Androgenresistenz - Funktion und Phänotyp In
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. med Egbert Herting Androgenresistenz - Funktion und Phänotyp In-vitro Charakterisierung definierter Mutationen des Androgenrezeptors Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck - Aus der Medizinischen Fakultät - vorgelegt von Julia Katharina Gesing aus Achim Lübeck 2010 1. Berichterstatter: Prof. Dr. med Olaf Hiort 2. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Tobias Restle Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2010 Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 25.05.2010 gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach - Dekan der Medizinischen Fakultät - Inhaltsverzeichnis ......................................................................................... i Tabellenverzeichnis und Abbildungsverzeichnis ......................................................iv Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ v I Einleitung ................................................................................................. 1 1. Physiologie der männlichen Geschlechtsentwicklung ................................... 1 2. Androgenresistenz........................................................................................ 4 3. 4. II 2.1 Komplette Androgenresistenz .............................................................. 5 2.2 Partielle Androgenresistenz ................................................................. 6 Der Androgenrezeptor .................................................................................. 7 3.1 Aufbau des Androgenrezeptorgens...................................................... 7 3.2 Molekulare Wirkungsweise des AR...................................................... 8 3.3 Funktionelle Domänen des AR ............................................................ 9 3.3.1 Die DNA-Bindungsdomäne .................................................... 10 3.3.2 Die Liganden-Bindungsdomäne ............................................. 10 3.3.3 Die N-terminale Domäne des AR ........................................... 11 3.4 Die N/C-terminale Interaktion ............................................................. 13 3.5 Mutationen des AR ............................................................................ 14 Zielsetzung und Fragestellungen ................................................................ 15 4.1 Vorstellung der zu untersuchenden Mutationen ................................. 15 4.2 Fragestellungen ................................................................................. 17 Material und Methoden......................................................................... 20 1. Materialien .................................................................................................. 20 1.1 2. Mammalia-Zellen ............................................................................... 20 1.1.1 Chinesische-Hamsterovar-Zellen ........................................... 20 1.1.2 HeLa-Zellen ........................................................................... 20 1.2 Bakterienzellen .................................................................................. 20 1.3 Plasmide ........................................................................................... 21 1.3.1 Der Androgenrezeptor Expressionsvektor pSVAR0 ............... 21 1.3.2 Reportergene......................................................................... 21 1.3.3 Renilla-Luziferase .................................................................. 23 1.3.4 Two-Hybrid-Plasmide............................................................. 24 1.3.5 Kofaktoren des Androgenrezeptors........................................ 25 1.3.6 Andere Plasmide ................................................................... 25 Methoden ................................................................................................... 26 2.1 Bakterienkultur .................................................................................. 26 2.1.1 Agarplatten für die Anzucht von Bakterienkulturen................. 26 i 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.1.2 Bakterienflüssigkulturen......................................................... 26 2.1.3 Glyzerolstocks zur Lagerung der Bakterienstämme ............... 26 2.1.4 Herstellung von DH5αF’ kompetenten E. coli......................... 27 2.1.5 DNA-Minipräparation ............................................................. 27 2.1.6 Herstellung Endotoxin-freier Plasmid-DNA ............................ 28 2.1.7 Photometrische Bestimmung der DNA................................... 28 Sequenzierung der Plasmid-DNA ...................................................... 28 2.2.1 Sequenzierung nach der Didesoxymethode........................... 28 2.2.2 Fällung der DNA .................................................................... 29 2.2.3 Analyse der Sequenz............................................................. 29 Klonierung der Plasmid-Vektoren ...................................................... 30 2.3.1 PCR-Mutagenese .................................................................. 30 2.3.2 Restriktion und Auftrennung im Agarose-Gel ......................... 30 2.3.3 Ligation .................................................................................. 31 2.3.4 Transformation in DH5αF’ kompetente E. coli........................ 31 Klonierungsstrategien ........................................................................ 32 2.4.1 pSVAR Konstrukte ................................................................. 32 2.4.2 AR-NTD-Konstrukte ............................................................... 33 2.4.3 AR-LBD-Konstrukte ............................................................... 34 Zellkultur für CHO- und HeLa-Zellen.................................................. 34 2.5.1 Medien für die Zellkultur......................................................... 34 2.5.2 Herstellung von steroidfreiem fetalen Kälberserum................ 34 2.5.3 Auftauen und Anziehen der Säugerzellen .............................. 35 2.5.4 Trypsinieren und Zählen der Säugerzellen............................. 35 2.5.5 Einfrieren der Säugerzellen.................................................... 35 Transfektionen................................................................................... 36 2.6.1 Das Prinzip der transienten Transfektion ............................... 36 2.6.2 Bestimmung der Transaktivität des Androgenrezeptors ......... 36 2.6.3 Transfektion und Detektion der Luziferaseaktivität ................. 37 2.6.4 Bestimmung der N/C-terminalen Interaktion .......................... 38 2.6.5 Bestimmung der Kofaktorinteraktion der LBD ........................ 39 Western Blot...................................................................................... 40 2.7.1 Herstellung der Proteinlysate ................................................. 40 2.7.2 Normalisierung der Lysatmengen .......................................... 41 2.7.3 Acrylamid-Gel-Elektrophorese und Western Blot ................... 41 2.7.4 Immundetektion ..................................................................... 42 Konzentrations-Wirkungs-Kurven....................................................... 43 ii III Ergebnisse ........................................................................................... 44 1. Sequenzierung der Plasmid-DNA ............................................................... 44 2. LBD-Mutationen.......................................................................................... 44 3. 2.1 Transaktivität des AR am (ARE)2-TATA-Promotor ............................. 44 2.2 N/C-terminale Interaktion................................................................... 47 2.3 Interaktion mit Kofaktoren.................................................................. 50 2.4 N/C-Abhängigkeit verschiedener Promotoren.................................... 53 NTD-Mutationen ......................................................................................... 58 3.1 N/C-terminale Interaktion bei NTD-Mutationen................................... 58 3.2 Transaktivität der N-terminalen Mutationen am Pem-Promotor .......... 60 IV Diskussion............................................................................................ 62 V Zusammenfassung............................................................................... 76 VI Literaturverzeichnis............................................................................. 77 VII Anhang ................................................................................................. 86 VIII Danksagung ....................................................................................... 100 IX Lebenslauf und Publikationen .......................................................... 101 iii Tabellenverzeichnis Tbl. 1 Klassifikation des AIS nach Sinnecker 1997............................................... 5 Tbl. 2 SOB-Medium............................................................................................ 27 Tbl. 3 Acrylamid-Gele für SDS-PAGE ................................................................ 41 Tbl. 4 Primärantikörper....................................................................................... 43 Tbl. 5 Sekundärantikörper .................................................................................. 43 Tbl. 6 T-Test zum Beweis der Signifikanz der Abweichung der N/C-Interaktion zwischen N-terminalen Mutationen und WT ............................................. 59 Tbl. 7 Tabellarische Darstellung der Ergebnisse der LBD-Mutationen................ 71 Abbildungsverzeichnis Abb. 1 Schematische Darstellung der embryonalen Geschlechtsentwicklung........ 3 Abb. 2 Schemazeichnung zur klinischen Einteilung des AIS.................................. 5 Abb. 3 Gen-Lokus, Gen-Aufbau, cDNA und Proteinstruktur des AR ...................... 7 Abb. 4 Schema des molekularen Wirkmechanismus des AR................................. 8 Abb. 5 Kristallstruktur der AR-DBD gebunden an ein ARE .................................... 9 Abb. 6 Dreidimensionale Struktur der AR-LBD .................................................... 11 Abb. 7 Funktionelle Untereinheiten des AR-Proteins ........................................... 12 Abb. 8 Verteilung der acht zu untersuchenden Mutationen im AR-Protein ........... 16 Abb. 9 Überblick über die Promotorregion der verwendeten Reportergene ......... 23 Abb. 10 Schematische Darstellung der Basen-Detektion im Kapillarsequenzierer 29 Abb. 11 Restriktion und Ligation ............................................................................ 31 Abb. 12 Prinzip der Transformation und Amplifikation in Bakterien........................ 32 Abb. 13 Luziferase-Reaktionen ............................................................................. 38 Abb. 14 Aufbau der Gene der Two-Hybrid-Fusionsproteine................................... 39 Abb. 15 Prinzip der Immundetektion ...................................................................... 42 Abb. 16 Sequenzanalyse des pSVAR WT und pSVAR L712F............................... 44 Abb. 17 Transaktivität des AR am (ARE)2-TATA-Promotor.................................... 46 Abb. 18 Two-Hybrid-Assay zur Detektion der N/C-terminalen Interaktion .............. 48 Abb. 19 Interaktion der AR LBD mit SRC1e .......................................................... 51 Abb. 20 Interaktion der AR LBD mit BAG1L .......................................................... 52 Abb. 21 Transaktivität des AR an verschiedenen Promotoren ............................... 55 Abb. 22 N/C-terminale Interaktion der NTD-Mutationen......................................... 58 Abb. 23 N/C-Interaktion der NTD-Mutationen mit 23FQNAA27-Motiv....................... 60 Abb. 24 Transaktivität des AR mit NTD-Mutationen am Pem-Promotor ................. 61 iv Abkürzungsverzeichnis AIS Androgenresistenz-Syndrom (Androgen Insensitivity Syndrome) AMH Anti-Müller-Hormon Amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfat AR Androgenrezeptor ARE Androgen-responsives Element AS Aminosäure AV Arbeitsverdünnung bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin (Bovine serum albumine) bzw. Beziehungsweise CAIS Komplette Androgenresistenz (Complete AIS) CI Konfidenzintervall (Confidence Interval) CHO-Zellen Chinesische Hamsterovar-Zellen CMV Cytomegalie-Virus DBD DNA-Bindungsdomäne DCC-FCS Steroidfreies fetales Kälberserum (dextran-coated charcoal-FCS) ddNTP Didesoxynukleosidtriphosphat dest. Destilliert DHT Dihydrotestosteron DMEM Dulbecco’s modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol EC50 Mittlere effektive Konzentration EtOH Ethanol f.c. Endkonzentration (Final concentration) FCS Fetales Kälberserum v FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer h Stunde (Hour) hCG Humanes Choriongonadotropin HeLa Henrietta Lacks HRE Hormon-responsives Element HRP Meerrettich Peroxidase (Horseradish Peroxidase) HSP Hitzeschockprotein IgG Immunglobulin G Kan Kanamycin kb Kilobasen Kd Dissoziationskonstante LB Luria-Bertani LBD Liganden-Bindungsdomäne LH Luteinisierendes Hormon m Milli M Molar MAIS Minimale Androgenresistenz (Minimal AIS) min Minute mRNA Messenger Ribonukleinsäure NLS Kernlokalisierungssequenz (Nuclear localization sequence) NTD N-terminale Domäne OD Optische Dichte p Pico pAD-NTD Two-Hybrid-Plasmid, das für ein Fusionsprotein aus der Aktivierungsdomäne (AD) des Maus NF-ΚB Gens und der N-terminalen Domäne (NTD) des Androgenrezeptors kodiert PAIS Partielle Androgenresistenz (Partial AIS) pBD-LBD Two-Hybrid-Plasmid, das für ein Fusionsprotein aus der DNABindungsdomäne (BD) des Hefeproteins GAL4 und der Ligandenbindungsdomäne (LBD) des Androgenrezeptors kodiert PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (Phosphate Buffered Saline) vi PCR Polymerase-Ketten-Reaktion (Polymerase Chain Reaction) pSVAR Expressionsvektor des Androgenrezeptors rpm Umdrehungen pro Minute (Rounds per minute) s Sekunde SD Standardabweichung (Standard Deviation) SDS Natriumdodecylsulfat (Sodium Dodecyl Sulfate) SOB-Medium optimales Nährmedium (Super Optimal Broth Medium) Tau Transikriptions-Aktivierungs-Einheit (Transcription Activation Unit) TBE-Puffer Tris-Borat-EDTA-Puffer TEMED Tetramethylethylendiamin TE-Puffer Tris-EDTA-Puffer TRIS Trishydroxymethylaminomethan U Umdrehungen u.a. Und andere V Volt WT Wildtyp vii Einleitung I I Einleitung Die Geschlechtsentwicklung ist ein komplexer Vorgang der Embryogenese, in dessen Regulation eine Vielzahl von Genen, Hormonen und zugehörigen Hormonrezeptoren eingreifen. Ausgehend von einem intersexuellen Stadium entwickelt sich ein Embryo zu einem Mädchen oder einem Jungen. Der Ausfall einzelner, hieran beteiligter Komponenten kann in einer Störung der Geschlechtsentwicklung resultieren. Die männlichen Sexualhormone entfalten ihre biologische Wirkung über den Androgenrezeptor. Liegt eine Funktionseinschränkung dieses Rezeptors vor, kommt es bei männlichen Embryos zu einer verminderten bis fehlenden Virilisierung. Diese Störung der Geschlechtsentwicklung wird als Androgenresistenz oder Androgeninsensitivitätssyndrom bezeichnet. In der Literatur sind mehr als 500 verschiedene Mutationen des Androgenrezeptors bekannt, die den Rezeptor in seiner Funktion einschränken. Es wird zwischen der kompletten Androgenresistenz mit vollständigem Funktionsverlust des Androgenrezeptors, der partiellen Androgenresistenz mit verminderter Rezeptorfunktion und einer minimalen Einschränkung unterschieden. Die phänotypische Ausprägung, vor allem der partiellen Resistenz, ist individuell sehr variabel. So reicht das Spektrum bei Vorliegen derselben Mutation, L712F, innerhalb einer Familie von einer leicht verminderten Virilisierung mit Mikropenis bei einem Sohn bis zu einem intersexuellen Genital bei einem zweiten Sohn (Holterhus et al., 2000). In dieser Arbeit wurden definierte Mutationen von betroffenen Patienten in-vitro funktionell untersucht. Durch die gewonnenen Ergebnisse soll ein besseres Verständnis in die Pathophysiologie der Androgenresistenz ermöglicht werden, insbesondere im Hinblick auf Genotyp-Phänotyp-Korrelation und die prognostische Einschätzung von Therapiemöglichkeiten. 1. Physiologie der männlichen Geschlechtsentwicklung Die Geschlechtsentwicklung des Menschen läuft in verschiedenen Phasen ab. Es wird zwischen dem genetischen, dem gonadalen und dem phänotypischen Geschlecht unterschieden. Das genetische Geschlecht wird über den Chromosomensatz der befruchteten Eizelle bestimmt. Dabei ist der weibliche Chromosomensatz typischerweise 46,XX und der männliche 46,XY. Unterschiede in der Entwicklung zwischen männlichen und weiblichen Keimzellen sind schon am 2. Tag nach der Befruchtung festzustellen. So zeigen männliche Embryos eine höhere Zellzahl und höhere metabolische Aktivität als vergleichbare weibliche Embryos (Mittwoch et al., 2000). Zunächst bilden sich bei beiden Geschlechtern aus dem Mesoderm undifferenzierte bipotente Gonadenanlagen (siehe Abb. 1). Dieser Vorgang wird durch die Expression verschiedener Gene (u.a. WT1 (Wilms- 1 Einleitung I Tumor-1 Gen), SF1 (steroidogenic-factor-1 Gen), später auch GATA4 (GATA-bindingprotein-4 Gen), LHX9 (LIM-Homeobox-9 Gen), LIM1 (LIM-Homeobox-1 Gen) gesteuert (Miyamoto et al., 2008; Shimamura et al., 1997; Wilson und Davies, 2007). Unabhängig vom Geschlecht entwickeln sich aus dem Urnierengang die Wolff’schen Gänge und aus der Urogenitalleiste die Müller’schen Gänge (Überblick in Hannema et al., 2007). Die Entwicklung der bipotenten Gonadenanlage zu den männlichen Keimdrüsen, den Hoden, ist der entscheidende Schritt der Geschlechtsdeterminierung (siehe Abb. 1). Die Ausdifferenzierung der Hoden mit Hodensträngen, Keim-, Leydig- und Sertoli-Zellen wird durch die Expression vor allem Y-chromosomaler Gene gesteuert. Eine Vielzahl dieser Gene, die für verschiedene Transkriptionsfaktoren kodieren, konnte bereits identifiziert werden (Überblick in Wilson und Davies, 2007). Das SRY (sex-determining region of the Y-Chromosome) -Gen wurde 1990 als lange gesuchter Testis-determinierender Faktor von Berta et al. identifiziert. SRY gehört zur Familie der High-Mobility-Group (HMG)-Box Proteine. Als Transkriptionsfaktor steuert SRY die Ausdifferenzierung der Hoden durch die Expression weiterer Gene. Hier ist vor allem SOX9 (SRY-related HMG box-9) zu nennen, welches zeitlich etwas nach SRY exprimiert wird und eine ähnliche Funktion wie SRY hat (Kanai et al., 2005; Harley et al., 2003). Das Gen DAX1 (Dosage-Reversal, Adrenal-Hypoplasia-Congenita, X-Chromosom) liegt auf dem X-Chromosom und ist im frühen Stadium für die Entwicklung der Sertoli-Zellen entscheidend. Es greift in die Proliferation und Differenzierung der Leydig-Zellen ein. In höherer Dosis wirkt es hingegen supprimierend auf die Expression von SRY und SOX9 (Meeks et al., 2003; Park und Jameson, 2005). Die Zellzahl, die bei männlichen Embryos durch den Einfluss des SRY-Gens größer ist, scheint für die Ausdifferenzierung der Hoden ebenfalls eine entscheidende Rolle zu spielen (Mittwoch et al. 2000). Die weitere Ausbildung des männlichen Geschlechts wird durch unterschiedliche Hormone gesteuert (siehe Abb. 1). Ab der 6. Entwicklungswoche beginnen die Sertoli-Zellen der Hoden mit der Hormonproduktion des Anti-Müller-Hormons (AMH) (Überblick in Wilson und Davies, 2007). Park et al. zeigte, dass die oben erwähnten Gene SOX9 und SF1 die Expression von AMH verstärken (Park et al., 2005). AMH bewirkt im Embryo eine Rückbildung der Müller’schen Gänge, aus denen sich im Zuge der normalen weiblichen Geschlechtsentwicklung Uterus, Tuben und Ovarien entwickeln. Die Leydig-Zellen des Hodens beginnen ab der 8. Woche mit der durch hCG (humanes Choriongonadotropin) und später LH (Luteinisierendes Hormon) kontrollierten Produktion des Steroidhormons Testosteron (Hannema et al., 2007; Hiort et al., 2000b). Die komplexe Synthese aus Cholesterol läuft in diversen Schritten vor allem über P450-Enzyme in den Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum ab (Miller, 1998). 2 Einleitung I Abb. 1 Schematische Darstellung der embryonalen Geschlechtsentwicklung WT1 und SF1 sowie später auch GATA4, LHX9 und LIM1 regulieren die Entwicklung der indifferenten Gonaden sowohl im männlichen als auch weiblichen Embryo. Unter dem Einfluss regulatorischer Gene (SRY, SOX9, DAX1, FGF9 u.a.) differenzieren sich die indifferenten Hodenanlagen des männlichen Embryos zu Hoden aus. Die Sertoli-Zellen der Hoden beginnen das Anti-Müller-Hormon (AMH) zu sezernieren, dieses führt zu einer Rückbildung der Müller’schen Gänge, die sich im weiblichen Embryo zu Uterus und Tuben ausbilden. Die Leydig-Zellen des Hodens produzieren Testosteron (T), dieses bewirkt über den Androgenrezeptor (AR) eine Differenzierung der Wolff’schen Gänge zu Samenbläschen und Nebenhoden. Testosteron wird von der 5α-Reduktase II zu Dihydrotestosteron (DHT) umgewandelt (gepunkteter Pfeil). Durch die Androgenvermittelte Wirkung von DHT kommt es zur Ausbildung des äußeren männlichen Geschlechts. Ist keine Testosteron- oder DHT-Wirkung vorhanden, bilden sich äußere weibliche Genitalien aus. Auch die weibliche Geschlechtsdifferenzierung unterliegt einer komplexen Genregulation, die hier nicht weiter erörtert werden soll. Durch die Testosteronwirkung differenzieren sich die Wolff’schen Gänge von den Hoden ausgehend zu Nebenhoden, Samengängen und Samenbläschen (Übersicht in Hannema, 2007). Durch das Enzym 5α-Reduktase II wird Testosteron in den Zielzellen in das potentere Androgen Dihydrotestosteron (DHT) umgewandelt. DHT bewirkt die Ausbildung des äußeren männlichen Genitals: die Entwicklung der männlichen Urethra, der Prostata, des Penis und des Skrotums (Übersicht in Wilson und Davies, 2007). Die Androgene Testosteron und DHT üben ihre biologische Wirkung in den Zielzellen über einen nukleären Hormonrezeptor, den Androgenrezeptor (AR) aus. Dieser wirkt als Androgen-abhängiger 3 Einleitung I Transkriptionsfaktor aktivierend oder supprimierend auf seine Zielgene. Die Expression des AR am Wirkort ist somit Grundlage für die Entwicklung des männlichen Phänotyps. In der Pubertät steigt, vermittelt über die Hypothalamus-Hypophysen-Achse, die Testosteronproduktion der Leydig-Zellen an und vermittelt die Ausbildung der sekundären männlichen Geschlechtsmerkmale und die Spermatogenese. Auch im weiteren Erwachsenenleben sind Androgene für den Erhalt der Fertilität und der sekundären männlichen Geschlechtsmerkmale entscheidend (Übersicht in Hiort, 2002). 2. Androgenresistenz Können die Androgene Testosteron und DHT ihre biologische Wirkung über den Androgenrezeptor auf Grund einer Rezeptormutation nicht oder nur teilweise ausüben, kommt es zu einer Störung der physiologischen Geschlechtsentwicklung, die als Androgenresistenz oder Androgen Insensitivity Syndrome (AIS, OMIM #300068) bezeichnet wird. AIS wird X-chromosomal rezessiv vererbt und tritt mit einer Prävalenz von eins pro 20 000 bis eins pro 64 000 männlichen Neugeborenen auf (Ahmed et al., 2000). Betroffene haben einen normalen 46,XY Karyotyp, unvollständig deszendierte Hoden und ein äußerlich weibliches oder auch teilweise bis vollständig virilisiertes Genital. Nach Sinnecker lassen sich die Phänotypen in Grad 1 (männlich) bis 5 (weiblich) einteilen (Sinnecker et al., 1997). Klinisch werden drei Formen, die komplette (CAIS), partielle (PAIS) und minimale (MAIS) Androgenresistenz unterschieden (Brinkmann, 2001). Zum Verständnis ist die Klassifikation in Tbl. 1 und Abb. 2 dargestellt. Die Hormonprofile von CAIS- und PAISPatienten sind vergleichbar. Serum-Testosteron- und LH-Werte sind während der ersten drei Lebensmonate am bzw. über dem oberen normalen Mittel für dieses Alter. Präpubertär werden normal niedrige LH- und Testosteron-Level gemessen. Da die Androgenresistenz auch das Hypothalamus-/ Hypophysenniveau betrifft, rufen hohe Testosteronwerte kein negatives Feedback hervor. Daher steigen in der Pubertät LH und nachfolgend Testosteron auf überhöhte Werte an (Brinkmann, 2001). Die Diagnose einer Androgenresistenz wird durch die Detektion eines molekularen Defekts im Gen des Androgenrezeptors bestätigt. Die Sequenzierung des Leserahmens und der Exon-/Intron-Grenzen des AR Gens kann bei CAIS-Patienten in 95 % der Fälle eine genetische Ursache beweisen. Bei PAIS liegt die Detektionsrate mit ungefähr 50 % deutlich darunter, bei MAIS ist sie unbekannt (Gottlieb et al., 2007). 