knock-in-strategie
Werbung
GENERIERUNG TRANSGENER TIERMODELLE SUSANNE BIERL – BOD8 IMMUNOLOGIE FR. DR. B. JUNGNICKEL FR DR. I. PFEIL 08.04.2009 INHALTÜBERSICHT Susanne Bierl BOD8 Immunologie 2 INHALTSVERZEICHNIS • • • • • • • Einführung Definitionen Knock-In-Strategie Geninaktivierungs-/ Knock-outStrategie konditionelle Knock-out-Strategie Anwendungen Zusammenfassung Susanne Bierl BOD8 Immunologie 3 EINFÜHRUNG Susanne Bierl BOD8 Immunologie 4 EINFÜHRUNG • Durch gezielte genetische Manipulation Veränderung des Genoms • Große Bedeutung in der Forschung • 2007 Nobelpreis für Physiologie/Medizin 2007 an Martin Evans, Mario Capecchi und Oliver Smithies Susanne Bierl BOD8 Immunologie 5 EINFÜHRUNG Susanne Bierl BOD8 Immunologie 6 EINFÜHRUNG • Verwendete Tierarten • In der BRD seit 1991 keine Menschenaffen Susanne Bierl BOD8 Immunologie 7 DEFINITIONEN Susanne Bierl BOD8 Immunologie 8 DEFINITIONEN Transgen Gen, das mit gentechnischen Verfahren in das Erbgut eines Organismus eingebracht wurde Transgene Tiere Chromosomen enthalten stabil integrierte Kopien exogener Gene zusätzliche/entfernte Kopien endogener Gene Genkonstrukte Susanne Bierl BOD8 Immunologie 9 DEFINITIONEN Konventionell Knock-Out Gezieltes Deaktivieren eines oder mehrerer Gene durch genetische Manipulation Knock-In Gezieltes Einbringen von Genen Insertion Konditionell Knock-Out in Gen definierter Gewebe Überleben der Tiere Susanne Bierl BOD8 Immunologie 10 DEFINITIONEN • Einsatzgebiete: ◦ „knock-out“- und „knock-in“-Mäuse in der Grundlagenforschung ◦ Xenotransplantate ◦ Tierzucht ◦ Produktion von Pharmaprodukten z.B. in der Milchdrüse („gene pharming“) Susanne Bierl BOD8 Immunologie 11 KNOCK-IN-STRATEGIE Susanne Bierl BOD8 Immunologie 12 HERSTELLUNG / GENERIERUNG • Mikroinjektion • Retroviraler Gentransfer • Embryonale Stammzelltechnik • Kerntransfermethode • spermienvermittelter Gentransfer Susanne Bierl BOD8 Immunologie 13 MIKROINJEKTION Susanne Bierl BOD8 Immunologie 14 MIKROINJEKTION • Nachteile ◦ Eizellen klein technisch sehr aufwändig ◦ Vorkern schwer zu erkennen Zeitpunkt ◦ Insertionsmutagenese durch Zufallsinsertion (event) ◦ Geringe Erfolgsrate (1 %) Susanne Bierl BOD8 Immunologie 15 RETROVIRALER GENTRANSFER Susanne Bierl BOD8 Immunologie 16 RETROVIRALER GENTRANSFER • Vorteile o Stabile Integration • Nachteile o Begrenzte Kapazität o Rekombination mit anderen Retroviren zu infektiösen Viren o Steuerung der Integrationsstelle schwierig Susanne Bierl BOD8 Immunologie 17 RETROVIRALER GENTRANSFER Susanne Bierl BOD8 Immunologie 18 EMBRYONALE STAMMZELLTECHNIK Susanne Bierl BOD8 Immunologie 19 SPERMIENVERMITTELTER GENTRANSFER • • • Viraler Gentransfer in Genom der Spermien Einnisten in Hoden Produktion Spermatozoen-Genom nimmt Fremd-DNA häufig nicht an Susanne Bierl BOD8 Immunologie 20 KERNTRANSFERMETHODE Susanne Bierl BOD8 Immunologie 21 GENINAKTIVIERUNGS-/ GENINAKTIVIERUNGSKNOCK--OUT KNOCK -STRATEGIE Susanne Bierl BOD8 Immunologie 22 KNOCK-OUT-STRATEGIE Susanne Bierl BOD8 Immunologie 23 KNOCK-OUT-STRATEGIE • Identifizierung des zu verändernden Gens • Einzubringendes, teilweise homologes Gen Selektionsmarker Susanne Bierl BOD8 Immunologie 24 KNOCK-OUT-STRATEGIE • Homologe Rekombination mittels cre/loxP-System (aus P1 Bakteriophagen) • Rekombinase cre (Causes recombination) katalysiert Spaltung und Neuverknüpfung zwischen spezifischen Sequenzen (loxP) Susanne Bierl BOD8 Immunologie 25 KNOCK-OUT-STRATEGIE • • Vor und nach betreffenden Abschnitt schneiden loxP floxen Susanne Bierl BOD8 Immunologie 26 KNOCK-OUT-STRATEGIE Susanne Bierl BOD8 Immunologie 27 KONDITIONALES KNOCK-OUT Susanne Bierl BOD8 Immunologie 28 KONDITIONALES KNOCK-OUT • Häufig frühzeitiges Sterben der Mausmutanten • Knock-Out im gesamten Organismus • Gezieltes Knock-Out in definierten Geweben Susanne Bierl BOD8 Immunologie 29 KONDITIONALES KNOCK-OUT Susanne Bierl BOD8 Immunologie 30 ANWENDUNGEN Susanne Bierl BOD8 Immunologie 31 ANWENDUNGEN • 99% der Mausgene kommen beim Menschen vor Maus ≠ Mensch • • Gesamtes molekulares Umfeld einer Krankheit vorhanden Wichtiges Instrument der Forschung Susanne Bierl BOD8 Immunologie 32 ANWENDUNGEN Susanne Bierl BOD8 Immunologie 33 ZUSAMENFASSUNG Susanne Bierl BOD8 Immunologie 34 ZUSAMMENFASSUNG • Transgenes Tiermodell wichtiges Forschungsinstrument • Verschiedene Methoden • Auswahl je nach Anforderung Susanne Bierl BOD8 Immunologie 35 ZUSAMMENFASSUNG • Aktueller Stand: ◦ 2.000 der 40.000 Mausgene konnten bisher gezielt mutiert werden ◦ Preis einer Knock-Out Maus: 100 – 200 € Susanne Bierl BOD8 Immunologie 36 DANKE Susanne Bierl BOD8 Immunologie 37
