Genomreplikation von DNA

Sommersemester 2006
Molekularbiologie IV:
Strategien der Virusreplikation
Genomreplikation von DNA-Viren
20. Juni 2006
Elisabeth Schwarz
DKFZ
Genexpression und DNA-Replikation
Early-late switch
früh (early, E)
spät (late, L)
Replikation von DNA-Viren
Wo: Cytoplasma oder Kern?
Kern
> Transkription
> DNA-Replikation
Wann?
M
G2
G1
S
S-Phase
•angewiesen auf S-Phase
•Induktion von S-Phase
DNA-Replikation
DNA-abhängige DNA-Polymerasen
semikonservative Replikation
+
Initiation:
origin of replication = ori (Replikationsursprung)
Elongation:
bidirektionale Replikation
Replikationsgabeln
bidirektionale Wanderungsrichtung der Replikationsgabel
Replikationsblasen
DNA-Replikation
• keine de-novo-Synthese! RNA-Primer
• DNA-Synthese durch Anheftung von Nucleotiden an das 3'-OH-Ende
der RNA-Primer
• Template (Matrize) und
Primer (Starter)
• Direktionalität:
Kettenverlängerung
in 5'-> 3'-Richtung
© Molecular Cell Biology, 2004
• dsDNA: Stränge komplementär und antiparallel
Polymerisationsrichtung = Wanderungsrichtung der Replikationsgabel
>kontinuierliche Synthese (leading strand, Leitstrang, Vorwärtsstrang)
Polymerisationsrichtung gegenläufig zur Wanderungsrichtung
>diskontinuierliche Synthese (lagging strand, Folgestrang,
Rückwärtsstrang)
Initiation der DNA-Replikation
SV40
Zelle
1.
T-Ag
ORC
2.
T-Ag
Cdc6/
Cdt1/
ORC
3.
T-Ag
MCM
4.
T-Ag
Cdc6/
Cdt1/
ORC
DNA-Replikation
SV40
Chromosom
• Ziel: viele neue
Virusgenome
•
•
•
•
• T-Antigen
Ziel: Verdopplung!
origin „licensing“ +
origin-Aktivierung
ORC (origin recognition
complex, 6 Proteine)
• CDC6, CDT1
• MCM2-7
• CDC7, S-CDKs, CDC45
1
1
DNAReplikation
von SV40
2
2
3
•ori
•bidirektionale
Replikation
3
4
4
Fareed et al., 1972
© Molecular Cell Biology, 1999
DNA-Replikation von SV40
• Bindung von T-Antigen (doppeltes
Hexamer) an ORI
• lokales Entwinden der Doppelhelix
(Helicase-Aktivität von T-Antigen)
• Öffnen des Doppelstrangs (benötigt
ATP + RFA als ssDBP)
• Bindung von Primase-Polymerasealpha
• Synthese der Primer durch Primase
• Bindung von RFC stimuliert die
Leitstrang-Synthese
© Molecular Cell Biology, 1999
DNA-Replikation von SV40
© Molecular Cell Biology, 1999
• Bindung von PCNA
> Inhibition und Verdrängung von Polα
> Unterbrechung der LeitstrangSynthese
• Bindung von Polδ an PCNA/RFC
> erhöhte Prozessivität
> Synthese des Leitstrangs
• Bindung von Polα-Primase (+ RFC) an
Folgestrang-Template
• Synthese des Folgestrangs
> Okazaki-Fragmente (100-200 Nucl.)