4 Einleitung I Typ Phänotyp Form Phänotyp und Funktion 1 männlich MAIS Gestörte Spermatogenese und/oder gestörte Virilisierung in der Pubertät 2 vorwiegend männlich PAIS Isolierte Hypospadie und/oder Mikropenis und höhergradige Hypospadie, Skrotum bipartitum 3 Ambivalent PAIS Klitorisähnlicher Mikrophallus, Labien-ähnliches Skrotum bipartitum, perineoskrotale Hypospadie oder auch Sinus urogenitalis mit kurzer blind endender Vagina 4 vorwiegend weiblich PAIS Klitorishypertrophie und labiale Fusion, Sinus urogenitalis mit kurzer blind-endender Vagina, oder leichte Virilisierungszeichen 5 weiblich CAIS Keine Virilisierungszeichen, in der Pubertät Brustentwicklung, keine Entwicklung Androgen-abhängiger Strukturen (keine Scham/Achselbehaarung) Tbl. 1 Klassifikation des AIS nach Sinnecker 1997 Abb. 2 Schemazeichnung zur klinischen Einteilung des AIS Darstellung des äußeren Genitals bei den verschiedenen Formen von AIS 1) vollkommen männlich 2) vorwiegend männlich 3) intersexuell 4) vorwiegend weiblich 5) vollständig weiblich 2.1 Komplette Androgenresistenz Die komplette Androgenresistenz ist durch einen vollständigen Funktionsverlust des Androgenrezeptors gekennzeichnet. Während der Embryonalentwicklung kommt es zur Ausbildung der Hoden mit Sekretion von AMH und Testosteron (siehe Abb. 1). AMH vermittelt die Rückbildung der Müller’schen Gänge, wodurch die Betroffenen keinen Uterus und keine Tuben ausbilden. In einigen Fällen wurde das Verbleiben von Müllerstrukturen in CAIS-Patienten beschrieben (Hannema, 2004; Ulloa-Aguirre et al.; 1990, Van et al., 2003). Da der Androgenrezeptor funktionsuntüchtig ist, können die gebildeten Androgene ihre biologische Wirkung nicht entfalten. Die Wolff’schen Gänge bilden sich nicht zu Nebenhoden, Samengängen und Samenbläschen aus, und auch die normalerweise durch DHT vermittelte Ausbildung von Prostata, Penis und Skrotum unterbleibt. Stattdessen kommt es zu einer Rückbildung der Wollf’schen Gänge und der Ausbildung eines norma- 5 Einleitung I len weiblichen äußeren Genitals mit einer kurzen blind-endenden Vagina (siehe Abb. 1 und Abb. 2 (5), Tbl. 1; Brinkmann, 2001). Die Hoden liegen intraabdominell oder in den Leisten. In der Pubertät steigt die Testosteronproduktion an. Das Testosteron wird in den Hoden sowie peripher durch das Enzym Aromatase in Östradiol umgewandelt. Somit kommt es in der Pubertät bei den CAIS-Patienten zu einer weiblichen Brustentwicklung (MacDonald et al., 1979). Typisch ist das Fehlen von Achsel- und Schambehaarung, die durch Androgene vermittelt wird (Übersicht in Papadimitriou et al., 2006). Die Diagnose ist oft ein Zufallsbefund: es wird eine Diskrepanz zwischen männlichem Karyotyp bei Amniozentese oder Chorionzottenbiopsie und dem im pränatalen Ultraschall oder bei der Geburt festgestellten äußerlich weiblichen Geschlecht entdeckt, oder beim Pädiater werden Leistenhoden vorgefunden. Bei beidseitiger Leistenhernie wurde die Prävalenz eines AIS mit 1 - 2 % angegeben (Galani et al., 2008; Hurme et al., 2009). Teilweise wird die Diagnose erst in der Pubertät bei Ausbleiben der Menstruation und sekundären Behaarung festgestellt. 2.2 Partielle Androgenresistenz Im Gegensatz zu dem relativ einheitlichen Phänotyp des CAIS zeigt das Bild der partiellen Androgenresistenz ein breites klinisches Spektrum. Die äußeren Genitalien können vorwiegend weiblich mit leichten Zeichen der Virilisierung, intersexuell nicht einem Geschlecht klar zuzuordnen oder auch vorwiegend männlich mit leichten Virilisierungsstörungen ausgeprägt sein (Tbl. 1 und Abb. 2 (2-4)). Die Funktionalität des Androgenrezeptors ist bei PAIS zum Teil vorhanden. Die Abkömmlinge der Wolff’schen Gänge sind somit teilweise bis vollständig entwickelt (Hiort et al., 2000b). PAIS-Patienten fallen durch ihr äußeres Genital meist schon direkt nach ihrer Geburt auf. In der Pubertät zeigt ein Großteil eine Gynäkomastie. In den Hoden ist eine reduzierte Zahl von Spermatogonien oder Azoospermie zu erkennen. Die Diagnose wird nach dem klinischen Bild, dem Karyogramm und einem hCG-Stimulationstest mit einer ausgeprägten bis supraphysiologischen Testosteronantwort gestellt. Es werden Testosteron, seine Vorstufen und DHT bestimmt, um differentialdiagnostisch Störungen der Testosteronbiosynthese ausschließen zu können. Als MAIS wird die mildeste Ausprägung einer Androgenresistenz mit normalem männlichen Geschlecht, jedoch leichten Virilisierungsstörungen wie Gynäkomastie oder Infertilität, beschrieben. Bei infertilen Männern kann in 2 - 3 % eine Mutation im AR-Gen, also ein MAIS nachgewiesen werden (Hiort et al., 2000a; Ferlin et al., 2006). 6 Einleitung I 3. Der Androgenrezeptor Der Androgenrezeptor (AR, OMIM *313700) gehört zur Gruppe der Steroidhormonrezeptoren, die ihre Wirkung über die Regulation bestimmter Zielgene entfalten. Wie beschrieben, ist die Funktion des AR unabdingbar in der Entwicklung des männlichen Geschlechts. Mutationen und andere strukturelle Veränderungen des Rezeptors führen zur Androgenresistenz. Um die Pathophysiologie dieses Rezeptordefektes zu verstehen, ist die Kenntnis seiner Struktur und seines molekularen Wirkungsmechanismus wichtig. Abb. 3 Übersicht über Gen-Lokus, Gen-Aufbau, cDNA und Proteinstruktur des AR (modifiziert nach Quigley et al., 1995) Oben: Das Gen des AR liegt auf dem langen Arm des X-Chromosoms an Position Xq11-12. Mitte: Das AR-Gen ist 75-90 kb lang und in 8 Exons gegliedert, die von Introns mit 0,7 bis zu 26 kb getrennt sind. Exon 1 kodiert für die N-terminale Domäne (NTD), Exon 2 und 3 kodieren für die DNABindungsdomäne (DBD). Die 5’-Region von Exon 4 kodiert für die Hinge-Region (H), der übrige Teil von Exon 4 und die Exons 5-8 kodieren für die Liganden-Bindungsdomäne (LBD) des AR. Unten: das AR-Protein, gegliedert in seine drei Domänen, NTD (rot), DBD (grün), Hinge-Region (H) mit der Kernlokalisierungssequenz (blau) und LBD (violett) mit Ligandenbindungsgrube für Testosteron (T) und Dihydrotestosteron (DHT). 3.1 Aufbau des Androgenrezeptorgens Das Gen des Androgenrezeptors ist auf dem X-Chromosom (Xq11-12) lokalisiert und umfasst ungefähr 90 Kilobasen mit 8 Exons, die mit 1-8 (Marcelli et al., 1990) oder A-H (Lubahn et al., 1989) bezeichnet werden (siehe Abb. 3). Exon 1 kodiert für die N-terminale Domäne (NTD), die mehr als die Hälfte des AR ausmacht. In Richtung des 5’ Endes befindet sich ein Glutamin-Repeat (PolyQ) und zum 3’ Ende der NTD hin liegt ein Glycin- 7 Einleitung I Repeat (PolyG). Abhängig von den Repeat-Längen variiert die Länge des AR zwischen 910 und 919 Aminosäuren. Exon 2 und 3 kodieren für die DNA-Bindungsdomäne (DBD) und die Exons 4-8 für die Hormonbindungsdomäne (LBD) des Rezeptors. Das 5’ Ende von Exon 4 kodiert für die Verbindung zwischen der DBD und LBD, die als Hinge-Region bezeichnet wird. In ihr ist auch die Kernlokalisierungssequenz (NLS) des AR zu finden (Übersicht in Quigley et al., 1995). Abb. 4 Schema des molekularen Wirkmechanismus des AR (nach Lee et al., 2003) Ohne Hormon liegt der Androgenrezeptor (AR) an Hitzeschockproteine (hsp) gebunden im Zytoplasma vor. Testosteron wird intrazellulär von der 5α-Reduktase II (5αRII) in DHT umgewandelt. Die Bindung von DHT an den AR bewirkt die Dissoziation des Proteinkomplexes. Der Hormonrezeptorkomplex wird u.a. durch Phosphorylierung (P) und Ubiquitinierung (U) modifiziert. Im Zellkern findet eine Rezeptordimerisierung statt. Infolge binden die Rezeptor-Dimere an Androgen-responsive Elemente (AREs) vor Zielgenen und führen durch Koregulator-Rekrutierung zu einer Transkriptionsinitiation der Zielgene, woraus letztlich der biologische Effekt der Hormonwirkung resultiert. 3.2 Molekulare Wirkungsweise des AR Der AR liegt in seinem inaktiven Zustand assoziiert mit Hitzeschockproteinen und hochmolekularen Immunophilinen im Zytoplasma der AR-exprimierenden Zellen vor (siehe Abb. 4; Dehm und Tindall, 2007). Erreichen Androgene, die als lipophile Moleküle in die Zelle diffundieren können, den Rezeptor, binden sie in der LBD und bewirken eine Rezeptoraktivierung. Die Hitzeschockproteine lösen sich, und der Hormon-Rezeptorkomplex 8 Einleitung I wird über seine Kernlokalisierungssequenz, vermittelt durch Importin-α, in den Zellkern transportiert (Gobinet et al., 2002; Cutress et al., 2008). Der AR bildet Homodimere aus und lagert sich an die Androgen-responsiven Elemente (AREs) seiner Zielgene an. Dort rekrutiert er weitere Kofaktoren und initiiert die Transkription mit Hilfe der RNAPolymerase II (Rosenfeld und Glass, 2001). Posttranslationale Modifizierungen des Rezeptors, wie Phosphorylierung, Acetylierung, Ubiquitinierung und Sumoylierung, beeinflussen Struktur und Funktion des AR (Dehm und Tindall, 2007, Orphanides et al., 2002, Geserick et al., 2003). Die genauen Abläufe sind noch nicht vollständig bekannt. Einen Überblick über die Rezeptorfunktion ist in Abb. 4 dargestellt. 3.3 Funktionelle Domänen des AR Die drei Domänen des AR haben unterschiedliche Funktionen und Struktureinheiten. Die zentrale DNA-Bindungsdomäne vermittelt die Translokation in den Zellkern, die ARDimerisierung und die DNA-Bindung. Die NTD ist die transaktivierende Domäne des AR, sie interagiert u.a. mit Kofaktoren. Die LBD ist für die Hormonbindung zuständig und ebenfalls in die Interaktion mit Kofaktoren involviert (Übersicht in Dehm und Tindall, 2007). Abb. 5 Kristallstruktur der AR-DBD gebunden an ein ARE (aus Shaffer et al., 2004) In Strickleiter-Konformation ist ein idealisiertes ARE, mit der Sequenz AGAACAnnnAGAAC, dargestellt: Zwei hexamerische direkte DNA-Repeats (in gelb bp 1-6) getrennt durch drei DNA-Basen (Spacer, dargestellt in blau). Darüber sind die DBDs von zwei ARs (DBD1 in rot und DBD2 in blau) in einer Kopf-zu-KopfKonformation abgebildet. Zink-Atome (Zn) strukturieren die DBDs in ihre Zinkfinger, der erste Zinkfinger geht über die P-Box die Interaktion mit den AREs ein. Über die D-Boxen der zweiten Zinkfinger lagern sich die ARs zu einem Homodimer zusammen. 9 Einleitung I 3.3.1 Die DNA-Bindungsdomäne Die DBD ist ungefähr 80 Aminosäuren lang und gliedert sich strukturell in zwei ZinkfingerMotive, in denen ein zentrales Zn2+ vier Cystein-Seitenketten koordiniert (Abb. 5). Das erste Zinkfinger-Motiv enthält die sogenannte P-Box, über die der Kontakt zu den Androgen-responsiven Elementen (AREs) vor Zielgenen aufgebaut wird. Die entsprechenden Aminosäuren sind innerhalb der Steroidhormon-Rezeptorfamilie konserviert. Der zweite Zinkfinger enthält die D-Box, über die sich, in Abhängigkeit von der DNA-Bindung, ARHomodimere ausbilden (siehe Abb. 5; Dehm und Tindall, 2007; Claessens et al., 2008). Am C-terminalen Ende der DBD befindet sich eine Kernlokalisierungssequenz, die nach Hormonaktivierung den Transport des AR in den Zellkern vermittelt. Die DBD des AR kann zwei verschiedene Arten von AREs binden. Die klassischen AREs werden sowohl vom AR als auch vom Mineralokortikoid-, Glukokortikoid- und Progesteronrezeptor erkannt. Zwei Hexamere bilden eine palindromische Sequenz mit der Konsensus-Sequenz 5’-GGTACAnnnTCTTCT-3’ aus (Geserick et al., 2003). Im Gegensatz zu den anderen Rezeptoren kann der AR außerdem eine Sequenz aus zwei hexamerischen direkten Repeats binden. In der Promotorregion einiger Androgen-abhängiger Gene, wie dem Probasin- und sex-limited-Protein-Gen, konnten diese Sequenzen detektiert werden. Sie werden als selektive Androgen-responsive Elemente (sARE) bezeichnet (Lee und Chang, 2003). In Kristall-Struktur-Analysen wurde eine Kopf-zu-Kopf-Konformation der an ein idealiertes sARE gebundenen DBD-Homodimere detektiert (siehe Abb. 5; Shaffer et al., 2004). 3.3.2 Die Liganden-Bindungsdomäne Die LBD hat eine konservierte Struktur, die ebenfalls mit Kristallographie-Studien dargestellt werden konnte. Sie lässt sich als ein Sandwich aus 12 α-Helices mit einer zentralen Hormonbindungsgrube beschreiben (siehe Abb. 6; Sack et al., 2001; Matias et al., 2000). Die physiologischen Liganden des AR sind Testosteron und Dihydrotestosteron. 18 Aminosäurereste der Helices 3, 5 und 11 bilden einen direkten Kontakt zum gebundenen Androgen aus. Die Hormonbindung löst eine Konformationsänderung des ganzen Rezeptors aus, wodurch sich Helix 12 über die Bindungsgrube legt und die Ligandenbindung stabilisiert (Moras und Gronemeyer, 1998). Die aktivierte LBD stabilisiert die Bindung der DBD an Androgen-responsive Elemente vor Zielgenen (Farla et al., 2004) und ist für ProteinProteininteraktionen entscheidend. Durch die Konformationsänderung wird eine hydrophobe Grube frei, über welche die LBD mit Kofaktoren interagieren kann. Diese Region der LBD, bestehend aus den positiv-geladenen Seitenketten K715, K718 und R724 und den negativen Seitenketten E707, E891 und E895, wird als Activation-Function-2 (AF2) 10 Einleitung I bezeichnet (He und Wilson, 2003). Im Gegensatz zu den strukturgleichen Regionen anderer Steroidhormonrezeptoren hat die LBD des AR eine geringere Affinität zu bestimmten Peptidstrukturen von p160-Koaktivatoren, die als LXXLL-Motive bezeichnet werden (L steht für Leucin, X kann jede Aminosäure sein) (Dubbink et al., 2004; Hur et al., 2004). Stattdessen kann die AF2 des AR mit hoher Affinität mit einer anderen Peptidstruktur, einem 23 FQNLF27-Motiv, welches sich in der NTD des AR selbst befindet, interagieren. Diese für den AR spezifische Interaktion zwischen NTD und LBD wird als N/C-terminale Interaktion bezeichnet. Mit hoher Affinität werden auch Kofaktoren mit FXXMF- und FXXFF-Motiven gebunden (van de Wijngaard et al., 2006). In Abb. 7 sind die funktionellen Untereinheiten und Wechselwirkungen des AR vereinfacht dargestellt. Abb. 6 Dreidimensionale Struktur der AR-LBD (Die Abbildung entstammt der AR-Database, von Dr. JH Wu, LDI Molecular Modeling Lab.) Durch Kristallographiestudien konnte die 3-dimensionale Struktur der LBD detektiert werden. Hier dargestellt mit dem künstlichen AR-Agonisten R1881, bildet die LBD 12 α-Helices (H1-H12) aus, die sich zu einem Sandwich mit zentraler Ligandenbindungsgrube zusammenlagern. Helix 12 (rot) verlagert sich nach der Hormonbindung und stabilisiert als „Deckel“ die Ligandenbindung. 3.3.3 Die N-terminale Domäne des AR Die N-terminale Domäne der Steroidhormonrezeptoren ist am wenigsten konserviert, sie variiert in Länge, Aminosäure-Zusammensetzung und auch in ihrer Funktion (Claessens et al., 2008). Im Gegensatz zu den anderen Domänen existiert keine feststehende Tertiärstruktur. Auch die NTD des AR weist eine hohe Plastizität auf. In Abhängigkeit von intraund intermolekularen Interaktionen ändert sich ihre Konformation (McEwan et al., 2007). Kofaktoren und Struktur-stabilisierende Lösungen können die NTD in einen geordneteren, stabileren Zustand transfomieren (Reid et al., 2002). Studien des AR mit zwei Domänen 11 Einleitung I zeigten, dass die Anwesenheit der DBD und/oder die DNA-Bindung die Konformation der NTD verändern (Brodie und McEwan, 2005). Funktionell gesehen stellt die NTD die Hauptaktivierungsdomäne des Rezeptors dar, die sogenannte Activation-Function-1 (AF1) (Mc Ewan et al., 2007). Innerhalb der AF1 wurden zwei überlappende Kern-Regionen lokalisiert, die im Besonderen die Transaktivierung beeinflussen (Jenster et al., 1995). Transcription-Activation-Unit-1 (Tau-1) liegt zwischen Aminosäure (AS) 101 und 370 und ist für die Transaktivierung des ganzen AR wichtig. Tau-5 erstreckt sich von AS 360 bis 529 und ist auch unabhängig von der LBD aktiv. Die Wechselwirkungen zwischen den LXXLL-Motiven von p160-Kofaktoren und der AF2 sind relativ schwach. Stattdessen können die Kofaktoren mit hoher Affinität über eine glutaminreiche Region (Qr) mit der Tau-5 der AR-NTD interagieren (siehe Abb. 7; Bevan et al, 1999, Christiaens et al., 2002). Für die ungestörte Funktion des AR sind sowohl Tau-1 als auch Tau-5 entscheidend (Callewaert et al., 2006). Abb. 7 Funktionelle Untereinheiten des AR-Proteins (modifiziert nach Claessens et al., 2008) Schematische Darstellung des AR mit NTD (rot), DBD (grün) und LBD (violett). Kofaktoren sind gelb dargestellt. Tau-1 mit einem Glutamin-Repeat (Qn) und Tau-5 mit einem Glycin-Repeat (Gn) stellen die beiden transaktivierenden Untereinheiten der NTD dar. Durch die Bindung von DHT/Testosteron an die LBD wird die AF2 aktiviert und kann mit Kofaktoren interagieren. Die Interaktion mit dem FQNLF-Motiv der NTD (N/Cterminale Interaktion) und FXXFF/FXXMF-Motiven von Kofaktoren ist stark (oben). LXXLL-Motive von p160Koaktivatoren binden nur schwach an die AF2. Eine stärkere Interaktion wird über eine glutaminreiche Sequenz (Qr) und das WHTLF-Motiv der Tau-5 in der NTD ausgebildet. Cyclin D1 und MAGE 11 interagieren direkt mit dem FQNLF-Motiv der NTD. Die ersten 25 Aminosäuren der NTD enthalten in einem α-helikalen Abschnitt das 23 FQNLF27-Motiv (He et al.,2004). Dieses bindet als rundliche Struktur an der Kofaktorbin- dungsgrube der LBD und bildet dadurch eine N/C-Interaktion aus. Für diese Interaktion 12 Einleitung I sind auch die angrenzenden Aminosäuren der NTD entscheidend (Steketee et al., 2002). Einige Kofaktoren, wie z.B. MAGE-11 und Cyclin D1, interagieren mit dem AR direkt über die Bindung an das 23FQNLF27-Motiv der NTD (Bai et al., 2005; Burd et al., 2005). 433 WHTLF437, ein ähnliches Motiv, befindet sich in der Tau-5 der NTD. Es wurde auch als potentielle Region für die N/C-Interaktion vermutet, zeigte allerdings im Unterschied zu 23 FQNLF27 eine sehr viel geringere Affinität zur LBD (He et al., 2000). In einer Studie von Dehm et al. (2007) wurde die Tau-5 analysiert und das 433 WHTLF437-Motiv als wichtigstes transaktivierendes Element definiert. Studien von Need et al. (2009) zeigten, dass die Aminosäuren 501-535 der NTD sowie die Aminosäure E895 für die Interaktion mit Kofaktoren und die Ausbildung der N/C-Interaktion eine Rolle spielen, die sich in klassischen Reportergenstudien mehr zeigte als an Promotoren, die in Chromatin integriert waren. 3.4 Die N/C-terminale Interaktion Die N/C-terminale Interaktion ist ein komplexer dynamischer Vorgang, der wichtig für die Funktion des AR in-vivo ist (Claessens et al., 2008). Durch die Interaktion zwischen Nund C-Terminus wird die Ligandendissoziationsrate gesenkt und der Abbau des ARProteins aufgehalten (Dubbink et al., 2004; He et al., 2001). In-vitro wird die Transaktivierungsfunktion des AR durch die N/C-Interaktion verstärkt. Das Ausmaß der Steigerung ist von der Art des verwendeten Promotors abhängig (Callewaert et al., 2003). Schon 1998 vermuteten Langley et al. eine fehlende N/C-terminale Interaktion als Ursache für AIS bei den LBD-Mutationen V889M und R752Q. Es existieren verschiedene Modelle der N/C-terminalen Interaktion. Im klassischen Fall ist, im Sinne einer direkten N/C-Interaktion, die Androgen-abhängige Interaktion zwischen der AF2 der LBD und dem 23FQNLF27-Motiv der NTD gemeint. Über die AF2 der LBD wird außerdem die Interaktion verschiedenster Kofaktoren vermittelt. Die Ergebnisse neuerer Studien sprechen dafür, dass beide Vorgänge an der AF2 kompetitiv ablaufen, sich aber von der Funktion unterstützen, indem sie zeitlich und örtlich versetzt passieren (Need et al., 2009; Centenera, 2008). Ein zweites Modell geht von einer indirekten N/C-Interaktion aus, bei der Kofaktoren als „Brücke“ N- und C-Terminus des AR in räumliche Nähe bringen. Bestimmte Kofaktoren können die N/C-Interaktion steigern oder sind in der Lage bei ARs, die zunächst keine N/C-Interaktion ausbilden, durch ihre Anwesenheit in-vitro eine N/C-Interaktion herzustellen (Shen et al., 2005). Durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer(FRET)-Analysen konnte gezeigt werden, dass die N/C-Interaktion im Zellkern, vor der Bindung des AR an seine Zielgene stattfindet (Schaufele et al, 2005; van Royen et al. 2007). Dabei könnte die N/C-Interaktion den AR vor unspezifischer Bindung mit Kofaktoren schützen. Es ist sowohl eine Dimerisierung von zwei Rezeptoren, über eine N/C-terminale Interaktion zwischen der NTD des einen und 13 Einleitung I der LBD des zweiten Rezeptors, als auch ein intramolekularer Ringschluss eines einzelnen AR beobachtet worden (Schaufele et al., 2005). Klokk et al. (2007) detektierten eine N/C-terminale Interaktion bei aktiven und an AREs angelagerten Androgenrezeptoren. Die intramolekulare Interaktion eines einzelnen Rezeptors war dabei erheblich stärker als intermolekulare Interaktionen. In-vivo Analysen von Li et al. (2006) zeigten, dass eine funktionierende N/C-Interaktion vor allem bei der Expression von in Chromatin integrierten Genen entscheidend ist. Die N/C-Interaktion ist nötig, um bestimmte Chromatinmodulierende Komplexe zu rekrutieren, die die Bindung des Rezeptors an seine AREs ermöglichen. 3.5 Mutationen des AR Mutationen im AR-Gen sind mit AIS, Spinobulbärer Muskelatrophie vom Typ Kennedy oder mit Prostatakarzinomen assoziiert. In der AR-Datenbank (www.mcgill.ca /androgendb) sind bisher über 500 verschiedene Mutationen registriert. Es werden größere Strukturdefekte des Gens (wie komplette oder partielle Gen-Deletionen), SplicesiteMutationen, (bei denen die mRNA durch Intron-Mutationen fehlerhaft gespleißt wird), kleine Basen-Deletionen, Punktmutationen und Expansionen der Trinukleotid-RepeatSequenzen beschrieben (Quigley et al., 1995). In allen 8 Exons wurden Mutationen nachgewiesen, die zu AIS führen. Größere Strukturänderungen des AR resultieren fast ausschließlich in einem kompletten Funktionsausfall des AR, also einem CAIS. Auch Punktmutationen, die zu einem präterminalen Stoppkodon führen, sind mit CAIS assoziiert. Missense-Mutationen, bei denen es durch Basensubstitution zum Austausch einer einzelnen Aminosäure kommt, stellen die häufigste Mutationsform dar und wurden in allen Formen von AIS gefunden. Sie finden sich am häufigsten in der LBD und DBD und seltener in der NTD des AR (Gottlieb et al., 2004). Mutationen in der LBD können die Hormonbindung stören oder die Interaktion mit Kofaktoren beeinflussen (Loy et al., 2001). Mutationen der DBD greifen in die Translokation des aktivierten Rezeptors in den Zellkern ein oder inhibieren die DNA-Bindung, wodurch sie zu PAIS oder CAIS führen (Kawate et al., 2005). In 70 % der Fälle wird AIS über eine Keimbahnmutation von der Mutter an die betroffenen Söhne weitergegeben. In 30 % der Patienten wird eine De-Novo-Mutation gefunden (Hiort et al., 1998; Köhler et al., 2005). Möglich ist das Auftreten der Mutation in einer einzelnen mütterlichen Eizelle oder durch das Bestehen eines Keimzellmosaiks der Mutter. Findet die Mutation während der Embryonalentwicklung statt, besteht ein somatisches Mosaik. Je nachdem in welchem Stadium sich die Mutation ereignet, sind unterschiedlich viele Körperzellen betroffen. Das klinische Bild kann dadurch variieren. CAIS-Mutationen können klinisch als PAIS in Er- 14 Einleitung I scheinung treten, da der Wildtyp-Androgenrezeptor in den nicht betroffenen Zellen androgene Wirkung vermitteln kann (Holterhus et al., 1997). 4. Zielsetzung und Fragestellungen Die klinische Diagnose eines AIS in Kombination mit dem Nachweis einer Mutation im Gen des AR stellt noch keinen endgültigen Beweis für eine Funktionseinschränkung des Androgenrezeptors dar. Hierfür sind weiterführende Analysen notwendig. Bei einigen Mutationen des AR ist der molekulare Mechanismus des Rezeptordefektes eindeutig. Liegt ein präterminales Stoppkodon vor, resultiert daraus ein instabiler, durch Androgene nicht zu aktivierender Rezeptor. Viele bekannte Aminosäuresubstitutionen in der LBD zerstören die Integrität der Ligandenbindungsgrube direkt, verhindern somit ebenfalls die Hormonbindung und die Aktivierung des AR. Einige Mutationen in der DBD verändern die Konformation der Zinkfinger, sodass die Anlagerung an AREs vor Zielgenen verhindert wird. In den beschriebenen Fällen liegt ein vollständiger Funktionsverlust des AR vor, der mit CAIS assoziiert. In vielen Fällen ist die Auswirkung einer Mutation auf die molekulare Funktion des AR jedoch nicht genau bekannt. Zu diesen Mutationen gehören CAIS-Mutationen der LBD, die eine normale Hormonbindung zulassen, und die meisten PAIS-Mutationen. Die Kenntnis der Pathologie ist im Hinblick auf den Umgang mit einzelnen Patienten, Therapieempfehlungen und Therapieaussichten entscheidend. Deshalb ist es Ziel dieser Arbeit, die Funktionalität mutierter Rezeptoren durch in-vitro Analysen differenziert zu untersuchen und eine Charakterisierung der Mutationen im Hinblick auf die Korrelation zwischen Funktion und Phänotyp darzustellen. 4.1 Vorstellung der zu untersuchenden Mutationen Es wurden acht natürlich vorkommende Mutationen des Androgenrezeptors, die zum Großteil dem Lübecker Patientenkollektiv entstammen, ausgewählt (siehe Abb. 8). Im Vordergrund stand hierbei, dass die mutierten Rezeptoren eine normale maximale Hormonbindung aufwiesen. Drei Mutationen befinden sich in der NTD und wurden in Patienten mit einem klinisch diagnostizierten PAIS entdeckt. S411N und S432F sind Missense-Mutationen und Δ409411 ist eine Deletion von 9 Basenpaaren, die zum Verlust von 3 Aminosäuren im ARProtein führt. In Reportergen-Assays konnte für die Mutation S432F eine Einschränkung der Rezeptorfunktion nachgewiesen werden, während die Ursache des PAIS bei den anderen Mutationen ungeklärt blieb. Die drei Patienten wurden im männlichen Geschlecht 15 Einleitung I erzogen. Die Mutation Δ409-411 wurde auch bei dem Zwillingsbruder des betroffenen Patienten festgestellt, der klinisch keinen Hinweis auf ein partielles AIS gab. Die übrigen untersuchten Mutationen sind in der LBD des Rezeptors lokalisiert. Die Mutation L712F ist eine PAIS-Mutation mit einer auffallend großen Variationsbreite des Phänotyps, auch innerhalb derselben Familie. Sie liegt am Rand der Kofaktorbindungsgrube der AF2. Die Funktionseinschränkung des AR konnte in-vitro an unterschiedlichen Promotoren eindeutig nachgewiesen werden (Werner et al., 2006). Während keine Einschränkung in der maximalen Hormonbindung vorliegt, ist die Dissoziationskonstante im Vergleich zum Wildtyp erhöht (Holterhus et al., 2000). Abb. 8 Verteilung der acht zu untersuchenden Mutationen im AR-Protein In dieser Arbeit wurden 8 natürlich vorkommende Mutationen des AR, die eine Hormonbindung zulassen, ausgewählt. Oberhalb des Proteins sind die PAIS-Mutationen abgebildet. Drei befinden sich in der NTD und zwei in der LBD des AR. Unterhalb des Proteins sind die CAIS-Mutationen gekennzeichnet. Sie befinden sich in der LBD. Die Mutation F916X diente der Negativkontrolle, da sie die Hormonbindung unterbindet. Die Mutation Q798E wurde in unabhängigen Fällen von PAIS und MAIS nachgewiesen. In zwei Fällen mit intersexuellem Genital wurden die Patienten als Mädchen erzogen (Batch et al., 1992; Quigley et al., 1995). Die gleiche Mutation wurde auch bei drei Männern mit Infertilität (Wang et al., 1998; Ferlin et al. 2006; Hiort et al. 2000a) und als somatische Mutation in zwei Fällen von Prostatakarzinomen detektiert (Evans et al., 1996; Castagnoro et al., 1993). Die Mutation befindet sich zwischen Helix 7 und 8 der LBD. In in-vitro Studien konnte eine normale Hormonbindung und eine ebenfalls normale Dissoziationskonstante des mutierten Rezeptors detektiert werden. Die Transaktivierungsfunktion des Rezeptors ist allerdings im Vergleich zum Wildtyp eingeschränkt (Bevan et al., 1996). Jääskeläinen et al. (2006) untersuchte die N/C-terminale Interaktion im Androgenrezeptor der Ratte und stellte keine Einschränkung durch die Mutation Q798E fest. Drei der untersuchten Mutationen sind mit CAIS assoziiert. Die Mutation P723S befindet sich in der Verbindung zwischen Helix 3 und 4, P904S am Ende von Helix 12 und H917R im C-Terminus des AR. Die Position P904 ist unter den Steroidhormonrezeptoren konserviert. An derselben Stelle wurden außerdem zwei weitere CAIS-Mutationen, P904V und 16 Einleitung I P904H detektiert (Melo et al., 2003). Song et al. (2003) detektierten eine gestörte Interaktion des Rezeptors mit P904S mit einigen Kofaktoren und der AR-NTD. Der AR mit der Mutation F916X wurde als Negativ-Kontrolle verwendet. Durch ein präterminales Stoppkodon an Position 916 fehlen die letzten 4 Aminosäuren des Rezeptors. Da das C-terminale Ende des AR für die Hormonbindung entscheidend ist (Tahiri et al., 2001), kann dieser Rezeptor nicht Androgen-abhängig aktiviert werden. Verschiedene natürlich vorkommende Mutationen in dieser Region des AR führen zu CAIS (Ahmed et al., 2003). 