Reaktion des Organismus dämpfen. Da sie bei den TGF-β- Mäusen
fehlen, werden die Pathogene von anderen antigenpräsentierenden Zellen
aufgenommen, die eine stärkere Immunantwort auslösen.
4.8 Langerhanszellen sind in der Lunge erst nach dem ersten Lebensjahr
vorhanden
Da unsere Ergebnisse auf eine bedeutende Rolle der Langerhanszellen bei der
Ausprägung von RSV-Infektionen hinweisen und RSV besonders Säuglinge betrifft,
ist es von Bedeutung, ab welchem Alter Langerhanszellen in der Lunge
nachgewiesen werden können. Dies ist beim Menschen erst wenig erforscht.
48
Es gibt eine Studie von Tschernig und Kollegen (2001), die Proben aus der Trachea
von Kindern auf dendritische Zellen untersucht hat, die jünger als 1 Jahr waren und
entweder an einem akuten Trauma oder an SIDS verstorben sind. Die Ergebnisse hat
er mit Proben von Säuglingen, die an Atemwegsinfektionen gestorbenen sind, und
mit Material von älteren Kindern und Erwachsenen verglichen.
Tschernig hat herausgefunden, dass ruhende dendritische Zellen erst nach dem ersten
Lebensjahr in der Trachea vorhanden sind. Dies wurde zuvor schon bei Ratten
beobachtet, deren Trachea postnatal nur wenige und unreife dendritische Zellen
enthielt (Nelson et al, 1994). Die endgültige Zahl wurde erst kurz vor dem
Erwachsenenalter erreicht.
Weitere Studien von Tschernig und Kollegen bestätigen seine vorherigen Ergebnisse.
So wurden im humanen fetalen Larynx keine Anzeichen für MALT (Dietrich et al,
2004) und
wie zuvor bei Kindern erst ab einem Alter von 1 Jahr vermehrt
dendritische Zellen in der Trachea entdeckt (2006).
Tschernig hat dendritische Zellen vor dem ersten Lebensjahr nur bei Kindern
entdeckt, die an Atemwegsinfektionen erkrankt waren. Zwar konnte er in einem
Versuch mit jungen Ratten (2007) nach einem Mykoplasmen-ähnlichen Stimulus
keine Erhöhung der Leukozytenzahl in der Lunge feststellen, doch Gill und Kollegen
(2005) fanden in der Nasenschleimhaut von Kindern unter 15 Monaten nach RSVInfektion eine erhöhte Anzahl von dendritischen Zellen, die mit einer Abnahme der
dendritischen Zellen im Blut einherging. Dies spricht für eine Rekrutierung von
inflammatorischen dendritischen Zellen in respiratorisches Gewebe, ausgelöst durch
eine Infektion (Gill et al, 2008; McWilliam et al, 1994 und 1996).
Auch wenn Tschernig mikroskopisch kein Langerin nachweisen konnte, kann man
davon ausgehen, dass die ruhenden dendritischen Zellen, die er bei gesunden
Probanden im Trachealepithel gefunden hat, Langerhanszellen sind. Demedts und
Kollegen (2005) fanden heraus, dass sich im Lungenepithel hauptsächlich CD1a+
dendritische Zellen befinden, die Langerin enthalten. Die dendritischen Zellen, die
nach der Atemwegsinfektion (z.B. mit RSV) in die Lunge einwandern, entsprechen
rekrutierten, inflammatorischen dendritischen Zellen.
49
Bei einer RSV-Erkrankung gibt es den direkten zytopathologischen Effekt des Virus
auf die Zellen mit Funktionsverlusten des Lungenepithels (Aherne et al, 1970) und
die indirekte Zerstörung des Epithels durch eine überschießende Immunreaktion
(Alwan et al, 1994; Cannon et al, 1988; Polack et al, 2002).
In Bezug auf unsere Ergebnisse, wo die Freisetzung viraler Partikel in den
langerhanszellähnlichen TGF-β-Zellen verringert war, kann das Vorhandensein von
Langerhanszellen nach dem ersten Lebensjahr zu einer geringeren Verbreitung der
Viren im Körper führen und zu einer gemäßigteren Immunreaktion. Dies führt zu
einer
milderen
Ausprägung
des
Krankheitsbildes.
Das
physiologische
Ungleichgewicht zwischen ruhenden Langerhanszellen und inflammatorischen
dendritischen Zellen im ersten Lebensjahr kann somit eine Erklärung für den
schweren Verlauf einer RSV-Infektion bei Kindern dieser Altersgruppe sein.
