07.01.2009 1 Cytokinese
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07.01.2009 U. Albrecht Cytokinese Cytokinese = Teilung des Cytoplasmas wird bei jeder Mitose gemacht. Ausnahmen: früher Drosophila Embryo, einige Säugerhepatocyten und Herzmuskel Zellen -> Zellen mit mehreren Nuclei können entstehen. 4 stufiger Prozess: 1) Initiation (Furche bildet sich aus, Myosin filamente lagern sich an zu Ring) 2) Kontraktion (Der unter Plasmamembran gemachte Ring kontrahiert kontinuierlich) 3) Membran Insertion (neben dem Ring werden Membrankomponenten deponiert -> nötig da die Oberfläche vergrössert wird). 4) Kompletierung (Fusion der Membranen schliesst den Raum zwischen Tochterzellen) U. Albrecht Aktin und Myosin II im Kontraktionsring generieren die Kraft für die Cytokinese Die Kontraktionskraft ist so gross dass eine Galsnadel gebogen werden kann. aktin Der Ring weist während der Kontration eine konstante Dicke auf -> totalvolumen an actin und Myosin II nimmt kontinuierlich ab. myosin II 1 07.01.2009 U. Albrecht Auflösung des kontraktilen Rings -> Dichtes Matrix Material bildet Deckel an jeder Tochterzelle. Dient als Orientierung für das Befestigen der Spindel in der nächsten Runde der Zellteilung. U. Albrecht Lokale Aktivierung von RhoA triggert das Zusammensetzen und Kontraktion vom Kontraktionsring. RhoA wird lokal am Spaltungsort der Zelle aktiviert in Abhängigkeit eines Guanine nucleotide exchange faktors. Dies führt dann zur Produktion von Aktinfilamenten und Myosin II Aktivierung. (Siehe Bild). 2 07.01.2009 U. Albrecht Die Mikrotubuli der mitotischen Spindel bestimmen den Ort der Zellteilung Wie wird Zelle zur richtigen Zeit und am richtigen Ort geteilt? 3 Modelle: Astrales Stimulationsmodell: U. Albrecht Teilung hier auch wenn Spindel nicht von gleicher Zellteilung stammen 3 07.01.2009 U. Albrecht Zentralspindelstimulationsmidell: zentrale Spindel generiert ein Signal um Teilungsfurche zu bilden. Rot: RhoA protein Grün: Cyk4 protein (bildet Komplexe an überlappenden + Enden von Mikrotubuli) -> hilft RhoA zu aktivieren am Zellkortex. Mutationen in diesen Proteinen führt dazu dass Cytokinese nicht stattfindet. Zellkortex Mikrotubuli Schnitt durch Ebene U. Albrecht Astrales Relaxationsmodell: Astrale Mikrotubuli Enden relaxieren die Aktin-Myosin Stränge -> Relaxation am geringsten zwischen den Polen -> stärkste Kontraktion. 4 07.01.2009 U. Albrecht Der Phragmoplast lenkt die Cytokinese in höheren Pflanzen Pflanzenzellen haben Zellwände und teilen die Zelle in einer inside to outside manier. Eine Zentrale Zellplatte wird gebildet die sich dann zu den Enden hin ausbreitet und so die Zelle teilt. Die Ausbildung der Zellplatte ist gelenkt durch den Phragmoplasten welcher Mikrotubuli von der mitotischen Spindel enthält. U. Albrecht Spezielle Cytokinese in höheren Pflanzen: 5 07.01.2009 U. Albrecht Membranumschlossene Organelle müssen während der Cytokinese auf die Tochterzellen verteilt werden. Die Mitose stellt sicher dass das genetische Material exakt aufgeteilt wird. Aber wie werden die anderen essentiellen Organelle aufgeteilt ? Mitochondrien und Chloroplasten könne nicht de novo synthetisiert werden. -> sind aber in einer Zelle in genügender Menge vorhanden, sodass sie der einen oder anderen Zellhälfte zugeteilt werden können. Auch ER kann nicht neu gemacht werden. Ist jedoch bei der Auflösung des Zellkerns an Reste davon gebunden. Bei der Reaggregation des Zellkerns werden dann