Transgene Tiere

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Transgene Tiere
Definition:
Ein transgenes Tier besitzt definierte Veränderungen im
Genom, die nicht durch klassische Züchtung oder zufällige
Mutagenese zu erreichen wären.
Beispiele:
- Das Gen für Wachstumshormon (GH) wurde mit einem
starke Promotor in das Genom der Maus eingepflanzt.
- Das Gen für humanes a1-Antitrypsin (AAT) wurde in das
Genom des Schafs übertragen.
- Das Gen für das Prion-Protein (PRP) wurde bei der Maus
durch homologe Rekombination inaktiviert (knock out
Maus).
Transgene Tiere
Wildtyp Maus
GH-transgene Maus
Erzeugung transgener Tiere
1. Mikroinjektion von DNA-Konstrukten in befruchtetete
Eizellen
2. Intramuskuläre DNA-Injektion
3. Genetische Veränderung von embryonalen Stammzellen
(ES)
und Erzeugung chimärer Transgene
4. Klonierung von Tieren aus genetisch veränderten Zellen
5. Gentransfer mittels retroviraler Vektoren
Mikroinjektion (1)
Spendertier
Superovulation
Besamung
Gewinnung befruchteter
Eizellen (Vorkernstadium)
in vitro Kultivierung
Mikroinjektion des
DNA-Konstrukts
transferfähiger
Embryo
Mikroinjektion (2)
transferfähiger
Embryo
zyklussynchronisertes
Empfängertier
Embryotransfer
Trächtigkeit
Geburt
Überprüfung auf Integration
und Expression des Transgens
F1-Generation, F2-Generation
transgene Linie
transgenes Foundertier
Eigenschaften der Mikroinjektion
- stabile Integration des DNA-Konstukts in das Genom
- häufig viele Kopien (ca. 10 – 100) tandemartig wiederholt
- Integrationsort zufällig (Positionseffekte !)
- Foundertiere besitzen genetisch einheitliche Zellen
- experimentell aufwendig (Mikroinjektion, in vitro Kultur der
Embryonen)
Intramuskuläre DNA-Injektion
- nur einzelne wenige Zellen des Tiers integrieren das Konstrukt
- Transgen wird nicht an die Nachkommen weitergegeben
- Durchführung sehr einfach
- ideal geeignet zur genetischen Immunisierung
- DNA besser lager- und transportfähig als Protein-Impfstoffe
- einmalige Applikation ausreichend
- keine Gefahr durch Lebendimpfstoffe (abgeschwächte Viren)
Gentransfer mittels ES oder durch
Klonierung genetisch veränderter Zellen
- genetische Veränderung wird an einzelnen Zellen in Zellkultur
vorgenommen
-durch homologe Rekombination kann man Integrationsstelle steuern
- praktisch jede denkbare Modifikation der DNA möglich
- ES-Zellen nur für Mäuse verfügbar
- Klonierung von Tieren aus differenzierten Zellen bietet prinzipiell die
gleichen Möglichkeiten zum Gentransfer wie die Verwendung von
ES-Zellen
Expression des Transgens
- abhängig vom gewählten Promotor
- starke virale Promotoren (CMV, SV40)
- endogene Promotoren
- induzierbare Promotoren (z.B. TetR-Promotor)
- gewebsspezifische Promotoren (z.B. ßLactoglobulinpromotor für
Expression in der Milchdrüse)
- abhängig vom Integrationsort (Positionseffekt)
- abhängig von der Kopienzahl der integrierten Konstrukte
- cDNA-Konstrukte funktionieren häufig nicht gut
Kosten bei der Erstellung transgener Tiere
Maus
Schwein
13
Kosten/Tag/Tier (DM)
Betreuungszeit
(Anzahl Tiere x Tage)
Kosten/Tier (DM)
Kosten für ein
exprimierendes
transgenes Tier (DM)
Schaf
Rind
320
120
1 040
0,40
14
4
24
204
2 412
20 400
30 135
40 000
96 000
873 000
195
Anwendungsmöglichkeiten transgener Tiere
• Tiergesundheit
- genetische Immunisierung
- Übertragung von Resistenzgenen
- Modifikation von endogenen Genen
• Humanmedizin
- Produktion therapeutischer Proteine (Bioreaktor, gene pharming)
- Produktion von Organen für die Xenotransplantation
• Verbesserung tierischer Produkte
- Fleischleistung (Wachstumshormon)
- Fettverteilung, Fettzusammensetzung
- Milchzusammensetzung (Lactose-Gehalt, Caseine)
- Eigenschaften der Wolle
• Umweltschutz
- Urinzusammensetzung (Reduktion von Phosphat und Nitrat)
Mögliche Ansatzpunkte für die Veränderung der
Milchzusammensetzung
Gen
Effekt
Casein
Steigerung des Proteingehalts
verändertes Casein
Änderung der Verarbeitungseigenschaften
Anti-sense ß-Lactoglobulin
Verringerung des ß-Lactoglobulingehalts
Anti-sense
Acetyl-CoA-Carboxylase
Verringerung des Fettgehalts
ß-Galactosidase, Lactase
Verminderung des Lactosegehalts
spezifische Antikörpergene
Mastitisprävention,
verbesserte Hygiene der Milch
Erstellung einer transgenen Kuh, die Lactase produziert
(Reduzierung des Lactosegehalts in der Kuhmilch)
DNA
ß-LactoglobulinPromotor (Rind)
Lactasegen ohne Promotor
(Rind oder Mensch)
r, r
tu f e
l
s
ku an
o
r
y t
br ryo
E m mb
E
transgenes Foundertier
(hemizygot)
Überprüfung der Integration des
DNA-Konstrukts
Überprüfung der Expression des
Lactase-Gens
(= Wird tatsächlich Lactase in der
Milch gebildet?)
