1 KAPITEL 1: Xenopus l.: Krallenfrosch: • Phase 1: unbefruchtetes Ei
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KAPITEL 1: Xenopus l.: Krallenfrosch: • Phase 1: unbefruchtetes Ei: animaler Pol (pigmentiert)Æspäter Vorderseite, vegetativer Pol (dotterreich) • Phase 2-8: nach Befruchtung: mitotische Furchungsteilungen • Phase 8: Blastula (nach 12.Ft.) mit Blastocoel, Mesoderm als äquatoriales Band, daneben Entoderm (beide noch an Oberfläche), Ektoderm am animalen Pol. • Phase 10-12: GASTRULATION: Meso und Entoderm wandern durch den Urmund (Blastoporus) ins Zellinnere, Ektoderm. Aus Mesoderm: Chorda dorsalis, Mesodermblöcke seitlich: Somiten. (für Muskeln, Dermis, WS) • Phase 12-15: NEURULATION: Ektoderm zu Neuralrohr über der Chorda. NeuralrohrÆGehirn, Rückenmark, Anlagen für Kiemen, Gliedmaßen, Augen • Phase 26: ORGANOGENESE: Differenzierung von spezialisierten Zellen wie für Muskeln, Neuronen, Knorpel, nach 48 Std. voll entwickelt Ursprünge Entwbio: Aristoteles: • Epigenese: neue Strukturen permanent, Erschaffer, metamorphisches Netzwerk, blank slate „Schöpferwille“ • Präformation: Humunculus, Schöpfer nur zu Beginn, Wiss. des 17.Jh., reine Größenzunahme, P. ist statischÆWiderspruch zu Evolution Zelltheorie: M. Schwann u. T. Schleiden: Lebewesen aus Zellen, durch Teilung aus anderen Zellen., Ei=Zelle Keimzellen: August Weisman: Keimzellen Träger der Eigenschaften. Die E. zu Lebzeiten sind nicht auf Keimzellen übertragbar. Körper = nur Träger Keimbahn: entstehen Körper- und Keimzellen. Für Vererbung Æ Keimzellen. Mutationen an Körperzellen: an Tochterz. weitergegeben aber nicht an Keimbahn. Mutationen der KeimzellenÆEinfluss auf Keimbahn. Haploide Keimzellen und diploide Zygote: 19.Jh.: Seeigeleier: KernverschmelzungÆphysikalische Grundlage der Vererbung. Zygotenkern aus zu gleichen Teilen elterlicher Chr. Chr.zahl konstant durch Meiose (Reduktionsteilung)Ædurch Befruchtung wieder diploid (Mendels 2 Allele) Weismanns Kern-Determinanten: Mosaikmodell Zygotenkern mit DeterminantenÆasymmetrische FurchungsteilungÆasymmetrische Verteilung auf TochterzellenÆuntersch. Tochterzellen Wilhelm Roux Experiment: Frosch: nach 1.Ft. eine Zelle durch heiße Nadel abgetötetÆHalblarveÆMosaikmechanismus Hans Driesch Experiment: nach 1.Ft. wird eine Zelle getrenntÆkleine vollkommene LarveÆRegulation Induktion: Ein Gewebe steuert Entw. des benachbarten Gewebes Hans Spemann+ Hilde Mangold: Organisatortransplantationsexperiment: Gewebsstück aus dorsaler Unterlippe (=Blastoporus, OrganisatorÆBeginn d. Gastrulation) des Urmundes wird entgegengesetzt in anderes Molchembryo transplantiertÆinduziert neue Körperachse mit Neuralrohr und Somiten. Spendergewebe: Chorda, Wirtsgewebe: Neuralrohr und andere StrukturenÆ2.Teilembryo Genetik u. Entw.biologie: • Unterscheidung Genotyp, Phänotyp (Wilhelm Johannsen) • Gene codieren Proteine, Proteine geben Zellen ihre Eigenschaften KAPITEL 2: Entw. = fortschreitend, Zellschicksal zu versch. Zeiten festgelegtÆ Zunahme an Zellen, an organisatorisches Komplexität (viele Zelltypen, räuml. Muster, Formveränderungen). Veränderungen graduell nach Ordnungsprinzipien über Einteilung in breite Regionen (Keimblätter) zu Zelltypen. Morphogenese: Formveränderung, strukturelle Veränderungen im Prozess + ihre Mechanismen Determination: Festlegen auf schwer umkehrbaren Differenzierungsweg Entwicklung: artspezifische Form- und Funktionsveränderungen: Wachstum, Diff., Morphogenese 1 Musterbildung: Aufbau von räuml. und zeitl. Muster von Zellaktivitäten, Körperbauplanfestlegung, Achsendefinierung im re. Winkel zueinanderÆZellen auf Keimblätter verteilt und erhalten Identitäten, sodass organisierte räuml. Muster von Zelldiff. Entstehen. In frühen Stadien geringer Untersch. zw. Zellen. Muster: nicht zufällige Verteilung von Zelltypen in einzelnen Organen od. im Körper Gastrulation: Zellen von Außenseite wandern ins Zellinnere, Gastrula mit Urdarm (durch Mitte) Zelldifferenzierung: Spezialisierung hinsichtlich Struktur und Funktion (Blut, Muskel, Haut), eng verknüpft mit Musterbildung Wachstum: durch Zellvergrößerung, -vermehrung, Ablagerung v. extrazell. Mat. wie Knochen, Schale. Untersch. Wachstumsgeschw. Æ Gestaltveränderung Zellverhalten: untersch. Genaktivität der Zellen für Musterbildung. Interaktionen durch Signale. Physikalische Kräfte (Faltung)ÆMorphogenese, Zellproliferation für Wachstum (untersch. Geschw.), ApoptoseÆ Modellierung. Gene codieren Proteine und steuern Zellen • • Haushaltsproteine: Energieerzeugung, biochm. Reaktionen Luxusproteine: gewebsspezifisch, untersch. Zellen Manchmal noch posttranslationale Modifikation. Transkriptionsfaktoren binden an Kontrollregionen d. GeneÆwichtig für Entw. Zellschicksal, Determination, Spezifikation: Spezifikation: wenn Zelle isoliert in neutralem Kulturmedium frei von Induktionssignal sich gemäß Entwicklungsschicksal entwickelt, muss noch nicht determiniert (interne Zustandsveränderung) sein, da Entw. abh. von anderen Zellen. TransplantationsexperimenteÆGrad der Determination. Mosaik – bzw. regulative Entwicklung: Zellen des frühen Embryo weniger determiniert • Mosaikembryo: Entw. nach fate mapÆDetermination in frühem Stadium, Teile entw. sich unabh. Æwenig Zell-Zell-Interaktion • Regulationsembryonen: Entw.potential größer als eigentliches SchicksalÆviel Komm. Induktion: Zellgruppe beeinflusst Entw. benachbarter Zellgruppe, drei Signalübertragungswege: 1. sezerniertes, diff.fähiges Molekül wird durch extrazell.Raum an Rezeptor geleitet 2. komplementäre Proteine auf Zelloberfläche empfangen Signal 3. gap junctions: spezialisierte Porenproteine, zB. Plasmodesmen Zell-Zell-Kommunikation: Kompetenz: Rezeptor, Signaltransduktionsweg oder Transkriptionsfaktor muss vorhanden seinÆKompetenz änderbarÆdeshalb Signale selektivÆso können Gene beliebig an- und abgeschaltet werden, Evo ist faul. French flag: zweidimensional: Durch Konzentrationsgradienten erhält Zelle Positionswert, der durch Morphogenkonz. an dieser Stelle definiert istÆ dann Interpretation des genet. Programms. Grundvoraussetzung: Morphogenkonz. muss an jedem Ende des Gradienten untersch. aber konstant bleibenÆGrenzendefinierung. Interpretation: beruht auf untersch. Schwellenwert ggüber untersch. Morphogenkonz. Schwellenwert: Menge an besetzten Rezeptoren, od. an aktivierten Transkriptionsfaktoren. French flag model: adaptiv, regulativ. Muster: Laterale Hemmung: Räuml Muster durch Lateralinhibition: gerade diff. Zelle sezerniert Hemmstoff, der benachbarte Zellen hindert das selbe zu tun: Federn, Spaltöffnungen Zellidentität Untersch. Tochterzellen sind nicht umwelt-, sondern abstammungsabhängig. French flag: zu den Farben müssen untersch. Faktoren in der Eizelle verteilt seinÆTeilungÆcytopl. Faktoren entsprechend auf Zellen verteilt bilden Flagge. Keine ZellinteraktionÆMosaikkonzept (z.B. Nematodenei, Drosophila). Wenn asymmetr. Lokalisation von Morphogen in Ursprungszelle (d.h. auf einer Seite konzentriert)Æ untersch. Tochterzellen aufgrund asymmetrischer Verteilung da eine Zelle Morphogen enthält und andere nicht. Stammzellen: Zellen, sie sich selbst erneuern und diff. Zellen hervorbringen • Asymmetrische ZellteilungÆ 1 Stamm- u. 1 diff. Zelle, durch cytopl. Determinanten od. externe Faktoren • Symm. Zellteilung einer Stammzellpop. Æ 50% Stamm- u. 50% diff. Zellen Genom enthält generatives, kein deskriptives Entw.programm, mit Instruktionen des Wie. Untersch.: Entw.programm bezieht sich nur auf einen Teil des genet. Programms, der eine Zellgruppe steuert. Jede Zelle hat eigenes Entw.programm, das sich im Laufe der Entw. ändert. Zuverlässigkeit der Entw.: • Fluktuationen im Embryo und in der Umwelt 2 • Redundanz: versch.MechanismenÆselbes Ergebnis, neg. Rückkoppelung (Endprodukt wirkt auf frühen Prozess und kontrolliert Morphogenmenge, enge Netzwerke d. Regulationswege KAPITEL 3: Modellorganismen: Wirbeltiere: Gemeinsamkeiten: BefruchtungÆ FurchungÆGastrulation. Unterschiede: wenn kein DotterÆ extrazell. Strukturen und Plazenta. Ähnlichkeit: im phylotypischen Stadium nach Gastrulation. Körpergrundbauplan eines Vertebraten: • • • Kopf Rückgrat aus Somiten (Hals, Brust, Lende, Becken/Schwanz) 2 Gliedmassenpaare Entwicklungsstadien: Zeit= schlechtes Maß, da umweltabhängig. Xenopus, HuhnÆTabellen mit Stadien, Maus: Einordnung nach Struktur (stabile Temp. Im Körperinneren): post coitum, Somitenanzahl. 1.) Xenopus laevis: Krallenfrosch Xenopuseier (durch Behandlung mit Choriongonadotropin), widerstandsfähig, infektresistent Befruchtung, Frühentwicklung: Vor Befruchtung: Ei mit Vitellinhülle. 