4.2 Fragestellungen Wird klinisch eine Androgenresistenz diagnostiziert und eine Mutation im Gen des AR nachgewiesen, kann nicht automatisch auf eine eingeschränkte Rezeptorfunktion geschlossen werden. Es ist denkbar, dass eine stumme Mutation oder ein Polymorphismus vorliegt und zusätzlich eine andere Ursache für eine verminderte Virilisierung vorhanden ist. Um einen Rezeptordefekt nachzuweisen, hat es sich daher etabliert, funktionelle Analysen durchzuführen. In dieser Arbeit sollen die acht beschriebenen Mutationen in Reportergen-Assays im Hinblick auf eine Einschränkung der Rezeptorfunktion untersucht und mit dem Wildtyp-Rezeptor verglichen werden. Die biologische Funktion des Androgenrezeptors ist ein komplexes Zusammenspiel der Funktionen seiner drei Domänen. Sie gliedert sich unter anderem in Hormonbindung, DNA-Bindung und Interaktion mit regulatorischen Proteinen. In dieser Arbeit soll durch die kombinierte Analyse verschiedener Funktionen des Androgenrezeptors versucht werden, die Funktionalität der mutierten Rezeptoren in einem möglichst breiten Spektrum zu charakterisieren. Ein besseres Verständnis der pathophysiologischen Vorgänge wäre hilfreich im therapeutischen Management der Betroffenen und könnte Therapieentscheidungen erleichtern. Drei funktionelle Analysen des AR wurden im Zellmodell durchgeführt: 1. Analyse der Funktion als Transkriptionsfaktor Der AR fungiert als Androgen-abhängiger Transkriptionsfaktor, dessen Hauptaufgabe die Regulation seiner Zielgene ist. Zunächst wurde daher die Fähigkeit der mutierten Rezeptoren, die Transkription Androgen-abhängiger Gene einzuleiten, untersucht. Hierzu wurden die Mutationen in ein Androgenrezeptor-Expressionsplasmid kloniert. Durch Transfektion wurden die Plasmide der mutierten ARs in Säugerzellen gebracht und die Transaktivität an Androgen-abhängigen Promotoren in Abhängigkeit von DHT untersucht. 17 Einleitung I Da sich die Promotoren der Zielgene in-vivo von Gen zu Gen unterscheiden, wurde das Verhalten in den Reportergen-Assays ebenfalls an verschiedenen Androgen-abhängigen Promotoren analysiert. Es war zu untersuchen, ob sich eine Mutation an einem definierten Promotor stärker bemerkbar macht als an einem anderen. Dieses würde bedeuten, dass die Expression bestimmter Gene in-vivo stärker durch eine Mutation verändert würde, als die Expression anderer Gene. Eine solche Beobachtung könnte bestehende Schwierigkeiten in der Korrelation zwischen Mutation und Phänotyp erklären. Die folgenden Fragen standen im Vordergrund: - Ist der mutierte Rezeptor in der Lage, in der Anwesenheit von DHT die Transkription von Zielgenen zu initiieren? - Ist die Transaktivierung mit der des Wildtyps vergleichbar oder abgeschwächt? - Kann die Rezeptorfunktion durch erhöhte Hormonkonzentrationen wiederhergestellt werden? - Sind Unterschiede zwischen verschiedenen Promotoren festzustellen, oder verhalten sich die mutierten Rezeptoren an jedem Promotor ähnlich? 2. Analyse der Interaktion zwischen N- und C-Terminus Die für den AR typische Interaktion zwischen NTD und LBD ist, wie oben beschrieben, für die Funktion des AR entscheidend. Sie stabilisiert den AR nach der Hormonbindung und ist wichtig bei der Regulation von in Chromatin integrierten Genen. Um die Auswirkungen der acht Mutationen auf die N/C-terminale Interaktion zu untersuchen, wurde diese in einem Zellmodell isoliert untersucht. Hierzu wurde ein Mammalia-Two-Hybrid-Assay eingesetzt. Die Mutationen wurden in die Expressionsplasmide von Two-Hybrid-Vektoren kloniert. Nach der Transfektion in Säugerzellen wurde durch die Interaktion zwischen N- und C-Terminus die Transkription eines Reportergens initiiert. Es stellten sich die folgenden Fragen: - Ist eine Interaktion zwischen mutierter LBD und Wildtyp-NTD oder mutierter NTD und Wildtyp-LBD nachweisbar? - Ist diese im Vergleich zum Wildtyp verändert? - Können höhere Hormonkonzentrationen die Interaktion zwischen NTD und LBD verbessern? 18 Einleitung I 3. Interaktion mit Kofaktoren Kofaktoren sind direkt an der Funktion des AR beteiligt, indem sie in allen Zuständen direkt oder indirekt auf ihn einwirken. Sie stabilisieren beispielsweise den inaktiven Rezeptor oder rekrutieren über Protein-Protein-Komplexe die RNA-Polymerase II. Um festzustellen, ob die in der LBD befindlichen Mutationen Unterschiede in der Kofaktorinteraktion aufweisen, wurde im Zellmodell exemplarisch die Interaktion mit zwei strukturell unterschiedlichen Kofaktoren, SRC1e und BAG1L, untersucht. SRC1e gehört zur Familie der p160 Koaktivatoren. Es interagiert über ein LXXLL-Motiv mit der AF2 der LBD und verstärkt dadurch die Transaktivierungsfunktion des AR (Ma et al., 1999; Dubbink et al., 2004). BAG1L gehört zu einer Gruppe von Kochaperonen, die die Funktion von Steroidrezeptoren regulieren (Froesch et al., 1998). Der AR kann sowohl über die NTD als auch über die LBD mit BAG1L interagieren und steigert durch seine Interaktion die Transaktivierungsfunktion des AR (Shatkina et al. 2003). Im Unterschied zu SRC1e besitzt BAG1L kein klassisches LXXLL-Motiv. Im Zellmodell wurde die Interaktion zwischen isolierter LBD mit Mutation und jeweils einem der beiden Kofaktoren untersucht. Die folgenden Fragen sollten beantwortet werden: - Findet eine Interaktion zwischen mutierter LBD und Kofaktor statt? - Können erhöhte DHT-Konzentrationen die Kofaktorinteraktion der mutierten LBDs stabilisieren? 19 Material und Methoden II II 1. Material und Methoden Materialien Eine Auflistung der verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Apparaturen sowie ihrer zugehörigen Bezugsquellen mit Standorten befindet sich im Anhang (Anhang 1.). Von der Aufzählung ausgenommen sind Verbrauchsmaterialien, Geräte, Apparaturen und sonstige Hilfsmittel, die zur Standardausrüstung eines Labors gehören. Enzyme wurden, wenn nicht anders vermerkt, von New England BioLabs (USA) bezogen und nach den Empfehlungen des Herstellers mit den zugehörigen Puffern eingesetzt. Die in Sequenzierung und PCR verwendeten Primer wurden von der Firma Metabion (Martinsried) bezogen. Aus der Stocklösung (100 pmol/µl) wurden mit Aqua dest. im Verhältnis 1:5 Arbeitsverdünnungen mit 20 pmol/µl hergestellt. 1.1 Mammalia-Zellen 1.1.1 Chinesische-Hamsterovar-Zellen In den Transfektionsversuchen wurde die Zelllinie CHO-K1 verwendet, die freundlicherweise von Dr. A. O. Brinkmann von der Erasmus Universität Rotterdam zur Verfügung gestellt wurde. Die Zelllinie ist ein Subklon der CHO-Zelllinie, die 1957 bei der Ovarbiopsie eines adulten Chinesischen Hamsters gewonnen wurde. Die Zellen wachsen adhärent, ihre Verdopplungszeit beträgt 24 h. Sie lassen sich unter einfachen Bedingungen kultivieren (siehe 2.5.1). 1.1.2 HeLa-Zellen HeLa-Zellen sind menschliche Epithelzellen aus einem Zervixkarzinom, das 1951 bei einer 31-jährigen afroamerikanischen Frau (Henrietta Lacks) biopsiert wurde. Es ist die erste aneuploide permanent kultivierte menschliche Zelllinie. Die HeLa-Zellen wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig) erworben. Sie vermehren sich mit einer Verdopplungszeit von 48h und wurden in den Transfektionsversuchen unter einfachen Kulturbedingungen angezogen (siehe 2.5.1). 1.2 Bakterienzellen Für die Klonierungen wurden DH5αF’ E. coli (Genotyp: F’/endA1 hsdR17 (rk-mk+) glnV44 thi- 1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 Δ(lacIZYA-argF) U169 deoR (φ80dlacΔ(lacZ)M15)) und One Shot Top10 Chemically Competent E. coli (Genotyp: F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) 20 Material und Methoden II φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG) der Firma Invitrogen Life Technologies (USA) verwendet. 1.3 Plasmide 1.3.1 Der Androgenrezeptor Expressionsvektor pSVAR0 Die cDNA des Androgenrezeptors mit 20 Glutamin (Q) und 16 Glycin (G) Wiederholungen wird über einen vorgeschalteten frühen Promotor des Simianen Virus 40 (SV40) in Säugetierzellen stark exprimiert. Ein Ampicillin-Resistenzgen ermöglicht die Selektion der Plasmid-herstellenden E. coli und somit die Bereitstellung der Plasmide für die Transfektionen. Der pSVAR0 Vektor wurde freundlicherweise von Brinkmann et al. zur Verfügung gestellt, die diesen 1989 beschrieben hatten. Auf der Grundlage des Wildtyp-Vektors, pSVAR0 (Q20, G16), wurden Vektoren mit verschiedenen Mutationen im Leserahmen des Androgenrezeptors konstruiert. Die Namen beziehen sich auf den Ein-Buchstaben-Code der Aminosäuren (Anhang 8.), und die Nummerierung der Aminosäuren lehnt sich an die 1989 von Lubahn et al. vorgestellte Sequenz des Androgenrezeptors an. In den Versuchen fanden die folgenden Vektoren Verwendung: pSVAR mit den N-terminalen Mutationen 23 S432F, pSVAR mit zwei N-terminalen Mutationen: pSVAR FQNAA27, Δ409-411, S411N, 23 FQNAA27 in Kombination mit den drei anderen N-terminalen Mutationen, pSVAR mit den C-terminalen Mutationen L712F, L723S, Q798E, P904S, F916X, H917R und die Doppelmutante pSVAR 23 FQNAA27 + L712F. Eine Plasmidkarte des pSVAR0(Q20, G16)-Vektors mit Kennzeich- nung der Mutationsstellen und eine tabellarische Auflistung der verwendeten pSVARVarianten ist im Anhang zu finden (Anhang 3.1 und 4.1). 1.3.2 Reportergene Reportergene werden verwendet, um bestimmte koregulatorische Eigenschaften von Proteinen aufzuzeigen. Durch Transfektion werden die cDNA der zu untersuchenden Proteine und die Reportergene in eukaryotische Zellen eingebracht. Je nach Versuchsaufbau ermöglicht letztendlich die Quantifizierung der Transkription des Reportergens eine Interpretation der untersuchten Proteineigenschaften. Die in den beschriebenen Versuchen eingesetzten Reportergene besitzen jeweils eine spezifische Promotorregion, die durch den Androgenrezeptor aktiviert werden kann. Hinter dieser Promotorregion liegt das Luziferasegen des nordamerikanischen Leuchtkäfers Photinus pyralis (luc, 2387bp). Luziferasen sind Enzyme, die die Oxidation von Substraten, sogenannten Luziferinen, katalysieren. Die Leuchtkäfer-Luziferase benötigt für diese Reaktion den Kofaktor ATP. Das entstehende Produkt ist instabil. Beim Zerfall wird Licht emittiert, das mit Hilfe eines Lumino- 21 Material und Methoden II meters detektiert werden kann (Greer et al., 2002). Da der Androgenrezeptor die Expression und damit die Biosynthese der Luziferase aktiviert, ermöglicht die nach Substratzugabe gemessene Lichtmenge einen Rückschluss auf die Höhe der Rezeptoraktivität. Eine Übersicht der Promotorregion der nachfolgend beschriebenen Reportergene stellt Abb. 9 dar. (ARE)2-TATA-Luc Die Promotorregion von diesem Vektor besteht aus zwei Androgen-responsiven Elementen (AREs) und einer TATA-Box. Über diesen Promotor wird die cDNA der LeuchtkäferLuziferase androgen-abhängig exprimiert. Der (ARE)2-TATA-Luc Vektor wurde uns von G. Jenster et. al. zur Verfügung gestellt und war 1997 von diesen beschrieben worden. MMTV-Luc Der MMTV-Luc Vektor wurde von Organon (West-Orange, NJ, USA) bezogen. Die Promotorregion aus dem Mouse-Mammary-Tumor-Virus (MMTV) ist wie folgt aufgebaut: Am weitesten distal liegen vier Hormon-responsive Elemente, es folgen Bindungsstellen bestimmter Kofaktoren (NF-1, Oct-1) sowie eine TATA-Box (Truss und Beato, 1993). Über diesen Promotor kann das Gen der Leuchtkäfer-Luziferase durch verschiedene intrazelluläre Rezeptoren, wie auch den AR, aktiviert werden. PB-Luc Das Reportergen PB-Luc exprimiert das Gen der Leuchtkäfer-Luziferase über den RattenProbasin-Promotor. Probasin ist ein nukleäres und sekretorisches Protein, das in der dorsolateralen Prostata der Ratte Androgen-abhängig exprimiert wird. Der Promotor besteht aus zwei AREs, die zusammen die Anlagerung des AR und damit die Androgenkontrollierte Expression des Leuchtkäfer-Luziferasegens ermöglichen (Rennie et al., 1993). Der 454 bp umfassende Promotorbereich wurde durch PCR amplifiziert und über einen partiellen Verdau mit KpnI/HindIII in den pGL3-Classic Vektor von Promega integriert. Pem-Luc Pem-Luc ist ein Reportergen, das uns freundlicherweise von F. Claessens (Leuven, Belgien) zur Verfügung gestellt wurde. Der proximale Promotor des Pem-HomeoboxTranskriptionsfaktors der Maus war über die Schnittstellen NheI und HindIII in den pGL3Basic-Vektor von Promega integriert worden. Die Expression des Pem-HomeoboxTranskriptionsfaktors findet vor allem im Reproduktionstrakt der Maus, in den Sertolizellen des Hodens und den Nebenhoden, aber auch im Muskel und in der Plazenta statt (Barbu- 22 Material und Methoden II lesco et al., 2001, Lindsey und Wilkinson, 1996). Der Promotor enthält zwei Androgenresponsive Elemente, ARE1 und ARE2, und wird durch den AR selektiv aktiviert (Denolet et al., 2006). Abb. 9 Überblick über die Promotorregion der verwendeten Reportergene (ARE)2-TATA-luc, PB-Luc und Pem-Luc haben in ihrer Promotorregion spezielle Androgen-responsive Elemente (AREs), an die sich die DBD des AR anlagert und dadurch die Expression des nachfolgenden Luziferasegens (luc-Gen) in Gang setzt. Der MMTV-Luc (dargestellt nach Beato und Truss, 1993) besteht aus Hormon-responsiven Elementen, an die Glukokortikoid-, Progesteron-, Mineralokortikoid- und Androgenrezeptoren binden können. Der Promotor von pFR-Luc setzt sich aus fünf Hefe-Gal4-responsiven Elementen zusammen. Die DBD-LBD Two-Hybrid-Proteine können mit der DNA-Bindungsdomäne des Hefe-Proteins Gal4 an den Promotor binden und durch Protein-Protein-Interaktionen die Expressionskaskade des Luziferasegens starten. 1.3.3 Renilla-Luziferase Der phRG-TK Vektor von Promega (USA) kodiert für ein Luziferasegen (ruc, 1196bp) aus dem Nesseltier Renilla reniformis. Das Luziferasegen wird über einen Herpes-simplexVirus-Thymidin-Kinase(HSV-TK)-Promotor konstitutiv exprimiert. Diese Luziferase wird somit, im Gegensatz zu den Reportergenen, unabhängig von Hormon und Androgenrezeptor synthetisiert. Die Kotransfektion mit diesem Vektor ermöglicht daher eine Normalisierung nach der Transfektionseffizienz. 23 Material und Methoden II 1.3.4 Two-Hybrid-Plasmide Die verwendeten Two-Hybrid-Plasmide basieren auf den Vektoren des MammalianAssay-Kits von Stratagene (La Jolla, USA). Im Anhang befinden sich Plasmidkarten des pAD-NTD- und pBD-LBD-Vektors (Anhang 3.2 und 3.3) und eine tabellarische Auflistung der verwendeten Vektoren (Anhang 4.2. und 4.3). pAD-NTD-Vektoren Der pAD-NTD-Vektor enthält die Transkriptionsaktivierungsdomäne des Maus NF-κB Gens (AS 364-550) und konsekutiv im Leseraster die N-terminale Domäne des AR (AS 1536). Ein konstitutiv aktiver CMV-Promotor bedingt eine starke Expression dieses Fusionsgens nach Transfektion in Säugerzellen. Eine SV40 poly A-Sequenz signalisiert die Beendigung der Transkription und ist für die Polyadenylierung der mRNA wichtig. Durch Proteinbiosynthese entsteht ein Fusionsprotein aus der Transkriptionsaktivierungsdomäne von NF-κB und der AR-NTD. Die nukleäre Lokalisierungssequenz (NLS) des großen TAntigens (PKKKRKV) von SV40 ermöglicht den Transport des Fusionsproteins in den Zellkern. Ein pUC Replikationsursprung und ein Ampicillin-Resistenzgen ermöglichen die Vervielfältigung des pAD-NTD-Plasmids in E. coli. In den Versuchen finden die folgenden Vektoren Verwendung: pAD-NTD Wildtyp (Q20, G16; AR 1-536) und pAD-NTD mit den Mutationen Δ409-411, S411N und S432F sowie die Doppelmutanten pAD-NTD FQNAA (23-27) in Kombination mit den Mutationen Δ409-411, S411N und S432F. pBD-LBD-Vektoren Der pBD-LBD-Vektor kodiert ebenfalls für ein Fusionsprotein, das in Säugerzellen synthetisiert wird. Ein konstitutiv aktiver CMV-Promotor kontrolliert die Expression des Fusionsgens aus der DNA-Bindungsdomäne des Gal4-Hefeproteins (AS 1-147) und der Liganden-Bindungsdomäne des AR (AS 644-919). Eine SV-40-poly-A-Sequenz liefert das Signal für die Beendigung der Transkription des Fusionsproteins und ist für die Polyadenylierung der mRNA wichtig. Ein Kanamycin-Resistenzgen ermöglicht die selektive Vervielfältigung der Vektoren in E. coli. In den Versuchen finden die folgenden Vektoren Verwendung: pBD-LBD Wildtyp und pBD-LBD mit den folgenden Mutationen: L712F, L723S, Q798E, P904S, F916X und H917R. Reportergen pFR-Luc Der Vektor enthält einen synthetischen Promotor, der sich aus fünf hinter einander angeordneten Hefe-Gal4-Bindungsstellen zusammensetzt. Über diesen Promotor wird die Ex- 24 Material und Methoden II pression des dahinter liegenden Luziferasegens von Photinus pyralis kontrolliert (luc, 2387 bp; siehe Abb. 9). Kontrollplasmide pBD-P53 und pAD-SV40T Die Transfektion des pBD-P53-Vektors in Säugerzellen führt zur Expression eines Fusionsproteins aus der Gal4-DNA-Bindungsdomäne und den AS 72-390 des murinen p53Proteins. Das pAD-SV40T-Plasmid kodiert für ein Fusionsprotein aus der Transaktivierungsdomäne von NF-κB und den Aminosäuren 84-708 des großen-T-Antigens von SV40. Werden beide Plasmide kotransfektiert, interagieren die beiden Fusionsproteine in den Säugerzellen miteinander und führen durch Anlagerung an die Gal4-responsiven Elemente des pFR-Luc-Reportergens zu einer Transkription der Leuchtkäfer-Luziferase. Für die Expression der Luziferase sind die in jeder Säugerzelle vorhandenen Transkriptionsfaktoren ausreichend, daher werden die Plasmide pBD-P53 und pAD-SV40T als Positivkontrolle verwendet. Die Kotransfektion von pBD-LBD mit pAD-SV40T, bzw. pBD-P53 mit pAD-NTD wurde in dieser Arbeit als Negativkontrolle verwendet. Diese Fusionsproteine können in-vivo nicht miteinander interagieren. Erst die spezifische Proteininteraktion zwischen Wildtyp-LBD und Wildtyp-NTD, oder auch P53 und SV40T, führt zu einer relevanten Expression des Reportergens. 1.3.5 Kofaktoren des Androgenrezeptors BAG1L in pcDNA3 Der Vektor BAG1L in pcDNA3 wurde uns freundlicherweise von G. Packham (Southampton, UK) zur Verfügung gestellt. Die Herstellung wurde in der Veröffentlichung von Cutress et al. (2003) beschrieben. In den Vektor ist die cDNA des Kofaktors BAG1L integriert. Dieser wird über einen CMV-Promotor nach Transfektion in Säugetierzellen stark exprimiert. SRC1e in pSG5 Dieser Expressionsvektor von Dr. F. Claessens (Leuven, Belgien), beschrieben in Kalkhoven et. al. (1998), enthält die vollständige Sequenz des Kofaktors SRC1e. Die Expression von SRC1e wird über einen SV40-Promotor reguliert. 1.3.6 Andere Plasmide Füllplasmid pTZ 19 pTZ 19 ist ein synthetischer Klonierungsvektor der Firma GE Healthcare (Großbritannien). In den Transfektionsversuchen wurde er als Füllplasmid eingesetzt, da er in seiner hier 25 Material und Methoden II verwendeten Rohform in Säugetierzellen keine Genexpression initiiert. Ein AmpicillinResistenzgen ermöglicht die selektive Bakterienanzucht zur Vervielfältigung des Vektors. Klonierungsvektor pCR® 4Blunt-TOPO® Der pCR® 4Blunt-TOPO® Vektor wurde von Invitrogen (Karlsruhe) bezogen. Die Vektoren liegen in linearisierter Form vor. Jeweils das 3’ Ende ist durch eine kovalent gebundene Topoisomerase I für die Ligation vorbereitet. Durch Ligation wurden PCR-Amplifikate ohne überhängende Enden in den Vektor integriert. Der Vektor enthält das für E. coli letale Gen ccdB in Fusion mit dem C-Terminus des LacZα-Gens. Durch Einfügen eines PCRAmpflifikats wird die Expression des letalen Gens unterdrückt. Hierdurch wird eine direkte Selektion rekombinanter Vektoren erreicht. Eine Plasmidkarte dieses Vektors befindet sich im Anhang (Anhang 3.4). 2. Methoden 2.1 Bakterienkultur 2.1.1 Agarplatten für die Anzucht von Bakterienkulturen Für die Bakterienanzucht wurden Agarplatten verwendet. Hierzu wurden 13 Kapseln LB Medium (QBiogene, USA) mit 7,5 g Select Agar (Invitrogen, USA) in 500 ml Aqua dest. bei 121 °C autoklaviert. Bevor der Agar in Petrischalen gegossen wurde, wurde er entweder mit 150 µg/ml Ampicillin oder 50 µg/ml Kanamycin versetzt. Nach Abkühlen und Aushärten erfolgte die weitere Lagerung bei 4 °C. 2.1.2 Bakterienflüssigkulturen Die Anzucht der Bakterien in Flüssigkulturen erfolgte in LB-Medium. Hierfür wurden 13 Kapseln (QBiogene, USA) mit 500ml Aqua dest. in einer Flasche bei 121 °C autoklaviert und nach dem Abkühlen verwendet. Die Anzucht erfolgte bei 37 °C in einem Schüttelinkubator in Volumina von 10 ml mit 100 µg/ml Ampicillin, bzw. 50µg/ml Kanamycin, je nach Resistenz des Bakterienstammes. Wurde eine höhere Bakterienzahl benötigt, wurden die 10 ml Kulturen nach ungefähr sechs Stunden in Maxikulturen mit 250 ml LB-Medium mit der entsprechenden Menge Antibiotikum überführt. 2.1.3 Glyzerolstocks zur Lagerung der Bakterienstämme Die Lagerung der Bakterienstämme erfolgte in Glyzerolstocks. Hierzu wurden zunächst 900 µl 60 %-iges Glyzerol in 2 ml CryoTubes (Nunc) vorgelegt und bei 121 °C autokla- 26 Material und Methoden II viert. Bakterien wurden über Nacht in Flüssigkultur inkubiert. Am Folgetag wurden 900µl der Bakteriensuspension entnommen und mit dem vorgelegten Glyzerol gut gemischt. Die Tubes wurden sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die weitere Lagerung erfolgte bei -80 °C. 2.1.4 Herstellung von DH5αF’ kompetenten E. coli Kompetente E. coli wurden nach der „simple and efficient method“ (einfache und effiziente Methode) von Inoue et al., 1990 hergestellt. Hierzu wurden DH5αF’ E. coli aus den Glyzerolstocks auf Agar ohne Antibiotikum ausgestrichen und über Nacht im Wärmeschrank (37 °C) inkubiert. Eine Einzelkolonie wurde in eine 10 ml Vorkultur mit LB-Medium ohne Antibiotikum überführt und über Nacht bei 37 °C schüttelnd inkubiert (200rpm). 8 ml der Vorkultur wurden in 250 ml auf 37 °C erwärmtes SOB-Medium inklusive 20 mM Mg2+ (siehe Tbl. 2) für 1,5 bis 3 h bei 37 °C schüttelnd inkubiert bis zu einer OD600 von 0,6. Nachdem sie für 10 min auf Eis gekühlt worden waren, wurden die Bakterien im vorgekühlten GS3 Rotor in der RC-5B-Superspeed-Zentrifuge (Sorvall, Fisher Scientific) bei 2700xg und 4 °C für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Bakterienpellet mit 80 ml kaltem TB-Puffer (10 mM Pipes, 55 mM MnCl2, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl, pH 6,7) auf Eis resuspendiert und wieder wie oben zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend mit 20 ml kaltem TB-Puffer resuspendiert. Tropfenweise wurde 1,4 ml DMSO als Gefrierschutz (f.c. 7 %) zugegeben und die Suspension für weitere 10 min auf Eis inkubiert. Jeweils 200 µl der Bakteriensuspension wurden in 1,5 ml Tubes gegeben. Die Tubes wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und in Folge bei -80 °C gelagert. SOB-Medium (pH 7) für die Transformation von Bakterien Select Peptone / Tryptone 20 g/l Hefeextrakt 5 g/l Natriumchlorid 10 mM (0,5 g/l) Kaliumchlorid 2,5 mM (0,2g/l) 2 M MgCl2 Lösung 20 mM (erst direkt vor Gebrauch zugeben) Tbl. 2 SOB-Medium 2.1.5 DNA-Minipräparation Dieses Verfahren wurde zur Isolation kleinerer Mengen Plasmid-DNA verwendet und kam zum Einsatz, um neue Plasmide durch anschließende Sequenzierung auf Fehler zu überprüfen. Die Bakterien wurden aus den Glyzerolstocks oder nach Transformation auf Agar- 27 Material und Methoden II platten ausgestrichen und über Nacht im Wärmeschrank bei 37 °C inkubiert. Eine Einzelkolonie wurde dann in eine Flüssigkultur überführt und über Nacht bei 37 °C und 200 rpm im Schüttelinkubator angezüchtet. 1800 µl der Flüssigkultur wurden in ein 2 ml Tube pipettiert und in der Centrifuge 5417R (Eppendorf) für eine Minute bei 20000xg abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Plasmid DNA wurde, nach den Empfehlungen des Herstellers, mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) aus dem Pellet extrahiert. Mit diesem Verfahren konnten durchschnittlich ungefähr 3 µg Plasmid-DNA in 50 µl EB Puffer (10mM TrisCl, pH 8,5) isoliert werden. 