• Entfernen der RNA-Primer durch
5’>3’-Exonuclease-Aktivität von Polα
• Auffüllen und Ligation der Fragmente
• Wanderung der Replikationsgabel:
durch T-Antigen erleichtert
• Trennung der beiden Tochtermoleküle:
Topoisomerase II
© Molecular Cell Biology, 2004
Struktur des SV40 ori
minimaler ori: ca. 65 bp, 3 essentielle Elemente
– T-Ag-Bindungsstelle II
• inverted repeat, 23-34 bp, GC-reich
• T-Bindungsstellen G-A/G-G-G-C
– AT-reiche Sequenz (15-20 bp)
– early imperfect palindrome
© Principles of Virology, 1999, 2004
SV40: T-Ag und origin
1. Hexamer-Bildung von T-Ag
Bindung an LT-BS II
2. Strukturveränderung von early
palindrome (EP)
3. Bindung von RFA (RpA)
Entwinden der DNA-Stränge
Stabilisierung durch RFA
© Principles of Virology, 1999, 2004
SV40 DNA-Replikation
• Präinitiationskomplex:
ori + T-Ag + RFA
• Initiationskomplex:
(ori + T-Ag + RFA)
+ Primase-Polα
© Principles of Virology, 1999, 2004
• Bildung des Initiationskomplexes bestimmt
den engen Wirtsbereich von Polyomaviren
SV40 DNA-Replikation
Topoisomerasen
Decatenation
© Principles of Virology, 2004
Papillomaviruses
Different modes of DNA replication
1. Establishment replication
Limited amplification:
50-100 copies/cell
2. Maintenance replication
(1+2: bidirectional replication)
3. Productive replication
(rolling circle replication)
© Principles of Virology, 2004
Rolling-circle replication
© Principles of Virology, 1999
Initiation der DNA-Replikation
bei Papillomviren
1. Kooperative Bindung von E1 und E2 an ori.
2. ATP-abhängige Bindung von weiteren E1-Molekülen
und Verdrängung von E2
Das Enden-Replikationsproblem
bei linearen DNA-Genomen
© Principles of Virology, 1999
Problem: Replikation der Genomenden
Problemlösungen
• eukaryote Chromosomen
¾ Telomere / Telomerase
•
•
•
•
¾
¾
¾
¾
Bakteriophage T7
Bakteriophage T4
Adenoviren
Herpesviren
Bakteriophage Lambda
• Pockenviren
• Parvoviren
terminale Redundanz (tR)
tR, zirkuläre Permutation
Protein-Primer
Zirkularisierung
¾ self priming, hairpin loops
¾ self priming
Bakteriophage T7
Virion:
polyedrischer Kopf
(Durchmesser 30 nm)
kurzer, nicht kontraktiler Schwanz
Familie Podoviridae
Genom:
ds-DNA, linear, ca. 40 kb
Sequenzwiederholungen an den
Enden
(160 bp): > terminale Redundanz
© Bakterienviren, 1992
Bakteriophage T7: DNA-Replikation
• origin bei ca. 15% am linken Genomende
• bidirektionale Replikation (RNA-Primer)
• unvollständige Replikation des Folgestrangs
> einzelsträngige 3’-Enden
• wegen terminaler Repeats: überstehende 3’-Enden komplementär
• Zusammenlagerung zu Dimeren
• Auffüllen der Lücken durch DNA-Ligase
• sequenzspezifische versetzte Spaltung durch Endonuclease gp3
> überstehende 5’-Enden
• Auffüllen der Einzelstrang-Enden
> vollständige Genome mit terminalen Repeats
• bei weiterer Replikation: Bildung von Konkatemeren
(bis ca. 100 Kopien) durch Stranginvasion (strand invasion)
Bakteriophage T7: DNA-Replikation
ori
5‘-ATTCAT
