Evolution 1: Q-beta replicase: The Spiegelman-Monster Q
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Evolution 1: Q-beta replicase: The Spiegelman-Monster 1. Was muss ein Evolutionsexperiment können? 2. Motivation für in vitro Experimente mit RNA Phagen 3. Qß-Bakteriophagen 4. Qß geeignet! 5. „Sol Spiegelman als Gott“: Selektionsdruck 6. Serial Transfer Methode 7. Messmethoden und Ergebnisse des Versuchs Was muss ein Evolutionsexperiment können? 1. Amplifikation muss beobachtbar sein <=> sich vermehrende Spezies 2. Mutation und Selektion muss stattfinden 3. Vorhandene Selektionsbedinungen sollten gut manipulierbar sein 4. In Überschaubaren Zeiträumen gültige Aussagen liefern 5. Ergebnisse sollten „einfach“ quantitativ und qualitativ auszuwerten sein Motivation für in vitro Experimente mit RNA Phagen Was sind Bakteriophagen? - Viren - häufigste „Lebewesen“ auf der Erde (10^30 Virionen im Meer) 1. Schnelle Replikation/Amplifikation 2. => viele Mutationen pro Zeit 3. Bakteriophagen sind sehr einfache, übersichtliche Systeme 4. wenig Ressourcen nötig! Qß-Bakteriophage Qß Virus befällt Escherichia Coli Salmonellen (kurz E-Coli, das „Haustier der Molekularbiologen“) Qß Qß-Bakteriophage Qß Virus befällt Escherichia Coli Salmonellen (kurz E-Coli, das „Haustier der Molekularbiologen“) Qß Warum Qß Replikationssystem zur Untersuchung elutionärer Prozesse? Qß basierendes Replikationssystem besteht (nur) aus: - isolierter RNA dependent Qß RNA Polymerase: Qß Replikase - isolierter Qß RNA sowie - mit radioaktivem Phosphor markierte RNA Bausteine (32P Ribonukleodide) - Puffer Substanzen (=> PH-Wert stabilisierend) Qß-Bakteriophage Qß Virus befällt Escherichia Coli Salmonellen (kurz E-Coli, das „Haustier der Molekularbiologen“) Qß Warum Qß Replikationssystem zur Untersuchung elutionärer Prozesse? Qß basierendes Replikationssystem besteht (nur) aus: - isolierter RNA dependent Qß RNA Polymerase: Qß Replikase - isolierter Qß RNA sowie - mit radioaktivem Phosphor markierte RNA Bausteine (32P Ribonukleodide) - Puffer Substanzen (=> PH-Wert stabilisierend) ===> Also relativ einfaches Replikationssystem! Qß-Bakteriophage Ganzes Viruspartikel („Virion“) Capsid(mit A-Protein) Ein Viruspartikel enthält: - Qß RNA als Erbmaterial(einzelsträngig, 3500BP) - Spezielle Replikase Proteine: RNA dependent Qß RNA Polymerase - Capsid Proteine, A-Protein - keine DNA! Qß geeignet! 1. Amplifikation muss beobachtbar sein <=> sich vermehrende Spezies Qß Replikase stellt anhand eines RNA Templates über doppelsträngige Zwischenformen weitere RNA Kopien unter Einbau der readioaktiven Ribonukleodide her. => exponentielle Amplifikation der Template RNA's bis umgebende Ressourcen (Ribonukleodide) verbraucht! Qß geeignet! 2. Mutation und Selektion muss stattfinden RNA Replikase im allgemeinen schlampiger als DNA Replikase: => keine replizierte RNA entspricht 100% dem Vorgänger „Sol Spiegelman als Gott“: Selektionsdruck Selektion auf schnelle Replikationsgeschwindigkeit! "What will happen to the RNA molecules if the only demand made on them is the Biblical injunction, multiply, with the biological proviso that they do so as rapidly as possible?" Serial Transfer Methode Selektionsdruck hinsichtlich schneller Replikation – wie kann man diesen technisch verwirklichen? RNA Replikation lässt man im Serial Transfer Methode In jedem Schritt, also vor jedem Transfer zwei Analysen: 