Auswirkungen - TiHo Bibliothek elib

Tierärztliche Hochschule Hannover
Auswirkungen zweier Vitrifikationsverfahren auf die
morphologische und molekulare Qualität in vitro
produzierter boviner Embryonen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Katharina Beuing
Ibbenbüren
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Christine Wrenzycki
Klinik für Rinder,
Reproduktionsmedizinische Einheiten der Kliniken
1. Gutachterin: Prof. Dr. Christine Wrenzycki
2. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke
Tag der mündlichen Prüfung:
13.05.2013
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung
1
2.
Literatur
4
2.1.
In-vitro-Produktion von Embryonen
4
2.2.
Physikalische Vorgänge beim Einfrieren von Zellen
11
2.3.
Kryokonservierungsverfahren
13
2.3.1.
Konventionelle Kryokonservierung
14
2.3.2.
Vitrifikation
16
2.4.
Kryoprotektiva
18
2.4.1.
Penetrierende Kryoprotektiva
19
2.4.1.1. Glyzerin
20
2.4.1.2. Ethylenglycol
22
2.4.1.3. Dimethylsulfoxid
25
2.4.1.4. Propylenglycol
29
2.4.2.
31
Nicht-penetrierende Kryoprotektiva
2.4.2.1. Zucker
32
2.4.2.2. Makromoleküle
34
2.5.
36
Vergleiche zwischen verschiedenen Trägersystemen zur
Vitrifikation
2.5.1.
Offene Trägersysteme
36
2.5.2.
Geschlossene Trägersysteme
40
2.6.
Qualität vitrifizierter, boviner Embryonen nach dem Auftauen
43
2.7.
Genexpression in präimplantatorischen bovinen Embryonen
48
2.7.1.
Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1)
52
2.7.2.
Zona occludens-Protein 1 (TJP1)
2.7.3.
Interferon  (IFNT2)
54
2.7.4.
Hitzeschockprotein 70 (HSPA1A)
57
2.7.5.
Desmocollin 2 (DSC2)
59
2.7.6.
Prostaglandin G/H Synthase 2 (PTGS2)
60
3.
Material und Methoden
63
3.1.
In-vitro-Produktion
63
3.1.1.
Herkunft und Transport der Ovarien
64
55
Inhaltsverzeichnis
3.1.2.
Bearbeitung der Ovarien
64
3.1.3.
Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe
65
3.1.4.
In-vitro-Maturation (IVM)
65
3.1.5.
In-vitro-Fertilisation (IVF)
66
3.1.5.1. Vorbereitung der Medien
66
3.1.5.2. Vorbereitung der Spermien
67
3.1.5.3. Fertilisation
67
3.1.6.
In-vitro-Kultur (IVC)
68
3.2.
Entwicklungskontrollen
68
3.3.
Vitrifikation durch Gynemed VitriFreeze Medien
69
3.4.
Auftauen der Embryonen durch Gynemed VitriThaw Medien
71
3.5.
Vitrifikation durch Origio MediCult Vitrification Cooling Medien
72
3.6.
Auftauen der Embryonen durch Origio MediCult Vitrification
73
Warming Medien
3.7.
Kontrollen
74
3.7.1.
Kontrolle des Einflusses der Vitrifikations- und Auftaumedien
75
3.8.
Qualitätskontrollen nach dem Auftauen
75
3.8.1.
Reexpansions- und Schlupfrate
75
3.8.2.
Lebend-Tot-Färbung
75
3.8.3.
mRNA Analyse
78
3.8.3.1. Vorbereitung der Dynabeads-Suspension
79
3.8.3.2. Isolierung der mRNA aus den geschlüpften Blastozysten
80
3.8.3.3. Reverse Transkription
81
3.8.3.4. Polymerase Kettenreaktion
82
3.9.
Statistische Analysen
84
3.10.
Allgemeiner Versuchsaufbau
85
4.
Ergebnisse
86
4.1.
Ergebnisse der In-vitro-Produktion
86
4.2.
Morphologische Qualitätsbestimmungen
87
4.2.1.
Reexpansions- und Schlupfraten
87
4.2.2.
Ergebnisse der Zellzahlzählung
89
Inhaltsverzeichnis
4.3.
Analyse der Genexpression
93
4.3.1.
Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1)
93
4.3.2.
Zona occludens-Protein 1 (TJP1)
4.3.3.
Interferon  (IFNT2)
94
4.3.4.
Hitzeschockprotein 70 (HSPA1A)
96
4.3.5.
Desmocollin 2 (DSC2)
96
4.3.6.
Prostaglandin G/H Synthase 2 (PTGS2)
97
5.
Diskussion
99
5.1.
Reexpansions- und Schlupfraten
101
5.2.
Zellzahlzählung
103
5.3.
Genexpression nach dem Auftauen
104
5.4.
Schlussfolgerungen
110
6.
Zusammenfassung
112
7.
Summary
115
8.
Anhang
118
8.1.
Verzeichnis der verwendeten Medien
118
8.1.1.
Medien für die IVM
118
8.1.2.
Medien für die IVF
120
8.1.3.
Medien für die IVC
123
8.1.4.
Medien für die Lebend-Tot-Färbung
125
8.1.5.
Medien für die RT-qPCR
126
8.2.
Abkürzungsverzeichnis
128
8.3.
Einzeldaten der Zellzahlzählung
132
8.4.
Einzeldaten der RT-qPCR
133
8.5.
Verzeichnis der Tabellen
134
8.6.
Verzeichnis der Abbildungen
138
9.
Literaturverzeichnis
140
95
Einleitung
1. Einleitung
Die Kryokonservierung boviner Embryonen erlangt immer größere Bedeutung in der
assistierten Reproduktionsmedizin. Auch die Anzahl der in vitro produzierten
Embryonen stieg in den letzten Jahren deutlich an. So wurden im Jahr 2010 11%
mehr bovine Embryonen in vitro generiert als 2009 (STROUD 2010). Nach wie vor ist
jedoch die Qualität in vitro produzierter Embryonen den in vivo generierten
unterlegen. Dies zeigt sich unter anderem an einer verzögerten Entwicklung, an
schlechteren
Trächtigkeitsraten,
an
reduzierten
Überlebensraten
nach
der
Kryokonservierung (GREVE et al. 1994) und an der veränderten Expression
entwicklungsrelevanter Gentranskripte (WRENZYCKI et al. 2001).
Zur Kryokonservierung von Embryonen werden zwei Hauptverfahren verwendet, die
konventionelle
Kryokonservierung
und
die
Vitrifikation.
Die
konventionelle
Kryokonservierung, bei der Embryonen durch langsame Kühlraten in speziellen
Gefrierautomaten auf Temperaturen unter den Gefrierpunkt heruntergekühlt und
dann in flüssigen Stickstoff verbracht werden, wird heutzutage sowohl bei in vitro als
auch in vivo generierte Embryonen standardmäßig eingesetzt. Es wurde jedoch
nachgewiesen, dass die Vitrifikation als Einfrierverfahren für in vitro produzierte
Embryonen besser geeignet ist (MAHMOUDZADEH et al. 1995, KAIDI et al. 2001,
DOBRINSKY 2002, VIEIRA et al. 2007, STINSHOFF et al. 2011). Die Vitrifikation
stellt eine ultraschnelle Gefriermethode dar, bei der Embryonen durch hohe
Konzentrationen an Kryoprotektiva und extrem hohe Kühlraten in einen amorphen,
glasähnlichen Zustand überführt werden (LUYET u. HODAPP 1938). Der große
Vorteil der Vitrifikation ist, dass durch die hohen Kühlraten und die hohen
Konzentrationen der Kryoprotektiva keine intrazellulären Eiskristalle entstehen,
welche die Zellmembran schädigen könnten. Dadurch lassen sich nach dem
Auftauen im Vergleich zur konventionellen Kryokonservierung gleich gute oder
bessere Überlebensraten erzielen (DINNYÈS et al. 1996, KULESHOVA u. LOPATA
2002).
Die Vitrifikation wurde 1985 zum ersten Mal erfolgreich zur Kryokonservierung von
Mäuseembryonen eingesetzt (RALL u. FAHY 1985). Seitdem wurde immer wieder an
1
Einleitung
der Veränderung und Verbesserung der Vitrifikationsprotokolle gearbeitet, um eine
praxisreife Methode zu entwickeln. Die Entwicklung einer solchen Methode ist dabei
nicht nur im Bereich der Veterinärmedizin, beispielsweise zur Ermittlung des
genomischen
Zuchtwertes
bei
Rinderembryonen,
sondern
auch
in
der
Humanmedizin von großem Interesse. Bei der Präimplantationsdiagnostik werden
Biopsien von frühen Embryonalstadien entnommen und die Embryonen für die Dauer
der
Untersuchungen
kryokonserviert.
Eine
Verbesserung
der
Konservierungsmethode wäre in diesem Bereich von enormer Bedeutung. Ein
Nachteil bei der Vitrifikation besteht jedoch darin, dass die eingesetzten
Kryoprotektiva in hohen Konzentrationen zelltoxisch wirken. Um die toxischen Effekte
möglichst gering zu halten, werden meist Gemische aus penetrierenden und
nicht-penetrierenden Kryoprotektiva verwendet. Penetrierende Kryoprotektiva, wie
zum Beispiel Glycerin, Dimethylsufoxid (DMSO) oder Ethylenglykol (EG), zeichnen
sich dadurch aus, dass sie die Fähigkeit haben, durch die Zellmembran zu
diffundieren, um intrazellulär einen Schutz vor der Bildung schädlicher Eiskristalle zu
bewirken. Nicht-penetrierende Kryoprotektiva, wie zum Beispiel Saccharose, Ficoll
oder Polyvinylpyrrolidon (PVP), erhöhen die extrazelluläre Osmolarität, wodurch
Wasser
aus
der
Zelle
transportiert
wird.
Die
geringere
intrazelluläre
Wasserkonzentration bewirkt dabei ebenfalls einen Schutz vor der Bildung
schädlicher Eiskristalle (MERYMAN et al. 1977).
Durch die Veränderung der Vitrifikationsprotokolle konnten in den letzten Jahren
deutliche Verbesserungen in den Überlebensraten in vitro produzierter boviner
Embryonen erzielt werden. Eine optimale Zusammensetzung der Einfriermedien für
eine praxisreife Vitrifikationsmethode konnte allerdings noch nicht ermittelt werden.
Ein
häufig
kontrovers
diskutiertes
Thema
ist
die
Frage,
ob
DMSO
als
Kryoprotektivum zur Vitrifikation boviner Embryonen geeignet ist. Zum einen hat
DMSO eine ausgezeichnete Fähigkeit zur Eisbildung (FRIEDLER et al. 1988,
VALDEZ et al. 1992), zum anderen gilt es jedoch als eines der toxischsten
Kryoprotektiva (STACHECKI et al. 2008). Der Vergleich der Auswirkungen
DMSO-haltiger und DMSO-freier Kryoprotektiva auf die Qualität boviner Embryonen
2
Einleitung
ergab unterschiedliche Ergebnisse, so dass bisher keine deutliche Aussage getroffen
werden konnte, welche Methode besser geeignet ist.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen eines DMSO-haltigen und eines
DMSO-freien kommerziell erhältlichen Vitrifikationsmediums auf die Qualität in vitro
produzierter boviner Blastozysten nach dem Auftauen zu ermitteln. Dabei sollte
sowohl die morphologische Qualität, durch die Ermittlung der Überlebensraten der
Embryonen nach dem Auftauen und der Lebend-Tot-Zellratio, als auch die
molekulare Qualität, durch die Analyse der Expression sechs entwicklungsrelevanter
Gentranskripte, untersucht werden.
3
Literatur
2. Literatur
2.1. In-vitro-Produktion von Embryonen
Die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen umfasst methodisch drei Schritte: Die
Reifung (In-vitro-Maturation, IVM), die Befruchtung (In-vitro-Fertilisation, IVF) und die
Kultur der befruchteten Eizellen (In-vitro-Culture oder -Kultur, IVC; BAVISTER 1995).
Das Verfahren der IVP wurde erstmalig bei Nagetieren dokumentiert. Die ersten
Kaninchen aus in vitro produzierten Embryonen wurden 1959 geboren (CHANG
1959) und 1968 folgte die erste erfolgreiche IVP bei Labormäusen (WHITTINGHAM
1968). Das erste in vitro fertilisierte Kalb wurde 1981 geboren, dabei wurden die in
vivo maturierten Oozyten aus dem Eileiter des Muttertieres gespült und nach der
Fertilisierung im Labor direkt auf Empfängertiere übertragen (BRACKETT et al.
1982). Das erste, vollständig in vitro produzierte Kalb kam 1987 zur Welt (FUKUDA
et al. 1990), seitdem steigt die IVP boviner Embryonen Jahr für Jahr an. Im Jahr
2010 wurden 451000 Rinderembryonen in vitro produziert, von denen rund 340000
übertragen wurden. Im Vergleich dazu waren es im Jahr 2009 11% weniger
(International Embryo Transfer Society, IETS; STROUD 2010). In Tabelle 1 sind die
Zahlen in vivo und in vitro generierter Embryonen für die Spezies Rind für 2010 und
2009 im Vergleich dargestellt.
Tabelle 1: Vergleich der Anzahl in vivo und in vitro produzierter boviner Embryonen 2009 und 2010
(STROUD 2010)
Rinderembryonen 2009 (ca.) 2010 (ca.) Steigerung (ca., %)
In vivo generiert
702000
732000
4,3%
Davon übertragen
534000
591000
10,7%
In vitro generiert
377000
451000
19,7%
Davon übertragen
306000
340000
11,0%
4
Literatur
Die für die IVP benötigten Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) aus Ovarien werden
durch zwei Hauptverfahren gewonnen; zum einen durch die transvaginale,
ultraschallgeleitete Follikelpunktion (Ovum Pick Up, OPU; PIETERSE et al. 1988)
oder zum anderen durch die Gewinnung der Eizellen aus Schlachthofovarien mittels
Aspiration oder durch die sogenannte „Slicing-Methode“ (ECKERT u. NIEMANN
1995). Ein Vorteil des OPU ist, dass besonders wertvolle Tiere mehrfach punktiert
und so viele Eizellen dieser Tiere gewonnen werden können (BOLS et al. 1995),
allerdings
können
aus
Schlachthofovarien,
aufgrund
der
größeren
Menge
gewonnener KOK und der stärkeren Selektion morphologisch guter Eizellen, häufig
KOK besserer Qualität gewonnen werden (MERTON et al. 2003). Diese Qualität
zeichnet sich unter anderem dadurch aus, dass die KOK aus Schlachthofovarien
meist eine höhere Anzahl Kumuluszelllagen besitzen (BUNGARTZ et al. 1995) und
durch den sogenannten „Post-mortem-Effekt“ eine bessere Entwicklungskompetenz
erreichen (BLONDIN et al. 1997). Die qualitative Beurteilung der KOK erfolgt
zunächst auf morphologischer Ebene. Dabei lässt sich aufgrund der Anzahl der die
Zelle umgebenden Kumulusschichten sowie der Homogenität und der Farbe des
Zytoplasmas unter dem Mikroskop eine erste Einordnung in Qualitätsklassen
durchführen. Oozyten mit einer kompakten und mehrlagigen Kumulusschicht und
einem möglichst homogenen Zytoplasma gelten als qualitativ gut (KASTROP et al.
1990), des Weiteren steigt die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Entwicklung
zur Blastozyste in vitro mit der Anzahl der Kumulusschichten an (KHURANA u.
NIEMANN 2000; KELLY et al. 2007). Die KOK werden bei der morphologischen
Beurteilung hinsichtlich ihrer Qualität selektiert, da nur die als qualitativ gut
eingestuften KOK in die IVP eingehen.
Der erste Schritt der IVP, die Maturation, findet unmittelbar nach der Selektion der
KOK im Labor statt. Die Reifungsdauer beträgt normalerweise 18-27 Stunden und ist
abhängig vom Reifungsmedium und der Qualität der Eizellen (ROSE u. BAVISTER
1992, NAGAI 2001). Sie gliedert sich in die nukleäre und die zytoplasmatische
Maturation (HYTTEL et al. 1997) und dient dazu, die in der Oogenese arretierte
Reifeteilung fortzusetzen (EDWARDS 1965, SIRARD u. COENEN 2006). In vivo wird
die unreife Eizelle in der Follikelflüssigkeit durch das follikuläre Milieu in der
5
Literatur
Prophase 1 der 1. Reifeteilung arretiert. Durch Änderungen im follikulären Milieu und
den präovulatorischen Anstieg der Gonadotropinkonzentration wird die Prophase 1
schließlich beendet und die 1. Reifeteilung fortgesetzt (SUTTON et al. 2003).
PINCUS und ENZMANN konnten bereits 1935 nachweisen, dass durch die
Entnahme unreifer Eizellen aus dem präovulatorischen Follikel und die dadurch
bedingte Milieuänderung eine spontane Einleitung der Eizellreifung stattfindet
(PINCUS u. ENZMANN 1935). Heute werden durch kommerziell erhältliche
Reifungsmedien Reifungsraten von 66-95% erreicht (ADONA 2008). Solche
kommerziell erhältlichen Medien sind beispielsweise Tissue Culture Medium 199
(TCM199), Waymouth MB 752/1, Ham’s F12, Minimum Essential Medium (MEM)
oder Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM). Dabei waren bei bovinen
Oozyten die Entwicklungsraten bei Verwendung der Maturationsmedien Waymouth
MB 752/1 oder Ham’s F12 signifikant schlechter als bei der Reifung in TCM199 oder
MEM (ROSE u. BAVISTER 1992, SUTTON et al. 2003).
Kommerziell
erhältlichen
Medien
werden
in
der
Regel
undefinierte
oder
semidefinierte Proteinzusätze wie beispielsweise fetales Kälberserum (fetal calf
serum, FCS), estrous cow serum (ECS), bovines Serumalbumin (bovine serum
albumine, BSA) oder auch humanes Serumalbumin (human serum albumine, HSA)
zugefügt. Diese sind wichtig, um beispielsweise die Toxizität anderer Medienzusätze
oder
metabolischer
Faktoren
zu
senken,
um
die
grundsätzlichen
Nährstoffanforderungen der Oozyten zu befriedigen oder um die Oozytenreifung zu
fördern (ECKERT u. NIEMANN 1995). Ein weiterer Vorteil von Proteinzusätzen ist
eine Verbesserung in der Handhabung der Oozyten, da ein Aufschwimmen der
Eizellen im Medium vermindert wird. Allerdings entstehen bei dem Einsatz
undefinierter Medienzusätze große Variabilitäten in der Zusammensetzung der
Maturationsmedien, wodurch die Reproduzierbarkeit von Ergebnissen und die
Vergleichbarkeit
innerhalb
unterschiedlicher
Laboratorien,
die
mit
solchen
Medienzusätzen arbeiten, erschwert werden (ECKERT u. NIEMANN 1995). Des
Weiteren besteht beim Zusatz von beispielsweise FCS oder BSA die Gefahr einer
möglichen Kontamination mit Krankheitserregern (SUTTON et al. 2003). Es hat sich
allerdings gezeigt, dass bovine Oozyten, welche in einem Maturationsmedium, dem
6
Literatur
FCS beigefügt war, gereift wurden, sowohl höhere Maturationsraten als auch höhere
Entwicklungsraten zur Blastozyste zeigten, als solche, die ohne Serumzusatz gereift
wurden (FUKUI u. ONO 1989, WIEMER et al. 1991, HASLER 2000). Zusätzlich
ermöglicht z.B. BSA, als Zusatz zum Maturationsmedium, bei bovinen Blastozysten
eine adäquate zytoplasmatische und Kernreifung (MINGOTI et al. 2002).
Eine Alternative zu
undefinierten Proteinzusätzen sind Makromoleküle wie
Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). In Kombination mit Hormonen
und anderen Zusätzen, wie z.B. Hypotaurin oder ß-Mercaptoethanol, können diese
Maturationsmedien zu Blastozystenraten führen, welche an die Raten von Medien
mit BSA-Zusatz herankommen (ABEYDEERA et al. 2000; MIZUSHIMA u. FUKUI
2001) und damit eine gute Alternative zu den undefinierten Medien darstellen
(SUTTON et al. 2003).
Nach Abschluss der Reifung erfolgt unmittelbar die IVF, die ca. 6-24 Stunden dauert.
Um eine erfolgreiche Fertilisierung zu ermöglichen, müssen die Spermien vor der
Koinkubation mit den Eizellen kapazitiert sein, da sie sonst die Zona pellucida nicht
penetrieren können (CHANG 1984, BRACKETT et al. 1993). Die Kapazitation und
auch die Akrosomenreaktion sind physiologische Vorgänge, welche zur Befruchtung
der Eizellen nötig sind. In vivo wird die Kapazitation durch Glukosaminoglykane wie
zum Beispiel Heparin im weiblichen Genitaltrakt induziert (BRACKETT et al. 1993,
PARRISH
et
al.
1986),
Permeabilitätsänderung
der
die
Akrosomenreaktion
Spermienmembran
für
wird
durch
Kalzium-Ionen
eine
ausgelöst
(BRACKETT et al. 1993). In vitro werden diese Vorgänge, bei der Aufbereitung der
Spermiensuspension und bei der Koinkubation der Spermien mit den Oozyten, durch
den Zusatz von Heparin zu den Kulturmedien induziert (PARRISH et al. 1988). Des
Weiteren wird in vitro durch die Dichtegradientenzentrifugation mit Silikaten, wie zum
Beispiel den kommerziell erhältlichen Spermfilter®, PureSperm®, BoviPure® oder
CryoBioSystem die Anreicherung motiler Spermien in der dichten Fraktion der
Suspension ermöglicht, wodurch diese von den nicht motilen Spermien separiert und
besser aussortiert werden können (PARRISH et al. 1995). Insgesamt können bei der
IVF Fertilisationsraten von durchschnittlich 80% erreicht werden (KRISHER et al.
1999, RIZOS et al. 2003).
7
Literatur
Nach der Koinkubation von Eizellen und Spermien findet die IVC statt. Dazu werden
die vermeintlichen Zygoten für etwa 6-8 Tage in ein Kulturmedium überführt. Auch
bei diesem Schritt hat die Wahl des Kulturmediums und der Kulturbedingungen, wie
zum Beispiel die Sauerstoffkonzentration, entscheidenden Einfluss auf die
Entwicklungsraten der Embryonen. Zu Beginn wurden häufig, ähnlich wie in der IVM,
komplexe Medien mit undefinierten Serumzusätzen wie FCS oder BSA eingesetzt.
Ein Beispiel für ein solch komplexes Medium ist das TCM199 (EYESTONE u. FIRST
1989). Neben der schon erwähnten schwierigen Vergleichbarkeit beim Einsatz
solcher Medien gibt es ein weiteres Problem, dass das TCM199 ursprünglich für
Zellkulturen entwickelt wurde und daher nicht auf die speziellen Bedürfnisse von
Embryonen abgestimmt ist (WRENZYCKI 2007). Zur Verbesserung der genannten
Probleme wurden zunächst definierte Makromoleküle wie PVA eingesetzt, um die
Ergebnisse vergleichbarer zu machen. Des Weiteren wurde bereits 1972 ein
chemisch definiertes Medium, das synthetic oviduct fluid (SOF), speziell für die Kultur
von Embryonen entwickelt, welches sich zunächst allerdings nicht durchsetzen
konnte (TERVIT et al. 1972). Heutzutage wird das SOF und andere chemisch
definierte Medien, wie das hamster embryo culture medium (HECM), standardmäßig
zur IVP von Embryonen eingesetzt (SCHINI u. BAVISTER 1988, SUTHAR u. SHAH
2009). Beim Einsatz solcher Medien wird meist eine Sauerstoffkonzentration von 5%
in der Atmosphäre benötigt, um gute Blastozystenraten erreichen zu können
(VANROOSE et al. 2001). Diese Sauerstoffkonzentration entspricht in etwa den
In-vivo-Bedingungen von Embryonen im maternalen Reproduktionstrakt (FISCHER
u.
BAVISTER
1993,
CORRÊA
et
al. 2008).
Durch
die
Absenkung
der
Sauerstoffkonzentration können höhere Überlebensraten bei der IVP erreicht werden
(CORRÊA et al. 2008).
Trotz vieler Verbesserungen der Kulturbedingungen in den letzten Jahren sind die in
vitro produzierten Embryonen qualitativ den in vivo generierten unterlegen, so
erreichen in der Regel 25-40% der in die IVP eingebrachten Oozyten das Stadium
der Blastozyste (KRISHER et al. 1999, RIZOS et al. 2003). Eine Übersicht der
gesamten IVP ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.
8
Literatur
Unreife Eizellen
Spermien
In-vitro-Maturation
18-27 Stunden
In-vitro-Kapazitation
In-vitro-Fertilisation
6-24 Stunden
In-vitro-Kultur
6-8 Tage
Blastozysten
Abbildung 1: Schematische Darstellung der IVP (modifiziert nach NIEMANN u. MEINECKE 1993)
Der Einsatz verschiedener Kulturmedien hat nicht nur Auswirkungen auf die
Entwicklungsrate zum Blastozystenstadium, es konnte ebenfalls festgestellt werden,
dass verschiedene Kulturbedingungen einen Einfluss auf die Kryokonservierbarkeit
boviner Embryonen haben. So wurde beispielsweise gezeigt, dass der Zusatz von
Hyaluronsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml zum SOF-Kulturmedium die
Reexpansionsrate und in einer Konzentration von 0,5 mg/ml die Schlupfrate
vitrifizierter Blastozysten nach dem Auftauen steigern kann (BLOCK et al. 2009).
Auch Phenazinethosulphat in einer Konzentration von 0,3 µM steigert die
Überlebensrate vitrifizierter und konventionell kryokonservierter boviner Blastozysten.
Dieser
Effekt
ist
darauf
zurückzuführen,
dass
Phenazinethosulphat
den
zytoplasmatischen Lipidgehalt der Embryonen senkt (BARCELÓ-FIMBRES u.
SEIDEL 2007). Sehr häufig konnte nachgewiesen werden, dass FCS als
Medienzusatz bei der IVC die Einfrierbarkeit boviner Blastozysten reduziert. So
erreichten GÓMEZ et al. (2008) bei bovinen Blastozysten, welche in Medien mit BSA
oder Verozellzusatz kultiviert wurden, nach dem Auftauen höhere Überlebensraten
9
Literatur
als bei solchen, die in Medien mit FCS kultiviert wurden. Auch HOSHI zeigte (2003),
dass der Einsatz von serumfreien Medien im Vergleich zu Medien mit FCS zu
wesentlich höheren Schlupfraten nach dem Auftauen führte. Ein Zusatz von FCS zu
einem Charles Rosenkrans Medium mit Aminosäurenzusatz (CR1aa) ergab im
Vergleich zu Medien ohne Serumzusatz zwar gleich gute Blastozystenraten, die
Schlupfraten nach dem Auftauen waren jedoch in den Gruppen mit Serumzusatz
geringer als bei denen ohne Serumzusatz (MUCCI et al. 2006). Die Tatsache, dass
der Zusatz verschiedener Seren zum Kulturmedium die Kryotoleranz beeinflusst, ist
darauf zurückzuführen, dass nach dem Einsatz von Serum im Zytoplasma der Zellen
vermehrt Lipideinschlüsse beobachtet werden (HOSHI 2003). Solche Einschlüsse
konnten schon ab dem 8-Zell-Stadium nachgewiesen werden (ABE et al. 1999) und
es wurde in mehreren Arbeiten bestätigt, dass dadurch die Kryotoleranz boviner
Blastozysten signifikant reduziert wird (MOHR u. TROUNSON 1981, LEIBO u.
LOSKUTOFF 1993). Bekräftigt werden diese Ergebnisse außerdem durch Versuche,
in denen vor dem Einfrieren Lipidtröpfchen manuell aus dem Zytoplasma der Zellen
entfernt wurden, wodurch die Überlebensrate der bovinen Blastozysten nach dem
Auftauen gesteigert werden konnte (DIEZ et al. 2001, LEIBO et al. 1995). Im
Gegensatz dazu konnte bei porzinen Embryonen die Zugabe von fetalem
Rinderserum (fetal bovine serum, FBS) an Tag 4 der Kultur die Kryotoleranz und
Überlebensraten nach Vitrifikation steigern. Dies ist darauf zurückzuführen, dass der
Zusatz von FBS zu einer Verbesserung der Teilungsfähigkeit von porcinen
embryonalen Zellen führt (MEN et al. 2005).
Auch Medienzusätze, welche nach dem Auftauen vitrifizierter Embryonen dem
Kulturmedium beigefügt wurden, konnten die Überlebensraten boviner Blastozysten
steigern. So zeigten RIZOS et al. (2001), dass die Kultur boviner Blastozysten in
SOF mit Granulosazellen einen positiven Effekt auf die Überlebensrate hatte. Auch
der Zusatz von ß-Mercaptoethanol nach dem Auftauen bewirkte eine Verbesserung
der Schlupfraten und der Gesamtzellzahl boviner Blastozysten (NEDAMBALE et al.
2006).
10
Literatur
2.2. Physikalische Vorgänge beim Einfrieren von Zellen
Das Einfrieren von biologischem Material ermöglicht dessen Lagerung über viele
Jahre ohne Verlust der Vitalität, da alle biologischen Prozesse bei Temperaturen von
-130°C und darunter zum Stillstand kommen. Die einzige mögliche Schädigung
scheint die Bildung freier Radikale durch terrestrische Strahlung zu sein, welche
jedoch so gering ist, dass Zellen theoretisch über 2000-4000 Jahre in flüssigem
Stickstoff gelagert werden können bis es zu einer Schädigung kommt (MAZUR
1984). Biologisches Material, welches einem Einfrierprozess ausgesetzt ist,
durchläuft verschiedene Veränderungen der externen und internen Bedingungen, wie
z.B. Temperaturunterschiede, Veränderungen im Wassergehalt und in der
Konzentration gelöster Stoffe (MAZUR u. SCHMIDT 1968). Die dabei entstehenden
chemischen und physikalischen Prozesse können zu Schäden an den Zellen führen
(MAZUR 1984). In Abb. 2 sind diese Prozesse schematisch dargestellt. Bis zu einer
Temperatur von etwa -5°C bleibt das Wasser innerhalb und außerhalb der Zellen in
einem flüssigen Zustand. Dies wird durch den Prozess des sogenannten
„supercoolings“ und durch die gelösten, den Gefrierpunkt erniedrigenden Stoffe in
den Medien hervorgerufen. Bei einer Temperatur von -5°C bis -15°C beginnt das
extrazelluläre Wasser zu kristallisieren. Dies geschieht entweder spontan oder wird,
wie beim „Seeding“, manuell hervorgerufen (siehe Kapitel 2.3.1.). Durch den Schutz
der Zellmembran bleibt das Wasser innerhalb der Zelle zunächst flüssig, was dazu
führt, dass in der Zelle ein höheres chemisches Potential entsteht und Wasser
anfängt, aus der Zelle zu diffundieren, um dieses Potential auszugleichen. Das
ausgetretene Wasser kristallisiert ebenfalls im Extrazellularraum, die Zelle dehydriert
und die gelösten Stoffe konzentrieren sich im flüssigen Medium innerhalb der Zelle,
bis ein chemisches Gleichgewicht zwischen intra- und extrazellulären Flüssigkeiten
herrscht. Die Geschwindigkeit des Einfrierprozesses bedingt dabei das Ausmaß der
Dehydratation der Zellen. Wie in Abb. 2 ersichtlich, kann das intrazelluläre Wasser
nur bei ausreichend kleinen Kühlraten aus der Zelle diffundieren. Sind die Kühlraten
zu hoch, hat die Zelle nicht ausreichend Zeit zu dehydrieren und es entstehen
schädliche, intrazelluläre Eiskristalle. Bei extrem hohen Kühlraten sind die Eiskristalle
11
Literatur
in der Zelle zwar sehr klein, wodurch die Zelle beim Einfrieren nur wenig geschädigt
wird, allerdings sind diese kleinen Eiskristalle extrem instabil und können sich beim
Auftauen zu größeren Eiskristallen zusammenlagern, welche wiederum zu
Zellmembranschäden führen können. Dieses Phänomen wird als Rekristallisation
bezeichnet (MAZUR et al. 1972).
-2° C
-5°C
Langsames
Einfrieren
Sehr schnelles
Einfrieren
Schnelles
Einfrieren
< -10°C
H2O
H2O
Abbildung 2: Schematische Darstellung physikalischer Prozesse beim Einfrieren von Zellen
(mod. nach Mazur 1977)
12
Literatur
Durch die Bildung intrazellulärer Eiskristalle können verschiedene Zellschäden
entstehen, beim der Kryokonservierung von Embryonen wurden beispielsweise
Veränderungen der Zona pellucida, der Zellmembran, der Mikrofilamentstruktur, der
Zellorganellen
oder
der
Zell-Zell-Verbindungen
beobachtet
(VAJTA
2000,
DOBRINSKY 2002). Doch nicht nur die Eiskristallbildung schädigt die Zellen beim
Einfrieren. MAZUR et al. postulierten 1972 zwei entscheidende Faktoren für die
Zellschädigung
beim
Kryokonservieren.
Der
eine
Faktor
ist
die
erwähnte
Eiskristallbildung, die von der Einfriergeschwindigkeit abhängt, der andere Faktor ist
die Konzentrierung gelöster Stoffe, sowohl intra- als auch extrazellulär, welcher
toxische Effekte hervorrufen kann. Ein optimales Einfrieren ist nur dann möglich,
wenn beide Faktoren auf ein Minimum begrenzt werden.
Bei der Vitrifikation entstehen durch extrem hohe Kühl- und Auftauraten sowie durch
den
Zusatz
von
Kryoprotektiva
in
höheren
Konzentrationen
als
bei
der
konventionellen Kryokonservierung keine intrazellulären Eiskristalle. Dies kommt
dadurch zustande, dass mittels der hochkonzentrierten Kryoprotektiva die Zellen
schon vor dem Abkühlprozess dehydriert werden. Die intrazelluläre Flüssigkeit wird
somit visköser und kann so beim Abkühlen direkt vom flüssigen in einen
glasähnlichen Zustand übergehen (RALL u. FAHY 1985). Die Schädigung durch
Eiskristallbildung entfällt demnach bei der Vitrifikation, allerdings können durch die
hohen Konzentrationen an Kryoprotektiva toxische Effekte entstehen. Es wird daher
versucht
durch
den
nicht-penetrierenden
Einsatz
von
Kryoprotektiva
Gemischen
und
durch
aus
penetrierenden
und
Reduzierung
der
die
Äquilibrierungszeit die toxischen Effekte auf ein Minimum zu reduzieren.