auch automatisch Teile des ER auf die 2 neuen Kerne verteilt und wird später wieder vergrössert. Golgi Apparat wird in Mitose auch fragmentiert und die Fragmente assoziieren mit den Spindelpolen -> Aufteilung und Rekonstruktion des Golgi apparates in der Telophase. U. Albrecht Einige Zellen repositionieren ihre Spindel um sich assymmetrisch zu teilen Blau: DNA Grün: P-granules -> Germ cells -> always in one daughter cell only Cell Fate determination Different size-> repositioning der Spindel 6 07.01.2009 U. Albrecht Mitose kann geschehen ohne anschliessende Cytokinese Normalerweise findet nach Zellteilung die Cytoplasmatische Teilung statt. Ausnahmen: 1) früher Drosophila Embryo. Um Geschwindigketi zu erhöhen -> keine Teilung des Cytoplasmas in den ersten Runden -> Synctium entsteht (mehrere Kerne teilen sich das Cytoplasma). Erst später findet ein Zellularisierung statt. 2) Megakaryocyten -> Blutplättchen 3) Einige Hepatocyten und Herzmuskelzellen U. Albrecht 7 07.01.2009 U. Albrecht Die G1‐Phase ist ein Zustand stablier Cdk Inak7vität M‐Cdk s7muliert Cdc20‐APC ‐> wenn M‐Cdk inak7viert ‐> Cdc20‐APC ak7vität nimmt ab ‐> M‐Cdk Ak7vität nimm wieder zu. ⇒ wenn M‐Cdk konstant 7ef sein soll ‐> anderer Komplex notwendig um M‐Cdk in G1 7ef zu halten. =>Cdh1‐APC Inaktivierung von M-Cdk: 1) leitet Prozesse der späten Mitose ein 2) promotet Cytokinese 3) ermöglicht die Bildung von prereplikationskomplexen an DNA ori. 1. Extrazelluläre Kontrolle der Zellteilung, Zellwachstum U. Albrecht Einzelliger Organismus -> Teilung -> neues Individuum -> natürliche Selektion begünstigt die Zellen welche: 1) am schnellsten wachsen 2) schlechte Zeiten am besten überleben. -> Proliferation ist beeinflusst nur von Nährstoffangebot und Sex. Mehrzellige Organismen -> Selektion nicht auf Ebene jeder Einzelzelle sondern auf dem Zellverband -> Zellverband unterliegt strikten Kontrollen welche Proliferation verhindern. -> im adulten Organismus teilen sich Zellen nicht -> in Ruhephase -> Ausführen spezialisierter Funktionen. -> Nährstoffe normalerweise im Ueberfluss -> Zellen müssen gebremst werden nicht zu proliferieren, dagegen würden Bakterein und Hefen unter diesen Bedingungen prolifereiern. -> was ist Unterschied in der Regulation? Für mehrzellige Organismen Nahrung für Zellen alleine nicht genug für Zellteilung -> Zellen müssen positives Signal von anderen Zellen erhalten. -> Wachstumsfaktoren -> binden an Rezeptoren der Zelloberfläche -> intrazelluläre negative Signale werden übergangen. ⇒ Hefe: Zelleproliferiert ausser negatives Signal wird erhalten ⇒ Tierzelle: Zelle stopt ausser postives Signal wird erhalten. 8 07.01.2009 U. Albrecht 4 Fragen: 1) Wie ist Säugerzellzykluskontrollsystem 2) Wie ist Proliferation kontrolliert 3) Was sind die Extrazellulären Signale 4) Wie überstimmen diese Signale das intrazelluläre Blockiersystem? U. Albrecht Regulation des Säugerzellzyklus wird mit kultivierten Zelllinien studiert Säugerzellen teilen sich in Kultur nur etwa 50 mal, dann Zelltod -> senescence Allerdings: in Kulturen -> wenige Zellen entrinnen Zelltod -> teilen sich unbegrenzt => Zelllinie -> sehen aus wie normale Zellen aber Achtung: Nachteil: Abnormal -> mindestens 1 Mutation Vorteil: Unlimitiertes Zellmaterial -> standardisiert und genetisch homogen Wachstumsfaktoren stimulieren die Proliferation von Säugerzellen Säugerzellen -> Kulturmedium mit Nährstoffen -> wachsen nicht !! -> + Serum -> Wachstum ! Vergleiche: Hefe keine Nährstoffe -> Zellzyklusarrest Säugerzellen kein Serum -> Zellzyklus arrest -> G0 Was ist Serum ? -> Wachstumsfaktoren in geringer Konzentration (10-9 - 10-11 M) Einer der ersten aufgereinigten Wachstumsfaktoren = platelet-derived growth factor (PDGF) 9 07.01.2009 U. Albrecht Platelets sind kleine Zellen ohne Nukleus. Sie zirkulieren im Blutstrom und helfen die Blutgerinnung an geschädigtem Gewebe zu stimulieren. Dadurch wird übermässiges Bluten verhindert. Platelets sezernieren auch Faktoren die Heilung stimulieren. Im Bild ist ein aufgeschnittenes Platelet (Blutplättchen) gezeigt um die sekretorischen Vesikel zu zeigen. Einige dieser Vesikel enthalten den sogenannten platelet derived growth factor (PDGF). Serum Serum = Ueberstand nach Koagulation Plasma Plasma = Ueberstand ohne Koagulation Warum dieser Unterschied? Platelets sekretieren ihren Inhalt, wenn sie in den Blood Clot eingeschlossen werden -> PDGF gelangt ins Serum U. Albrecht Mitogene -> Zellteilung Wachstumsfaktoren -> Zellwachstum Survival Factors -> suprimieren Apoptose 10 07.01.2009 U. Albrecht Wachstumsfaktoren haben spezifische Rezeptoren Growth Factor Receptor Kombination von mehreren Faktoren wichtig für viele Zelltypen Wachstumsfaktoren in geringer Konzentration -> Isolation über Identifikation der DNA U. Albrecht Serum Deprivation verhindert Durchgang von G1 Checkpoint Zellkulturen -> beobachten mit time-lapse Video -> experimentelle Behandlung -> Effekt z.B. -> Serum weg für 1 Stunde -> dramatischer Effekt Videographischer Referenzpunkt: Mitose 3.5 h nach Mitose Serumentzug gehen in G0 + Serum mehr als 3.5 h nach Mitose Serumentzug Cycle geht weiter Zellen sind commited dauert 8 Stunden ⇒ G1 checkpoint ist 3.5 Stunden von Mitose weg! ⇒ Wachstumsfaktoren kritisch zwischen Mitose und G1-Checkpoint ! -> wenn Serum entfernt -> Protein Synthese geht runter weil Protein Synthese inhibitoren (Cycloheximide) in später G2 -> Zellen durch Mitose -> Stop in G1 11 07.01.2009 U. Albrecht 3.5 h Serumentzug S G2 M G1 Cycloheximide ⇒ G1-Checkpoint Maschinerie ist nötig für G1-S Transition aber nicht für Mitose U. Albrecht Benachbarte Zellen kompetitieren für Wachstumsfaktoren Zellproliferation muss reguliert sein weil damit: 1) Anzahl Zellen 2) räumliche Anordnung sichergestellt ist. Regulation abhängig von: 1) Zell-Zell Interaktionen 2) Kontakt zu extracellulärer Matrix z.B. Epithel -> Zellen sterben -> müssen ersetzt werden und in Platz passen. Nur Zellen die in Kontakt sind mit basal lamina proliferieren -> messen 1) Zelldichte 2) Kontakt zu basal lamina Meiste Experimente mit Fibroblasten -> nur bedingt übertragbar auf Organe. 12 07.01.2009 U. Albrecht Dissozierte Zellen -> kultivieren in Schale -> heften sich an -> wachsen zu konfluentem Monolayer -> dann Stop => zelldichteabhängige Inhibition der Zellteilung Wounding experiment: Kontakt Inhibition? U. Albrecht -> nicht nur Kontakt sondern Menge von Wachstumsfaktoren ist wichtig Zelldichte abhängige Inhibition -> Fähigkeit der Zelle lokale Wachstumsfaktorkonzentration zu ändern. z.B. PDGF -> 10-10M = ca. 1 Molekül in Kugel mit 3 µm Durchmesser Fibroblast hat etwa 105 PDGF Rezeptoren -> kann alles PDGF in der Umgebung von Kugel mit 150 µm Durchm. binden. ⇒ eine Zelle kann Umgebung von PDGF befreien -> Kompetition zwischen Zellen -> viele Zellen -> kein freies PDGF mehr -> Proliferationsstop. 