1. Menge der gebildeten RNA Serial Transfer Methode In jedem Schritt, also vor jedem Transfer zwei Analysen: 1. Menge der gebildeten RNA 2. Menge an infektiöser RNA Zu 1. Nachweis der Menge der geb. RNA Ansäuern des Ansatzes mit Trickloressigsäure (TCA) mit dem Ergebnis, dass polymerisierte P32 Nukleodide (RNA) ausflocken und unlöslich werden, während nicht polymerisierte Monomäre weiterhin in Lösung bleiben und durch Membranfiltration von den Polymeren abgetrennt werden können. („Ausflocken = RNA Stränge verhackeln sich“) Bestimmung der auf dem Membranfilter hängengebliebenen Radioaktivität (radioaktive Moleküle müssen Polymere sein, also RNA). ==> Messung der Strahlung ~ Bildung von RNA Zu 2. Nachweis noch voll funktionsfähiger Einheiten: RNA Verdünnung wird mit zellwandlosen Bakterien versetzt (Protoplasten – leicht eindringbar), um festzustellen wieviel RNA Stränge noch infektiöse Partikel hervorbringen konnten. Protoplasten auf trüben Nährboden -> dort wo Infektion: Protoplastenrasen durchsichtig. => Zählbar: Anzahl Löcher (Plugs) entsprechen Anzahl infektiöser Einheiten. Kontrolle:RNA Kopie in Vitro ohne Verluste Qbeta RNA Replikase Qbeta RNA Protoplast von E-Coli Zelle; RNA Nukleotide Funktionsfähige Virus RNA Komplette funktionsfähige Viren (infectious units) => RNA Replikasen aus Bakteriophage (Qbeta-Virus): Replizieren nur Qbeta RNA! RNA Produktion Messung RNA Länge Durch Sedimentationsrate während Zentrifugation mit S(=Svedberg) als Maß für Rate Großes S => schwer => großes Molekül Reduktion der Genlänge Kein Genom mehr mit Orginallänge (Referenz markiert mit niederenergetischem ß-Strahler 3h (Trizium)) Bestimmung des Gewichts (Geschwindigkeit durch Gel ~ Länge ~ Gewicht) Bestimmung des Gewichts (Geschwindigkeit durch Gel ~ Länge ~ Gewicht) Bestimmung des Gewichts (Geschwindigkeit durch Gel ~ Länge ~ Gewicht) Vergleich der Replikationsraten des Endprodukts und der Ausgangs RNA Ergebnisse: “Spiegelman monster“: Nach 74 Transfers nur noch 83% der Orginalgenomlänge(218 Nukleotiden); nach wie vor reproduzierbar durch Replikase! ===> MONSTERHAFT (bzw. zwergenhaft!!!) Erfolgreiche Methodik, um Evolution In Vitro zu untersuchen! Eigen: 3SR Methode 3sr Methode: Anhand eines HIV-1 RNA Template wird ein dazu komplementärer DNA Strang erzeugt (Reverse HIV-1 Transkriptase (Retro Viruses)) Aus diesem DNA Strang wird Doppel DNA Strang gebaut (DNA Polymerase) Diese Doppel DNA wird konventionell wieder in eine RNA transkribiert (RNA Polymerase) Eigen: Fluoreszenz von in Doppelstrang gezwickte Farbstoffe (während DNA Polymerase) unmittelbar messbar (Interkalation). Ressourcen waren im Überfluss da, nur die zugegebene Menge von RNA war ausschlaggebend für das erhaltene Produkt Deshalb bedeutet ein Transfer jedesmal nur innerhalb der exponentiellen Phase durchgeführt (konstante Reproduktionsraten – maximalschnell) eine Selektion der RNA Bildungsgeschwindigkeit: Anders ausgedrückt: Diejenigen Mol. die schneller reproduzieren können nach einigen dieser Transfers die übrigen verdrängen – ersetzen (Mengenverhältnis verändert sich - „Herausverdünnung“). Man nahm dafür ein HIV Genom mit 220 Basen, von dem man wusste, dass es in vivo die Bindungsstellen für die reverse RNA Transkriptase enthält. Bei Eigen haben sich sehr schnell zwei Varianten in diesen seriellen Transfers herausgebildet: „EP1“ und „EP2“, die nur noch 48 Basen lang waren.