1. meiotische Teilung: 1.Polkörper am animalen Pol, 2.meiotische Tlg. Wird nach der Befruchtung vollendetÆ2.Polkörper. Sperma dringt in animaler Region einÆAbschluss der Meiose (2.Pk.). KernverschmelzungÆAbhebung der VitellinschichtÆ innerhalb v. 15 min. Rindenrotation in Richtung Spermaeintrittstelle (dotterreiche, vegetative Reg. Zeigt nach unten). Rindenrot. Legt zukünftige dorsale Seite festÆggüber Spermaeintrittstelle. • 1.Furchung: in 90 min. nach Befr. längs der animal-vegetal-Achse, weitere Furchungen in 20min. Intervallen • 2.Furchung: senkrecht zur ersten • 3.Furchung. äquatorial, im re. Winkel zu den beiden ersten, je 4 animale und vegetative (größer) Zellen • weitere TeilungenÆ insg. 12. Innen: Blastocoel in Animalregion. Embryo= Blastula. Nun sind mesodermale und entodermale Keimblätter in der äquatorial und vegetativen Region=Außenseite. EktodermÆAnimalregion. Blastula und Gastrulation: Gastrulation beginnt am Urmund (Blastoporus, dorsal ggüber Spermaeintrittstelle, später After). Embryo= Gastrula. Zukünftiges Meso und Entoderm der Marginalzone wandert durch die dorsale Urmundlippe in das Innere, wächst aufeinander zu unterhalb des Ektoderms entlang der Längsachse weiter. Ektoderm breitet sich über dotterreichen vegetativen Zellen aus, um Embryo zu umschließenÆEpibolie. Mesoderm endet zw. Ento- u. Ektoderm, in Animalregion. Durch UmlagerungenÆArchenteron (Urdarm) von Entoderm ausgekleidet, da es ebenfalls durch Urmundlippe wandert. Zw. Dorsaler und ventraler Blastoporuslippe ÆDotterpfropfen. Ende: Blastocoel kleiner, Urmund geschlossen. Während Gastrulation: aus MesodermÆ Notochord (entlang dorsaler Mittellinie) und Somiten (durch schrittweise Segmentierung in Längsrichtung. Neurulation: NeuralrohrÆNS-Vorläufer. Während Chorda u. Somiten bilden beginnt Ektoderm Neuralwülste an Rändern der Neuralplatte zu bilden, sie schwellen an, falten sich zur Mittellinie u. verschmelzen zu Neuralrohr, das unter Epidermis absinkt. Embryo= Neurula. Vorderer Neuralrohr Teil: Gehirn, hinten über Chorda liegend: Rückenmark. Während N. anterio-posteriore Achsenverlängerung. Erkennbare Strukturen: Chorda, Somiten, Seitenplattenmesoderm, Entoderm (Darmkleid), dorsale Somitenregion: Dermatom. Organogenese: Kopfbereich: zukünftiges Auge, Ohrbläschen. Gehirn (Prosencephalon, Mesencephalon, Rhombencephalon), hinterm Mund: drei Kiemenbögen (1. wird Unterkiefer ausbilden). Weiter hinten: Somitenreihe. Pronephron (Niere) aus Seitenplattenmesoderm. Ventral dazu: Darm. Teil hinter Anus wird zuletzt gebildet: Schwanzknospe (=Forsetzung d. Somiten, Neuralrohrs u. Notochord) an dorsaler Urmundlippe Neural crest cells (Zellen d. Neuralleiste)Æsensorisches u. autonomes NS, Schädelknochen, Pigmentzellen. Kaulquappe schlüpftÆspäter MetamorphoseÆSchwanzrückbildung, Gliedmaßenbildung. 2.) Vögel: Huhn: Ausserhalb d. Eies kultivierbar. Befruchtung in Eileiter u. Beginn von Furchungen. Cytoplasma+Zellkern wenige mm im Ggsatz zu Dotter. FurchungÆAusbildung der Keimscheibe/Blastoderms. 20-stündige Passage durch Eileiter: Ei wird mit Albumen, Eihüllen u. Kalkschale umhüllt. Eiablage: Blastoderm mit ca. 60 000 Zellen, auf Dotter, mit Eiweiß und Eischale umhüllt. 3 Lebenszyklus: Nach Eiablage Fortsetzung der Furchungen mit Bildung von Furchungsrinnen. In frühem Furchungsstadium: Rinnen ziehen von Oberfläche des Eicytoplasmas in Tiefe, trennen Zellen nicht vollständig, ventral ist Blastoderm zum Dotter hin offen. Durch FurchungÆKeimscheibe (mehrere Zelllagen): zentraler Bereich: Area pellicuda (durchscheinend, über SubmarginalhöhleÆdarunter Dotter). Area pellucida: dünklere, äußere Region. zw. Area p. und Dotter=Submarginalhöhle, zw. Submarginalhöhle und Dotter entsteht nun Zellschicht=Hypoblast (Zellen aus post. Marginalzone, Übergangsbereich von Area o. zu Area p., u. von den drüber liegenden Zellen der Keimscheibe). Aus HypoblastÆextraembr. Str. wie Dottersackstiel, eigentlicher EmbryoÆEpiblast (verbleibende Keimscheibenzellen). Gastrulation: Posteriore Marginalzone= leicht verdickte Region des Epiblasten, die Dorsalseite und Hinterende bestimmmt. G. beginnt mit Primitivstreifenbildung (Längsachsenvorläufer) aus hinterer Rand/MarginalzoneÆ16 Std. nach Eiablage volle Länge. Zunächst dichter Streifen von posteriorer Marginalzone bis Mitte der Keimscheibe (über Hälfte der Area p.). Im Streifenbereich proliferieren Epiblastenzellen und wandern durch Primitivstreifen nach innen unter die obere Schicht. Während Primitivstreifen über Area p. ausbreitet wandern Epiblastenzellen der post. Mz. Nach vorne. Die durchwandernden Zellen bilden unter der Oberfläche Mesoderm und Entoderm, während aus Oberflächenschicht des Epiblasten das Ektoderm wird. Zukünftiges Mesoderm verdrängt Hypoblasten, Mesoderm als Schicht zw. Ekto- u. Entoderm. Im Gastrulationsverlauf wird Area p. birnenförmig. Am Vorderende des Primitivstreifens: Hensenscher Knoten (Primitivknoten) =Zellanhäufung. Wenn Zellwanderung größtenteils abgeschlossenÆPrimitivstreifenrückbildung. Nun wandert H.k. zum post. Ende Kopffalte u. Neuralplatte bilden sich. Kopffalte (ekto- u. entodermale Ausstülpung d. Blastoderms) grenzt Kopfbereich vor Knoten ab. Knoten bewegt sich nach hintenÆunmittelbar davor: Chorda und Somiten aus H.k.zellenÆ 25Std. nach Eiablage: 7 Somitenpaare. Nächstes Somitenpaar aus undiff. Mesoderm zu beiden Chordaseiten in post. Richtung mit 1Somitenpaar/h. Bildung des Notochord, dann Neuralrohr, Entw. In anterio-posteriorer Richtung. Neurulation: Über dem Neuralrohr liegende Neuralplatte: sequentielle Auffaltung des Ektoderms von vorne nach hinten. Wülstverschmelzung längs dorsaler Mittellinie, von Fusionsstellen der Neuralleiste lösen sich Zellen. Gleichzeitig: Kopffaltenentw. ÆKopf wird v. Epiblastenoberfläche abgetrennt. Glztg. Faltung der ventralen Körperseite mit Entodermeinschließung und Darmbildung. Mesodermdifferenzierung: Intermediäres M.in Rumpfregion: Nierenteile. Splanchisches M.: Herzen (zuerst zwei Anlagen). Körperfalte/Darmbildung bringt paarig angelegte Organe zusammenÆ bilden endgültige Organe ventral vom Darm (ÆHerzrudimente zu einem Organ). Somiten werden zu Wirbeln, Achsen- und. Gliedmaßenmuskulatur und Dermis. 2 Tage nach Eiablage: 20 Somitenstadium. 3.Tag: 40 Somiten, Kopf ausgebildet, Gliedmaßen beginnen zu entw. Extraembryonal: (=weitester ventral gelegener Lateralmesodermteil) Blutgefäße u. Blutinseln (Hämatopoese). Gefäße verbinden sich mit EmbryoÆKreislaufsystem mit schlagendem Herz. In diesem Stadium: Embryo dreht sich mit stark zur Brust geneigtem Kopf zur Seite. Ernährung+Schutz durch extraembr. Membranen. Chorionumhüllung d. Embryo(=unter Schalenmembran). Allantois: nimmt Stoffwechselprodukte auf, Sauerstoff- u. Kohlenstoffdioxidaustausch. Ateria umbilicalis: transportiert Stoffwechselabfallprodukte zur Allantois, Vena umbilicalis bringt O2 zu Embryo. Dottersackmembran mit Dotter. Vitelinvene: Nährstoffzufuhr von Dottersack zu Embryo, Vitellinarterie: Blut fließt zu Dottersack zurück. Organogenese bis Schlüpfen: Augen, Innenohr, Flügel, Beine, Schnabel, innere Organe. 21 Tage nach EiablageÆKüken schlüpft. KAPITEL 4: 3.) Säugetiere: Maus: Lebenszyklus: 9 Wochen, gut für gen. Analysen und Mutantenherstellung. Embryonenentwicklung In Mutter erschwert Einfriffe, trotzdem für kurze Zeit auch außerhalb kultivierbar. Befruchtung, Frühentwicklung: Eibefruchtung in EileiterÆMeioseabschluss mit 2.Polkörperbildung. Ei 100µm. Außen: Zona pellucida (Mucopolysaccharide+Glycoproteine)=Schutz. Nährstoffe über Plazenta. Furchung in Eileiter: Serh langsam: 1. 24Std. nach Befruchtung, weitere in 12Std. Intervallen. 8-Zell-Stadium: Kontaktflächenvergrößerung der Blastomeren, über die sie sich berührenÆVerdichtungÆkompakte Morula: Außen: Mikrovilli, innen: glatt. Weitere Furchungen rafial u. tangential. Morula: mehr äußere als innere Zellen. Aus frühen Furchungen gehen zwei Zellgruppen hervor: Trophektoderm u. innere Zellmasse. Inneren Morulazellen= innere Zellmasse, äußeren= Trophektoderm (Æbildet extraembryon. Strukturen wie Plazenta). Embryo: aus kleiner Anzahl an Zellen der inneren Zellmasse. 3 ½ Tage nach Befr.: Embryo=Blastocyste. Trophektoderm pumpt Flüssigkeit ins BlastocysteninnereÆAusweitung zu flüssigkeitsgefülltem Vesikel, das an einer Seite innere Zellmasse als kompakten Zellklumpen enthält. 3 ½-4 ½ Tage nach Befr.: innere Zellmasse teilt sich: Oberflächenschicht, die mit Blastocystenhöhle in Kontakt istÆprimitives Entoderm (Æextraembr. 4 Strukturen). Übrige innere Zellmasse: primitives Ektoderm od. Epiblast (Æ Embryo, extraembry. Membranen). Nun Ablösung des Embryos aus Zona pellucida und Einnistung in Gebärmutterwand. Bei Einnistung replizieren Zellen der muralen Trophektodermwand (jene, die mit flüssigkeitsgefüllter Höhle in Kontakt stehen) ihre DNA ohne sich zu teilenÆ riesige Trophektodermzellen entstehen die bei Einnistung in Uteruswand eindringen. Restliches Trophektoderm: wächst zu ektoplazentalen Kegel und extraembryonalem Ektoderm (ÆPlazentabildung). Einige primitive Entodermzellen wandern aus und bedecken die gesamte innere Oberfläche des muralen TrophektodermsÆdiese Schicht=parietales Entoderm. Restlichen primitiven Entodermzellen umwachsen EpiblastenÆviscerales Entoderm (hüllt Eizylinder ein=Zylinderstruktur mit Epiblast u. extraembryonalem Gewebe vom polaren Trophektoderm), der sich in die Länge zieht und Epiblast enthältÆ Elongation. Durch Ausbildung des extraembry. Ektoderms wird Epiblast nach unten gedrückt, wodurch Blastocoel fast verschwindet. Epiblast wird länger und erhält HöhleÆeinschichtig gekrümmte Ephitelschicht als Becherform (1000 Zellen)Ædaraus eigentlicher Embryo. Zukünftige Körperachse nach 6 ½ Tagen sichtbar, wenn mit Primitivstreifenbildung Gastrulation einsetzt. Ps. Beginnt als eine lokale Verdickung an einer Stelle außen am Becher, wo später Embryohinterende ist. Innenseite des BechersÆwird zu Dorsalseite. Gastrulation: Beginn: profilerierende Epiblastenzellen wandern durch Primitivstreifen, breiten sich zur Seite und nach vorne zw. Ektoderm und visceralem Entoderm aus, bilden so mesodermale Schicht, die später zu Meso- u. Entoderm wird (Inversion). Primitivstreifen: verläuft am post. Ende von Innenseite bis Außenseite des Epiblasten bis unter viscerales Entoderm, dehnt sich in anteriorer Richtung aus. Einige Epiblastenzellen( später Entoderm und Darm), dringen in viscerale Schicht ein und ersetzen ihn schrittweiseÆElongation des Primitivstreifens (zuerst in Richtung Vorderseite). Dort Zellverdichtung (wie H.k.). Aus Zellen die durch Primitivknoten in anteriore Richtung wandern wird Chorda dorsalis. Chorda u. Somiten entw. sich auf Vorderseite des Knotens. Zellen durchwandern Mesoderm, bilden Entodermschicht (später Darm) u. ersetzen vollständig viscerale Entodermzellen. Weiters: Bildung v. extraembry. Mesoderm am posteriorem Ende des PrimitivstreifensÆsomit Amnion-, Visceraldottersack, Allantois und ChorionbildungÆwichtige Plazentabestandteile. Endstadien: 8 ½ Tage n. Befr. Organogenese im Vorderteil d. Embryo: Herz, craniale Neuralwülste (vorne,dorsal) u. Somiten. Dann umfassende Faltungen im EmbryoÆEntoderm bedeckt zunächst ventrale Oberfläche d. Embryos, verlagert sich nach innen u. bildet Darm. Herz u. Leber nehmen Stellung, Kopf beginnt sich abzuzeichnen. Zw. 8 ½ -9 ½ Tag: Drehung, sodass schützendes Amnion u. Amnionflüssigkeit ihn umhüllt. Viscerales Dottersack umgibt Amnion u. Allantois verbindet Embryo mit Plazenta. Nach 9 tagen: Kopf erkennbar, Vorderextremitätenentw., Organogenese am Anfang wie bei Huhn. 4.) Zebrafisch: Lebenszyklus 12 Wochen, durchsichtig, kleines Genom Befruchtung, Frühentwicklung: Durch Furchungen: Blastoderm Hüllschicht(=Außenschicht)+zukünftiges Ektoderm, darunter Tiefenschicht+zukünftiges Meso- u. Entoderm, liegen auf Dotter. Drunter: syncytiale Dotterzellschicht (Æbildet extraembryo. Gewebe)Blastodermzellenausbreitung in vegetative Richtung durch EpibolieÆbedecken obere Dotterhälfte zunächst becherförmig,schließlich Umhüllung d. gesamten Dottermasse. 