13 07.01.2009 U. Albrecht Normale Tierzellen müssen verankert sein um Start zu passieren Kompetition für Wachstumsfaktoren nicht einziger Einfluss auf Proliferation -> Form der Zelle wichtig! Fibroblasten und Epithelzellen -> teilen sich nicht wenn in Suspension ⇒ Anchorage dependence of cell division Gut ausgebreitete Zellen -> grössere Oberfläche -> mehr Wachstumsfaktoren und Nahrung -> teilen sich besser Focal adhesion point genügt -> Intracelluläre actin filamente + extracelluläre matrix Moleküle ⇒ Proliferation ist gekoppelt an die Organisation des Zytoskelets. Lamin und Fibronektin -> können als Wachstumsfaktoren wirken. ⇒ Zelle in Zyklus -> M-Phase rund -> G1 flach -> attachement und detachement -> wichtig um neugenerierte Tochterzellen in den Zellverband einzubetten. U. Albrecht Das Studium von Krebszellen offenbahrt Gene wichtig für Zellzykluskontrolle Externe Einflüsse wie Wachstumsfaktoren und Zellform -> Wie übersetzt in molekulare Sprache? Effekte auf Zellkern und Proliferation Wachstumsfaktor Bindet an Rezeptoren Studium von Krebszellen die ein Gen mutiert haben oder mehrere ⇒ können proliferative Gene sein -> Assembly control System oder antiproliferative Gene -> Disassambly of control System Mutiertes Gen = Oncogen (gleiches Gen ohne Mutation = Proto-oncogen) Wenn mutiert = Tumor-suppressor Gene (z. B. Rb) 14 07.01.2009 U. Albrecht Zellzyklus Progression ist koordiniert mit Zellwachstum in Hefe In Hefe Nahrungsangebot und Zellgrösse gekoppelt an Zellteilung (siehe vorher) Wie kann Grösse gemessen werden? In Hefe möglicherweise über messen von G1 cyclin das parallel zum Wachstum synthetisiert wird. Hypothet. Cln3 Bindeprotein auf DNA konstant -> von gewisser Grösse an Cln3 frei -> Zellteilung. U. Albrecht Zellwachstum und Zellteilung kann unabhängig reguliert werden in Säuger Zellen Hefe: Verhältnis Cytoplasma/DNA starr Säuger: Verschiedene Zelltypen mit spezialisierter Funktion -> Verhältnis Cytoplasma/DNA variabel Wie wird dann in Säugerzellen Zellteilung Reguliert? ⇒ spezielle Wachstumsfaktoren die entweder Wachstum oder Replikation beeinflussen. z.B. Neuronen -> können sehr viel wachsen ohne sich zu teilen -> nerve growth factor (NGF) von zu enervierenden Zellen sezerniert -> Wachstum des Neurons in die Richtung der sezernierenden Zelle. Grösse eines Organs: Anzahl Zellen + Grösse der Zellen Reguliert durch Zellwachstum, Zellteilung und Zelltod (Apoptose) Moleküle die dies regulieren: Sekretierte Proteine, Zelloberflächen Strukturen, Extrazelluläre Matrix Eingeteilt in: 1) Mitogene -> Zellteilung 2) Wachstumsfaktoren -> Zellwachstum 3) Survival Factors -> suprimieren Apoptose 15 07.01.2009 U. Albrecht Zellen können Teilung verzögern durch Eintritt in Ruhephase Säugerzellen in Kultur -> kein Serum (Growth factors) -> machen Zyklus fertig bis G1, dann Stop -> G0 G0 -> Protein Synthese reduziert, nur noch ca. 20% Auch Nahrungsmangel führt zu Stop -> G0 Hefe -> G1 checkpoint -> Start Säugerzellen -> Nahrung im Ueberfluss -> Wachstumsfaktoren kritisch -> Eintritt in G0 -> Variabilität in Zellzyklus verschiedener Zelltypen z.B. Neuronen, Muskelzellen teilen sich nie Leberzellen ca. 1x im Jahr Epithelzellen, Darm 2x pro Tag Diese Angaben aber variabel -> abhängig von Umständen (z.B. Verletzungen) -> Variation im Zellzyklus in Säugerzellen zwischen M und G1 aber S-Phase bis Mitose sehr konstant (ca 12-24 h) ⇒ G1 checkpoint spezifische Kontrolle U. Albrecht Kontrolle der S‐Phasen Ini7a7on in Säugerzellen Das Rb Protein agiert als Bremse in Säuger