2.3. Kryokonservierungsverfahren
Unter dem Begriff Kryokonservierung wird die Überführung flüssiger Substanzen
oder Zellen in eine feste, gefrorene Phase mit dem Ziel der vollständigen Erhaltung
der Ausgangseigenschaften des Materials verstanden (SCHEIWE u. RAU 1981). Die
erste
erfolgreiche
Kryokonservierung
und
anschließende
Übertragung
von
Embryonen fand 1971 bei der Maus statt (WHITTINGHAM 1971), 1973 folgte das
13
Literatur
erste aus einem kryokonservierten Embryo geborene Kalb (WILMUT u. ROWSON
1973). Beim Menschen fand die erste Übertragung kryokonservierter Embryonen in
den späten 1970ern statt (EDWARDS et al 1980), von der ersten Schwangerschaft
wurde 1983 in Australien berichtet (TROUNSON u. MOHR 1983). Heute ist das
Einfrieren von Embryonen ein in der Biotechnologie routinemäßig angewandtes
Verfahren
und
findet
Embryonentransfers.
So
immer
wurden
größere
Bedeutung
2010
beispielsweise
im
in
Rahmen
der
des
bovinen
Reproduktionsmedizin der überwiegende Teil der in vivo gewonnenen Embryonen
vor dem Transfer auf ein Empfängertier kryokonserviert (STROUD 2010). Auch bei
den in vitro generierten Embryonen gewinnt die Kryokonservierung immer mehr an
Bedeutung. Mit ihrer Hilfe können Embryonen über Jahre gelagert, international
verschickt und somit auf viele verschiedene Empfängertiere übertragen werden
(RALL 1992). Es werden zwei hauptsächlich genutzte Gefrierverfahren, die
konventionellen
Kryokonservierung
und
die
Vitrifikation,
unterschieden.
Der
bedeutendste Unterschied liegt hierbei in der Einfriergeschwindigkeit. Während bei
der konventionellen Kryokonservierung die Embryonen durch langsame Kühlraten in
Einfrierautomaten heruntergekühlt werden, können die Embryonen bei den
Vitrifikationsmethoden direkt in den flüssigen Stickstoff verbracht werden.
2.3.1. Konventionelle Kryokonservierung
Die konventionelle Kryokonservierung stellt das ursprünglich bei Embryonen
eingesetzte Verfahren dar. Es wurde bei Forschungen zu den Effekten von Einfrierund Auftauraten auf die Überlebensfähigkeit von Säugetierzellen entwickelt (MAZUR
et al. 1972). Bei der konventionellen Kryokonservierung wird noch einmal zwischen
langsamen und schnellen Gefrierverfahren unterschieden.
Bei den langsamen Gefrierverfahren werden die Embryonen bis zu einer bestimmten
Temperatur langsam heruntergekühlt und bei dieser Temperatur für eine gewisse
Zeit gelagert bevor, sie wieder aufgetaut werden. WHITTINGHAM benutzte ein
solches Verfahren erstmalig 1971 für die Kryokonservierung von Mäuseembryonen,
dabei lagen die Kühlraten bei ca. 1°C/s und die Embryonen wurden in einem
14
Literatur
Medienvolumen von 0,25 ml in einem Glas- oder Plastikröhrchen eingefroren. Die
Embryonen wurden für 30 Minuten auf Trockeneis bei -79°C in einem isolierten
Gefäß gelagert, bevor sie wieder aufgetaut wurden. Als Kryoprotektivum kam hier
PVP zum Einsatz (WHITTINGHAM 1971). Später wurden Einfrierautomaten
verwendet, durch welche die Kühlraten individuell angepasst und eingestellt werden
konnten.
Bei
den
schnellen
Gefrierverfahren
werden
die
Embryonen
in
diesen
Gefrierautomaten ebenfalls zunächst schrittweise heruntergekühlt. Bei einer
Temperatur von ca. -6°C wird das sogenannte „Seeding“ durchgeführt. Dabei wird
manuell eine Kristallisation des extrazellulären Mediums hervorgerufen, wodurch
schädliche Effekte auf den Embryo durch Unterkühlung vermieden werden sollen
(LEIBO 1984). Daraufhin erfolgt die weitere langsame Kühlung auf ca. -20 - -40°C.
Anschließend
werden
die
Embryonen,
im
Gegensatz
zu
den
langsamen
Gefrierverfahren, direkt in flüssigen Stickstoff überführt und können dort sehr lange
gelagert werden.
Im Allgemeinen können bei der konventionellen Kryokonservierung die folgenden
Schritte unterschieden werden (NIEMANN 1991):
 Äquilibrierung des Embryos im Kryoprotektivum
 Einführen des Embryos in das Trägersystem
 Einführen des Trägersystems in den Einfrierautomaten und Herunterkühlen
 Seeding
 Erneutes Herunterkühlen
 Überführung in flüssigen Stickstoff
 Auftauen
 Ausverdünnen des Mediums
Die Äquilibrierung im Kryoprotektivum erfolgte in mehreren Schritten, allerdings
zeigte NIEMANN (1985), dass eine erfolgreiche Kryokonservierung auch mit nur
einem Äquilibrierungsschritt in 1,4 M Glyzerin möglich ist. Heute werden bovine
Embryonen bei der konventionellen Kryokonservierung standardmäßig in einem
15
Literatur
Äquilibrierungsschritt in Ethylenglycol (EG) eingefroren. Eine große Verbesserung
der Einfriertechnik wurde durch die Verwendung von Plastikstraws mit einem
Volumen von 250 µl erreicht. Dadurch konnten die Embryonen zum einen besser in
den Stickstoffcontainern gelagert werden, zum anderen war es nun möglich, eine
Verdünnungslösung direkt mit in den Straw aufzuziehen, wodurch das Ausdünnen
der Kryoprotektiva nach dem Auftauen vereinfacht werden konnte (MASSIP 2001).
Auf diese Weise gelang es LEIBO 1984 ein sogenanntes „One-step-Verfahren“ zu
etablieren, bei dem das Kryoprotektivum durch Schütteln des Straws nach dem
Auftauen direkt ausverdünnt wurde. Die Embryonen können dadurch, ohne dass eine
weitere Manipulation im Labor nötig ist, unmittelbar auf Empfängertiere übertragen
werden (LEIBO 1984).
2.3.2. Vitrifikation
Seit
der
Entwicklung
und
dem
standardmäßigen
Einsatz
von
Kryokonservierungstechniken bei Embryonen wurden immer neue, verbesserte
Methoden entwickelt. Die Entwicklung der Vitrifikation gilt als eine zunehmend
nennenswerte Alternative zur konventionellen Kryokonservierung (DOBRINSKY
2002). Die Vitrifikation ist ein physikalischer Prozess, bei dem ein flüssiges Medium
durch extrem schnelle Kühlraten ohne die Bildung von Eiskristallen in einen
amorphen, glasartigen Zustand übergeht (LUYET
u. HODAPP 1938). Dadurch
können Schäden durch die Bildung intrazellulärer Eiskristalle verringert werden. Ein
weiterer Vorteil ist eine Zeitersparnis, die dadurch entsteht, dass die Zellen nicht
mehr durch Einfrierautomaten schrittweise heruntergekühlt werden müssen, sondern
nach einer Äquilibrierungszeit im Einfriermedium direkt in flüssigen Stickstoff
überführt werden können. Des Weiteren entfallen die Kosten für die Anschaffung von
Einfrierautomaten, welche zur konventionellen Kryokonservierung benötigt werden
(RALL 1987, VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997). Die erste erfolgreiche
Vitrifikation fand 1985 durch RALL und FAHY bei Mäuseembryonen statt. Die
Embryonen wurden in einem Schritt in sehr hochkonzentrierten Lösungen äquilibriert,
wobei
Medien
benutzt
wurden,
denen
16
sowohl
penetrierende
als
auch
Literatur
nicht-penetrierende Kryoprotektiva zugesetzt waren. Durch VAN-WAGTENDONK-DE
LEEUW et al. wurde 1997 zum ersten Mal eine große, vergleichende Versuchsreihe
mit
vitrifizierten
und
konventionell
kryokonservierten
bovinen
Blastozysten
veröffentlicht. Sie zeigten unter anderem, dass die Vitrifikation eine Methode ist, die
auch unter praxisähnlichen Bedingungen keine Reduzierung der Trächtigkeitsraten
im Vergleich zu konventionell kryokonservierten Embryonen hervorrief (VAN
WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997).
Laut ARAV et al. wird eine erfolgreiche Vitrifikation durch drei Hauptfaktoren
beeinflusst. Diese sind eine genügend hohe Viskosität des Einfriermediums durch
hohe Konzentrationen an Kryoprotektiva, das Erreichen möglichst hoher und
gleichbleibender Kühl- und Auftauraten und ein möglichst kleines Probenvolumen.
Durch eine genügend hohe Viskosität des Mediums wird verhindert, dass beim
Einfrieren der Embryonen in flüssigem Stickstoff Eiskristalle entstehen, welche die
Zellmembran und die Zellorganellen schädigen können. Allerdings wird durch die
Verwendung von hohen Konzentrationen an Kryoprotektiva die Gefahr der
Zellschädigung durch toxische Effekte erhöht. Um diese zu minimieren, werden
häufig
Gemische
aus
mehreren
Kryoprotektiva
verwendet,
wodurch
die
Konzentration der einzelnen Komponenten niedrig gehalten werden kann, die
Fähigkeit zur Vitrifikation aber erhalten bleibt. Sowohl die Nutzung möglichst kleiner
Probenvolumina als auch möglichst hoher Kühlraten bei der Vitrifikation dienen dazu,
das Probenmaterial schnell in einen glasähnlichen Zustand zu überführen (ARAV et
al. 2002). Beide Faktoren werden hauptsächlich durch die Wahl des Trägersystems
beeinflusst. Dabei zeigt die Verwendung von offenen Trägersystemen wesentlich
höhere Kühlraten, da das Probenmaterial in direktem Kontakt mit dem flüssigen
Stickstoff steht. Einen limitierenden Faktor für die Kühlraten stellt die Bildung einer
isolierenden Dampfschicht um das Probenmaterial dar, wodurch bei offenen
Verfahren maximale Kühlraten von ca. 20.000°C/min erreicht werden können
(VAJTA et al. 1998). Allerdings konnte durch die Verwendung von Stickstoff, der sich
am Übergang vom flüssigen zum festen Aggregatzustand befand und damit eine
Temperatur von -210°C aufwies, die Kühlraten auf ca. 53.000°C/min gesteigert
werden (YAVIN et al. 2009). Ein weiterer Faktor, der die Qualität vitrifizierter
17
Literatur
Embryonen beeinflusst, ist eine schrittweise Äquilibrierung in immer höher
konzentrierten Medien vor dem eigentlichen Einfrierprozess. So konnte gezeigt
werden, dass Blastozysten, die in vier oder mehr Schritten einer ansteigenden
Konzentration an Kryoprotektiva ausgesetzt waren bessere Reexpansionsraten
zeigten als solche, die nur zwei Äquilibrierungsschritte durchliefen oder direkt in das
Vitrifikationsmedium überführt wurden (KUWAYAMA et al. 1992).
Vergleiche zwischen den Überlebensraten und der Qualität vitrifizierter und
konventionell
kryokonservierter
boviner
IVP-Embryonen
ergaben,
dass
die
Vitrifikation als Konservierungsmethode gleich gut oder besser geeignet zu sein
scheint (MAHMOUDZADEH et al. 1995, KAIDI et al. 2001, DOBRINSKY 2002,
VIEIRA et al. 2007, STINSHOFF et al. 2011). Beispielsweise unterschieden sich die
Ergebnisse bezüglich der Trächtigkeitsraten beim Übertragen vitrifizierter oder
konventionell Kryokonservierter boviner Embryonen nicht voneinander (VAN
WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997). Die Vitrifikation stellt demnach eine
praxistaugliche, einfache und effektive Methode für
die Kryokonservierung
präimplantatorischer Embryonen bei Nutztieren dar.
2.4. Kryoprotektiva
Kryoprotektiva werden in zwei Gruppen eingeteilt: Die penetrierenden Kryoprotektiva,
welche in der Lage sind, Zellmembranen zu überwinden und in hohen
Konzentrationen Zellen vor Gefrierschäden bei langsamen Kühlraten zu schützen
und die nicht-penetrierenden Kryoprotektiva, welche in wesentlich niedrigeren
Konzentrationen
eingesetzt
werden
können,
jedoch
schnellere
Einfrierraten
benötigen, um einen schützenden Effekt zu haben (MERYMAN 1971). Die erste
erfolgreiche Kryokonservierung von Mäuseembryonen erfolgte in einem Gemisch
aus phosphate buffered saline (PBS) mit Natriumchlorid (NaCl), BSA, Glukose und
Penicillin G, dem PVP als Kryoprotektivum zugesetzt war (WHITTINGHAM 1971).
Als Basismedium für die Kryokonservierung wird meist PBS mit einem Zusatz von
BSA oder FCS verwendet (NIEMANN 1991). Diesem Grundmedium werden ein oder
mehrere Kryoprotektiva zugesetzt. Bei der Vitrifikation werden meist Gemische aus
18
Literatur
penetrierenden
und
nicht-penetrierenden
Kryoprotektiva
verwendet,
um
die
Konzentration und damit die Toxizität der Einzelsubstanzen zu verringern.
2.4.1. Penetrierende Kryoprotektiva
Die penetrierenden Kryoprotektiva zeichnen sich dadurch aus, dass sie die
Zellmembran überwinden und somit im Inneren der Zelle ihre protektive Wirkung
entfalten können. MERYMAN postulierte 1971, dass penetrierende Kryoprotektiva
dabei zwei entscheidende Eigenschaften haben müssen. Zum einen müssen sie
allgemein in der Lage sein, die Zellmembran zu überwinden, zum anderen dürfen sie
in den für die Kryokonservierung benötigten Konzentrationen nicht zelltoxisch sein
(MERYMAN 1971). Beim Zusatz von penetrierenden Kryoprotektiva schrumpfen die
Zellen zunächst durch Dehydratation. Dies liegt nicht nur an der hyperosmolaren
extrazellulären Lösung, sondern auch daran, dass die Zellmembran für Wasser
permeabler ist als für die Kryoprotektiva (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). Ist ein
Gleichgewicht zwischen dem Ausströmen von Wasser und dem Einströmen des
Kryoprotektivums erreicht, fängt die Zelle wieder an zu reexpandieren. Eine
erfolgreiche Äquilibrierung ist erreicht, wenn die Zelle wieder ihre normale Größe
erreicht hat (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). Welches penetrierende Kryoprotektivum
für eine bestimmte Spezies oder ein bestimmtes Einfrierverfahren am besten
geeignet ist, hängt von vielen Faktoren ab. So ist beispielsweise die Zeit, die für eine
genügende Äquilibrierung benötigt wird abhängig von Faktoren wie der Spezies, dem
embryonalen Entwicklungsstadium, seinem Oberflächen-/Volumen-Verhältnis und
der Umgebungstemperatur (LEIBO 1989). Wie schnell ein Kryoprotektivum die
Zellmembran überwinden kann, hängt von seiner Permeabilitätskonstante und von
der Umgebungstemperatur ab und ist daher für jeden Stoff individuell (SCHNEIDER
u. MAZUR 1984). In Versuchen mit Mäuseembryonen wurde festgestellt, dass die
Permeabilitätskonstante
eines
Stoffes
mit
der
Temperatur
und
mit
dem
fortgeschrittenen Entwicklungsstadium des Embryos ansteigt, von der Konzentration
des Kryoprotektivums jedoch unabhängig ist (SCHNEIDER u. MAZUR 1984). Für die
19
Literatur
konventionelle Kryokonservierung und die Vitrifikation von Embryonen werden
verschiedene penetrierende Kryoprotektiva eingesetzt.
2.4.1.1. Glyzerin
Glyzerin oder auch Propan-1,2,3-triol ist ein dreiwertiger Alkohol, der eine sowohl
farb- als auch geruchslose Substanz darstellt (Abb. 3). Es wurde 1949 zum ersten
Mal zur Vitrifikation von Geflügelsperma benutzt (POLGE et al. 1949).
Abbildung 3: Strukturformel Glyzerin
Glyzerin wurde bis in die 90er Jahre häufig als alleiniges Kryoprotektivum bei der
konventionellen Kryokonservierung von Rinderembryonen eingesetzt. Es zeichnet
sich durch eine langsame Penetrationszeit aus, gilt in hohen Konzentrationen jedoch
auch als eine geringfügig toxische Substanz (MERYMAN 1971). Die für die
konventionelle Kryokonservierung eingesetzte Konzentration liegt in der Regel
zwischen 1 M und 2 M. LEHN-JENSEN verglich 1986 verschiedene Konzentrationen
an Glyzerin beim Einfrieren boviner Blastozysten und konnte feststellen, dass eine
Konzentration von 0,5 M signifikant schlechtere Überlebensraten erbrachte als
Konzentrationen von 1 M oder 1,5 M. (LEHN-JENSEN 1986). Dieses wurde durch
KENNEDY et al. (1983) bestätigt, welche bovine Blastozysten in 1 M oder 1,4 M
Glyzerin-Lösung
einfroren
und
keine
signifikanten
Unterschiede
erkannten.
NIEMANN verglich 1985 den Einsatz des sogenannten „One-step-Verfahrens“ mit
nur einem Äquilibrierungsschritt unter Anwendung von 1,4 M Glyzerin mit der damals
üblichen, schrittweisen Äquilibrierung bis zu einer Konzentration von 1,0 M bei
bovinen Blastozysten. Er zeigte dabei, dass das „One-step-Verfahren“ zu guten
Überlebensraten nach dem Auftauen und zu guten Trächtigkeitsraten führte
20
Literatur
(NIEMANN 1985). Bei der Vitrifikation werden, im Gegensatz zur konventionellen
Kryokonservierung, meist wesentlich höhere Konzentrationen Glyzerin eingesetzt,
um die Fähigkeit, einen glasähnlichen Zustand zu bilden, zu erreichen. Dabei gibt es
sowohl die Möglichkeit Glyzerin als alleiniges Kryoprotektivum einzusetzen, als auch
es mit anderen Kryoprotektiva zu mischen und so die Einzelkonzentrationen zu
senken. Der Vergleich zwischen bovinen Blastozysten, die entweder in 6,5 M
Glyzerin oder in einem Gemisch aus 25% Glyzerin und 25% Propylenglycol vitrifiziert
wurden, ergab, dass die Überlebensraten zwar gleich gut, die Trächtigkeitsraten
jedoch bei der Vitrifikation in 6,5 M Glyzerin höher waren (Tab. 2; VAN
WAGTENDONK-DE
LEEUW
et
al.
1995).
Der
Vergleich
zwischen
einer
Vitrifikationsmethode in 6,5 M Glyzerin und konventioneller Kryokonservierung in
1,5 M
Glyzerin
ergab
keine
signifikanten
Unterschiede
(Tab.
2;
VAN
WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1997). DONNAY et al. verglichen 1998 zwei
Vitrifikationsmethoden, in denen Glyzerin und Ethylenglycol zum Einsatz kamen. So
waren die Reexpansions- und Schlupfraten von bovinen Blastozysten nach der
Vitrifikation in einem Medium aus 25% Glyzerin und 25% Ethylenglycol deutlich
besser als bei der Vitrifikation mit 10% Glyzerin und 40% Ethylenglykol (Tab. 2,
DONNAY et al. 1998).
Tabelle 2: Vergleich der Einfrierverfahren und Einfriermedien hinsichtlich Überlebens- (ÜR) und
Trächtigkeitsraten (TR, EG = Ethylenglycol, n.u. = nicht untersucht)
Autor
VAN-WAGTENDONK-DE
LEEUW et al. (1995)
VAN-WAGTENDONK-DE
LEEUW et al. (1997)
DONNAY et al. (1998)
Methode
Medien
Vitrifikation
6,5 M Glyzerin
44%
43%
Vitrifikation
25% Glyzerin
25% EG
51%
24%
Vitrifikation
6,5 M Glyzerin
n.u.
44,5%
n.u.
45,1%
67%
n.u.
5%
n.u.
Konventionelle
1,5 M Glyzerin
Kryokonservierung
25% Glyzerin
Vitrifikation
25% EG
10% Glyzerin
Vitrifikation
40% EG
21
ÜR (%) TR (%)
Literatur
2.4.1.2. Ethylenglycol
Ethylenglycol (EG; Abb. 4) oder auch Ethan-1,2-diol hat im Vergleich zu den anderen
aufgeführten penetrierenden Kryoprotektiva ein sehr geringes Molekulargewicht und
kann daher schneller durch die Zellmembran diffundieren. Es gilt auch in hohen
Konzentrationen und bei direkter Äquilibrierung im konzentrierten Medium als ein
Kryoprotektivum mit geringer Toxizität (MAMOUDZADEH et al. 1993).
Abbildung 4: Strukturformel Ethylenglycol
Seine kryoprotektive Wirkung wurde zuerst durch MIYAMOTO und ISHIBASHI
(1977) bei der konventionellen Kryokonservierung von Mäuse- und Rattenembryonen
untersucht. Sie benutzten EG als alleiniges Kryoprotektivum in relativ niedrigen
Konzentrationen von 1,2 M zur Kryokonservierung von Mäuseembryonen im
8-Zell-Stadium und erreichten damit nach dem Auftauen und der weiteren Kultur
Blastozystenraten von 76-85% (MIYAMOTO u. ISHIBASHI 1977). Beim Rind wurden
Konzentrationen von 1,5 M EG ebenfalls als sehr effektiv getestet. VOELKEL und
HU verglichen 1992 die Wirkung von 1,5 M EG, Dimethylsulfoxid (DMSO), Glyzerin
und Propylenglycol (PG) bei der konventionellen Kryokonservierung boviner
Embryonen. Hier zeigt sich deutlich, dass durch EG die besten Überlebensraten
erzielt werden konnten (Tab 3;VOELKEL u. HU 1992).
22
Literatur
Tabelle 3: Entwicklungsraten boviner Embryonen nach konventionellem Kryokonservieren mit
verschiedenen Kryoprotektiva (VOELKEL u. HU 1992)
Kryoprotektivum Konzentration Entwicklungsraten
Ethylenglykol
1,5 M
70%
Glyzerin
1,5 M
30%
Propylenglykol
1,5 M
11%
Dimethylsulfoxid
1,5 M
25%
KASAI et al. zeigten 1990 durch Toxizitätstest mit verschiedenen Kryoprotektiva,
dass EG auch in hohen Konzentrationen als alleiniges Kryoprotektivum eingesetzt
werden kann. Dabei wurden beim Einsatz von 30% und 40% EG gute
Blastozystenraten ermittelt. Wie in Tabelle 4 ersichtlich, konnten auch beim Einsatz
von 30% Glyzerin gute Raten erzielt werden, die Raten bei der Verwendung von PG
waren im Vergleich dazu schlecht (Tab. 4; KASAI et al. 1990).
Tabelle 4: Blastozystenraten nach Vitrifikation von Mäusemorulae in Medien mit verschiedenen
Konzentrationen an Kryoprotektiva (n.u. = nicht untersucht)
Konzentration
30%
Kryoprotektivum
40%
50%
Blastozystenrate (%)
Ethylenglykol
98%
84%
0%
Glyzerin
88%
3%
n.u.
Propylenglykol
16%
0%
n.u.
Auch SOMMERFELD und NIEMANN konnten 1999 zeigen, dass Ethylenglycol
erfolgreich in hohen Konzentrationen zur konventionellen Kryokonservierung und zur
Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen eingesetzt werden kann. So
zeigten sich bei der konventionellen Kryokonservierung die besten Schlupfraten bei
3,6 M EG (81%), bei der Vitrifikation konnten mit einer schrittweisen Äquilibrierung in
23
Literatur
3,6 M EG und 7,2 M EG Schlupfraten von 42% erreicht werden (SOMMERFELD u.
NIEMANN 1999). In vorherigen Toxizitätstest wurden sogar Schlupfraten von 93%
bei bovinen Blastozysten erreicht. Bei diesen Toxizitätstests wurden die Blastozysten
zwar nur dem Medium ausgesetzt und nicht vitrifiziert, es konnte allerdings deutlich
gezeigt werden, dass EG auch in hohen Konzentrationen nur gering zelltoxisch wirkt
(SOMMERFELD 1997). Gute Überlebensraten konnten nicht nur durch den
alleinigen Einsatz von EG bei der Vitrifikation, sondern auch in Verbindung mit
anderen, nicht-penetrierenden Kryoprotektiva erreicht werden. Dies wurde zuerst
durch KASAI et al. 1990 gezeigt, welche bei der Vitrifikation von Mäusemorulae
durch 40% EG in Verbindung mit Ficoll und Saccharose Entwicklungsraten zur
Blastozyste von 97-98% dokumentierten (KASAI et al. 1990). TACHIKAWA et al.
benutzten 1993 die Kombination verschiedener penetrierender Kryoprotektiva mit
Ficoll und Saccharose auch zur Vitrifikation boviner Blastozysten. Dabei zeigten sich
ähnliche Ergebnisse wie bei den Mäuseembryonen, wobei EG und Glyzerin in dieser
Kombination am besten geeignet waren und die Entwicklungsraten bei PG am
schlechtesten ausfielen (TACHIKAWA et al. 1993; Tab. 8). Die Kombination aus EG,
Ficoll und Saccharose (EFS) schien demnach auch für die Vitrifikation boviner
Blastozysten sehr gut geeignet zu sein, was durch mehrere Autoren bestätigt werden
konnte. MAMOUDZADEH et al. zeigten 1995, dass die Entwicklungraten durch eine
schrittweise Äquilibrierung noch gesteigert werden konnten. Sie benutzten für den
ersten Äquilibrierungsschritt 20% EFS, für den zweiten Schritt 40% EFS und
erreichten damit bei der Vitrifikation von expandierten Blastozysten Schlupfraten von
89% nach dem Auftauen (MAMOUDZADEH et al. 1995). MARTINEZ et al. verglichen
1998 den Einsatz einer zweischrittigen EFS-Methode (2EFS) mit einer dreischrittigen
(3EFS) und einer Kombination aus EG und Glyzerin. Dabei ergaben sich bei der
dreischrittigen Methode bessere Schlupfraten als bei der zweischrittigen (Tab. 5),
allerdings waren die Entwicklungsraten bei der Kombination von EG mit Glyzerin
ebenfalls gut und es wurden sogar höhere Trächtigkeitsraten als bei der
EFS-Methode erzielt.
24
Literatur
Tabelle 5: Schlupf- und Trächtigkeitsraten boviner in vitro produzierter Embryonen bei verschiedenen
Einfriermethoden (MARTINEZ et al. 1998)
Kryoprotektiva Schlupfraten Trächtigkeitsraten
2EFS
35,7%
Nicht getestet
3EFS
57,7%
35,2%
EG + Glyzerin
59,6%
43,7%
Neben dem Einsatz von EG in Verbindung mit Ficoll und Saccharose gab es noch
andere Versuche, EG mit verschiedenen nicht-penetrierenden Kryoprotektiva zu
kombinieren. SAHA et al. (1996) benutzten beispielsweise erfolgreich eine
Kombination aus EG mit Trehalose und PVP und erreichten damit bessere
Schlupfraten als bei alleinigem Einsatz von EG oder einer Kombination aus EG mit
Trehalose (Tabelle 6).
Tabelle 6: Schlupfraten in vitro produzierter boviner Embryonen bei der Verwendung verschiedener
Kryoprotektiva (SAHA et al. 1996, EG = Ethylenglycol, PVP = Polyvinylpyrrolidon)
Kryoprotektiva
Schlupfraten
40% EG
19,6%
40% EG + 11,3% Trehalose
42,5%
40% EG + 11,3% Trehalose + 20% PVP
68,2%
Eine Vitrifikation mit EG scheint demnach in der Kombination mit anderen
penetrierenden und nicht-penetrierenden Kryoprotektiva am effektivsten zu sein.
2.4.1.3. Dimethylsulfoxid
Dimethylsulfoxid (Abb. 5) ist eine farblose Substanz mit analgetischen und
antiphlogistischen Eigenschaften, die sehr schnell durch die Haut und durch
25
Literatur
Zellmembranen diffundieren kann und wird daher in der Medizin häufig allein oder als
Trägersubstanz bei dermalen Applikationen genutzt.
Abbildung 5: Strukturformel Dimethylsulfoxid
Als Kryoprotektivum wurde DMSO zum ersten Mal bei humanen und bovinen
Erythrozyten sowie bei Bullensperma eingesetzt (LOVELOCK u. BISHOP 1959).
Dabei
ergab
sich
im
Vergleich
zu
Glyzerin
eine
wesentlich
schnellere
Permeabilitätszeit. Das Medium mit DMSO konnte seine kryoprotektive Wirkung auf
bovine Erythrozyten bereits nach 30 Sekunden entfalten, wogegen Glyzerin in diesen
Versuchen keine ausreichend kryoprotektive Wirkung zeigte (LOVELOCK u. BISHOP
1959). Eine schnelle und vollständige Penetration ist laut MERYMAN entscheidend
für die erfolgreiche Schutzwirkung von DMSO bei der Kryokonservierung
(MERYMAN 1971, MERYMAN et al. 1977). Trotz seiner exzellenten kryoprotektiven
Eigenschaften zeigt sich, dass DMSO, wenn es in hohen Konzentrationen und bei
einer langen Äquilibrierungszeit eingesetzt wird, zytotoxisch wirken kann. MALININ
konnte verschiedene Zellschäden an Nierenzellen, welche für zehn Minuten einer
7,5%igen DMSO-Lösung ausgesetzt waren, nachweisen (MALININ 1973). Bei
Mäuseoozyten verursachte die Äquilibrierung in DMSO Veränderungen in der
Mikrofilamentstruktur und gesteigerte Chromosomendegenerationen (VINCENT et al.
1990, BOUQUET et al. 1995). Trotz der toxischen Eigenschaften wird DMSO häufig
in Verbindung mit anderen Kryoprotektiva zur Kryokonservierung von Embryonen
verwendet.
Zur konventionellen Kryokonservierung von bovinen Embryonen wurde DMSO
bereits 1978 eingesetzt. WILLADSEN et al. verwendeten in ihren Versuchen eine
schrittweise Äquilibrierung in 0,5 M, 1 M und 1,5 M DMSO-Lösung und erreichten
26
Literatur
damit Trächtigkeitsraten von bis zu 67% (WILLADSEN et al. 1978). Die
Konzentration von 1,5 M DMSO lieferte für die konventionelle Kryokonservierung
sehr gute Ergebnisse. Auch TROUNSON et al. benutzten eine solche Konzentration
zur Konservierung boviner Blastozysten und erreichten Entwicklungsraten von
50-56% und Trächtigkeitsraten von 39-45% (TROUNSON et al. 1978). BILTON
verglich den Einsatz einer 1,5 M DMSO-Lösung mit einer 1 M Glyzerin-Lösung zur
konventionellen Kryokonservierung boviner Blastozysten und konnte dabei keine
signifikanten Unterschiede in den Entwicklungs- und Trächtigkeitsraten erkennen
(BILTON 1980).
Zur Vitrifikation von Embryonen ist DMSO aufgrund seiner ausgeprägten Fähigkeit
zur Bildung eines glasähnlichen Zustandes sehr gut geeignet (FRIEDLER et al.
1988, VALDEZ et al. 1992). Meist kommt es dabei in Verbindung mit anderen
Kryoprotektiva zum Einsatz. Seine guten kryoprotektiven Eigenschaften wurden
schon bei der ersten erfolgreichen Vitrifikation von Mäuseembryonen in Verbindung
mit EG und Glycerin genutzt (RALL u. FAHY 1985). ISHIMORI et al. verwendeten
1993 ebenfalls eine Kombination aus DMSO und EG, dabei wurde eine zweistufige
Äquilibrierung, zunächst in 12,5% DMSO mit 12,5% EG und danach in 25% DMSO
mit 25% EG, benutzt. Da beide Kryoprotektiva eine sehr schnelle Penetrationszeit
aufweisen, benötigen sie relativ kurze Äquilibrierungszeiten, um ihre protektive
Wirkung zu entfalten. ISHIMORI et al. (1993) verglichen in diesem Zusammenhang
Zeitspannen im ersten Medium von ein, zwei und fünf Minuten und konnten
nachweisen, dass die Entwicklungsraten bei kurzen Äquilibrierungszeiten signifikant
höher ausfielen (Tab. 7).
Tabelle 7: Ergebnisse der Entwicklungsraten boviner Blastozysten bei verschiedenen
Äquilibrierungszeiten im 1. Medium (12,5% DMSO + 12,5% EG) und 30 s im 2. Medium (25% DMSO
+ 25% EG; ISHIMORI et al. 1993)
Zeit im 1. Medium Zeit im 2. Medium Entwicklungsraten
Versuch 1
1 min
30 s
85%
Versuch 2
2 min
30 s
73%
Versuch 3
5 min
30 s
20%
27
Literatur
VIEIRA et al. verwendeten 2007 ebenfalls die Kombination aus DMSO und EG und
verglichen dieses Vitrifikationsmedium mit einem Medium aus EG, Saccharose und
PVA. Bei beiden Verfahren konnten vergleichbar gute Reexpansionsraten nach dem
Auftauen von 94,8% für die Methode mit DMSO und 84,5% für die Methode ohne
DMSO erreicht werden, die Schlupfraten waren bei der Methode mit DMSO jedoch
signifikant besser (75,8% im
Vergleich
zu
55,2%). Die Trächtigkeitsraten
unterschieden sich in diesen Versuchen nicht (VIEIRA et al. 2007).
Trotz solch guter Ergebnisse wird der Einsatz von DMSO als Kryoprotektivum zur
Vitrifikation immer wieder kontrovers diskutiert. Aufgrund der toxischen Wirkung
kommt DMSO bei der Vitrifikation fast ausschließlich als Gemisch mit anderen
Kryoprotektiva zum Einsatz. Außerdem wurden für die Vitrifikation DMSO-freie
Medien entwickelt, um auf den Einsatz von DMSO als Kryoprotektivum verzichten zu
können. STACHECKI et al. entwickelten eine einfache Vitrifikationsmethode unter
Verwendung von Glyzerin und EG und erreichten Überlebensraten von 96,1% bei
bovinen expandierten und bovinen geschlüpften Blastozysten. Einen direkten
Vergleich mit einem DMSO-haltigen Medium gab es allerdings nicht (STACHECKI et
al. 2008). Vergleiche zwischen Vitrifikationsmedien mit und ohne DMSO, wie sie
beispielsweise durch VIEIRA et al. bei bovinen Blastozysten durchgeführt wurden,
sind auch im Bereich der humanen Reproduktionsmedizin zu finden. So verglichen
ISACHENKO et al. (2005) Maturationsraten humaner Oozyten, welche zuvor durch
DMSO in Kombination mit EG oder nur durch EG vitrifiziert wurden und erreichten
bei der Vitrifikation mit DMSO signifikant höhere Reifungsraten. KARTBERG et al.
benutzten 2008 ein Vitrifikationsmedium mit DMSO, PG und EG im Vergleich zur
Vitrifikation in PG und EG bei humanen Embryonen sowie Mäuseembryonen und
konnten keine Unterschiede in den Entwicklungsraten feststellen (KARTBERG et al.
2008).