5 ½ Std. nach Befr.: erstrecken sich Blastodermz. über die halbe Strecke bis zu veg. PolÆnun Gastrulation mit Involution. Gastrulation: Als Einwärtsbewegung. Zukünftige Ento- u. Mesodermzellen d. Tiefenschicht am Rande des Blastoderms strömen nach Innen Richtung zukünft. DorsalseiteÆstrebt auf Mittellinie und dehnt sich aus, während Elongation in antero-post. Richtung. Zukünft. Meso- u. Entoderm schließl. unter Ektoderm. Gastr. Wie bei Xenopus, Unterschied: Einrollbeweg. am Blastodermrand fast überall gleichzeitig. Nach 9Std.:Chorda, nach 10Std.: G. abgeschlossen Neurulation: Elongation u. Anlagen für primäre Organsysteme Nach ca. 10Std.: anterior erste Somiten, nächsten in Intervallen von anfänglich 2, später 3Std. Nach 18Std.: 18 Somiten. NS entw. schnell, Optische Bläschen( für Augen) nach 12Std. als Gehirnausstülpungen sichtbar. Nach 18Std.: Körper zuckt, nach 48Std.: Schlüpft Embryo. Wirbellose Tiere: Gemeinsamkeiten: Furchung, Blastulabildung od. Blastoderms, Gastrulation. Weniger Embroynenzellen als Vertebraten. Stereotypes Furchungsmuster: Schicksal einzelner Zellen verfolgbar. 1.) Taufliege: Drosophila melanogaster: 5 viele Mutanten, kurze Generationszeit, viele Nachkommen, kleines Genom (13600), gut erforscht. Lebenszyklus: befruchtetes Ei-syncytiales Blastoderm-Embryo-Schlüpfung-Larve-Puppe-erwachsenes Tier. Befruchtung und Frühentwicklung: Spermium durch Mikropyle in anteriore EiregionÆZellkernverschmelzungÆmitotische Teilungen d. Zygotenkerns (alle 9 min.)Æohne Cytokinese also Syncytium (viele Zellkerne+gemeins. Cytoplasma). Nach 9.Tlg.: Zellkerne wandern an Peripherie u. bilden syncytiales Blastoderm. 3Std. nach Befr.: Zellwände von Eioberfläche eingezogen=Zellkerneinschließung=zelluläre Blastodermbildung. Nach 13 Mitosen: richtige Zellen des Blastoderms. 15 Zellkerne bleiben als Polzellen am Hinterende übrigÆspäter Keimzellen. Aufgund Syncytiums: große Moleküle zw. Zellkernen diffundierbar. Einzige Ephitelschicht: zukünf. Mesoderm=weitesten ventralgelegene Region, Mitteldarm aus 2 Bereichen d. präsumptiven EntodermsÆVorder- u. Hinterende d. Embryos. Gastrulation: 3Std. nach Befruchtung: zukünft. Mesoderm in Bauchregion stülpt sich einÆFurche entlang ventraler Mittellinie Ædaraus innen liegende Röhre. Mesodermzellen lösen sich von Röhrenoberflächenschicht ab u. wandern unter Ektoderm an Innenstellen, wo sie später Muskel- u. Bindegewebe bilden. Hauptnervenstrang auf ventraler Seite (Wirbeltiere: dorsal). Nach Mesodermeinstülpung verlassen Ektodermalzellen (später NS) einzeln Oberfläche u. lagern zw. Ventralem Ekto- u. Mesoderm zu einer Neuroblastenschicht. Gleichzeitig entwickeln sich 2 röhrenförmige Einstülpungen an beiden Seiten des zukünft. Anterior. U. post. MitteldarmsÆwachsen nach innenÆverschmelzen zu Entoderm des Mitteldarms, während Ektoderm hinter ihnen an beiden Seiten nach innen gezogen Vorder-u. Enddarm bildet. Äußere EktodermschichtÆEpidermis. Erst nach Beendung d. G. Zellteilung. Epidermiszellen teilen sich nur 2mal bevor sie Cuticula ausscheiden. Während G. dehtn sich Keimstreifen (germ band, ventrales Blastoderm) aus u. drängt post. Rumpfbereich um das Hinterende herum auf bisherige Dorsalseite. Nach Abschluss d. Entwicklung: Keimstreifen zieht sich zurück. Bei Ausdehnung: ersten Segmentierungen, glzt. Reihe gleichmäßiger VertiefungenÆ Grenzen d. ParasegmenteÆspäter Larvensegmente. Parasegmente u. Segmente ggeinander verschoben: 1 Segment je aus Hinterteil des einen u. Vorderteil des folgenden Parasegments. 14 Parasegmente, 3 Mundteile am Kopf, 3 Thorax- u. 3 Abdominalsegmente. Larvenstadium: 24 Std. nach Befr. Schlüpfung. Strukturen d. vorderkopfregion: Akron, weitest hinteren Strukturen= Telson. Dazw. Drei Thorax u. 8 Abdominalsegmente. Jedes Segment auf Ventralseite mit Dentikelstreifen (segmentcharakteristisch). Larve frisstÆwird größerÆ2x HäutungÆwirft Cuticula abÆjedes Stadium=Larvenstadium. Metamorphose: Wenn Larve nach 3. Larvenstadium zur Puppe wird und durch Hormone gesteuerte Metamorphose durchläuft erscheinen Flügel u. Beine. Organe u. Gliedmaßen in Larve als Imaginalscheiben. Kleine Plättchen aus zukünft. Epidermalzellen, aus zell. Blastoderm, je ca. 40 Zellen. Scheiben wachsen während Larvenstadien und bilden gefaltete Epithelsäckchen, um ihre Größe anzupassen. Imaginalscheiben für je 6 Beine, 2 Flügel u. Halteren, Genitalapparat, Augen, Antennen u. Kopfstrukturen. Durch Metam. Entw. zu adulten Strukturen. Injedem Abdominalsegment: Gruppe v. ca. 10 HistoblastenÆteilen sich nicht, während Met. Bildung der abdominalen Cuticula beteiligt. KAPITEL 5: 2.) Fadenwurm: Caenorhabditis elegans: Lebenszyklus: befruchtetes Ei-Furchung-Embryogenese-Schlüpfen-4Larvenstadien-erw. Wurm. Vorzüge: 19.000 Gene, 558 Zellen im 1.Larvenstadium (invariante cell lineage), durchsichtig, 1mm 70µm, können in großer Zahl auf Agrarplatten wachsen. Eier u. frühe Larvenstadien in fl. N eingefroren werden, Fortpflanzung: induzierte Fremdbefruchtung od. Selbstbefruchtung (Inzuchtlinien) erwachsener Hermaphroditen (Zwitter). Unter besonderen Umständen auch ♂. Embryonalentw. Schnell: Larve schlüpft bei 20° nach 15Std., Reifung gesamt 50Std. Befruchtung u. Frühentwicklung: Eizelle 50µm. BefruchtungÆPolkörperÆVor Kernfusion abortive FurchungÆKernfusion u. eigentliche Fuchungen: 1. asymm.: es entstehen eine große anteriore AB u eine kleinere posteriore P1-ZelleÆFurchung: AB in Aba u. Abp, p1 zu P2 u. EMS. P2=posterior, Abp=dorsalÆHauptachsen. Durch weitere ABzellfurchungen entstehen Hypodermis (Wurmaußenschicht), Neuronen u. Muskel. EMSÆ E (Verdauungstrakt) u. MS (Muskulatur, Drüsen, Coelomocyten, NS). Weitere PTeilungen: wie Stammzellen: 50% d. Tochterzellen (C u. D) zu Geweben, 50% (p2 u. P3) fungieren als Stammzelle. Aus P2ÆP3 u. C (Muskel, Hypodermis, Neuronen). P3ÆP4 (Keimzellen) u. D (Muskeln). Muster genau definiert. 6 Gastrulation: Im 28-Zell-Stadium, sobald Nachkommen der E-Zellen (Darmbildung) nach innen wandern. Apoptose wichtig für Entw. Æ nicht alle Zellen überleben Larvenstadium: Larve wie erw. tier ohne Geschlechtsreife (Keimdrüsen, vulva). Postembryonal: 4 Häutungen. Larve: 558 Zellkerne, Hermaphrodit 959 som. Zellen +viele Keimzellen (manche Zellen Syncytien). Erwachsenentierzellen größtenteils von P-Zellen entlang der Körperachse. Jede dieser Blastenzelle gründet invariante Tellinie, die bis zu 8 Zellteilungen durchläuft. Vulva zb aus Blastenzellen P5, P6 u. P7. Zahl an Keimbahnzellen ist variabel. Modellorganismen: Höhere Pflanze: Lebenszyklus: befruchtetes Ei- Embryo-Samenkorn-Keimling-Wachstum u Reifungs-Gametogenese Arabidopsis thaliani: Lz. 6 Wochen, 25 000 Gene, zwittrig, Selbstbefruchtung, Inzuchtlinien Blütenpflanze aus bodenständiger Blattrosette, verzweigte Blütenstängel mit Blütenstand am Ende. Jede Blüte: 4 Kelchblätter (Sepalen) von 4 weißen Blütenblätter umgeben. Im Inneren d. Blütenblätter (Petalen): 6 Staubblätter (Stamina) mit ♂-Pollen+zentraler Fruchtknoten aus zwei Carpellen, der Samenanlage hat. Jede Samenanlage hat eine Eizelle. Im Fruchtknoten wird Eizelle durch ♂-Zellkern eines Pollenkorns befruchtet. Nach Befr. ÆEmbryoentw. In Samenanlage, 2 Wochen bis Samenkornreife, 3-4Wochen nach Samenkeimung Blütenknospen. In Samenanlage wird Ei mit Endosperm (Gewebe) ernährt. Frühes Embryo: viele, klein, undiff, Zellen, aus denen 3 Gewebe entw.: 1. äußere Epidermis, 2. künftiges Gefäßgewebe (im Zentrum d. Hauptachse u Keimblätter), 3. Grundgewebe (umgibt Gewäßgewebe). Befruchtung u. Embryonalentwicklung: Eizelle durch ♂-Staubblätterbefruchtet. Pollenkorn auf Oberfläche eines Blatts bildet durch Fruchtblatt hindurchwachsendes Schlauch, das haploide Pollenzellkerne zu einer Samenanlage transpoertiert. 1 Zellkern befruchtet Eizelle, 2. verschmilzt mit Polkernen, die zu triploidem Endosperm werden. Frühe Zellteilung: 2 Teile: eigentl. Embryo u. fadenförmiger Suspensor (Nahrungsquelle). Ersten Furchungsmuster bis 16-Z-St. immer gleich. 