2.1.6 Herstellung Endotoxin-freier Plasmid-DNA Die durch Sequenzierung kontrollierte Plasmid-DNA wurde nun für die Transfektionen in größerer Menge und möglichst hoher Reinheit benötigt. Hierzu wurde das EndoFreePlasmid-Maxi-Kit (Qiagen) verwendet, bei dem die extrahierte DNA keine Endotoxine enthält. Die Bakterienanzucht auf Agarplatten und in Flüssigkultur erfolgte wie bereits beschrieben (siehe 2.1.1 bis 2.1.2). Die Maxikulturen wurden über Nacht bei 37 °C im Schüttelinkubator bei 200 rpm inkubiert. In der RC-5B-Refrigerated-Superspeed-Zentrifuge mit GS3 Rotor von Sorvall® wurden die Maxikulturen für 20 Minuten bei 4 °C und 6000xg abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das weitere Vorgehen erfolgte nach den Empfehlungen des Herstellers. Bei diesem Verfahren konnten durchschnittlich 500 µg Plasmid-DNA in 200 µl TE-Puffer extrahiert werden. Die in den Versuchen verwendete Plasmid-Arbeitsverdünnung wurde mit TE-Puffer aus dem EndoFree-Plasmid-Maxi-Kit hergestellt. Die Lagerung der Endotoxin-freien Plasmid-DNA erfolgte bei -20 °C. 2.1.7 Photometrische Bestimmung der DNA Die DNA-Konzentration sowie der Reinheitsgrad der Mini- und Maxipreps wurde in Verdünnung mit TE-Puffer (EndoFree-Maxi-Kit, Qiagen) mit dem Bio-Photometer (Eppendorf) bestimmt. Die Absorption von DNA, RNA, Oligo- und Mononukleotiden wird bei 260 nm detektiert. Bezogen auf eine Küvettenschichtdicke von 1 cm entspricht eine Absorption von 1 OD bei 260 nm ca. 50 µg/ml doppelsträngiger DNA. Da Proteine bei 280 nm absorbieren, können Verunreinigungen durch die Ratio E260/E280 abgeschätzt werden. Bei reiner DNA sollte der Quotient 1,8 betragen. 2.2 Sequenzierung der Plasmid-DNA 2.2.1 Sequenzierung nach der Didesoxymethode Die Didesoxymethode nach Sanger ist ein Verfahren zur Analyse von DNA-Sequenzen, das auf dem Prinzip des Kettenabbruchs beruht. Im Puffer liegen dNTPs und je nach Ba- 28 Material und Methoden II se unterschiedlich fluoreszenzmarkierte ddNTPs in einem bestimmten Verhältnis vor. Wird in den neu synthetisierten Strang ein ddNTP, das keine 3’OH-Gruppe besitzt, eingebaut, bewirkt dies den Kettenabbruch. Nach der Fällung kann die DNA über die fluoreszierenden Farbstoffe der abgebrochenen Stränge analysiert werden. Die Sequenzierungen wurden mit dem BigDye®-Terminator-v1.1-Cycle-Sequencing-Kit (ABI, USA) nach den Empfehlungen des Herstellers, durchgeführt . Das verwendete PCR-Programm ist im Anhang (Anhang 7.) dargestellt. In einem Thermocycler erfolgte die Strangsynthese zyklisch ausgehend von einem Primer. 2.2.2 Fällung der DNA Zum 20 µl Sequenzierungsansatz wurden 80 µl Aqua dest., 10 µl 3 M Na-Acetat (pH 5) und 250 µl Ethanol (100 %) zugegeben und gemischt. Die Probe wurde für 10 min bei 18000xg zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zum Pellet wurden nun 180 µl Ethanol (70 %) pipettiert, das Pellet resuspendiert und wieder 10 min bei 17949 g zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstands wurde die DNA bei 37 °C getrocknet. Abb. 10 Schematische Darstellung der Basen-Detektion im Kapillarsequenzierer Die DNA-Fragmente aus der Sequenzierungsreaktion werden in der Kapillare elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend mittels Laser detektiert. Jedes Fragment schließt mit einem ddNTP ab, das den Kettenabbruch bewirkt. Je nach Base sind die ddNTPs mit vier verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Somit kann die Farbinformation in die Basensequenz übersetzt werden. Im Chromatogramm (rechts oben) lassen sich die verschiedenen Basen zuordnen, die Höhe der Peaks korreliert mit der Signalstärke. 2.2.3 Analyse der Sequenz Die Analyse der DNA erfolgte im 4-Kapillarsequenzierer 3130-Genetic-Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi). In diesem wurden die unterschiedlich langen DNA-Stränge elektrophoretisch aufgetrennt und der Fluoreszenzfarbstoff durch einen Laser detektiert (Abb. 10). Diese Informationen wurden in ein Chromatogramm übersetzt, das anschließend mit 29 Material und Methoden II der Software Sequence-Analysis 5.2 (ABI, USA) und SeqManager, Lasergene 6.0 (DNAStar, USA) ausgewertet wurde. 2.3 Klonierung der Plasmid-Vektoren Die Klonierung stellt ein molekularbiologisches Verfahren dar, mit dem DNA-Sequenzen, zum Beispiel die cDNA des AR, in einen Vektor integriert werden. Dieser Vektor wird in bestimmte Bakterien transformiert und in diesen selektiv vermehrt. In den hier vorgenommenen Klonierungsarbeiten wurden Plasmid-Vektoren, Derivate natürlicher ResistenzPlasmide, eingesetzt und in kompetente E. coli Stämme transformiert. Im Folgenden sind zunächst die grundlegenden Verfahren geschildert. 2.3.1 PCR-Mutagenese Das Prinzip der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) besteht darin, mit Hilfe eines definierten Primer-Paares und einer hitzebeständigen Polymerase ein bestimmtes DNA-Segment in-vitro zu amplifizieren. Hierbei werden mit Hilfe eines Thermocyclers die Phasen der Denaturierung, der Primer-Anlagerung und der Elongation zyklisch durchlaufen, wodurch sich das Amplifikat exponentiell vervielfältigt. Mit Hilfe dieser Methode wurden die Two-Hybrid-Vektoren der LBD hergestellt. Die proofreading Phusion-High-Fidelity-DNA-Polymerase (Finnzymes, Finnland) wurde verwendet, um Fehler in der Strangsynthese zu vermeiden. Nach der PCR im Mastercycler-Gradient (Eppendorf) wurde das Amplifikat im Agarose-Gel überprüft und dann mit Hilfe des Cloning-Kits-for-Sequencing (Invitrogen, USA) in den Zero-Blunt-TOPO-pCR4-Vektor (Invitrogen, USA) eingebracht. Die Plasmide wurden in One-Shot-TOP10- E. coli transformiert, vervielfältigt und abschließend sequenziert. Aus dem Zero-Blunt-TOPO-pCR4Vektor erfolgte dann die weitere Umklonierung durch Restriktion und gerichtete Klonierung. Das verwendete PCR-Programm und eine Auflistung der Primer ist im Anhang zu finden (Anhang 2. und 5.). 2.3.2 Restriktion und Auftrennung im Agarose-Gel Die Restriktion wird in der Molekularbiologie eingesetzt, um DNA-Stränge an definierten Stellen zu schneiden. Hierfür werden Restriktionsenzyme verwendet, die bestimmte DNASequenzen erkennen und die DNA dort durchtrennen (Abb. 11). Die verwendeten Restriktionsenzyme wurden von New England BioLabs (USA) bezogen und nach den Empfehlungen des Herstellers mit den zugehörigen Puffern verwendet. Es wurden solche Enzyme ausgewählt, deren Schnittstellen im Vektor nur einmalig vorkamen und die überhängende Enden produzierten. Dadurch konnten die DNA-Stränge im nächsten Schritt wieder gerichtet mit einer Ligase verbunden werden. Es wurde ein Restrikti- 30 Material und Methoden II onsansatz von 50 µl nach den Empfehlungen des Herstellers angesetzt. Nach der Restriktion wurde der Ansatz mit 10 µl 6x Ladepuffer (30 % Glyzerol, 0,25 % Bromphenolblau) auf ein präparatives Agarose-Gel auf TBE-Basis (90 mM Tris, 90 mM Borsäure, 25 mM EDTA+Na; pH 8) aufgetragen und für eine Stunde bei 8-10 V/cm der Größe nach aufgetrennt. Insert und Vektorbanden wurden einzeln aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem High-Pure-PCR-Product-Purification-Kit (Roche, USA) nach den Angaben des Herstellers aufgereinigt. Abb. 11 Restriktion und Ligation Die Restriktionsenzyme schneiden doppelsträngige DNA an definierter Stelle (Pfeile). Vektor und Insert können durch Agarose-Gel-Elektrophorese in zwei Banden aufgetrennt und einzeln eluiert werden. Für die Ligation kann nun ein Insert, das dieselben überhängenden Enden besitzt, durch eine Ligase mit dem Vektor verbunden werden. Es entsteht ein rekombinanter Vektor. 2.3.3 Ligation Bei der Ligation werden zwei DNA-Enden über eine Phosphodiesterbindung vom 3’ OHEnde zum 5’ Phosphat-Ende mit Hilfe einer Ligase verbunden (Abb. 11). Im Ligationsansatz wurde die Vektor-DNA mit dem „neuen“ Insert in einem molaren Verhältnis von Insert zu Vektor von 5:1 bis 3:1 angesetzt und über Nacht bei 16 °C mit der T4-DNA Ligase (NEB, USA) nach Angaben des Herstellers ligiert. 2.3.4 Transformation in DH5αF’ kompetente E. coli Transformation bezeichnet das Einbringen von Vektor DNA in Wirtszellen. Die durch Restriktion und Ligation neu konstruierten Plasmide wurden mit diesem Verfahren in kompetente E. coli Zellen eingebracht. Dies ermöglichte die Lagerung in Glyzerolstocks und die selektive Vervielfältigung durch Bakterienanzucht. Hierzu wurden 10 µl des Ligationsansatzes auf 200 µl kompetente E. coli Bakterien gegeben und der Ansatz für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Ein Hitzeschock von 30 Sekunden im Wasserbad bei 42 °C führte zum Eindringen der Plasmide in die Bakterien. Im Anschluss wurde der Ansatz wieder für 2 min auf Eis gekühlt und dann mit 800 µl SOB-Medium (siehe Tbl. 2) für eine Stunde mit 31 Material und Methoden II dem Thermomixer-Comfort (Eppendorf) schüttelnd inkubiert. Die Bakterienkultur wurde nun auf LB-Agarplatten mit Ampicillin oder Kanamycin ausgestrichen und über Nacht im Wärmeschrank bei 37 °C inkubiert. Durch den Antibiotikazusatz wurden die nicht transformierten E. coli am Wachstum gehindert (Abb. 12). Einige der transformierten Einzelkolonien wurden anschließend in Flüssigkulturen einen weiteren Tag angezogen. Aus diesen wurden Glyzerolstocks angelegt, die im -80 °C Schrank gelagert wurden und Minipräparationen für die Sequenzierung durchgeführt. Abb. 12 Prinzip der Transformation und Amplifikation in Bakterien Plasmide (rot) werden durch Transformation in Bakterienzellen (E. coli) eingeschleust (oben). Dieser Vorgang gelingt nicht bei allen vorhandenen Bakterienzellen (rechts). Zur Selektion werden die Bakterien auf LB-Agar mit einem Antibiotikum ausgestrichen. Nur die Bakterien mit Plasmid haben eine Resistenz und können Kolonien bilden (Mitte). Werden die gewachsenen Bakterien weiter kultiviert kann die Plasmid-DNA aus ihnen extrahiert werden (unten). 2.4 Klonierungsstrategien Im Folgenden werden die Klonierungsstrategien der in den Transfektionsversuchen verwendeten Plasmide dargestellt. 2.4.1 pSVAR Konstrukte Die Mutationen P723S und P904S wurden durch PCR-Mutagenese mit dem Quickchange-site-directed-mutageneses-Kit (Stratagene, USA) nach den Angaben des Herstellers in den pSVAR0 Vektor eingebracht. Hierfür wurden die Mutagenese-Primer P723S-up 32 Material und Methoden II + P723S-low sowie P904S-up und P904S-low und pSVAR0 als Template verwendet. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind im Anhang zu finden (Anhang 2.). Durch Sequenzierung wurden die entstandenen Klone überprüft. Um weitere Mutationen ausschließen zu können, wurde eine Restriktion mit Tth111I und BamHI durchgeführt und das so entstandene Insert in den Wildtyp-Vektor umkloniert. Insert und die Vektorübergänge wurden durch Sequenzierung auf Mutationen untersucht. Die Herstellung der C-terminalen Mutationen F916X und H917R erfolgte ebenfalls mittels PCR. Als Template diente der pSVAR0. Über die Primer-Paare AR-Kpn_fw + F916XBamHI und AR-Kpn_fw + H917R-BamHI wurde die Mutation in das Amplifikat eingebracht. Das entstandene DNA Fragment wurde mit dem Zero-Blunt-TOPO-pCR4-CloningKit (Invitrogen, Karlsruhe) in den pCR4-TOPO-Vektor subkloniert und durch Sequenzierung überprüft. Die Reklonierung in den pSVAR0 erfolgte gerichtet über die Schnittstellen von Tth111I und BamHI. 2.4.2 AR-NTD-Konstrukte Der Vektor pAD-NTD wurde mittels PCR-Mutagenese konstruiert. Es wurden die Primer HindIII-AR1 und AR536-TAG-BamHI und der pSVAR0 als Template verwendet, um die NTD selektiv zu amplifizieren. Das entstandene Amplifikat wurde in den Zero-BluntTOPO-pCR4-Cloning-Vektor (Invitrogen, Karlsruhe) nach Anleitung des Herstellers kloniert. Über die HindIII und BamHI Schnittstellen wurde die NTD im Leseraster mit der NFκB-Domäne in den pCMV-AD-Vektor (Stratagene, USA) integriert. Die Mutationen S411N und Δ409-411 wurden mittels Restriktion mit BstEII und RsrII im Doppelverdau aus ihren AR-Expressionsvektoren isoliert und in den pAD-NTD-Vektor eingebracht. Die Sequenzen wurden mit den Primern GGN5up und T7 verifiziert. Die Mutation S432F wurde über eine zweischrittige Klonierung aus dem pSVAR-S432F in den pAD-NTD-Vektor überführt. Über die BstEII und KpnI Schnittstellen wurde die Mutation in den Vektor pSV02-AR-NTD subkloniert. Der pSV02-AR-NTD Vektor ist eine Variante von pSVAR0; statt des AR ist die NTD (AS 1-536) eingefügt. Über die HindIII + XbaI Schnittstellen wurde die Mutation S432F in den pAD-NTD-Vektor eingebracht. Die Umklonierung in den pSV02-AR-NTD war nötig, da der pSVAR0 mehrere HindIII Schnittstellen besitzt. Mit den Primern hAR-GGN1s und T7 wurde die Klonierung auf Fehler überprüft. Die drei N-terminalen Mutationen wurden in einigen Versuchen mit dem FQNAA-Motiv (AS 23-27 des AR) kombiniert. Durch Doppelverdau des pAD-NTD-FQNAA-Vektors mit HindIII und KasI wurde die FQNAA-Sequenz isoliert und konnte über dieselben Schnittstellen in die pAD-NTD-Vektoren mit N-terminaler Mutation integriert werden. Mit den Primern hARseq2 und T7 wurden die Vektoren zur Kontrolle sequenziert. 33 Material und Methoden II 2.4.3 AR-LBD-Konstrukte Die ursprüngliche oder mutierte AR-LBD wurde über das Primer-Paar HindIII-LBD644 und pSV02-seq-as amplifiziert. Als Template diente die jeweilige pSVAR-Vektor-DNA. Das Amplifikat wurde anschließend in den Zero-Blunt-TOPO-pCR4-Cloning-Vektor (Invitrogen, USA) subkloniert. Die Vektoren wurden mittels Sequenzierung verifiziert. Über einen Doppelverdau mit HindIII und PstI wurde die LBD in Fusion mit der Gal4-DNABindungsdomäne in den pCMV-BD-Vektor (Stratagene, USA) eingebracht. Auf diese Weise wurden pBD-LBD Wildtyp sowie die Mutanten L712F, P723S, Q798E und P904S konstruiert und mit den Primern pBD-5’-seq und T7 auf Fehler untersucht. Für die Klonierung der LBD H917R und F916X wurden spezielle Primer verwendet. So wurde die PCR-Mutagenese mit den Primern HindIII-LBD644 und LBD_H917R bzw. LBD_F916X durchgeführt. Das weitere Vorgehen erfolgte wie bei den anderen LBDKonstrukten. 2.5 Zellkultur für CHO- und HeLa-Zellen Zunächst wird die Herstellung der verwendeten Kulturmedien beschrieben. Danach folgen die Methoden der Zellaussaat, der Anzucht und des Einfrierens. Alle Arbeiten an der Zellkultur wurden unter sterilen Bedingungen vorgenommen. Bei beiden Zelllinien konnten die gleichen Methoden verwendet werden. 2.5.1 Medien für die Zellkultur Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) von Sigma wurde nach den Anleitungen des Herstellers hergestellt (DMEM-Pulver für 5 l mit 6 g NaHCO3 (MG 84,01 g) in 5 l Aqua dest., pH 7,3), steril filtriert und bei 4 °C gelagert. Um ein gutes Wachstum der Zellen zu gewährleisten, wurden zu 500 ml DMEM 50 ml steroidfreies fetales Kälberserum (DCCFCS) zugegeben. Das Kulturmedium wurde bei 4 °C gelagert und vor Verwendung im Wasserbad auf 37 °C erwärmt. Zum Einfrieren der Zellen wurde DMEM mit 10 % DMSO (Einfriermedium) versetzt. 2.5.2 Herstellung von steroidfreiem fetalen Kälberserum Um fetales Kälberserum (FCS) von seinen hormonellen Bestandteilen zu befreien, wurde das folgende Verfahren verwendet. Aus 200 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer, 5 g Aktivkohle und 0,5 g Dextran wurde eine Suspension hergestellt. Diese wurde bei 4 °C über Nacht gerührt, wodurch die Aktivkohle das Dextran adsorbierte. Am Folgetag wurde die Suspension in vier 50 ml Röhrchen aliquotiert, für 10 min bei 2704 g und 4 °C abzentrifugiert und der Überstand verworfen. 34 Material und Methoden II Zwei Kohle-Pellets wurden nun mit 500 ml FCS resuspendiert. Die Mischung wurde für 2 h bei 0 °C langsam gerührt. Während dieser Zeit adsorbierte die mit Dextran umhüllte Aktivkohle selektiv die hormonellen Bestandteile und kleineren Verunreinigungen des FCS. Die Kohle wurde durch das Absaugen durch einen Filter entfernt. Die zweistündige Inkubation wurde mit den beiden übrigen Kohle-Pellets wiederholt und die Kohle durch einen Filter zweimal abgesaugt. Das nun steroidfreie FCS (DCC-FCS) wurde dreimal steril filtriert und in 50 ml Aliquots bei -20 °C aufbewahrt. 2.5.3 Auftauen und Anziehen der Säugerzellen Säugerzellen wurden, aus flüssigem Stickstoff, im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und anschließend in 10 ml 37 °C warmes Kulturmedium (DMEM10% DCC-FCS) aufgenommen. Für 10 min wurden sie bei 1500 rpm abzentrifugiert und in frisches Kulturmedium überführt, um Reste des DMSO-haltigen Einfriermediums zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen mit 30 ml Kulturmedium auf Zellkulturflaschen der Größe 175 cm2 verteilt. Das Nährmedium wurde 3 Mal wöchentlich gewechselt. Die Zellkulturflaschen wurden in einem Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. 2.5.4 Trypsinieren und Zählen der Säugerzellen Sowohl HeLa-, als auch CHO-Zellen haben eine hohe Teilungsrate, so waren die 175 cm2 Flaschen beim Aussäen von 2 Millionen Zellen nach 2-4 Tagen zu 90 % konfluent. Das Kulturmedium wurde abgesaugt, und die Zellen wurden zunächst mit 37 °C warmem PBS gewaschen. Danach wurden sie kurz mit 3 ml 0,05 % Trypsin-EDTA inkubiert, um sie vom Flaschenboden zu lösen. Mit 10 ml Serum-haltigem Kulturmedium wurde diese Reaktion abgestoppt, und die Zellen wurden in ein Harre-Röhrchen überführt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 1500 rpm wurden die Zellen in frisches Kulturmedium aufgenommen und in neue Zellkulturflaschen ausgesät. Für die Transfektionen, bei denen die Aussaat einer definierten Zellzahl wichtig war, wurden die Zellen 1:1 mit Trypanblau verdünnt und in einer Neubauer Zählkammer ausgezählt. 2.5.5 Einfrieren der Säugerzellen Zum Einfrieren wurden die Zellen zunächst wie oben beschrieben trypsiniert. Ungefähr 2 Millionen Zellen wurden nach der Zentrifugation in 1,5 ml kühles Einfriermedium (DMEM10% DMSO ) aufgenommen und mit dem Nalgene-Cryo-Einfriergerät im -80 °C Ge- frierschrank um 1 °C pro Minute heruntergekühlt. Nach 24 Stunden wurden sie in flüssigen Stickstoff überführt und bei -196 °C gelagert. 35 Material und Methoden II 2.6 Transfektionen Transfektionen wurden durchgeführt, um die Transaktivität des AR, die N/C-terminale Interaktion und die Interaktion des AR mit Kofaktoren zu untersuchen. Dieses Unterkapitel beginnt mit der Beschreibung des Verfahrens an sich. Es folgen Beschreibungen zum Aufbau der einzelnen Versuche. Der genaue Ablauf einer Transfektion wird beispielhaft anhand des Versuches zur Transaktivität dargestellt. 2.6.1 Das Prinzip der transienten Transfektion Als transiente Transfektion bezeichnet man das zeitweilige Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische Zellen. Es gibt verschiedene Verfahren, die das Übertreten von DNA durch die Zellmembran ermöglichen. In den durchgeführten Versuchen wurde das lipidbasierte Multikomponenten Transfektionsreagenz FuGene HD (Roche) eingesetzt. Das Transfektionsreagenz bildet mit der Plasmid-DNA Lipid-DNA-Komplexe aus, die mit der Zellmembran fusionieren, wodurch die Fremd-DNA in das Zellinnere gelangt. Durch dieses Verfahren wird eine hohe Transfektionseffizienz erreicht, ohne größeren physikalischen Stress auf die Zellen auszuüben. 2.6.2 Bestimmung der Transaktivität des Androgenrezeptors Um Einschränkungen in der Funktion des Androgenrezeptors durch die verschiedenen Mutationen aufzuzeigen, wurden Reportergen-Modelle eingesetzt. Hierzu wurde das Gen des AR (pSVAR) mit einem Reportergen in CHO- oder HeLa-Zellen kotransfektiert. Über den SV40-Promotor wurde der AR stark exprimiert und synthetisiert. Durch die Zugabe von DHT wurde der AR aktiviert und bewirkte durch Rekrutierung weiterer Kofaktoren die Transkription des vorliegenden Luziferase-Reportergens (aus Photinus pyralis). Die Aktivität dieser Luziferase zeigte somit an, inwieweit das Reportergen vom AR aktiviert werden konnte. Um verschiedene Versuche vergleichbar machen zu können, wurde die konstitutiv exprimierte Luziferase der Renilla reniformis (phRG-TK) kotransfektiert. Nach Lysieren der Zellen wurde mit dem Dual-Luciferase®-Reporter-Assay-System von Promega die Aktivität der beiden Luziferasen getrennt detektiert. Indem der Quotient aus der Aktivität der Photinus-Luziferase und der Aktivität der Renilla-Luziferase gebildet wurde, konnten die Ergebnisse nach der Transfektionseffizienz normalisiert werden. Das Hormon DHT wurde in aufsteigenden Konzentrationen zugegeben, um differenziert die Hormonbindung des AR, die durch Mutationen verändert sein kann, aufzeigen zu können. Hierzu wurden die folgenden Endkonzentrationen eingesetzt: kein DHT, 0,001 nM DHT, 0,01 nM DHT, 0,1 nM DHT, 1 nM DHT, 10 nM DHT und 100 nM DHT. Mit die- 36 Material und Methoden II sem Spektrum wurde der Bereich von keinem Hormon bis zu supraphysiologischen Mengen abgedeckt. Die Versuche wurden jeweils in Triplikaten mit mindestens 3 unabhängigen Wiederholungen durchgeführt. Die Auswertung der Messdaten erfolgte mit Excel (Microsoft, USA). Dabei wurde der Mittelwert der bei 10 nM DHT gemessenen Werte des Wildtyp AR als 100 % angesetzt. Die übrigen Messwerte wurden im entsprechenden Verhältnis dazu angegeben. 2.6.3 Transfektion und Detektion der Luziferaseaktivität In Greiner bio-one-CELLSTAR-24-Well-Platten wurden 80 000 CHO-Zellen oder 50 000 HeLa-Zellen in 500 µl Kulturmedium (DMEM + DCC-FCS) pro Well ausgesät. Über Nacht wurden die Zellen im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Transfektion wurde am nächsten Tag vorgenommen. Pro Well wurden 30 ng pSVAR (mit oder ohne Mutation), 200 ng Reportergen ((ARE)2-TATA-, MMTV-, Pem- oder PBLuc) und 5 ng phRG-TK in 100 µl DMEM mit 0,5 µl FuGene HD (Roche) transfektiert. Um eine hohe Transfektionseffizienz zu erreichen, wurde zunächst das FuGene bei Raumtemperatur für 5 min in DMEM inkubiert und dann die DNA zugegeben. Nach weiteren 20 min wurde das DMEM-FuGene-DNA-Gemisch, in dem sich inzwischen Lipid-DNAKomplexe ausgebildet hatten, auf die Wells gegeben. Die Komplexe fusionierten nun mit den Zelloberflächen, und die Plasmid-DNA wurde in das Zellinnere aufgenommen. Es folgte eine fünfstündige Inkubation im Brutschrank. Anschließend wurde durch Zugabe von DHT-Ethanol-Lösungen eine Hormonreihe mit ansteigenden DHT-Konzentrationen (siehe 2.6.2) hergestellt. Um toxische Zellschäden durch Ethanol zu vermeiden, wurden die Lösungen mit DMEM soweit verdünnt, dass in den Wells eine Ethanolendkonzentration von 0,1 Promille vorlag. Nach Hormonzugabe wurden die Zellen für weitere 18 h bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Für die Zelllyse wurde zunächst das Kulturmedium abgesaugt, und die Wells wurden zwei Mal mit je 1 ml PBS gespült. Pro Well wurden 100 µl Passive-Lysis-Puffer (Promega) zugegeben. Nach 20 min Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Schüttler wurden je 25 µl der Lysate in eine Costar-Assay-Plate (96-Well; Corning, USA) überführt. Die Messung im Luminometer-Lucy-3 (Anthos Mikrosysteme, Krefeld) wurde mit dem Dual-Luziferase-Reporter-Assay-System (Promega) nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Das Substrat Luziferase-Assay-Reagenz-II ermöglichte die Erfassung der Leuchtkäfer-Luziferase-Aktivität (Abb. 13A). Das Stop&Glow-Reagenz detektierte nachfolgend die Aktivität der Renilla-Luziferase, die Androgen-unabhängig, konstitutiv, exprimiert wird (Abb. 13B). Das Messprogramm ist im Anhang zu finden (Anhang 6.). 37 Material und Methoden II Abb. 13 Luziferase-Reaktionen Die Aktivitäten der Luziferasen werden mit Hilfe von zwei Reagenzien im Luminometer detektiert. Das Luzife2+ rase-Assay-Reagenz-II enthält das Leuchtkäfer-Luziferin sowie Adenosintriphosphat (ATP) und Mg . Die Leuchtkäfer-Luziferase katalysiert die unter A) dargestellte Oxidation, das dabei entstehende Licht wird im Luminometer gemessen und korreliert mit der Expression der Reportergene. Das Stop&Glow-Reagenz enhält Coelenterazin, das von der Renilla-Luziferase ebenfalls oxidiert wird B). Auch bei dieser Reaktion wird Licht emittiert. Die Renilla-Luziferase wurde konstitutiv über einen HSV-TK-Promotor exprimiert. Die gemessene Aktivität der Renilla-Luziferase wurde für die Normalisierung nach Transfektionseffizienz verwendet. 