Replikation (MA)

Institut für Biochemie und Molekulare Medizin
KV: DNA-Replikation
Michael Altmann
Herbstsemester 2008/2009
Übersicht VL DNA-Replikation
1.) Das Zentraldogma der Molekularbiologie
1.)
Semikonservative Replikation
2.)
Matrizengesteuerte DNA-Synthese
3.)
DNA-abhängige Primase
4.)
Kontinuierlich vs. diskontinuierlich
5.)
Koordinierte Synthese an der Replikationsgabel
6.) Abschliessende Schritte der DNA-Synthese
7.)
Ligation von DNA
8.)
Problematik bei der Replikation linearer DNA
8.)
Funktion der Telomerase
9.) Replikationsursprünge
10.) Negatives Supercoiling
11.) Topoisomerasen
12.) Transition und Transversion
13.) Prinzip der DNA-Reparatur
14.) Homologe Rekombination bei der Meiose: Crossing-over
Das Zentraldogma der Molekularbiologie
DNA-Replikation
RNA
Protein
Translation
RNA
re
Tr ver
an se
sk
rip
tio
n
DNA
cDNA
Tr
an
sk
rip
tio
n
DNA
Protein
RNA-Replikation
T.A. Brown, Moderne Genetik (2. Auflage 1999), Abb. 4.7
Semikonservative Replikation
Meselson-Stahl-Experiment (1958):
• Beide Tochterzellen erhalten je einen DNAStrang der Mutterzelle
• Die Replikation ist ein sehr genauer Prozess
(Fehlerrate 10-10)
Matrizengesteuerte DNA-Synthese
• Syntheserichtung: immer 5‘->3‘,
Ableserichtung: immer 3‘->5‘
• Antiparalleler Verlauf des neu synthetisierten
Stranges
• Die DNA-Polymerase braucht zur Synthese
eine abzulesende Matrize und
einen Primer, ein kurzes RNA-Stück mit einem
freien 3‘-OH Ende
DNA-abhängige Primase
• Primase: DNA-abhängige RNA-Polymerase, die
den Primer für die DNA-Synthese polymerisiert
• RNA-Polymerasen brauchen keinen Primer
Kontinuierlich vs. diskontinuierlich
DNA-Synthese an der Replikationsgabel:
• Wegen der 5‘->3‘ Syntheserichtung wird der
eine Strang (Leit- oder Vorwärtsstrang)
kontinuierlich, der andere Strang (Folge- oder
Rückwärtsstrang) diskontinuierlich synthetisiert
Koordinierte Synthese an der Replikationsgabel
DNA-Synthese an der Replikationsgabel:
• Die zu replizierende Doppelhelix wird mit Hilfe
von DNA-Helicasen geöffnet (nicht gezeigt).
• Enzelstrang-Bindungsproteine verhindern, dass
die Doppelhelix wieder vor dem Ablesen
zuschnappt.
• Die DNA-Polymerase ist ein Enzymkomplex, der
aus zwei synthetisierenden Untereinheiten und
der Primase besteht. Beide Stränge werden
simultan synthetisiert.
• „Trick“: Da sich die Replikationsgabel von der
Syntheserichtung am Folgestrang wegbewegt,
bildet der Folgestrang eine Schleife, um
gleichzeitig abgelesen werden zu können.
Abschliessende Schritte der DNA-Synthese
• DNA-Polymerasen können nicht nur
synthetisieren, sie können auch DNA- oder RNAStücke entfernen (Korrekturfunktion).
• Es gibt sowohl eine 5‘-3‘-Exonuklease wie eine
3‘-5‘-Exonuklease-Aktivität (nicht jede DNAPolymerase hat beide Aktivitäten).
• Die 5‘-3‘-Exonukleaseaktivität der DNAPolymerase I entfernt die RNA-Primer und füllt
die Lücken auf.
• Die letzte 3‘-OH / 5‘-Phosphat Lücke zwischen
zwei benachbarten Nukleotiden wird mit Hilfe der
DNA-Ligase geschlossen.
Ligation von DNA
• Für die Schliessung der Lücke muss die 5‘-Phosphat Bindung erst mit Hilfe von ATP
aktiviert werden. Dabei wird zuerst AMP an ein Lysin-Rest am aktiven Zentrum der
Ligase angehängt.
• Die DNA-Ligase knüpft vorübergehend eine Phosphosäureanhydrid-Bindung am 5‘Phosphat (durch Anhängen von AMP), die den nukleophilen Angriff der freien 3‘-OH
Gruppe und die Bildung der 3‘-5‘-Bindung unter Abspaltung von AMP begünstigt.
Problematik bei der Replikation linearer DNA
Funktion der Telomerase (eine reverse Transkriptase)
• Das Ende der Chromosomen besteht aus
repetitiven DNA-Sequenzen (hier: TTAGGG)
• Die Telomerase, eine RNA-abhängige DNAPolymerase, bringt eine zur repetitiven DNASequenz komplementäre RNA mit.
• Die angelagerte RNA dient als Matrize um den
oberen DNA-Strang zu verlängern
• Im letzten Schritt wird die ursprüngliche Lücke
mit Hilfe der DNA-Polymerase und -Ligase
aufgefüllt.
• Nicht alle Zellen enthalten Telomerase, deshalb
werden je nach Zelltypus pro Teilung die
Chromosomen kürzer.