8Zstd.: Embryo von Suspensor unterscheidbar. Anlagenplan erstellbar. Obere Zellreihe: Keimblätter/kotyledonen (Speicherorgane). Arabidopsis dikotylÆ2Keimblätterausbildung, unten (wo Suspensor auf Embryo trifft)=Wurzel. Im 16Zstd. Dermatogen (Epidermalschicht) vorhandenÆdann globulärer Stadium: Gefäß-u.Grundgewebe erkennbarÆweitere Teilg.: Herzstadium (2 Keimblätter flügelartig)Æweitere Keimblätter- u. Hypokotylausdehnung. Zukünft. Apikales Sprossmeristem=Zellhaufen zw. Keimblättern in Ruhestand bis Keimung. Apikalmeristeme aus undiff., unaufhörlich teilenden ZellenÆentw. sich an beiden Enden der Hauptsprossachse u. bilden Wurzel u. Spross des Keimlings, sowie sämtliche adulte Strukturen. Reifer Embryo: 2 Kotyledonen am apikalen Ende (Spross) des Hypokotyls, das an diesem Ende Spross-, am anderen Wurzelmeristem aufweist. Embryo in Samenanlage wird zu SamenkornÆEinschluss in SamenhülleÆBis Bedingungen Keimung auslösen. Meristem erst nach Embryon.stadium aktivÆSpross u. Wurzel werden länger,bis Spross an Erdoberfläche gelangt u. mit Photosynthese u. Blattentw. an Sprosspitze beginnt. Zellteilungen im SprossmeristemÆapikales WacshtumÆStielentwicklung u. Blätterbildung durch lokale Verdickung des Apikalmeristems als Blattanlage ÆFortsatzÆBlatt. Pflanzenblühung: aus apikalem Sprossmeristem wird Blütenstandmeristem, das einzelne Blütenmeristeme (daraus Blüten) abschnürt (Reproduktion). Blütenmeristem bringt nacheinander Kelchblätter, Blütenblätter, Staubblätter, Fruchtblätter hervor. 4 Tage nach KeimungÆPflanze mit Blätter, Stängel, Blüten, Wurzel aus Apikalmeristem. Identifikation von Entwicklungsgenen: Welche Gene im Entwicklungsprozess? Suche nach MutationenÆgenetische Methode (Xenopus, Huhn zu kompliziert). Jedoch Techniken der Genanalyse beginnen Entw.gene dieser Organismen zu identifizieren. Wenn man in einer Tierart ein wichtiges Entw.gen identifiziert hatÆsucht man homologes Gen=ähnliche NucleotidsequenzÆgemeinsamer Vorfahre? Identifikation von Entw.genen anhand selten auftretender Spontanmutationen: Mutageneseexperimente: mit chem. Mutagenen od. RöntgenstrahlenÆSpontanmutantenÆSuche nach Entwicklungsmutationen. • Dominante od. semidominante Mutationen= auch dann Phänotypveränderung wenn heterozygot,d.h. nur ein Allel mutiert (leichter erkennbar aber seltenÆ zb. Gesamtanatomie od. Färbung) • Rezessiv: wenn nur im homozygoten Zustand Phänotyp verändert zB.: Mausgen Brachyury: semidominant. Bei heterozygot: kurze Schwänze, homozygot: Tod. Br.-Mutation bewirkt dass sich posteriore Mesoderm nicht entickelt. Heute kloniert, d.h. reine Form isoliert. 7 Rezessive M.: aufwendiger, da Heterozygote und Wildtyp selben Phänotyp. Genaues Zuchtprogramm notwendig. Homozygote sterben möglw. unbemerkt in Mutter. Unterscheiden muss man Mut. Von Entwicklungsgenen und für Haushaltsfunktionen. Einfaches Kriterium: Entwicklungsmutationen =EmbryoletalmutantenÆumfasst auch Haushaltsgene, vielversprechender M. die anomale Muster hervorrufen. William Bateson 1894: • • • • Meristische Variation (Zahl an Organen, Körpergeometrie) Substantive Variation (Natur, Farbe, Identität d. Organe) Homöostasische Transformation (Veränderung d. Identität v. Organen, Calvin Bridges 1915: erste homöopatischesche Mutante, Drosophila Folie) Identifikation v. Entwicklungsgenen durch Induktion v. Mutante u. gezieltes Screening Mehr Entw.gene durch Behandlung mit Chemikalien u. RöntengstrahlenÆZufallsmutationenÆgroße Population, sodass jedes Gen mutiert (Zebrafische: rasche Vermehrung, leichte Beschaffung, Transparenz). Im ggsatz zu Drosophila, keine genetische Mögl., nicht betroffene Individuen automatisch zu eliminierenÆeinzelne Überprüfung nötigÆScreening (Suchprogramm) 3 aufeinanderfolgene Generationen nötig. Männliche, mit mutagenbehandelte Fische gekreuzt mit Wildtypweibchen. In F1: jedes Individuum für anderes mutiertes Gen heterozygot. Männliche Nachkommen wieder mit Wildtypweibchen gekreuztÆ50% d. Nachkommen aus jeder F2-Fam. Tragen gleiche MutationÆGeschwisterkreuzungÆEmbryonentrennungÆUntersuchung auf homozygote mutante Phänotypen bzw. Entwicklungsanomalien. In f2-Paarungen treffen 25% 2 Heterozygote aufeinander (d.h. 25% homozygot). Wenn man mit UV-Licht bestrahlte Spermien zur Befruchtung nimmtÆhaploide ZebrafischeÆso früh wirkende rezessive Mut. erkennbar. Screening-Programm: Edward Lewis, Christiane Nüsslein-Volhard u. Eric Wieschaus 1995 Nobelpreis. Identifikation v. Entwicklungsmutanten in Drosophila: EMS-Mutagen wird tausenden ♂Fliegen verabreicht, die homozygot für rez. Mutation auf einem bestimmten Chr. waren (auch homozygot lebensfähig) u. leicht erkennbarer Phänotyp gewählt). Behandelte ♂ ( die Spermien mit induzierten Mut. auf aChr. (a*) produzieren) mit unbehandelten ♀ (mit DTS u. b Mut. auf beiden aChr.) gepaartÆunbehandelten verfolgbar u. Embry. mit 2 Chr. ♀-Ursprungs automatisch eliminierbar: DTS=dominant temperatursensitive Mut. (29° Tod), b=rezessiv embryolethale Mut., die nichts mit Entw. Zu tun hat. Jede Fliege, die für vom ♀-stammende Chr. homozygot= stirbt automatischÆAussonderung Nichtmutierter. Fliegerweibchen trugen Balancer Chr. Æverhindert Rekombination während Meiose (Bei ♂keine Meiose). Um rezessive Mut (ä*) zu finden ÆKreuzung heterozygoter ♂ aus 1.Kreuzung mit DTS/bWeibchenÆbei 29° überlebten nur a*/b-FliegenÆKreuzung überlebender GeschwisterÆSuche nach Musterbildungsmutanten. Drei Ergebnisse: homozygot a*(induzierte Mut.), heterozygot a*, homozygot bFliegen (sterben als Embry.). Falls a* (weißäugige) tödlich wäreÆkeine EntwicklungÆd.h. uninteressant weil Entw. Wenn keine weißäugigenÆdann homozygot a*/a* vermutlich tot aufgrund AnomalentwicklungÆ man kann Embryonen im Larvenstadium auf Musterbildungsdefekte untersuchen. Erwachsenen Fliegen=a* heteroz. ÆEinsatz in Züchtung für MutantenuntersuchungÆganzes Programm für jedes Chr.paar. Phänotypisches Merkmal: gleichförmiges Dentikelmuster der LarvensegmenteÆUnregelmäßigkeiten =MusterveränderungenÆso stieß man auf Schlüsselgene der Musterbildung. Bei frühem Drosophila-Em. Mutationen d. Haushaltsgene wurden größtenteils durch maternale Haushaltsgene ausgeglichen (maternaleffect-genes)ÆFadenwürmer bestens geeignet. Ent.mutanten bei Mäusen: große Menge nötig u. Phänotyp schwer bestimmbar, da noch im Mutterleib. ArabidopsisÆGametenmutagenisierungÆFalls Zelle in Apikalmeristem gelangt, Chance, dass bei Blütenbildung an Geschelchtszellentstehung beteiligt ist Æmutierte Keimzellentstehung. Arabidopsis SelbstbestäuberÆ nächste Generation sowohl homo- als auch heterozygote Pflanzen mit Mutation. KAPITEL 6: Das Grundmuster des Vertebratenkörpers: Die Körperhauptachsen: • Anterior-posteriore od. Längsachse: segmentierte WS, die Rückenmark umgibt, anderem anterioren Ende Gehirn mit Schädel. Also Vorderende:kopf, Rumpf mit Extremitäten, bei Wirbeltieren postnalater Schwanz. • Dorso-ventrale Achse: Mund bestimmt Bauchseite • Beide Achsen definieren re u. li d Embryos • Asymmetrie einzelner innerer Organe wie Herz u. Leber 8 Wirbeltierembryonen: gleiches phylotypisches Stadium: Kopf, Neuralrohr entlang Mittellinie, Chorda dorsalis, Somiten. Unterschiede: Amphibien, Fische, VögelÆDotter, SäugetiereÆPlazenta, d.h. Ausbildung extraembr. StrukturenÆwirken auf Achsen: Zeitpunkt, Mechanismus, aus welchem Anteil. Ein zentraler Aspekt der Frühentwicklung: Inwieweit Embryo durch Faktoren in Eizelle festgelegt: • • Maternale Faktoren: wirken bei Entw. in Mutter, anschließende Embryonalentw. durch maternale Faktoren wie mRNA, Proteine, die bei Oogenese ins Ei gelangenÆsteuern welche Faktoren wie in Ei verteilt. Zygotische Gene: im sich entw. Embryo durch Genom exprimiert Animal-vegetale Achse des Xenopus Ei (maternale Festlegung) Schon vor Befruchtung Polarität: Animal-vegetative Achse dient als Bezugssystem für Furchungsebenen (1. parallelÆlegt Spiegelsymmetriebene fest, 3. im re.Winkel u. teilt Embryo in animale u. vegetative Hälfte). Maternale mRNA vor Furchung entlang animal-vegetative Achse verteilt. Im unbefruchteten Ei: viele mRNAs für Haushaltsproteine, u. viele für spezielle Proteine. Mind. 9 Klassen entlang a-v-Achse entdecktÆEinige aus Signalmolekülfamilien die wahrsch. wichtig für Polaritätsfestlegung und Mesoderminduktion. Von maternalen mRNAs codierte Signalproteine: • • • Vg-1 (TGF-ß): mRNA asymm. am veg. Pol des befruchteten Eis verteilt (nachweisbar durch Insitu u. Autoradiographie. Wird während OOgenese synth. u. in vegetative Oocytenrinde eingelagert, wandert v. Befruchtung in vegetatives Cytoplasma. Xwnt-1 (Wnt): am veg. Pol, von Wingless-Gen codiertÆMusterbildungssignalmolekül VegT: Transktiptionsfaktor Ähnlichkeiten in der Nnucleotidsequenz v. Entwicklungsgenen. Genaue Spezifikation der Hauptachsen (Xenopus) erst nach Befruchtung also wenn Dorsoventralachse feststeht. Signaltransduktionswege, die in Frühentwicklung Rolle spielen: S20 6 Familien (siehe Tabelle). Proteinfaktoren wirken indem sie an Rezeptor auf Zelloberfläche anheftenÆSignalerzeugung, das Rezeptor durch Membran zu biochm. Signaltransduktionswegen in Zelle weiterleitetÆAn-Abschaltung v. Genen. Für jeden FaktortypÆSatz von Rezeptoren die auf Signal reagieren können. Insitu-Hybridisierung: Sichtbarmachung von gerade transkribierter mRNA: Besitzt Antisense-RNA-Sonde komplementäre Sequenzen zu gerade transkribierter mRNAÆHybridisierungÆLokalisation: Markierung mit radioaktivem Isotop (Autoradiographie), Fluoreszenzfarbstoff, od. Enzym für histochem. Nachweise. Sonden bei Gewebsschnitten u. Ganzkörperpräparaten verwendbar: Antisense-RNA-Sonde mit EinzelstranmRNA mischenÆHybridiserung— EmbryonenfixierungÆEnzym mit markierter DANN-Sonde hinzuÆEmbryonenwaschungÆdurch Farbreaktion Sonde sichtbarÆEmbryonenfixierungÆEmbr. In Wachs u. Schnittfür AutoradiographieÆSchnitte auf ObjektträgerÆInkubation mit radioaktiver SondeÆObjektträger im Dunklen in photogr. Emulsion getauchtÆLösung wird entwickeltÆMikroskop Die dorso-ventrale Achse des Amphibien Embryos wird durch Spoermaeintrittsort festgelet: Xenopus Eizelle: Radiärsymmetrie um animal-vegetative Achse. Eindrigen d. SpermiumsÆDorsoventralachse ggüber Eintrittstelle, nach 90 min. Rindenrotation ggüber Eintrittstelle um 30° (Cytoplasma steht)ÆRichtung Spermaeintrittstelle. Ggüber Sp.e.s. entwickelt sich Nieuwkoop-Zentrum (beeinflusst umgebendes Gewebe)ÆFestlegung DorsoventralachseÆspäter darüber Spemann-Organisator und Urmund. Nieuwkoop Zentrum essentiell für normale Entwicklung: Furchung durch Spermae.st. u. N-.Z.:Bilateralsymmetrie. 