Mikroinjektion des DNA-Konstrukts
Aufbau einer transgenen Linie
mit homozygot transgenen Tieren
Humane Proteine, die bislang in der Milch transgener Nutztiere produziert
wurden:
Gen
Spezies
Konz.
[mg/l]
α1-Antitrypsin (AAT)
Schaf
35 000
γ-Interferon (γIFN)
Schaf
0,02
Krebs
Faktor IX (FIX)
Schaf
100
Hämophilie
Wachstumshormon (GH)
Schaf
1 700
Plasminogen-Aktivator (tPA)
Schaf
3
Fibrinogen
Schaf
1 000
Blutersatzprodukte
monoklonaler Antikörper
Schaf
300
antikörperspezifisch
Antithrombin III (ATIII)
Ziege
10
Durchblutungsstörungen
5
Herzinfarkt, Schlaganfall
Anwendung
Lungenemphysem
Wachstumsstörungen
Herzinfarkt, Schlaganfall
lange wirksamer
Plasminogen-Aktivator (LA-tPA) Ziege
Interleukin 2 (IL2)
Kaninchen
0,4
Krebs
Protein C (PC)
Schwein
0,2
Thrombose
Lactoferrin
Rind
Infektionen, Anämie
Erstellung einer knock out Maus (1)
homologe Rekombination
Startcodon
ATG
Stopcodon
genomische DNA
+
1
DNA-Konstrukt für
knock-out
2
R
neo
3
Gen mit 3 Exons
HSV-TK
homologe DNA-Bereiche
Transfektion des DNA-Konstrukts in ES-Zellen
homologe Rekombination von Konstrukt und gen. DNA
Zellkultur der ES-Zellen
Selektion mit G418 (Anwesenheit von neoR)
Selektion mit Ganciclovir (Abwesenheit von HSV-TK)
Überprüfung der korrekten Integration des Konstrukts
Stopcodon
rekombinierte
genomische DNA
R
neo
1
2
3
1. Exon des Gens fehlt,
Genprodukt kann nicht
mehr gebildet werden
Erstellung einer knock out Maus (2)
Erzeugung einer Keimbahnchimäre
genetisch modifizierte ES-Zellen
Injektion in eine Blastocyste,
Implantation in Empfängertier
Trächtigkeit
Chimäre Maus
Überprüfung, ob genetisch modifizierte ES-Zellen
zur Keimbahn beigetragen haben
Erzeugung heterozygoter F1-Tiere und
homozygot Gen-defizienter F2-Tiere (= knock out Mäuse)
Dolly (erstes kloniertes Schaf)
Wilmut et al., (1997)
Nature 385, 810-813
Polly
(Klon eines Faktor IX transgenen Schafs)
Abstammungssicherung in der Tiermedizin
?
Kommt ein bestimmtes männliches Tier als Vater in Frage ?
M
N
V1
3 Systeme:
- Blutgruppen
- Mikrosatelliten (STR-Typisierung)
- AFLP/Fingerprint
Quelle: Tosso Leeb, Tierärztl. HS Hannover
V2
Abstammungssicherung in der Tiermedizin
Notwendigkeit eines gesicherten Abstammungsnachweises:
- Nutzung erblicher Leistungsmerkmale
- Vermeidung erblicher Defekte
Kennzeichnung von Tieren:
(Abhängig von Tierart)
Aufnahme des Signalements
Tätowierungen
Brandzeichen
Ohrmarken
Geburtsmeldung nach VVO (Tierpass)
Mikrochip
Quelle: Tosso Leeb, Tierärztl. HS Hannover
Doppellender ( Myostatin-Gen)
Blaue Belgier (Belgian Blue):
Extreme Bemuskelung (+ 20 %), reine Fleischrasse
Muskuläre Hyperplasie (mehr Muskelzellen, Größe normal)
Verminderte Fruchtbarkeit
Verminderte Milchleistung
Häufig Schwergeburten
monogenetisch, autosomal rezessiver Erbgang
Erbliche Immunschwäche bei Arabern (SCID)
Severe combined immunodeficiency (SCID):
Vollständiges Fehlen von B- und TLymphozyten
Tiere sterben früh an opportunistischen
Infektionen
monogenetisch, Erbgang autosomal rezessiv
Ursache: Mutation im Gen f. d. katalytische
Untereinheit d. DNA-Abhängigen
Proteinkinase (PRKDC) keine funktionelle
DNA-PK, keine VDJ-Rekombination
(Sequenzspezifische Rekombination zur
Umlagerung von Genen für Immunglobuline
und T-Zell-Rezeptoren)
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