2.6.4 Bestimmung der N/C-terminalen Interaktion Auf die Interaktion zwischen der NTD und LBD des Androgenrezeptors wurde bereits im ersten Teil dieser Arbeit eingegangen. Um genauer zu analysieren, ob einige der Mutationen sich auf die N/C-terminale Interaktion auswirken, wurde das Mammalian-Two-HybridAssay-Kit von Stratagene eingesetzt. Die Vektoren pAD-NTD und pBD-LBD wurden wie in 2.4 beschrieben konstruiert. Nach Kotransfektion von pAD-NTD und pBD-LBD entstehen in Säugerzellen zwei verschiedene Fusionsproteine. Durch die Expression des Fusionsgens im pAD-NTD-Vektor wird die transkriptionsaktivierende Domäne des Maus Proteins NF-κB in Fusion mit der AR-NTD synthetisiert. Das Fusionsgen im pBD-LBD-Vektor kodiert für ein Protein aus der Hefe-Gal4-DNA-Bindungsdomäne in Fusion mit der AR-LBD (Abb. 13). Wird die LBD durch DHT aktiviert und interagiert daraufhin über das 23 FXXLF27-Motiv mit der NTD, ent- steht ein funktioneller Transkriptionsfaktor aus den beiden Fusionsproteinen. Dieser Transkriptionsfaktor lagert sich über seine Gal4-DNA-Bindungsdomäne an die Gal4responsiven Elemente der Promotorregion strangaufwärts des Leuchtkäfer- Luziferasegens (pFR-Luc) an. Über die NF-κB Komponente werden weitere Transkriptionsaktivatoren rekrutiert und die Transkription des Luziferasegens initiiert. Das Maß der 38 Material und Methoden II Expression der Luziferase korreliert mit der Interaktion zwischen N- und C-Terminus des AR. Die Transfektionen wurden entsprechend 2.6.3 durchgeführt. Pro Well wurden 100 ng pAD-NTD, 100 ng pBD-LBD (mit oder ohne Mutation), 250 ng pFR-Luc und 10 ng phRGTK (zur Messung der Transkriptionseffizienz) transfektiert. Es wurden vier aufsteigende Hormonkonzentrationen, kein DHT, 1 nM DHT, 10 nM DHT und 100 nM DHT, verwendet. Auch diese Versuchsreihe wurde in Triplikaten mit drei unabhängigen Wiederholungen durchgeführt. Der Mittelwert der Messung von Wildtyp NTD und Wildtyp LBD wurde als 100 % angesetzt. Als Positivkontrolle wurde die Interaktion der Kontrollplasmide pBD-P53 und pAD-SV40T aus dem Kit verwendet. Die Kotransfektion von pBD-LBD mit pADSV40T sowie pAD-NTD mit pBD-p53 diente der Negativkontrolle. Abb. 14 Aufbau der Gene der Two-Hybrid-Fusionsproteine Der pAD-NTD-Vektor enthält einen CMV-Promotor (CMV-P), der eine starke Expression in Mammalia-Zellen auslöst. Das Gen der Aktivierungsdomäne von NF-ΚB (NF-ΚB-AD) ist im Leseraster mit dem Gen der NTD des Androgenrezeptors verbunden. Nach Transkription entsteht eine Fusions-mRNA, aus der ein Fusionsprotein translatiert wird. Durch den SV40PolyA-Schwanz wird die mRNA stabilisiert. Der pBD-LBD-Vektor ist vergleichbar aufgebaut. Durch Proteinbiosynthese entsteht das Fusionsprotein aus der DNA- Bindungsdomäne des Hefeproteins Gal4 und der LBD des AR. 2.6.5 Bestimmung der Kofaktorinteraktion der LBD Zur differenzierten Beurteilung der Kofaktorbindung, beim Vorliegen von Mutationen in der LBD, wurde die Interaktion anhand von zwei bekannten Kofaktoren des AR, BAG1L und SRC1e, in einem Zellmodell untersucht. Hierzu wurden die Vektoren pBD-LBD und pFRLuc des Mammalian-Two-Hybrid-Assay-Kit (Stratagene) mit den Expressionsvektoren der Kofaktoren kotransfektiert. Wie beschrieben lagert sich die Gal4-Bindungsdomäne des Fusionsproteins aus pBD-LBD (AR-LBD und Gal4-DNA-Bindungsdomäne) an die Gal4Bindungsstellen stromaufwärts des Luziferasegens an. Interagieren die Kofaktoren SRC1e und BAG1L mit der LBD des AR, können sie weitere Kofaktoren rekrutieren und die Ausbildung eines Transkriptionskomplexes initiieren. Die Interaktion zwischen Kofaktor und LBD-Fusionsprotein führt zur Expression des Luziferasegens, die im Luminometer detektierbar ist. 39 Material und Methoden II Für die Versuche mit BAG1L wurden pro Well 100 ng pBD-LBD, 100 ng BAG1L in pcDNA3, 250 ng pFR-Luc und 10 ng phRG-TK Plasmid-DNA eingesetzt. Da die LBD auch selbst in der Lage ist, Kofaktoren zu rekrutieren, allerdings in schwächerem Maße, wurde eine Kontrolltransfektion ohne BAG1L in pcDNA3 durchgeführt. Hierzu wurden statt des Kofaktor-Plasmids 80 ng pcDNA3 (ohne BAG1L) und 16 ng pTZ19 als Füllplasmid eingesetzt, um die DNA-Menge und Promotor-Anzahl konstant zu halten. Für den Kofaktor SRC1e wurden 200ng SRC1e in pSG5 bzw. in der Kontrolle 100ng pSG5 und 100ng pTZ19 Plasmid-DNA eingesetzt. DHT wurde in den Endkonzentrationen von kein DHT, 1 nM DHT, 10 nM DHT und 100 nM DHT zugegeben. Auch die Kofaktorversuche wurden in Triplikaten und mindestens drei unabhängigen Wiederholungen durchgeführt. Der Mittelwert der Transfektionen des Wildtyp pBD-LBD mit leerem Vektor wurde gleich 100 % gesetzt. 2.7 Western Blot Mit dem Western Blot können Proteine nach elektrophoretischer Auftrennung nachgewiesen und quantifiziert werden. Dieses Verfahren wurde eingesetzt, um zu zeigen, dass eine Funktionseinschränkung in den Reportergen-Assays sich nicht auf eine verminderte Proteinbiosynthese mutierter Rezeptoren, sondern auf eine veränderte Funktion der mutierten Rezeptoren selbst zurückführen lässt. 2.7.1 Herstellung der Proteinlysate In 6-Well-Platten wurden 300 000 CHO Zellen in 2,5 ml Kulturmedium pro Well ausgesät und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Pro Well wurden 1000 ng pSVAR, pBDLBD oder pAD-NTD sowie 30 ng phRG-TK Plasmid-DNA in 500µl DMEM mit 2,2 µl FuGene HD wie oben beschrieben transfektiert. Die Inkubation erfolgte für 24 h ohne Hormonzugabe. Vor der Lyse wurden die Zellen zweimal mit je 3 ml PBS pro Well gewaschen. In 7 ml Mammalian-Protein-Extraction-Reagent (M-PER, Pierce, USA) wurde eine Tablette Proteasen-Inhibitor-Cocktail (complete, Mini, EDTA-free von Roche, USA) gelöst. Mit 250 µl M-PER pro Well wurden die Zellen für 5 min auf Eis inkubiert und dann mit einem Zellscraper vom Boden gelöst. Die Lysate wurden über eine QiaShredder-Säule (Qiagen, Hilden) abzentrifugiert. 25µl des Lysats wurden direkt für die Detektion der Transfektionseffizienz im Luminometer entnommen. Der übrige Teil wurde aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Mit dem Bio-Rad-Microassay wurde die Proteinkonzentration der Lysate im Biophotometer (Eppendorf) bestimmt. 40 Material und Methoden II 2.7.2 Normalisierung der Lysatmengen Um die Proteinmenge der verschiedenen AR-Mutanten in den transfektierten Zellen miteinander vergleichen zu können, wurde die eingesetzte Lysatmenge nach der Transfektionseffizienz normalisiert. Dazu diente der im Luminometer bestimmte Wert der kotransfektierten Renilla-Luziferase. 2.7.3 Acrylamid-Gel-Elektrophorese und Western Blot In den durchgeführten Versuchen wurde das diskontinuierliche SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis) Puffersystem nach Laemmli (1970) verwendet. Im Gel- und Elektrodenpuffer liegen jeweils unterschiedliche Ionen vor. Das Sammelgel dient zunächst dem Einbringen der Proteine in die Gelphase. Anschließend erfolgt im Trenngel die Auftrennung in die Einzelbanden. Die Proteinlysate wurden zunächst 1:1 mit einem SDS-haltigen Probenpuffer (100 mM Tris, 4 % SDS, 20 % Glyzerol, 0,002 % Bromphenolblau, 10 nM DTT, pH 6,8) für 3 min bei 99 °C denaturiert. Dies ermöglichte die nachfolgende elektrophoretische Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht. In einem Acrylamid-Gel, bestehend aus einem 4-prozentigen Sammel-Gel und einem 7-prozentigen Trenn-Gel (siehe Tbl. 3), wurden die Lysate unter Verwendung eines SDS-haltigen Tris-Glycin-Elektrodenpuffers (0,1 % SDS, 25 mM Tris, 192 mM Glycine, pH 8,3) in einer Mini-PROTEAN-3-Cell (Bio-Rad) bei einer Spannung von 100 V für 1,5h aufgetrennt. Als Marker wurden 15 µl Kaleidoskopmarker (BioRad) verwendet. Sammel-Gel (4 %) Trenn-Gel (7 %) Acrylamid (Rotiphoresegel 30) 0,71 ml 3 ml 5x Sammel-Gel-Puffer 1,1 ml (625 mM Tris, 0,5 % SDS, pH 6,8) 5x Trenn-Gel-Puffer 2,7 ml (1,875 M Tris, 0,05 % SDS, ph 8,8) Aqua dest. 3,5 ml 7,2 ml TEMED 10 µl 10 µl 10 % APS 15 µl 28,8 µl Tbl. 3 Acrylamid-Gele für SDS-PAGE Als das eigentliche „Blotting“ wird das Übertragen der im Gel vorliegenden Proteine auf eine Membran durch Elektrophorese bezeichnet. Unter Verwendung der Ready-GelBlotting-Sandwiches (BioRad) wurde das Gel in eine Mini-Trans-Blot-Electrophoretic- 41 Material und Methoden II Transfer-Cell (BioRad) eingespannt. Die elektrophoretische Übertragung der Proteine aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran erfolgte für 1 h 20 min bei 100 V in BlottingPuffer (20 % Methanol, 16,5 mM Tris, 150 mM Glycin, pH 8,3). Das elektrische Feld war dabei senkrecht zur Laufrichtung der Acrylamid-Gel-Elektrophorese angelegt. Durch den Methanol-haltigen Puffer wurde das SDS aus den Proteinen gelöst. Durch die nun wieder mögliche Ausbildung von Proteinsekundär- und Tertiärstruktur konnten die Proteine besser an der Membran haften. Aus PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,8 mM Na2HPO4x2H2O, 1,5 mM KH2PO4), versetzt mit 0,1 % Tween 20 und 5 %-igem Magermilchpulver (Difco, Becton & Dickinson), wurde eine Block-Milch hergestellt. In dieser wurde die Membran bei 4 °C über Nacht schüttelnd blockiert. 2.7.4 Immundetektion Bei der Immundetektion werden Proteine mit Hilfe spezifischer Antikörper markiert und sichtbar gemacht. In einem zweistufigen Verfahren bindet zunächst ein Erstantikörper direkt das nachzuweisende Protein. In einem zweiten Schritt bindet ein Zweitantikörper, der mit einer Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert ist, den Erstantikörper über sein FcFragment (Abb. 15). Nach Substrat Zugabe katalysiert die HRP die Oxidation von Luminol. Bei dieser Reaktion wird Licht emittiert, das mit einer Kamera oder einem Film optisch fixiert werden kann. Der Film wird dort, wo das nachzuweisende Antigen vorliegt, belichtet. Durch wiederholtes Spülen werden vorher ungebundene Antikörper entfernt. Abb. 15 Prinzip der Immundetektion Der Primärantikörper bindet das Antigen, der Sekundärantikörper mit gebundener HRP bindet den Primärantikörper. Nach Zugabe des Substrats Luminol katalysiert die HRP eine Chemilumineszenzreaktion, bei der Licht emittiert (hν) wird. 42 Material und Methoden II In den durchgeführten Immunoblots wurde die blockierte Membran für eine Stunde mit der jeweiligen Primärantikörper-Arbeitsverdünnung (siehe Tbl. 4) inkubiert. In der nächsten Stunde wurden die Membranen 4 Mal für 15 min in PBS mit 0,1 % Tween gewaschen. Dann erfolgte, wiederum für eine Stunde, die Inkubation mit der Arbeitsverdünnung des Sekundärantikörpers (siehe Tbl. 5). Die Membran wurde wieder 4 Mal mit PBS und 0,1 % Tween gewaschen. Die Detektion erfolgte mit dem Western-Lightning- Chemiluminescence-Reagent-Plus (PerkinElmer) im Molecular-Imager-Chemidoc-XRS sowie in der Dunkelkammer mit Hyperfilm (Amersham). Kaninchen Anti-Aktin Antikörper Sigma, Deisenhofen Lagerung bei -20 °C Arbeitsverdünnung 1:1000 in Block Milch Anti-Androgen Receptor (F39.4.1) Biogenex, USA monoklonaler Maus-Antikörper Lagerung bei +4 °C Arbeitsverdünnung: 1:600 in Block Milch Anti-Gal4 (DBD): sc-577 Antikörper Santa Cruz, USA polyklonaler Kaninchen-Antikörper erkennt die Aminosäuren 1-147 in der N-terminalen DNA Bindungsdomäne von Gal4 Lagerung bei +4 °C Arbeitsverdünnung: 1:200 in Block Milch Tbl. 4 Primärantikörper Anti-Kaninchen IgG Antikörper Sigma-Aldrich, Deisenhofen HRP konjugierter Ziegen-Antikörper Lagerung bei -20 °C Arbeitsverdünnung: 1:4000 in Block Milch ECL TM Anti-Maus IgG Antikörper Amersham, Freiburg HRP konjugierter Schaf-Antikörper Lagerung bei -20 °C Arbeitsverdünnung: 1:2000 in Block Milch Tbl. 5 Sekundärantikörper 2.8 Konzentrations-Wirkungs-Kurven Konzentrations-Wirkungs-Kurven und EC50-Werte wurden mit Hilfe des Software-Pakets GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) berechnet. 43 Ergebnisse III III 1. Ergebnisse Sequenzierung der Plasmid-DNA Um die Plasmide auf Fehlerlosigkeit zu prüfen und die einzelnen Mutationen vor ihrem Einsatz in Reportergen-Assays zu verifizieren, wurde die Plasmid-DNA nach der Didesoxymethode sequenziert. Die gewonnenen Sequenzen wurden mit dem Programm Sequence-Analysis-5.2 (ABI, USA) auf ihre Qualität geprüft. Mit dem SequenceManager aus Lasergene 6.0 (DNAStar, USA) wurden die Sequenzen der Plasmid-DNA mit der Originalsequenz verglichen und die Mutationen gesondert überprüft (Abb. 15). Alle verwendeten Plasmide wurden auf diese Weise kontrolliert bevor sie für die Transfektionen verwendet wurden. Abb. 16 Sequenzanalyse des pSVAR WT und pSVAR L712F Vergleich von Wildtyp und mutierter Sequenz der pSVAR Plasmide. Die einzelnen Basenpeaks sind farblich kodiert, Guanin schwarz, Thymin rot, Cytosin blau und Adenin grün. Die jeweiligen Aminosäuren (AS) des AR sind im Einbuchstabencode (siehe Anhang 8.) mit zugehörigem Leseraster und ihrer Position nach der Sequenz von Lubahn et al. (1989) dargestellt. 2. LBD-Mutationen 2.1 Transaktivität des AR am (ARE)2-TATA-Promotor Um funktionelle Unterschiede in der Transaktivität zwischen dem Wildtyp (WT) und den mutierten Rezeptoren aufzuzeigen, wurden die pSVAR-Plasmide mit einem Androgen- 44 Ergebnisse III responsiven Leuchtkäfer-Luziferase-Reportergen ((ARE)2-TATA-Luc) und einem konstitutiv exprimierten Renilla-Luziferase-Plasmid (phRGTK) kotransfektiert. Durch die Zugabe ansteigender Hormonkonzentrationen (0-100 nM DHT) wurde die konzentrationsabhängige Transaktivierung des Reportergens durch den AR in CHO-Zellen differenziert dargestellt (Abb. 17 A). Bei 0,1 nM DHT lag die detekierte Transaktivierung durch den WT AR bei 40 % des Maximalwerts. Bei 1 nM DHT erreichte sie ungefähr 90 %. Mit Prism 5 (GraphPad) wurde aus den Messwerten eine mittlere effektive Konzentration (EC50) von 1,55 x 10-10 (CI: 1,4 x 10-10 – 1,7 x 10-10) berechnet (Abb. 17 B). Im Vergleich zum Wildtyp führten die mutierten Rezeptoren zu einer verminderten Transaktivierung. Eine Ausnahme stellte der AR mit der PAIS-Mutation Q798E dar. Dieser Rezeptor erreichte bei Hormonkonzentrationen von 10 und 100 nM DHT eine dem Wildtyp vergleichbare Transaktivierung (Abb. 17 A). Die EC50 lag mit 3,691 x 10-10 (CI: 3,324 x 1010 – 4,099 x 10-10) etwas unter dem Wert des Wildtyps (Abb. 17 B). Die PAIS-Mutation L712F reduzierte die maximale Transaktivität auf 70 % des Wildtyprezeptors. Bei 0,1 nM DHT erreichte der mutierte Rezeptor eine Transaktivierung von knapp 10 % und bei 1 nM von unter 40 % (Abb. 17 A). Aus den gemessenen Werten berechnete sich eine EC50 von 8,358 x 10-10 (CI: 7,316 x 10-10 – 9,548 x 10-10) (Abb. 17 B). Die Mutationen P723S und P904S, die beide mit CAIS assoziiert sind, führten zu einer stark verringerten Transaktivierung des Reportergens (Abb. 17 A). Hormonkonzentrationen von 1 nM DHT konnten die mutierten Rezeptoren nicht aktivieren. Bei 10 nM DHT wurde eine Aktivierung von 20 - 35 % erreicht. Der supraphysiologische Wert von 100 nM DHT bewirkte eine Steigerung der Transaktivierung auf 50 - 60 % des Wildtyps. Da diese beiden Mutationen dazu führten, dass erst sehr hohe Hormonkonzentrationen eine Transkription des Reportergens auslösen, kann von einer stark erhöhten EC50 ausgegangen werden. Diese ließ sich jedoch aus den vorhandenen Messwerten nicht berechnen. Bei der AR-Variante 23 FQNAA27 ist die Sequenz 23 FQNLF27 durch den Austausch von zwei AS verändert. Der Rezeptor ist nicht mehr in der Lage, eine N/C-terminale Interaktion über dieses Motiv auszubilden (Shen et al., 2005). Im Reportergen-Assay war die maximale Transaktivität des AR mit FQNAA auf 20 % des Wildtyps reduziert (Abb. 17 A). Für eine Aktivierung waren relativ geringe Hormondosen ausreichend. Eine halbmaximale Aktivierung fand bereits bei 0,1 nM DHT statt. Dies ist dadurch zu erklären, dass die Hormonbindung und die dadurch initiierte primäre Aktivierung des Rezeptors durch den Nterminalen Basenaustausch nicht moduliert wird. Die Stoppkodon-Mutation F916X hob die Transaktivierungsfähigkeit des Rezeptors vollständig auf (Abb. 17 A). Der AR mit H917R zeigte von den CAIS-Mutationen die höchste maximale Transaktivierung. Bei 1 nM DHT erreichte der mutierte Rezeptor 35 % und bei 10 nM DHT 60 - 70 % der Wildtyp-Transaktivität (Abb. 17 A). Aus den Messwerten er- 45 Ergebnisse III rechnete sich eine EC50 von 1,03 x 10-9 (CI: 6,7 x 10-10 - 1,59 x 10-9) (Abb. 17 B). Die ARs mit den Mutationen P723S, P904S und F916X konnten bei der physiologischen DHTKonzentration von 1 nM DHT kaum eine Transaktivierung des Reportergens bewirken. Dieses Ergebnis korreliert mit dem CAIS-Phänotyp der beschriebenen Patienten. Im Unterschied hierzu zeigte der Rezeptor mit H917R ein Transaktivierungsprofil wie der AR mit der PAIS-Mutation L712F. Bei hoch-physiologischen DHT Werten (10 nM) erreichte der AR mit H917R eine Transaktivierung von fast 70 % des Wildtyps (Abb. 17 A). In der Literatur war beschrieben worden, dass diese Mutation mit einem CAIS-Phänotyp einhergeht. Eine Überprüfung der AR-Expression durch Western-Blot-Analysen zeigte, dass sich die unterschiedliche Transaktivierungsfunktion der AR-Varianten nicht auf unterschiedliche Proteinexpression in CHO-Zellen zurückführen lässt (Abb. 16 C). A) B) 46 Ergebnisse III C) Abb. 17 Transaktivität des AR am (ARE)2-TATA-Promotor A) CHO-Zellen wurden mit dem Reportergen (ARE)2-TATA-Luc (Leuchtkäfer-Luziferase), der konstitutiv exprimierten Renilla-Luziferase, phRGTK, und Varianten des AR in ganzer Länge (pSVAR) transfektiert. Es wurden der Wildtyp-Rezeptor, die PAIS-Mutationen L712F und Q798E, die CAIS-Mutationen P723S, P904S und H917R und zwei artifizielle Mutationen, 23 FQNAA 27 und F916X, untersucht. Um die hormonvermittelte Aktivierung des Reportergens detektieren zu können, wurde 5 Stunden nach Transfektion DHT in der jeweils angegebenen Konzentration zugegeben. Nach weiteren 18 Stunden Inkubation wurden die CHO-Zellen lysiert und die Aktivitäten von Leuchtkäfer- und Renilla-Luziferase im Luminometer detektiert. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe des Renilla-Wertes nach der Transfektionseffizienz normalisiert. Der Wert des WT AR bei der physiologischen Konzentration von 10 nM DHT wurde gleich 100 % gesetzt. Es wurden mindestens drei unabhängige Versuche in Triplikaten durchgeführt, die Standardabweichung ist als Fehlerbalken abgebildet. RLU: relative Luziferase Einheiten. B) Konzentrations-Wirkungs-Kurven: Konzentrations-Wirkungs-Kurven des WT AR und des AR mit den Mutationen Q798E, L712F und H917R am (ARE)2-TATA-Promotor. Die Einzelmesswerte wurden verwendet, um mit Prism 5 (GraphPad) die zugehörigen EC50-Werte zu berechnen (siehe Text). Der WT erreicht bereits bei niedrigen Hormonkonzentrationen eine Aktivierung des Reportergens. Die Q798E hat eine im Vergleich etwas geminderte EC50. Die Kurven der Mutationen L712F und H917R überlagern sich. Um eine dem Wildtyp vergleichbare Aktivierung zu erreichen, benötigen beide AR-Varianten eine zehnfach erhöhte DHTKonzentration. C) Western Blot der AR-Konstrukte in ganzer Länge: CHO-Zellen wurden mit pSVAR-Konstrukten sowie dem Plasmid der konstitutiv exprimierten Renilla-Luziferase, phRGTK, transfektiert. Die auf den Blot aufgetragene Proteinmenge wurde nach der Transfektionseffizienz normalisiert. Es wurden zwischen 10 und 25 µl Proteinlysat aufgetragen. Die Immundetektion erfolgte mit dem Antikörper Anti-Androgen Receptor (F39.4.1) von TM Biogenex als Primärantikörper und ECL Anti-Maus IgG Antikörper von Amersham als Sekundärantikörper. Das Molekulargewicht des AR beträgt ca. 110 kDa. Nicht transfektierte CHO-Zellen (CHO) dienten der Negativkontrolle. 2.2 N/C-terminale Interaktion Um die Interaktion zwischen N- und C-Terminus des Androgenrezeptors differenziert zu untersuchen, wurde ein Two-Hybrid-Assay eingesetzt, bei dem der pAD-NTD-WildtypVektor und verschiedene Varianten des pBD-LBD-Vektors zusammen mit dem Reportergen pFR-Luc und phRGTK in CHO-Zellen kotransfektiert wurden (Abb. 18 B). Die Ergebnisse zeigten beim Wildtyp die erwartete Androgen-abhängige N/C-Interaktion (Abb. 18 A). Im Wildtyp-Rezeptor vermittelt das 23 FQNLF27-Motiv die N/C-Interaktion (He et al. 2002a). Die NTD mit der Variante 23FQNAA27 zeigte keine N/C-Interaktion und wurde als Negativkontrolle eingesetzt. 47 Ergebnisse III Im Vergleich mit den oben beschriebenen Ergebnissen fallen, wie in Abb. 18 B zu sehen, wesentliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Mutationen auf. Während die LBD F916X bei allen eingesetzten DHT-Konzentrationen (0-100 nM) keinerlei Interaktion mit der NTD einging, übte die Mutation Q798E keinen supprimierenden Effekt auf die N/CInteraktion aus, die mutierte LBD verhielt sich wie der Wildtyp. Die CAIS-Mutationen P723S, P904S und H917R führten zu einer verzögerten N/C-Interaktion. Bei 1 nM DHT zeigte die LBD mit H917R im Vergleich zum Wildtyp ¼ der Aktivität. Bei höheren DHTKonzentrationen (10 nM und 100 nM) erreichte sie 80 - 90 % der Wildtyp-Interaktion. Dieses Ergebnis ist auf eine 5-10 Mal höhere EC50 zurückzuführen und entspricht den Ergebnissen im Versuch zur Transaktivität. Die Mutationen P723S und P904S unterdrückten bei niedrigeren DHT-Konzentrationen (≤10 nM) die N/C-Interaktion. Bei 100 nM wurde eine Aktivität von 30 - 50 % des Wildtyps erreicht. Diese verzögerte Reaktion zeigt, dass sich in der LBD, trotz vorliegender Mutationen, durch Hormoninduktion eine Faltung zur aktiven AF2 vollzieht. Die fehlende N/C-Interaktion bei niedrigen Hormonkonzentrationen lässt sich durch eine stark erhöhte Dissoziationskonstante (Kd) erklären. Die Mutation L712F unterbindet die für den AR spezifische Interaktion zwischen NTD und LBD vollständig. Dieses steht in Diskrepanz mit dem Versuch zur Transaktivität des vollständigen Rezeptors am (ARE)2-TATA-Promotor, bei dem die Mutation L712F die maximale Transaktivität des AR nur um 30 - 40 % reduzierte. Durch Western-Blot-Analysen wurde die Proteinexpression der verwendeten Varianten des Fusionsproteins aus LBD und Gal4-DNA-Bindungsdomäne in CHO-Zellen untersucht. Dabei wurden keine wesentlichen quantitativen Unterschiede in der Expression der verschiedenen LBD-Fusionsproteine festgestellt (Abb. 18 C/D). A) 48 Ergebnisse III B) C) D) Abb. 18 Two-Hybrid-Assay zur Detektion der N/C-terminalen Interaktion A) Balkendiagramm der N/C-Interaktion: Die Transfektion der CHO-Zellen wurde wie in Abb. 18 B beschrieben durchgeführt. 5 Stunden nach Transfektion wurde DHT in den angegebenen Konzentrationen zugegeben. Mit dem Dual-Luziferase-Assay wurde die Aktivität der Luziferasen nach weiteren 18 h getrennt detektiert und die Ergebnisse nach Transfektionseffizienz normalisiert. Die Werte von Wildtyp NTD und LBD bei 10 nM DHT wurde gleich 100 % gesetzt. Standardabweichungen sind als Fehlerbalken dargestellt. Es wurden mindestens 3 unabhängige Experimente in Triplikaten durchgeführt. RLU: relative Luziferase Einheiten. B) Schemazeichnung des Mammalian-Two-Hybrid-Assays (nach dem Handbuch von Stratagene): CHOZellen wurden mit den Vektoren pBD-LBD (kodiert für das Fusionsprotein aus der Gal4-DNABindungsdomäne und AR-LBD, hier violett dargestellt) und pAD-NTD (kodiert für das Fusionsprotein aus der NFΚB Aktivierungsdomäne und AR-NTD, hier gelb dargestellt) sowie dem Reportergen pFR-Luc (Leuchtkäfer-Luziferase, grün dargestellt) und der konstitutiv exprimierten Renilla-Luziferase phRGTK (rot dargestellt) transfektiert. In den CHO-Zellen werden die beiden Fusionsproteine über ihre CMV-Promotoren exprimiert. Im 49 Ergebnisse III Zellkern wird nach Hormonzugabe (DHT) die Interaktion zwischen AR N- und C-Terminus ausgelöst, wodurch sich beide Fusionsproteine aneinander anlagern. Über die Gal4-DNA-Bindungsdomäne findet eine Assoziation an die Gal4-responsiven Elemente, stromaufwärts des Reportergens pFR-Luc, statt. Über die Aktivierungsdomäne von NFΚB werden zelluläre Kofaktoren rekrutiert und die Expression des Luziferasegens initiiert. Die Expression von pFR-Luc ist somit von einer funktionierenden N/C-terminalen Interaktion abhängig. C) und D) Western-Blot-Analysen der Fusionsproteine: CHO-Zellen wurden mit pBD-LBD- bzw. pAD-NTDKonstrukten sowie dem Plasmid der konstitutiv exprimierten Renilla-Luziferase phRGTK transfektiert. Die auf den Blot aufgetragene Proteinmenge wurde nach der Transfektionseffizienz normalisiert und durch WesternBlot-Analysen immundetektiert. Die LBD-Fusionsproteine wurden mit den Antikörpern Anti-Gal4 (DBD), Santa Cruz, und Anti-Kaninchen IgG Antikörper, Sigma-Aldrich, und die NTD-Fusionsproteine mit dem AntiTM Androgen Receptor (F39.4.1), Biogenex und ECL Anti-Maus IgG Antikörper, Amersham, immundetektiert. Die LBD-Gal4-DBD hat ein Molekulargewicht von 58 kDa, die NTD-NFΚB von 81,3 kDa. Nicht transfektierte CHO-Zellen (CHO) zeigten keine Bande. 2.3 Interaktion mit Kofaktoren Der Androgenrezeptor benötigt für die Transaktivierung seiner Zielgene das optimale Zusammenspiel verschiedenster Koaktivatoren. Diese interagieren sowohl mit der NTD als auch der LBD des AR. Wichtig für die Kofaktorinteraktion in der LBD ist die ActivationFunction-2 (AF2) (Askew et al. 2007). Um exemplarisch die Auswirkung der beschriebenen Mutationen auf die Kofaktorwirkung darzustellen, wurden Kotransfektionen der isolierten LBD mit zwei bekannten Kofaktoren durchgeführt. SRC1e gehört zur Familie der p160 Koaktivatoren und interagiert mit dem AR über die AF2 der LBD (Ma et al., 1999). Hierfür ist ein LXXLL-Motiv entscheidend, das, wie das 23 FQNLF27-Motiv der NTD, über eine Kofaktor-Bindungsgrube der AF2 bindet, allerdings mit geringerer Affinität (Dubbink et al., 2004). Um die Auswirkung der LBD-Mutationen auf die Interaktion mit SRC1e zu untersuchen, wurden Kotransfektionen mit den pBD-LBD Vektoren mit Mutation und SRC1e bzw. dem leeren Expressionsvektor pSG5, pFR-Luc als Reportergen und phRGTK durchgeführt. In Abb. 19 ist eine hormonabhängige Transaktivierung des Reporter-Gens durch die isolierte Wildtyp-LBD zu erkennen. Die Überexpression von SRC1e erhöhte die Transaktivierung etwa um das Zweifache. Nur die Mutation Q798E zeigte eine ähnliche Transaktivierungsfunktion wie die Wildtyp-LBD (Abb. 19). Auch hier führte die Kotransfektion von SRC1e zu einer Steigerung der Transaktivität auf mehr als 200 %. Die Mutation F916X inhibierte, wie aus den vorigen Versuchen bereits zu erwarten, die Transkriptionsinitiation vollständig (Abb. 19). Die PAIS-Mutation L712F führte ebenfalls zu einer gestörten Funktion der AF2, die auch durch die Kotransfektion mit SRC1e nicht verändert werden konnte. Die LBD mit den CAIS-Mutationen P723S und P904S konnte über die AF2 ebenfalls nicht genügend zelluläre Koaktivatoren rekrutieren. Nur bei 100 nM DHT und der Überexpression von SRC1e konnte für die LBD mit P904S eine leichte Transkriptions- 50 Ergebnisse III aktivierung festgestellt werden. Die CAIS-Mutation H917R verzögerte die Aktivierung der AF2. Während die Wildtyp LBD und die LBD mit Q798E ihre maximale Aktivierung schon bei 1 nM DHT erreichten, zeigte die LBD mit H917R hier noch keine Aktivierung. Bei 10 und 100 nM DHT konnte sie 50 % der Wildtyp-Aktivierung erreichen. Die Überexpression von SRC1e steigerte die Transaktivierung ebenfalls auf das Doppelte, was der Transaktivierung des Wildtyps ohne Überexpression von SRC1e entsprach (Abb. 19). Abb. 19 Interaktion der AR LBD mit SRC1e CHO-Zellen wurden mit pBD-LBD-Konstrukten, dem Expressionsvektor SRC1e in pSG5 (+) oder dem leeren Expressionsvektor pSG5 (-), dem Reportergen pFR-Luc und phRGTK kotransfektiert. 