2.F. senkrecht: ventrale u. dorsale Hälfte. Experimente: 1.) Embryo in 4-Z-St geteilt sodass nur dorsal N-ZÆEntwicklung meister Strukturen jedoch Ventralbereiche fehlen (Darm)= dorsalisiert. Hälfte ohne NZ: radiärsymmetrisch, ventralisiertes Zerrbild ohne dorsale und anteriore Strukturen. 2.) Vegetative Zellen mit NZ v. Xenopus-Em. Im 32-Z-St. Von dorsaler Seite auf ventrale Seite anderen Embryos verpflanztÆ2.Achse u. Zwillingsembryo. Verpflanzung ventraler Zellen auf dorsale S. keine WirkungÆSignale des NZ erforderlich für dorsale u. anteriore Strukturen. 3.)Roux: zerstört im 2-Z-St. Eine HälfteÆhalber Embryo. Entscheidend: getötete Zelle war noch verbunden an andere, Embryo „wusste“ nicht dass sie tot war, NZ wurde durch 1.F. geteiltÆdeshalb halber Embryo mit halbem ZentrumÆHätte man getrenntÆRegulation NZ wird durch kortikale Rotation spezifiziert: Rindenrotationsauslösung: vermutlich Signal bei Spermaeintritt an Cytoskelett weitergeleitet. Centriol d. Spermiums reorientiert Cytoskelett. Rinde bewegt sich ggüber Rest d. CytoplasmasÆ WW mit parallel verlaufenden Bereichen aus Mikrotubuli (im Cytoplasma d. Vegetativregion)ÆRotation führt ggüber 9 Spermaeintrittsstelle zur NZ-Bildung im veg. Bereich unterm ÄquatorÆDorsalseiten- u. Bilateralsymmetrienebenenfestlegung. Rotationsbewegung bei Spermaeintrittsebene am stärksten, da liegt NZ u. MittellinieÆ1. F. hier hindurch teilt in 2 symm. Hälften (Bilateralsymmetrie). Rotationsblockierung durch Bestrahlung der Vegetativseite mit UV-Licht (Mikrotubulizerstörung)Æventralisierte Embryonen, keine dorsalen Strukturen, viel blutbildendes Mesoderm (normal auf ventraler Mittellinie). UV-Erhöhung Æ dorsale u. anteriore Strukturen verschwindenÆverbeulter Zylinder wie isolierte ventrale Hälfte aus 4-Z-St. Rettung: NZÆRotationssimulation. Später: dorsale NZVerpflanzung aus 32-Z-St. eines anderen EmbryosÆNZ-Spezifizierung ist ausschlaggebend. LithiumchloridÆDorsalisierungÆfördert Bildung dorsaler u. anteriorerStrukturen auf Kosten ventraler u. posteriorer. ß-Catenin wirkt wie Niewkoopzentrum in Transplantationsversuchen: zur Rettung ß-Catenin: im Ei als mRNAÆÜbertragung v. Wnt-Signalen. (eier können auch von Xwnt-11 u. Vg1 Mol gerettet werden). ß-Catenin akkumuliert mit Rindenrot. Auf dorsale Seite u. dringt im 16-Z-St in dorsale Zellkerne ein NZ induziert Spemann-O. Versuch: Zerstörung der Mikrotubuli durch UVÆdorsalisierend. Durch Injektion ß-Catenin codierender mRNA in ventral vegetative ZellenÆneues NZÆZwillingsembryo (wie vg-1). Zebrafish: Dorsoventraleachse aufgrund Einfluss d. ß-Catenineinwanderung. Embryonales Schild=NZÆSpezifizierung durch ß-Catenineinwanderung in dorsale Kerne des DottersyncytiumsÆZellularisierung. ß-Catenin Akkumulation durch verhinderten Proteinabbau: NZ nur wenn ventralisierende Signale der Dorsalregion unterdrücktÆzB GSK3 (maternal mRNA, wichtig für ventrale Entw, bei HemmungÆdorsalisiertes embryonales Gebilde ohne ventrale od. posteriore Strukturen. GSK-3 künstlich auf zukünft. DorsalseiteÆventralisiertes Embryo, d.h. GSK-3 kann Bildung od. Signalaktv. von NZ hindern. Auf dorsaler Seite GSK-3 wnt-abh. gehemmt. Lithium hemmt GSK-3. Transkr.f. Siamos wird angeschaltet. NZÆSpemann-O. oberhalb NZÆSO Musterbildung an Anterioposterior- u. Dorsoventralachse u ZNSinduktion, d.h. Spermaeintritt=Signal für Dorsoventralchse, anterio-posterior-Achse Zusammenhang mit animal-vegetativer-Achse (bereits im Ei festgelegt). Spezifizierung d. anterio-posterioren Achse im Hühnerei: Die posteriore Marginalzone (dichterer Zellbereich auf einer Seite des Blastoderms)Ædaraus PrimitivstreifenÆAnterioposteriorenachsendefinition, Bilateralsymmetrienachse (posterior am Ausgangspunkt des PrimitivstreifensÆdamit Ventraldorsalachse. Posteriore Marginalzone/Hinterende durch Schwerkraft bestimmt. 20stündige-Uteruspassage: Zygote mit spitzen Ende wandert voran u. dreht sich dabei um Längsachse(6min/D.)ÆBlastoderm neigt in Rotationsrichtung, versucht aber oben zu bleiben. FurchungÆEiablageÆEi im Gravitationsfeld schräg geneigt, Blastoderm obenauf. Zukünftige Randzone= oberste BlastodermzellschichtÆAquivalent zu NZ. Während Schale u. Albumen drehen, versucht Embryo mit Dotter in Senkrechte zurückzukehrenÆdeshalb Blastoderm etwas in Eirotationsrichtung verschoben. Die posteriore Randzone d. Huhns spezifiziert Ende der anterio-posterioren Achse: Wenn man vg-1-exprimierende Zellen in anderen Bereich d der Marginalzone verpflanztÆneuer Primitivstreife (= neue anterio-posteriore-Achse) u. so gleiche Wirkung wie Transplantate aus der posterioren Marginalzone. In der Regel entwickelt sich nur der weiter fortgeschrittene Streigen, und hemmt Ent. Des anderen. An der Primitivstreifenentw.stelleÆzu vg-1 homologes Gen. Die Achsen des Mausembryos werden durch Zell-Zell-Interaktionen spezifiziert: Keine Polaritätsanzeichen od. Maternalfaktorenanordnung. FrühentwicklungÆMorula mit zwei ZellpopulationenÆ32-Z-Stadium: Blastocyste. Spezifizierung der inneren Zellmasse eines Mausembryos hängt von Position der Zellen relativ zur Inneren- u Außenseite des Embryos ab. Markierte Blastomeren im 4-Z-St mit unmarkierten Blastomeren kombiniertÆBlastomeren an Außenseite der Zellaggretage zu Trophektoderm, aus Innerem innere Zellmasse, d.h. markierte Blastomeren auf umarkierte Bl. AußenÆTrophektoderm, Innen: beide Gewebe können sich bilden, häufiger innere Zellmasse. Umgibt man Embryo ganz mit anderen BlastomerenÆkann auch innere Zellmassenteil eines riesigen Embryos werden. Zellansammlungen aus außen od. innen früherer Embry. können auch normale Blastocysten werdenÆd.h nur durch Position spezifiziert. Im 32-Z-Std. entscheidet sich das Schicksal, vorher äquivalent. Säugetiere: DorsoventralachseÆPosition d. inneren Zellmasse. Mausembryo: nach Spezifizierung von innercellmass u. TRophektodermÆBlastocoelÆsomit innercellmass nur noch an einer Stelle mit T. verbunden0 deutliche Achse von embryonalem Pol bis ggüberliegendes EndeÆBis Gastrulation erhaltene Dorsoventralachse. 4 ½ Tage n. Befr.: innercellmass diff.: primäres,primitives Entoderm u. Epiblast (innen)ÆEinnistungÆT. am embryonalen Pol proliferiert u. bildet ektoplazentalen KegelÆverschiebt innere 10 Zellmasse in BlastocoelÆpromaniotische HöhleÆEpiblast als UÆZelldurchmischung u. deshalb keine Unterscheidung, ob dorsal od. ventral, noch nicht spezifiziert. ÆAkkumulation v. Chrypto u. Proteinen in Zellen d. post. Eizylinderregion unter extraembryonalem Ektoderm durch Proteinabbau und Primitivstreifenbildung (Grenze zu Proamnionhöhle). Primitivstreifen wandert zu zu anteriorem Ende. Knoten an Anteriorende der zweite Achse ohn ekopfteil bilden kann bei Transplantationen. Viscerales Entoderm mit Induktionswirkung wandert an Anteriorende u bildet Kopfteil. Längsachse bei Säugetieremb. Wahrscheinlich durch WW zw. ZellenÆSignale der Gebärmutter? Da Längsachse des Embryos senkrecht zu L.achse der Gebärmutter. Spezifizierung der Rechts-Links-Ausrichtung innerer Organe erfordert besondere Mechanismen: Wirbeltiere: viele Strukturen d. Bilateralsymmetrie zur Mittellinie, nach außen hin symmetrisch, innere Organe asymmetrisch. (situs inversus 1:10000 Menschen). Rechts-links Unterscheidung erst sinnvoll wenn Körperachsen vorhanden. Man nimmt an, dass auf mol. Ebene eine Asymmetrie vorhanden ist, die dann auf zell. u. multizell. Ebene übertragen wirdÆd.h. müsste Bezug auf Achsen haben. Situs-inversus-Seitenverkehrte Anordnung der asymmetrischen Organe: Hühnerembryo: einige Gene in Bezug auf H.k. am Vorderende des Primitivstreifens asymmetrisch exprimiert. „Sonic hedgehog“ nur auf linker Seite des H.k. exprimiert, Aktivin u. sein Rezeptor auf rechter Seite gebildet u. unterdrücken Sonic h. Expression rechts. Links induziert Sh Nodalexpression (TGF), Bringt man einige Shproduzierende Zellen nach rechts, sodass Expressionsmuster symmetrisch wirdÆdann Organentstehung zufällig auf den Seiten. Nodal ebenfalls asymm. Exprimiert. iv-Mutante der Maus: Links-Rechts-Asymmetrie: iv-Gen bei Maus: Links-Rechts-Organverteilung. Bei 50% der Tiere, die für mutiertes iv-Allel hpomozygotÆ Seitenausrichtung vertauschtÆSeitenfestlegung zufällig. Mutation betrifft nicht Vorgang sondern Mechanismus, die eine Seite bevorzugt. Solche Mausmutanten: häufig Heterotaxis (organe mit normaler und umgekehrter Symmetrie im selben TierÆunabh. Entw. der Organe?) Mensch: Kartagener Syndrom (rezessiver Defekt) mit situs inversus vbd. Seitenausrichtung zufällig. 