Versuch 1_Schumann
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1. Isolierung von E. coli-Stämmen mit selektionierbaren Markergenen Versuchsziele: 1. Markierung von Bakterienstämmen mit einer Antibiotikum-Resistenz 2. Konzept kryptischer Gene Warum isoliert man Bakterienstämme mit selektiven Markern ? 1. Genetische Markierung von WildtypStämmen 2. Kreuzungsexperimente Mutagenese - spontane Mutagenese - induzierte Mutagenese Spontane Mutationen entstehen durch: - Replikationsfehler - tautomere Umlagerungen der Basen - oxidative Schädigungen der Basen - spontane Desaminierung von 5-Methylcytosin zu Thymin - Error-Prone Repair Mispairing Because of the Rare Tautomeric Forms Induzierte Mutationen können ausgelöst werden durch: - energiereiche Strahlung, z. B. UV - bestimmte Chemikalien, z. B. Methylmethansulfonat (MMS), Nitrosoguanidin(NG) - Mutatorstämmen, z. B. E. coli mutD Streptomycin Produzent: Streptomyces griseus Aminoglycosid-Antibiotikum hemmt die Translation Target: ribosomales Protein S12 Gen: rpsL; 73 min Mutationsfrequenz pro cfu: 1.5x10-8 bis 4.4x10-11 Plasmid-codierte Resistenz: Modifikation durch Adenylierung oder Phosphorylierung Nalidixinsäure synthetisches Produkt hemmt DNA-Replikation Target: DNA-Gyrase Gene: gyrA, 48 min gyrB, 58 min Mutanten in gyrB zeigen Wachstum bis zu 4 µg/ml Mutanten in gyrA zeigen Wachstum bei >20 µg/ml Mutationsfrequenz pro cfu: 1.1x10-9 bis 3.0x10-9 Rifampicin Produzent: Nocardia mediterranei hemmt die Transkription Target: β - U ntereinheit der RNA-Polymerase Gen: rpoB, 90 min Mutationsfrequenz pro cfu: 1.0x10-7 bis 2.3x10-9 Untereinheiten der bakteriellen RNAPolymerase Core Enzym: α 2 β β ' ω Holoenzym: α 2 β β ' ω σ Funktion der einzelnen Untereinheiten α 2 : - α NTD: Interaktion mit β u nd β ' - α CTD: Interaktion mit UP-Element oder Transkriptions-Aktivator β: - bindet rNTPs - Katalyse β ' : - bindet unspezifisch an DNA ω: - Funktion beim Zusammenbau σ : - erkennt Promotor Initiation der Transkription 1. 2. 3. 4. 5. unspezifische Bindung an die DNA (β ' ) Translokation Promotor-Erkennung (σ ) Bildung des geschlossenen Komplexes Bildung des offenen Komplexes 6. abortive Transkription 7. Promotor-Clearance (Rifampicin) Kryptische Gene: 1. Produzieren in der Regel kein nachweisbares Protein oder (selten) ein nicht-funktionelles Protein 2. Benötigen eine Mutation zur Aktivierung Valin-'Resistenz' Valinsynthese in E. coli Pyruvat Acetohydroxysäure- α - A cetolactat α, β Dihydroxyisovaleriansäure α - K etoisovalerinsäure L-Valin α - A cetohydroxybutyrat Endprodukt-Hemmung Synthase = AHAS α - K etobutyrat L-Isoleucin AHAS-Gene bei E. coli Gene ilvBN Eigenschaften konstitutiv; Val-sensitiv Bezeichnung AHAS I ilvGM kryptisch; Val-resistent AHAS II ilvIH konstitutiv; Val-sensitiv AHAS III ilvJ kryptisch; Val-resistent AHAS IV ilvF kryptisch; Val-resistent AHAS V _____________________________________________ ilvGM: α - U ntereinheit kryptisch: 300 Aminosäuren α - U ntereinheit dekryptifiziert: 521 AS How to detect degradation of certain sugars by enteric bacteria ? Streak bacteria on McConkey agar plates containing the appropriate sugar If the cells cannot degrade the sugar, they will form white colonies If cells can degrade the sugar, they will form red colonies Why? During degradation acid is formed which is detected by pH indicators within the plates Naturally Occuring β - Glucosides Can E. coli cells degrade salicin ? 1. Prepare McConkey plates with salicin 2. Plate E. coli cells and incubate overnight 3. Record the colour of the colonies 4. Keep the plates for a few days on the bench and inspect every morning 5. What will happen after a few days ? Dekryptifizierung des bgl-Operons bgl = beta-glucoside Escherichia coli kann die aromatischen ß-Glucoside (z.B. Salicin) nicht verwerten MacConkey Medium: Vollmedium mit pH Indikator Zusatz eines best. Zuckers (z.B. Lactose) Verwertung des Zuckers: rote Kolonien kein Abbau des Zuckers: weiße Kolonien MacConkey + Salicin: 2 - 3 Tage über Nacht Spontanmutationen ermöglichen E. coli den Abbau von Salicin → rote Papillen Bakterienkolonien mit roten Papillen Bakterienkolonien mit roten Papillen H-NS: histone-like nucleoidstructuring protein • eine der Hauptkomponenten des bakteriellen Chromatins • beeinflusst Struktur der DNA und die Genexpression • inhibiert die Expression bestimmter Gene in der exp.Phase H-NS Bindestellen H-NS bgl keine Transkription des bgl Operons Dekryptifizierung des bgl-Operons durch Insertionvon IS-Elementen IS-Element bgl Insertion von IS1 und IS5 im Bereich der H-NS Bindestelle (bglR) IS-Elemente: Insertionssequenzen bewegliche genetische Elemente 800 - 2000 bp inverted repeats an den Enden codieren für Transposase Experimentelle Durchführung: Selektion Resistenzen ÜNK auf Selektivplatten ausplattieren Kolonien zählen Mutationsrate berechnen; auf Ausgangs-cfu beziehen Nachweis Salicinverwertung 50-100 Kolonien auf McConkey + Salicin Platten auf dem Labortisch stehen lassen Anzahl der roten Papillen pro Kolonie auszählen