3‘-TAAGTA
ATTCAT-3‘
TAAGTA-5‘
bid. Replikation
5‘-ATTCAT
3‘-TAAGTA
+
5‘3‘-TAAGTA
ATTCAT-3‘
-5‘
a
ATTCAT-3‘
TAAGTA-5‘
b
Zusammenlagerung
Ligation
5‘-ATTCAT
3‘-TAAGTA
a
ATTCAT
TAAGTA
b
ATTCAT-3‘
TAAGTA-5‘
Bakteriophage T7: DNA-Replikation
5‘-ATTCAT
3‘-TAAGTA
a
b
ATTCATTAAGTA-
ATTCAT-3‘
TAAGTA-5‘
Spaltung durch gp3
5‘-ATTCAT
3‘-TAAGTA
a
5‘-ATTCAT
5‘-ATTCAT
3‘-TAAGTA
+
TAAGTA-5‘
ATTCAT-3‘
TAAGTA-5‘
Auffüllen der Enden
a
5‘-ATTCAT
3‘-TAAGTA
b
ATTCAT-3‘
TAAGTA-5‘
+
b
ATTCAT-3‘
TAAGTA-5‘
Bakteriophage T4
Virion:
elongierter polyedrischer Kopf (111 nm x 78 nm)
langer kontraktiler Schwanz
Familie Myoviridae, geradzahlige T-Phagen
Genom:
ds-DNA, linear, ca. 166 kb
Genom in Virionen ca. 171 kb, wegen:
Sequenzwiederholungen an den Enden (ca 5 kb):
terminale Redundanz
zirkuläre Permutation
© Viren, 1993
Bakteriophage T4: DNA-Replikation
• mehrere origins
• frühe Replikation:
bidirektionale Replikation > unvollständige Enden
• späte Replikation:
Konkatemerbildung durch Rekombination
(recombination-dependent DNA replication)
Invasion der 3’-Enden in homologe ds-DNA
(strand invasion)
> komplexes Netzwerk von replizierender Virus-DNA
• Verpackung des Genoms in Phagenkopf:
“head full”-Mechanismus
Verpackungslänge größer als Genomlänge
> terminale Redundanz, zirkuläre Permutation
Bakteriophage T4: DNA-Replikation
Terminale Redundanz und zirkuläre Permutation
A
Z A
Z A
Z A
Z A
Z A
Z A
Z A
ZA
ABCD...........YZA
BCDE..........YZAB
CDEF.........YZABC
ZA
Z A
Z A
T4 + T7: Virale Replikationsfaktoren
T4
T7
• DNA-Polymerase
(gp43)
• Helikase, Primase
(gp41 + gp61)
• Einzelstrang-bindendes
Protein gp32
• ca. 30 virale
Genprodukte
insgesamt
• DNA-Polymerase
(gp5)
• Helikase, Primase
(gp4)
• Endonuclease
(gp3)
• DNA-Ligase
>> autonomer viraler Replikationsapparat mit allen
notwendigen Komponenten
Adenoviren
• 1953 aus Rachenmandeln (adenoids)
isoliert
• Erkrankungen der Atemwege,
des Gastrointestinalbereichs,
der Augenbindehaut
• >100 Adenovirus-Typen bei Wirbeltieren
Viruspartikel:
• Ikosaeder (Durchmesser 80-110 nm)
• 252 Capsomere
(240 Hexone, 12 Pentone)
© Viren, 1993
Adenoviren als Modellsysteme:
• effiziente Vermehrung in Zellkultur
• Genexpression: Splicing
• DNA-Replikation
• Onkogenese, Zelltransformation
• Vektoren
Adenoviren: Genom
• lineare doppelsträngige DNA, 36 – 38 kb
• inverted terminal repeats (ITRs, 54-166 bp)
© Molekulare Virologie, 2003
• terminales Protein TP kovalent an 5‘-Enden
• Interaktion der TPs > quasizirkulärer Zustand der DNA
• Strangtrennung: ITRs > Hybridisierung der
komplementären Sequenzen > Pfannenstiel-Strukturen
Adenoviren: Initiation
TP 55 kD
© Molekulare Virologie, 2003
TP 80 kD
• Bindung von pTP + Pol an
terminalen ORI
• Bindung von NF-1 und Oct-1 an ORI
• kovalente Bindung von dCMP an Serin-OH: TP-C (Protein-Primer)
• TP-C komplementär zu 3‘-terminalem G
• Initiation der DNA-Synthese an TP-C
• Bindung von ssDBP an verdrängten Einzelstrang