50%Symmetrie verändert. Individuen mit Ks.: Cilien auf Oberfläche von Lungen u. Atemwegen unbeweglichÆfunktionsunfähigÆAtmungsprobleme. Cilien fehlt Dyneinantrieb (für Bew.). Dynein mit Mikrotubuli assoziiert hat andere Funktionen. Mikrotubuli u. weitere Cytoskelettstrukturen sind asymmetrisch->wichtig für Asymmetrieausbildung. Cilien am Primitivstreifenanfang produzieren seitlich gerichteten Strom der extraembry. Flüssigkeit. Siehe Überblick Achsendetermination bei Wirbeltieren (S25) KAPITEL 7: Ursprung und Spezifizierung der Keimblätter: Zuerst Hauptachsen, dann Muster. Aus Keimblättern alle Gewebe außer Keimbahnzellen abstammend. Siehe Tabelle: S26. Fate maps (Anlagenpläne) welche Gewebe aus untersch. Teilen d. Embryos entw Erstellung eines Anlagenplans der frühen Amphibienblastula durch Beobachtung markierter Zellen: 32-Z.St. noch kein Hinweis wie Regionen sich entw. werden. Identifizierung einzelner Zellen: Karte d. Blastulaoberfläche(Anlagenplan) mit den Regionen, die später zu versch. Organen werdenÆdurch durch Schicksalsverfolgung einzelner Zellen od. Zellgruppen. Zeigt nicht Determinationsgrad. Frühe WirbeltierembryonenÆhohe Regulationsfähigkeit, d.h. Schicksal der Zellen abh. v. Signalen der Nachbarzellen (Zellkommunikation)Æso Ausgleich von Störungen. Anlagenplanerstellung: Oberfläche des frühen Embryos mit lipophilem Farbstoff wie „diI“ (?)färben u. achten welcher Bereich markiert bleibt. Einzelne Zellen: rhodaminmarkiertes DextranÆkönnen Zellmembran nicht passieren, also ausscholießlich in behandelter Zelle u. ihren NachkommenÆunter UV-Mikroskop: rot. zB Xenopus: C3-Zelle mit Fluorescein-Dextranamin (grün) markiertÆQuerschnitt: im Schwanzknospenstadium aus markierten Zellen Mesodermzellen. Anlagenplan Xenopus: Entoderm aus vegetativem Dotterbereich. Animalpol: Ektoderm ( ventral:Epidermis, dorsal: NS). Mesoderm der Dorsoventralachse: dorsal:Notochord, ventral:Somiten, Seitenplattenmesoderm. Mesoderm in Marginalzone bei Xenopus von dünner Entodermschicht bedeckt. Fate map zeigt das Gastrulation erforderlich damit ZellwanderungÆDorsalzellen bilden nicht nur dorsale Strukturen sondern auch ventrale Teile des Embryovorderendes (Kopf, Herz). Aus Ventralbereich (vorderteil) auch Dorsalstrukturen im hinteren TeilÆdeshalb: dorsalisierte Embr. Viele anteriore Strukturen, posteriore fehlen. Der Anlagenplan definiert Grenzen und spiegelt stereotype Muster d. Gewebebewegungen wieder, durch die Zellen an ihre Positionen gelangen. Spezifizierungskarte: hinweise auf Zellunterschiede: Erstellung: GewebsstückisolierungÆKultivierungÆwelches Gewebe wird es? Bei Xenopus zw. Anlagenplan u. Spezifizierungskarte in ektodermalen u. mesodermalen Regionen Unterschiede: Animalhälfte: kein 11 Nervengebwebe, aus Mesoderm: keine Muskel (außer äußerster dorsaler Teil)Æd.h. Ekto- u. Mesoderm noch nicht differenziert. Grenzen der drei Keimschichten in später Blastula determiniert. Anlagepläne der Wirbeltiere variieren ein Grundmuster: Markierung früher EmbryonalzellenÆAnlagenplanerstellung (Xenopus, Huhn, Maus, Zebrafisch). Hühnerembryo: kein Anlagenplan v. Blastodermstadium, da posteriore Marginalzone (Embryoentstehung) noch winzig, während G. viel Zellteilung, -wachstum, u -bewegung. Wenn Primitivstreifen vollständigÆKeimschichtenkartierung u. Fatemaperstellung. Nun: 3 Schichten, Zellwanderung durch P. (Meso, Entoderm). Meisten Oberflächenzellen des Blastoderms=zukünftiges Ektoderm (Neuralroh u. Epidermisbildung). In Embryomitte: Zellanhäufung: H.k. Æzukünft. Mesoderm. Wanderung nach post.: hinterlässt er Zellen für Chorda- und Somitenentstehunh. Seitlich d. Somiten: Seitenplattenmesoderm, Herz u. Niere. Nah am Dotter zukünft. Entoderm. Posterior bildet sich extraembry. Meso- u. Entoderm aus. Maus: ersten StadienÆkein Anlagenplan, da innere Zellmasse am Tag 3,5 neben embryonalen auch extraem. Strukturen entwickelt. 4,5: innercellmass: primitives Entoderm (außen,für extrae. Strukturen) u. Epiblast (primitives Ektoderm, innen, Embryo u ex.e.Str.). 6,5: Primitivstreifen—GastrulationÆKeimblätterFatemapping. Genauer Anlagenplan: einige Zellen mit Farbstoff injiziert u. Tochterzellen ermitteltÆ dastarke Zellmischung, nur 50% aller markierten Zellen in einer keimschicht. Anlagenplan im P.stadium wie Huhn: außen anterior: prospektive Ektoderm (Neuralrohr, Epidermis). H.k. am Primitivstreifenvorderende dorsal auf Embryo aufliegend, bewegt sich nach posterior u. entwickelt Chorda, Somitenteile u. prospektives Mesoderm. Mittlerer Streifenteil: Seitenplattenmesoderm, Herz, Niere, Posteriorteil: extraem. Mesoderm u. Entoderm (Amnion, visceraler Dottersack, Allantois). Zebrafisch: von Blastula zu Gastrula: starke ZelldurchmischungÆkein fatemap. Zu Beginn Gastrulation: Schicksal der Tiefenschichtzellen (Embryo) abh. davon, wo sie im Verh. Zum animalen Pol liegen. Zellen oben am Animalpol: Ektoderm, aus Randzone des Blastoderms: Entoderm, zw. Zukünft. Ento- u. Ektoderm: Mesoderm. In Dorsoventralachse ist Chorda dorsal, Muskel in Mitte, Blut ventral. Gemeinsamkeiten: Chorda immer dorsal, Neuroektoderm immer dorsal neben Notochord, restliches Ektoderm: anterior d. Notochord. Zukünft. Ektoderm (Epidermis) ventral. Bei deuterostomen Tieren: Urmund= Anus, Mund entfernter. Protostomen: Blastopore zu Mund. GemeinsamkeitenÆd.h. Spezifizierung durch ähnliche Mechanismen. Anlagenpläne zeigen nicht volles Entw.potentialÆnoch nicht festgelegtÆin Blastulau.Gastrulastadien immer noch regulativ. Geoffrey St. Hilaire: Inversion des Embryos während Entwicklung: • • Chordin-Gen: bestimmt Dorsalseite (Vertebratengen): Ch-mRNA in Drosophila-Embryo injiziert: ventralisiert diese Stelle. Sog-Gen in Drosophila: umgekehrten Effekt wie Chordin : Sog-mRNA in Froschembryo injiziert: Rücken In beiden Fällen: ZentralnervensysteminduktionÆGene kontrollieren Entw. Schicksal der Zellen des frühen Wirbeltier-Embryo noch nicht determiniert: Regulationspotenzial: Xenopus-Ei mit ¼ der Normalgröße zu kleinen Embryonen entwickelbarÆd.h. Mechanismus für Größenregulation bei Musterbildung. Regulationskapazität hat Grenzen: isoliert man animale u. vegetative Hälften eines Xenopus-Embryo im 8-Z-St. Ækeine Normalentwicklung mehr: Dorsalhälfte: halbnormalen Embryo ohne Darm. Ventrale Hälfte: abnormer Embryo ohne anteriore od. dorsale Str. u. wenig MuskelmasseÆabh. davon ob NZ in diesen Fragmenten vorhanden od. nicht. Regulationspotential früherer Embryos spiegelt Determinationszustand einzelner Zellen wieder. Transplantationen: Entw. entsprechend Ursprungsposition: determiniert, neue Position: nicht determiniert. Nichtdeterminierte Vegetativpolzellen (normal Entoderm), können Muskel od. NS bilden. Nichtdeterminierte Animalpolzellen (Epidermis): nach Transplantation: Entoderm u. MesodermÆmit fortschr. Entw. weniger Entw.potential. Innercellmass des Mausembryos: noch nicht determiniert, bis 4,5 T. pluripotent. Transplantation v. innercellmass-Zellen in innere Zellmasse einer anderen Blastocyste selben Stadiums: Beteiligung an Embryonalgewebe- u. KeimzellenbildungÆChimäre Mäuse: haben zellen mit zwei versch. Genotypen. Man kann aus innercellmass-Zellen ES-Zellen gewinnen, die sich wie innere Zellmasse verhalten bei Injizierung in Wirtsembryo. Transgene Mäuse: wenn man ES-Zellen mit Mutationen nimmt. Rolle eines Gens in Entw. durch Entwicklungsmutationen feststellbar. Mit transgenen Techniken Tiere mit bestimmten Genotyp erzeugbar. Z.B: Injektion von ES-Zellen mit Mutation in eine normale BlastocysteÆdaraus alle Gewebe der Maus. ES-Zellen in Kultur gentechnisch veränderbarÆ mutierte Zellen mit inaktivierten Genen entstehen oder neue GeneinführungÆTechnik für Funktinsverlustmutationen (Gen-Knock-Out)ÆRolle in Entw. fraglich. Tragen transgene Tiere Transgen in Keimzellen kann man durch Rückkreuzungen nicht chimäres transgenes Tier erhalten, in dem Mut. entw. in hetero-od.homozygot. Form vorliegt. Fast alle transgenen Tiere durch Spermien übertragbar. Chimären: auc mit totipotenten Zellen im 4-od.8-Z-St machbar: bildet man durch 12 Zusammenschluss mehrerer Embryonen in frühen Entw.stadien RiesenembryonenÆin 6 Tagen Normalgröße erreichbarÆRegulation durch Verringerung der Zellproliferation. Embr. Mit untersch. Genen kombinierbar für chimäre Maus. Wird 8-Z-Embryo eines unpigmentierten Mausstammes mit pigmentiertem Mausstamm fusioniertÆchimäres Tier: aufgrund Verteilung der untersch. ZellenÆgestreiftes Fell. KAPITEL 8: Embryonale Stammzellen: Stammzellkonzept: pluripotente Stammzellen im Knochenmark bringen Vorläuferzellen hervor, die eine der Entwicklungsbahnen einschlagen. Hämatopoese zuerst in Blutinseln des Dottersacks, dann fetale Leber u. Knochenmark. Zelltypen aus zwei Hauptlinien: • • Myeloid: Erythrocyten, 5 Typen weißer Bk., Eosionphile, Neutrophile, Basophile (=beide: Granulocyten), Monocyten, Megakaryocyten Lymphoid (antigenspez. Immunsystemzelltypen): B-Lymphocyten (Säuger: Knochenmark), T-Lymphocyten (Thymus)Æweitere Diff. Bei Kontakt mit passendem Antigen. Stammzellen: • • • • Somatische Z.: alle diploiden Körperzellen, keine Keimbahn/Keimzellen Keimbahnzellen: diploide zur Bildung von Keimzellen determinierte Zellen Keimzellen: haploide ZellenÆdurch Meiose aus Keimbahnzellen Stammzellen: undiff, teilungsfähige, SomazellenÆAusbildung mono- od. multipotenter Zellen sowie Selbsterneuerung Embryonale Stammzelle der Maus: ES: (?) Im KM verschiedene BlutzelltypenÆVorläufer stark durchmischtÆKnochenmarkstromazellenÆKM kann Blutsystem komplett wieder herstellen. Chimäre Mäuse: Zellen von versch. Mausstämmen. ICM wird Blastocyste entnommen, auf Nährmedium kultiviert (bestrahlte feeder layer: Zellen, die sich nicht mehr teilen können u. ICM-Zellen mit Wachstumsstoffen versorgen)Ædann Injizierung in andere Maus.-->Chimäre aus Zellen der weißen Maus u den injizierten Zellen der schwarzen MausÆgestreiftes Muster. Chimärismus erstreckt sich auch auf Geschlechtsorgane u. Gameten. Nachkommen nicht chimär. ICM-Zellen der Maus noch nicht determiniertÆpluripotent. Ch.M. auch mit totipotenten Zellen im 4-od.8-Zellstadium machbar. Pluripotenz: Fähigkeit alle Zelltypen eines erwchsenen Organismus hervorzubringen. ICM u. ES-ZellenÆkein Trophektoderm bilden. Totipotenz: Fähigkeit alle Zelltypen hervorzubringen, auch TRophektoderm Multipotent: Zellen mit bestimm. Differenzierungsstufe, die weiter diff. (Haare, Drüsen, Haut) Toti-pluripotente Zellen bei Säugern: • • bis 4-8-Z-St. Menschl Embryozellen totipotent, Stadium von Art zu Art verschieden ES sind pluripotent, da nach Transfer (Chimären) in Blastocysten, alle Zelltypen vorhanden waren. ICM u. ESÆkein Trophektoderm Quellen von pluripotenten Stammzellen beim Menschen: Stammzellen: in Embryonen, Föten u. 20 Menschenorganen: embryonale, fetale, adulte Stammzellen Aus Embryonen: aus Innerem von wenige Tage alten Embryonen 1. überzählige Embryonen bei künstlicher Befruchtung: InvitrofertilisationÆEi+Samenzellverschmelzung im ReagenzglasÆTeilungenÆ8-Z-St. Sind Zellen totipotentÆdaraus BlastocysteÆaus deren innercellmass am 4.Entw.tag pluripotente ES gewonnen werden für Forschung 2. 