28
Literatur
2.4.1.4. Propylenglycol
Propylenglycol (PG, Abb. 6) oder auch 1,2-Propandiol ist wie EG ein zweiwertiger
Alkohol, der, wie
alle penetrierenden Kryoprotektiva, stark hygroskopische
Eigenschaften aufweist.
Abbildung 6: Strukturformel Propylenglycol
Die Toxizität von PG gilt im Vergleich zu EG als gering, die Fähigkeit, einen
glasähnlichen Zustand zu bilden, ist bei PG allerdings noch höher als bei DMSO oder
Glyzerin (RENARD u. BABINET 1984). BOUTRON u. KAUFMANN untersuchten
1979 die Stabilität wässriger Lösungen verschiedener Kryoprotektiva, wenn sie bei
niedrigen Temperaturen in eine komplett amorphe Phase übergehen. Dabei zeigte
sich, dass die PG-Lösung im Gegensatz zu DMSO- und EG-Lösungen eine
wesentlich größere Stabilität aufwies. Es wurde vermutet, dass ein Zusammenhang
zwischen der Stabilität und den kryoprotektiven Eigenschaften der Substanzen
besteht, so dass PG demnach eine gute Schutzwirkung aufweisen müsste. Die
Versuche wurden allerdings mit rein wässrigen Lösungen durchgeführt, welche nicht,
wie zum Beispiel die heutzutage benutzten Vitrifikationslösungen, Proteinzusätze wie
BSA oder FCS aufwiesen (BOUTRON u. KAUFMANN 1979).
Zur konventionellen Kryokonservierung von Mäuseembryonen scheint PG als
alleiniges Kryoprotektivum gut geeignet zu sein. So erreichten RENARD u. BABINET
(1984) bei einer Verwendung von 1,5 M PG Blastozystenraten von 88,1. Auch beim
Rind konnten gute Ergebnisse bei der konventionellen Kryokonservierung von
Blastozysten erzielt werden. Bei der Verwendung von 1,6 M PG-Lösung wurden
Überlebensraten von 72-89% und Trächtigkeitsraten von bis zu 61% erreicht
29
Literatur
(SUZUKI et al. 1990). Andere Autoren hingegen erzielten weit schlechtere
Ergebnisse bei bovinen Embryonen. VOELKEL u. HU verglichen 1992 1,5 M
Lösungen verschiedener Kryoprotektiva bei der konventionellen Kryokonservierung
von
bovinen
Blastozysten
und
erreichten
bei
der
Verwendung
von
PG
Entwicklungsraten von nur 11% (Tab. 3; VOELKEL u. HU 1992). DOCHI et al.
ermittelten
1998
Trächtigkeitsraten
nach
dem
Direkttransfer
konventionell
kryokonservierter, in vivo generierter boviner Morulae und Blastozysten. Sie
verglichen zwei verschiedene Einfriermethoden unter Verwendung von 1,6 M PG
oder 1,8 M EG und zeigten ebenfalls, dass die Trächtigkeitsraten unter Nutzung von
PG niedriger waren. Sie lagen bei 36% im Vergleich zu 44,7% bei der Verwendung
von EG (DOCHI et al. 1998).
Trotz der guten glasbildenden Eigenschaften und der Tatsache, dass die Stabilität
von PG-Lösungen im amorphen Zustand sehr gut ist (BOUTRON u. KAUFMANN
1979), wurden bei der Verwendung von PG in Vitrifikationslösungen sowohl für die
Maus als auch für das Rind eher schlechte Überlebensraten ermittelt. KASAI verglich
1990
den
Einsatz
30-50%iger
Lösungen
verschiedener
penetrierender
Kryoprotektiva bei der Vitrifikation von Maus-Morulae. Wie in Tab. 4 ersichtlich,
konnten bei der Verwendung von 30%iger PG-Lösung Blastozystenraten von nur
16% erreicht werden. Beim Einsatz einer 40%igen PG-Lösung wurden keine
überlebenden Blastozysten mehr ermittelt, was dazu führte, dass die Verwendung
einer 50%igen PG-Lösung nicht mehr untersucht wurde (KASAI et al 1990). Bei
bovinen Blastozysten ermittelten TACHIKAWA et al. ebenfalls wesentlich schlechtere
Entwicklungsraten bei der Verwendung von PG im Vergleich zu EG und Glyzerin. Sie
benutzten ein Gemisch aus 40 % des jeweiligen penetrierenden Kryoprotektivums in
Kombination mit 30% Ficoll und 0,5 M Saccharose und bewerteten die
Reexpansions- und Schlupfraten nach dem Auftauen. Des Weiteren wurden in
diesem Versuch Äquilibrierungszeiten von zwei, fünf und zehn Minuten verglichen,
die Ergebnisse sind in Tab. 8 dargestellt (TACHKAWA et al. 1993).
30
Literatur
Tabelle 8: Reexpansions- (ReexR) und Schlupfraten (SR) boviner Blastozysten nach Vitrifikation
durch verschiedene penetrierende Kryoprotektiva (EG, Glyzerin und PG) in Kombination mit Ficoll und
Saccharose (TACHIKAWA et al. 1993)
Äquilibrierungszeiten
2 min.
5 min.
10 min.
Kryoprotektiva
ReexR
SR
ReexR
SR
ReexR
SR
EG + Ficoll + Saccharose
90%
73%
14%
4%
0%
0%
Glyzerin + Ficoll + Saccharose
94%
81%
68%
52%
37%
17%
PG + Ficoll + Saccharose
31%
24%
0%
0%
0%
0%
Es zeigt sich, dass, auch in Kombination mit nicht-penetrierenden Kryoprotektiva, PG
als Schutzmittel für die Vitrifikation boviner Blastozysten eher ungeeignet zu sein
scheint.
2.4.2. Nicht-penetrierende Kryoprotektiva
Nicht-penetrierende Kryoprotektiva zeichnen sich dadurch aus, dass sie ihre
protektive
Wirkung
Molekulargröße
die
im
Extrazellularraum
Zellmembran
nicht
entfalten,
frei
da
überwinden
sie
aufgrund
können.
Für
ihrer
die
Kryokonservierung lebender Zellen werden unter anderem Zucker und verschiedene
Makromoleküle wie PVP, PVA oder Ficoll verwendet. Sie können ihre Schutzwirkung
schon in geringen Konzentrationen erreichen und gelten damit als weniger toxisch
als penetrierende Kryoprotektiva (NIEMANN 1991). Ihre Wirkung beruht auf einer
Erhöhung der extrazellulären Osmolarität, wodurch die Zellen eine geringere
Zeitspanne
benötigen,
um
den
für
den
Einfriervorgang
erforderlichen
Dehydrierungsgrad zu erreichen. Dies hat den positiven Effekt, dass die Zellen den
toxischen Medien weniger lange ausgesetzt sein müssen (LIEBERMANN u.
TUCKER 2002). Nicht-penetrierende Kryoprotektiva werden daher in der Regel bei
hohen Einfrierraten eingesetzt, um eine schnelle Dehydrierung zu erreichen
(MERYMAN 1971). Des Weiteren kommen sie in der Auftauphase zum Einsatz. Hier
verhindern sie ein zu schnelles Anschwellen durch die Diffusion von Wasser in die
31
Literatur
Zelle und ermöglichen eine gute Ausschleusung der penetrierenden Kryoprotektiva
aus den Zellen (NIEMANN 1991).
2.4.2.1. Zucker
Bei den für die Kryokonservierung verwendeten Zucker handelt es sich hauptsächlich
um Disaccharide wie Saccharose und Trehalose (Abb. 7), welche mit einem
Molekulargewicht von >340 g/mol Zellmembranen nicht überwinden können. Sie
werden am häufigsten in Auftaumedien verwendet.
Abbildung 7: Strukturformeln von Saccharose (links) und Trehalose (rechts)
Werden Zellen aufgetaut, enthalten sie meist sehr hohe Konzentrationen
penetrierender Kryoprotektiva, welche schnell aus der Zelle entfernt werden müssen,
da sie durch die steigenden Temperaturen an Toxizität gewinnen (NIEMANN 1991).
Bei
der
Verwendung
einer
isotonen
PBS-Lösung
kommt
es
durch
die
Hyperosmolarität des Intrazellularraumes zu einem schnellen Einstrom von Wasser,
da Wasser einfacher in die Zelle penetrieren kann als die Kryoprotektiva heraus
kommen. Um ein extremes Anschwellen der Zellen zu verhindern, werden dem
Auftaumedium Zucker hinzugefügt, welche als osmotischer Puffer dienen und
dadurch die Überlebensraten der Zellen steigern können (NIEMANN 1991,
MCWILLIAMS et al. 1995). Bei der konventionellen Kryokonservierung werden
solche Auftaumedien häufig direkt beim Einfrieren in den Straw mit aufgezogen.
Dadurch können die Medien beim Auftauen schon im Straw vermischt und die
32
Literatur
Kryoprotektiva schneller ausverdünnt werden. Dies wird als „in-straw-dilution“
bezeichnet. Sie ermöglicht ein sogenanntes „One-step-Verfahren“, durch das die
Embryonen direkt auf Emfängertiere übertragen werden können, und macht eine
Ausverdünnung des Mediums unter dem Mikroskop im Labor unnötig. Der Einsatz
von Zuckern bei der konventionellen Kryokonservierung beschränkt sich jedoch nicht
nur auf die Auftaumedien. SUZUKI et al. zeigten 1990, dass der Zusatz von
Saccharose zu einem Einfriermedium mit Glyzerin in Konzentrationen von 0,4 M und
0,8 M im Vergleich zu einer Konzentration von 0,2 M oder einem Medium ohne
Saccharosezusatz die Überlebensraten boviner Blastozysten steigern konnte. In
Verbindung mit PG trat diese Wirkung nicht auf, hier waren die Überlebensraten
ohne Saccharosezusatz genauso hoch wie mit Saccharosezusatz. Ein Überblick
über die Überlebensraten ist in Tab. 9 aufgeführt (SUZUKI et al. 1990).
Tabelle 9: Überlebensraten in vitro produzierter boviner Embryonen nach konventioneller
Kryokonservierung in Glyzerin oder Propylenglycol mit Saccharosezusätzen verschiedener
Konzentrationen (SUZUKI et al. 1990, M = Molar)
Saccharosezusatz (M)
Kryoprotektiva
0M
0,2 M 0,4 M 0,8 M
Glyzerin
0%
21%
82%
88%
Propylenglycol 88%
89%
84%
72%
LIM et al. zeigten 2008 ebenfalls, dass der Zusatz von 0,1 M Saccharose zu einem
Einfriermedium mit 1,5 M EG im Vergleich zu 0,1 M Xylose oder dem Einfrieren ohne
Zucker zu besseren Entwicklungsraten nach konventioneller Kryokonservierung
führt. (LIM et al. 2008).
Bei der Vitrifikation werden Zucker ebenfalls sowohl dem Einfrier- als auch dem
Auftaumedium zugesetzt, wobei die Ergebnisse sehr unterschiedlich ausfallen. So
zeigten DOBRINSKY et al. (1992) nach Versuchen mit drei unterschiedlichen
Saccharosekonzentrationen im Auftaumedium (1 M, 0,3 M und 0,1 M) eine
Verbesserung der Überlebensraten boviner Embryonen bei einer Konzentration von
33
Literatur
0,3 M Saccharose. MAHMOUDZADEH et al. (1995) jedoch konnten keine
Veränderungen bei den Reexpansions- und Schlupfraten durch den Einsatz von
0,25 M oder 0,5 M Saccharose im Auftaumedium erkennen. Auch VAJTA et al.
(1999) ermittelten beim Zusatz von Saccharose sowohl zum Auftau- als auch zum
Vitrifikationsmedium
keine
Unterschiede
in
den
Überlebensraten
boviner
Blastozysten nach der Vitrifikation. Dagegen konnten verschiedene andere Autoren
zeigen, dass ein Zuckerzusatz zum Vitrifikationsmedium einen positiven Effekt auf
die
Überlebensraten
zu
haben
scheint.
So
wurden
beispielsweise
Vitrifikationsmedien, die Glyzerin und Ethylenglycol und einen Zusatz von 0,75 M
Saccharose oder 0,375 M Saccharose und 0,375 M Dextrose enthielten, verglichen.
Dabei führte der Zusatz der Kombination aus Saccharose und Dextrose zu signifikant
höheren Überlebensraten (SAITO et al. 1994). SAHA et al. (1996) konnten zeigen,
dass der Einsatz von 11,3% Trehalose in Kombination mit 20% PVP zum
Vitrifikationsmedium
ebenfalls
zu
Schlupfraten
als
Vitrifikation
führte
die
signifikant
höheren
ohne
Zusatz
Reexpansions-
und
nicht-penetrierender
Kryoprotektiva.
2.4.2.2. Makromoleküle
Makromoleküle, wie beispielsweise PVP, PVA (Abb. 8) oder Ficoll, haben ebenso
wie Zucker den Effekt, die Osmolarität im Extrazellularraum zu erhöhen. Sie werden
am häufigsten in Verbindung mit penetrierenden Kryoprotektiva eingesetzt, um deren
Konzentration im Einfriermedium senken zu können.
Abbildung 8: Strukturformeln von Polyvinylpyrrolidon (PVP, links) und Polyvinylalkohol (PVA, rechts)
34
Literatur
Schon MERYMAN berichtete 1971 über einen positiven Effekt des Zusatzes von
PVP zu Einfriermedien. Durch den Einsatz des Makromoleküls konnte die Toleranz
gegenüber höheren Kühlraten gesteigert und somit die Überlebensrate von
Erythrozyten nach dem Auftauen verbessert werden. Dabei reichten schon kleinste
Mengen von 3 mM PVA aus (MERYMAN 1971).
Ein wichtiger Grund, warum Makromoleküle bei der Kryokonservierung von
Embryonen den Einfriermedien zugesetzt werden, ist das Problem einer möglichen
Infektionsgefahr bei dem Einsatz von Seren wie FCS oder semidefinierten Zusätzen
wie BSA. Es wurde versucht, diese Proteine durch PVA, Ficoll oder PVP zu ersetzten
und somit beispielsweise eine virale Kontamination zu vermeiden (GUTIERREZ et al.
1993) Des Weiteren gab es das Bestreben, die verwendeten Medien zu
standardisieren, um Versuche verschiedener Laboratorien vergleichbarer zu machen
(SOMMERFELD u. NIEMANN 1999). Der Zusatz von PVP oder PVA wurde
allerdings schon früh wegen deren starker zytotoxischer Wirkung kritisiert (WILMUT
u. ROWSON 1973). So konnte nachgewiesen werden, dass bei der Vitrifikation mit
Medien, denen PVA oder PVP als Ersatz für die Serumkomponente beigefügt wurde,
schlechtere Trächtigkeitsraten erreicht wurden. Des Weiteren wurde von einer
schlechteren Handhabung der so vitrifizierten Embryonen berichtet (SEIDEL et al.
1990). SOMMERFELD und NIEMANN (1999) ermittelten zusätzlich reduzierte
Schlupfraten nach konventioneller Kryokonservierung boviner Blastozysten mit PVA
statt bovinem Kälberserum (bovine calf serum, BCS) im Einfriermedium.
Der Zusatz von Ficoll zu Vitrifikationslösungen scheint im Gegensatz zu PVA und
PVP besser geeignet zu sein, so kann Ficoll zum Beispiel die Rekristallisation eines
Vitrifikationsmediums beim Auftauen erfolgreich verhindern (KASAI et al. 1990,
PALASZ et al. 1997). KASAI et al. (1990) entwickelten eine sehr effektive
Vitrifikationslösung durch den Einsatz von EG, Ficoll und Saccharose (EFS), dabei
konnten gute Entwicklungsraten bei Mäuseembryonen und später auch bei der
Vitrifikation von Rinderembryonen ermittelt werden(PALASZ et al. 1997). Auch
MARTINEZ
et
al.
Vitrifikationsmedien
erreichten
mit
EG
1998
eine
durch
den
Verbesserung
Blastozysten (MARTINEZ et al. 1998).
35
Zusatz
der
von
Ficoll
Schlupfraten
zum
boviner
Literatur
2.5. Vergleiche zwischen verschiedenen Trägersystemen zur Vitrifikation
Auch wenn viele Autoren gute Überlebensraten durch die Entwicklung neuer Medien
erzielen
konnten,
hängt
eine
erfolgreiche
Vitrifikation
nicht
nur
von
der
Zusammensetzung der Einfrier- und Auftaumedien ab. Laut ARAV et al. (2002) gibt
es
drei
Faktoren,
die
eine
Vitrifikation
beeinflussen.
Die
Viskosität
des
Einfriermediums, das Erreichen möglichst hoher und gleichbleibender Kühlraten und
die Reduzierung des Probenvolumens. Wird das Probenvolumen auf ein Minimum
reduziert, so können beim Einfrieren höhere Kühlraten entstehen, was zur Folge hat,
dass die Konzentration der Kryoprotektiva in den Medien gesenkt werden kann und
trotzdem eine erfolgreiche Vitrifikation möglich ist (ARAV et al. 2002). Das
Probenvolumen wird hauptsächlich durch das verwendete Trägersystem festgelegt.
Es gibt viele verschiedene Systeme, die im Laufe der Zeit entwickelt wurden.
Unterschieden wird zwischen offenen und geschlossenen Trägersystemen.
2.5.1. Offene Trägersysteme
Offene Trägersysteme ermöglichen den direkten Kontakt des Probenmaterials mit
flüssigem Stickstoff, wodurch sehr hohe Kühlraten erreicht werden. Durch solche
Einfriersysteme können nicht nur die Überlebensraten der Zellen verbessert, sondern
auch Schäden unter anderem an der Zona pellucida von Embryonen minimiert
werden (Siehe Kapitel 2.2 ,BIELANSKI et al. 2000). STEPONKUS et al. entwickelten
1990 ein System, bei dem Drosophila-Embryonen in kleinsten Volumina eines
Vitrifikationsmediums
auf
ein
Elektronenmikroskop-Kupferraster
(electrone
microscope grid, EMG) pipettiert und direkt in flüssigen Stickstoff überführt wurden
(Abb. 9, STEPONKUS et al. 1990). Neben den höheren Kühlraten bietet ein solches
System noch den Vorteil, dass mehrere Embryonen gleichzeitig eingefroren werden
können. MARTINO et al. (1996) nutzten diese Methode erfolgreich für die Vitrifikation
von
bovinen
Oozyten
und
erreichten
damit Teilungsraten
von
40% und
Entwicklungsraten zur Blastozyste von 15%. PARK et al. (1999) konnten mit
36
Literatur
derselben Methode sehr gute Reexpansions- und Schlupfraten von 87,8% und
67,8% bei der Vitrifikation boviner Blastozysten erreichen.
Blastozyste im
Vitrifikationsmedium
EMG
Abbildung 9: Schematische Darstellung des Elektronenmikroskop-Kupferrasters (EMG)
VAJTA et al. stellten 1998 eine neue Methode eines offenen Systems, den
sogenannten Open-Pulled-Straw (OPS) vor. Es handelt sich dabei um einen
einfachen 0,25 ml Straw, der manuell erhitzt und in die Länge gezogen wird, so dass
sich der innere Durchmesser auf 0,8 mm verkleinert. Die zu vitrifizierenden
Embryonen befinden sich im Vitrifikationsmedium und werden beim Eintauchen des
OPS in das Medium durch kapilläre Kräfte in den Straw gezogen (Abb. 10 a). Die
Menge an Flüssigkeit im Straw beträgt ca. 1-2 µl. Der Straw wird direkt in flüssigen
Stickstoff überführt (Abb. 10 b), so können sehr hohe Kühlraten von bis zu
20.000°C/min erreicht werden. Beim Auftauen wird die Spitze des Straws in das
Verdünnungsmedium gehalten, wodurch die Embryonen innerhalb sehr kurzer Zeit
auftauen und direkt in das Ausdünnungsmedium gelangen (Abb. 10 c, VAJTA et al.
1998).
37
Literatur
OPS
a)
c)
N2
b)
Auftaumedium
Abbildung 10: OPS-Methode nach VAJTA et al. 1998
Eine weitere erfolgreiche Methode, welche das Prinzip des Einfrierens möglichst
kleiner Probenvolumina nutzt, ist das Cryoloop-Verfahren (LANE et al 1999a).
Benutzt wird dazu eine Nylonschlaufe mit einem Durchmesser von 0,5-0,7 mm, die
am Deckel eines Plastikröhrchens befestigt ist. Für die Vitrifikation wird die Schlaufe
in das Vitrifikationsmedium getaucht, so dass sich ein kleiner Mediumfilm bildet. Die
äquilibrierten Embryonen werden auf den Mediumfilm in der Schlaufe pipettiert und
direkt in ein Plastikröhrchen mit flüssigem Stickstoff verbracht (Abb. 11, LANE et al
1999b). Zum Auftauen wird die Nylonschlaufe kurz in das Auftaumedium gehalten,
damit sich die Embryonen aus der Schlaufe lösen.
Abbildung 11: Schematische Darstellung des Cryoloop nach LANE et al. 1999b
Mit dieser Methode erzielten LANE et al. (1999b) bei humanen- und murinen
Blastozysten sehr gute Reexpansions- und Schlupfraten (Tab. 10).
38
Literatur
Tabelle 10: Reexpansions- und Schlupfraten bei der Vitrifikation von Blastozysten mit dem
Cryoloop-Verfahren (LANE et al. 1999b)
Humane Blastozysten Murine Blastozysten
Reexpansionsrate
83,3%
100%
Schlupfrate
73,3%
95,5%
Eine ähnliches Verfahren, die Cryotop-Methode, bei der die Embryonen auf einen
dünnen Polypropylen-Streifen pipettiert werden, wurde erfolgreich 1999 durch
HAMAWAKI et al. für bovine Blastozysten und 2005 durch KUWAYAMA et al. für
humane Oozyten angewendet (HAMAWAKI et al 1999, KUWAYAMA et al. 2005a).
Auch das sogenannte Hemi-Straw-Verfahren beruht auf der Erhöhung der Kühlraten
durch das Einfrieren möglichst kleiner Probenvolumina. Bei diesem Verfahren wird
der zu vitrifizierende Embryo auf die Spitze der Vertiefung eines Hemi-Straws
pipettiert. Die Volumengröße beträgt dabei ca. 0,3 µl. Nach dem Überführen des
Hemi-Straws in flüssigen Stickstoff wird dieser in einen weiteren Straw geschoben
(VANDERZWALMEN et al. 2003). Ein ähnliches Verfahren wurde auch durch
STINSHOFF et al. (2011) angewandt. Sie benutzten einen sogenannten Vitriplug,
einen Plastikstab mit einer kleinen, schaufelähnlichen Spitze, auf welche die
Embryonen in möglichst wenig Medium pipettiert und direkt in flüssigen Stickstoff
überführt wurden. Bei bovinen Blastozysten konnten dabei Reexpansions- und
Schlupfraten von 81,1% und 63,2% erzielt werden (STINSHOFF et al. 2011).
Die große Gefahr eines offenen Trägersystems ist das von direktem Stickstoffkontakt
ausgehende Kontaminationsrisiko. So konnten zum Beispiel im Bereich der
Humanmedizin Kontaminationen von Stickstoffcontainern mit Hepatitis B-Viren
nachgewiesen
werden
(TEDDER
et
al
1995).
Im
Bereich
der
bovinen
Reproduktionsmedizin konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass Viren, wie
beispielsweise das bovine Virus Diarrhoe Virus (BVDV) und das bovine Herpesvirus
Typ-1 (BHV-1) als Krankheitserreger der infektiösen bovinen Rhinotracheitis (IBR),
den Einfrierprozess in flüssigem Stickstoff überleben (BIELANSKI 1997, BIELANSKI
et al. 1999). Auch bakterielle und sogar Pilzinfektionen sind im flüssigen Stickstoff
39
Literatur
möglich, so können unter anderem Aspergillus spp. und Staphylokokken bei
Temperaturen von -196°C im flüssigen Stickstoff überleben (BIELANSKI et al. 2003,
FOUNTAIN et al. 1997).
2.5.2. Geschlossene Trägersysteme
Aufgrund der Problematik der Kontaminationsgefahr bei der Verwendung offener
Trägersysteme sieht die IETS vor, dass Embryonen für den nationalen und
internationalen Versand in geschlossenen Trägersystemen einzufrieren sind. Besteht
allerdings kein Kontakt zum flüssigen Stickstoff, können beim Einfrieren nicht so
hohe Kühlraten erzielt werden. In Tab. 11 sind die ermittelten Kühlraten
verschiedener Autoren bei offenen und geschlossenen Trägersystemen aufgeführt.
Tabelle 11: Vergleich der Kühlraten verschiedener Vitrifikationssysteme
Autor
VAJTA et al. (1998)
Vitrifikationsmethode Ermittelte Kühlraten
OPS
20.000°C/min.
0,25 ml Straw
<2.000°C/min.
0,25 ml Straw
4.460°C/min.
OPS
16.340°C/min.
Cryotop
22.800°C/min.
Cryotip
12.000°C/min.
Cryotop
23.000°C/min.
VitriSafe
<1.300°C/min.
KUWAYAMA et al. (2005a)
KUWAYAMA et al. (2005b)
VANDERZWALMEN et al. (2009)
Ursprünglich wurden Embryonen in herkömmlichen 0,25 ml Straws vitrifiziert. Dazu
wird der Embryo, ähnlich wie bei der konventionellen Kryokonservierung, mit dem
Vitrifikationsmedium in den Straw aufgezogen und der Straw, bevor er in den
flüssigen Stickstoff überführt wird, an beiden Enden hitzeversiegelt. Diese Methode
wird auch heute noch erfolgreich genutzt (STACHECKI et al. 2008). Darauf
40
Literatur
aufbauend wurde das sogenannte „One-step-Verfahren“ entwickelt, bei dem weitere
Flüssigkeitssäulen mit Auftaumedien in den Straw aufgezogen werden. Der Embryo
gelangt nach dem Auftauen durch Schütteln des Straws direkt in das Auftaumedium
und kann, ohne weitere Manipulation, unmittelbar auf Empfängertiere übertragen
werden (Abb. 12, VIEIRA et al. 2007, AKIYAMA et al. 2010). Ein solches Verfahren
ist gerade für die assistierte Reproduktionsmedizin bei Rindern von Bedeutung, da
der Transfer vitrifizierter Embryonen erleichtert werden kann und das Auftauen nicht
unter mikroskopischer Kontrolle stattfinden muss.
Auftaumedium
Hitzeversiegelung
Embryo
Luft
Vitrifikationsmedium
Abbildung 12: Schematische Darstellung eines One-Step-Verfahrens für die Vitrifikation von
Embryonen
Ein weiteres Verfahren, welches 2000 von KULESHOVA und SHAW entwickelt
wurde, ist das Straw-in-Straw-System, bei dem ein den Embryo enthaltender 0,25 ml
Straw in einen 0,5 ml Straw geschoben und hitzeversiegelt wird. Bei einem Vergleich
zwischen einem herkömmlichen 0,25 ml Straw und dem Straw-in-Straw-System
konnten
bei
Mäuseembryonen
keine
signifikanten
Unterschiede
in
den
Blastozystenraten ermittelt werden (KULESHOVA u. SHAW 2000). KUWAYAMA et
al. entwickelten 2005 ein weiteres Verfahren, das Cryotip-Verfahren, welches auf
dem Cryotop-Verfahren aufbaut. Es handelt sich dabei um einen Straw mit einem
sehr dünnen, ausgezogenen Ende, in dem der Embryo in maximal 1 µl
Vitrifikationsmedium aufgezogen wird. Dieses Straw-Ende wird hitzeversiegelt und
durch eine Metallhülle geschützt, bevor der Straw in den flüssigen Stickstoff überführt
wird. Bei der Vitrifikation humaner Embryonen konnten mit dieser Methode im
Vergleich zu dem herkömmlichen Cryotop-System genauso gute Überlebensraten
41
Literatur
erzielt werden (KUWAYAMA et al 2005b). Weitere Versuche mit humanen Oozyten
ergaben jedoch bei der Cryotip-Methode etwas schlechtere Raten (KUWAYAMA
2007). Ein weiteres, geschlossenes Verfahren wurde auf Basis des Hemi-Straws
entwickelt. Dazu wurde ein „Hemi-Straw-ähnliches“ Plastik-Schäufelchen, genannt
VitriSafe, verwendet. Auf die Spitze des VitriSafes wurde eine geringe Menge
Vitrifikationsmedium mit maximal zwei Embryonen pipettiert und dieser in einen
0,3 ml Straw geschoben und versiegelt. Das besondere an der Methode ist, dass
zwar die Kühlraten durch den 0,3 ml Straw auf maximal 1.300°C/min fallen, die
Auftauraten
durch
das
direkte
Eintauchen
der
VitriSafe-Spitze
in
das
Verdünnungsmedium jedoch mit >20.000°C/min sehr hoch sind. Die Gefahr einer
Rekristallisation des Mediums während des Auftauprozesses kann dadurch minimiert
werden. VANDERZWALMEN et al. (2009) erreichten mit dieser Methode bei
humanen in vitro produzierten Blastozysten Überlebensraten von 69% nach dem
Auftauen.
42
Literatur
2.6. Qualität vitrifizierter, boviner Embryonen nach dem Auftauen
Die Qualität vitrifizierter Embryonen nach dem Auftauen lässt sich durch zahlreiche
verschiedene Parameter messen. VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. erklärten
1997, dass neue Konservierungsmethoden für Embryonen in drei Versuchsphasen,
in denen diese Parameter untersucht werden, etabliert werden müssen.
In der ersten Versuchsphase wird zunächst die In-vitro-Überlebensfähigkeit beurteilt.
Dies
erfolgt
anhand
der
Beurteilung
morphologischer
Kriterien,
wie
der
Reexpansions- und Schlupfrate nach dem Auftauen und durch die Analyse von
Zellfärbungen zur Beurteilung der Gesamtzellzahl oder der Lebend-Tot-Zellratio. Des
Weiteren kann die Qualität auf molekularer Ebene untersucht werden. Dazu gehört
beispielsweise die Beurteilung der Ultrastruktur der Embryonen oder die Analyse
entwicklungsrelevanter Gentranskripte durch eine Reverse Transkriptase quantitative
PCR (RT-qPCR).
In der zweiten Phase einer Versuchsreihe wird die In-vivo-Überlebensfähigkeit
überprüft. Die Ermittlung von Trächtigkeitsraten und die Untersuchung der
geborenen Kälber gilt als das geeignetste Verfahren, um die Qualität von Embryonen
beurteilen zu können (Proof of Principle). Häufig sind solche Untersuchungen aber
aus zeitlichen und wirtschaftlichen Gründen nicht möglich.
In der dritten Versuchsphase folgt eine Studie, in der die Methode unter praxisnahen
Bedingungen getestet und bewertet wird (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al.
1997).
Die einfachste und am häufigsten eingesetzte Methode zur morphologischen
Qualitätsbeurteilung vitrifizierter Embryonen ist die Messung der Reexpansions- und
Schlupfraten nach dem Auftauen. Die Raten innerhalb verschiedener Versuchsreihen
zu vergleichen ist jedoch schwierig, da sie von vielen verschiedenen Parametern, wie
dem Kulturmedium, dem Alter und der Entwicklungsphase der vitrifizierten
Embryonen abhängig sind. In Tabelle 12 sind die Reexpansions- und Schlupfraten
verschiedener Versuche aufgelistet.
43
Literatur
Tabelle 12: Übersicht über Reexpansions- und Schlupfraten boviner Embryonen nach Vitrifikation
(*Schlupfrate bezogen auf die Anzahl reexpandierter Embryonen)
Autor
Medien
Reexpansionsrate Schlupfrate
EG
52,9%
19,6%
EG + Trehalose
75,0%
42,5%
EG + Trehalose +
PVP
84,1%
68,2%
EG
-
41,8-51,4%
Ohne Vitrifikation
-
89,9%
Glyzerin
44-83%
30-63%
EFS
77,0-88,2%
52,9-68,2%
ohne Vitrifikation
-
83,8%
MUCCI et al. (2006)
EG + DMSO
52,1%
43%
GÓMEZ et al. (2009)
EG + DMSO
16,2-50,4%
8,3-35,0%
SHIRAZY et al. (2009)
Glyzerin + EG
22,2-69,9%
17,1-61,1%*
STACHECKI et al. (2008)
Glyzerin + EG
93,6%
-
LEROY et al. (2010)
EG + DMSO
64,3%
35,7%
EG + DMSO
100%
95,5%
Glyzerin + EG
100%
97,3%
STINSHOFF et al. (2011)
EG + DMSO
81,1%
63,2%
SIQUEIRA-FILHO et al.
(2011)
EG + DMSO
79-90%
63-76%
SAHA et al. (1996)
SOMMERFELD u.
NIEMANN (1999)
NEDAMBALE et al.
(2004b)
PARK et al. (2006)
INABA et al. (2011)
Eine weitere morphologische Beurteilungsmöglichkeit ist die Ermittlung der
Gesamtzellzahl boviner Embryonen. Bei einem Vergleich zwischen in vivo
generierten Embryonen, welche bis Tag neun nach der Ovulation durch die Spülung
superovulierter
Spendertiere
gewonnen
wurden,
und
in
vitro
produzierten
Embryonen, konnte bei den in vivo generierten Embryonen eine signifikant höhere
44
Literatur
Gesamtzellzahl ab dem achten Tag nach der Ovulation ermittelt werden. In diesem
Entwicklungsstadium wurde eine mittlere Zellzahl von 305,7 ± 29,9 Zellen pro
Embryo bei den in vivo generierten Embryonen und 169,4 ± 20,0 Zellen pro Embryo
bei den in vitro produzierten gemessen (USHIJIMA et al. 2008). Der Vergleich der
Gesamtzellzahl und der Lebend-Tot-Zellratio wird auch zur Ermittlung der Qualität
vitrifizierter
boviner
Embryonen
verwendet.
Dazu
können
verschiedene
Zellfärbemethoden verwendet werden. STACHECKI et al. verwendeten 2008 für die
Färbung boviner Blastozysten nach dem Auftauen mit Propidiumiodid und Hoechst
33342 eine invasive Färbemethode, die den Tod der Embryonen zur Folge hat, und
ermittelten durch diese Methode die Anzahl lebender Zellen pro Embryo. Sie konnten
eine mittlere Überlebensrate von 93,6% der Zellen nach der Vitrifikation erreichen.
