Versuch 1_Schumann

1. Isolierung von E. coli-Stämmen
mit selektionierbaren
Markergenen
Versuchsziele:
1. Markierung von Bakterienstämmen mit
einer Antibiotikum-Resistenz
2. Konzept kryptischer Gene
Warum isoliert man Bakterienstämme
mit selektiven Markern ?
1. Genetische Markierung von WildtypStämmen
2. Kreuzungsexperimente
Mutagenese
- spontane Mutagenese
- induzierte Mutagenese
Spontane Mutationen entstehen
durch:
- Replikationsfehler
- tautomere Umlagerungen der Basen
- oxidative Schädigungen der Basen
- spontane Desaminierung von 5-Methylcytosin
zu Thymin
- Error-Prone Repair
Mispairing Because of the Rare
Tautomeric Forms
Induzierte Mutationen können
ausgelöst werden durch:
- energiereiche Strahlung, z. B. UV
- bestimmte Chemikalien, z. B.
Methylmethansulfonat (MMS), Nitrosoguanidin(NG)
- Mutatorstämmen, z. B. E. coli mutD
Streptomycin
Produzent: Streptomyces
griseus
Aminoglycosid-Antibiotikum
hemmt die Translation
Target: ribosomales Protein S12
Gen: rpsL; 73 min
Mutationsfrequenz pro cfu:
1.5x10-8 bis 4.4x10-11
Plasmid-codierte Resistenz: Modifikation durch
Adenylierung oder Phosphorylierung
Nalidixinsäure
synthetisches Produkt
hemmt DNA-Replikation
Target: DNA-Gyrase
Gene: gyrA, 48 min
gyrB, 58 min
Mutanten in gyrB zeigen Wachstum bis zu 4 µg/ml
Mutanten in gyrA zeigen Wachstum bei >20 µg/ml
Mutationsfrequenz pro cfu: 1.1x10-9 bis 3.0x10-9
Rifampicin
Produzent: Nocardia mediterranei
hemmt die Transkription
Target: β - U ntereinheit der RNA-Polymerase
Gen: rpoB, 90 min
Mutationsfrequenz pro cfu: 1.0x10-7 bis 2.3x10-9
Untereinheiten der bakteriellen RNAPolymerase
Core Enzym: α 2 β β ' ω
Holoenzym: α 2 β β ' ω σ
Funktion der einzelnen Untereinheiten
α 2 : - α NTD: Interaktion mit β u nd β '
- α CTD: Interaktion mit UP-Element oder
Transkriptions-Aktivator
β:
- bindet rNTPs
- Katalyse
β ' : - bindet unspezifisch an DNA
ω: - Funktion beim Zusammenbau
σ : - erkennt Promotor
Initiation der Transkription
1.
2.
3.
4.
5.
unspezifische Bindung an die DNA (β ' )
Translokation
Promotor-Erkennung (σ )
Bildung des geschlossenen Komplexes
Bildung des offenen Komplexes
6. abortive Transkription
7. Promotor-Clearance (Rifampicin)
Kryptische Gene:
1. Produzieren in der Regel kein nachweisbares
Protein oder (selten) ein nicht-funktionelles
Protein
2. Benötigen eine Mutation zur Aktivierung
Valin-'Resistenz'
Valinsynthese in E. coli
Pyruvat
Acetohydroxysäure-
α - A cetolactat
α, β Dihydroxyisovaleriansäure
α - K etoisovalerinsäure
L-Valin
α - A cetohydroxybutyrat
Endprodukt-Hemmung
Synthase = AHAS
α - K etobutyrat
L-Isoleucin
AHAS-Gene bei E. coli
Gene
ilvBN
Eigenschaften
konstitutiv; Val-sensitiv
Bezeichnung
AHAS I
ilvGM
kryptisch; Val-resistent
AHAS II
ilvIH
konstitutiv; Val-sensitiv
AHAS III
ilvJ
kryptisch; Val-resistent
AHAS IV
ilvF
kryptisch; Val-resistent
AHAS V
_____________________________________________
ilvGM: α - U ntereinheit kryptisch: 300 Aminosäuren
α - U ntereinheit dekryptifiziert: 521 AS
How to detect degradation of certain
sugars by enteric bacteria ?
Streak bacteria on McConkey agar plates
containing the appropriate sugar
If the cells cannot degrade the sugar, they will
form white colonies
If cells can degrade the sugar, they will form
red colonies
Why? During degradation acid is formed which
is detected by pH indicators within the plates
Naturally Occuring β - Glucosides
Can E. coli cells degrade salicin ?
1. Prepare McConkey plates with salicin
2. Plate E. coli cells and incubate overnight
3. Record the colour of the colonies
4. Keep the plates for a few days on the bench
and inspect every morning
5. What will happen after a few days ?
Dekryptifizierung des bgl-Operons
bgl = beta-glucoside
Escherichia coli kann die aromatischen ß-Glucoside (z.B. Salicin)
nicht verwerten
MacConkey Medium: Vollmedium mit pH Indikator
Zusatz eines best. Zuckers (z.B. Lactose)
Verwertung des Zuckers: rote Kolonien
kein Abbau des Zuckers: weiße Kolonien
MacConkey + Salicin:
2 - 3 Tage
über Nacht
Spontanmutationen ermöglichen E. coli den Abbau von
Salicin → rote Papillen
Bakterienkolonien mit roten Papillen
Bakterienkolonien mit roten Papillen
H-NS: histone-like nucleoidstructuring protein
• eine der Hauptkomponenten des bakteriellen Chromatins
• beeinflusst Struktur der DNA und die Genexpression
• inhibiert die Expression bestimmter Gene in der exp.Phase
H-NS Bindestellen
H-NS
bgl
keine Transkription des bgl Operons
Dekryptifizierung des bgl-Operons
durch Insertionvon IS-Elementen
IS-Element
bgl
Insertion von IS1 und IS5 im Bereich der H-NS Bindestelle
(bglR)
IS-Elemente:  Insertionssequenzen
 bewegliche genetische Elemente
 800 - 2000 bp
 inverted repeats an den Enden
 codieren für Transposase
Experimentelle Durchführung:
Selektion Resistenzen
 ÜNK
 auf Selektivplatten ausplattieren
 Kolonien zählen
 Mutationsrate berechnen; auf Ausgangs-cfu
beziehen
Nachweis Salicinverwertung
 50-100 Kolonien auf McConkey + Salicin
 Platten auf dem Labortisch stehen lassen
 Anzahl der roten Papillen pro Kolonie auszählen