50
5 Zusammenfassung
RSV ist einer der häufigsten Erreger für Atemwegsinfektionen in der frühen
Kindheit. Besonders betroffen sind Kinder, die jünger als ein Jahr alt sind. Da es bis
jetzt noch keine kausale Therapie gibt, und viele Kinder an wiederholten RSVInfektionen leiden, ist der Umgang des Immunsystems mit RSV von besonderer
Bedeutung. Dendritische Zellen stehen dabei als stärkste antigenpräsentierende
Zellen im Mittelpunkt des Interesses.
In dieser Studie wurde die Infektion zweier Gruppen dendritischer Zellen, TGF-βZellen und IL-4-Zellen, miteinander verglichen. TGF-β-Zellen repräsentieren
langerhansähnliche Zellen und IL-4-Zellen sind monozytenähnliche Zellen. Für den
Nachweis einer RSV-Infektion benutzten wir verschiedene Methoden: Real-Time
PCR, Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie. Die Freisetzung viraler
Partikel wurde über die Messung des Virustiter im Überstand der dendritischen
Zellen bestimmt.
Durch die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung des P-Proteins als ein Nachweis
einer RSV-Infektion konnten wir zeigen, dass das P-Protein als runde Vakuole im
Zytoplasma der Zelle lag. Dabei war der Durchmesser in TGF-β-Zellen etwas größer
als in IL-4-Zellen. Auch der mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessene
Proteingehalt war zur gleichen Zeit in der Gruppe der TGF-β-Zellen mit 18% zu
14% leicht erhöht, nach 48 h enthielten aber die IL-4-Zellen mit 20% mehr RSVProteine als die TGF-β-Zellen mit 17%.
Die Bestimmung der Replikationsrate mittels Real-Time PCR ergab bei beiden
Zellgruppen nach 24 h noch eine identische Replikationsrate von 8x108 RSVKopien/µg RNA, nach 48 h sank diese Zahl aber bei den TGF-β-Zellen auf 3x108/µg
RNA ab, während sie bei den IL-4-Zellen auf 1x109/µg RNA anstieg.
Die Freisetzung viraler Partikel war zu diesem Zeitpunkt bei den TGF-β-Zellen mit
3x105 pfu im Gegensatz zu den IL-4-Zellen mit 4x107 pfu auf mehr als ein
hundertstel reduziert.
Diese Ergebnisse führen zu der Vermutung, dass der Produktionsfehler in der viralen
Morphogenese liegt. Welche Unterschiede im Aufbau oder Organisation der beiden
51
untersuchten Zelltypen für die unterschiedliche Viruspartikelbildung verantwortlich
sind, muss in weiteren Studien noch erforscht werden.
Von besonderer Bedeutung sind unsere Ergebnisse im Hinblick auf eine Studie, in
der bei Kindern unter einem Jahr in den Atemwegen keine Langerhanszellen
nachgewiesen werden konnten (Tschernig et al, 2001). In Bezug auf unsere
Ergebnisse, wo die Freisetzung viraler Partikel in den langerhanszellähnlichen TGFβ-Zellen verringert war, führt dies zu der Annahme, dass das physiologische
Ungleichgewicht zwischen ruhenden Langerhanszellen und inflammatorischen
dendritischen Zellen im ersten Lebensjahr von besonderer Bedeutung für den
schweren Krankheitsverlauf bei diesen Kindern ist.
52
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Danksagung
Mein Dank gilt insbesondere meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. U. Schauer
für seine engagierte und geduldige Unterstützung, von den ersten Anfängen bis zur
endgültigen Fertigstellung meiner Arbeit.
Den Mitarbeiterinnen des immunologischen Labors der Kinderklinik Bochum, Frau
Baumeister und Frau Michel, danke ich für die Einweisung in die angewandten
Methoden und ihre Hilfe bei den praktischen Tätigkeiten.
Herrn Dr. med. T. Rothoeft danke ich für die Bereitstellung der mikroskopischen
Bilder.
Besonders möchte ich mich bei meiner Familie bedanken, die mich während der
gesamten Zeit unterstützt hat.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Marita Horstkemper
Geburtsdatum
16.05.1983
Geburtsort
Hagen
Familienstand
ledig
Schulausbildung
August 1989 - Juli 1993
Grundschule Kückelhausen in Hagen
August 1993 - Juni 2002
Christian-Rohlfs-Gymnasium in Hagen
Studium
Oktober 2002 - November 2008
Medizinstudium an der Ruhr-UniversitätBochum
September 2004
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
(Physikum)
August 2007 - Juli 2008
Praktisches Jahr mit Wahlfach Pädiatrie im
Allgemeinen Krankenhaus Hagen
November 2008
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Beruflicher Werdegang
seit Januar 2009
Assistenzärztin in der Kinderklinik des
Allgemeinen Krankenhauses Hagen