Auch MUCCI et al. (2006) verwendeten eine solche Färbemethode, dabei verglichen
sie die mittlere Gesamtzellzahl in vitro produzierter Embryonen aus verschiedenen
Kultursystemen und nach Vitrifikation im Blastozystenstadium. Die Gesamtzellzahl
der nicht vitrifizierten Blastozysten aus verschiedenen Kultursystemen schwankte
zwischen 124,7 ± 4,9 und 142,1 ± 4,7 Zellen. Die Gesamtzellzahl der vitrifizierten
Blastozysten war mit 96,6 ± 2,4 Zellen signifikant niedriger als die der nicht
kryokonservierten Embryonen. Auch die Verwendung von Ethidium homodimer und
Hoechst 33342 stellt eine invasive Lebend-Tot-Färbung dar. STINSHOFF et al.
ermittelten
mit
Hilfe
dieser
Lebend-Tot-Zellratio boviner
Methode
2011
Blastozysten,
die
konnten
Gesamtzellzahl
aber
keine
und
die
signifikanten
Unterschiede feststellen. In Tabelle 13 sind die Ergebnisse von Zellfärbemethoden
verschiedener Autoren vergleichend aufgeführt.
45
Literatur
Tabelle 13: Durchschnittliche Zellzahl boviner Blastozysten sowie Lebend-Tot-Zellratio nach
Lebend-Tot-Zellratio
ohne Vitrifikation
Zellzahl ohne
Vitrifikation
Lebend-Tot-Zellratio
nach Vitrifikation
Zellzahl
nach Vitrifikation
Vitrifikationsmedien
Autoren
Vitrifikation oder ohne Kryokonservierung (n.u. = nicht untersucht, - = keine Vitrifikation)
SOMMERFELD
EG
130,5 ± 2,9
21,0
n.u.
n.u.
u. NIEMANN (1999)
MUCCI
EG + DMSO
96,6 ± 2,4
n.u.
124,7-142,1
n.u.
et al. (2006)
GÓMEZ
EG + DMSO
127,2 ± 7,6
n.u.
162,5 ± 5,5
n.u.
et al. (2009)
SHIRAZY
Glyzerin + EG 55,8-101,6 3,0-6,6 93,4-128,3 22-22,5
et al. (2009)
LEROY
n.u.
n.u.
146,9 ± 34,2
n.u.
et al. (2010)
STINSHOFF
EG + DMSO 121,3 ± 21,2 15,3 130,2 ± 25,5
17,9
et al. (2011)
SUDANO
n.u.
n.u.
140,1 ± 2,9
n.u.
et al. (2012)
Die Übertragung von Embryonen auf Empfängertiere und die Ermittlung der
Trächtigkeitsraten sowie die Untersuchung der Kälber nach der Geburt ist eine
weitere Möglichkeit, die Qualität vitrifizierter Embryonen zu ermitteln. Beim Vergleich
von Trächtigkeitsraten zwischen verschiedenen Versuchsgruppen können starke
Unterschiede gefunden werden. AL-KATANANI et al. verglichen 2002 die
Trächtigkeitsraten nach Transfer von vitrifizierten bovinen Embryonen mit denen
nicht kryokonservierter IVP-Embryonen. Dabei war die Rate bei den vitrifizierten
Embryonen mit 6,5% signifikant niedriger als die der frisch übertragenen (19,0%). Bei
einer
großen,
praxisnahen
Versuchsreihe
wurden
1997
insgesamt
728
kryokonservierte bovine Embryonen auf Empfängertiere übertragen, von denen 393
in Glyzerin vitrifiziert und 335 konventionell kryokonserviert wurden. Dabei konnten
46
Literatur
Trächtigkeitsraten von 44,5% bei den vitrifizierten und von 45,1% bei den
konventionell
kryokonservierten
bovinen
Embryonen
ermittelt
werden
(VAN
WAGTENDONCK-DE LEEUW et al. 1997). INABA et al. entwickelten 2011 eine
Methode zum Direkttransfer vitrifizierter boviner Embryonen und erreichten damit
Trächtigkeitsraten von bis zu 40%. Die Trächtigkeitsraten dieser Versuche und
anderer Versuchsreihen sind vergleichend in Tabelle 14 zusammengefasst.
Tabelle 14: Trächtigkeitsraten kryokonservierter und nicht-kryokonservierter boviner in vitro
produzierter Embryonen unterschiedlicher Herkunft (d=Tag)
Autor
Methode (Medium)
ISHIMORI et al.
(1993)
SAHA et al.
(1996)
Vitrifikation (EG +
DMSO)
Vitrifikation (EG + PVP
+ Trehalose)
VAN
WAGTENDONCK
-DE LEEUW et
al. (1997)
Vitrifikation (Glyzerin)
MARTINEZ et al.
(1998)
AL-KATANANI et
al. (2002)
INABA et al.
(2011)
Konventionelle
Kryokonservierung
(Glyzerin)
Vitrifikation (EG +
Ficoll + Saccharose)
Vitrifikation (Glyzerin +
EG)
Herkunft der
Embryonen
Trächtigkeitsraten
(Zeitraum)
In vivo Produktion
39% (d60)
IVP
60% (lebende
Kälber)
In vivo Produktion
44,5% (d90)
In vivo Produktion
45,1% (d90)
IVP
IVP
41,1 (d30)
35,2 (d60)
43,7% (d30)
43,7% (d60)
42,8 (d30)
35,7 (d60)
Keine Vitrifikation
IVP
Vitrifikation (Glyzerin +
EG)
IVP
6,5 ± 4,1 (d45)
Keine Vitrifikation
IVP
19,0 ± 5,0 (d45)
Vitrifikation (EG +
DMSO)
IVP
Vitrifikation (Glyzerin +
EG)
IVP
Keine Vitrifikation
IVP
47
40% (d60-70)
36,7% (lebende
Kälber)
29,4% (d60-70)
29,4% (lebende
Kälber)
40% (d60-70)
30,9% (lebende
Kälber)
Literatur
2.7. Genexpression in präimplantatorischen bovinen Embryonen
Trotz vieler Verbesserungen im Bereich der Produktion boviner Embryonen sind in
vitro produzierte Embryonen immer noch den in vivo generierten unterlegen
(WRENZYCKI et al. 2001). Dieses wurde vielfach auf morphologischer und auch
molekularer Ebene untersucht. Im Vergleich mit in vivo generierten, bovinen
Embryonen zeigen in vitro produzierte deutliche Unterschiede, unter anderem
hinsichtlich ihrer Morphologie, Farbe, Dichte, Zellzahl, Entwicklungsrate oder
Einfrierbarkeit (GREVE et al. 1994). Auf molekulargenetischer Ebene konnte gezeigt
werden, dass die mRNA-Expression verschiedener entwicklungsrelevanter Gene bei
in vivo generierten und in vitro produzierten Embryonen deutliche Unterschiede
aufweist (WRENZYCKI et al. 2007). In Tabelle 15 ist der Vergleich zwischen einigen
entwicklungsrelevanten Gentranskripten bei in vivo und in vitro produzierten bovinen
Embryonen aufgeführt. Es handelt sich dabei um Gentranskripte, welche für
entscheidende Aufgaben, wie die Kompaktierung, die Bildung von Proteinen, den
Metabolismus oder die Trophoblastenfunktion, in der embryonalen Entwicklung
exprimiert werden.
Tabelle 15: Vergleich entwicklungsrelevanter Gentranskripte bei in vivo und in vitro produzierten
bovinen Blastozysten
Gentranskript
Vergleich zu
in vivo
generierten
Embryonen
Autor
↓
KNIJN et al. (2002)
↓
Keine
Unterschiede
SLC2A1
Metabolismus
↑
↓
↓
SLC2A5
48
WRENZYCKI et al.
(2001)
LONERGAN et al.
(2003)
PURPERA et al.
(2009)
BALASUBRAMANIAN
et al. (2007)
BALASUBRAMANIAN
et al. (2007)
Literatur
Tabelle 15: Vergleich entwicklungsrelevanter Gentranskripte bei in vivo und in vitro produzierten
bovinen Blastozysten (Fortsetzung)
Gentranskript
Cx43
DSC2
Zell-Zell-Verbindungen
↓
RIZOS et al. (2002)
↑
PURPERA et al. (2009)
↓
KNIJN et al. (2002)
↑
WRENZYCKI et al.
(2001)
WRENZYCKI et al.
(2001)
↓
KNIJN et al. (2002
↓
WRENZYCKI et al.
(2001)
TJP1
↓
MILLER et al. (2003)
DNMT1
↑
DNMT3A
↑
DSC3
DNA-Methylierung
Apoptose
Autor
↓
Plakophilin
Stressindikator
Vergleich zu
in vivo
generierten
Embryonen
HSP
BAX
Maternale
Trächtigkeitserkennung
IFNT2
Prostaglandinsynthese
PTGS2
↑
WRENZYCKI u.
NIEMANN (2003)
WRENZYCKI u.
NIEMANN (2003)
WRENZYCKI et al.
(2001)
↑
SMITH et al. (2009)
↑
BALASUBRAMANIAN
et al. (2007)
↑
RIZOS et al. (2002)
↑
WRENZYCKI et al.
(2001)
↓
GAD et al. (2012)
↓
GAD et al. (2012)
Auch die Kryokonservierung boviner Blastozysten hat einen Einfluss auf deren
Expression
entwicklungsrelevanter
Gentranskripte.
Eine
Übersicht
über
die
verschiedenen Einflüsse im Vergleich zu nicht kryokonservierten Embryonen ist in
Tabelle 16 aufgeführt.
49
Literatur
Tabelle 16: Vergleich entwicklungsrelevanter Gentranskripte bei kryokonservierten und
↓
Konv. Kryokonservierung
↓
Vitrifikation
-
Konv. Kryokonservierung
↓
Konv. Kryokonservierung
↑
Vitrifikation
↑
Vitrifikation
↓
Konv. Kryokonservierung
↓
Vitrifikation
-
Konv. Kryokonservierung
-
Vitrifikation
↓
Konv. Kryokonservierung
-
Konv. Kryokonservierung
↑
OCC
Konv. Kryokonservierung
↑
TBA8
Vitrifikation
↑
SLC2A1
Metabolismus
SLC2A3
SC4MOL
TJP1
CDH1
Zell-ZellVerbindungen
DSC2
50
Autor
Expression im Vergleich
zu nicht
kryokonservierten
Embryonen
Vitrifikation
Gentranskript
Konservierungsmethode
nicht-kryokonservierten bovinen Blastozysten (* = vitrifizierte Oozyten)
STINSHOFF
et al. (2011)
STINSHOFF
et al. (2011)
KUZMANY
et al. (2011)
SIQUEIRA
FILHO et al.
(2011)
STINSHOFF
et al. (2011)
STINSHOFF
et al. (2011)
STINSHOFF
et al. (2011)
KUZMANY
et al. (2011)
KUZMANY
et al. (2011)
AKSU et al.
(2012)
Literatur
Tabelle 16: Vergleich entwicklungsrelevanter Gentranskripte bei kryokonservierten und
Stressindikator
DNMT3A
HSPA1A
Konv.
Kryokonservierung
↓
Vitrifikation
↓
Konv.
Kryokonservierung
Konv.
Kryokonservierung
↓
↑
Vitrifikation
-
Vitrifikation
↑
Konv.
Kryokonservierung
↑
Vitrifikation*
↑
BCL-XL
Konv.
Kryokonservierung
↑
BCL-2
Vitrifikation*
↑
FAS
Vitrifikation*
↑
Vitrifikation
-
Konv.
Kryokonservierung
↑
IFNT2
51
Autor
-
↑
BAX
Trophoblastenfunktion
Vitrifikation
Vitrifikation
HSPA5
Apoptose
Expression im Vergleich
zu nicht
kryokonservierten
Embryonen
DNAMethylierung
Konservierungsmethode
Gentranskript
nicht-kryokonservierten bovinen Blastozysten (Fortsetzung, * = vitrifizierte Oozyten)
STINSHOFF
et al. (2011)
STINSHOFF
et al. (2011)
KUZMANY
et al. (2011)
PARK
et al. (2006)
SIQUEIRA FILHO
et al. (2011)
AKSU et al. (2012)
KUZMANY
et al. (2011)
ANCHAMPARUTHY
et al. (2010)
KUZMANY
et al. (2011)
ANCHAMPARUTHY
et al. (2010)
ANCHAMPARUTHY
et al. (2010)
STINSHOFF
et al. (2011)
Literatur
Die Präimplantationsphase von Embryonen ist durch wichtige entwicklungsrelevante
Schritte wie zum Beispiel die Kompaktierung, Blastocoel-Bildung oder die Expansion
der
Blastozysten
charakterisiert.
Sie
hängt
von
dem
Zusammenspiel
der
Genexpression des maternalem und embryonalem Genoms ab (KIDDER 1992).
Änderungen
in
der
Genexpression
können
zu
bedeutenden
qualitativen
Veränderungen von in vitro produzierten Embryonen führen (WRENZYCKI et al.
2007).
2.7.1. Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1)
Der Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1) ist ein Membranprotein, welches zur Familie
der Natrium-unabhängigen Glukosetransporter gehört. Bei einem Molekulargewicht
von 45-55 kDa besteht der Glukosetransporter aus zwölf transmembranären
Domänen, die sich in der Plasmamembran anordnen (GOULD u. BELL 1990,
OLSON u. PESSIN 1996). Der Transport von Glukose erfolgt bei dieser
Proteinfamilie energieunabhängig und entlang eines Konzentrationsgradienten
sowohl nach intra- als auch nach extrazellulär. Das SLC2A1-Membranprotein ist in
jeder Säugetierzelle zu finden, am häufigsten wird es dabei in fetalem Gewebe bzw.
in adultem Gewebe in Erythrozyten, Fibroblasten und in endothelialen Zellen,
weniger in der Leber, im Muskel und im Fettgewebe, angetroffen (BELL et al. 1993,
OLSON u. PESSIN 1996). Die Hauptaufgabe der Glukosetransporter ist die
Regulierung der intrazellularen Glukosekonzentration. SLC2A1 spielt außerdem eine
große Rolle im Transport von Glukose über epitheliale und endotheliale Barrieren wie
der Blut-Hirn-Schranke (MUECKLER 1994). SLC2A1 konnte zuerst in humanen
Erythrozyten nachgewiesen werden und war damit auch die erste identifizierte
Isoform dieses Proteins (OLSON u. PESSIN 1996). MUECKLER (1994) konnte das
Transportprotein in murinen Oozyten und in allen Stadien von Mäuseembryonen, von
der Zygote bis hin zur Blastozyste, nachweisen. Auch in bovinen Embryonen konnte
SLC2A1 in allen frühembryonalen Stadien bis zur geschlüpften Blastozyste
nachgewiesen werden (LEQUARRÉ et al. 1997), dabei wurde ein kontinuierlicher
Anstieg der SLC2A1-Expressionsmenge ab dem 2-Zellstadium gemessen. Zum
52
Literatur
Zeitpunkt der Aktivierung des embryonalen Genoms und im Molulastadium, in dem
die Kompaktierung des Embryos stattfindet, wurde der höchste Anstieg der
SLC2A1-Expression ermittelt. Dies liegt zum einen daran, dass im Stadium der
Aktivierung des embryonalen Genoms der Metabolismus der Embryonen von Laktat
und Pyruvat auf Glukose umgestellt wird, zum anderen werden die Embryonen im
Stadium der Kompaktierung immer stärker von Glukose als Nahrungsquelle
abhängig (RIEGLER et al. 1992, WRENZYCKI et al. 1999).
Bei der IVP wird die SLC2A1-Expression in präimplantatorischen Embryonen von
verschiedenen Kulturbedingungen, wie der Sauerstoffkonzentration, einem Zusatz
von Serum oder der Glukosemenge im Kulturmedium, beeinflusst (LOPES et al.
2007). So erhöht der Zusatz von PVA zum Kulturmedium die SLC2A1-Expression in
bovinen Embryonen ab dem 8-16-Zellstadium bis zur geschlüpften Blastozyste
(WRENZYCKI et al. 1999). Des Weiteren konnte SLC2A1 bei bovinen Embryonen
hauptsächlich in der lateralen Membran des Trophoektoderms (TE) und weniger in
der inneren Zellmasse (inner cell mass, ICM) gefunden werden (AUGUSTIN et al.
2001, WRENZYCKI et al. 2003). Auch in Hinsicht auf das Geschlecht des Embryos
konnten Unterschiede festgestellt werden, so wurde in männlichen Embryonen
signifikant mehr SLC2A1 exprimiert als in weiblichen (LOPES et al. 2007,
GARCIA-HERREROS et al 2012). Die Expression des Glukosetransporters ist
jedoch nicht nur abhängig von den äußeren Bedingungen oder dem Geschlecht,
sondern auch von der Qualität der Embryonen. So konnte bei Embryonen von
morphologisch
guter
Qualität
signifikant
höhere
SLC2A1-Transkriptmengen
nachgewiesen werden (LOPES et al. 2007). Des Weiteren konnte bei in vivo
generierten Embryonen ebenfalls eine höhere SLC2A1-Expression nachgewiesen
werden als bei in vitro produzierten (WRENZYCKI et al. 2001, BALASUBRAMANIAN
et al. 2007).
Der Einfluss von Kryokonservierungsmethoden auf die Expression von SLC2A1
ergab, dass sowohl bei konventioneller Kryokonservierung, als auch bei der
Vitrifikation boviner Blastozysten die Expression des Glukosetranspoters im
Vergleich zu normal in vitro produzierten Embryonen herunterreguliert war
(STINSHOFF et al. 2011).
53
Literatur
2.7.2. Zona occludens-Protein 1 (TJP1)
Die
Kommunikation
zwischen
Zellen
findet
über
sogenannte
Zellverbindungsmoleküle statt. Zu diesen Zellverbindungen gehören die Tight
junctions (TJ), welche zwei Hauptfunktionen in Epithelzellen haben. Zum einen
bilden die TJ durch die gürtelartige Umhüllung von Zellen und den Kontakt mit den
TJ der Nachbarzellen eine parazelluläre Barriere, durch welche der transepitheliale
Austausch von Molekülen reguliert wird, zum anderen trennen die TJ innerhalb der
Zellmembran von Epithelzellen die apikale von der basolateralen Seite (SHETH et al.
1997, STEVENSON u. KEON 1998). Die TJ sind ein Multiproteinkomplex, bestehend
aus
integralen
herstellen,
Membranproteinen,
und
welche
zytoplasmatischen
die
interzellulären
Plaque-Proteinen,
Verbindungen
wie
dem
Zona occludens-Protein 1 (TJP1/ZO-1), welche die TJ mit dem Aktinzytoskelett
verbinden (STEVENSON u. KEON 1998, MILLER et al. 2003). Das TJP1 war das
erste Protein, welches in diesem Multiproteinkomplex entdeckt wurde. Es handelt
sich um ein Phosphoprotein, welches in der Zellmembran lokalisiert ist und eine
speziesspezifische molekulare Masse von 210 bis 225 kDa aufweist (STEVENSON
et al. 1986).
Es gibt zwei Isoformen des TJP1, welche sich in einer 80 Aminosäure großen
Terminale,
genannt
α,
unterscheiden
und
durch
alternatives
Slicen
der
mRNA-Vorstufe entstehen (WILLOTT et al. 1992, BALDA u. ANDERSON 1993). Die
eine als ZO-1α+ bezeichnete Isoform wird in allen herkömmlichen Epithelzellen
gefunden, während die andere Isoform, ZO-1α-, nur in spezialisierten Epithelzellen,
wie den Sertolizellen, zu finden ist (SHETH et al. 1997).
In Embryonen werden beide Isoformen des TJP1 exprimiert. Zwar kann auch schon
im Oozyten-Stadium und in der frühembryonalen Entwicklung von Mäuseembryonen
TJP1 nachgewiesen werden, die entscheidende Expression beginnt jedoch mit der
Kompaktierung des Embryos. Die zuvor deutlich voneinander getrennt liegenden
Zellen fangen an, Verbindungen aufzubauen, wodurch die Differenzierung in TE und
ICM beginnt. Bei Mäuseembryonen findet die Kompaktierung ab dem 8-Zell-Stadium
statt (VESTWEBER et al. 1987). Die Menge des exprimierten TJP1 steigt ab dem
54
Literatur
Morula-Stadium stark an, was mit der Aktivierung des embryonalen Genoms in
Verbindung gebracht werden kann. Dabei wurde ermittelt, dass sich die Expression
zwischen in vitro und in vivo generierten Mäuseembryonen nicht voneinander
unterscheidet. Allerdings konnte festgestellt werden, dass bovine Embryonen,
welche eine kurze Kompaktierungsphase und somit eine schnelle Entwicklung zur
Blastozyste aufwiesen signifikant weniger TJP1 exprimierten als Embryonen, die sich
langsamer entwickelten und somit mehr Zeit für die Kompaktierung hatten (MILLER
et al. 2003).
Sowohl in murinen als auch in porcinen Embryonen konnte die ZO-1α- -Isoform
schon in frühembryonalen Stadien, ab dem 2-Zell-Stadium, ermittelt werden,
während
die
ZO-1α+
-Isoform
erst
ab
dem
Zeitpunkt
der
embryonalen
Genomaktivierung detektiert wurde (SHETH et al. 1997). Dabei stieg die
detektierbare Menge bei den porcinen Embryonen ab dem Morula-Stadium deutlich
an (XU et al. 2012).
Bei bovinen Embryonen konnte TJP1 zunächst nur im Blastozystenstadium detektiert
werden
(SHEHU
et
al.
1996).
BARCROFT
et
al.
gelang
1998
der
TJP1-Proteinnachweis durch Immunfluoreszenz bereits im Morula-Stadium. Die
Lokalisation war beim Rind auf die Zellen des TE beschränkt und stieg bei der
Entwicklung zur Blastozyste stark an (BARCROFT et al. 1998). Ein deutlicher
Anstieg in der Menge des TJP1-Transkripts war auch bei dem Vergleich von Tag 7und Tag 8 Blastozysten zu erkennen (WRENZYCKI et al. 2003). Bei der
Kryokonservierung boviner Blastozysten konnte ermittelt werden, dass Blastozysten,
welche durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung eingefroren wurden
signifikant weniger TJP1 exprimierten als solche, die nicht kryokonserviert wurden
(STINSHOFF et al. 2011).
2.7.3. Interferon  (IFNT2)
Interferon (IFNT2) oder auch bovines-Trophoblastenprotein-1 genannt gehört zur
Familie der Typ-I Interferone. Es wird von bovinen Embryonen gebildet und dient als
primäres Signal zur maternalen Erkennung der Trächtigkeit (BAZER 1992,
55
Literatur
JOHNSON et al. 2006). Die Ausschüttung des Proteins erreicht in der Zeitspanne
zwischen Tag 15 und 24 der Trächtigkeit ein Maximum (BARTOL et al. 1985). In
dieser Zeitspanne erfolgt normalerweise die pulsatile Ausschüttung von PGF2α
durch das Endometrium und eine dadurch bedingte Luteolyse des zyklischen
Gelbkörpers. Durch die Ausschüttung des IFNT2 wird die luteolytische Wirkung des
PGF2α gehemmt, was zum Erhalt der Trächtigkeit führt (FARIN et al. 1990). Die
Ausschüttung des IFNT2 erfolgt dabei ausschließlich aus den Zellen des TE, in den
Zellen der ICM konnte IFNT2 nicht nachgewiesen werden (FARIN et al. 1990,
WRENZYCKI et al. 2003). Der Nachweis ist daher abhängig von einem
funktionierenden TE und kann bei bovinen Embryonen ab dem Blastozystenstadium
erfolgen (HERNANDEZ-LEDEZMA et al. 1993, WRENZYCKI et al. 1998).
Die Menge des vorhandenen IFNT2-Proteins hängt von verschiedenen Faktoren ab.
Dabei steigt die embryonale Bildung ab dem Stadium der expandierten Blastozyste
zunächst an und erreicht an Tag 15-24 der Trächtigkeit, also zum Zeitpunkt der
Implantation bei bovinen Embryonen, einen Höchstwert (BARTOL et al. 1985). Auch
bei in vitro produzierten Embryonen steigt die IFNT2-Bildung ab dem Stadium der
expandierten Blastozyste an. Die Menge des exprimierten IFNT2
ist bei
IVP-Embryonen im Gegensatz zu in vivo generierten höher (WRENZYCKI et al.
2001, LONERGAN et al. 2003). Auch verschiedene Kultursysteme haben einen
Einfluss auf die Höhe der Expression. So konnten WRENZYCKI et al. 1999
nachweisen, dass Embryonen, die in Anwesenheit von Serum kultiviert wurden, eine
höhere IFNT2-Expression aufwiesen als solche, die in Medien mit PVA-Zusatz
kultiviert wurden. Diese Ergebnisse wurden 2003 durch RIZOS et al. bestätigt. Sie
konnten ebenfalls nachweisen, dass Embryonen aus Kultursystemen mit einem
Zusatz von FCS höhere IFNT2-Expression zeigten als solche aus Kulturen ohne
Serumzusatz.
KUBISCH et al. konnten 1998 eine negative Korrelation zwischen der frühen
Expression von IFNT2 und der Entwicklungskompetenz von IVP-Embryonen
feststellen. Ebenso konnten sie 2004 nachweisen, dass die Trächtigkeitsraten nach
Transfer von Embryonen, welche ein niedrigeres IFNT2-Level auswiesen, besser
waren, als die von Embryonen, die früh IFNT2 ausbildeten (KUBISCH et al. 2004).
56
Literatur
Dies wurde durch GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 2004 bestätigt. Sie konnten in
IVP-Embryonen schon an Tag 3 eine geringe Expression von IFNT2 und damit eine
anormale Transkription nachweisen. Des Weiteren ermittelten sie bei sich langsam
entwickelnden und damit qualitativ schlechteren Embryonen eine höhere Expression
von IFNT2.
Einen
Einfluss
von
Kryokonservierungsmethoden
auf
die
Menge
der
IFNT2-Expression konnte nur bei der konventionellen Kryokonservierung festgestellt
werden. Die konventionell kryokonservierten Embryonen wiesen nach dem Auftauen
eine signifikant höhere Expression IFNT2 auf. Die Expression bei vitrifizierten im
Vergleich zu nicht kryokonservierten Embryonen war dagegen nicht unterschiedlich
(STINSHOFF et al. 2011). Im Gegensatz dazu konnten YAO et al. 2009 beim
Vergleich zwischen konventionell kryokonservierten und in vivo generierten
Embryonen keine Unterschiede in der IFNT2-Expression feststellen.
2.7.4. Hitzeschockprotein 70 (HSPA1A)
Bei den Hitzeschockproteinen handelt es sich um eine Gruppe von Proteinen, die
aufgrund ihrer molekularen Masse in verschiedene Familien eingeteilt werden
(LINDQUIST u. CRAIG 1988). Eine dieser Familien ist die Familie der
HSP70-Proteine, welche heute auch als HSPA1A-Proteine bezeichnet werden. Diese
Proteine haben eine hohe Affinität zu Adenosintriphosphat (ATP) und kommen in
allen Säugetierzellen vor. Sie wurden erstmals 1962 durch RITOSSA entdeckt und
dienen unter anderem zum Schutz der Zelle vor Hitzestress und als Chaperone bei
der Faltung von Proteinen. Als Chaperone übernehmen die Hitzeschockproteine
weitere Aufgaben, wie die Zersetzung instabiler Proteine, den Im- und Export von
Proteinen, die Auflösung von Proteinkomplexen oder die Neufaltung falsch gefalteter
Proteine (NOVER u. SCHARF 1997, GARRIDO et al. 2001). Das HSPA1A-Protein
besteht aus zwei wichtigen Domänen, dem N-Terminal, welcher für die Bindung von
ATP zuständig ist, und dem C-Terminal, welcher zur Protein-Interaktion dient. In
Säugetierzellen gibt es zwei vorkommende Arten des HSPA1A. Die eine Art wird
ständig exprimiert und dient dazu, die Zelle bei der Proteinfaltung zu unterstützen,
57
Literatur
die andere Form wird durch Stressfaktoren induziert (GARRIDO et al. 2001). Solche
Stressfaktoren
können
beispielsweise
Temperaturveränderungen
und
die
Auswirkung von Ethanol oder Schwermetallen auf die Zelle sein (LINDQUIST u.
CRAIG 1988). Das HSPA1A dient dazu die zellulären Strukturen vor solchen
Stressoren zu schützen (DUNCAN u. HERSHEY 1989).
Es ist bekannt, dass Hitzestress eine Auswirkung auf die Trächtigkeit von
Säugetieren haben kann. So wird durch hohe Temperaturen in der Phase ab der
ersten Teilung der Embryonen die embryonale Sterblichkeit erhöht. Auch bei in vitro
produzierten Embryonen, welche einem Hitzestress ausgesetzt waren, ist die
embryonale Entwicklung reduziert (EDWARDS u. HANSEN. 1997). Dabei ist die
Auswirkung eines solchen Hitzestresses im 2-Zell-Stadium ausgeprägter als im
Stadium der Morula (EALY et al. 1995). Allerdings konnte bei Embryonen, welche in
einem frühen Stadium einem moderaten Hitzestresses ausgesetzt waren, in späteren
Stadien eine größere Thermotoleranz induziert werden (EDWARDS et al. 1995).
In Mäuseembryonen wurde das HSPA1A-Transkript ab dem 2-Zellstadium
nachgewiesen. Die Expression beginnt hier mit der Aktivierung des embryonalen
Genoms (CHRISTIANS et al. 1995). In bovinen Oozyten und Embryonen konnte
HSPA1A in allen Stadien bis zur geschlüpften Blastozyste nachgewiesen werden. Es
kann hier als ein Indikator für den Nachweis suboptimaler Kulturbedingungen dienen
(WRENZYCKI et al. 1998). So wurden beispielsweise beim Zusatz von Serum zu
den Kulturmedien signifikant mehr HSPA1A-Transkripte nachgewiesen als bei einer
Kultur mit PVA-Supplementation (WRENZYCKI et al. 1999). Ebenso wurde bei
Morulae und Blastozysten aus einer TCM-Kultur mehr HSPA1A nachgewiesen als
bei denen aus einer SOF-Kultur oder bei in vivo generierten Embryonen. Auch der
Zusatz
von
FBS
zum
Maturationsmedium
bewirkt
einen
Anstieg
in
der
HSPA1A-Expression im Vergleich zu Maturationsmedien mit BSA oder PVP
(WARZYCH et al. 2007). Der Vergleich in vitro produzierter Embryonen mit in vivo
generierten ergab, dass sowohl bei der Maus als auch beim Rind die
HSPA1A-Expression bei IVP-Embryonen deutlich höher war (CHRISTIANS et al.
1995, WRENZYCKI et al. 2001, SMITH et al. 2009). Auch die Kryokonservierung von
Embryonen scheint Auswirkungen auf die HSPA1A-Expression zu haben. So zeigten
58
Literatur
konventionell kryokonservierte, genauso wie vitrifizierte Embryonen, im Vergleich zu
nicht
kryokonservierten
IVP-Embryonen
eine
Reduzierung
der
relativen
Transkriptmenge (STINSHOFF et al. 2011). PARK et al. stellten im Gegensatz dazu
eine Erhöhung der Transkriptmenge vitrifizierter Embryonen nach dem Auftauen fest
und auch KUZMANY et al. konnten eine Steigerung der HSPA1A-Expression nach
der Vitrifikation im Vergleich zu nicht vitrifizierten Embryonen ermitteln (PARK et al.
2006, KUZMANY et al. 2011). SIQUEIRA FILHO et al. konnten dagegen 2011 keine
Veränderungen in der HSPA1A-Expression bei vitrifizierten im Gegensatz zu nicht
kryokonservierten bovinen Blastozysten ermitteln.
2.7.5. Desmocollin 2 (DSC2)
Desmosome gehören zu den kalziumabhängigen Membranproteinen aus der
Superfamilie der Cadherine und bilden einen Teil der Zell-Zell-Verbindungsapparate,
welche in so gut wie allen Epithelzellen vorkommen (FLEMING et al. 1991, COLLINS
et al. 1995). Desmosome bestehen aus transmembranären Glykoproteinen, wie dem
Desmoglein oder dem Desmocollin, welche im Interzellularraum eine Verbindung zur
Nachbarzelle
aufbauen,
und
einem
zytoplasmatischen
Plaque-Protein,
wie
Plakoglobin oder Desmoplakin, welche die Aufgabe haben, die Verankerung der
Zytofilamente in der Plasmamembran zu bilden (SCHWARZ et al. 1990). Beim Rind
kommen drei Typen des Desmocollins vor, das Desmocollin 1, 2 und 3. Jedes
Desmocollin besitzt außerdem zwei Isoformen, welche sich in der Größe der
zytoplasmatischen Domäne unterschieden. Die b-Isoform besitzt im Gegensatz zur
a-Isoform ein zusätzliches, 46 Basenpaare (bp) langes Exon (COLLINS et al. 1991,
LEGAN et al. 1994).
Bei Mäuseembryonen kann DSC2 in der Oozyte und in frühembryonalen Stadien bis
zum nicht-kompaktierten 8-Zeller detektiert werden. In der Phase der Kompaktierung
im 8-Zell-Stadium wird DSC2 nicht exprimiert. Der Nachweis gelingt erst wieder ab
dem 16-Zell-Stadium und steigt in der weiteren Entwicklung zur Blastozyste und
geschlüpften Blastozyste an (COLLINS et al. 1995). Lokalisiert ist das DSC2
hauptsächlich in den Zellen des TE. Hier ist es beteiligt an der Blastocoel-Bildung
59
Literatur
und der Stabilisierung des TE im Verlauf der Expansion der Blastozysten (FLEMING
et al. 1991).
Bei bovinen Embryonen konnten beide Isoformen des DSC2 und des DSC3 ab dem
2-4 Zell-Stadium bis zum Stadium der geschlüpften Blastozyste nachgewiesen
werden, DSC1 wurde dagegen nicht exprimiert (WRENZYCKI et al. 1998).
Die Menge des exprimierten Transkripts hängt von verschiedenen Faktoren ab. So
konnte beispielsweise in bovinen Blastozysten, welche an Tag 7 expandierten,
signifikant weniger DSC2 nachgewiesen werden als in solchen, die erst an Tag 8
expandierten. Des Weiteren wurde im TE boviner Blastozysten signifikant mehr
DSC2 nachgewiesen als in der ICM (WRENZYCKI et al. 2003). Auch die
Zusammensetzung der Kulturmedien für die IVP hat einen Einfluss auf die
Expression von DSC2. So exprimieren Blastozysten aus einer Kultur mit PVA-Zusatz
signifikant mehr DSC2 als Blastozysten aus einer Kultur mit Serum. Wird dem
Kulturmedium IGF-1 (Insulin-like Growth Faktor 1) zugesetzt, erhöht dies die
Expression von DSC2 in bovinen Blastozysten im Vergleich zu solchen, denen kein
IGF-1 zugeführt wurde (BLOCK et al. 2008).
Bei dem Vergleich von in vitro produzierten Embryonen mit solchen, die in vivo
generiert wurden, konnte ein deutlicher Unterschied in der DSC2-Expression
nachgewiesen werden. Embryonen aus einer IVP bildeten weniger DSC2 als die in
vivo generierten. Dies kann ein Indikator für eine bessere Qualität der in vivo
produzierten Embryonen sein (WRENZYCKI et al. 2001, KNIJN et al. 2002). Auch
die Kryokonservierung beeinflusst die Bildung von DSC2, so konnte bei vitrifizierten
Embryonen nach dem Auftauen signifikant weniger DSC2 ermittelt werden als bei
Embryonen, die nicht kryokonserviert wurden (STINSHOFF et al. 2011).