5 Stunden nach Transfektion wurden die angegebenen Hormonkonzentrationen durch Zugabe von DHT hergestellt. Die Luziferaseaktivitäten wurden nach weiteren 18 Stunden detektiert. Das LBD-Gal4-DBD Fusionsprotein kann durch DHT-Aktivierung der LBD und Anlagerung an die Gal4-responsiven Elemente von pFR-Luc selbst Kofaktoren aktivieren und die Expression der Luziferase initiieren (-). Durch die zusätzliche Überexpression von SRC1e (+) wird die Transaktivierungsfunktion der LBD verstärkt. Die Ergebnisse wurden nach Transfektionseffizienz normalisiert und der Mittelwert der WT pBD-LBD bei 10 nM DHT ohne Überexpression von SRC1e gleich 100 % gesetzt. Es wurden drei unabhängige Versuche in Triplikaten durchgeführt. RLU: relative Luziferase Einheiten. In Folge wurde die Interaktion mit dem Kofaktor BAG1L genauer analysiert. BAG1L gehört zu einer Gruppe von Kochaperonen, die die Funktion von Steroidrezeptoren regulieren (Froesch et al., 1998). BAG1L kann dabei seine Funktion als Kofaktor über die Interaktion mit dem Hitzeschockprotein HSP70, über eine modulierende Interaktion mit DNA oder über die direkte Interaktion mit bestimmten Proteinen vermitteln (Gehring et al., 2006). Der AR kann mit dem Kofaktor sowohl über seine NTD als auch LBD interagieren. Hier- 51 Ergebnisse III durch wird die Transaktivierungsfunktion des AR gesteigert (Shatkina et al. 2003). Im Unterschied zu SRC1e besitzt BAG1L kein klassisches LXXLL-Motiv. In diesem Versuch wurde untersucht, ob die Formation einer aktiven AF2 auch für diese Kofaktorinteraktion entscheidend ist. Hierzu wurden die pBD-LBD Vektoren mit BAG1L oder dem leeren Expressionsvektor pcDNA3, pFR-Luc als Reportergen sowie phRGTK kotransfektiert. Die Ergebnisse sind den Ergebnissen der Kotransfektion mit SRC1e sehr ähnlich (Vergleich Abb. 19 und 20). Die hormonabhängige Transaktivierungskapazität der Wildtyp-LBD wurde durch die Überexpression von BAG1L ebenfalls auf das Zweifache gesteigert. Die LBD mit Q798E zeigte wiederum dem Wildtyp vergleichbare Ergebnisse. Die H917R Mutante zeigte eine Transkriptionsaktivierung bei hohen DHT-Konzentrationen (10/100 nM DHT), die 50 % der Wildtyp-Aktivität entsprach und durch die Überexpression von BAG1L verdoppelt werden konnte. Die LBD mit den Mutationen L712F, P723S, P904S noch F916X konnte keinen aktiven Transkriptionskomplex rekrutieren, unabhängig von der An- oder Abwesenheit des Kofaktors BAG1L (Abb. 20). Abb. 20 Interaktion der AR LBD mit BAG1L Entsprechend des Versuches von SRC1e wurden CHO-Zellen mit pBD-LBD Konstrukten, dem Expressionsvektor BAG1L in pcDNA3 (+) oder dem leeren Expressionsvektor pcDNA3 (-), dem Reportergen pFR-Luc und phRGTK kotransfektiert. 5 Stunden nach Transfektion wurden die angegebenen Hormonkonzentrationen durch Zugabe von DHT hergestellt. Die Luziferaseaktivitäten wurden nach weiteren 18 Stunden detektiert. Die Ergebnisse wurden nach Transfektionseffizienz normalisiert und der Mittelwert der WT pBD-LBD bei 10 nM DHT ohne Überexpression von BAG1L gleich 100 % gesetzt. Es wurden drei unabhängige Versuche in Triplikaten durchgeführt. RLU: relative Luziferase Einheiten. 52 Ergebnisse III 2.4 N/C-Abhängigkeit verschiedener Promotoren In der Literatur wurden Promotoren des AR in zwei Gruppen geteilt: Promotoren, die für ihre Transaktivierung auf eine funktionierende N/C-Interaktion angewiesen sind wie der Probasin- und der PSA-Promotor und N/C-unabhängige Promotoren wie der MMTV- und Sex-limited-protein(Slp-)Promotor (He et al., 2002a). Um diese Ergebnisse mit dem in unseren Versuchen verwendeten (ARE)2-TATA-Promotor vergleichen zu können, analysierten wir die Transaktivität des AR an unterschiedlichen Promotoren. Hierzu wurde der AR mit den Mutationen 23 FQNAA27, L712F sowie ihrer Kombination (23FQNAA27 und L712F) im Vergleich zum Wildtyp am MMTV-, Probasin- und (ARE)2-TATA-Promotor in CHO und HeLa-Zellen untersucht. Die bisher beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die natürlich vorkommende Mutation L712F ebenso wie das konstruierte 23 FQNAA27-Motiv die N/C-Interaktion unterbinden (Abb. 18 B). Der Wildtyp AR erreichte in CHO-Zellen am MMTV-Promotor bereits bei Konzentrationen von 0,1 nM DHT 80 % seiner maximalen Transaktivität, während die Aktivität am (ARE)2TATA- und Probasin-Promotor nur bei 40 % lag (Vergleich des WT in Abb. 21 A mit Abb. 21 B/C). Bei 1 nM DHT war am MMTV-Promotor bereits die maximale Aktivität erreicht, an den beiden anderen Promotoren kam es zu einer 80 %-igen Aktivierung des Reportergens. An allen Promotoren führte die Konzentration von 10 und 100 nM DHT zu einer maximalen Aktivierung des Reportergens. Da am Probasin-Promotor in CHO-Zellen eine Basalaktivität von fast 20 % festzustellen war (Abb. 20 C), wurde dieser Versuch zum Vergleich in HeLa-Zellen durchgeführt (Abb. 21 D). Die Grundaktivität konnte hierdurch auf 5 - 10 % gesenkt werden, während die maximale Aktivität und Sättigung des Rezeptors erst bei 100 nM DHT erreicht wurde (40 % bei 1 nM, 100 % bei 10 nM, 180 % bei 100 nM DHT). Werden die WT-Messwerte als Konzentrations-Wirkungs-Kurve aufgetragen (Abb. 21 E), zeigt sich, dass die EC50 in Abhängigkeit vom verwendeten Promotor variiert. Am MMTVPromotor in CHO-Zellen errechnet sich eine EC50 von 4,29 x 10-11 (CI: 3,47 x 10-11 – 5,32 x 10-11), damit findet an diesem Promotor schon bei geringen DHT-Konzentrationen eine Transaktivierung des Reportergens statt. Die EC50 des (ARE)2-TATA-Promotors in CHOZellen liegt bei 2,2 x 10-10 (1,95 x 10-10 – 2,48 x 10-10). Der Probasin-Promotor hat in CHOZellen eine vergleichbare EC50 von 2,39 x 10-10 (CI: 2,07 x 10-10 – 2,82 x 10-10). In HeLaZellen wurde eine erheblich höhere EC50 von 6,15 x 10-9 (CI: 4,655 x 10-9 – 8,13 x 10-9) berechnet. Der AR mit den Einzelmutationen L712F und 23 FQNAA27 zeigte am MMTV-Promotor in CHO-Zellen eine maximale Aktivität von 60 - 70 % des Wildtyps (Abb. 21 A). Der AR mit L712F reagierte dabei, wie auch in den vorigen Ergebnissen, mit einer verzögerten Akti- 53 Ergebnisse III vierung von nur 10 % bei 0,1 nM DHT und 60 % bei 1 nM DHT. Die Mutation 23 FQNAA27, reduzierte die maximale Transaktivierung auf 60 %. Wie beim Wildtyp reichte die Konzentration von 0,1 nM DHT bereits zur Induktion der maximalen Transaktivität. Die Kombination beider Mutationen führte zu einer stärkeren Einschränkung der Rezeptoraktivität. Die maximale Aktivierung lag bei 40 % der Wildtyp-Aktivität. Der Kurvenverlauf entsprach dem des AR mit L712F. Eine Transaktivierung war erst bei höheren Hormonkonzentrationen sichtbar (siehe Abb. 21 A). Sowohl am Probasin- als auch am (ARE)2-TATA-Promotor erreichte der AR mit L712F in CHO-Zelle mit 60 % der Wildtyp-Aktivität eine deutlich höhere Aktivierung als die 23 FQNAA27-Variante mit 20 - 40 % (siehe Abb. 21 B/C). Durch die Kombination der beiden Mutationen wurde die maximale Transaktivität erst bei höheren Hormonkonzentrationen erreicht. Dieses Ergebnis ist kongruent mit den übrigen Ergebnissen der Mutation L712F. Mit 20 - 40 % der Wildtyp-Transaktivität entsprach die maximale Transaktivität der Doppelmutation dem Wert der Einzelmutation 23FQNAA27. Die Mutationen zeigten an den verschiedenen Promotoren unterschiedliche Wirkungsprofile. Während der AR mit L712F an allen Promotoren 60 % der Wildtyp-Transaktivität erreicht, scheint das 23 FQNLF27-Motiv für die Aktivierung über den Probasin- und (ARE)2- TATA-Promotor essenziell zu sein (siehe Abb. 21 B/C). Eine Kombination der beiden Mutationen führte nur am MMTV-Promotor zu einer Reduktion der Transaktivität im Vergleich zu den Einzelmutationen, L712F und 23 FQNAA27. Am Probasin- (Abb. 21 C/D) und (A- RE)2-TATA-Promotor (Abb. 21 B) entsprach die maximale Transaktivierung der Mutation 23 FQNAA27 dem Wert der Doppelmutation. Die Wirkung von DHT wurde zum einen durch den Promotor und zum anderen durch den Zelltyp beeinflusst. Es ist fraglich, ob sich die Unterschiede in der Transaktivität an den verschiedenen Promotoren wirklich auf eine N/C-Abhängigkeit dieser zurückführen lassen. Die Mutationen L712F und 23 FQNAA27, die beide keine N/C-Interaktion zulassen, wirken sich unterschiedlich auf die Rezeptorfunktion aus. Es ist davon auszugehen, dass jeder Promotor auf das Zusammenspiel spezifischer Kofaktoren angewiesen ist. Jeder Zelltyp besitzt ein spezifisches Ensemble von Kofaktoren. Hierdurch lassen sich die Unterschiede der EC50 zwischen CHO- und HeLa-Zellen erklären. Mutierte Rezeptoren scheinen die Interaktion mit spezifischen Kofaktoren, je nach Mutation, in unterschiedlichem Ausmaß zu inhibieren. Dadurch können sie an verschiedenen Promotoren ein unterschiedliches Ausmaß der Funktionseinschränkung zeigen. Western-Blot-Analysen zeigten in CHO-Zellen eine vergleichbare Expression der verwendeten AR-Varianten (Abb. 21 F). Die Unterschiede in den Reportergen-Assays lassen sich somit nicht auf eine unterschiedliche Proteinexpression zurückführen. 54 Ergebnisse III A) Abb. 21 A) Transaktivität am MMTV-Promotor in CHO-Zellen B) Abb. 21 B) Transaktivität am (ARE)2-TATA-Promotor (V1-V3) in CHO-Zellen 55 Ergebnisse III C) Abb. 21 C) Transaktivität am Probasin-Promotor in CHO-Zellen D) Abb. 21 D) Transaktivität am Probasin-Promotor in HeLa-Zellen 56 Ergebnisse III Promotor MMTV (ARE)2-TATA Probasin Probasin Pem Zelllinie CHO CHO CHO HeLa HeLa EC50 4,29 x 10 -11 2,2 x 10 -10 2,39 x 10 -10 7,56 x 10 -10 6,15 x 10 -9 F) Abb. 21 Transaktivität des AR an verschiedenen Promotoren CHO- (A-C), bzw. HeLa- (D) Zellen wurden mit pSVAR-Konstrukten (WT, L712F, 23 23 FQNAA 27 und L712F + 27 FQNAA ), der konstitutiv exprimierten Renilla-Luziferase phRGTK und verschiedenen Reportergenen (A: MMTV-Luc B: (ARE)2-TATA-Luc; C/D: PB-Luc) transfektiert. 5 Stunden nach Transfektion wurde DHT in den angegebenen Konzentrationen zugegeben. Die Ergebnisse wurden nach der Transfektionseffizienz normalisiert. Der Mittelwert des WT AR bei 10 nM DHT wurde gleich 100 % gesetzt. Es wurden jeweils mindestens drei unabhängige Versuche in Triplikaten durchgeführt. Standardabweichungen wurden berechnet und als Fehlerbalken angegeben. RLU: relative Luziferase Einheiten. E) Vergleich der Konzentrations-Wirkungs-Kurven des WT AR an verschiedenen Promotoren: Aus den WTWerten aus A-D wurden mit Prism5 (GraphPad, USA) Konzentrations-Wirkungs-Kurven berechnet. Zu sehen sind von links nach rechts die Kurven der WT-Transaktivierung am MMTV-Promotor (in CHO-Zellen), fast deckungsgleich am (ARE)2-TATA-Promotor und Probasin-Promotor (beide in CHO-Zellen), Pem-Promotor (in HeLa-Zellen, die Werte entstammen dem Versuch der N-terminalen Mutationen, dargestellt in Abb. 23) und am Probasin-Promotor (in HeLa-Zellen). Die zugehörigen EC50-Werte sind ergänzend tabellarisch dargestellt. F) Western Blot der AR-Mutanten in ganzer Länge: CHO-Zellen wurden mit den pSVAR-Konstrukten (WT, L712F, 23 FQNAA 27 und L712F + 23 27 FQNAA ) und phRGTK transfektiert und die Zellen anschließend lysiert. Für den Western Blot wurden, normalisiert nach Transfektionseffizienz, zwischen 10 und 25 µl Proteinlysat verwendet. Die Immundetektion erfolgte mit dem Anti-Androgen Receptor (F39.4.1) von Biogenex als Primärantikörper und dem ECL TM Anti-Maus IgG Antikörper von Amersham als Sekundärantikörper. Das Molekular- gewicht des AR beträgt ca. 110 kDa. Nicht transfektierte CHO-Zellen (CHO) dienten der Negativkontrolle. 57 Ergebnisse III 3. NTD-Mutationen 3.1 N/C-terminale Interaktion bei NTD-Mutationen In leichteren Formen von AIS ist der in-vitro Nachweis einer Funktionseinschränkung des AR, die bei CAIS meist problemlos gelingt, weitaus schwieriger (Zuccarello et al., 2008). Unter unseren Patienten fanden sich drei N-terminale Mutationen, die mit PAIS assoziiert sind. In vorausgehenden Reportergen-Assays in CHO-Zellen konnte am (ARE)2-TATAPromotor für die Mutation S432F eine Minderung der Transaktivierung von 75 - 80 % gezeigt werden, während die Punktmutation S411N und die Deletion Δ409-411 zu keiner Funktionseinschränkung des Rezeptors führten (Holterhus et al., 2005b). Um Auswirkungen der PAIS-Mutationen auf die N/C-terminale Interaktion genauer zu analysieren, wurde die mutierte pAD-NTD (mit S411N, S432F oder Δ409-411) mit dem pBDLBD Wildtyp-Vektor sowie dem Reportergen pFR-Luc und phRGTK in CHO-Zellen kotransfektiert. Die im Luminometer detektierten Messwerte der durch DHT vermittelten Interaktion zwischen NTD und LBD sind in Abb. 22 dargestellt. Die WT-Aktivität bei 10 nM DHT wurde gleich 100 % gesetzt. Die mutierten NTDs führten zu einer leichten Minderung der N/C-Interaktion auf 80 - 90 %. Da bei den Einzelmesswerten zwischen den Gruppen gleiche Varianz gegeben war, konnte ein T-Test durchgeführt werden. Die Abweichung vom Wildtyp ist bei allen drei Mutanten statistisch signifikant (p < 0,001 siehe Tbl. 6). Die AR-Variante 23FQNAA27, die die N/C-Interaktion unterbindet, zeigte eine maximale Aktivierung von 10 % des Wildtyps (Abb. 22). A) 58 Ergebnisse III B) Abb. 22 N/C-terminale Interaktion der NTD-Mutationen A) CHO-Zellen wurden mit pBD-LBD WT und pAD-NTD Mutanten (WT, Δ409-411, S411N, S432F und 23 27 FQNAA ), dem Reportergen pFR-Luc und phRGTK transfektiert. Nach 5-stündiger Inkubation wurde 10 nM DHT (bzw. kein DHT) zugegeben. Die Interaktion der entstehenden Fusionsproteine führte zur Expression des Reportgens. Die Ergebnisse wurden nach Transfektionseffizienz normalisiert. Der Mittelwert der WTInteraktion bei 10 nM DHT wurde gleich 100 % gesetzt. Es wurden drei unabhängige Versuche in Triplikaten durchgeführt. Durch einen T-Test (Tbl. 6) wurden die Einzelwerte der mutierten Rezeptoren mit den WTWerten verglichen und ein statistisch signifikanter Unterschied ermittelt (*). RLU: relative Luziferase Einheiten. B) Western Blot der AR-NTD Fusionsproteine. Für Western-Blot-Analysen wurden CHO-Zellen mit den pADNTD Mutanten und phRGTK kotransfektiert und die Zellen anschließend lysiert. Auf den Western Blot wurden, normalisiert nach Transfektionseffizienz, zwischen 10 und 25 µl Proteinlysat aufgetragen. Die Immundetektion erfolgte mit dem Anti-Androgen Receptor (F39.4.1) von Biogenex als Primärantikörper und dem ECL TM Anti- Maus IgG Antikörper von Amersham als Sekundärantikörper. Nicht transfektierte CHO-Zellen (CHO) dienten der Negativkontrolle. Das Molekulargewicht des NTD-NFΚB-Fusionsproteins beträgt 81,3 kDa. Mittelwert ± SD WT ∆409-411 S411N S432F 100 ± 4,36 84,08 ± 5,23 88,5 ± 6,17 82,3 ± 6,39 7,019 4,567 6,743 16 15 16 = <0,001 = <0,001 = <0,001 t Freiheitsgrade 16 P Tbl. 6 T-Test zum Beweis der Signifikanz der Abweichung der N/C-Interaktion zwischen N-terminalen Mutationen und WT Innerhalb der NTD sind zwei Motive für die N/C-Interaktion entscheidend, das stärkere 23 FQNLF27- und das schwächere 433 WHTLF437-Motiv (He et al., 2000). Die untersuchten NTD-Mutationen liegen in unmittelbarer Nachbarschaft zum detektieren, ob diese sich direkt auf die Wirkung von 433 433 WHTLF437-Motiv. Um zu WHTLF437 auswirken, wurde das 23 FQNAA27 in die pAD-NTD-Vektoren integriert. Hierdurch wurde die Wechselwirkung über das 23 FQNLF27-Motiv unterbunden und die N/C-terminale Interaktion erneut unter- sucht (Abb. 23). Die maximale Aktivität mit 23FQNAA27 entsprach, wie oben erwähnt, 10 % der Aktivität mit 23 FQNLF27-Motiv. In diesem Versuch waren keine signifikanten Unter- schiede zwischen der hormonvermittelten N/C-Interaktion von Wildtyp und mutierter NTD zu erkennen (Abb. 23 A). Durch Western-Blot-Analysen wurde gezeigt, dass Wildtyp und mutierte NTDs in CHO-Zellen gleich stark exprimiert wurden (Abb. 23 B). 59 Ergebnisse III A) B) Abb. 23 N/C-Interaktion der NTD-Mutationen mit 23 27 FQNAA -Motiv A) Es wurden die Two-Hybrid-Vektoren pBD-LBD WT und pAD-NTD-Varianten (mit den Mutationen 23 27 23 FQNAA , FQNAA 27 + Δ409-411, 23 FQNAA 27 + S411N oder 23 FQNAA 27 + S432F), das Reportergen pFR- Luc und phRGTK in CHO-Zellen transfektiert. 5 Stunden nach Transfektion wurde DHT in den angegebenen Konzentrationen zugegeben und nach weiteren 18 h die Luziferase-Aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse wurden nach Transfektionseffizienz normalisiert. Der Mittelwert der 23 27 FQNAA -Mutation bei 10 nM DHT wur- de gleich 100 % gesetzt. Es wurden 3 unabhängige Versuche in Triplikaten durchgeführt. RLU: relative Luziferase Einheiten. 23 27 B) Western Blot der AR-NTD-Fusionsproteine: CHO-Zellen wurden mit den pAD-NTD Vektoren ( FQNAA , 23 FQNAA 27 + Δ409-411, 23 FQNAA 27 + S411N und 23 FQNAA 27 + S432F) und phRGTK kotransfektiert und die Zellen lysiert. Die auf die Blots aufgetragene Proteinmenge (10 bis 25 µl Proteinlysat) wurde nach Transfektionseffizienz normalisiert. Die Immundetektion erfolgte mit Anti-Androgen Receptor (F39.4.1) von Biogenex und ECL TM Anti-Maus IgG Antikörper von Amersham. Nicht transfektierte CHO-Zellen (CHO) dienten der Negativkontrolle. Das Molekulargewicht des NTD-NFΚB-Fusionsproteins beträgt 81,3 kDa. 3.2 Transaktivität der N-terminalen Mutationen am Pem-Promotor Der Androgen-abhängige Pem-Promotor reguliert im Reproduktionstrakt von Mäusen die Expression des Pem-Homeobox-Transkriptionsfaktors. Zuccarello et al. (2008) beschrieb diesen Promotor als sehr sensitiv für den Nachweis von PAIS-Mutationen. Bei zwei der beschriebenen N-terminalen Mutationen war in bisherigen Studien keine Funktionseinschränkung in-vitro nachweisbar gewesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Transaktivierungsfunktion des AR mit N-terminalen Mutationen am sensitiven Pem-Promotor unter- 60 Ergebnisse III sucht. Hierzu wurden die mutierten pSVAR-Vektoren im Vergleich zum Wildtyp mit dem Reportergen Pem-luc und phRGTK in HeLa-Zellen transfektiert. Der Wildtyp-AR zeigte eine hormonabhängige Aktivierung des Reportergens (Abb. 24). Bei 0,1 nM DHT war ein erster Anstieg auf etwa 10 % der Endaktivität zu sehen. Bei 1 nM DHT lag die Transaktivität bei 60 - 70 %, 10 nM DHT wurden gleich 100 % gesetzt. Bei 100 nM wurden 100 120 % erreicht. Die mutierten Rezeptoren zeigten an diesem Promotor keine Reduktion der Transaktivität (Abb. 24). Auch die Mutation S432F, die am (ARE)2-TATA-Promotor die Transaktivität im Vergleich zum WT deutlich reduzierte, minderte die Transaktivierungsfunktion des AR am Pem-Promotor nicht. Durch Western-Blot-Analysen waren in Vorversuchen Expressionsunterschiede zwischen den verschiedenen AR-Mutanten ausgeschlossen worden (Holterhus et al. 2005b). Abb. 24 Transaktivität des AR mit NTD-Mutationen am Pem-Promotor Die pSVAR-Mutanten (WT, Δ409-411, S411N und S432F) wurden mit dem Reportergen Pem-Luc und phRGTK in CHO-Zellen transfektiert. Nach 5 Stunden wurde DHT in angegebener Konzentration zugegeben. Die Luziferaseaktivitäten wurden nach weiterer 18-stündiger Inkubation bestimmt. Die Ergebnisse wurden nach der Transfektionseffizienz normalisiert. Der Mittelwert des Wildtyp-AR bei 10 nM DHT wurde gleich 100 % gesetzt. Es wurden mindestens 3 unabhängige Versuche in Triplikaten durchgeführt. RLU: relative Luziferase Einheiten. 61 Diskussion IV IV Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurden acht bekannte Mutationen des AR im Hinblick auf ihre Funktionalität untersucht. Hierzu wurden Zellmodelle eingesetzt, in denen die Transaktivierungsfähigkeit des Rezeptors, die Interaktion zwischen N- und C-Terminus des AR und die Interaktion der LBD mit zwei bekannten Kofaktoren analysiert wurde. Reportergen-Assays stellen ein etabliertes Verfahren dar, um die Expression von Genen und die Funktion von Transkriptionsfaktoren zu analysieren (Groskreutz und Schenborn, 1997). Auch in Studien zu Mutationen des AR werden sie verwendet, um die Funktion des Rezeptors einschätzen zu können (Zuccarello et al., 2008; Bevan et al., 1996; Jääskeläinen et al., 2006). In der hier vorgestellten Arbeit wurden drei verschiedene Reportergenmodelle eingesetzt. Um die Transaktivierungsfähigkeit der mutierten ARs zu untersuchen, wurde ein klassischer Reportergen-Assay durchgeführt. Hierzu wurden Expressionsvektoren des Androgenrezeptors sowie verschiedene Reportergene mit Androgen-abhängigem Promotor mit dem Verfahren der transienten Transfektion in Mammalia-Zellen eingebracht. Durch die Messung der Expression des Reportergens sind Rückschlüsse auf die Funktion des AR möglich. Die N/C-Interaktion wurde durch den Einsatz eines Mammalian-Two-Hybrid-Systems untersucht. In Studien von Ghali et al. (2003) zeigte die Analyse der N/C-terminalen Interaktion Ergebnisse, die mit dem klinischen Bild von fünf AIS-Patienten gut korrelierten. Eine Einschränkung der N/C-terminalen Interaktion wurde als mögliche Ursache von AIS in Patienten mit Mutationen der LBD, die die Hormonbindung nicht stark beeinflussen, vermutet (Thompson et al., 2001). Für den Mammalian-Two-Hybrid-Assay wurden die NTD und LBD separat in Two-Hybrid-Vektoren (pAD-NTD und pBD-LBD) kloniert, wodurch sie als Fusionsproteine mit Domänen anderer Proteine exprimiert werden. Interagieren die beiden Fusionsproteine miteinander, entsteht ein funktionierender Transkriptionsfaktor, der die Expression eines Reportergens initiiert. Da nur die spezifische Interaktion zwischen NTD und LBD die Expression des Reportergens auslöst, eignet sich dieses Verfahren zur Analyse der N/C-Interaktion. Neuere Studien zeigten, dass die Hinge-Region (AS 624-639) einen inhibierenden Effekt auf die N/C-terminale Interaktion sowie auf Kofaktorbindungen ausübt (Askew et al., 2007, Haelens et al, 2007). Deeb et al. (2008) zeigten, dass die Hinge-Region eine regulierende Rolle bei der N/C-terminalen Interaktion spielt. Eine Mutation der Hinge-Region, R629W, führte zu einer fehlenden N/C-Interaktion im Two-Hybrid-Assay. Deswegen wurde in den Two-Hybrid-LBD-Vektor (pBD-LBD) die LBD ohne Hinge-Region, von Aminosäure 644 bis 919, integriert. 62 Diskussion IV Der AR bildet über verschiedene Oberflächenstrukturen Interaktionen mit regulatorischen Proteinen aus. Die AF2 der LBD kann mit FXXLF- und LXXLL-Motiven von Kofaktoren (Heery et al., 1997; Hsu et al., 2003) bzw. dem FQNLF-Motiv der NTD (He et al., 2000; Steketee et al., 2002) interagieren. Die klassischen p160-Koaktivatoren besitzen LXXLLMotive und konkurrieren mit dem FQNLF-Motiv der NTD um die Bindung an die AF2 (Dubbink et al., 2004). Dabei bindet das FQNLF-Motiv die AF2 mit höherer Affinität als das Leucin-reiche Motiv der Kofaktoren (Hur et al., 2004). Ein vergleichbares FXXLFMotiv wurde auch in einigen AR-spezifischen Kofaktoren wie ARA 54 und ARA70 detektiert (Kang et al., 1999; Yeh et al., 1999, He et al., 2002b). Van de Wijngaart et al. (2006) zeigte, dass auch FXXFF- und FXXMF-Motive mit der AF2 interagieren können. Dadurch erweitert sich die Zahl der interagierenden Proteine. Um die Interaktion von Kofaktoren mit den mutierten Rezeptoren zu untersuchen, wurden zwei strukturell unterschiedliche Kofaktoren des AR ausgewählt. Beide verstärken die Transaktivität des AR in Reportergen-Assays. SRC1e gehört zu den p160 Koaktivatoren und bindet über ein LXXLL-Motiv an die AF2 und über eine Glutamin-reiche Region an die NTD des AR (Ma et al., 1999). BAG1L gehört zu einer Gruppe von Kochaperonen und interagiert ebenfalls sowohl mit der NTD als auch der LBD des AR (Shatkina et al., 2003). Die genaue Bindungsregion in der LBD ist bisher unbekannt. Um die Auswirkung der in der LBD liegenden Mutationen auf die isolierte AF2 zu analysieren, wurde der Two-Hybrid-Vektor der LBD (pBD-LBD) verwendet. In diesem Vektor sind weder NTD noch Hinge-Region enthalten, dadurch wird eine Überlagerung durch Wechselwirkungen zwischen NTD und Kofaktor vermieden und die inhibierende Wirkung der Hinge-Region unterbunden. Im Zellmodell wurde der pBD-LBD-Vektor mit einem Reportergen und dem Expressionsvektor eines Kofaktors kotransfektiert. Die LBD ist selbst in der Lage, zelluläre Kofaktoren zu rekrutieren und die Expression des Reportergens in Gang zu setzen. Um die zusätzliche Expressionssteigerung durch die Überexpression des Kofaktors zu erkennen, wurde im Vergleich eine Kotransfektion mit dem leeren Expressions-Vektor, ohne Gen des Kofaktors, durchgeführt. Die Experimente wurden in Triplikaten mit mindestens 3 unabhängigen Wiederholungen durchgeführt. Um Schwankungen der Transfektionseffizienz zu vermeiden, wurden der Vektor der konstitutiv exprimierten Renilla-Luziferase (phRGTK) kotransfektiert und die Ergebnisse nach den Renilla-Messwerten normalisiert. Die DNA aller verwendeten Vektoren wurde durch Sequenzierung verifiziert. Choong et al. (1996) beschrieb eine Mutation des AR, die durch ihre Lage die Translation des Rezeptors verminderte und dadurch eine partielle Androgenresistenz in den betroffenen Individuen hervorrief. Mit Western-BlotAnalysen konnte gezeigt werden, dass die Rezeptoren bzw. Rezeptordomänen mit den 8 untersuchten Mutationen in Säugerzellen gleich stark wie der Wildtyp exprimiert werden. 63 Diskussion IV Unterschiede in der Transaktivierung der Reportergene sind somit auf eine eingeschränkte Funktion der mutierten Rezeptoren zurückzuführen. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zellmodelle haben den Nachteil, dass die Funktion des AR nicht unter physiologischen Bedingungen getestet wurde. Das Einbringen der Rezeptor-DNA in die Säugerzellen führt zu einer Überexpression des AR in den Mammalia-Zellen, die weit über dem normalen Niveau liegt. Hinzu kommt, dass die DNA der Zielgene des AR im Nukleus normalerweise als Chromatin vorliegt. Im verwendeten Zellmodell sind die Reportergene in den Plasmiden viel freier exponiert. In Studien von Li et al. (2007) konnte gezeigt werden, dass verschiedene verkürzte AR-Mutanten in der Lage waren, Reportergene zu aktivieren, während eine Transkriptionsaktivierung von im Chromatin befindlichen Androgen-responsiven Genen nicht möglich war. Für das „Entpacken“ von Genen aus Chromatin ist das Zusammenspiel vieler regulatorischer Proteine nötig. Diese Interaktionen werden bei den durchgeführten Versuchen außer Acht gelassen, könnten aber die Funktion der mutierten ARs in-vivo maßgeblich beeinflussen. Der Hauptteil der Experimente wurde in CHO-K1 Zellen durchgeführt. Diese Zelllinie stammt aus dem Ovar chinesischer Hamster und wird standardmäßig für Transfektionen verwendet. Wie in der Literatur beschrieben und durch die durchgeführten Western Blots bestätigt, findet in CHO-Zellen keine endogene Expression des AR statt (Delypere et al., 1992). Als weitere Zelllinie wurden HeLa-Zellen verwendet, deren Verwendung ebenfalls in Transfektionsversuchen etabliert ist. Der AR wird in dieser Zelllinie nicht oder nur wenig exprimiert (Read et al., 2007). Inwieweit sich die genregulatorischen Elemente und das Set der zellulären Kofaktoren zwischen den verwendeten Zelllinien und in den Geweben der AIS-Patienten unterscheiden, ist nicht bekannt. Es wurde nachgewiesen, dass die Zusammensetzung der Kofaktoren, und damit die Sensibilität auf bestimmte Hormone, auch innerhalb des menschlichen Organismus, in verschiedenen Geweben und zu verschiedenen Zeitpunkten des Lebens Schwankungen unterliegt (Bebermeier et al. 2006; Trapman und Dubbink, 2007). Hieraus lässt sich schließen, dass beim Einsatz humaner Zellen die Verteilung der Kofaktoren zwischen verschiedenen Zellpassagen variieren würde. Vergleiche zwischen den in CHO-Zellen und HeLa-Zellen durchgeführten Experimenten zeigten ebenfalls große Unterschiede in der Funktionalität des Wildtyp-Rezeptors. Dieses bestätigt, dass sich die koregulatorischen Proteine zwischen den beiden Zelllinien unterscheiden. Während kleinere Hormonkonzentrationen in CHO-Zellen bereits für die Rekrutierung der Transkriptions-initiierenden Kofaktoren durch den AR ausreichten, wurde in HeLa-Zellen eine vergleichbare Aktivierung erst bei höheren DHT-Mengen erreicht. Das Zellmodell stellt ein stark vereinfachtes und reduziertes System dar, in dem lediglich die Wirkung des Androgenrezeptors an einem definierten Androgen-abhängigen Reportergen untersucht wird. Durch den Einsatz verschiedener Promotoren im Vergleich und 64 Diskussion IV die parallele Untersuchung der N/C-terminalen Interaktion und Kofaktorinteraktion wird es möglich, die Rezeptorfunktion auf verschiedenen Ebenen zu analysieren. Ein Vergleich des Wildtyps mit den mutierten Rezeptoren gibt weitere Aufschlüsse über die veränderte Funktion. Durch den Einsatz eines breiten Hormonspektrums, von 0 nM DHT bis zu supraphysiologischen Werten von 100 nM, konnten die mutierten Rezeptoren differenziert in ihrer Abhängigkeit von DHT untersucht werden. Die Standardabweichung in den Transfektionsversuchen war tolerabel und die Ergebnisse konsistent und wiederholbar, sodass Aussagen über die Funktionalität der mutierten Rezeptoren auf Basis der gewonnenen Ergebnisse möglich sind. In Grenzen lassen sich die Ergebnisse aus dem Zellmodell auf die Rolle der mutierten Androgenrezeptoren in der Entstehung von AIS projizieren. Genotyp-Phänotyp-Korrelationen können durch die Korrelation zwischen einer gut charakterisierten Funktionalität des mutierten Rezeptors und dem Phänotyp des betroffenen Individuums ergänzt werden. Dieses ist auch im Hinblick auf medizinische Therapieansätze im Umgang mit den betroffenen Patienten wichtig. In dieser Arbeit wurden acht Mutationen des Androgenrezeptors, die eine Bindung von Androgenen in der Ligandenbindungsgrube der LBD zulassen, analysiert. Fünf Mutationen befinden sich in der LBD, von diesen wurden zwei bei PAIS- (L712F und Q798E) und drei bei CAIS-Patienten (P723S, P904S und H917R) gefunden. Eine tabellarische Übersicht der Ergebnisse für diese Mutationen ist in Tbl. 7 dargestellt. Die restlichen drei Mutationen (Δ409-411, S411N und S432F) liegen in der NTD des AR und sind mit PAIS assoziiert, wobei der Nachweis einer Funktionseinschränkung in-vitro nicht bei allen Mutationen vorlag und die Ätiologie des PAIS noch zu ergründen war. Die PAIS-Mutation L712F war in einer Familie bei drei Brüdern und ihrem Onkel gefunden worden (Holterhus et al., 2000). Auffällig war besonders die große phänotypische Varianz, die vom männlichen Phänotyp des Onkels mit Mikropenis und Gynäkomastie bis zu einem intersexuellen Genital mit Skrotum bipartum bei einem der Brüder reichte. In den durchgeführten Reportergen-Assays am (ARE)2-TATA-, Probasin- und MMTV-Promotor zeigte der mutierte Rezeptor bei höheren DHT-Konzentrationen (10-100 nM DHT) eine Transaktivierung von 60 - 70 % des Wildtyps. Die Ergebnisse zum (ARE)2-TATA- und MMTVPromotor stimmen mit vorherigen Ergebnissen der Arbeitsgruppe überein (Holterhus et al., 2000; Holterhus et al., 2005a). Am Probasin-Promotor war die Transaktivierung für den AR mit L712F noch nicht bestimmt worden. Es zeigte sich auch hier eine vorhandene Transaktivierungsfunktion, die allerdings deutlich unter der Wildtyp-Aktivität lag und insofern die Diagnose eines PAIS bestätigte. An allen verwendeten Promotoren benötigte der mutierte Rezeptor deutlich höhere DHT-Konzentrationen, um eine ReportergenTranskription auslösen zu können. Eine erhöhte Kd war bereits von He et al. (2006) de- 65 Diskussion IV tektiert worden. Der durchgeführte Two-Hybrid-Assay ergab eine vollkommen aufgehobene N/C-terminale Interaktion durch die Mutation L712F, selbst bei der supraphysiologischen Konzentration von 100 nM DHT. Es ist davon auszugehen, dass der HormonRezeptor-Komplex durch die fehlende N/C-Interaktion weniger stabil ist und möglicherweise mehr unspezifischen Proteinbindungen vor der DNA-Bindung als der Wildtyp ausgesetzt ist (van Royen et al., 2007). Dies korreliert mit einer erhöhten Kd. Eine Diskrepanz zwischen Ergebnissen der N/C-Interaktion im Two-Hybrid-Assay und Versuchen mit dem vollständigen AR-Protein waren auch bei Need et al. (2009) bei Versuchen zu den Aminosäuren 501-535 aufgetaucht. Die N/C-Interaktion ist ein sehr komplexer Prozess, sodass sich die Ergebnisse des Two-Hybrid-Assays nur bedingt auf Vorgänge in-vivo übertragen lassen. Eine entscheidende Rolle scheint die N/C-Interaktion im Zusammenhang mit in Chromatin integrierten Genen zu spielen (Li et al. 2006). Hierfür spricht auch, dass die Transaktivierungsfunktion des AR mit L712F im Reportergen-Assay viel weniger eingeschränkt war, als es eine fehlende N/C-Interaktion zunächst vermuten lässt. Da sich die Auswirkungen der fehlenden N/C-Interaktion in-vivo nur erahnen lassen, wäre es im nächsten Schritt interessant zu untersuchen, inwieweit der AR mit L712F in der Lage ist, die Expression von Zielgenen zu initiieren, die in Form von Chromatin vorliegen. Die isolierte LBD mit L712F war nicht in der Lage, zelluläre Kofaktoren zu rekrutieren und die Transkription eines Reportergens zu initiieren. Auch die Überexpression der Kofaktoren SRC1e und BAG1L konnte die Transaktivierung nicht positiv beeinflussen. Studien von Dubbink et al. (2006) zeigten, dass die umliegenden Aminosäuren der Kofaktorbindungsgrube einen großen Einfluss sowohl auf die Bindung von FXXLF als auch LXXLLMotiven haben. Die Mutation L712F liegt am Rand dieser Bindungsgrube und ist von hydrophoben Seitenketten umgeben. He et al. (2006) vermutete durch die prominente Seitenkette des Phenylalanins bereits eine gestörte Interaktion mit FXXLF-Motiven. Normalerweise liegt das Leucin an Position 712 in unmittelbarer Nähe zum Leucin an Position 4 des FXXLF-Motivs sowie zu Aminosäuren der Helix 3, 4 und 12. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse untermauern weiter, dass die Mutation L712F die Funktion der AF2 in der Interaktion mit Kofaktoren und dem FQNLF-Motiv der NTD direkt unterbindet. In seiner Gesamtheit wird die Funktion des ARs durch die Mutation L712F sehr viel weniger beeinträchtigt als die alleinige Funktion der AF2. Die untersuchten Kofaktoren sind in der Lage, auch über die NTD mit dem AR zu interagieren. Diese Interaktion ist durch die Mutation L712F nicht mit betroffen. Die Möglichkeit des Rezeptors, die Funktion der gestörten AF2 über andere Kofaktorbindungsstellen auszugleichen, wird auch durch die deutliche Virilisierung der betroffenen Patienten bekräftigt. Der mutierte Rezeptor benötigt zur Aktivierung und Stabilisierung des Hormon-Rezeptor-Komplexes deutlich höhere Hormonkonzentrationen als der Wildtyprezeptor. Die Konzentration von DHT und Testos- 66 Diskussion IV teron während der embryonalen Entwicklung spielt daher eine wichtige modulierende Rolle im Hinblick auf die große phänotypische Varianz. Durch Hormontherapien konnte bei zwei der betroffenen Brüder eine deutliche Verstärkung der Virilisierung erreicht werden (Holterhus et al., 2000). Adachi et al. (2000) beschrieb einen CAIS-Patienten bei dem keine Mutation im Gen des AR gefunden werden konnte und vermutete das Fehlen eines entscheidenden Kofaktors als mögliche Ursache des AIS. Studien über das mit dem AR interagierende Kochaperon FKBP52 zeigten, dass Mäuse ohne das Gen von FKBP52 eine Störung der Geschlechtsentwicklung aufwiesen, die als Androgenresistenz gewertet werden kann (Cheung-Flynn et al. 2005, Hong et al., 2007). Eine Vielzahl von regulatorischen Proteinen, die mit dem AR interagieren, wurde bereits beschrieben (Trapman und Dubbink, 2007). Brooke et al. (2008) wiesen nach, dass die LBD-Mutationen T877A und W743L die Rekrutierung von Kofaktoren im Vergleich zum Wildtyp verändern. Schwierig bleibt es bisher, die Relevanz einzelner Kofaktorbindungen nachzuweisen. Der Androgenrezeptor mit L712F ist in seiner Kofaktorinteraktion eingeschränkt. Es lässt sich vermuten, dass die Interaktion je nach Art des Kofaktors unterschiedlich stark beeinträchtigt ist. Durch Unterschiede in der Expression verschiedener Kofaktoren während der Geschlechtsentwicklung ließe sich die unterschiedliche Ausprägung der Androgenresistenz bei den betroffenen Familienmitgliedern erklären. Das Vorliegen der Mutation L712F verändert die Funktion des AR maßgeblich. Der mutierte Rezeptor ist nicht in der Lage, eine N/C-terminale Interaktion auszubilden, und die Interaktion mit Kofaktoren über die LBD ist stark beeinträchtigt. Es bleiben weiter viele Details der Rezeptorfunktion im Unklaren, die in weiteren Funktionsanalysen eruiert werden sollten. Es besteht die Möglichkeit, dass die Ergebnisse letzendlich auch in der Behandlung betroffener Patienten umgesetzt werden können und eine differenzierte Therapie angeborener Störungen ermöglichen. Zwischen Helix 3 und 4 der LBD liegt die CAIS-Mutation P723S. Normalerweise bilden die beiden Helices zusammen mit der Helix 12 nach der Aktivierung durch DHT die AF2. Am (ARE)2-TATA-Promotor konnte eine Transaktivierung durch den AR mit der Mutation P723S erst bei hohen bis sehr hohen DHT-Werten (10-100 nM DHT) erreicht werden. Bei niedrigeren Hormonkonzentrationen war keine Aktivierung sichtbar. Dieses Ergebnis weist auf eine erhöhte Kd des mutierten Rezeptors hin. Bei 100 nM DHT war eine N/Cterminale Interaktion von 40 % der Wildtyp-Interaktion detektierbar. Die mutierte LBD war nicht in der Lage, durch die Rekrutierung zellulärer Kofaktoren die Transaktivierung eines Reportergens auszulösen. Durch die Überexpression der Kofaktoren SRC1e und BAG1L konnte bei physiologischen DHT-Werten ebenfalls keine Transaktivität erreicht werden. 67 Diskussion IV Lediglich bei 100 nM DHT und der Überexpression von BAG1L war eine leichte Expression des Reportergens messbar. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Mutation die Ausbildung einer aktiven AF2 unter physiologischen Hormonkonzentrationen verhindert. Allerdings wurde in einem Patienten, der die Mutation P723S aufwies, die Ausbildung von Nebenhoden nachgewiesen (Hannema et al., 2004). Nebenhoden bilden sich unter parakrinem Testosteroneinfluss im Zuge der embryonalen Entwicklung aus den Wolff’schen Gängen aus. Dieses lässt darauf schließen, dass in diesem Fall die embryonalen Hormonkonzentrationen für die Aktivierung des mutierten Rezeptors ausgereicht haben und dadurch die Ausbildung der Nebenhoden vermitteln konnten. Die Ergebnisse der durchgeführten Funktionsanalysen für den AR mit P723S korrelieren gut mit dem klinischen Bild einer kompletten Androgenresistenz. Die Mutation Q798E ist in verschiedenen Fällen von PAIS und MAIS gefunden worden. In früheren Untersuchungen war in Reportergen-Assays mit dem synthetischen Androgen Miboleron eine signifikante Reduktion der Transaktivierung nachgewiesen worden (Bevan et al., 1996). Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigten, dass der mutierte Rezeptor eine dem Wildtyp vergleichbare maximale Transaktivierung am (ARE)2TATA-Promotor aufweist. Die EC50 wies mit 3,691 x 10-10 (CI: 3,324 x 10-10 – 4,099 x 1010 ) einen etwas niedrigeren Wert auf als die EC50 des Wildtyps mit 1,55 x 10-10 (CI: 1,4 x 10-10 – 1,7 x 10-10). Die N/C-terminale Interaktion war von Jääskeläinen et al. (2006) mit dem Ratten-AR ebenfalls in einem Mammalian-Two-Hybrid-System untersucht worden. Die Ergebnisse waren zu den hier dargestellten kongruent. Es fand sich keine Einschränkung der N/C-Interaktion durch den mutierten Rezeptor. Die isolierte LBD mit der Mutation Q798E war in der Lage, im gleichen Ausmaß wie der Wildtyp, zelluläre Kofaktoren zu rekrutieren und die Expression des Reportergens zu aktivieren. Die zusätzliche Überexpression der Kofaktoren SRC1e und BAG1L konnte ebenfalls, wie beim Wildtyp, die Transaktivität der LBD in etwa verdoppeln. In den durchgeführten Reportergen-Assays gelang der Nachweis einer Funktionseinschränkung des AR durch die Mutation Q798E nicht. Es bleibt weiter abzuklären, inwieweit diese Mutation für die Entwicklung von PAIS und MAIS in den Patienten ursächlich ist. Das Zusammentreffen sehr niedriger Testosteronkonzentrationen während der embryonalen Entwicklung und eine geringe Expression spezifischer Kofaktoren könnte zum klinischen Bild eines PAIS führen. In den Fällen von MAIS war eine Azoospermie und Infertilität der betroffenen Patienten beschrieben worden. Dieses ließe sich ebenfalls durch unterdurchschnittliche Konzentrationen der Androgene Testosteron und DHT und eine leicht verminderte Transaktivierung des mutierten Rezeptors erklären. Das Vorliegen einer weiteren Ursache der verminderten Androgenwirkung würde die Unterschiede im 68 Diskussion IV Grad des AIS zwischen den betroffenen Patienten erklären können. Unbekannte Mutationen in den Genen von Kofaktoren des AR wären denkbar. In der Veröffentlichung von Wong et al. (2008) wird ein vergleichbarer Fall für die PAIS-Mutation F826L beschrieben. Da die Mutation Q798E mehrfach unabhängig in Fällen von PAIS und MAIS detektiert wurde, ist von einer ursächlichen Beteiligung der Mutation Q798E an der Entstehung von AIS auszugehen. Die Hormonbindung führt zu einer Konformationsänderung der LBD. Der gesamte CTerminus des AR verlagert sich, und Helix 12 bedeckt die Ligandenbindungsgrube. Bei dieser Umlagerung bildet sich gleichzeitig eine Kofaktorbindungsgrube (AF2) aus (Moras und Gronemeyer, 1998). Die C-terminalen Aminosäuren sind in der Funktion des AR unabdingbar (Tahiri et al., 2001). Auch beim Mineralokortikoidrezeptor sind die letzten 4 AS der LBD für die Hormonbindung und Rezeptoraktivierung entscheidend (Couette et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit wurden Punktmutationen untersucht, die sich weit am CTerminus des ARs befinden und möglicherweise die Funktion der AF2 stören. Die betroffenen Aminosäuren, Prolin 904, Phenylalanin 916 und Histidin 917, sind unter den Steroidhormonrezeptoren konserviert (Lanz und Rusconi, 1994). Die Mutation P904S ist am Ende der Helix 12 lokalisiert. In der Literatur wurden zwei weitere Missense-Mutationen, P904H und P904R, an gleicher Stelle beschrieben (McPhaul et al., 1992, Melo et al., 2003). Diese Mutationen, sowie auch P904S, sind mit CAIS assoziiert, was die wichtige Rolle des Prolins an der Position 904 unterstreicht. In den durchgeführten Versuchen zeigte der AR mit P904S ähnliche Ergebnisse wie der AR mit P723S. Am (ARE)2-TATA-Promotor initiierte der mutierte Rezeptor erst bei 10-100 nM DHT eine Transaktivierung des Reportergens. Aus den Messdaten konnte keine EC50 berechnet werden, da bei den eingesetzten DHT-Konzentrationen keine Sättigung des Modells erreicht wurde. Der vermutete Wert liegt etwas unter dem geschätzten Wert des AR mit P723S. Die Mutation P904S wirkte sich auch auf die N/C-terminale Interaktion aus. Bei 100 nM DHT war diese auf 50 % der Wildtyp-Interaktion reduziert. Die isolierte LBD des mutierten Rezeptors konnte zelluläre Kofaktoren nicht in ausreichendem Maße rekrutieren, um die Expression eines Reportergens anzuschalten. Die zusätzliche Überexpression des Kofaktors BAG1L hatte keinen transkriptionsaktivierenden Effekt. Die Überexpression von SRC1e konnte hingegen bei 100 nM DHT eine sichtbare Expression des Reportergens von 20 % der Wildtyp-Aktivität mit Kofaktor auslösen. Diese Ergebnisse sprechen für eine gestörte Funktion der AF2 durch die vorliegende Mutation. Nur bei supraphysiologischen Hormonkonzentrationen in-vitro konnte der mutierte Rezeptor in dem Maße aktiviert und 69 Diskussion IV stabilisiert werden, dass eine geringe Rezeptorfunktion nachweisbar war. Diese Ergebnisse korrelieren gut mit dem assoziierten klinischen Bild eines CAIS. Im C-terminalen Ende des AR, hinter Helix 12, befindet sich die Mutation H917R. Diese Mutation wurde in einem Fall von CAIS detektiert (Ahmed et al., 2000). In den vorliegenden Versuchen zeigte der mutierte Rezeptor ausnahmslos eine gute – aber im Vergleich zum Wildtyp verzögerte – Antwort auf DHT. Am (ARE)2-TATA-Promotor lag die EC50 eine Zehnerpotenz über der des Wildtyps. Bei 100 nM erreichte der mutierte Rezeptor 80 90 % der Wildtyp-Aktivität. Tahiri et al. (2001) führten Studien zum C-Terminus des AR durch. Dabei zeigte der AR mit einer positionsgleichen Mutation (H917A) am MMTVPromotor ebenfalls eine zehnfach erhöhte EC50 und im Bindungsassay eine erhöhte Kd (1 nM statt 0,5 nM beim WT). Die Mutation H917A wurde bisher nicht in Fällen von AIS beschrieben und war zur Analyse des C-Terminus konstruiert worden. Da die Ergebnisse zur Transaktivität zwischen H917A und H917R ähnlich sind, ist anzunehmen, dass die Kd des AR mit H917R ebenfalls erhöht ist. Die N/C-terminale Interaktion des Rezeptors mit H917R wurde durch steigende DHTKonzentrationen zunehmend stabilisiert, und bei 100 nM DHT lag sie bei 90 % der Wildtyp-Interaktion. Dies korreliert ebenfalls gut mit einer erhöhten Kd und lässt vermuten, dass eine direkte Auswirkung auf die N/C-terminale Interaktion durch die H917R nicht vorliegt. Die isolierte LBD zeigte eine deutlich verminderte transaktivierende Aktivität, die bei 50 % des Wildtyps lag und durch die Überexpression der Kofaktoren BAG1L und SRC1e jeweils noch verdoppelt werden konnte. Die Ergebnisse zeigen, dass die AF2 des Rezeptors durch die Mutation beeinträchtigt ist. Vor allem bei höheren Hormonkonzentrationen wird der Rezeptor jedoch zunehmend stabilisiert und zeigt in-vitro eine deutliche Restfunktion. Im Gegensatz zu den anderen untersuchten CAIS-Mutationen und auch zur Mutation L712F ist die Funktion der AF2 relativ gut erhalten. Diese Ergebnisse stehen in gewissem Widerspruch zum klinischen Bild eines CAIS. Estebanez-Perpina et al. beschrieben eine bisher unbekannte Kofaktorbindungsstelle, genannt binding function 3 (BF-3), die regulatorisch in die Funktion der AF2 eingreift. BF-3 besteht aus den Aminosäuren E829, N833, F683 und Y834 und liegt in Nachbarschaft zur AF2 auf der Oberfläche der LBD. Mutationen in dieser Region sind mit AIS sowie Prostatakarzinomen assoziiert (Estebanez-Perpina et al., 2007). Es ist durchaus möglich, dass weitere Proteinstrukturen der LBD ebenfalls wichtige regulatorische Funktionen innehaben. Möglicherweise wirkt sich die Mutation H917R weniger auf die AF2, aber dafür auf bisher unbekannte Kofaktor-Interaktionsstellen des AR aus, deren Funktion in den bisher durchgeführten Reportergen-Assays nicht untersucht wurde. Eine andere Erklärung für die Entstehung eines CAIS-Phänotyps wäre die selektive Interaktionsstörung mit speziellen Kofaktoren, die in der Zeit der embryonalen Geschlechts- 70 Diskussion IV entwicklung eine große Rolle spielen. Auch möglich wäre das Zusammentreffen der Mutation H917R mit einer zusätzlichen Mutation in Kofaktorgenen. Ausgehend von den Ergebnissen der durchgeführten Versuche ist es denkbar, dass die Mutation in einem anderen Fall zum klinischen Bild eines PAIS führen kann. Auch eine stärkere Virilisierung in der Pubertät durch den Anstieg von Testosteron ist vorstellbar. Die durchgeführten Funktionsanalysen konnten das Bild eines CAIS bei Vorliegen der Mutation H917R nicht vollständig erklären und zeigen die Grenzen der verwendeten Methoden auf. = = () = Transaktivierung am (ARE)2-TATAPromotor (100 nM DHT) CAIS / = Promotor (1 nM DHT) CAIS F916X = = Transaktivierung am (ARE)2-TATA- PAIS CAIS H917R PAIS P904S Klinischer Grad des AIS Q798E P723S L712F Mutation N/C-Interaktion (1 nM DHT) isolierten LBD (100 nM DHT) Tbl. 7 Tabellarische Darstellung der Ergebnisse der LBD-Mutationen = () stärker verminderte Funktion im Vergleich zum WT Rezeptor Funktion wie der WT Rezeptor verminderte Funktion im Vergleich zum WT Rezeptor der Kofaktorinteraktion LBD (1 nM DHT) isolierten der () Kofaktorinteraktion = N/C-Interaktion (100 nM DHT) Kaum Funktion sichtbar keine nachweisbare Funktion Legende zu Tbl. 7 In der NTD sind vor allem Stoppkodon-Mutationen bekannt, die den Abbruch der Aminosäurekette bei der AR-Synthese bewirken und zu CAIS führen. Auch MAIS und PAIS Mutationen sind beschrieben worden (Wang et al., 1998; Ferlin et al., 2006). In der vorliegenden Arbeit wurden die Missense-Mutationen S411N, S432F und die 9 Basenpaardele- 71 Diskussion IV tion Δ409-411 untersucht, die mit PAIS assoziiert sind (Holterhus et al., 2005b). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die N/C-terminale Interaktion der mutierten NTDs im Two-HybridAssay untersucht. Dabei konnte bei allen Mutationen eine signifikant reduzierte N/CInteraktion von 80 - 90 % der Wildtyp-Interaktion detekiert werden (siehe Tbl. 6). Die Mutationen scheinen die variable NTD in ihrer Konformation leicht zu verändern und somit auf die Interaktion zwischen N- und C-Terminus modulierend einzuwirken. Das 23 FQNLF27-Motiv, das direkt mit der AF2 der LBD interagiert, befindet sich ganz am NH2- Terminus des Rezeptors und liegt somit nicht in direkter räumlicher Nähe zu den Mutationen. Ein zweites ähnliches Motiv, 433 WHTLF437, befindet sich in der Tau-5 der NTD, direkt neben den drei untersuchten Mutationen. He et al. (2000) beschrieben, dass die Ausbildung der N/C-Interaktion auch über das WHTLF-Motiv möglich ist, allerdings sehr viel schwächer ausgeprägt als über das FQNLF-Motiv. Um den starken Effekt von FQNLF auf die N/C-Interaktion auszuschalten, wurde in den pAD-NTD-Vektoren FQNLF zu FQNAA verändert und erneut die N/C-Interaktion im Two-Hybrid-Assay untersucht. Es gelang nicht, einen Unterschied zwischen Wildtyp-NTD mit FQNAA-Motiv und mutierten NTDs mit FQNAA-Motiv festzustellen. Das WHTLF-Motiv scheint für die N/C-Interaktion nicht die vorher vermutete Rolle zu spielen. Neuere Studien zeigten, dass die Tau-5 mit dem WHTLF-Motiv eine Androgen-unabhängige transaktivierende Domäne ist, die bei der Entstehung des Hormon-insensitiven Prostata-Karzinoms eine Rolle spielen könnte (Dehm et al., 2007). Das verwendete Modell untersucht die Auswirkungen der Mutationen nur im Hinblick auf die N/C-Interaktion und kann andere möglicherweise veränderte Funktionen des WHTLF-Motivs somit nicht detektieren. In vorhergehenden Studien wurde die Transaktivität der drei N-terminalen Mutationen bereits am (ARE)2-TATA-Promotor im Vergleich zum Wildtyp untersucht (Holterhus et al., 2005b). Dabei konnte nur für die Mutation S432F eine Funktionseinschränkung des Rezeptors in-vitro nachgewiesen werden. Der Pem-Promotor wurde von Zuccarello et al. (2008) als sehr sensitiv für die Funktionsanalyse von PAIS-Mutationen beschrieben. Aus diesem Grund wurde er im Rahmen dieser Arbeit verwendet, um die Transaktivierungsfunktion des AR mit den N-terminalen Mutationen zu untersuchen. Im Vergleich zum Wildtyp ergab sich jedoch bei keiner der drei Mutationen eine verminderte Funktion des Rezeptors. Dieses zeigt, dass der (ARE)2-TATA-Promotor ein sensitiver Promotor für die Funktionsanalyse von PAIS und CAIS-Mutationen ist, im Fall der Mutation S432F sensitiver als der Pem-Promotor, und sich auch weiterhin für die Funktionsanalyse mutierter ARs eignet. Eine eingeschränkte Rezeptorfunktion konnte für die Mutationen S411N und Δ409-411, bis auf eine leicht verminderte N/C-terminale Interaktion, nicht nachgewiesen werden. Die Mutationen scheinen die Integrität der NTD nachweislich zu verändern. Es kann jedoch 72 Diskussion IV nicht sicher davon ausgegangen werden, dass die gefundenen Mutationen wirklich ursächlich für die Entstehung des PAIS bei den Patienten ist. Wiederum sind zusätzliche Mutationen in den Genen entscheidender Kofaktoren der Genitalentwicklung denkbar. Da die NTD eine variable Domäne ist, die in Abhängigkeit von interagierenden Proteinen ihre Konformation ständig verändert, ist es gut vorstellbar, dass die beschriebenen Mutationen einen eher unterschwelligen Einfluss auf die Rezeptorfunktion ausüben, die in Kombination mit niedrigen Androgen- oder niedrigen Kofaktorspiegeln ein PAIS erklären können. Verschiedene Androgen-abhängige Promotoren wurden eingesetzt, um zu untersuchen, ob Mutationen die Transaktivierung eines Reportergens differenziert beeinflussen können. Hierzu wurden Reportergen-Assays des AR mit den Einzelmutationen L712F und 23 FQNAA27, sowie der Doppelmutation L712F und 23 FQNAA27 am Probasin-, (ARE)2- TATA- und MMTV-Promotor durchgeführt. Während der AR mit L712F in allen Assays ca. 60 % der Wildtyp-Aktivität erreichte, schwankten die Ergebnisse für den AR mit 23 FQNAA27. Am MMTV-Promotor glich die Transaktivierung durch die 23FQNAA27-Variante des AR jener der der Mutante L712F. Am (ARE)2-TATA- und Probasin-Promotor lag sie mit 20 % bzw. 40 % deutlich darunter. He et al. (2002a) untersuchten Promotoren in Reportergen-Assays im Hinblick auf ihre Abhängigkeit von der N/C-terminalen Interaktion des AR. Hierzu verwendeten sie ebenfalls den AR mit 23 FQNAA27. Aus den Ergebnissen schlossen sie, dass der PSA- und Probasin-Promotor von der N/C-terminalen Interaktion abhängig sind, der MMTV- und sex-limited-protein-Promotor nicht. Auch die Veröffentlichung von Tadokoro et al. (2008) geht von der Einteilung in N/C-Interaktion-abhängige und N/C-Interaktion-unabhängige Promotoren aus. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse stehen dazu im Widerspruch. Die Mutation L712F unterbindet die N/CInteraktion komplett. Der AR mit L712F führt trotzdem am Probasin-Promotor und MMTVPromotor zu einer vergleichbaren Genexpression. Die N/C-Interaktion scheint somit für eine Aktivierung dieser Promotoren keine modulierende Rolle zu spielen. Die Abweichungen der Rezeptorfunktion in Abhängigkeit vom Promotor, die bei den Ergebnissen der Mutation 23 FQNAA27 auffallen, wurden möglicherweise durch die Interaktion mit bestimm- ten Promotor-spezifischen Kofaktoren ausgelöst. Während der MMTV-Promotor gut zu aktivieren war, sind der (ARE)2-TATA- und Probasin-Promotor auf das 23 FQNAA27-Motiv verstärkt angewiesen, allerdings nicht im Hinblick auf die N/C-terminale Interaktion. Die Doppelmutante erreichte am (ARE)2-TATA- und am Probasin-Promotor die gleiche Transaktivierung wie der AR mit 23 FQNAA27. Am MMTV- Promotor führte die Kombination der beiden Mutationen zu einer zusätzlichen Reduktion der Transaktivität von 60 % der Wildtyp-Aktivität bei den Einzelmutanten auf 40 % für die Doppelmutante. Dieses zeigt, dass der MMTV-Promotor weniger sensitiv auf eine Verän- 73 Diskussion IV derung des 23FQNAA27-Motivs reagiert als der Probasin- und (ARE)2-TATA-Promotor. Erst die Kombination mit einer weiteren Mutation inhibierte die Rekrutierung zellulärer Kofaktoren. Auch der Wildtyp-Rezeptor konnte die Expression eines Reportergens an bestimmten Promotoren bei geringeren Hormonkonzentrationen initiieren als an anderen. Dieses zeigen die je nach Promotor und Zelllinie variierenden EC50-Werte (Abb. 20 E). Strukturelle Unterschiede der Promotorregionen und der dadurch unterschiedliche Bedarf an regulatorischen Proteinen scheinen hierfür maßgeblich verantwortlich zu sein. Dieses wird durch die detektierten Unterschiede zwischen den beiden verwendeten Zelllinien, die ein abweichendes Ensemble von Kofaktoren aufweisen dürften, weiter bestärkt. Die Verwendung verschiedener Promotoren in der Funktionsanalyse von Mutationen des AR ist sinnvoll, da der AR auch im menschlichen Organismus eine Vielzahl unterschiedlicher Zielgene mit verschiedenen Promotoren reguliert. So konnte gezeigt werden, dass der Kofaktor SRC3, der auch zu den p160-Koaktivatoren gehört, essenziell für die durch den AR vermittelte Induktion des PSA-, TMPRSS2- und PMEPA1-Gens war, während das Fehlen des Steroid-Rezeptor-RNA-Aktivator nur die Induktion des TMPRSS2-Gens störte (Agoulnik et al., 2009). Durch die Verwendung verschiedener Zelllinien kann möglicherweise auf die Auswirkungen der je nach Gewebe variierenden zellulären Kofaktoren geschlossen werden. Einige Mutationen sind erst in einem bestimmten Kontext auffällig, daher ist die Kombination unterschiedlicher Assays wichtig, um die veränderte Funktion eines mutierten AR verstehen zu können. Die Ergebnisse der AR-Variante 23 FQNAA27 zeigten, dass erhebliche Unterschiede der Transaktivierungsfunktion an verschiedenen Promotoren in-vitro nachweisbar sind. Die natürliche Mutation L712F hatte einen relativ gleichmäßigen Effekt auf die Transaktivierungsfunktion an den verwendeten Promotoren. Im Rahmen dieser Arbeit ist eine Charakterisierung der acht untersuchten Mutationen des Androgenrezeptors in den analysierten funktionellen Bereichen gelungen. Dabei zeigte sich, dass die Mutationen die Funktion des AR differenziert beeinflussen und die detektierten Unterschiede zwischen PAIS- und CAIS-Mutationen fließend sind. Der Übertragung der gewonnenen Ergebnisse auf die Funktion des AR in-vivo ist bei den verwendeten Verfahren Grenzen gesetzt. Für die N-terminalen Mutationen konnte nur der Ansatz einer Funktionseinschränkung des AR detektiert werden. Bei der Mutation Q798E gelang der Nachweis nicht. Weiterführende funktionelle Untersuchungen und die Analyse von Kofaktorwirkungen könnten hier Klarheit bringen. Im Hinblick auf den einzelnen Patienten sind eine fundierte klinische Diagnostik und funktionelle Studien nötig, um Therapieentscheidungen und prognostische Einschätzungen machen zu können. Durch internationale Datenbanken und die Zunahme an gut charakterisierten Mutationen verbessert sich die Möglichkeit, auch bei neuen, bisher unbekannten 74 Diskussion IV Mutationen durch ihre Lage im AR-Protein und die Kenntnis der betroffenen Aminosäuren Parallelen zu schon bekannten und untersuchten Mutationen zu ziehen. Dieses Wissen könnte für die Geschlechtszuweisung bei einem Kind mit intersexuellem Genital hilfreich sein. Der immer wieder aufgetretenen Frage nach dem Einfluss von Kofaktoren des AR auf AIS-Phänotypen sollte ebenfalls weiter nachgegangen werden. Untersuchungen im Tiermodell ermöglichen das Auffinden von Kofaktoren der Embryonalentwicklung, die möglicherweise nur innerhalb eines kurzen Zeitfensters exprimiert werden. Das Verständnis der Pathogenese ist ein wichtiger Schritt, der in der Zukunft Hinweise auf Therapieansätze im schwierigen Feld angeborener Störungen geben könnte. 75 Zusammenfassung V V Zusammenfassung Die Androgenresistenz (AIS) gehört zu den Störungen der Geschlechtsentwicklung. Pathogenetisch führt die eingeschränkte bis aufgehobene Funktion des Androgenrezeptors während der Embryonalentwicklung bei einem 46,XY Karyotyp zu einer verminderten bis fehlenden Virilisierung. In den meisten Fällen liegt eine Mutation im Gen des Androgenrezeptors vor. Bei der kompletten Androgenresistenz (CAIS) werden die Kinder mit einem weiblich ausgebildeten Genital geboren. Die partielle Androgenresistenz (PAIS), bei der der Androgenrezeptor eine Restfunktion aufweist, führt zu einem breiten phänotypischen Spektrum, das von einem fast vollständig weiblichen Äußeren, über die Ausbildung intersexueller Genitalien, bis hin zu einem fast vollständig männlichen Phänotyp reicht. In dieser Arbeit sollten acht beschriebene Mutationen des Androgenrezeptors im Hinblick auf ihre Funktionalität charakterisiert werden. In Transfektionsversuchen wurde die Rezeptortransaktivität an verschiedenen Androgen-abhängigen Promotoren, die N/Cterminale Interaktion des Androgenrezeptors und die Interaktion der isolierten LigandenBindungsdomäne (LBD) mit zwei bekannten Kofaktoren, SRC1e und BAG1L, untersucht. Zur Rezeptoraktivierung wurde Dihydrotestosteron in aufsteigender Konzentration verwendet. Fünf der Mutationen befinden sich in der LBD des Rezeptors. Die Mutationen L712F und Q789E waren bei PAIS-Patienten gefunden worden. Die Mutationen P723S, P904S und H917R sind mit CAIS assoziiert. Die PAIS-Mutationen Δ409-411, S411N und S432F befinden sich in der N-terminalen Domäne (NTD) des Androgenrezeptors. In den durchgeführten Versuchen zeigten sich große Unterschiede im Verhalten der verschiedenen AR-Mutanten. Die N-terminalen Mutationen reduzierten die Transaktivität des AR am Pem-Promotor nicht. Die N/C-terminale Interaktion beeinflussten sie signifikant, wodurch ein Hinweis auf einen modulierenden Einfluss auf die NTD gegeben ist. Bei der Mutation Q798E blieb die Ätiologie des AIS nach wie vor ungeklärt. Der AR mit L712F zeichnete sich durch eine fehlende N/C-Interaktion und gestörte Kofaktorbindungsgrube aus. Die CAIS-Mutationen P723S und P904S ließen erst bei sehr hohen DHTKonzentrationen eine Aktivierung des Rezeptors zu. Der AR mit H917R zeigte eine unerwartet hohe Rezeptoraktivität. In dieser Arbeit gelang es, die Mutationen differenziert funktionell darzustellen. Eine eindeutige Zuweisung der Mutationen in CAIS und PAIS kann anhand der Ergebnisse nicht erfolgen. In-vivo wirken viele Faktoren modulierend auf den Rezeptordefekt, so lässt sich vermuten, dass dieselbe Mutation sowohl eine partielle als auch eine komplette Androgenresistenz verursachen könnte. Im Hinblick auf den einzelnen Patienten sind auch in Zukunft eine fundierte klinische Diagnostik und funktionelle Studien nötig, um Therapieentscheidungen und prognostische Einschätzungen machen zu können. 76 Literaturverzeichnis VI VI Literaturverzeichnis Adachi M, Takayanagi R, Tomura A, Imasaki K, Kato S, Goto K, Yanase T, Ikuyama S, Nawata H: Androgen-insensitivity syndrome as a possible coactivator disease. N Engl J Med 343, 856-862 (2000) Agoulnik IU, Weigel NL: Coactivator selective regulation of androgen receptor activity. Steroids 74, 669-674 (2009) Ahmed SF, Cheng A, Dovey L, Hawkins JR, Martin H, Rowland J, Shimura N, Tait AD, Hughes IA: Phenotopic features, androgen receptor binding, and mutational analysis in 278 clinical cases reported as androgen insensitivity syndrome. J Clin Endocrinol Metab 85, 658-665 (2000) Askew EB, Gampe RT Jr, Stanley TB, Wilson EM: Modulation of androgen receptor activation function 2 by testosterone and dihydrotestosterone. 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Clin Endocrinol (Oxf) 68, 580-588 (2008) 85 VII Anhang 1. Materialienindex................................................................................... 87 1.1 Allgemein verwendete Chemikalien und Reagenzien ..................................87 1.2 Für Bakterienkultur und Klonierung verwendete Reagenzien ......................87 1.3 Für Zellkultur und Transfektion verwendete Reagenzien .............................88 1.4 Für Proteinlysate und Western Blots verwendete Reagenzien ....................88 1.5 Geräte und Computersoftware ....................................................................89 1.6 Einmalartikel................................................................................................90 1.7 Kits ..............................................................................................................90 2. Primer ................................................................................................... 91 3. Plasmidkarten...................................................................................... 92 3.1 pSV AR0 .....................................................................................................92 3.2 pAD-NTD.....................................................................................................93 3.3 pBD-LBD .....................................................................................................94 3.4 pCR4-Blunt-TOPO mit AR-LBD...................................................................95 4. Plasmidlisten ..................................................................................... 96 4.1 Verwendete Plasmide des AR Expressionsvektors pSVAR .........................96 4.2 Verwendete Plasmide des Two-Hybrid-Vektors pAD-NTD ..........................96 4.3 Verwendete Plasmide des Two-Hybrid-Vektors pBD-LBD ...........................97 5. Programm für die PCR-Mutagenese .................................................. 97 6. Luminometer-Programm..................................................................... 98 7. Sequenzierungsprogramm ................................................................. 98 8. Einbuchstaben-Code der Aminosäuren ............................................ 99 86 1. Materialienindex 1.1 Allgemein verwendete Chemikalien und Reagenzien Bromphenolblau Sigma-Aldrich, Deisenhofen Ethanol Merck, Darmstadt Glyzerol Sigma-Aldrich, Deisenhofen Glycin Merck, Darmstadt Select Peptone Invitrogen, Karlsruhe Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fluka, Schweiz Trizma Base (Tris) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Select Tryptone Invitrogen, Karlsruhe Trypsin-EDTA GIBCO, Invitrogen, USA Select Yeast Extract Invitrogen, Karlsruhe Natriumacetat Merck, Darmstadt Natriumchlorid J.T.Baker, Holland 1.2 Für Bakterienkultur und Klonierung verwendete Reagenzien Select-Agar Invitrogen, Karlsruhe Agarose Invitrogen, Karlsruhe Ampicillin Sigma-Aldrich, Deisenhofen DNA Ladder 100bp und 1kb New England Biolabs, USA dNTPs Invitrogen, Karlsruhe Ethidiumbromid Merck, Darmstadt Kanamycin mg/ml Sigma-Aldrich, Deisenhofen LB Medium Capsuletten QBioGene, USA TE-Puffer (10mM TrisCl, pH 8,0, 1mM EDTA) Qiagen, Hilden 87 1.3 Für Zellkultur und Transfektion verwendete Reagenzien Aktivkohle (Norit A pract 4-7 µm) Serva, Heidelberg Dextran T300 Sigma, Deisenhofen Dihydrotestosteron (DHT) 0,001 g/l in Ethanol Sigma-Aldrich, Deisenhofen Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium (DMEM) Sigma-Aldrich, Deisenhofen DMSO Sigma-Aldrich, Deisenhofen FCS PAA, Cölbe FuGene HD Transfection Reagent Roche, USA PBS Puffer 1, pH 7,2 Sigma-Aldrich, Deisenhofen 1.4 Für Proteinlysate und Western Blots verwendete Reagenzien Acrylamid (Rotiphoresegel 30) Roth, Karlsruhe Ammoniumpersulfat (APS) Serva, Heidelberg bovine serum albumine (BSA) Serva, Heidelberg Kaleidoscope Precision Plus Protein Standards Bio-Rad, München Methanol J.T. Baker, Holland Mammalian-Protein-Extraction-Reagent (M-PER) Pierce, USA Protein Assay Bio-Rad, München Proteasen-Inhibitor-Cocktail (complete, Mini, EDTA-free) Roche, USA Skim Milk Powder Difco, Becton & Dickinson, USA Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Tween 20 Bio-Rad, München Western-Lightning-Chemiluminescence-Reagent-Plus PerkinElmer, USA 88 1.5 Geräte und Computersoftware Geräte Bezugsfirma BioPhotometer Eppendorf, Hamburg Centrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg Centrifuge 5804R Eppendorf, Hamburg Genetic-Analyzer-3130 (Kapillarsequenzierer) Applied Biosystems, Hitachi, USA Excel Microsoft, USA Lasergene 6.0 (SeqBuilder, SeqManager) DNAStar, USA Lucy 3 Luminometer Anthos Mikrosysteme, Krefeld Mastercycler-Gradient Eppendorf, Hamburg Mikro-Rapid Zentrifuge Hettich, Tuttlingen Mini-PROTEAN®-3-Cell BioRad, München Mini-Trans-Blot®-Electrophoretic-Transfer-Cell BioRad, München Molecular-Imager-Chemidoc-XRS-System Bio-Rad, München Nalgene-Cryo-Einfriergerät NUNC Thermo Wiesbaden Prism 5 GraphPad Software, LaJolla, USA QuantityOne Bio-Rad, München Sorvall RC-5B-Refrigerated-Superspeed-Centrifuge GS3 Rotor mit Fisher Scientific, Thermo Scientific, Karlsruhe Schüttler Duomax 1030 Heidolph, Schwabach Schüttelinkubator Lab Therm Kühner, Schweiz Sequence Analysis 5.2 Applied Biosystems, USA Thermomixer-Comfort Eppendorf, Hamburg 89 1.6 Einmalartikel bio-one-CELLSTAR-TC-Plate 24-Well Greiner, Solingen Costar-Assay-Plate, 96-Well Corning, USA CryoTube Nunc, Wiesbaden Hyperfilm Amersham, Freiburg Nunclon ™ Surface 6-Well Platten Nunc, Wiesbaden Petrischalen Greiner, Solingen QIAshredder Homogenizer Qiagen, Hilden Ready-Gel-Blotting-Sandwiches Bio-Rad, München 10ml Röhrchen Harre, Hannover 2 Zellkulturflaschen 175cm mit Filter 1.7 Sarstedt, Nümbrecht Kits BigDye® Terminator-v1.1-Cycle-Sequencing-Kit Applied Biosystems, USA Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System Promega, USA EndoFree-Plasmid-Maxi-Kit Qiagen, Hilden High-Pure-PCR-Product-Purification-Kit Roche, USA Mammalian-Two-Hybrid-Assay-Kit Stratagene, USA QIAprep-Spin-Miniprep-Kit Qiagen, Hilden QIAfilter-Plasmid-Midi-Kit Qiagen, Hilden Zero-Blunt-TOPO-pCR4-Cloning-Kit for Sequencing Invitrogen, Karlsruhe 90 2. Primer Name Sequenz AR536-TAG-BamHI* 5’-TGG ATC CTA GTC CCC GTA AGG TCC GGA GTA GCT-3’ ARKpn_fw* 5’-CGC ACC TGA TGT GTG GTA CCC T-3’ GGN5up 5’-TGC CGA CTA CTA CAA CTT TCC ACT -3’ GGN5low 5’-AGG GGC CCA TTT CGC TTT TCA CAC-3’ F916X-BamHI* 5’-CTC GGA TCC TCA ATA GAT GGG CTT GAC TT-3’ H917RBamHI* 5’-CTC GGA TCC TCA CTG GGT GCG GAA ATA GAT G-3’ hAR-GGN-1s: 5’-GCA AGA GCA CTG AAG ATA CTG C-3’ hAR-GGN-2a 5’-CAT CAA AGA ATT TTT GAT TTT TCA GC-3’ HindIII-AR1*: 5’-GGA AGC TTG ATG GAA GTG CAG TTA GGC TG-3’ HindIII_LBD644* 5’-AAG CTT GGA GGC TTC CAG CAC CAC CA-3’ LBD_F916X* 5’CTC CTG CAG TCA ATA GAT GGG CTT GAC TT-3’ LBD_H917R* 5’-CTC CTG CAG TCA CTG GGT GCG GAA ATA GAT G-3’ LBD-seq-1s 5’-ACA CGA CAA CAA CCA GCC CGA CTC-3’ LBD-seq-2a 5’-CTT GGG CAC TTG CAC AGA GAT GAT-3’ LBD-seq-3s 5’-TAC TTC GCC CCT GAT CTG CTT TTC-3’ P723S-up* 5’-GGG CCA AGG CCT TGT CTG GCT TCC GC-3’ P723S-low* 5’- GCG GAA GCC AGA CAA GGC CTT GGC CC-3’ P904S-up* 5’- CAT CTC TGT GCA AGT GTC CAA GAT CCT TTC TGG G-3’ P904S-low* 5’-CCC AGA AAG GAT CTT GGA CAC TTG CAC AGA GAT G-3’ pBD-5’-seq 5’-AGC ATA GAA TAA GTG CGA C-3’ pCMV-AD-seq1 5’-GAA GCT ATA ACT CGC CTG GTG ACA-3’ pSV0-Seq-as* 5’-TGA TAG GCA GCC TGC ACC TGA-3’ T3 TOPO 5’-ATT AAC CCT CAC TAA AGG-3’ T7 TOPO 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’ mit * gekennzeichneten wurden auch für die PCR-Mutagenese verwendet 91 3. Plasmidkarten 3.1 pSV AR0 92 3.2 pAD-NTD 93 3.3 pBD-LBD 94 3.4 pCR4-Blunt-TOPO mit AR-LBD 95 4. Plasmidlisten 4.1 Verwendete Plasmide des AR Expressionsvektors pSVAR pSVAR0 Wildtyp Q16, G20 pSVAR FQNAA Mutationen in der NTD pSVAR Δ409-411 pSVAR S411N pSVAR S432F pSVAR FQNAA+ Δ409-411 Mutationen in der NTD mit dem FQNAA – Motiv (AS 23-27) pSVAR FQNAA+ S411N pSVAR FQNAA+ S432F pSVAR L712F Mutationen in der LBD pSVAR L712F + FQNAA pSVAR P723S pSVAR Q798E pSVAR P904S pSVAR F916X pSVAR H917R pSV02 AR NTD 4.2 Variante von pSVAR0; statt des AR-Gens nur die NTD (AS 1-536) Verwendete Plasmide des Two-Hybrid-Vektors pAD-NTD pAD-NTD Wildtyp (Q20, G16; AS 1-536) pAD-NTD FQNAA Mutationen in der NTD pAD-NTD Δ409-411 pAD-NTD S411N pAD-NTD S432F pAD-NTD FQNAA + Δ409-411 Doppelmutationen mit dem FQNAA-Motiv pAD-NTD FQNAA + S411N pAD-NTD FQNAA + S432F 96 4.3 Verwendete Plasmide des Two-Hybrid-Vektors pBD-LBD pBD-LBD Wildtyp der LBD (AS 644-919) pBD-LBD L712F Mutationen in der LBD pBD-LBD P723S pBD-LBD Q798E pBD-LBD P904S pBD-LBD F916X pBD-LBD H917R 5. Programm für die PCR-Mutagenese Temperatur Zeit in min:s Zykluszahl Aufheizen des Heizblocks 98 °C Initiale Denaturierung 98 °C 0:30 1 Denaturierung 98 °C 0:10 30 Primerhybridisierung 60 °C 0:30 Elongation 72 °C 0:30 72 °C 5:00 Kühlung 8 °C 1 1 1 97 6. Luminometer-Programm Programm für die Detektion der Luziferaseaktivität mit dem Double Single Point Luminometer Lucy 3 von Anthos mit 570nm Highpass Filter 25 µl Zelllysat 100 µl Luciferase Assay Reagent II 10 s Messung der Firefly- Lufziferase Aktivität 3s Pause 100 µl Stop&Glo Reagent 10 s Abstoppen der Reaktion und Messung der Renilla-Luziferase Aktivität 3s Pause und Einstellen des nächsten Wells 7. Sequenzierungsprogramm Temperatur Zeit in min:s Zykluszahl Aufheizen des Heizblocks 96 °C Initiale Denaturierung 96 °C 3:00 1 Primerhybridisierung 59 °C 0:20 24 Elongation 60 °C 4:00 Denaturierung 96 °C 0:20 50 °C 0:20 1 60 °C 4:00 1 Kühlung 4 °C 1 1 98 8. Einbuchstaben-Code der Aminosäuren Aminosäure Buchstabe Aminosäure Buchstabe Alanin A Leucin L Arginin R Lysin K Asparagin N Methionin M Asparaginsäure D Phenylalanin F Cystein C Prolin P Glutamin Q Serin S Glutaminsäure E Threonin T Glycin G Tryptophan W Histidin H Tyrosin Y Isoleucin I Valin V 99 VIII Danksagung Zum Abschluss möchte ich allen herzlich danken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Zunächst möchte ich meinem Doktorvater Prof. Dr. Olaf Hiort meinen Dank für die Bereitstellung des spannenden Themas und das Heranführen an das wissenschaftliche Arbeiten aussprechen. Weiterhin bedanke ich mich bei ihm für die sehr gute und freundliche Betreuung, die Unterstützung bei der Interpretation der Ergebnisse und für wichtige Denkanstöße bei der schriftlichen Ausarbeitung meiner Dissertation. Ich möchte dem Direktor der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Lübeck, Prof. Dr. Egbert Herting, für die Möglichkeit danken, in seiner Klinik zu forschen. Außerdem bedanke ich mich bei der Medizinischen Fakultät der Universität zu Lübeck für die Förderung im Rahmen des Stipendienprogramms „Exzellenzmedizin“, die mir die Durchführung einer aufwendigeren experimentellen Arbeit sehr erleichtert hat. Mein großer Dank gilt Dr. Ralf Werner für die ausdauernde Betreuung beim experimentellen Teil dieser Arbeit. Besonders möchte ich mich für die naturwissenschaftlichen Einblicke in die Thematik, die Einführung in die verwendeten Methoden, die jederzeitige Erreichbarkeit und die praktischen Hilfestellungen im Umgang mit dem technischen Equipment bedanken. Eine große Hilfe war für mich ebenfalls die Unterstützung beim Erstellen der schriftlichen Fassung meiner Dissertation. Bei Helga Grötsch möchte ich mich sehr für die guten Ratschläge und Korrekturen bedanken. Weiterhin danke ich der ganzen Arbeitsgruppe für die freundliche Aufnahme und das positive Arbeitsklima während der vielen gemeinsam verbrachten Stunden. Mein besonderer Dank gilt Frau Dagmar Struve für die geduldige Einarbeitung in die verschiedenen Methoden und die Hilfe bei unvorhergesehenen Problemen an der Zellkultur oder in der Dunkelkammer. Johanna Varvarikés und Carolin Criée möchte ich für das Korrekturlesen der schriftlichen Ausarbeitung danken. Meine Eltern und Freunde haben mir im Studium und während der Ausarbeitung meiner Dissertation immer zur Seite gestanden, dafür möchte ich mich ganz herzlich bedanken. 100 IX Lebenslauf und Publikationen Persönliche Daten Name Julia Katharina Gesing Geburtsdatum 01.10.1983 Geburtsort Achim Studium Okt 2009 – Jan 2010 3. Tertial Pädiatrie, Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Lübeck Sep 2009 Aktive Teilnahme an der Jahrestagung der European Society for Paediatric Endocrinology 2009 in New York, Posterpräsentation Jun – Okt 2009 2. Tertial Chirurgie, Hospital General de México, Mexiko-Stadt Apr – Jun 2009 2. Hälfte 1. Tertial Innere Medizin, VA Medical Center Northport, Long Island Feb – Apr 2009 1. Hälfte 1. Tertial Innere Medizin, Sana-Kliniken Lübeck Jul 2008 Teilnahme an der Sommerakademie Globale Gesundheit in Würzburg Okt 2007 Stipendium „Exzellenzmedizin” der Medizinischen Fakultät zu Lübeck für die Ausarbeitung einer experimentellen Promotionsarbeit Feb – Jul 2007 Auslandssemester im Rahmen des Erasmus Programms an der „Universidad de Murcia“ in Spanien Sep 2006 Teilnahme am Kongress „From Gene to Gender – 2nd International Symposium on DSD“ der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin UKSH – Campus Lübeck Aug 2006 – Mai 2008 experimenteller Teil der Dissertation in der pädiatrisch-endokrinologischen Forschungsgruppe der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin des UKSH – Campus Lübeck Aug 2005 1. Staatsexamen (Note: 1,5) seit Okt 2003 Studium der Humanmedizin an der Universität zu Lübeck Schulausbildung 2000-2003 Oberstufe des Alten Gymnasiums zu Bremen (Abiturnote: 1,1) Aug – Nov 1999 Teilnahme am Schüleraustauschprogramm des Senators für Bildung und Wissenschaft Bremen mit British Columbia (Kanada) 1994 – 2000 Ökumenisches Gymnasium in Bremen 1990 – 1994 Grundschule an der Lessingstraße, Bremen 101 Praktika Sep 2008 Famulatur im „Hospital del Niño“ in Toluca, Mexiko Mär 2008 Famulatur in der Ambulanz des St. Joseph Stifts, Bremen Aug 2007 Famulatur in der Kinderklinik der Universitätsklinik Murcia, Spanien Apr 2006 – Nov 2007 Arbeit als studentische Aushilfskraft für den zentralen Blutentnahme Dienst der Medizinischen Klinik I, UKSH Lübeck Mär 2006 Famulatur in der Gynäkologie und Geburtshilfe des St. Joseph Stifts, Bremen Feb 2004 Krankenpflegepraktikum in der Prof. Hess Kinderklinik, Bremen Sep 2003 Praktikum im Zentrum für Humangenetik, Bremen Jun – Jul 2003 Krankenpflegepraktikum in der Mund- Kiefer- und Gesichtschirurgie des Krankenhauses Bremen Mitte Soziales Engagement und Interessen Seit Sep 2005 Violine im Uni-Orchester Lübeck Apr 2008 Organisation des bvmd-Projekts „uni hilft” in Lübeck, zur Registrierung neuer Blutspender und Knochenmarkspender Seit Apr 2006 Mitarbeit in der Bundesvertretung der Medizinstudierenden in Deutschland (bvmd) in Lübeck, Organisation von Famulaturplätzen, Unterkunft und Rahmenprogramm für ausländische Medizinstudenten und Vermittlung der Lübecker Studenten ins Ausland 2001 - 2003 Rudern, Teilnahme an Wettkämpfen und Co-Leitung des Kindertrainings 1998- 2003 Violine im Jugend-Sinfonie-Orchester Bremen Mitte Publikation Werner R, Zhan J, Gesing J, Struve D, Hiort O: In-vitro characterization of androgen receptor mutations associated with complete androgen insensitivity syndrome reveals distinct fuctional deficits. Sex Dev 2, 73-83 (2008) Posterpräsentationen Gesing J, Werner R, Zhan J, Holterhus PM, Hiort O: Promotor-specific dependency on the N/Cterminal interaction of the human androgen receptor – a reexamination. PO2-087 Disorders of Sexual Differentiation, Horm Res 2009, Vol 72 suppl 3: 232 Gesing J, Struve D, Werner R, Hiort O: Ist es ein Mädchen oder ein Junge? Androgenresistenz. Zweiter Lübecker Doktorandentag 2008 Werner R, Gesing J, Zhan J, Struve D, Holterhus PM, Hiort O: Mutations in the Ligand Binding Domain of the Human Androgen Receptor and their Role for N/C- and Coactivator Interaction. PO3657 Sex Differentiation, Horm Res 2007, Vol 68 suppl 1: 204 102