Adenoviren: Elongation
Phase I:
• kontinuierliche Leitstrang
-synthese
• Strangverdrängung
(strand displacement)
Phase II:
• verdrängter Strang: ITR
>Pfannenstielstruktur
• Gegenstrangsynthese
Virale Replikationsproteine:
• Pol, pTP, ssDBP
© Molekulare Virologie, 2003
Herpesviren
• große umhüllte Viren (Durchmesser 100-200 nm)
• Envelope durch Knospung an innerer Kernmembran
• lytische Infektion
• Etablierung von latenten Infektionen
(> Viruspersistenz)
• Reaktivierung
Genom:
• lineare ds-DNA
(130-240 kb)
• im Virus-Core
© Viren, 1993
spulenförmig um
© Molekulare Virologie, 2003
Proteinmatrix gewickelt
• Enden werden zusammengehalten
• unique (ULund US) und repetitive Sequenzen
Herpesviren beim Menschen
Herpes-simplex-Virus: Genom ca. 150 kb
HSV1: Herpes labialis (Lippenbläschen)
HSV2: Herpes genitalis
Varizellen-Zoster-Virus (VZV): Genom ca. 125 kb
Varizellen = Windpocken: Primärinfektion
Zoster = Gürtelrose: Rezidiv
Cytomegalievirus (CMV): Genom ca. 230 kb
inapparente Infektionen
bei Immunsupprimierten schwere Verläufe
Epstein-Barr-Virus (EBV): Genom ca. 172 kb
infektiöse Mononucleose (Pfeiffer’sches Drüsenfieber)
Burkitt-Lymphom (B-Zell-Lymphom), Afrika
Nasopharynx-Karzinom, Südchina
Herpesviren beim Menschen
Humanes Herpesvirus 6 (HHV-6):
1986 entdeckt
Exanthema subitum (Rubeola infantum, Dreitagefieber)
Humanes Herpesvirus 7
1990 entdeckt, verwandt mit HHV-6
Humanes Herpesvirus 8:
Genom ca. 270 kb
1994 entdeckt
Kaposi-Sarkome bei AIDS-Patienten
Herpesviren: DNA-Replikation
• Zirkularisierung der DNA
• rolling-circle-Mechanismus > head-to-tail-Konkatemere
• Spaltung der Konkatemere und Verpackung:
miteinander verbundene Prozesse
(virales cleavage-packaging protein)
•„head full“-Mechanismus
Rolling-circle replication
© Principles of Virology, 1999
Herpesviren
HSV-kodierte Enzyme für DNA-Replikation
Proteine für virale origin-abhängige DNA-Replikation
DNA-Polymerase
Helicase-Primase
origin-bindendes Protein
ssDNA-bindendes Protein
Prozessivitätsfaktoren
Enzyme für Nucleinsäuremetabolismus
Bakteriophage Lambda
• Genom: dsDNA, linear, 48502 bp
• überstehende 5‘-Enden (m, m‘, cos)
(12 Nucleotide, komplementär)
• Infektion: Ringschluss
• ori, O-Protein, P-Protein
• 1. Bidirektionale Replikation
• 2. „Rolling Circle“-Replikation
• Concatemere > Encapsidierung > Spaltung durch Terminase
(GenA+GenNu1) an cos(m/m‘)
© Molekulare Genetik, 2001
Pockenviren
große, komplex aufgebaute Viruspartikel
(350 x 270 nm)
im Lichtmikroskop sichtbar
Virusreplikation:
im Cytoplasma, in „factory areas“
(Virusfabriken)
in kernlosen Zellen möglich
Beginn der DNA-Replikation:
ca 1-2 h p.i.
Produktion: ca. 10.000 Genomkopien/Zelle
ca. 50 % werden verpackt
© Viren, 1993
© Molekulare Virologie, 2003
Pockenviren
Variolavirus
Erreger der Pocken (variola: scheckig)
im 6. Jh. von Asien nach Europa eingeschleppt
Höhepunkt der Pockenepidemie in Europa: 18. Jh.