2.7.6. Prostaglandin G/H-Synthase 2 (PTGS2)
Die
Prostaglandin
G/H-Synthase
(PTGS),
auch
als
Cyclooxygenase
bzw.
Prostaglandin Endoperoxid-Synthase bezeichnet, ist ein integrales Membranprotein,
welches in so gut wie jeder Zelle vorkommt (SMITH u. MARNETT 1991). Es spielt
eine entscheidende Rolle in der Synthese von Prostanoiden, wie Prostaglandin,
60
Literatur
Prostacyclin oder Thromboxanen, welche an vielen wichtigen Mechanismen im
Körper
beteiligt
sind.
Dies
sind
unter
anderem
Immunreaktionen,
Entzündungsreaktionen, Schmerzbildung oder die Blutgerinnung (SIROIS et al.
1992).
Eine
weitere
entscheidende
Rolle
spielen
die
Prostanoide
bei
verschiedensten Mechanismen der Reproduktionsbiologie, so beeinflussen sie
beispielsweise die Ovulation, die Implantation von Embryonen und die Bildung der
Plazenta (SIROIS et al. 1992, SMITH u. MARNETT 1991). Die Bildung von
Prostanoide erfolgt zunächst durch die Oxidierung von Arachidonsäure zu
Prostaglandin G2 und eine anschließende Reduzierung zu Prostaglandin H2. Dieses
wird wiederrum von verschiedenen Enzymen zu den einzelnen Prostanoiden,
beispielsweise dem PGF2α, verstoffwechselt (VANE et al. 1998).
Im
Organismus
kommen
zwei
Formen
der
PTGS
vor,
die
Prostaglandin G/H-Synthase 1 (PTGS1) und die Prostaglandin G/H-Synthase 2
(PTGS2). Die PTGS1 wird von jeder Zelle durchgehend in bestimmtem Maße
gebildet, die erst 1991 entdeckte zweite Form PTGS2 wird dagegen erst nach der
Stimulation der Zelle durch verschiedene Faktoren, wie Zytokine oder andere
Entzündungsmediatoren, freigesetzt (MORITA et al. 1995). Diese zweite Enzymform
lässt sich durch Stoffe wie Acetylsalicylsäure und andere, nicht-steroidale
Antiphlogistika hemmen und ist daher von großem wissenschaftlichen Interesse im
Hinblick auf die Bekämpfung von Entzündungen (VANE et al. 1998), aber auch in der
Tumorbekämpfung. So konnte 1995 durch TSUJII und DUBOIS nachgewiesen
werden, das Zellen, die eine starke Expression von PTGS2 zeigen, strukturelle
Veränderungen, wie eine starke Proliferationsrate und eine Resistenz gegenüber
dem programmierten Zelltod, aufwiesen. Es wurde weiterhin eine Bedeutung des
PTGS2 für die Entstehung von Tumoren vermutet (TSUJII u. DUBOIS 1995).
Bei den physiologischen Vorgängen der Ovulation, der Eizellreifung und der
Embryonenentwicklung sowie der Implantation und Plazentabildung spielt PTGS2
eine entscheidende Rolle. So konnten bei Mäusen, welche nicht in der Lage waren,
PTGS2
auszubilden,
Infertilität
und
Störungen
in
der
Ovulation,
der
Oozyten-Maturation und der Implantation der Embryonen festgestellt werden (LIM et
al. 1999). PTGS2 wird bei der Implantation sowohl von den Blastozysten als auch
61
Literatur
vom Uterus gebildet und scheint hier eine entscheidende Rolle zu spielen (LIM et al.
1999). Des Weiteren wird es auch im Eileiter und in den Kumuluszellen exprimiert
(GAUVREAU et al. 2010). Eine genügende Expression von PTGS2 in den
Kumuluszellen scheint ein Faktor für eine gute Entwicklungskompetenz und Qualität
der Eizellen zu sein. So war die Expression von PTGS2 in den Kumuluszellen von
qualitativ hochwertigen Eizellen bis zu sechsmal so hoch wie in qualitativ schlechten
(MCKENZIE et al. 2004).
In bovinen Embryonen konnte PTGS2 in allen Stadien bis zur geschlüpften
Blastozyste
nachgewiesen
werden.
Dabei
exprimieren
Morulae
und
frühe
Blastozysten weniger PTGS2 als expandierte oder geschlüpfte Blastozysten und
Blastozysten von guter Qualität exprimierten deutlich mehr PTGS2 als solche von
geringerer Qualität (SAINT-DIZIER et al. 2011). GAD et al. (2012) konnten bei einem
Vergleich in vitro produzierter mit in vivo generierten bovinen Embryonen niedrigere
Expressionsraten bei den IVP Embryonen ermitteln. Das Vorkommen von PTGS2 ist
hauptsächlich auf das TE beschränkt, in der ICM konnte es nur in geringem Umfang
nachgewiesen werden. Dies signalisiert die Bedeutung des Enzyms für die
Implantation des Embryos und die Interaktion zwischen dem Embryo und dem
Uterus (CHARPIGNY et al. 1997). Des Weiteren konnte in Embryonen, welche zu
einer erfolgreichen Trächtigkeit und der Geburt gesunder Kälber führten, eine höhere
PTGS2-Expression nachgewiesen werden, als in solchen, die zu Beginn der
Trächtigkeit resorbiert wurden (EL-SAYED et al. 2006). Eine Inhibierung der
PTGS2-Aktivität in der Maturationsphase boviner Eizellen führt zu einer Reduzierung
der Reifungsrate, einer langsamen Embryonalentwicklung und zu einer geringeren
Zellzahl im Blastozystenstadium (NUTTINCK et al. 2011).
62
Material und Methoden
3. Material und Methoden
Die verwendeten Geräte und Materialien sowie die Zusammensetzung der
verwendeten Medien und Chemikalien sind, sofern nicht im Text beschrieben, im
Anhang aufgeführt. Wenn nicht anders angegeben, stammen die verwendeten
Chemikalien von der Firma Sigma (Steinheim, Deutschland)
3.1. In-vitro-Produktion
Die In-vitro-Produktion (IVP) boviner Embryonen besteht aus drei aufeinander
folgenden
Schritten:
Der
In-vitro-Maturation
oder
-Reifung
(IVM),
der
In-vitro-Fertilisation oder -Befruchtung (IVF) und der In-vitro-Kultur (IVC). Der Tag der
In-vitro-Kultur
0
1
2
3
4
5
6
Abbildung 13: Zeitachse der In-vitro-Produktion
63
Entwicklungskontrollen
In-vitro-Fertilisation
Tag -1
Entwicklungskontrollen und Vitrifikation
In-vitro-Maturation
In-vitro-Fertilisation entspricht Tag 0 der Embryonalentwicklung (Abb. 13).
7
8
Material und Methoden
3.1.1. Herkunft und Transport der Ovarien
Zur IVP wurden Ovarien frisch geschlachteter Rinder verwendet. Die Ovarien
stammten von einem Schlachthof der Firma Vion (Bad Bramstedt, Deutschland). Es
wurde darauf geachtet, keine juvenilen, pathologisch veränderten oder zystisch
entarteten Ovarien zu verwenden. Ebenso wurden keine Ovarien von trächtigen
Tieren benutzt. Der Transport der Ovarien zum Labor fand in einem Thermobehälter
in 28-30°C warmer PBS-Complete Lösung statt, dabei betrug die Transportdauer
durchschnittlich zwei Stunden.
3.1.2. Bearbeitung der Ovarien
Nach Ankunft im Labor wurden die Ovarien zunächst dreimalig mit 37°C warmer, mit
60 mg Penicillin und 100 mg Streptomycin versetzter, isotonischer Kochsalzlösung
gewaschen (NaCl-Complete). Zur Eröffnung der Follikel wurden die Ovarien mittels
einer Arterienklemme in eine mit ca. 80 ml PBS-Complete gefüllte Petrischale
gehalten und durch mehrere parallel angeordnete Kürschnerklingen eröffnet. Diese
so genannte Slicing-Methode (Eckert u. Niemann 1995) eröffnete die oberflächlichen
und tiefen Follikel, wodurch die Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) herausgespült
wurden und in das PBS-Complete übergingen. Um die KOK zu isolieren, musste
zunächst die Flüssigkeit durch ein Sieb in ein 500 ml Becherglas überführt werden,
um
große
Gewebestücke
zu
entfernen.
Nach
einer
zehnminütigen
Sedimentationszeit konnte der Überstand durch eine Pasteurpipette bis auf 100 ml
abgesaugt
werden.
Das
Sediment
wurde
auf
ca.
zehn
bis
zwölf 15 ml
Falconröhrchen verteilt, mit PBS verdünnt und erneut zehn Minuten zum
Sedimentieren auf der Wärmeplatte bei 37°C stehen gelassen. Anschließend konnte
mittels einer Pasteurpipette ca. 5 ml Sediment aus dem Reagenzglas abgesaugt, in
eine Petrischale überführt und mit ca. 80 ml PBS-Complete erneut verdünnt werden.
64
Material und Methoden
3.1.3. Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Die Selektion der KOK erfolgte unter dem Stereomikroskop (Fa. Olympus, Hamburg,
Deutschland) auf einer Wärmeplatte bei 37°C. Mittels einer 20 μl Glaspipette
(Fa. Brand, Wertheim, Deutschland) und eines Pipettierhelfers (Fa. Brand, Wertheim,
Deutschland) wurden die gefundenen KOK aufgesaugt und zunächst in einer
Petrischale, in der sich 2 ml 37°C warme TCM-air-Lösung befand, gesammelt. Nach
dem Auffinden aller KOK wurden diese in der TCM-air-Lösung morphologisch
qualitativ beurteilt. Die Beurteilung erfolgte dabei nach dem in Tabelle 17
aufgeführten Schema in fünf Kategorien. Nur KOK der Kategorien 1, 2 und 3 konnten
für die folgenden Versuche verwendet werden, die restlichen KOK wurden verworfen.
Tabelle 17: Klassifizierung der KOK
Kategorie
1
2
3
4
5










Merkmale
Homogenes Zytoplasma
Mehrlagiger Kumulus (mindestens 3 Lagen)
Homogenes Zytoplasma
Mindestens einlagige, durchgehende
Kumulusschicht
Homogenes oder heterogenes Zytoplasma
Einzelne anhaftende Kumuluszellen
Homogenes oder heterogenes Zytoplasma
Keine anhaftenden Kumuluszellen; leere Zonae
Homogenes oder heterogenes Zytoplasma
Expandierter Kumulus
Tauglichkeit
Ja
Ja
Ja
Nein
Nein
3.1.4. In-vitro-Maturation (IVM)
Nach der Selektion der KOK wurden diejenigen der Kategorien 1-3 (Abb. 14)
randomisiert in Gruppen zu 18-22 KOK aufgeteilt. In diesen Gruppen wurden sie
zunächst dreimalig durch 100 μl Waschdrops pipettiert, um noch anhaftende
Gewebebestandteile zu entfernen und das TCM-air-Medium auszudünnen. Die
Waschdrops bestanden aus TCM-BSA (FAF), befanden sich in 3er-Reihen
65
Material und Methoden
angeordnet in 60 mm Petrischalen und waren mit Silikonöl (Fa. Serva, Heidelberg,
Deutschland) überschichtet. Nach diesem Waschschritt wurden die KOK-Gruppen in
100 μl-Reifungsdrops, bestehend aus TCM-BSA (FAF) versetzt mit Suigonan®,
pipettiert. Suigonan® ist eine kommerziell erhältliche Lösung, welche in einer Menge
von 25 µl als Hormone 10 Internationale Einheiten (I.E.) Pregnant Mare Serum
Gonadotropin (PMSG) und 5 I.E. Humanes Corion Gonadotropin (HCG) enthält. Die
Reifungsdrops waren jeweils zu viert in einer 35 mm Petrischale angeordnet und
ebenfalls mit Silikonöl überschichtet. In diesem Medium erfolgte die Reifung der
Eizellen für 24 Stunden bei 39°C, feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre und 5% CO2.
*
**
***
Abbildung 14: KOK der Kategorien 1-3 (*:1, **:2, ***:3)
3.1.5. In-vitro-Fertilisation (IVF)
3.1.5.1. Vorbereitung der Medien
Für
die
Fertilisation
wurde
zunächst
die
Fertilisations-Tyrode`s-Albumin-
Laktat-Pyruvat-Hypotaurin-Heparin-Epinephrin-Gebrauchslösung
Gebrauchslösung)
als
Fertilisationstropfen
für
mindestens
(Fert.Talp-HHEeine
Stunde
im
Brutschrank bei 39°C und 5% CO2 äquilibriert. Die 100 μl-Fertilisationstropfen waren
dabei zu viert in 35 mm Petrischälchen angeordnet und mit Silikonöl überschichtet.
Genauso
wurde
mit
den
IVF-Waschdrops,
66
bestehend
aus
Material und Methoden
Fert.Talp-Gebrauchslösung verfahren. Die restlichen, zur Aufbereitung der Spermien
benötigten
Medien,
die
Fert-Talp-Gebrauchslösung,
die
Fert-Talp-HHE-
Gebrauchslösung sowie die Sperm-Filter-Gebrauchslösung verblieben bis zu ihrem
Gebrauch ebenfalls im Kulturschrank bei 39°C, feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre
und 5% CO2.
3.1.5.2. Vorbereitung der Spermien
Zunächst erfolgte das Auftauen der 250 μl Straws mit Spermien eines im Vorfeld auf
IVF-Tauglichkeit getesteten Bullen für zehn Sekunden bei 30°C im Wasserbad. Nach
dem Auftauen fand eine erste Kontrolle der Spermien hinsichtlich ihrer Motilität unter
dem Mikroskop statt. Bei genügender Qualität wurde ein Eppendorfgefäß, in dem
sich 750 μl Sperm-Filter®-Gebrauchslösung befand, mit den aufgetauten Spermien
überschichtet
und
für
16 Minuten
bei
380 g
zentrifugiert.
Dieser
erste
Zentrifugationsschritt diente der Separation der toten von den lebenden Spermien.
Nach Ablauf der 16 Minuten wurde der Überstand bis auf 50 μl abgenommen, die
Spermien mit 750 μl Fert.Talp-Gebrauchslösung resuspendiert und erneut für drei
Minuten bei 380 g zentrifugiert. Es folgte ein weiterer Waschschritt, bei dem der
Überstand bis auf 50 μl abgenommen, mit 750 μl Fert.Talp-HHE-Gebrauchslösung
resuspendiert und erneut für 3 Minuten bei 380 g zentrifugiert wurde. Nach diesem
letzten Waschschritt erfolgte die Abnahme des Überstandes bis auf 100 μl und eine
zweite Qualitätskontrolle der Spermien unter dem Mikroskop. Bis zur Fertilisierung
wurden die vorbereiteten Spermien im Brutschrank bei 39°C, feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre und 5% CO2 aufbewahrt.
3.1.5.3. Fertilisation
Die gereiften Eizellen wurden zunächst in jeweils drei 100 μl-IVF-Waschdrops
gewaschen und dann in die Fertilisationstropfen überführt. Die Bestimmung der
Spermiendichte erfolgte mittels einer Thoma-Kammer. Auf dessen Grundlage fand
die Berechnung des benötigten Volumens Spermiensuspension pro 100 μl
67
Material und Methoden
Kulturtropfen statt, um eine Endkonzentration von 100.000 Spermien/100 μl
Fertilisationstropfen zu erreichen. Das benötigte Volumen wurde daraufhin zu den
Eizellen in die Fertilisationstropfen pipettiert und für 19 Stunden bei 39°C,
feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre
und 5% CO2 koinkubiert. Der Tag der
Fertilisation entsprach Tag 0 der Embryonalentwicklung.
3.1.6. In-vitro-Kultur (IVC)
Nach 19stündiger Fertilisation konnten die vermeintlichen Zygoten in Gruppen zu
20-40 in 2 ml TCM-air bei 37°C auf der Wärmeplatte unter dem Stereomikroskop von
ihrer Kumuluszellen befreit werden. Dazu wurden sie mehrmals mittels eines
Strippers (Fa. Gynemed, Lensahn, Deutschland) in eine im Durchmesser 135 μm
große Kapillare gesaugt und wieder in das TCM-air pipettiert. Durch diese
Manipulation gelang es, die Kumuluszellen vollständig zu entfernen. Die Kultivierung
der denudierten Zygoten fand nach vorerst dreimaligem Waschen in 80 μl
IVC-Waschtropfen (SOFaa), in Gruppen zu 5-7 Zygoten in 30 μl IVC-Kulturtropfen
(SOFaa)
statt.
Die
Kultur
erfolgte
für
insgesamt
8
Tage
bei
39°C,
feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre, 5% CO2 und 5% O2.
3.2. Entwicklungskontrollen
An Tag 7 und 8 der IVP wurden unter dem Stereomikroskop die Teilungs- und
Entwicklungsraten der Embryonen beurteilt. Die Teilungsrate ergab sich dabei aus
dem Anteil geteilter zu den in das Kultursystem eingebrachten Eizellen, die
Entwicklungsrate aus dem Anteil Blastozysten und expandierten Blastozysten an der
Gesamtanzahl Eizellen. Die Beurteilung der Entwicklungsrate fand dabei sowohl an
Tag 7 als auch an Tag 8 statt.
An Tag 7 expandierte Blastozysten wurden in 2 ml TCM-air gesammelt und gingen
randomisiert in die Vitrifikation durch Gynemed VitriFreeze Medien (Vitrifikation 1;
V1), bzw. durch Origio MediCult Vitrification Cooling Medien (Vitrifikation 2; V2)
68
Material und Methoden
sowie die Kontrollgruppen zu den einzelnen Vitrifikationmethoden [(Kontrolle der
Vitrifikation1; KV1);(Kontrolle der Vitrifikation 2; KV2)] ein.
3.3. Vitrifikation durch Gynemed VitriFreeze Medien
Für die Vitrifikation durch Medien, die unter anderem DMSO als Kryoprotektivum
enthielten, wurde das VitriFreeze-Kit der Firma Gynemed (Lensahn, Deutschland)
verwendet. Die Zusammensetzung der Medien ist in Tabelle 18 dargestellt. Die
Vitrifikationsmethode wird im weiteren Verlauf auch als Vitrifikationsmethode 1 (V1)
benannt. Nach einer Aufwärmphase der Medien auf 37°C im Wärmeschrank wurden
diese in die Vertiefungen eines Four-well-dishes überführt. Die Verteilung ist Tabelle
19 zu entnehmen. Die Vitrifikation fand unter dem Stereomikroskop auf einer
Wärmeplatte bei ebenfalls 37°C statt. An Tag 7 expandierte Blastozysten wurden
zunächst in 2 ml TCM-air gesammelt und anschließend wie folgt durch die
VitriFreeze
Medien pipettiert. Die
Medien
stellten
dabei eine
umgekehrte
Verdünnungsreihe mit immer höher werdenden Konzentrationen an Kryoprotektiva
dar:




Maximal 10 s im Präinkubationsmedium (Ausdünnen des TCM-air)
2 min im Präinkubationsmedium
2 min in der VitriStore Freeze Lösung 1
Maximal 20 s in der VitriStore Freeze Lösung 2
Die Manipulation durch die Verdünnungsreihe erfolgte immer mit 1-2 Blastozysten
gleichzeitig mittels eines Strippers und einer im Durchmesser 275 µm großen
Kapillare. Nach Ablauf der 20 Sekunden in der VitriStore Freeze Lösung 2 kamen die
Blastozysten mit möglichst wenig Medium auf die Spitze eines Vitriplugs (Fa. Astro
Medtec, Bergheim, Österreich; Abb. 15) und wurden unmittelbar in den flüssigen
Stickstoff überführt. Im Stickstoff erfolgte mittels Arterienklemmen das Aufschieben
eines Straws auf den Vitriplug. Die Vitriplugs befanden sich bei der Überführung in
69
Material und Methoden
den Stickstoffcontainer, in dem sie bis zum Auftauen lagerten, in ständigem Kontakt
zum flüssigen Stickstoff.
Tabelle 18: Zusammensetzung der Gynemed VitriFreeze-Medien
Medium
Zusammensetzung
Präinkubationsmedium
DMSO; EG; Ficoll; HSA; Saccharose
VitriStore Freeze Lösung 1 DMSO; EG; Ficoll; HSA; Saccharose
VitriStore Freeze Lösung 2 DMSO; EG; Ficoll; HSA; Saccharose
Tabelle 19: Einfrierprotokoll durch Gynemed VitriFreeze-Medien
Well 1
Well 2
Well 3
Well 4
Medium
Präinkubationsmedium
Präinkubationsmedium
VitriStore Freeze
Lösung 1
VitriStore Freeze
Lösung 2
Menge
Ca. 300 µl
Ca. 300 µl
Ca. 300 µl
Ca. 300 µl
Dauer
max. 10 s
2 min
2 min
20 s
*
**
Abbildung 15: Vitriplug; (*: Ansicht von der Seite, **: Ansicht von oben)
70
Material und Methoden
3.4. Auftauen der Embryonen durch Gynemed VitriThaw Medien
Für den Auftauschritt der Vitrifikationsmethode 1 wurden ebenfalls Medien der Firma
Gynemed verwendet, deren Zusammensetzung in Tabelle 20 dargestellt ist. Die
Verteilung der Medien, nach deren Erwärmung auf 37°C im Wärmeschrank, erfolgte
analog zu den Einfriermedien in die Vertiefungen eines Four-well-dishes (Tab. 21).
Es handelt sich ebenfalls um eine Verdünnungsreihe, bei der den Medien immer
geringere Mengen an Saccharose zugesetzt sind.
Tabelle 20: Zusammensetzung der Gynemed VitriThaw Medien
Medium
Zusammensetzung
Warming Medium 1
DMSO; EG; Ficoll; HSA; 0,5 M Saccharose
Warming Medium 2
DMSO; EG; Ficoll; HSA; 0,25 M Saccharose
Warming Medium 3 DMSO; EG; Ficoll; HSA; 0,125 M Saccharose
PBS, HSA
Warming Medium 4
Die Lagerzeit der Blastozysten im Stickstoffcontainer betrug mindestens sechs Tage
und maximal einen Monat. Zunächst wurden die Vitriplugs unter ständigem
Stickstoffkontakt aus dem Container in einen Styroporbehälter, der ebenfalls mit
flüssigem Stickstoff gefüllt war, überführt. In diesem erfolgte daraufhin die Entfernung
des Straws vom Vitriplug mittels Arterienklemmen. Zum Auftauen wurde der Vitriplug
aus dem Stickstoff genommen und direkt unter stereomikroskopischer Kontrolle in
das Warming Medium 1 gehalten. Nach dem Aufsuchen der Blastozysten erfolgte ein
mehrmaliges Auf- und Abpipettieren im Medium mittels eines Strippers und einer
Kapillare mit 275 µm Durchmesser, um die Medien gut zu vermischen. Die
Äquilibrierungszeit im ersten Medium betrug 3 Minuten. Anschließend wurden die
Blastozysten wie folgt durch die weiteren Medien pipettiert:
71
Material und Methoden



2 min im Warming Medium 2
2 min im Warming Medium 3
2 min im Warming Medium 3
Eine Übersicht des gesamten Auftauprotokolls ist in Tabelle 21 dargestellt:
Tabelle 21: Auftauprotokoll durch Gynemed VitriThaw Medien
Well 1
Well 2
Well 3
Well 4
Medium
Warming
Medium 1
Warming
Medium 2
Warming
Medium 3
Warming
Medium 4
Menge
1 ml
300 µl
300 µl
300 µl
Dauer
3 min
2 min
2 min
2 min
Nach Ablauf der letzten zwei Minuten wurden die Blastozysten zunächst wieder in
2 ml 37°C warmem TCM-air gesammelt. Um die Reexpansions- und die Schlupfrate
beurteilen zu können, mussten die Blastozysten erneut in Kulturmedium überführt
werden. Dazu wurden sie in Gruppen zu 5-7 Blastozysten zunächst dreimalig durch
Waschtropfen bestehend aus SOF (aa) pipettiert und dann in 30 μl Tropfen SOF (aa)
für 48 Stunden bei 39°C, feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre, 5% CO2 und 5% O2
im Wärmeschrank kultiviert.
3.5. Vitrifikation durch Origio MediCult Vitrification Cooling Medien
Für die Vitrifikationsmethode durch Medien, die kein DMSO als Kryoprotektiva
enthielten, wurde ein Kit der Firma Origio (Berlin, Deutschland) verwendet. Die
Vitrifikationsmethode wird im weiteren Verlauf auch als Vitrifikationsmethode 2 (V2)
bezeichnet.
Das
Kit
bestand
aus
einem
Äquilibrierungs-
sowie
einem
Vitrifikationsmedium, welche als Kryoprotektiva Ethylenglycol, Propylenglycol und
Saccharose enthielten. Des Weiteren war humanes Serumalbumin zugesetzt
(Tab. 22). Als Trägersystem wurde zur besseren Vergleichbarkeit ebenfalls ein
72
Material und Methoden
Vitriplug mit Straw benutzt. Nach einer Aufwärmphase im Wärmeschrank bei 37°C
kamen die Medien analog zur Vitrifikationsmethode 1 in jeweils eine Vertiefung eines
4-well-dishes (Tab. 22). Zunächst wurden 1-2 Blastozysten aus dem TCM-air in das
Äquilibrationsmedium
überführt
und
für 5
Minuten
darin
belassen.
Durch
stereomikroskopische Kontrolle konnte beobachtet werden, wie die Blastozysten
zunächst schrumpften und nach einer kurzen Zeit wieder reexpandierten. Die
Reexpansion zeigte eine erfolgreiche Äquilibrierung der Blastozysten an das Medium
an. Anschließend wurden die Blastozysten in das Vitrifikationsmedium überführt,
wobei die maximale Kontaktzeit mit dem Vitrifikationsmedium eine Minute betrug.
Innerhalb dieser Zeit wurden die Blastozysten mit möglichst wenig Flüssigkeit auf die
Spitze eines Vitriplugs pipettiert und in den flüssigen Stickstoff überführt.
Tabelle 22: Zusammensetzung und Einfrierprotokoll durch Origio MediCult Vitrification Cooling
Medien
Well 1
Well 2
Medium
Equilibration Medium
Vitrifikation Medium
Zusammensetzung
HSA, EG, PG
HSA, EG, PG, Saccharose
Menge
250 µl
250 µl
Dauer
5 min
1 min
Im flüssigen Stickstoff erfolgte analog zu 3.3 das Einführen des Vitriplugs in den
Straw mittels Arterienklemmen. Die Vitriplugs wurden in einem Stickstoffcontainer für
mindestens sechs Tage gelagert.
3.6. Auftauen der Embryonen durch Origio MediCult Vitrification Warming
Medien
Der Auftauprozess erfolgte ebenfalls durch ein kommerziell erhältliches Kit der Firma
Origio. Die Medien enthielten HSA und, mit Ausnahme vom Washing Medium,
73
Material und Methoden
Saccharose in absteigenden Konzentrationen. Zunächst wurden die Vitriplugs unter
ständigem Stickstoffkontakt in einen Styroporbehälter überführt, in welchem mittels
Arterienklemmen der Straw vom Vitriplug entfernt wurde. Die auf 37°C vorgewärmten
Auftaumedien befanden sich in den Vertiefungen von zwei Four-well-dishes
(Tab. 23). Die weitere Behandlung der vitrifizierten Blastozysten erfolgte ab hier
analog zu 3.4. Die jeweiligen Äquilibrierungszeiten sind in Tabelle 7 dargestellt. Nach
dem Durchlaufen der fünf Auftauschritte wurden die Blastozysten in 2 ml 37°C
warmem TCM-air gesammelt.
Tabelle 23: Auftauprotokoll durch Origio MediCult Vitrification Warming Medien
Well 1
Well 2
Well 3
Well 4
Well 5
Medium
Warming
Medium
Dilution
Medium 1
Dilution
Medium 2
Washing
Medium
Washing
Medium
Menge
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
Dauer
3 min
3 min
3 min
3 min
3 min
Zur Ermittlung der Reexpansions- und Schlupfrate erfolgte die Kultivierung der
aufgetauten Blastozysten für 48 h in Gruppen zu 5-7 Blastozysten in einer
SOF(aa)-Kultur (siehe 3.4)
3.7. Kontrollen
Um den Einfluss der Vitrifikations- und Auftaumedien auf die Qualität der
Blastozysten beurteilen zu können, wurden verschiedene Kontrollen durchgeführt.
Als Standard (K) für die Qualitätsanalysen, die Lebens-Tot-Färbung und die
RT-qPCR, dienten nicht vitrifizierte, an Tag 7 oder 8 geschlüpfte Blastozysten aus
dem SOF(aa)-Kultursystem, die nicht in Kontakt mit den Vitrifikationsmedien kamen.
74
Material und Methoden
3.7.1. Kontrolle des Einflusses der Vitrifikations- und Auftaumedien
Zur Kontrolle der Einflussfaktoren der Medien auf die Qualität der expandierten
Blastozysten wurden diese zwei weiteren Kontrollgruppen zugeordnet. Die
Embryonen dieser Kontrollgruppen kamen in Kontakt mit den jeweiligen Einfrierrespektive Auftaumedien der Vitrifikationsmethode 1 bzw. 2 ohne tatsächlich
kryokonserviert worden zu sein (KV1 – Kontakt zu den Medien mit DMSO, KV2 –
Kontakt zu den Medien ohne DMSO). Der Medienkontakt erfolgte nach den gleichen
Protokollen wie die jeweiligen Vitrifikationsmethoden. Nach dem Durchlaufen aller
Pipettierschritte wurden sie, genau wie die vitrifizierten Blastozysten, in SOFaa
Kulturmedium verbracht und für 48 Stunden darin belassen.
3.8. Qualitätskontrollen nach dem Auftauen
3.8.1. Reexpansions- und Schlupfrate
Vierundzwanzig Stunden nach dem Auftauen, bzw. im Falle der Kontrollgruppen
24 Stunden nach dem Medienkontakt wurde unter dem Stereomikroskop die
Reexpansionsrate der Blastozysten beurteilt. Eine weitere Manipulation fand zu
diesem Zeitpunkt nicht statt und die Blastozysten kamen für weitere 24 Stunden in
den Brutschrank. Nach 48 Stunden fand die Beurteilung der Schlupfrate der
Blastozysten statt.
3.8.2. Lebend-Tot-Färbung
Die für die Färbung genutzten Fluoreszenzfarbstoffe waren zum einen Ethidium
homodimer (Abb. 16; Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), welches nicht in der
Lage ist, intakte Zellmembranen zu überwinden und somit nur Zellen anfärbt, deren
Membranintegrität durch vorherigen Zelltod zerstört wurde. Zum anderen wurde
Bisbenzimid (Abb. 17; Hoechst 33342, Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland)
benutzt. Dieser Farbstoff ist in der Lage intakte Zellwände zu überwinden, wodurch
alle Zellen angefärbt werden.
75
Material und Methoden
Abbildung 16: Ethidium homodimer
Abbildung 17: Hoechst 33342
Um die Gebrauchslösungen für die Färbung zu erhalten, wurden zunächst von
beiden Farbstoffen Stocklösungen hergestellt (Tab. 24), welche aliquotiert und bei
-20°C im Gefrierfach aufbewahrt wurden.
76
Material und Methoden
Tabelle 24: Ethidium homodimer-Stocklösung, Hoechst-33342 Stocklösung
Inhaltsstoffe
Ethidium-homodimer
Stocklösung
Bisbenzimid
Stocklösung
Ethidium
homodimer
1 mg
-
Hoechst 33342
-
2 mg
aqua bidest.
1000 μl
1000 μl
Aliquote zu
25 μl
10 μl
Konzentration
0,1%
0,2%
Für die Erzeugung der Ethidium-homodimer-Gebrauchslösung wurde zunächst ein
Aliquot Ethidium-homodimer-Stocklösung aufgetaut und 225 μl PVA/PBS-Lösung
zugegeben, wodurch eine Endkonzentration von 0.01% entstand. Für die
Bisbenzimid-Gebrauchslösung
wurde
PVA/PBS-Lösung
und
vorgelegt
Bisbenzimid-Stocklösung
zugegeben.
in
2 μl
Die
einer
der
35 mm
ebenfalls
Petrischale
zuvor
Endkonzentration
1998 μl
aufgetauten
betrug
0,002%
Bisbenzimid. Des Weiteren benötigte Materialien waren: ca. 2 ml PVA/PBS-Lösung,
ein Styropordeckel, ein Stripper mit einer 275 μm Stripperspitze, Objektträger,
Deckgläschen, eine Stoppuhr, Vaseline und 2 Kanülen. Die Vaseline und die
PVA/PBS-Lösung mussten zunächst im Wärmeschrank auf 37°C erwärmt werden.
Die
Ethidium
homodimer-Gebrauchslösung
und
die
Hoechst
33342-
Gebrauchslösung wurden jeweils in einer 35 mm Petrischale auf der Wärmeplatte
unter einem Styropordeckel bei Lichtausschluss aufbewahrt. Vor dem Überführen der
geschlüpften
Blastozysten
aus
dem
TCMair
in
Ethidium-homodimer-
Gebrauchslösung erfolgte ein Waschschritt durch drei Tropfen PVA/PBS-Lösung.
Während die Embryonen für 15 Minuten in dem ersten Farbstoff verblieben, wurden
die Objektträger vorbereitet. Die auf den Objektträger aufgebrachten Vaselinetropfen
dienten dabei als Abstandshalter für das Deckgläschen. Nach Ablauf der 15 Minuten
wurden die Blastozysten erneut durch 3 Tropfen PVA/PBS-Lösung pipettiert, um die
Ethidium homodimer-Gebrauchslösung zu entfernen, in die Hoechst 33342Gebrauchslösung überführt und für weitere drei Minuten inkubiert. Nach Ablauf der
77
Material und Methoden
drei Minuten erfolgte ein letzter Waschschritt in drei Tropfen PVA/PBS-Lösung.
Danach wurden die Blastozysten einzeln mit genügend Flüssigkeit auf die
vorbereiteten Objektträger pipettiert und vorsichtig unter mikroskopischer Kontrolle
mithilfe von zwei Kanülen unter dem Deckgläschen gequetscht, um die einzelnen
Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop in einer Ebene betrachten zu können. Es
folgte die Ermittlung der Gesamtzellzahl sowie die Differenzierung zwischen
lebenden und toten Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 20-40facher
Vergrößerung.