G1 Zellen Rb = Re7noblastoma Protein Wurde im Studium des Augenkrebses in Kindern, Re7noblastoma, das erste mal beschrieben. Ist aber nicht nur im Auge wich7g. Wich7g in developing Re7na, in anderen Geweben back‐up Proteine für Rb. 16 07.01.2009 U. Albrecht Zellteilung: Mitogene stimulieren G1-Cdk und G1/S-Cdk Aktivitäten Krebsfördernde Gene = Onkogene z.B. Ras, Myc ⇒ Mutationen in diesen Genen ->Ueberproliferation Krebs entsteht nur dann, wenn auch Schutzmechanismus inaktiviert wird. d.h. mehrere Mutationen müssen akkumulieren z.B. in Ras + p53 U. Albrecht Zellzyklus Progression wird blockiert durch beschädigte DNA und p53: DNA damage checkpoints Einzeller ‐> Beschädigung ‐> Stop ‐> Reparatur ‐> Zyklus wird fortgesetzt ‐> Ueberleben Vielzeller ‐> Beschädigung ‐> Stop ‐> wenn keine schnelle Reparatur ‐> programmierter Zelltod um andere Zellen im Zellverbund zu schützen. Ataxia Telangiectasia = Defekt in Protein kinase die p53 ak7viert ‐> Pa7enten sensi7v zu Strahlung ‐> erhöhtes Krebsrisiko 17 07.01.2009 Viele menschliche Zellen haben eine eingebaute Limite für die Anzahl Teilungen replikative Zellaterung Telomere U. Albrecht Wahrscheinlichkeit in G0 einzutreten wächst mit der Anzahl von Zellteilungen einer Zelle: Zellalterung - Senescence Zellproliferation: 1) Umgebung 2) Langzeitgeschichte der Zelle Dies gilt für somatische Zellen, Stammzellen sind davon ausgenommen z.B. Fibroblasten (Mensch) -> embryonal -> 50 Teilungen 40 - Jährig -> 40 Teilungen 80 - Jährig -> 30 Teilungen ⇒ Teilungsfähigkeit korreliert mit Alter. Verschiedene Erklärungen für Zellalterung: 1) 2) 3) Akkumulation von Mutationen (Replikation unpräzise) Mechanismus der vor Krebs schützen soll da alte Zellen sterben Telomere am Ende der Chromosomen werden verkürzt durch jede Zellteilung Nur in Stammzellen Telomerase welche die Verkürzung repariert. Alterung der Zelle jedoch nicht strikt vorprogrammiert, da aus derselben Population einige sich mehr teilen können als andere. 18 07.01.2009 U. Albrecht Aufheben der replikativen Zellalterung durch Expression von Telomerase Menschliche Zellen haben ein eingebaute Limitation für Teilung Fibroblasten teilen sich 25-50 mal -> dann nicht replikativer Zustand = replikative Senescence Telomere -> werden bei jeder Replikation verkürzt -> Telomerase behebt Verkürzung Aber im Menschen Telomerase in meisten Zellen inaktiviert = Schutz vor unendlicher Replikation (Krebszellen haben Telomerase re-aktiviert) Abnormale Proliferationssignale führen zu Zellkyklus Stop oder Apoptose, ausser in Krebszellen Krebsfördernde Gene = Onkogene z.B. Ras, Myc ⇒ Mutationen in diesen Genen ->Ueberproliferation Krebs entsteht nur dann, wenn auch Schutzmechanismus inaktiviert wird. d.h. mehrere Mutationen müssen akkumulieren z.B. in Ras + p53 Myc + Arf 19 07.01.2009 Wachstum des Organismus und der Organe hängen von Zellwachstum ab U. Albrecht Beispiel für Signaltransduktion von äusserem Signal zum Zellkern. 1. aktivierte Kinase 2. aktivierte Kinase early response und delayed reesponse genes. U. Albrecht 20 07.01.2009 U. Albrecht U. Albrecht Structure of p53 oligomeriza7on domain (Okorokov et al., 2006) 21 07.01.2009 U. Albrecht (Okorokov et al., 2006) U. Albrecht (Okorokov et al., 2006) 22 07.01.2009 U. Albrecht Kontrolle der G1‐Phase druch Cdk Ak7vität in Hefe (Cerevisiae) Akkumula7on von G1 cyclin abhängig von extracellulären Signalen (Umgebung) stabile Cdk (kinase) Inak7vierung durch Sic1 und Hct1‐APC 23