5-9-wöchigen abgetriebenen FötenÆfetale Stammz. sind Vorläufer d. Ei- u. Samenzellen= promordiale KeimzellenÆim Labor zu embryonalen Keimzellen entwickeltÆpluripotent u. wie ES aus Blastocystengewinnung 3. therapeutisches Klonen (Zellkerntransfer): Gespendete Eizelle wird entkernt u. dem Kern einer Körperzelle angefülltÆReprogrammierung des KörperzellenkernsÆneue totipotente Zelle die, sich zur Blastocyste entwickeltÆaus derem ICM pluripotente StammzellenÆwie Dolly. Adulte Stammzellen: (20 untersch. Typen) Aus ES entw. multipotente Stammzellen als Vorläufer von Gewebszellen. Einige dieser MSZ diff. nicht aus, sondern als adulte SZ im OrganismusÆschwer isolierbar. Umdifferenzierung möglich. Teilungsunfähig. Z.b. in Knochenmark, Blut (zb Nabelschnur), GehirnÆAufgabe: Ersatzzellbildung. Stammzellen aus Nabelschnurblut: • geringfügig spezialisiertÆnicht mehr zu allen Zelltypen • Blutbildende Stammzellen • SZ anderer Organe wie Leber, Muskel, Herzmuskel, Gefäße ES: 13 • • • E. Stammzellen: undiff., teilungsfähige Zellen aus ICM, pluripotent E. Keimbahnzellen (EG) undiff., teilungsfähige KBZ des Fötus, in invitro-Kultur pluripotent Embryonale Karzinomzellen (EC): Zellen v. Teratokarzinomen (spontaner Hodentumor, od. Tumorzellen, wenn man menschl EG od. ES-Zellen unter Haut v. erwachsener immunsupprimierter Maus spritzt), invitro: pluripotent Telomerase +: verlängert Chr., die bei jeder Zellteilung kürzer werden, da nicht ewig teilungsfähig. Tumorzellen: ewig teilungsfähig LIF+: für Erhaltung der ES-Zelle, bei LIF-Entfernung:ÆStammzellendifferenzierung u. bilden versch. Gewebe, werden feeder entzogen: diff. der SZ ebenfalls. Werden die Zellen vereinzelt bilden sie Embryoid bodies. Drei Tests auf Pluripolarität v. Stammzellen (SZ) • Invivo Differenzierung nach Transfer in Blastocyste • Induktion von Teratokarzinom nach Transfer in immunsupprimierte Mäuse • In vitro Diff.: 1.: Entzug von LIF u. Trennung v. SZ, Embryoidbildung der Embryoidzellen, Diff. in getrennter Kultur Embryoid body: Missbildeter EmbryoÆspäter Tod. Außen: Trophektodermartig mit ICM. Blastocyste gastruliert(3 Keimschichten)Æneuruliert (Herz)Æalle Zelltypen erzeugbar. Embryo= nicht implantiertÆMaternalfaktoren für Normalentw. Fehlen. EB Diff.zellquelle für Transplantierung, menschl. BlastocysteÆinvitro Fertilisation. EU-verbot. Therapien mit Embryonalen Stammzellen: ES-ZellenÆlineage-specific stem cellsÆversch. Vorläuferzellen(Herz, Nerven, Blut, Lymphocyt)Æadulte SZ für Transplantationstherapie. Gewinnung best. Zellen: durch: cell sorting, selective growth media od. gentechnische Veränderung. ES-Maus-Zellen invitroÆNährmedium als Faktor: „Basic fibroblast growth factor)Æentw. sich in Mäuse implantierbare Glial-Zellen. RetinalsäureÆES in neutrale StammzelleÆnach Transpl. Neuronen. Menschl. Es auf KM von Mäusen kultiviert: Blutzellen, da SZ bestimmte Wachstumsfaktoren vom KM aufnehmen. Derivation of Embryonic Germ Cells and Male Gametes from Embryonic Stem Cells: In vitro Fertilisation: In Eizelle wird Spermazelle injiziertÆMorula. Zellen haben green fluorescent ProteinÆspäter Embryoid body Ausbildung der haploide Keimzellen produzieren kannÆd.h. Keimzellen aus Embryoid body gewinnbarÆwieder in vitro FertilisationÆfür Beweis, dass wirklich Keimzellen. Brauchen wir Stammzellen v. Embryos?: Alternativen: multipotente adulte SZ: • • • • Natürliche Multipotenz Induziert Nabelschnurstammzellen: keine ES sondern fötale SZ Transdifferenzierung von adulten SZ ES u. EG genetisch manipulierbar, adulte nicht. Herstellung von Knock-out-MäusenÆGenausschaltung durch homologe RekombinationÆGen wird nicht hinzugefügt (transgene Mäuse) sondern durch Injizierung ausgetauschtÆho. Rek. nur bei ES. Adulte hämatopoetische SZ nicht beliebig vermehrbarÆMengenproblem. Ausnahmen: Oligodentrozytenvorläuferzellen: Eigenschaft gewebsspezifisch. Erbkrankheiten: funktionsunfähiger Zelltyp durch SZ ersetzbar? Transdifferenzierung: Von KM-Stammzellen in Darmzellen bei Maus u. in vivo Muskelkolonisierung. SZ diff. ortsgemäß u. nicht herkunftsgemäß (nicht zu 100%). Tdiff.: SZ, die unter experimentiellen Bed. etwas anderes als sie normal tun würde. Einzelne pigmentierte Ephitelzelle der embry. Retina v. Huhn kann in Zellkultur zu Monolayer an pigm. Zellen expandiert werdenÆbei weiterer Kultur auf Hyaluronidase, Serum u. PhenylschwefelharnstoffÆVerlust v. Pigmentierung u. anderen Retinalzell-CharalteristikaÆDedifferenzierung. Æ anschließend Kultur auf Ascorbinsäure u. in hoher Zelldichte: diff. zu Linsenzellen u. CrystallinproduktionÆimmer noch Zelltyp des Auges aber sehen anders aus u. haben andere Funktion. Für Transdiff. muss Zelle erst dediff. bevor sie diff. kann. Sicherheitsaspekte in vitro differenzierter Zellen: • Histokompatibilität: Therapeutisches Klonen (som. Kerntransfer) 14 Genetische Manipulation durch homologe Rek. könnte Abstoßungsreaktion abschaltenÆEs für invitro • Krebsbildung durch CO-Transfer von SZ (ektopische Position induziert Krebs) Herstellung homogener Zellpopulationen, effiziente Abtrennung von SZ (zB.HerzzelltransplantationÆTetrakarzinomgefahr) • Infektionsgefahr durch Feeder Zellen od. Serum: man braucht def., serumfreies Medium mit rekom. Wachstumsfaktoren u definierten extrazell. Matrices. NährmediumÆdarf keine Extrakte haben! KAPITEL 9: Klonen u. Entwicklungsbiologische Totipotenz: Pflanzen, Frosch, Säuger (reproduktives, therapeutisches Klonen) Toti- pluripotente Zellen bei Säugern: Bis 4-8-Z-Std. totipotent, ES pluripotent Totipotenz bei Pflanzen: Wurzel einer KarotteÆdünne Scheibe geschnittenÆOberflächensterilisiertÆReagenzglas mit KokosnussmilchÆscheibe proliferiertÆZellen zu Embryonen (mit normalem Stadienverlauf)ÆKarotte. Dieser Prozess=Klonen= aus einem Gewebsstück riesige Nachkommenanzahl, genetisch ident. Versuch zeigt, ausdiff. Somazellen reprogrammiert, neues Embryo bildenÆZelle wie befr. Eizelle u. totipotent Klonen v. Fröschen: Laubfrosch: somatic nuclear transfer: meiotische Spindel wird aus dem Cytoplasma entfernt, aber in Vitellinschicht belassenÆEizelle ist aktiviertÆdann Kernentnahme aus irgendeinem Froschgewebe u. Transferierung in entkernte, aktivierte EizelleÆnun somatisch diploider Kern. VersuchÆmanchen Geweben. Xenopus: Zellkern unterhalb AnimalpolÆDNA-ZerstörungÆInjizierung eines Kerns aus späterem Entw.stadiumÆFrühe Embryokerne können manche diff. Zellen v. Kaulquappen und adulten Tieren ersetzen u. Embryoentw. Auslösen. Kerne adulter Haut, Nieren-, Herz-, Lungen, -u. Darmzellen von Kaulquappen können bei Transfer in entkernte Eizelle Embryonalentw. Bis zur Kaulq. steuernÆmanchmal sogar ausgewachsene Tiere. Xenopustotipotenz eingeschränkt durch Zelltyp u. AlterÆje fortgeschrittener das Entw.stadium einer Zelle desto weniger wahrscheinlich, dass ihr Kern EMbryonalentw. unterstützt. Xenopusblastulazellen reprogrammierbarÆda totipotent. Durch Transplantation mehrerer Kerne aus Blastulazelle in versch. entkernte unbefruchtete Xenopus-EierÆgenetisch idente Frösche=Klone. Totipotenz mit forschreitender Entw. geht verloren. Mausblastulazellen können in keinem Stadium reprogrammiert werden. Mäuse aber klonierbar. Klonen beim Schaf: Dolly Ausgangspunkt zwei Rassen: scottish blackfaceÆEizelle, Finn-DorsetÆKern einer ausdiff. Milchdrüse Milchdrüsen in zellkultur gegebenÆZellen entnommen und mit (durch Pipette) entkernte Zellen zusammengebrachtÆZelle unter Vitellinschicht der Eizelle, dann Dann elektrische MembranfusionierungÆSomakern im CytoplasmaÆFurchungsteilungenÆEmbryo 7 Tage in KulturÆBlastocyste in 3.Schaf (scottish blackface), um festzustellen ob es sich um implantierte Blastocyste handeltÆResultat: Finn-Droset-Schaf, mit Kernspender genetisch ident. Beweis dafür, dass: 1. terminal diff. Zellen von Säugetieren komplette Erbinfor der Art 2. Somazellen und Eizellen im Gehalt von Erbinfo äquivalent 3. diese Info nicht irreversibel verändert 4. aussdiff. Säugerzellen wie Pflanzenzellen komplett reprogrammierbar, Funktion wie Eizellkern. Serumentzug als möglicher auslöser der Totipotenz (Zellzyklusarrest) Milchdrüsenzellen in ZellkulturÆZellzyklusdurchlauf und ReplikationÆ Serum für Zellteilung wird wieder entzogenÆG0 Arrest (keine Zelltlg. Mehr)ÆVerwendung d. Zellen: Fusion mit entkernten Eizellen. Herstellung gentechnische veränderter Schafe für das gene pharming: Produktion eines gentechnisch veränderten Schafes, das ein Gen exprimiert, dessen Protein in Milch sekretiert wird und pharmazeutische Bedeutung hat (Blutgerinnungsfaktoren, Antigene, Insulin, Wachstumsfaktoren). Rekombinante DNA in EizelleÆBlastocyste in LeihmutterÆtransgene Nachkommen die Milch mit gewünschtem Protein abgebenÆReinigung. Man muss viele transgene Schafe produzieren, u. ergiebigstes Schaf selektieren u. klonen. Sicherheitsaspekte bei der Transplantation von invitro differenzierten Stammzellen: Histokompatibilität: Transplantierte Zellen dürfen nicht abgestoén werdenÆam besten Zellen mit gleichem gen. Material. Entweder: adulte SZ, die zu entspr. Zellen transdiff. werden od. therapeutisches Klonen (somatischer Kerntransfer) 15 Therapeutisches Klonen: Spendereizelle entkernt u. Somazellkerne in entkernte Zelle übertragenÆBlastocyste: daraus: ES-Isolation, welche in entspr. Zelle diff. wirdÆkein lebensfähiger Organismus produz. Therapeutisches Klonen kombiniert mit Gentherapie