3.8.3. mRNA-Analyse
Die Untersuchung der entwicklungsrelevanten Gentranskripte mittels RT-qPCR
erfolgte an geschlüpften Blastozysten aus den beiden Vitrifikationversuchen (V1, V2)
sowie aus den drei Kontrollgruppen (K, KV1, KV2). Die Blastozysten wurden zuvor
unter mikroskopischer Kontrolle dreimalig durch PVA-Waschtropfen pipettiert und in
möglichst
wenig
PVA-Medium
bei
-80°C
in
silikonisierten
Eppendorf-Cups
eingefrorenen. Die zu untersuchenden entwicklungsrelevanten Gentranskripte waren
SLC2A1, TJP1, IFNT2, HSPA1A, DSC2 und PTGS2. In Tabelle 25 sind die
verwendeten Primersequenzen für die PCR aufgelistet.
78
Material und Methoden
SCL2A1
TJP1
IFNT2
HSPA1A
DSC2
PTGS2
Globin
forward
CAGGAGATGAAGGAGGAGAGC
reverse
CACAAATAGCGACACGACAGT
forward
CGACCAGATCCTCAGGGTAA
reverse
GAATCACCCACATCGGATTC
forward
TCTCTACTGATGGCCCTGGT
reverse
GATCCTTCTGGAGCTGGTTG
forward
GGGGAGGACTTCGACAACAGG
reverse
CGGAACAGGTCGGAGCACAGC
forward
GGCAGCACGTCTCTCCTACT
reverse
GATGGCCCACTTTCCAAGTA
forward
CCAGACAAGCAGGCTAATCC
reverse
GAAAGACGTCAGGCAGAAGG
forward
GCAGCCACGGTGGCGAGTAT
reverse
GTGGGACAGGAGCTTGAAAT
256
162
203
245
199
200
257
894
1151
40
201
95
302
844
1088
1744
1942
1054
1253
241
555
Accession Number
Startposition
des Primers
Transkript
Sequenz (5‘-3‘)
Amplifikatgröße
(bp)
Tabelle 25: Primersequenzen der verwendeten Primer
M60448
AJ313183
NM_001015511
NM_174550
M81190
AF031698
X04751
3.8.3.1. Vorbereitung der Dynabeads-Suspension
Zur Isolierung der mRNA aus den geschlüpften Blastozysten musste zunächst die
Dynabeads-Suspension aus dem verwendeten Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro
Kit
(Fa.
Invitrogen,
Karlsruhe,
Deutschland)
vorbereitet
werden.
Die
Dynabeads-Suspension wurde zunächst auf einem Vortexer homogenisiert, jeweils
79
Material und Methoden
10 µl pro zu untersuchender Probe entnommen und in ein Eppendorf-Gefäß
überführt. Um die Dynabeads von der Flüssigkeit zu separieren, kamen die
Eppendorf-Gefäße auf einen Magnetic Particle Concentrator (MPC). Durch die
magnetische Wirkung wurden die Dynabeads an den Rand des Eppendorf-Gefäßes
gezogen, wodurch der Puffer-Überstand einfacher abgenommen werden konnte. Es
erfolgte eine Resuspension der Dynabeads durch 10 µl Lysis/Binding Puffer pro zu
untersuchender Probe und eine erneute Abnahme des Überstandes auf dem MPC.
Nach einem weiteren Waschschritt mit Lysis/Binding Puffer waren die Dynabeads für
die Isolierung der mRNA vorbereitet.
3.8.3.2. Isolierung der mRNA aus den geschlüpften Blastozysten
Zu jeder Probe wurden zunächst 150 µl des im Kit enthaltenen Lysis/Binding-Puffers
sowie 1 µl Kaninchen-Globin-mRNA in einer Konzentration von 1pg/ µl zugegeben.
Die Kaninchen-Globin-mRNA diente als externer Standard. Anschließend wurden die
Proben für 10 Sekunden gevortext, kurz zentrifugiert und für 10 Minuten zum
Inkubieren bei Raumtemperatur stehen gelassen. Darauf folgte die Zugabe von 10 µl
der vorbereiteten Dynabeads-Suspension pro Probe und eine erneute Inkubation für
fünf Minuten in einem Thermoblock bei 20°C unter leichter Bewegung. In dieser Zeit
fand die Bindung der Dynabeads an den PolyA-Schwanz der mRNA statt. Nach
Ablauf der Inkubationszeit wurden die Proben erneut in den MPC verbracht und der
Überstand entfernt. Es folgten mehrere Waschschritte. Zunächst wurden die Proben
durch Zugabe von 100 µl Washing Buffer A resuspendiert, der Überstand erneut im
MPC abgenommen und dreimalig mit jeweils 100 µl Washing Buffer B resuspendiert.
Nach dem letzen Waschschritt wurde der Überstand erneut abgenommen, die
Proben mit 11 µl H2O (Ampuwa, Fresenius) versetzt und zur Lösung der mRNA von
den Dynabeads für drei Minuten in einen Thermomixer (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei
65°C verbracht. Anschließend wurde der MPC auf Eis gestellt. Der Überstand
enthielt die isolierte mRNA, die direkt für die Reverse Transkription weiter verwendet
wurde.
80
Material und Methoden
3.8.3.3. Reverse Transkription
Die Reverse Transkription der mRNA zu cDNA fand in fünf Ansätzen statt (Tab. 26):
Die Probe mit der geschlüpften Blastozyste (Probe), eine Positivkontrolle für Globin
(Globin-Standard), eine Negativ-Kontrolle der Probe ohne den Zusatz einer
Reversen Transkriptase und eines RNAse Inhibitors
(Negativ-Probe), eine
Negativ-Kontrolle des Standards ebenfalls ohne den Zusatz einer Reversen
Transkriptase
und
eines
RNAse
Inhibitors
(Negativ-Standard)
sowie
eine
Medien-Kontrolle in der anstatt eines mRNA-Zusatzes nur steriles Wasser beigefügt
wurde. Diese diente dazu eine Kontamination der Medien auszuschließen.
Zusatz
Konzentration
Endkonzentration
Probe
Globin-Standard
Negativ-Standard
Negativ-Probe
Medien-Kontrolle
Tabelle 26: Ansätze für dir Reverse Transkription (Endvolumen der Ansätze 20 µl)
MgCl2
50 mM
5 mM
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
PCR-Puffer
10x
1x
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
dNTPs
10 mM
1 mM
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
Hexamer Primer
50 mM
2,5 µM
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
RNAse Inhibitor
20 IE/µl
20 U
1 µl
1 µl
-
-
1 µl
MuLV RT
50 IE/µl
50 U
1 µl
1 µl
-
-
1 µl
mRNA Globin
1 pg/µl
-
1 µl
1 µl
-
-
10,7 µl
-
-
0,3 µl
-
mRNA Probe
H2O ad 20 µl
81
Material und Methoden
Bei der Herstellung der verschiedenen Ansätze wurden die Proben durchgängig auf
Eis gelagert. Die Reverse Transkription fand in einem PCR-Cycler (Fa. Biometra,
Göttingen) statt, dabei durchliefen die Proben das unten aufgeführte 75minütige
Programm, währenddessen die mRNA in cDNA umgeschrieben wurde.



10 Minuten bei 25°C
60 Minuten bei 42°C
5 Minuten bei 99°C
Im Anschluss an die Reverse Transkription wurden die Proben direkt auf Eis gelagert
und der PCR zugeführt. Der Transport und die Lagerung der Proben zwischen den
einzelnen Schritten fanden ebenfalls immer auf Eis statt.
3.8.3.4. Polymerase-Kettenreaktion
Für die Quantifizierung der Intensität der Expression entwicklungsrelevanter
Gentranskripte ging die zuvor erhaltene cDNA in die real time PCR (qPCR) ein. Die
bei der PCR verwendeten Embryonenäquivalente variierten je nach untersuchtem
Gen. Sie sind in Tabelle 27 ersichtlich. Die PCR wurde im doppelten Ansatz
durchgeführt.
82
Material und Methoden
Tabelle 27: Eingesetzte Embryonenäquivalente der zu untersuchenden Gentranskripte
Gen
Embryonenäquivalent
(einfacher Ansatz)
Embryonenäquivalent
(doppelter Ansatz)
Globin
(Embryo)
0,05
0,1
SLC2A1
0,1
0,2
TJP1
0,025
0,05
IFNT2
0,05
0,1
HSPA1A
0,05
0,1
DSC2
0,025
0,05
PTGS2
0,0125
0,025
Die real time PCR wurde mit einem Endvolumen von 20 μl
durchgeführt. Die
Ansätze für die PCR sind in Tabelle 28 ersichtlich. Der kommerziell erhältliche
„Mesa Green qPCR MasterMix Plus for SYBR Assay w/ fluorescin“ (MasterMix PCR,
Fa. Eurogentec, Köln) enthielt: Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), Meteor
Taq Polymerase, MgCl2, SYBR Green I, Stabilisatoren und Fluoreszin. Für die
Untersuchung jedes Gens wurden mindestens 5 Wiederholungen durchgeführt.
Tabelle 28: Ansätze für die Real-Time PCR
Medium
Medium Endkonzentration Einfacher Ansatz
MasterMix PCR
1,0
10 μl
Primer forward
0,2 μM
0,4 μl
Primer reward
0,2 μM
0,4 μl
cDNA
0,25-2 μl
H2O
ad 20 μl
Die Proben wurden nach ihrer Bearbeitung direkt der qPCR zugeführt. Dabei startete
das Programm zunächst mit einer zehnminütigen Denaturierungsphase bei 95°C.
83
Material und Methoden
Darauf folgten 43 Zyklen in denen die cDNA vervielfacht wurde. Das Programm
durchlief dabei in jedem Zyklus die folgenden Schritte:



15 Sekunden bei 95°C (Trennung der doppelsträngigen DNA)
30 Sekunden bei 60°C (Anlagerung der Primer)
30 Sekunden bei 70°C (Amplifikation)
Die Quantifizierung der erhaltenen cDNA fand über eine kontinuierliche Messung der
Fluoreszenz statt. Dabei wurde die Fluoreszenz des Farbstoff-DNA-Komplexes aus
dem enthaltenen SYBR-green-Fluorenzenz-Farbstoff und der doppelsträngigen DNA
gemessen. Die Verifikation der PCR-Fragmente erfolgte durch eine Schmelzkurve
mit schrittweiser Erhöhung der Temperatur um 0,5°C alle 10 Sekunden beginnend
bei 55°C mit einer Endtemperatur von 95°C.
3.9. Statistische Analysen
Die statistische Analyse fand mittels SigmaStat 2.0 Software (Fa. Jandel Scientific,
San
Rafael,
CA,
USA)
statt.
Dabei
wurden
zunächst
durch
einen
Kolmogorov-Smirnov Test alle Daten eines Gens auf eine Normalverteilung getestet.
Die Berechnung der Reexpansions- und Schlupfraten der Gruppen V1, V2 KV1 und
KV2 erfolgte durch eine One Way ANOVA (Analysis of Variance, Varianzanalyse) mit
anschließendem Tukey Test. Im Anschluss daran wurde eine Two Way ANOVA mit
den Faktoren Vitrifikation der Blastozysten und Medien mit/ohne DMSO mit
anschließendem Holm-Sidak-Test durchgeführt.
Die Ermittlung der Gesamtzellzahl sowie der Anzahl der toten Zellen pro Embryo und
der Lebend-Tot-Zellratio erfolgte mittels One Way ANOVA und im Falle der
Lebend-Tot-Zellratio mittels anschließendem Tukey Test und t-Test.
Für die Auswertung der RT-qPCR wurde ebenfalls eine Varianzanalyse durch eine
One Way ANOVA und einen Tukey Test durchgeführt. Unterschiede von P ≤ 0,05
wurden als statistisch signifikant angesehen.
84
Material und Methoden
3.10. Allgemeiner Versuchsaufbau
In-vitro-Produktion
Expandierte Blastozysten
V1
KV1
V2
KV2
Beurteilung der Reexpansions- und Schlupfrate
K
Kultivierung bis
zum Schlupf
Geschlüpfte Blastozysten aus allen Gruppen
mRNA-Analyse
Lebend-Tot-Färbung
Abbildung 18: Schematischer Überblick über den Versuchsaufbau
85
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1. Ergebnisse der In-vitro-Produktion
Die In-vitro-Produktion boviner Embryonen erfolgte ein- bis zweimal wöchentlich aus
Ovarien frisch geschlachteter Rinder. In 26 IVP-Sitzungen wurden insgesamt
4902 Eizellen gewonnen, welche in vitro gereift und fertilisiert wurden und in die
Kultur eingingen. Insgesamt teilten sich 2990 der vermeintlichen Zygoten, was eine
Teilungsrate von durchschnittlich 61,1 ± 6,2% ergab. Bis zum Tag 7 nach der
Fertilisation entwickelten sich 906, an Tag 8 1275 Zygoten zu Morulae und
Blastozysten. Dies entsprach einer Entwicklungsrate von durchschnittlich 18,6 ±
4,8% an Tag 7 und 25,9 ± 6,1% an Tag 8. Die Teilungs- und Entwicklungsraten sind
in Tabelle 29 aufgeführt.
Tabelle 29: Anzahl Eizellen, Teilungs- und Entwicklungsraten (MW ± STABW)
Anzahl [n]
Raten [%]
(MW ± STABW)
Eizellen in der IVC
4902
Teilungsrate
2990
61,1 ± 6,2
Entwicklungsrate Tag 7
906
18,6 ± 4,8
Entwicklungsrate Tag 8
1275
25,9 ± 6,1
Von den an Tag 7 im Stadium der expandierten Blastozyste befindlichen Embryonen
gingen 142 in die Vitrifikationsmethode 1, bei der unter anderem DMSO als
Kryoprotektivum verwendet wurde (V1), und 151 in die Vitrifikationsmethode 2, bei
der kein DMSO als Kryoprotektivum zum Einsatz kam, ein. Des Weiteren wurden
107
an
Tag
sieben
expandierte
Blastozysten
der
Kontrollgruppe
der
Vitrifikationmethode 1 und 97 der Kontrollgruppe der Vitrifikationsmethode 2
zugeordnet. Einundvierzig Embryonen wurden, nachdem sie bis zum Schlupf weiter
kultiviert worden waren, im Stadium der geschlüpften Blastozyste ohne weitere
Manipulation als Standard für die RT-qPCR und die Lebend-Tot-Färbung verwendet.
86
Ergebnisse
Tabelle 30 zeigt die Verteilung der expandierten und geschlüpften Blastozysten auf
die Versuchsgruppen.
Tabelle 30: Blastozystenverteilung der einzelnen Gruppen
Gruppe
Anzahl verwendeter Blastozysten
Vitrifikation 1
142 exp. Blastozysten
Vitrifikation 2
151 exp. Blastozysten
Kontrolle Vitrifikation 1
107 exp. Blastozysten
Kontrolle Vitrifikation 2
97 exp. Blastozysten
Kontrolle
41 geschl. Blastozysten
4.2. Morphologische Qualitätsbestimmungen
4.2.1. Reexpansions- und Schlupfraten
In
insgesamt
11
Durchgängen
wurden
142
Blastozysten
durch
die
Vitrifikationsmethode 1 eingefroren, nach mindestens 6 Tagen Lagerzeit in flüssigem
Stickstoff wieder aufgetaut und in SOFaa-Medium verbracht. Von diesen waren nach
24 Stunden 126 reexpandiert und nach weiteren 24 Stunden 90 geschlüpft. Zwanzig
der geschlüpften Embryonen wurden für die RT-qPCR in Eppendorf-Cups bei -80°C
gelagert, 25 gingen in die Lebend-Tot-Färbung ein. Des Weiteren wurden in
insgesamt 12 Durchgängen 151 an Tag 7 expandierte Blastozysten durch die
Vitrifikationsmethode 2 eingefroren, wieder aufgetaut und kultiviert. Nach 24 Stunden
waren insgesamt 108 Embryonen reexpandiert und nach 48 Stunden 48 Embryonen
geschlüpft. Dreiundzwanzig der geschlüpften Embryonen wurden für die RT-qPCR
gelagert und 20 der Lebend-Tot-Färbung zugeführt.
Für die Kontrollen der Vitrifikationsmethoden wurden die expandierten Blastozysten
durch die entsprechenden Medienreihen pipettiert, ohne dass sie in Kontakt mit dem
flüssigen Stickstoff kamen. Hierfür gelangten in 7 Sitzungen insgesamt 107
Embryonen in die Kontrollgruppe der Vitrifikationsmethode 1. Von diesen 107
87
Ergebnisse
Embryonen reexpandierten 96 nach 24 Stunden und 77 schlüpften nach weiteren 24
Stunden von denen 25 in die Färbung eingingen und 16 für die RT-qPCR gelagert
wurden. Siebenundneunzig expandierte Blastozysten gelangten in insgesamt 9
Sitzungen
in
die
Kontrollgruppe
der
Vitrifikationsmethode
2.
Von
diesen
reexpandierten 87 Embryonen nach 24 Stunden und 48 schlüpften nach 48 Stunden.
Dreizehn der geschlüpften Embryonen wurden für die RT-qPCR gelagert und 25
gingen in die Färbung ein. Eine Übersicht über die Reexpansions- und Schlupfraten
ist in Tabelle 31 und in Abbildung 19 dargestellt. Beim Vergleich der
Reexpansionsraten konnte eine statistisch signifikant niedrigere Rate bei der
Vitrifikationsgruppe 2 im Gegensatz zu den anderen Versuchsgruppen, festgestellt
werden. Ebenso unterschied sich die Schlupfrate der V2 signifikant von denen der
anderen Gruppen. Des Weiteren konnte ein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen den Schlupfraten der KV2-Gruppe zur V2- und KV1-Gruppe festgestellt
werden.
Tabelle 31: Reexpansions- und Schlupfraten der Embryonen nach Vitrifikation (V1,V2) und Kontrolle
[(KV1, KV2);(MW ± STABW innerhalb der Spalten: a:b:c P≤ 0,05)]
Gruppe
Reexpansionsrate [%] Schlupfrate [%]
(MW ± STABW)
(MW ± STABW)
V1 (n = 142)
89,2 ± 5,3a
62,9 ± 12,2ac
KV1 (n = 107)
90,0 ± 8,2a
69,2 ± 12,0a
V2 (n = 151)
67,0 ± 15,5b
29,4 ± 14,5b
KV2 (n = 97)
90,0 ± 15,4a
47,9 ± 17,8c
88
Ergebnisse
a
a
a
b
a
ac
c
b
Abbildung 19: Reexpansions- und Schlupfraten der Embryonen nach Vitrifikation (V1,V2) und
Kontrolle [(KV1, KV2);(MW ± STABW: a:b:c P≤ 0,05)]
4.2.2. Ergebnisse der Zellzahlzählung
Die Zellzahlzählung nach Färbung mit den Fluoreszenzfarbstoffen Ethidium
homodimer und Hoechst 33342 ergab für die Embryonen der V1-Gruppe (n=25; Abb.
22 a) eine mittlere Gesamtzellzahl von 119,8 ± 5,8 Zellen/Blastozyste. Die Anzahl
toter Zellen lag bei durchschnittlich 10,4 ± 1,2 Zellen/Blastozyste. In den Embryonen
der V2-Gruppe (n=20; Abb. 22 c) lag die durchschnittliche Gesamtzellzahl bei 123,5
± 4,0 Zellen/Blastozyste und die Anzahl toter Zellen, welche sich rot darstellten, bei
15,4 ± 1,0 Zellen/Blastozyste.
In den Embryonen der Kontrollgruppe (n=24; Abb. 22 e), die bis zum Schlupf
ausschließlich im SOFaa-Kultursystem kultiviert wurden, betrug die durchschnittliche
Gesamtzellzahl nach Färbung 116,7 ± 4,8 Zellen/Blastozyste und 8,1 ± 0,8 tote
Zellen/Blastozyste. In den Embryonen der KV1-Gruppe (n=25; Abb. 22 b) betrug die
89
Ergebnisse
mittlere Zellzahl 120,6 ± 4,8 Zellen/Blastozyste und 9,5 ± 1,0 tote Zellen/Blastozyste
und in denen der KV2-Gruppe (n=25; Abb. 22 d) 119,0 ± 5,0 Zellen/Blastozyste und
9,2 ± 0,6 tote Zellen/Blastozyste. Eine Übersicht der Zellzahlen sowie der LebendTot-Zellratio sind in Tabelle 32, Abbildung 20 und Abbildung 21 dargestellt. Bei der
Gesamtzellzahl der gefärbten Blastozysten der einzelnen Gruppen konnten keine
statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt werden, jedoch war die Lebend-TotZellratio der V2-Gruppe signifikant höher als die der anderen Versuchsgruppen. Die
Einzeldaten der Zellfärbungen sind dem Anhang zu entnehmen.
Tabelle 32: Gesamtzellzahl, Anzahl lebender und toter Zellen sowie Lebend-Tot-Zellratio in den
Embryonen der verschiedenen Versuchsgruppen (MW ± SEM innerhalb der Spalten: a:b P≤ 0,05)
Gruppe
Gesamtzellzahl
(MW ± SEM)
Tote Zellen
(MW ± SEM)
Lebend-Tot-Zellratio
(MW ± SEM)
V1 (n = 25)
119,8 ± 5,8
10,4 ± 1,2
12,5 ± 0,9a
KV1 (n = 25)
120,6 ± 4,8
9,5 ± 1,0
15,6 ± 2,1a
V2 (n = 20)
123,5 ± 4,0
15,4 ± 1,0
7,8 ± 0,8b
KV2 (n = 25)
119,0 ± 5,0
9,2 ± 0,6
13,1 ± 1,0a
K (n= 24)
116,7 ± 4,8
8,1 ± 0,8
17,0 ± 2,0a
90
Ergebnisse
Abbildung 10: Gesamtzellzahl und Anzahl toter Zellen der Blastozysten der verschiedenen
Versuchsgruppen
a
a
a
a
b
Abbildung 21: Lebend-Tot-Zellratio in den verschiedenen Versuchsgruppen
(MW ± SEM: a:b P≤ 0,05)
91
Ergebnisse
Abbildung 22: Geschlüpfte Blastozysten nach Zellfärbung mittels Ethidium homodimer und
Hoechst-33342 der Gruppen a) V1, b) KV1, c) V2, d) KV2 und e) K
92
Ergebnisse
4.3. Analyse der Genexpression
Zur Analyse der Genexpression entwicklungsrelevanter Gentranskripte wurde eine
RT-qPCR durchgeführt. Die Quantifizierung der cDNA fand über eine kontinuierliche
Messung der Fluoreszenz bei der qPCR statt. Die Verifizierung der PCR-Fragmente
erfolgte durch eine Schmelzkurve mit schrittweiser Erhöhung der Temperatur um
0,5°C
alle
10
Gentranskripte:
Sekunden.
ein
Analysiert
wurden
Glukosetransporter
die
folgenden
(SLC2A1),
zwei
spezifischen
Zell-Zell-
Verbindungsproteine (TJP1, DSC2), ein Protein zur maternalen Erkennung der
Trächtigkeit (INFT2), ein Stressindikatorprotein (HSPA1A) sowie ein Enzym zur
Prostaglandinsynthese (PTGS2). Es konnten statistisch signifikante Unterschiede für
die Expression von SLC2A1, TJP1, DSC2 und HSPA1A gefunden werden. Bei der
Expression von IFNT2 und PTGS2 waren keine signifikanten Unterschiede zu
erkennen.
4.3.1. Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1)
Bei der Expression der relativen Transkriptmenge für den Glukosetransporter Typ 1
konnten statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Embryonen der V1Gruppe und denen der KV1- und Kontrollgruppe festgestellt werden. Die Embryonen
der V1-Gruppe exprimierten signifikant weniger SLC2A1 als die der KV1 und die der
Kontrollgruppe. Wie in Abbildung 23 ersichtlich, konnten zwischen den Embryonen
der beiden Vitrifikationsgruppen genauso wie zwischen denen der V1- und der KV2Gruppe und zwischen denen der drei Kontrollgruppen untereinander keine statistisch
signifikanten Unterschiede festgestellt werden.
93
Ergebnisse
a
a
ab
ab
b
Abbildung 23: Relative Transkriptmenge von SLC2A1 in präimplantatorischen Embryonen der
verschiedenen Versuchsgruppen (MW ± SEM: a:b < 0,05)
4.3.2. Zona occludens-Protein 1 (TJP1)
a*
ab
ab*
b
b
Abbildung 24: Relative Transkriptmenge von TJP1 in präimplantatorischen Embryonen der
verschiedenen Versuchsgruppen (MW ± SEM: P a:b < 0,05, P * < 0,1)
94
Ergebnisse
Bei der Expression der relativen Transkriptmenge von TJP1 zeigte sich ein statistisch
signifikanter Unterschied sowohl zwischen den Embryonen der V1-Gruppe und
denen der Kontrollgruppe als auch zwischen den Embryonen der KV2-Gruppe und
denen der Kontrollgruppe (Abb. 24). Die Embryonen beider Gruppen, der V1- und
der Kontrollgruppe, exprimierten signifikant weniger TJP1 als die Embryonen der
Kontrollgruppe. Des Weiteren konnte zwischen den Embryonen der V2-Gruppe und
denen der Kontrollgruppe ein statistisch tendenzieller Unterschied festgestellt
werden. Auch hier exprimierten die Embryonen der V2-Gruppe tendenziell weniger
TJP1 als die der Kontrollgruppe. Bei den Blastozysten der KV1- Gruppe war kein
statistisch signifikanter Unterschied zu denen der anderen Gruppen festzustellen.
4.3.3. Interferon  (IFNT2)
Für die relative Transkriptmenge von IFNT2 konnte zwischen den Embryonen der
einzelnen Versuchsgruppen keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt
werden (Abb. 25).
Abbildung 25: Relative Transkriptmenge von IFNT2 in präimplantatorischen Embryonen der
verschiedenen Versuchsgruppen
95
Ergebnisse
4.3.4. Hitzeschockprotein 70 (HSPA1A)
Für HSPA1A war für die Embryonen der V1-Gruppe eine statistisch signifikant
niedrigere relative Transkriptmenge im Vergleich zu den Embryonen der V2-, der
KV1- und der Kontrollgruppe festzustellen. Im Vergleich zu der KV1- und der V2Gruppe hatten auch die Embryonen der KV2-Gruppe eine statistisch signifikant
niedrigere Genexpression des Hitzeschockproteins. Die Embryonen der V1- und die
der KV2-Gruppe unterschieden sich nicht voneinander und auch zwischen den
Embryonen der K-, der KV1- und der V2-Gruppe waren keine statistisch signifikanten
Unterschiede in der Genexpression von HSPA1A festzustellen.
b
b
bc
ac
a
Abbildung 26: Relative Transkriptmenge von HSPA1A in präimplantatorischen Embryonen der
verschiedenen Versuchsgruppen (MW ± SEM: P a:b:c < 0,05)
4.3.5. Desmocollin 2 (DSC2)
Abbildung 27 zeigt die relative Transkriptmenge von Desmocollin 2. Es konnten
statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Werten der Embryonen beider
Vitrifikationsgruppen
festgestellt
werden.
96
Die
Embryonen
der
V1-Gruppe
Ergebnisse
exprimierten signifikant weniger DSC2 als die der V2 Gruppe. Auch im Gegensatz zu
den Embryonen der K- und der KV1-Gruppe war die Expression bei denen der V1Gruppe signifikant geringer. Ähnlich zeigte sich die Expression der relativen
Transkriptmenge von DSC2 in den Embryonen der KV2-Gruppe. Auch hier wurde
statistisch signifikant weniger DSC2 exprimiert als in denen der V2-, der KV1- und
der K-Gruppe. Die DSC2-Expression der Embryonen der V1- und der KV2-Gruppe
unterschied sich nicht signifikant voneinander.
a
a
a
b
b
Abbildung 27: Relative Transkriptmenge von DSC2 in präimplantatorischen Embryonen der
verschiedenen Versuchsgruppen (MW ± SEM: P a:b < 0,05)
4.3.6. Prostaglandin G/H Synthase 2 (PTGS2)
Für die relative Transkriptmenge von PTGS2 konnte zwischen den Embryonen der
einzelnen Versuchsgruppen keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt
werden (Abb. 28).
97
Ergebnisse
Abbildung 28: Relative Transkriptmenge von PTGS2 in präimplantatorischen Embryonen der
verschiedenen Versuchsgruppen
98
Diskussion
5. Diskussion
Die Kryokonservierung von Rinderembryonen ist seit Jahren fester Bestandteil der
bovinen Reproduktionsmedizin. Durch die Konservierung können Embryonen über
Jahre gelagert werden und es ist ohne größeren Aufwand möglich, eingefrorene
Embryonen international zu verschicken. Sowohl in vivo gewonnene als auch in vitro
produzierte Embryonen werden auch heute noch standardmäßig konventionell
kryokonserviert. Die Überlebensraten in vivo gewonnener boviner Embryonen sind
dabei besser als die in vitro produzierter Embryonen. Trotzdem steigt die Zahl in vitro
produzierter Embryonen in den letzten Jahren deutlich an, so wurden 2010 11%
mehr in vitro produzierte bovine Embryonen übertragen als noch 2009 (STROUD
2010). Diese Embryonen zeigen im Gegensatz zu in vivo gewonnenen allerdings
eine geringere Kryotoleranz bei der konventionellen Krokonservierung, die
Vitrifikation scheint für die Kryokonservierung boviner in vitro produzierter
Embryonen besser geeignet zu sein. Dies konnte sowohl auf morphologischer
Ebene, bei der Untersuchung der Zellzahlen (KAIDI et al. 2001), der Entwicklungsund Schlupfraten (NEDAMBALE et al. 2004a, RODRIGUEZ VILLAMIL et al. 2012)
oder des Metabolismus (KAIDI et al. 2001), als auch auf molekularer Ebene durch
die Untersuchung entwicklungsrelevanter Gentranskripte (STINSHOFF et al. 2011)
nachgewiesen werden. In den letzten Jahren wurden immer wieder neue
Vitrifikationsprotokolle entwickelt, um die Qualität der Embryonen nach dem Auftauen
weiter zu verbessern, jedoch gelang es bis heute nicht, eine praxisreife Methode zu
entwickeln.
Ein wichtiger Punkt bei der Vitrifikation ist die Wahl der eingesetzten Kryoprotektiva.
Die Frage, ob das nachweislich zytotoxische DMSO als Kryoprotektivum zur
Vitrifikation geeignet ist, wird immer wieder kontrovers diskutiert. DMSO gilt, unter
anderem wegen seiner extrem schnellen Penetrationszeit, als ein Stoff mit
exzellenten kryoprotektiven Eigenschaften. Jedoch konnte in verschiedenen Arbeiten
nachgewiesen werden, dass beispielsweise bei Eizellen, welche einer längeren Zeit
DMSO-haltigen Lösungen ausgesetzt waren, erhebliche Zellschäden auftraten. So
konnte bei Mäuseoozyten eine Veränderung der Mikrofilamentstruktur und vermehrte
99
Diskussion
Chromosomendegeneration festgestellt werden (VINCENT et al. 1990, BOUQUET et
al. 1995). Ebenso scheint eine lange Inkubationszeit in DMSO-haltigen Lösungen zu
einem vermehrten Auftreten von degenerativen Veränderungen an Zellen zu führen.
MALININ stellte bei Nierenzellen, welche für zehn Minuten einer 7,5%igen DMSOLösung ausgesetzt waren, deutliche Zellschäden fest (MALININ 1973). Bei der
Kryokonservierung von Embryonen in DMSO-haltigen Medien wurde durch die
Reduzierung
der
Inkubationszeiten
eine
signifikanten
Steigerung
der
Entwicklungsraten boviner Blastozysten erreicht (ISHIMORI et al. 1993). Das
Bestreben möglichst kurze Inkubationszeiten zu erreichen führt jedoch dazu, dass
die Durchführung der Vitrifikationsmethoden erheblich erschwert wird und viel
Erfahrung des Laborpersonals erforderlich ist. Beim Einsatz DMSO-freier Medien zur
Vitrifikation können häufig längere Inkubationszeiten genutzt werden, wodurch die
Methodik vereinfacht wird. Bei Vergleichen zwischen den Überlebensraten von
Embryonen bei dem Einsatz DMSO-haltiger und DMSO-freier Vtrifikationsmedien zur
Kryokonservierung wurden bisher sehr unterschiedliche Ergebnisse erzielt, die keine
eindeutigen Schlussfolgerungen zulassen. So konnten beispielsweise VIEIRA et al.
(2007) nach der Vitrifikation und dem Auftauen boviner in vitro produzierter
Blastozysten mit DMSO-haltigen Medien bessere Schlupfraten ermitteln als mit
DMSO-freien Vitrifikationsmedien.
Als Richtwert für die Qualität von Embryonen werden meist Untersuchungen an in
vivo
gewonnenen
Embryonen
herangezogen.
Sowohl
bei
der
Expression
entwicklungrelevanter Gentranskripte (WRENZYCKI et al. 2001) als auch bei der
Kryokonservierbarkeit (RIZOS et al. 2001, RODRIGUEZ VILLAMIL et al. 2012)
konnten im Vergleich zu IVP-Embryonen deutliche qualitative Unterschiede
festgestellt werden, wobei sich die in vivo gewonnene Embryonen als qualitativ
besser
erwiesen.
Bei
einem
Vergleich
zwischen
vitrifizierten
und
nicht
kryokonservierten in vitro produzierten bovinen Embryonen waren ebenfalls deutliche
qualitative Unterschiede festzustellen, wobei die Vitrifikation die Expression
entwicklungsrelevanter Gentranskripte beeinflusste (STINSHOFF et al. 2011).
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss eines DMSO-haltigen und eines
DMSO-freien Kryoprotektivums sowohl auf morphologischer Ebene, durch die
100
Diskussion
Ermittlung
der
Überlebensraten,
sowie
der
Gesamtzellzahl
und
Lebend-Tot-Zellratio, als auch auf molekularer Ebene, durch die
der
Analyse
entwicklungsrelevanter Gentranskripte mittels RT-qPCR, untersucht. Dazu wurden in
vitro produzierte bovine Embryonen an Tag sieben nach der Befruchtung durch zwei
kommerziell erhältliche Verfahren vitrifiziert. Des Weiteren wurden Embryonen, die
zwei zusätzlichen Gruppen zugeordnet waren, durch die jeweiligen Vitrifikations- und
Auftaumedien der beiden Verfahren pipettiert, ohne in Kontakt mit dem flüssigen
Stickstoff zu kommen. Als qualitativer Standard für die Zellzahlzählung und die
RT-qPCR dienten nicht kryokonservierte, aus der SOF(aa)-Kultur stammende,
geschlüpfte Blastozysten.
5.1. Reexpansions- und Schlupfraten
Die Untersuchung der Reexpansions- und Schlupfraten kryokonservierter boviner
Embryonen nach dem Auftauen gilt als ein einfaches und gängiges Verfahren zur
Qualitätsbeurteilung und wird in vielen verschiedenen Arbeiten angewendet. Der
Vergleich der Ergebnisse solcher Versuchsreihen ist jedoch schwierig, da viele
Faktoren die Qualität der Embryonen aus einer IVP beeinflussen. Beispiele für
solche Faktoren sind die Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien
(NEDAMBALE et al. 2004a, MUCCI et al. 2006, SHIRAZI et al. 2009, LEROY et al.