Variola major:
schwarze Blattern (hämorrhagische Pocken), Letalität 5-40%
Variola minor:
weiße Blattern, Letalität ca. 1 %
Ausrottung der Pocken 1977 durch weltweites Impfprogramm
der WHO
Pockenviren
Virale Faktoren für DNA-Replikation
DNA-Replikation:
im Cytoplasma: keine Verwendung zellulärer Faktoren möglich
alle Replikationsfaktoren vom Virusgenom codiert
Enzyme für Nucleotidmetabolismus
(um genügend große Mengen an dNTPs für DNA-Replikation
herzustellen):
Thymidinkinase
Thymidylatkinase
Ribonucleotidreductase
dUTPase
Pockenviren
Genom:
lineare ds-DNA 130-300 kb
Kodierungskapazität: 150-200 Gene
hairpin loops an den Enden + inverted terminal repeats (ITRs)
ITR-Länge: 725 bp (Variola) bis 12 kb (Vaccinia)
Vacciniavirus ITR
© Molekulare Virologie, 2003
Pockenviren DNA-Replikation
Priming:
Setzen eines Nicks: self-priming (i.e. DNA-Primer)
Rückfalten der ITRs
kein definierter ori
Elongation:
Strand displacement (i.e. keine lagging strand-Synthese)
Concatemer-Bildung
Auflösung der Concatemere in unit-length-Moleküle
(Monomere) erfordert Synthese von späten Proteinen
Pockenviren
nicks
>self-priming
nick
inverted repeats
>hairpin loops
concatemers
©Fields Virology, 2001
Parvoviren
kleine nicht umhüllte DNA-Viren (Durchmesser 18-26 nm)
(parvus = klein)
Genom: lineare ss-DNA, ca. 5000 Basen
Parvovirinae (Vertebraten), Densovirinae (Insekten)
felines Panleukopenievirus (Katzenseuche)
Minute virus of mice (MVM)
Aleutian mink disease virus (Aleuten-Nerzvirus)
B19: Erythema infectiosum (Ringelröteln)
Dependovirus (helferabhängige Viren): AAV 1-5
Helferfunktionen für AAV
Adenoviren: frühe Genprodukte > Induktion von S-Phase
keine direkte Interaktion von Ad-Proteinen mit AAV-Genom
Herpesviren: HSV-Replikationsproteine
Parvoviren DNA-Replikation
Genom:
• lineare einzelsträngige DNA, ca. 5000 Basen
• Palindromsequenzen am 5'- und 3'-Ende: > hairpin-Strukturen
• 3'-Palindrom: ca 100 Basen, 5'-Palindrom: 200-250 Basen
DNA-Replikation:
• im Kern, notwendig: S-Phase
• Parvoviren können S-Phase nicht induzieren
>Parvoviren sind die am stärksten von zellulären Funktionen abhängigen Viren
• Primer: terminale 3'-Sequenzen der Genom-DNA
• single strand displacement (model)
• unidirektionale Leitstrangsynthese
• „rolling hairpin“-Synthese
Virales Protein für Replikation: NS-1
nukleäres Phosphoprotein, sequenz-spezifische DNA-Bindung, Helicase,
an 5'-Ende von replikativer DNA (+ Virion-DNA)kovalent gebunden
Parvoviren
DNA-Replikation
AAV-2
3‘-terminaler hairpin > primer-template
¾Initiation
Nick (Rep) > Elongation
replication
intermediate
genomic
DNA
self-priming, Rückfaltung der Termini
strand displacement, „rolling hairpin“
© Principles of Virology, 1999
Genomreplikation von DNA-Viren
Viren
Genom Replikationsproteine Priming
viral
zellulär
Elongation
Polyoma
T-Ag
RNA
5 kb
Primase
bidirektionale
Replikation
Polymerase
SSBP (RF-A)
RF-C (Bel.faktor)
PCNA (Proz.faktor)
Topo II
Papillom
E1
wie Polyoma RNA
8 kb E2
bid. Replikation
Genomreplikation von DNA-Viren
Viren
Genom Replikationsproteine Priming
viral
zellulär
Elongation
Adeno 35 kb pTP
Initiation:
Protein (pTP)
Pol
NFI
strand
displacement
DBP
NFIII/Oct1
Elongation:
NFII (Topo)
für Elongation >9000 bp
Genomreplikation von DNA-Viren
Viren
Genom Replikationsproteine
viral
zellulär
Herpes 150 kb DNA-Pol. UL30
ssDBP
UL29
ori-bind. Protein UL9
Proz.faktor UL42
Primase/Helicase:
UL5, 8, 52
Priming
Elongation
RNA
rolling circle
head-to-tailKonkatemere
Spaltung in
Monomere
Genomreplikation von DNA-Viren
Viren
Genom Replikationsproteine
viral
zellulär
Pocken
DNA-Polymerase
130-300 kb
????
Resolvase
Replikation im
Cytoplasma!
Parvo
5 kb
NS1
DNA-Pol.
Priming
Elongation
self-priming
Rückfaltung der
Termini
strand
displacement
„rolling hairpin“
self-priming
Rückf. der Termini
strand displacement
„rolling hairpin“