bei Erbkrankheiten: Rag2-Maus (Blutkrankheit)Ædefekten Erythrozyten sollen ersetzt werden. Aus Schwanzspitze: SomezallenentnahmeÆKerntransfer in eine Eizelle->BlastocysteÆICM-ZellenentnahmeÆdiese ES-Zellen sind Rag2Æwerden nun mit Rag2 wildtyp transformiertÆdann hämatopoetische Diff. induziertÆwodurch Rag2 hematopo. SZ entstehenÆInjizierung in MausÆHeilungÆmuss wiederholt werdenÆnicht an Nachkommen weitergegeben. KAPITEL 10: Mesodermale Induktion: Mesoderminduktion bei Xenopus durch Signale aus der vegetativen Region: Kultivierung: Entw. nach normalem SchicksalÆmaternale Faktoren im Ei und nicht Signale spezifizieren Entoderm. Mesoderm jedoch völlig Signalabh. Aus vegetativer Region, die dafür sorgen, dass für Ektoderm vorgesehene animaler Zellstreifen Mesoderm wird. Versuch für Mesoderminduktion: Gewebsstück aus animaler Polkappe (Ektoderm) in Kontakt mit vegetativem GewebeÆnach 3 Tagen: Mesoderminduktion in animaler Polkappe mit Chorda, Muskel, Blut, lockeres Mesenchym. Nachweis auch durch gewebsspezifische Proteine zb. Aktin (für Muskel, aus Mesoderm)Æauch mit Antikörpernachweis. Um zu bestätigen, dass Animalpolkappzellen Mesoderm bilden u. nicht vegetativeÆFärbung mit diIÆAbstammungsmarkerÆzeigt dass markierte Zellen Mesoderm bildenÆvegetative Reg. erzeugt offensichtlich ein od. mehrere Signale. Specification map einer späten Blastula: Isolierte Gewebe v. animaler Polkappe od. vegetative Zellen einer späteren Blastula bilden allein nur Ekto- bzw. Entoderm. Explantate aus ÄquatorialregionÆMesodermale Gewebe (Mesenchym, Blutzellen, Chorda, Muskeln)Æzeigen Mesoderminduktion Kombination von Teilen einer frühen Blastula: Gewebsstücke aus animal u. vegetativem Bereich einer frühen Blastula zusammengegeben u. kultiviertÆMesoderminduktion in animaler PolkappeÆFestlegung durch Faktoren im Kontaktbereich. Natur des induktiven Signals für Mesodermbildung: Induzierendes Signal wahrscheinlich sezerniertes Molekül, dass durch extrazell. Raum diffundieren kann. Animale Polkappe nur kurze Zeit für Signal kompetent. Mesoderminduktion beginnt um das 32-Z-St und ist mit Beginn der Gastrulation fast abgeschlossen.2h Kontakdauer zw. Induzierender veg. Region u. den darauf reagierenden Animalpolkappzellen reicht für Mesoderminduktion, 5h: Mesodermgewebe vollst. induziert. 11h nach Befr.-->Kompetenzverlust. Gemeinschafftseffekt der reagierenden Zellen: Induzierende Zellen produzieren einen Faktor, der Mindestkonzentration erreichen muss, um Muskelbildung im Mesoderm zu induzieren: GE: größere Zellanhäufungen der animalen PolkappeÆstarke Expression. Ausmaß? Vielleicht Gradient von induzierendem Signal: wird Schwellenwert d. Gradienten unterschrittenÆkeine Mesoderminduktion. Zeitliche Kontrolle der Entwicklung: innere Uhr kontrolliert Zeitpunkt der Genexpression mesodermspezifischer Gene: Zellen der Animalpolkappe haben nur 7h Kompetenz um auf ind. Signal zu reagieren (etwa 4-11h nach Befruchtung). Damit Zellinduktion in diesem Zeitraum, müssen die Zellen mindestens 2h lang dem Induktor ausgesetzt seinÆunabh. Von Induktion in der Kompetenzphase setzt die Expression der Muskelgene immer 16 h nach Befruchtung ein. Mehrere Signale induzieren und organisieren Mesoderm in der Xenopus Blastula Zwei aus vegetativer Region (1.Signalgruppe): 1. ist Mesoderminduktor, der größtenteils für Bauchseite typisches Mesoderm spezifiziert, 2. spezifiziert ganze dorsal gelegene Mesoderm, das Spemann-O. enthält und aus dem Chorda entsteht. Zwei weitere Gruppen von Signalen: organisieren ventrales Mesoderm entlang dorsoventral-Achse, indem sie es in Bereiche einteilen (Muskel, Nieren, Blut). Dritte SignalgruppeÆaus Ventralregion, 4.Sg.: v. S.OÆmodifiziert ventralisierende Wirkung der 3. Gruppe. Verschiedene Quellen für mesodermale Strukturen: Dorsal-vegetale-Zellen: Notochord, Muskel, ventral vegetale Zellen: Blut assoziierte Gewebe (Niere). Ventrales Mesoderm stark an Bildung von Somiten und damit Muskeln beteiligt, aber Spezifikationsversuche v. präsumptivem ventralem Mesoderm einer frühen Blastula macht kein MuskelÆweiteres (3.) Signal aus Ventralbereich notwendig, das Mesoderm ventralisiert u. mit dorsalisierendem Signal interagiert. 4. Dorsalisierendes Signal aus S.O.: Versuch: dorsale Randregion einer späten Blastula+ventrales präsumptives Mesoderm: Muskel+Herz. Kultur ohne dorsale Randregion: Mesenchym/Blut (ventrale Identität in beiden Fällen durch 3. Signal festgelegt). 16 Wirkung des 4.Signals: zB wenn man S.O. in ventrale Marginalzone einer frühen Gastrula transplantiertÆ2.AchseninduktionÆDoppelembryo (Siam. Zwilling). Dorsalisierende Effekt des NZ beruht darauf dass S-O- induziert. Die chemische Natur der mesodermalen Signale: Zwei Strategien um Faktoren zu finden die Mesoderm induzieren: • • Applikation des Faktors (Protein) zu isolierten Blastulasegmenten → Spezifikations-Karte Injektion der mRNA in den animalen Pol einer frühen Blastula Kandidaten: maternale Faktoren: Vg-1 (TGF-ß): mRNA in Vegetalregion, neues Vg-1 zuerst proteolysiert, reifes Vg-1: stark mesoderminduzierend. Durch Konstruktion einer Hybrid-DNA konnte man Protein in diesen Zellen herstellenÆInjiziert man dann RNA-Konstrukt in Gewebe aus AnimalpolkappeÆdorsales Mesoderm u. Rettung UV-bestrahlter Embryonen. Behandelt man isolierte Animalpolkappzellen mit gereinigtem, aktivem Vg-1ÆEmbryoide mit klaren Achsen und Kopfstrukturen. Bei hoher Cg-1-Konz.: dorsales Mesoderm (2.Signal), niedrig: ventrales Mesoderm (1.S.) Andere Mesodermale Induktoren (kein eindeutiger Bezug bis heute festgestellt): • • • • • • • Aktivin (TGF-ß): Reaktion Konz.abh.: hoch: Bildung von Chorda u. Muskeln, niedrig: nur Muskeln. Bone morphogenic factor (TGF-ß): Knochenwachstumsf: Musterbldg. d. vent. Mesoderms Xwnt-8: ventralisiertes Mesoderm Fibrolastenwachstumsfaktor (FGF): ventrale Mesoderminduktion Noggin: dorsalisiert, bindet BMP-4 Chordin: dorsalisiert, bindet BMP-4 Frizbee: dorsalisiert, bindet Wnt-Proteine Musterbildende Faktoren des Mesoderm: • • • • • Noggin: in S.O. exprimiert, sekretiertes Protein mit unbekannter Sequenz, kein Mesoderminduktor, dorsalisiert Explantate der ventralen RandzoneÆkein echter Faktor 4, Signalkandidat für Mesodermmuster entlang Dorsoventralachse Chordin u. Frizbee (auch v. S.O.)Æinduzieren dorsales Gewebe Dritte Signalgruppe ventralisiert Embryo BMP-4: Expression in zukünf. Mesoderm (wie Xwnt-8)ÆUnterdrückt man BMP-4-AktivitätÆEmbryo dorsalisiert u. Ventralzellen werden zu Muskel u. Chorda. Noggin verhindert BMP-4-Bindung. Chordin funktioniert ähnlich, und frizbee bindet an Wnt-Proteine. Huhn-u.Mausembryonen: auch TGF-ß-Fam-Signale mesoderminduzierend. Maus: Nodal wird während Mesodermbildung im Primitivstreifen exprimiert, homozygote Mutante von NodalÆkein Mesoderm (also Nodal=Mesoderminduktor), Wenn Aktivin od. Typ-II-Rezeptor dafür fehltÆDennoch MesodermÆalso nicht nötig. Die Mid-Blastula-Transition: BefruchtungÆProteinsynthesegeschwindigkeit steigtÆneue Proteine entstehen durch Translation vorhandene maternale mRNAÆbis zu Ende der 12.Furchungsteilung wird nur wenig neue mRNA synthetisiertÆdieser Punkt=MBT in später Blastula. Glztg: (all dies zam=MBT) • • • erste Expression paternaler Gene Veränderungen in Blastula: Furchungen zunächst alle 35 min., ab 12.Teilung asynchron, da Zellen unerschiedlich lang zur nächsten Zellzyklusvollendung brauchen Zellen beweglicher, bilden erkennbare, kleine Ausbuchtungen Auslöser der Mid-Blastula-Transition: • • • Zellteilung hat keinen Einfluss auf Transition (Versuch: mit Cytochalasin B Furchungsunterdrückung aber nicht DNASyntheseÆTranskription setzt trotzdem ein) Zell-Zell-Interaktionen keine Rolle: dissoziierte Blastomeren machen Transition zur gleichen Zeit Auslöser vielmehr Verhältnis DNA zu Cytoplasma: Versuch: erhöht man DNA-Menge künstlich (zB durch Polyspermie od. DNA-Injizierung)Ævorzeitiger TranskriptionsstartÆvermutlich im Cytoplasma von Anfang an bestimmte Transkriptionsrepressormenge da, bei Furchungen erhöht sich Menge an DANNÆRepressormenge im Verh. dazu sinkt bis Repression aufgehoben wird. D.h. zeitliche Steuerung der MBT so, dass ein Stoff solange anhäufen muss, bis Schwellenwert erreicht ist, der durch anfängliche cytoplasmatische Faktorkonz. definiert ist. Zygotische Gene: Brachyury (reagiert auf mesodermorganisierendes Signal), codiert Transkriptionsfaktor, wurde zuerst bei Mäusen entdeckt. Expression: zuerst im Mesoderm, später nur Notochord u. Posteriormesoderm. Xenopus: Brachyury-Homolog in Ektoderm wenn mans zb mit Aktivin (Mesoderminduktor) behandelt. Ob Brachyury aktiv: abh. von FGF, der durch Brachyury aktiviert wird. Überexpression (zB mRNA-Injektion) v. B.: Ventralmesoderm Wie schalten vg-1 od. Aktivin die abh. Gene wie Brachyury an der richtigen Stelle im Embryo an? 17 Konzentrationsgradient aktiviert bei einer bestimmten Schwellenwertkonzentration (SWK) Gene. Aktivin: bei best. SWKÆGenanschaltungÆ Zellzustände werden definiert, die den versch. Regionen der dorso-ventralenAchse entsprechen: • • • • • Bei niedrieger A-Konz.: nur Epidermis 0: Ektoderm +: Muskel ++: Notochord +++: Goosecoid (typisch für Organisatorregion) Experiment: Ansteigende Aktivin-mRNA-Menge in vegetatives Gewebe injiziert u. dann in Kontakt mit animaler Kappe: Aktivin diffundiert in Polkappe, Brachyury wird in einiger Entf. der Quelle angeschaltet (Gradient), goosecoid in direkt benachbarten Zellen exprimiert. Übersicht: Mesoderminduktion bei Xenopus: Vegetative Region È Signal 1 (allg. Induktionssignal) z.B.: Vg-1, Aktivin Ë Induktion Ì Ventrales Mesoderm Signal 3: ventralisierendes Signal z.B.: BMP-4, Xwnt-8 dorsales Mesoderm mit Sp.-O. Ì Ë Signal 4: dorsalisierendes Signal z.B.: noggin, chordin 18