Replikationsursprünge
• Für den Beginn der Replikation wird mindestens
ein Startpunkt gebraucht, vor allem wenn -wie bei
vielen Prokaryoten- die DNA ringförmig ist.
• Trotz der hohen Polymerisationsgeschwindigkeit
der DNA-Polymerase (mehrere Hundert Nukleotide
pro Sekunde), braucht es bei Eukaryoten mehrere
Replikationsursprünge, an denen die DNASynthese gleichzeitig stattfindet.
• Die DNA-Synthese ist an jedem
Replikationsursprung bidirektional, d.h. dass beide
DNA-Stränge abschnittsweise kontinuierlich und
diskontinuierlich abgelesen werden.
Negatives Supercoiling
• Die Torsion während der Öffnung der
Doppelhelix bei der Replikation erzeugt
Überdrehungen/Superwindungen der DNA, da
diese nicht frei um sich selber rotieren kann.
Diesem Phänomen sagt man Supercoiling.
• Die rechtsdrehende B-DNA wird gegen den
Uhrzeiger-Sinn entwunden, d.h. die Zahl der
Helixwindungen hinter der Replikationsgabel
reduziert sich = negatives Supercoiling.
• Demgegenüber stauen sich vor der
Replikationsgabel die DNA-Überdrehungen =
positives Supercoiling.
Topoisomerasen
• Topoisomerasen sind Enzymkomplexe, die den Torsionsstress beseitigen. Dazu
schneiden sie mittels ihrer DNA-Endonuklease-Aktivität einen (Toposiomerase I) oder
beide (Topoisomerase II) parentale DNA-Stränge in der Nähe der Replikationsgabel.
• Die gelösten DNA-Stränge können nun gegeneinander rotieren und die Spannung gelöst
werden. In einem Folgeschritt verschliesst die Topoisomerase die Bruchstellen.
Transition und Transversion
• Mit einer geringen Frequenz (10-4) kommt es
wegen Keto-Enol-Gleichgewichten zu
ungewöhnlichen Basenpaarungen (G-T in der
Abb.).
• Wenn nicht von der DNA-Polymerase erkannt,
führen diese ungewöhnlichen Basenpaarungen in
der nächsten Generation zu einer Punktmutation
(G-C gegen A-T ausgetauscht).
• Ein Austausch eines Purins oder eines
Pyrimidins gegen das andere (G->A; C->T) wird
als Transition bezeichnet, der Austausch eines
Pyrimidins gegen ein Purin (oder umgekehrt; zB.
A->C) als Transversion.
• Dank 3‘-5‘-Exonukleaseaktivität der DNAPolymerase passieren solche Punktmutationen
während der Replikation „nur“ mit einer Frequenz
von 10-7.
Prinzip der postreplikativen DNA-Reparatur
• Durch Einwirkung äusserer Faktoren
(Chemikalien, UV-Licht, Hitze) kommt es nach
der Replikation zu chemischen Veränderungen
von Basen der DNA.
• Neben der Korrekturfunktion der DNAPolymerase gibt es sog. postreplikative
Korrekturmechanismen, die sowohl die Fehlerrate
während der Replikation erniedrigen (10-10!) wie
auch postreplikative Schäden korrigieren.
• Dazu dienen spezialisierte Enzymkomplexe, die
die DNA abtasten und nach Fehlern/Mutationen
absuchen.
• Ein häufig verwendetes Prinzip ist das der
Nukleotid-Excisionsreparatur. Nach
Identifizierung des Defektes wird ein Stück
Einzelstrang herausgeschnitten, mit Hilfe der
DNA-Polymerase und -Ligase eingefüllt und
ligiert.
Homologe Rekombination bei der Meiose: Crossing-over
Rekombination
• Trotz der hohen Replikationsgenauigkeit gibt es definierte Situationen, wo DNA-Veränderungen
gewünscht werden, so zB. während der Meiose von Geschlechtszellen (zwecks Erhöhung der Varianz
der Nachkommenschaft).
• Allerdings handelt es sich beim sog. Crossing-over um den exakten Austausch von gleichen DNARegionen zwischen homologen Chromosomen von Vater und Mutter, für die wiederum ein
spezialisierter Enzymkomplex gebraucht wird.
Ortsgerichtete (somatische) Rekombination
• In manchen somatischen Zellen kommt es zur
Umordnung (Deletionen, Rearrangement von
DNA) gewisser Gene oder sogar von
Gengruppen.
• Das bekannteste Beispiel ist die programmierte
Umordnung der Antikörpergene des
Immunsystems. Dieser Vorgang, der in B- und TLymphozyten passiert, erlaubt es, mit einem
minimalen Repertoir an Genen, eine enorme
Auswahl von mehr als 1011 verschiedenen
Antikörperproteinen anzubieten.
• Die variablen Regionen der Antikörper-Ketten,
welche die Spezifität ausmachen, werden
während der Reifung der B-Lymphozyten durch
ein Rearrangement gewisser DNA-Segmente (in
der Abb. L, V, J) aus einem vorgegebenen
Repertoir zusammengelegt.
• Ein ähnliches Verfahren der DNARekombination wie bei den B-Zellen kommt bei
den T-Zellen zur Maximierung der möglichen TZell-Rezeptoren vor.