2010), die verwendeten Vitrifikationsmedien (SAHA et al. 1996, INABA et al. 2011)
oder auch die verschiedenen Vitrifikationsmethoden und Trägersysteme (PARK et al.
2006, INABA et al. 2011).
Die Reexpansionsraten vitrifizierter, boviner Embryonen nach dem Auftauen, welche
durch verschiedene DMSO-haltige oder DMSO-freie Vitrifikationsmedien eingefroren
wurden, schwanken in verschiedenen Arbeiten zwischen 22,2% (SHIRAZI et al.
2009) und 100% (INABA et al. 2011), die Schlupfraten zwischen 19,6% (SAHA et al.
1996) und 97,3% (INABA et al. 2011). Diese sehr großen Schwankungsbreiten sind
durch die Verwendung unterschiedlicher Kultursysteme und Vitrifikationsmedien in
den einzelnen Laboratorien zu erklären. Bei der Betrachtung der Reexpansions- und
Schlupfraten von Embryonen, die durch DMSO-haltige oder DMSO-freie Medien
101
Diskussion
vitrifiziert wurden, konnten ähnlich große Schwankungsbreiten ermittelt werden. So
liegen die Reexpansionsraten bei dem Einsatz DMSO-haltiger Medien zwischen
52,1% (MUCCI et al. 2006) und 100% (SHIRAZI et al. 2009), wogegen sie bei
DMSO-freien Medien zwischen 22,2% (INABA et al. 2011) und 100% (SHIRAZI et al.
2009) schwanken. Die Vergleiche der Schlupfraten aus DMSO-haltigen und
DMSO-freien Medien ergeben Raten zwischen 35,7% (LEROY et al. 2010) und
95,5% (INABA et al. 2011) bzw. zwischen 19,6% (SAHA et al. 1996) und 97,3%
(INABA et al. 2011).
Um in der vorliegenden Arbeit die Vergleichbarkeit zwischen den einzelnen Gruppen
zu ermöglichen, wurden die bovinen Embryonen in einem Standard-Kultursystem
produziert. Es wurden ausschließlich an Tag sieben expandierte Blastozysten
vitrifiziert und dasselbe Trägersystem für beide Vitrifikationsmethoden verwendet.
Die Raten der vorliegenden Arbeit liegen für die Embryonen der V1-Gruppe, welche
mit DMSO-haltigen Medien vitrifiziert wurden, bei 89,2 ± 5,3% und für die Embryonen
der V2-Gruppe, welche ohne DMSO vitrifiziert wurden, bei 67,0 ± 15,5% und damit
innerhalb der Schwankungsbreite der oben aufgeführten Arbeiten. Die Raten der
KV1- und der KV2 Gruppe lagen mit 90,0 ± 8,2% und 90,0 ± 15,4% im Bereich der
V1-Gruppe.
Es
konnte
eine
statistisch
signifikante
Reduzierung
der
Reexpansionsrate bei Embryonen der Vitrifikationsgruppe mit DMSO-freien Medien
im Vergleich zu denen der anderen Gruppen ermittelt werden. Auch bei dem
Vergleich der Schlupfraten der Embryonen der einzelnen Gruppen in der
vorliegenden Arbeit konnte eine statistische Signifikanz festgestellt werden. So war
mit 29,4 ± 14,5% eine signifikant niedrigere Schlupfrate bei den Embryonen der
V2-Gruppe im Vergleich zu denen der V1- (62,9 ± 12,2%), KV1- (69,2 ± 12,0%) und
KV2-Gruppe (47,9 ± 17,8%) zu erkennen. Des Weiteren war die Schlupfrate der
Blastozysten bei der KV2-Gruppe signifikant niedriger als die derer der KV1-Gruppe.
Da die Embryonen aus den beiden Gruppen mit den DMSO-freien Medien reduzierte
Überlebensraten im Vergleich zu den Embryonen der DMSO-haltigen Gruppen
zeigen kann vermutet werden, dass die Vitrifikation mit DMSO-freien Medien zu einer
Verminderung der Embryonenqualität auf morphologischer Ebene führt. Die DMSOfreien Medien scheinen keinen ausreichenden Schutz vor den Schäden durch die
102
Diskussion
Kryokonservierung zu bieten, was sich in den verminderten Reexpansions- und
Schlupfraten der kryokonservierten Embryonen der V2-Gruppe zeigt. Da auch die
Embryonen der KV2-Gruppe signifikant niedrigere Schlupfraten zeigen als die
Embryonen der KV1-Gruppe, kann davon ausgegangen werden, dass nicht nur die
Kryokonservierung sondern auch die Verwendung der DMSO-freien Medien an sich
auf morphologischer Ebene zu verminderten Entwicklungsraten führt.
5.2. Zellzahlzählung
Die Ermittlung der Gesamtzellzahl und die Berechnung der Lebend-Tot-Zellratio von
Embryonen ist eine weitere, häufig genutzte Methode zur Bewertung der
Embryonenqualität auf morphologischer Ebene. Wie die Reexpansions- und
Schlupfrate der Blastozysten nach Vitrifikation und Auftauen ist auch die
Gesamtzellzahl abhängig von zahlreichen Parametern (MUCCI et al. 2006,
USHIJIMA et al. 2008). So können beispielsweise erhebliche Unterschiede zwischen
in vivo gewonnenen und in vitro produzierten Embryonen ermittelt werden.
USHIJIMA et al. (2008) konnten zwar an Tag sieben nach der Befruchtung mit eine
Gesamtzellzahl von durchschnittlich 164,1 bei bovinen in vivo gewonnenen und
166,8 bei bovinen IVP-Embryonen keine Unterschiede nachweisen, ab Tag acht
wurden bei den in vivo gewonnenen Embryonen jedoch statistisch signifikant höhere,
mittlere Zellzahlen von 305,7 Zellen im Vergleich zu 169,4 Zellen bei den
IVP-Embryonen ermittelt (USHIJIMA et al. 2008).
Auch der Vergleich zwischen kryokonservierten und nicht kryokonservierten
Embryonen und die Wahl der der Kryokonservierungsmethode hat einen Einfluss auf
die Zellzahl boviner Embryonen. Mehrfach wurden verschiedene Einfriermethoden
verglichen, die dabei erzielten Ergebnisse variieren allerdings. Bei dem Vergleich der
Zellzahl konventionell kryokonservierter, virtifizierter und nicht kryokonservierter
boviner IVP-Embryonen konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden
(STINSHOFF et al. 2011). Andere Autoren ermittelten im Gegensatz dazu bei dem
Vergleich vitrifizierter und nicht kryokonservierter boviner IVP-Embryonen eine
signifikante Reduzierung der Gesamtzellzahl nach der Kryokonservierung (MUCCI et
103
Diskussion
al. 2006, GÓMEZ et al. 2009, SHIRAZY et al. 2009). Die mittlere Gesamtzellzahl der
vitrifizierten Blastozysten schwankte in den aufgeführten Arbeiten zwischen 55,8
(SHIRAZY et al. 2009) und 127,2 (GÓMEZ et al. 2009). Auch bei Vergleichen
zwischen der Lebend-Tot-Zellratio vitrifizierter und nicht kryokonservierter boviner
Embryonen konnten keine einheitlichen Ergebnisse ermittelt werden. STINSHOFF
et al. (2011) konnten keine signifikanten Abweichungen feststellen, im Gegensatz
dazu ermittelten SHIRAZY et al. (2009) eine niedrigere Lebend-Tot-Zellratio bei
Embryonen nach der Kryokonservierung. Ein Vergleich der angegebenen Arbeiten ist
jedoch aufgrund der Verwendung unterschiedlicher Kultursysteme schwierig. In der
vorliegenden Arbeit schwankte die mittlere Gesamtzellzahl der Blastozysten aller
Versuchsgruppen zwischen 116,7 und 123,5 Zellen pro Embryo. Hier war, wie bei
der Arbeit von STINSHOFF et al. (2011), kein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen den Embryonen der beiden Kryokonservierungsmethoden und denen der
nicht kryokonservierten Kontrollen festzustellen. Bei der Betrachtung der lebenden
und toten Zellen konnte allerdings eine statistisch signifikante Reduzierung der
Lebend-Tot-Zellratio der Blastozysten aus der DMSO-freien Vitrifikationsgruppe 2 im
Vergleich zu allen anderen Gruppen festgestellt werden. Dieses Ergebnis bestätigt
die Vermutung, dass die Vitrifikation ohne DMSO-Zusatz auf morphologischer Ebene
zu
einem
nicht
Kryokonservierung
ausreichenden
und
somit
Schutz
zu
vor
einer
der
Schädigung
morphologisch
durch
die
verminderten
Embryonenqualität und Überlebensrate führt.
5.3. Genexpression nach dem Auftauen
Durch die Analyse entwicklungsrelevanter Gentranskripte bleibt die Beurteilung der
Qualität boviner Embryonen nicht auf die morphologischen Kriterien beschränkt
sondern kann auch auf molekularer Ebene erfolgen. Als „goldener Standard“ dienen
hier die Expressionshäufigkeiten in vivo gewonnener Embryonen, welche sich
nachweislich von denen in vitro produzierter unterscheiden (WRENZYCKI et al.
2007). Doch nicht nur die Herkunft der Embryonen hat Auswirkungen auf die
exprimierte Menge entwicklungsrelevanter Gentranskripte. Auch andere Parameter,
104
Diskussion
wie beispielsweise das verwendete Kultursystem (WRENZYCKI et al. 1998), das
Alter der untersuchten Embryonen (WRENZYCKI et al. 1999) oder die Art der
Kryokonservierung (ANCHAMPARUTHY et al. 2010, KUZMANY et al. 2011,
SIQUEIRA FILHO et al. 2011, STINSHOFF et al. 2011, AKSU et al. 2012), haben
Einfluss auf die molekulare Qualität in vitro produzierter, boviner Embryonen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression sechs entwicklungsrelevanter
Gentranskripte
Gentranskripte
untersucht.
signifikante
Dabei
waren
bei
Unterschiede
vier
in
der
den
sechs
untersuchten
Expressionsmengen
kryokonservierter und nicht kryokonservierter Embryonen zu erkennen.
Der Glukosetransporter Typ 1 ist verantwortlich für die Regulierung der
intrazellulären Glukosekonzentration und den Transport von Glukose über epitheliale
und endotheliale Membranen (MUECKLER 1994). Die SLC2A1-Expression kann bei
bovinen Embryonen ab dem 2-Zell Stadium in allen frühembryonalen Stadien
nachgewiesen werden (LEQUARRÉ et al. 1997). Dabei erreicht die Menge des
exprimierten Gens im Stadium der Kompaktierung, in dem der embryonale
Metabolismus von Laktat und Pyruvat auf Glukose umgestellt wird, ihren Höchstwert
(RIEGLER et al. 1992). In diesem Entwicklungsstadium konnte bei in vitro
produzierten bovinen Embryonen signifikant weniger SLC2A1 als bei in vivo
generierten nachgewiesen werden (WRENZYCKI et al. 2001, KNIJN et al 2002).
Ebenso konnte bei Embryonen von morphologisch schlechter Qualität geringere
Mengen SLC2A1 nachgewiesen werden (LOPES et al. 2007). Dies legt den Schluss
nahe, dass in vitro produzierte Embryonen geringere Mengen Glukose aufnehmen
können als in vivo gewonnene. Auch nach der Kryokonservierung boviner
IVP-Embryonen durch konventionelle Kryokonservierung oder Vitrifikation konnte
signifikant weniger SLC2A1 nach dem Auftauen nachgewiesen werden als bei nicht
kryokonservierten Embryonen (STINSHOFF et al. 2011). Diese Beobachtung konnte
auch in der vorliegenden Arbeit gemacht werden. So wurde bei den Embryonen der
DMSO-haltigen
Vitrifikationsmethode
1
eine
signifikante
Reduzierung
der
SLC2A1-Expression im Vergleich zur Kontrollgruppe und zur KV1-Gruppe ermittelt.
Die Reduzierung der SLC2A1-Expression nach der Kryokonservierung kann zu einer
verminderten Glukoseaufnamefähigkeit der Embryonen, welche mit DMSO-haltigen
105
Diskussion
Medien vitrifiziert wurden, führen. Dies könnte ein Grund für eine verminderte
Überlebensfähigkeit und somit eine reduzierte Qualität der auf diese Weise
kryokonservierten Embryonen sein. Inwiefern sich diese Qualitätsminderung auch bei
der Übertragung der Embryonen auf die Trächtigkeitsraten und die Gesundheit der
Kälber auswirkt, müsste in weiteren Untersuchungen geklärt werden.
Auch bei der Ermittlung der TJP1-Expression konnte in der vorliegenden Arbeit eine
signifikante Reduzierung der Expressionsmenge bei Embryonen der V1- und der
KV2-Gruppe im Vergleich zu solchen der Kontrollgruppe festgestellt werden. Des
Weiteren wurde eine tendenzielle Reduzierung der TJP1-Expression bei der
V2-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe ermittelt. Das TJP1 ist das erste
entdeckte Protein des Multiproteinkomplexes der Tight junctions (STEVENSON et al.
1986). Als Zellverbindungsmoleküle dienen sie unter anderem der Kommunikation
zwischen verschiedenen Zellen. Die entscheidende Expression beginnt bei
Embryonen im Kompaktierungsstadium, in dem die Differenzierung zwischen TE und
ICM beginnt. Hier dient das TJP1 vor allem dem Aufbau von Verbindungen zwischen
den zuvor deutlich voneinander getrennt liegenden Zellen und deren Differenzierung
in TE und ICM. Bei bovinen Embryonen mit kurzer Kompaktierungsphase konnte
signifikant weniger TJP1 ermittelt werden als bei solchen, die eine längere
Kompaktierungsphase durchliefen (MILLER et al. 2003). Außerdem konnte bei dem
Vergleich zwischen in vivo und in vitro produzierten Embryonen eine signifikant
niedrigere Expression bei den IVP-Embryonen gemessen werden (MILLER et al.
2003). Eine verringerte Expression von TJP1 konnte auch bei dem Vergleich
zwischen kryokonservierten und nicht-kryokonservierten Embryonen festgestellt
werden, so exprimierten vitrifizierte und konventionell kryokonservierte Embryonen
signifikant geringere Mengen TJP1 (STINSHOFF et al. 2011). Die signifikante
Reduzierung der TJP-Expression bei der Vitrifikationsmethode mit DMSO-haltigen
Medien in der vorliegenden Arbeit kann hinsichtlich der Qualität der Embryonen von
Bedeutung sein. So kann eine geringere Expressionsmenge Störungen in der
Kompaktierungsphase und bei der Ausdifferenzierung des TE der Embryonen
verursachen.
Die
Tatsache,
dass
eine
tendenzielle
Reduzierung
der
TJP1-Expression auch in der V2-Gruppe zu erkennen war legt die Vermutung nahe,
106
Diskussion
dass die Kryokonservierung an sich einen Einfluss auf die Bildung von
Zellverbindungen und die Zelldifferenzierung der Embryonen hat.
Das von bovinen Embryonen ausgeschüttete Interferon  dient dem maternalen
Organismus als primäres Signal zur Erkennung der Trächtigkeit (BAZER 1992). Die
Ausschüttung erfolgt ausschließlich aus den Zellen des TE und beginnt bei bovinen
Embryonen mit dem Blastozystenstadium (FARIN et al. 1990, WRENZYCKI et al.
1998). Die Menge des exprimierten IFNT2 ist abhängig von der Herkunft der
Embryonen. In vitro produzierte Embryonen zeigten beispielsweise im Gegensatz zu
in vivo generierten eine höhere Expression von IFNT2 (WRENZYCKI et al. 2001).
Dies scheint ein Anzeichen für eine schlechtere Embryonenqualität zu sein, da
IVP-Embryonen
mit
einer
höheren
Expression
IFNT2
zu
geringeren
Trächtigkeitsraten nach Embryotransfer führen (KUBISCH et al. 2004). Bei
konventionell kryokonservierten bovinen IVP-Embryonen konnte im Gegensatz zu
Embryonen welche vitrifiziert wurden, eine erhöhte IFNT2-Expression ermittelt
werden, was bedeuten könnte, dass die konventionelle Kryokonservierung für
IVP-Embryonen nicht so gut geeignet ist wie die Vitrifikation (STINSHOFF et al.
2011). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte bei den vitrifizierten Embryonen kein
Unterschied in der Expressionsmenge des IFNT2 im Vergleich zu denen des nicht
kryokonservierten Standards ermittelt werden. Die Vitrifikation scheint demnach
keinen Einfluss auf die IFNT2-Expression zu haben.
Auch bei der Betrachtung der PTGS2-Expression konnten in der vorliegenden Arbeit
keine
statistisch
signifikanten
Unterschiede
zwischen
den
Embryonen
der
verschiedenen Gruppen festgestellt werden. Die Prostaglandin G/H-Synthase 2 spielt
eine entscheidende Rolle in vielen Reproduktionsmechanismen. Sie beeinflusst die
Ovulation, die Maturation der Oozyten, die Implantation von Embryonen oder auch
die Plazentabildung (SIROIS et al. 1992, LIM et al. 1999). Nachgewiesen werden
kann PTGS2 bei bovinen Embryonen in allen Stadien bis zur geschlüpften
Blastozyste, wobei es hauptsächlich in den Zellen des TE vorkommt. Die Menge des
exprimierten PTGS2 hat auch in bovinen Embryonen eine entscheidende Bedeutung,
so bilden Embryonen von guter Qualität signifikant mehr PTGS2 als solche von
schlechter Qualität (SAINT-DIZIER et al. 2011). GAD et al. konnten eine signifikante
107
Diskussion
Verringerung der Expression bei in vitro produzierten bovinen Embryonen im
Vergleich zu in vivo generierten ermitteln (GAD et al. 2012). Da nach der Vitrifikation
der Embryonen in der vorliegenden Arbeit keine signifikante Reduzierung der
PTGS2-Expression zu erkennen war, kann davon ausgegangen werden, dass diese
Art der Kryokonservierung keinen entscheidenden Einfluss auf die Expression von
PTGS2 hat.
Das HSPA1A-Protein dient der Zelle unter anderem als Schutzprotein vor Hitzestress
und
als
Chaperon.
In
Embryonen
kann
das
Hitzeschockprotein
in
allen
Entwicklungsphasen bis zur geschlüpften Blastozyste nachgewiesen werden
(WRENZYCKI et al. 1998). Es dient als eine Art Indikator für den Nachweis
suboptimaler Kulturbedingungen, so exprimieren beispielsweise Embryonen aus
einer Kultur, welcher Serum zugesetzt ist, signifikant mehr HSPA1A als solche aus
einer Kultur mit PVA (WRENZYCKI et al. 1999). Auch bei dem Vergleich zwischen in
vitro produzierten und in vivo gewonnenen Embryonen kann ein Unterschied in der
HSPA1A-Expression festgestellt werden. So exprimieren bovine und murine
IVP-Embryonen größere Mengen des Proteins, was die Vermutung nahe legt, dass
die IVP-Embryonen größeren Stressfaktoren ausgesetzt sind (CHRISTIANS et al.
1995, WRENZYCKI et al. 2001). Auch bei der Kryokonservierung konnten
Unterschiede in der HSPA1A-Expression festgestellt werden, diese sind jedoch nicht
eindeutig. So ermittelten PARK et al. und KUZMANY et al. eine Steigerung der
HSPA1A-Expression nach dem Auftauen vitrifizierter in vitro produzierter boviner
Embryonen (PARK et al. 2006, KUZMANY et al. 2011), SIQUEIRA FILHO et al.
konnten dagegen keine Veränderung der Expression feststellen (SIQUEIRA FILHO
et al. 2011). AKSU et al. konnten ebenfalls eine gesteigerte Expression eines
ähnlichen Hitzeschockproteins, HSPA5, nach der Vitrifikation boviner in vitro
produzierter Embryonen im Vergleich zu in vivo generierten ermitteln (AKSU et al.
2012).
STINSHOFF et
al.
stellte
jedoch
sowohl bei der konventionellen
Kryokonservierung als auch bei der Vitrifikation eine niedrigere Expression von
HSPA1A in den kryokonservierten Embryonen im Vergleich zu nicht eingefrorenen
IVP-Embryonen fest (STINSHOFF et al. 2011). Diese widersprüchlichen Ergebnisse
sind durch die Verwendung verschiedener Kultursysteme in den einzelnen Arbeiten
108
Diskussion
zu erklären, da diese nachweislichen Einfluss auf die HSPA1A-Expression haben
können (WRENZYCKI et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit konnte, ähnlich wie bei
STINSHOFF et al. (2011) eine verminderte HSPA1A-Expression der Embryonen der
V1- und der KV2-Gruppe im Vergleich zu denen der V2- und KV1-Gruppe festgestellt
werden. Weiterhin war die Expression der Embryonen der V1-Gruppe im Vergleich
zu denen der Kontrollgruppe signifikant reduziert. Dies kann auf eine verminderte
Qualität der Embryonen der V1- und der KV2-Gruppe hindeuten, da diese durch die
möglicherweise geringere Proteinbildung nicht mehr ausreichend auf Stressfaktoren
reagieren können, was zu einer geringeren Überlebensfähigkeit führen kann. Ob sich
diese beispielsweise auch bei den Trächtigkeitsraten nach Übertragung solcher
Embryonen bemerkbar macht, müsste in weiteren Untersuchungen getestet werden.
Das DSC2 ist ein wichtiger Bestandteil des Zell-Zell-Verbindungsapparates
(FLEMING et al. 1991). Es wird nachweislich ab dem 2-4 Zellstadium exprimiert und
spielt eine entscheidende Rolle in der Stabilisierung des Blastozoels von Embryonen
(WRENZYCKI et al. 1998). In vitro produzierte, bovine Embryonen zeigen eine
verringerte Expression von DSC2 im Vergleich zu in vivo generierten, was eine
Erklärung für die zum Teil verzögerte Entwicklung dieser Embryonen wäre
(WRENZYCKI et al. 2001, KNIJN et al. 2002). Auch die Zusammensetzung der
Kulturmedien hat einen Einfluss auf die Expression von DSC2. Embryonen aus einer
Kultur mit PVA-Zusatz zeigen eine erhöhte Expression im Vergleich zu Embryonen
aus einer Kultur mit Serum (WRENZYCKI et al. 1999). Nach der Kryokonservierung
konnte in der vorliegenden Arbeit eine Reduzierung der DSC2-Expression in den
Embryonen der V1- und der KV2-Gruppe im Vergleich zu den drei anderen Gruppen
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse werden durch STINSHOFF et al. (2011)
bestätigt, welche ebenfalls eine Reduzierung der Desmocollin-Expression nach der
Vitrifikation boviner IVP-Embryonen ermittelten. Da in der vorliegenden Arbeit die
DSC2-Expression in der Vitrifikationsgruppe mit DMSO-Zusatz signifikant geringer
war als in der Kontrollgruppe und der V2-Gruppe, kann dies ein Hinweis auf eine
reduzierte Entwicklung der so vitrifizierten Blastozysten sein. Dies müsste durch
weitere Untersuchungen wie beispielsweise das Übertragen so vitrifizierter
Embryonen und die Ermittlung der Trächtigkeitsraten oder auch durch eine
109
Diskussion
Immunfluorenzenzuntersuchung zur Darstellung der Zell-Zell-Verbindungen weiter
untersucht werden.
5.4. Schlussfolgerungen
Die Verwendung verschiedener Vitrifikationsmedien hat einen entscheidenden
Einfluss auf die Qualität der Embryonen nach dem Auftauen. Dies kann in der
vorliegenden Arbeit verdeutlicht werden. Die morphologische Qualitätsmessung
durch die Ermittlung der Reexpansions- und Schlupfraten dient häufig als erste
Analysemethode vitrifizierter IVP-Embryonen. Die Embryonen, welche zuvor durch
DMSO-freie Medien kryokonserviert wurden, zeigten eine geringere Reexpansionsund Schlupfrate und eine geringere Lebend-Tot-Zellratio als die Embryonen der
anderen Gruppen. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Embryonen durch das
DMSO-freie Vitrifikationsmedium nicht ausreichend geschützt sind. DMSO hat eine
ausgeprägte Fähigkeit zur Bildung eines glasähnlichen Zustandes (FRIEDLER et al.
1988, VALDEZ et al. 1992), wodurch es zur Vitrifikation sehr gut geeignet ist. Die
Vitrifikation durch DMSO-freie Medien führte möglicherweise zu einer nicht
ausreichenden Glasbildung, wodurch die Embryonen durch intrazelluläre Eiskristalle
geschädigt werden können, was die geringeren Überlebensraten erklären würde.
Bei Betrachtung allerdings nicht nur der morphologischen Qualitätsanalyse sondern
auch der Expressionsmessung entwicklungsrelevanter Gentranskripte wird deutlich,
dass die Mehrheit der molekularen Veränderungen bei Embryonen der V1- und der
KV2-Gruppe
auftraten.
So
konnten
in
den
Embryonen
der
V1-Gruppe
Veränderungen in vier der sechs untersuchten Gentranskripte ermittelt werden,
während in der V2-Gruppe nur bei der Expression von TJP1 eine tendenzielle
Reduzierung im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erkennen war. Dies lässt die
Vermutung zu, dass die Vitrifikation mit DMSO zwar zu höheren Überlebensraten
nach dem Auftauen der Embryonen führt, die toxische Wirkung des DMSO jedoch
auf
molekularer
Ebene
zu
zahlreichen
Veränderungen
der
Expression
entwicklungsrelevanter Gentranskripte führt, welche bei der Vitrifikation ohne DMSO
nicht auftreten.
110
Diskussion
Zusammenfassend
kann
festgehalten
werden,
dass
die
Vitrifikation
durch
DMSO-haltige Medien zwar zu hohen Überlebensraten führt, die Embryonen auf
molekularer Ebene jedoch signifikante Veränderungen aufweisen. Ob sich diese
molekularen Veränderungen auch auf die Etablierung der Trächtigkeit und auf die
Überlebensraten und Gesundheit der geborenen Kälber auswirken müsste in
weiteren Versuchen untersucht werden. Die Vitrifikation durch DMSO-freie Medien
scheint solche molekularen Veränderungen nicht auszulösen, allerdings konnten in
der vorliegenden Arbeit keine zufriedenstellenden Überlebensraten der Embryonen
nach dem Auftauen erreicht werden. Um eine praxisreife Methode zur Vitrifikation
boviner Blastozysten zu entwickeln, sind demnach weitere Untersuchungen und
Modifikationen der gewählten Methoden nötig. Die Entwicklung einer solchen
Methode hat für die Rinderzucht, insbesondere im Hinblick auf die Ermittlung des
genomischen Zuchtwertes von Embryonen, große Bedeutung. Die Vitrifikation ist für
die Kryokonservierung in vitro produzierter boviner Embryonen besser geeignet als
die konventionelle Kryokonservierung. Da die Embryonen zu Ermittlung des
genomischen
Zuchtwertes
für
den
Zeitraum
des
Untersuchungsverfahrens
kryokonserviert werden ist eine Verbesserung der Überlebensraten von großer
Bedeutung. Auch in der Humanmedizin werden, bei der Präimplantationsdiagnostik,
Biopsien von frühen Embryonalstadien entnommen und die Embryonen für die Dauer
der
Untersuchungen
kryokonserviert.
Eine
Verbesserung
Konservierungsmethode wäre auch in diesem Bereich von enormer Bedeutung.
111
der
Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Katharina Beuing
Auswirkungen zweier Vitrifikationsverfahren auf die morphologische und
molekulare Qualität in vitro produzierter boviner Embryonen
Das Ziel der vorliegenden Studie war es den Einfluss zweier Vitrifikationsmedien auf
die morphologische und molekulare Qualität boviner, in vitro generierter Embryonen
zu untersuchen. Die Vitrifikation und das Auftauen von an Tag 7 expandierten
Blastozysten, die aus einem Standard-IVP-System (SOFaa) stammten, erfolgte
entweder mit einem Vitrifikationskit das unter anderem DMSO als Kryoprotektivum
enthielt (V1, n=142; Gynemed, Lehnsahn, Deutschland), oder mit einem Kit, welches
kein DMSO enthielt (V2, n=151; Origio, Berlin, Deutschland). Embryonen, die zwei
weiteren Gruppen zugeordnet wurden, hatten nur Kontakt mit den jeweiligen Einfrierrespektive Auftaumedien, ohne tatsächlich kryokonserviert worden zu sein (KV1 Kontakt zum DMSO-haltigen Medium der Firma Gynemed, n=107; KV2 - Kontakt
zum DMSO-freien Medium der Firma Origio, n=97). Nach der Vitrifikation und dem
Auftauen erfolgten weitere 48 Stunden der Kultur, um nach 24 bzw. 48 Stunden die
Reexpansions- und Schlupfraten zu ermitteln.
Die Analyse der geschlüpfte Blastozysten der jeweiligen Gruppen erfolgte mittels
einer Lebend-Tot-Färbung oder einer RT-qPCR. In der molekularen Analyse wurde
die relative Transkriptmenge von SLC2A1, HSPA1A, IFNT2, TJP1, DSC2 und
PTGS2 bestimmt. Als Standard dienten für diese Analysen nicht vitrifizierte,
geschlüpfte Blastozysten (K), die weder Kontakt zu den Vitrifikationsmedien hatten
noch eingefroren wurden. Die folgenden Ergebnisse konnten erzielt werden:
1. Die
in
den
versuchen
eingesetzten
Blastozysten
entstammen
26
IVP-Durchgängen. Die durchschnittliche Teilungsrate betrug 61,1 ± 6,2% (n =
2990). Die Entwicklungsrate bis zur Morula oder Blastozyste lag an Tag 7 bei
18,6 ± 4,8% (n = 906) und an Tag 8 bei 25,9 ± 6,1% (n = 1275).
112
Zusammenfassung
2. Nach dem Auftauen lag die Reexpansionsrate für die expandierten Blastozysten
der V1-Gruppe bei 89,2 ± 5,3%, die der V2-Gruppe bei 67,0 ± 15,5%. Die
Schlupfrate lag bei 62,9 ± 12,2% für die Embryonen der V1- und bei 29,4 ± 14,5%
für die Embryonen der V2-Gruppe. Die Reexpansionsraten der Embryonen der
KV1- bzw. der KV2-Gruppe lagen bei 90,0 ± 8,2% und 90,0 ± 15,4%, die
Schlupfraten bei 69,2 ± 12,0% und 47,9 ± 17,8%. Es konnte eine statistisch
signifikante Reduzierung der Reexpansions- und Schlupfrate der Embryonen der
V2-Gruppe im Vergleich zu allen anderen Gruppen ermittelt werden. Des
Weiteren konnte eine Reduzierung der Schlupfrate der KV2-Blastozysten im
Vergleich zu den Blastozysten der KV1-Gruppe festgestellt werden.
3. Die
durchschnittliche
Zellzahl
lag
bei
den
Embryonen
der
einzelnen
Versuchsgruppen bei 119,8 ± 5,8 in der V1-Gruppe (n = 25), 123,5 ± 4,0 in der
V2-Gruppe (n = 20), 120,6 ± 4,8 in der KV1-Gruppe (n = 25), 119,0 ± 5,0 in der
KV2-Gruppe (n = 25) und 116,7 ± 4,8 in der Kontrollgruppe (n = 24). Es konnte
kein statistisch signifikanter Unterschied in der Gesamtzellzahl der geschlüpften
Blastozysten zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden.
Die
Lebend-Tot-Zellratio war bei den Embryonen der V2-Gruppe (7,8 ± 0,8) statistisch
signifikant niedriger als die der V1-Gruppe (12,5 ± 0,9), der KV1-Gruppe (15,6 ±
2,1), der KV2-Gruppe (13,1 ± 1,0) und der Kontrollgruppe (17,0 ± 2,0).
4. Die Analyse der relativen Transkriptmengen von IFNT2 und PTGS2 ergab keine
statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Embryonen der einzelnen
Gruppen.
5. Die Expression von SLC2A1 war in den Embryonen der V1-Gruppe signifikant
niedriger als in den Embryonen der KV1- und der Kontrollgruppe.
6. Bei der Analyse der Blastozysten der Gruppen V1 und KV2 konnten signifikant
weniger TJP1-Transkripte nachgewiesen werden als in denen der Kontrollgruppe.
113
Zusammenfassung
Tendenziell waren in den Embryonen der V2-Gruppe ebenfalls weniger
TJP1-Transkripte als in den Embryonen der Kontrollgruppe darstellbar.
7. Blastozysten, die nach dem KV2- oder dem V1-Protokol behandelt wurden,
wiesen eine geringere Menge an DSC2-Transkripten auf als die Blastozysten der
anderen Versuchsgruppen und der Kontrollgruppe.
8. Die Expression von HSPA1A war in den Embryonen der V1-Gruppe statistisch
signifikant niedriger als in denen der Kontrollgruppe, der V2- und der KV1Gruppe. Die Transkriptmenge der Embryonen der KV2-Gruppe war signifikant
niedriger als die der Embryonen der V2- und der KV1-Gruppe, unterschied sich
jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht.
Schlussfolgernd lässt sich festhalten, dass die Vitrifikation durch Medien, welche
unter anderem DMSO als Kryoprotektivum enthalten, auf morphologischer Ebene zu
einer besseren Überlebensfähigkeit nach dem Auftauen führt. Die Embryonen zeigen
jedoch Veränderungen auf molekularer Ebene. Bei vier der sechs untersuchten,
entwicklungsrelevanten Gentranskripte konnte eine verringerte Qualität im Vergleich
zu den Embryonen der DMSO-freien Gruppen festgestellt werden. Inwiefern sich
diese molekularen Unterschiede auf die Überlebensfähigkeit und die Gesundheit von
Kälbern auswirken, müsste in weiteren Untersuchungen ermittelt werden.
114
Summary
7. Summary
Katharina Beuing
Effects of two different vitrification methods on the morphological and
molecular quality of in vitro produced bovine embryos
The aim of the present study was to analyze the influence of two different vitrification
solutions on the morphological and molecular quality of in vitro produced bovine
embryos. Expanded day 7 blastocysts from a standard IVP-system (SOFaa) were
either vitrified with a commercially available vitrification kit containing DMSO as a
cryoprotective agent (V1, n= 142; Gynemed, Lehnsahn, Germany), or with a
commercially available vitrification kit without DMSO (V2, n= 151; Origio, Berlin,
Germany). Additional blastocysts were passed through the vitrification solutions
without
succeeding
vitrification
(KV1
–
contact
to
the
DMSO-containing
vitrification-solutions, n= 107; KV2 – contact to the solution without DMSO, n= 97).
After thawing the blastocysts were further cultured for 48h. Reexpansion rates were
documented 24h post thawing and finally 48h post thawing hatching rates were
assessed. Hatched blastocycsts of all groups were either subjected to live-dead
staining or the analysis of relative abundance of developmentally important gene
transcripts (SLC2A1, HSPA1A, IFNT2, TJP1, DSC2 and PTGS) via RT-qPCR. As
control, non vitrified blastocysts cultured until hatching were employed. The following
results could be obtained:
1. The average cleavage rate lay at 61.1 ± 6.2% (n = 2990). Development rates
were 18.6 ± 4.8% (n = 906) on day 7 and 25.9 ± 6.1% (n = 1275) on day 8.
2. After thawing re-expansion rates were 89.2 ± 5.3% among the blastocysts of the
V1 group and 67.0 ± 15.5% in the V2 group. Hatching rates lay at 62.9 ± 12.2%
and 29.4 ± 14.5%. Reexpansion rates for blastocysts of the KV1 group were
90.0 ± 8.2% and 90.0 ± 15.4% for those of the KV2 group. Hatching rates of the
115
Summary
latter two groups lay at 69.2 ± 12.0% and 47.9 ± 17.8%, respectively. Significantly
fewer embryos reexpanded and hatched in the V2 group compared to all other
groups. Furthermore, significantly more embryos hatched in the KV2 group than
in the KV1 group.
3. Average cell numbers lay at 119.8 ± 5.8 cells in embryos of group V1 (n = 25),
123.5 ± 4.0 cells V2 (n = 20), 120.6 ± 4.8 cells in KV1 (n = 25), 119.0 ± 5.0 cells in
KV2 (n = 25) and 116.7 ± 4.8 cells in the control group (n = 24). No significant
differences could be detected. The live/dead ratio was significantly decreased in
blastocyst of the V2 group (7.8 ± 0.8) compared to those of the V1 (12.5 ± 0.9),
KV1 (15.6 ± 2.1), KV2 (13.1 ± 1.0) and the control group (17.0 ± 2.0).
4. No significant differences could be detected regarding the expression of IFNT2
and PTGS2 among embryos of all groups.
5. The expression of SLC2A1 was significantly reduced in embryos derived from the
V1 group in comparison to those from the KV1 and the control group.
6. A significantly lower amount of TJP1 transcripts was detected in embryos of the
V1 and KV2 group compared to those blastocysts of the control group. In
tendency fewer TJP1 transcripts were detected in embryos of the V2 group than
in those of the control group.
7. Compared to blastocysts of all other groups those derived from the V1 and KV2
groups had significantly fewer DSC2 transcripts.
8. There was a statistically significantly decreased expression of HSPA1A in V1
embryos compared to those obtained from the V2, KV1 and control group. The
amount of HSPA1A transcripts was significantly lower for KV2 embryos than for
V2 and KV1 embryos, but there was no difference in comparison to the control
group.
116
Summary
In conclusion, vitrification with DMSO-containing media results in an increased
number of surviving embryos compared to DMSO-free media. Nevertheless, these
embryos show a reduced quality at the molecular level. Four of six investigated
genes which are essential of evolution an inferior quality were effected compared to
embryos which have been vitrified in media without DMSO. Whether these
differences in gene transcription have an effect concerning the survivability and the
health of calves needs to be investigated in future studies.
117
Anhang
8. Anhang
8.1. Verzeichnis der verwendeten Medien
8.1.1. Medien für die IVM
Tabelle 33: Zusammensetzung der PBS-Stocklösung
Substrat
Hersteller
G/500 ml G/1000 ml
Natriumpyruvat
Sigma-Aldrich P3662
1,80 g
3,60 g
Streptomycinsulfat Sigma-Aldrich S6501
2,50 g
5,00 g
D-Glukose
Sigma-Aldrich 49158
50,00 g
100,00 g
CaCl2 x H2O
Sigma-Aldrich C7902
6,65 g
13,30 g
Tetracyclin
Serva 35866
3,00 g
6,00 g
Tabelle 34: Zusammensetzung der PBS-Gebrauchslösung
Substrat
Hersteller
PBS-Pulver
Sigma-Aldrich D5773
G/1000 ml G/2000 ml
9,6 g
19,2 g
PBS-Stocklösung
10,0 ml
20,0 ml
Aqua bidest.
Ad 1,0 l
Ad 2,0 l
Tabelle 35: Zusammensetzung der PBS-Complete-Lösung
Substrat
Hersteller
PBS-Gebrauchslösung
G/500 ml G/1000 ml
500 ml
1000 ml
Heparin
Serva 24590
5,60 mg
11,20 mg
BSA (Fraktion V)
Sigma-Aldrich A9647
0,50 g
1,00 g
118
Anhang
Tabelle 36: Zusammensetzung der NaCl-Complete-Lösung
Substrat
Hersteller
G/1000 ml
NaCl
Sigma-Aldrich S5886
9,00 g
Penicillin G
Sigma-Aldrich PENK 10MU
0,06 g
Streptomycin
Sigma-Aldrich S6501
0,10 g
1,00 l
Aqua bidest.
Tabelle 37: Zusammensetzung TCM-BSA(FAF)
Substrat
Hersteller
G/30 ml
G/100 ml
TCM 199
Sigma-Aldrich M2520
0,453 g
1,51 g
Tetracyclin
Serva 35866
0,0015 g
0,005 g
Natriumpyruvat Sigma-Aldrich P3662
6,6 mg
2,2 mg
NaHCO3
Sigma-Aldrich S5761
0,066 g
0,22 g
H2O
Ampuwa® Fresenius
30,0 ml
100,0 ml
BSA(FAF)
Sigma-Aldrich A7030
0,03 g
0,1 g
Tabelle 38: Zusammensetzung TCM-air
Substrat
Hersteller
G/30 ml
G/100 ml
TCM 199
Sigma-Aldrich M2520
0,453 g
1,51 g
Tetracyclin
Serva 35866
0,0015 g
0,005 g
6,6 mg
2,2 mg
Na-Pyruvat Sigma-Aldrich P3662
Sigma-Aldrich S5761 0,0105 g
0,035 g
H2O
Ampuwa® Fresenius
30,0 ml
100,0 ml
BSA(FAF)
Sigma-Aldrich A7030
0,03 g
0,1 g
NaHCO3
119
Anhang
Tabelle 39: Zusammensetzung Suigonan (Fa. Intervet GmbH, Tönisvorst)
Substrat
Hersteller
1 Aliquot (25 μl)
PMSG
Intervet A 055 A01
10 I.E.
HCG
Intervet A 055 A01
5 I.E.
8.1.2. Medien für die IVF
Tabelle 40: Zusammensetzung der Fert.-Talp-Stocklösung
Substrat
Hersteller
Konzentration (mM) G/100 ml
NaCl
Sigma-Aldrich S5886
114,0
0,6658 g
KCl
Sigma-Aldrich P5405
3,2
0,0239 g
NaHCO3
Sigma-Aldrich S5761
25,0
0,2100 g
NaH2PO4 x H2O
Sigma-Aldrich S9638
0,3
0,0041 g
CaCl2 x 2 H2O
Sigma-Aldrich C7902
2,0
0,0294 g
MgCl2
Sigma-Aldrich M8266
0,5
0,0048 g
Phenolrot
Sigma-Aldrich P5530
0,01 μg/ml
0,0010 g
Penicillamine
Sigma-Aldrich P4875
20,0
0,0003 g
Natriumlactat (60%)
Sigma-Aldrich L4263
10,0
0,1860 g
Tabelle 41: Zusammensetzung der Natriumpyruvat-Lösung
Substrat
Natriumpyruvat
Hersteller
G/1 ml
Sigma-Aldrich P3662 2,0 mg
1,0 ml
Fert.-Talp Stocklösung
120
Anhang
Tabelle 42: Zusammensetzung der Fert.-Talp-Gebrauchslösung
Substrat
Hersteller
G/10 ml
Sigma-Aldrich A9647 60,0 mg
BSA Fraktion V
Fert.-Talp Stocklösung
10,0 ml
Natriumpyruvat-Lösung
140 μl
Tetracyclin-Stocklösung
10 μl
Tabelle 43: Zusammensetzung der Tetrazyklin-Stocklösung
Substrat
Hersteller
G/0,5 ml
Tetracyclin
Serva 35866
11,0 mg
H2O
Ampuwa® Fresenius
0,5 ml
Tabelle 44: Zusammensetzung der Epinephrin-Stocklösung
Substrat
Epinephrin
Hersteller
G/40 ml
Sigma-Aldrich E4250 1,83 mg
40,0 ml
Lösungsmittel
Tabelle 45: Zusammensetzung Lösungsmittel
Substrat
Hersteller
Natriummetabisulfit Sigma-Aldrich 31448
Natriumlaktat
H2O
G/50 ml
50,0 mg
Sigma-Aldrich L4263 165,0 mg
Ampuwa® Fresenius
121
50,0 ml
Anhang
Tabelle 46: Zusammensetzung der Hypotaurin-Stocklösung
Substrat
Hersteller
G/10ml
Hypotaurin Sigma-Aldrich H1384 1,09 mg
H2O
Ampuwa® Fresenius
10,0 ml
Tabelle 47: Zusammensetzung der Heparin-Stocklösung
Substrat
Hersteller
G/10ml
Heparin
Serva 24590,02
2,82 mg
H2O
Ampuwa® Fresenius
10,0 ml
Tabelle 48: Zusammensetzung der Hypotaurin-Epinephrin-Arbeitslösung
Substrat
Hersteller
G/40ml
Hypotaurinstocklösung
10,0 ml
Epinephrinstocklösung
4,0 ml
H2O
Ampuwa® Fresenius 26,0 ml
Tabelle 49: Zusammensetzung der HHE-Gebrauchslösung
Substrat
G/100μl
Hypotaurin-Epinephrin-Arbeitslösung
80 μl
Heparinstocklösung
40 μl
Tabelle 50: Zusammensetzung der Fert.-Talp-HHE-Gebrauchslösung
Substrat
G/2 ml
HHE-Gebrauchslösung
120 μl
Fert.Talp-Gebrauchslösung
2,0 ml
122
Anhang
Tabelle 51: Zusammensetzung der Sperm-Filter®-Gebrauchslösung
Substrat
Hersteller G/1ml
Sperm-Filter®
Cryos
900 μl
100 μl
Fert.Talp-Gebrauchslösung
8.1.3. Medien für die IVC
Tabelle 52: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung A
Substrat
Hersteller
Konzentration (g/M)
G/100ml
NaCl
Sigma-Aldrich S5886
58,44 g
6,290 ml
KCl
Sigma-Aldrich P5405
74,55 g
0,534 ml
KH2PO4
Sigma-Aldrich P5655
136,10 g
0,162 ml
MgSO4
Sigma-Aldrich M2643
120,40 g
0,182 ml
H2O
Ampuwa® Fresenius
Natriumlactat
Sigma-Aldrich L4263
98,400 ml
112,10 g
0,600 ml
Tabelle 53: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung B
Substrat
Hersteller
Konzentration (g/M)
G/100ml
NaHCO3
Sigma-Aldrich S5761
84,01 g
2,10 ml
Phenolrot Sigma-Aldrich P5530
376,40 g
0,01 ml
H2O
Ampuwa® Fresenius
100,00 ml
Tabelle 54: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung C
Substrat
Hersteller
Natriumpyruvat Sigma-Aldrich P3662
H2O
Ampuwa® Fresenius
123
Konzentration (g/M)
G/10ml
110,0 g
0,08 ml
10,00 ml
Anhang
Tabelle 55: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung D
Substrat
Hersteller
Konzentration (g/M)
G/10ml
147,0 g
0,262 ml
CaCl2 x 2 H2O Sigma-Aldrich C7902
Ampuwa® Fresenius
H2O
10,00 ml
Tabelle 56: Zusammensetzung der Glutamin-Stocklösung
Substrat
Hersteller
G/10ml
L-Glutamine Sigma-Aldrich G6392 292,00 mg
H2O
Ampuwa® Fresenius
10,00 ml
Tabelle 57: Zusammensetzung der SOF-aa(m)-Gebrauchslösung
Substrat
Hersteller
Konzentration (g/M) G/100ml
Myo-Inositol
Sigma-Aldrich I7508
180,2 g
0,05 g
Trinatriumcitrat
Sigma-Aldrich S4641
294,1 g
0,01 g
Tetracyclin
Serva 35866
480,0 g
0,0011 g
H2O
Ampuwa® Fresenius
78,00 ml
Glutamine-Stocklösung
0,10 ml
SOF-Stock A
10,00 ml
SOF-Stock B
10,00 ml
SOF-Stock C
1,00 ml
SOF-Stock D
1,00 ml
BME
Sigma-Aldrich B6766
3,00 ml
MEM
Sigma-Aldrich M7145
1,00 ml
124
Anhang
Tabelle 58: Zusammensetzung des SOF-aa(m)-Kulturmediums
Substrat
Hersteller
G/10ml
10,00 ml
SOF-aa(m)-Gebrauchslösung
BSA(FAF)
Sigma-Aldrich A7030
0,04 g
8.1.4. Medien für die Lebend-Tot-Färbung
Tabelle 59: Zusammensetzung der PVA/PBS Lösung
Substrat
Hersteller
G/100 ml
Polyvinlylalkohol
Sigma-Aldrich P8136
10 mg
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
Invitrogen 14190-136
(DPBS)
100 ml
Tabelle 60: Zusammensetzung der Ethidium-homodimer-Stocklösung
Substrat
G/1000 μl
Hersteller
Ethidium homodimer Invitrogen E1169
1,0 mg
1000 μl
H2O bidest
Tabelle 61: Zusammensetzung der Hoechst-33342-Stocklösung
Substrat
Hersteller G/1000 μl
Hoechst 33342
2,0 mg
H2O bidest
1000 μl
125
Anhang
Tabelle 62: Zusammensetzung der Ethidium-homodimer-Gebrauchslösung
Hersteller G/250μl
Substrat
Ethidium homodimer-Stocklösung
25 μl
PVA/PBS-Lösung
225 μl
Tabelle 63: Zusammensetzung der Hoechst-33342-Gebrauchslösung
Hersteller G/2000μl
Substrat
Hoechst 33342-Stocklösung
2 μl
PVA/PBS-Lösung
1998 μl
8.1.5. Medien für RT-qPCR
Tabelle 64: Zusammensetzung Lysis/Binding Puffer
Substrat
Konzentration pH
Tris-HCl
100 mM
LiCl
500 mM
EDTA
10 mM
LiDS
1%ig
Dithiothreitol (DTT)
5 mM
7,5
8,0
Tabelle 65: Zusammensetzung Washing Buffer A
Substrat Konzentration pH
Tris-HCl
10 mM
LiCl
150 mM
EDTA
1 mM
LiDS
0,1%ig
126
7,5
Anhang
Tabelle 66: Zusammensetzung Washing Buffer B
Substrat Konzentration pH
Tris-HCl
10 mM
LiCl
150 mM
EDTA
1 mM
7,5
Tabelle 67: Tris-HCl
Substrat Konzentration pH
Tris-HCl
10 mM
127
7,5
Anhang
8.2. Abkürzungsverzeichnis
aa
mit Aminosäurezusatz
Abb.
Abbildung
ANOVA
Analysis of Variance (Varianzanalyse)
aqua bidest.
aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser)
ATP
Adenosintriphosphat
BCS
Bovine Calf Serum (bovines Kälberserum)
BHV-1
Bovines Herpesvirus Typ 1
bp
Basenpaare
BSA
Bovine Serum Albumine (bovines Serumalbumin)
BVDV
Bovines Virus Diarrhoe Virus
bzw.
Beziehungsweise
°C
Grad Celsius
ca.
Circa
cDNA
complementary Desoxyribonucleic Acid
CO2
Kohlenstoffdioxid
CR1aa
Charles Rosenkrans Medium mit Aminosäurenzusatz
d
day (Tag)
DMEM
Dulbecco’s modification of Eagle’s Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonucleic Acid
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphat
DSC2
Desmocollin 2 (Bos taurus)
ECS
Estrous cow serum
EFS
Ethylenglycol Ficoll Saccharose
EG
Ethylenglycol
et al.
et alii (und andere)
Fa.
Firma
FAF
Fatty Acid Free (ohne Fettsäuren)
FBS
Fetal Bovine Serum (Fetales Rinderserum)
128
Anhang
FCS
Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum)
Fert.Talp
Fertilisations-Tyrode`s-Albumin-Laktat-Pyruvat-Lösung
g
Gramm
g
Erdschwerebeschleunigung
H2O
Wasser
HCG
Humanes Corion Gonadotropin
HECM
Hamster Embryo Culture Medium
HHE
Hypotaurin-Heparin-Epinephrin
HSA
Human Serum Albumin (Humanes Serumalbumin)
HSPA1A
Hitzeschockprotein 70 (Bos taurus)
IBR
Infektiöse Bovine Rhinotracheitis
ICE
Inner Cell Mass (Innere Zellmasse)
I.E.
Internationale Einheiten
IETS
International Embryo Transfer Society
IFNT2
Interferon τ (Bos taurus)
IGF-1
Insuline-like Growth Faktor 1
IVC
In-vitro-culture (In-vitro-Kultur)
IVF
In-vitro-Fertilisation
IVM
In-vitro-Maturation
IVP
In-vitro-Produktion
kDa
Kilodalton
K
Kontrolle (Standard)
KOK
Kumulus-Oozyten-Komplex
KV1
Kontrolle der Vitrifikationsmethode 1
KV2
Kontrolle der Vitrifikationsmethode 1
l
Liter
M
Molar (mol/l)
MEM
Minimum Essential Medium
mg
Milligramm
MgCl2
Magnesiumchlorid
min
Minute
129
Anhang
ml
Milliliter
mm
Millimeter
mM
Millimolar
mod.
Modifiziert
mol
Mol (Stoffmenge)
MPC
Magnetic Particle Concentrator
mRNA
Messenger Ribonucleic Acid
N2
Stickstoff
NaCl
Natriumchlorid
O2
Sauerstoff
OPS
Open Pulled Straw
OPU
Ovum pick up
PBS
Phosphate Buffered Saline
PCR
Polymerase Chain Reaktion (Polymerase Kettenreaktion)
pg
Pikogramm
PG
Propylenglycol
PGF2α
Prostaglandin F2α
PMSG
Pregnant Mare Serum Gonadotropin
PTGS2
Prostaglandin G/H Synthase 2 (Bos taurus)
PVA
Polyvinylalkohol
PVP
Polyvinylpyrrolidon
RT
Reverse Transkriptase
RT-qPCR
Reverse Transkriptase quantitative Real-Time-PCR
s
Sekunde
SLC2A1
Glukosetransporter Typ 1 (Bos taurus)
SOF
Synthetic Oviduct Fluid
spp.
Species pluralis
Tab.
Tabelle
TCM
Tissue Culture Medium
TE
Trophoektoderm
TJ
Tight Junctions
130
Anhang
TJP1
Zona occludens Protein 1 (Bos taurus)
u.
und
µl
Mikroliter
μm
Mikrometer
µM
Mikromolar
%
Prozent
131
Anhang
8.3. Einzeldaten der Zellzahlzählung
Tabelle 1: Einzeldaten der Zellzahlzählung nach Differentialfärbung der Gruppen V1, KV1, V2, KV2
und K (GZZ = Gesamtzellzahl, TZ = Tote Zellen)
Lfd. Nr.
V1
KV1
V2
KV2
K
GZZ
TZ
GZZ
TZ
GZZ
TZ
GZZ
TZ
GZZ
TZ
1
182
18
125
13
118
24
133
11
84
6
2
115
10
127
14
121
18
110
5
115
10
3
134
17
92
6
159
19
85
6
119
5
4
159
13
210
19
120
7
88
8
85
11
5
78
9
130
13
149
15
106
9
141
15
6
160
27
124
11
122
15
118
13
138
9
7
108
6
116
11
125
10
100
10
96
3
8
111
10
126
7
126
14
126
10
105
11
9
130
8
123
10
138
16
89
8
98
7
10
107
6
95
3
94
14
147
15
160
19
11
130
7
108
2
108
9
105
6
146
11
12
119
16
123
4
135
9
128
5
95
5
13
65
4
130
9
118
18
166
8
99
5
14
133
9
96
7
128
20
124
10
84
4
15
126
12
104
6
104
18
130
8
102
3
16
95
8
116
9
120
16
85
6
129
9
17
99
12
131
6
128
17
95
11
111
8
18
150
10
114
9
81
16
92
13
105
10
19
93
5
105
16
133
10
98
7
142
7
20
98
5
143
17
142
23
152
11
141
11
21
97
6
106
20
114
8
148
6
22
169
24
151
5
143
6
110
12
23
90
6
118
8
142
14
151
6
24
141
8
114
7
128
7
97
2
25
105
5
87
5
171
14
132
Anhang
8.4. Einzeldaten der RT-qPCR
Tabelle 2: Einzeldaten der RT-qPCR der Gruppen V1, KV1, V2, KV2 und K
V1
KV1
Gentranskript
n
Mittelwert
± SEM
n
Mittelwert
± SEM
SLC2A1
5
86,5
11,3
6
202,6
30,6
TJP1
5
40,7
6,3
6
74,7
8,5
IFNT2
5
52,7
3,4
6
63,6
4,1
HSPA1A
5
19,2
1,0
6
44,1
7,8
DSC2
5
108,3
17,5
6
183,6
14,5
PTGS2
5
156,8
16,4
6
252,0
29,9
V2
KV2
Gentranskript
n
Mittelwert
± SEM
n
Mittelwert
± SEM
SLC2A1
6
132,9
18,6
6
119,1
12,1
TJP1
6
65,1
7,6
6
48,3
14,4
IFNT2
6
59,2
13,9
6
52,7
16,0
HSPA1A
6
50,1
5,5
6
22,8
1,5
DSC2
6
162,5
10,3
6
109,7
PTGS2
6
221,3
15,8
6
175,3
6,7
15,8
K
Gentranskript
n
Mittelwert
± SEM
SLC2A1
5
181,6
26,2
TJP1
5
104,7
8,5
IFNT2
5
35,3
2,9
HSPA1A
5
40,5
3,4
DSC2
5
189,8
13,7
PTGS2
5
220,4
34,7
133
Anhang
8.5. Verzeichnis der Tabellen
Tabelle 1:
Vergleich der Anzahl in vivo und in vitro produzierter boviner
Embryonen 2009 und 2010 (STROUD 2010)
Tabelle 2:
Vergleich der Einfrierverfahren und Einfriermedien hinsichtlich
Überlebens- (ÜR) und Trächtigkeitsraten (TR, EG = Ethylenglycol, n.u.
= nicht untersucht)
Tabelle 3:
Entwicklungsraten boviner Embryonen nach konventionellem
Kryokonservieren mit verschiedenen Kryoprotektiva (VOELKEL u. HU
1992)
Tabelle 4:
Blastozystenraten nach Vitrifikation von Mäusemorulae in Medien mit
verschiedenen Konzentrationen an Kryoprotektiva (n.u. = nicht
untersucht)
Tabelle 5:
Schlupf- und Trächtigkeitsraten boviner in vitro produzierter Embryonen
bei verschiedenen Einfriermethoden (MARTINEZ et al. 1998)
Tabelle 6:
Schlupfraten in vitro produzierter boviner Embryonen bei der
Verwendung verschiedener Kryoprotektiva (SAHA et al. 1996, EG =
Ethylenglycol, PVP = Polyvinylpyrrolidon)
Tabelle 7:
Ergebnisse der Entwicklungsraten boviner Blastozysten bei
verschiedenen Äquilibrierungszeiten im 1. Medium (12,5% DMSO +
12,5% EG) und 30 s im 2. Medium (25% DMSO + 25% EG; ISHIMORI
et al. 1993)
Tabelle 8:
Reexpansions- (ReexR) und Schlupfraten (SR) boviner Blastozysten
nach Vitrifikation durch verschiedene penetrierende Kryoprotektiva (EG,
Glyzerin und PG) in Kombination mit Ficoll und Saccharose
(TACHIKAWA et al. 1993)
Tabelle 9:
Überlebensraten in vitro produzierter boviner Embryonen nach
konventioneller Kryokonservierung in Glyzerin oder Propylenglycol mit
Saccharosezusätzen verschiedener Konzentrationen (SUZUKI et al.
1990, M = Molar)
134
Anhang
Tabelle 10: Reexpansions- und Schlupfraten bei der Vitrifikation von Blastozysten
mit dem Cryoloop-Verfahren (LANE et al. 1999b)
Tabelle 11: Vergleich der Kühlraten verschiedener Vitrifikationssysteme
Tabelle 12: Übersicht über Reexpansions- und Schlupfraten boviner Embryonen
nach Vitrifikation (*Schlupfrate bezogen auf die Anzahl reexpandierter
Embryonen)
Tabelle 13: Durchschnittliche Zellzahl boviner Blastozysten sowie Lebend-TotZellratio nach Vitrifikation oder ohne Kryokonservierung (n.u. = nicht
untersucht, - = keine Vitrifikation)
Tabelle 14: Trächtigkeitsraten kryokonservierter und nicht-kryokonservierter boviner
in vitro produzierter Embryonen unterschiedlicher Herkunft (d=Tag)
Tabelle 15: Vergleich entwicklungsrelevanter Gentranskripte bei in vivo und in vitro
produzierten bovinen Blastozysten
Tabelle 16: Vergleich entwicklungsrelevanter Gentranskripte bei kryokonservierten
und nicht-kryokonservierten bovinen Blastozysten (* = vitrifizierte
Oozyten)
Tabelle 17: Klassifizierung der KOK
Tabelle 18: Zusammensetzung der Gynemed VitriFreeze-Medien
Tabelle 19: Einfrierprotokoll durch Gynemed VitriFreeze-Medien
Tabelle 20: Zusammensetzung der Gynemed VitriThaw Medien
Tabelle 21: Auftauprotokoll durch Gynemed VitriThaw Medien
Tabelle 22: Zusammensetzung und Einfrierprotokoll durch Origio MediCult
Vitrification Cooling Medien
Tabelle 23: Auftauprotokoll durch Origio MediCult Vitrification Warming Medien
Tabelle 24: Ethidium homodimer-Stocklösung, Hoechst-33342 Stocklösung
Tabelle 25: Primersequenzen der verwendeten Primer
Tabelle 26: Ansätze für dir Reverse Transkription (Endvolumen der Ansätze 20 µl)
Tabelle 27: Eingesetzte Embryonenäquivalente der zu untersuchenden
Gentranskripte
Tabelle 28: Ansätze für die Real-Time PCR
Tabelle 29: Anzahl Eizellen, Teilungs- und Entwicklungsraten (MW ± STABW)
135
Anhang
Tabelle 30: Blastozystenverteilung der einzelnen Gruppen
Tabelle 31: Reexpansions- und Schlupfraten der Embryonen nach Vitrifikation
(V1,V2) und Kontrolle [(KV1, KV2);(MW ± STABW innerhalb der
Spalten: a:b:c P≤ 0,05)]
Tabelle 32: Gesamtzellzahl, Anzahl lebender und toter Zellen sowie Lebend-TotZellratio in den Embryonen der verschiedenen Versuchsgruppen (MW ±
SEM innerhalb der Spalten: a:b P≤ 0,05)
Tabelle 33: Zusammensetzung der PBS-Stocklösung
Tabelle 34: Zusammensetzung der PBS-Gebrauchslösung
Tabelle 35: Zusammensetzung der PBS-Complete-Lösung
Tabelle 36: Zusammensetzung der NaCl-Complete-Lösung
Tabelle 37: Zusammensetzung TCM-BSA(FAF)
Tabelle 38: Zusammensetzung TCM-air
Tabelle 39: Zusammensetzung Suigonan (Fa. Intervet GmbH, Tönisvorst)
Tabelle 40: Zusammenstzung der Fert.-Talp-Stocklösung
Tabelle 41: Zusammensetzung der Natriumpyruvat-Lösung
Tabelle 42: Zusammensetzung der Fert.-Talp-Gebrauchslösung
Tabelle 43: Zusammensetzung der Tetrazyklin-Stocklösung
Tabelle 44: Zusammensetzung der Epinephrin-Stocklösung
Tabelle 45: Zusammensetzung Lösungsmittel
Tabelle 46: Zusammensetzung der Hypotaurin-Stocklösung
Tabelle 47: Zusammensetzung der Heparin-Stocklösung
Tabelle 48: Zusammensetzung der Hypotaurin-Epinephrin-Arbeitslösung
Tabelle 49: Zusammensetzung der HHE-Gebrauchslösung
Tabelle 50: Zusammensetzung der Fert.-Talp-HHE-Gebrauchslösung
Tabelle 51: Zusammensetzung der Sperm-Filter®-Gebrauchslösung
Tabelle 52: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung A
Tabelle 53: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung B
Tabelle 54: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung C
Tabelle 55: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung D
Tabelle 56: Zusammensetzung der Glutamin-Stocklösung
136
Anhang
Tabelle 57: Zusammensetzung der SOF-aa(m)-Gebrauchslösung
Tabelle 58: Zusammensetzung des SOF-aa(m)-Kulturmediums
Tabelle 59: Zusammensetzung der PVA/PBS Lösung
Tabelle 60: Zusammensetzung der Ethidium-homodimer-Stocklösung
Tabelle 61: Zusammensetzung der Hoechst-33342-Stocklösung
Tabelle 62: Zusammensetzung der Ethidium-homodimer-Gebrauchslösung
Tabelle 63: Zusammensetzung der Hoechst-33342-Gebrauchslösung
Tabelle 64: Zusammensetzung Lysis/Binding Puffer
Tabelle 65: Zusammensetzung Washing Buffer A
Tabelle 66: Zusammensetzung Washing Buffer B
Tabelle 67: Tris-HCl
Tabelle 68: Einzeldaten der Zellzahlzählung nach Differentialfärbung der Gruppen
V1, KV1, V2, KV2 und K (GZZ = Gesamtzellzahl, TZ = Tote Zellen)
Tabelle 69: Einzeldaten der RT-qPCR der Gruppen V1, KV1, V2, KV2 und K
137
Anhang
8.6. Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 1:
Schematische Darstellung der IVP (modifiziert nach NIEMANN u.
MEINECKE 1993)
Abbildung 2:
Schematische Darstellung physikalischer Prozesse beim
Einfrieren von Zellen (mod. nach Mazur 1977)
Abbildung 3:
Strukturformel Glyzerin
Abbildung 4:
Strukturformel Ethylenglycol
Abbildung 5:
Strukturformel Dimethylsulfoxid
Abbildung 6:
Strukturformel Propylenglycol
Abbildung 7:
Strukturformeln von Saccharose (links) und Trehalose (rechts)
Abbildung 8:
Strukturformeln von Polyvinylpyrrolidon (PVP, links) und
Polyvinylalkohol (PVA, rechts)
Abbildung 9:
Schematische Darstellung des ElektronenmikroskopKupferrasters (EMG)
Abbildung 10:
OPS-Methode nach VJATA et al. 1998
Abbildung 11:
Schematische Darstellung des Cryoloop nach LANE et al. 1999b
Abbildung 12:
Schematische Darstellung eines One-Step-Verfahrens für die
Vitrifikation von Embryonen
Abbildung 13:
Zeitachse der In-vitro-Produktion.
Abbildung 14:
KOK der Kategorien 1-3 (*:1, **:2, ***:3)
Abbildung 15:
Vitriplug; (*: Ansicht von der Seite, **: Ansicht von oben)
Abbildung 16:
Ethidium homodimer
Abbildung 17:
Hoechst 33342
Abbildung 18:
Schematischer Überblick über den Versuchsaufbau
Abbildung 19:
Reexpansions- und Schlupfraten der Embryonen nach
Vitrifikation (V1,V2) und Kontrolle [(KV1, KV2);(MW ± STABW:
a:b:c P≤ 0,05)]
Abbildung 20:
Gesamtzellzahl und Anzahl toter Zellen der Blastozysten der
verschiedenen Versuchsgruppen
138
Anhang
Abbildung 21:
Lebend-Tot-Zellratio in den verschiedenen Versuchsgruppen
(MW ± SEM: a:b P≤ 0,05)
Abbildung 22:
Geschlüpfte Blastozysten nach Zellfärbung mittels Ethidium
homodimer und Hoechst-33342 der Gruppen a) V1, b) KV1, c)
V2, d) KV2 und e) K
Abbildung 23:
Relative Transkriptmenge von SLC2A1 in präimplantatorischen
Embryonen der verschiedenen Versuchsgruppen (MW ± SEM:
a:b < 0,05)
Abbildung 24:
Relative Transkriptmenge von TJP1 in präimplantatorischen
Embryonen der verschiedenen Versuchsgruppen (MW ± SEM:
P a:b < 0,05, P * < 0,1)
Abbildung 25:
Relative Transkriptmenge von IFNT2 in präimplantatorischen
Embryonen der verschiedenen Versuchsgruppen
Abbildung 26:
Relative Transkriptmenge von HSPA1A in präimplantatorischen
Embryonen der verschiedenen Versuchsgruppen (MW ± SEM:
P a:b:c < 0,05)
Abbildung 27:
Relative Transkriptmenge von DSC2 in präimplantatorischen
Embryonen der verschiedenen Versuchsgruppen (MW ± SEM:
P a:b < 0,05)
Abbildung 28:
Relative Transkriptmenge von PTGS2 in präimplantatorischen
Embryonen der verschiedenen Versuchsgruppen
139
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Danksagung
 Mein erster Dank geht an Frau Prof. Dr. med. vet. Christine Wrenzycki für die
Bereitstellung des Themas, die immerwährende große Hilfsbereitschaft bei
der Anfertigung der Arbeit, die Hilfe und Unterstützung in jeglichen Situationen
und die schnelle Korrektur trotz großer Entfernung in der Endphase.
 Weiterhin danke ich den Firmen Gynemed und Origio für die freundliche
Unterstützung durch die Bereitstellung der Vitrfikationsmedien.
 Ein herzliches Dankeschön geht an alle Mitarbeiter der Firma VION in Bad
Bramstedt für ihre Geduld und freundliche Unterstützung beim Sammeln der
Ovarien.
 Danke an Doris Müller für die große Unterstützung im IVP-Labor und an
Sandra Wilkening für die Durchführung der RT-qPCR und die pünktliche
Erinnerung an wichtige Mensatermine.
 Dr. Hanna Stinshoff danke ich für die Unterstützung in der Anfertigung der
Arbeit, für viele aufmunternde Worte, fürs Korrekturlesen und für einen Haufen
„Überlebens-Schoki“.
 Danke an Dr. Ana Hanstedt unter anderem für die Möglichkeit nebenbei noch
ein bisschen OPU zu lernen.
 Ein großes Dankeschön geht an meine Mitstreiter Johanna, Nina, Katharina,
Basti, Friederike und Nicole ohne die unser Büro-Trakt nur halb so lustig
gewesen wäre.
 Meinen Hannover-Mädels Anne-Sophie, Maike, Maren, Sonja, Hellen und
Kathrin danke ich für die großartige Ablenkung vom Doktoranden-Dasein
durch viele Mädels-Abende.
 Schlussendlich möchte ich ganz besonders meiner Familie und vor allem
Michi für die unglaublich große Unterstützung und die Geduld danken. Ohne
euch hätte ich diese Arbeit nicht schreiben können.