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Zusammenfassung
Ester der Sinapinsäure sind eines der löslichen Produkte des phenolischen Stoffwechsels in
Pflanzen. Ihr Vorkommen ist typisch für viele Arten aus der Familie der Brassicaceen (Kreuzblütler). Sie spielen eine wichtige Rolle als Schutzfilter gegen schädigende UV-Strahlung in
Arabidopsis thaliana L. Heynh. (Ackerschmalwand). Im Wildtyp dieser Pflanze ist 1-O-Sinapoyl-ß-D-glucose die Vorstufe von 2-O-Sinapoyl-L-malat, das hauptsächlich in der oberen
Epidermis der Blätter akkumuliert. Die Umwandlung dieser Ester wird katalysiert von der 1-OSinapoyl-ß-D-glucose:L-Malat-Sinapoyltransferase (SMT, EC 2.3.1.92). Weiterhin wurde die
SMT in Raphanus sativus (Radieschen), Brassica rapa (Rübsen) und Brassica napus (Raps)
nachgewiesen. Die Arabidopsis-Mutante sinapoylglucose accumulator1 (sng1) akkumuliert
Sinapoylglucose anstelle von Sinapoylmalat, was zu der Annahme führte, dass durch das
SNG1-Gen die SMT kodiert wird. Um dieses Gen zu klonieren, wurde in der Sammlung des
Arabidopsis Biological Resource Centers (ABRC) an der Ohio State University (Columbus,
Ohio, USA) eine T-DNA-Mutante mit sng1-Phänotyp identifiziert. Durch inverse PCR konnte
daraus ein Fragment genomischer DNA isoliert werden, das von der T-DNA-Insertion stammte. Mit dieser DNA wurde aus einer genomischen Bibliothek von Arabidopsis ein Cosmid
erhalten, dass die sng1-Mutante nach Transformation (Vakuuminfiltration mit Agrobacterium
tumefaciens) komplementierte. Die 13 kb genomischer DNA des Cosmids befinden sich im
Abschnitt 131 (GenBank Nr. AC004401) des Chromosoms 2 von Arabidopsis, was einer Position bei 38,1 cM (Marker pCC300) auf der Karte Rekombinanter Inzuchtlinien von Lister und
Dean entspricht. In einem Gen, das von der DNA kodiert wird, wurde die T-DNA-Insertion in
der sng1-Mutante gefunden. Ein Fragment genomischer DNA, das nur dieses Gen kodiert,
komplementierte die sng1-Mutante wie zuvor das Cosmid, auf dem sich noch ein weiteres Gen
befand. Das SNG1-Gen (GenBank Nr. AAC17816) gehört zu einer Gruppe von fünf sehr ähnlichen, dicht beieinander liegenden Genen. Ein Fragment des SNG1-Gens wurde eingesetzt, um
in einer Bibliothek aus Arabidopsis-Keimlingen eine vollständige cDNA zu isolieren (GenBank
Nr. AF275313). Die SNG1-cDNA weist eine Größe von 1,5 kb auf, das daraus abgeleitete
SNG1-Protein enthält ein N-terminales Peptid von 17 Aminosäuren (ASIVKFLPGFEGPLPFE) , das zuvor auch durch Aufreinigung der SMT aus Brassica rapa erhalten worden war. Die
vor diesem Peptid befindlichen, N-terminalen 19 Aminosäuren wurden als Signalpeptid für das
Endoplasmatische Retikulum identifiziert. Das SNG1-Protein besteht aus 433 Aminosäuren,
woraus sich eine molare Masse von 49,4 kDa ergibt. Die Expression der SNG1-cDNA in
Escherichia coli zeigte, dass das SNG1-Protein SMT-Aktivität besitzt. Die SNG1-Sequenz
weist eine signifikante Ähnlichkeit zu Serincarboxypeptidasen aus diversen Organismen auf
(EC 3.4.16, Peptidasen-Familie S10). Die katalytisch aktiven Reste dieser Enzyme sind auch in
der Sequenz des SNG1-Proteins vorhanden (Serin 173, Asparaginsäure 358 und Histidin 411,
sog. katalytische Triade). Die Aktivität der SMT aus Arabidopsis wird durch Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) gehemmt, was die Beteiligung eines Serinrests an der Katalyse zeigt. Die
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Ergebnisse führten zu dem Schluss, dass die Acyltransferase SMT aus einer Serincarboxypeptidase entstanden ist. Der Mechanismus der Peptidhydrolyse durch diese Enzyme liegt deshalb
wahrscheinlich auch der Katalyse durch die SMT zugrunde. Zahlreiche Transacylierungen, in
denen analog zur SMT die Aktivierung durch einen 1-O-ß-Acylglucoseester erfolgt, sind insbesondere aus dem phenolischen Stoffwechsel der Pflanzen bekannt. Zwei Enzyme, die ebenfalls
aus derartigen Peptidasen entstanden sind, wurden bislang noch an anderer Stelle im pflanzlichen Sekundärstoffwechsel gefunden, eine weitere Acyltransferase in Lycopersicon pennellii
(Wildtomate) und eine Hydroxynitril-Lyase in Sorghum bicolor (Mohrenhirse). Durch das Arabidopsis-Genomprojekt konnte außerdem eine große Anzahl von Genen und Proteinen mit
Ähnlichkeit zu dieser in Eukaryonten ubiquitären Familie von Peptidasen identifiziert werden.
Es ist daher anzunehmen, dass in Pflanzen und eventuell auch darüber hinaus weitere Enzyme
wie die SMT vorhanden sind, die aus diesen Peptidasen hervorgegangen sind, aber eine von
der Peptidhydrolyse abweichende Reaktion katalysieren und in anderen Stoffwechselwegen divergente biologische Funktionen erfüllen. Die SMT ist damit eines der aktuellen Beispiele, die
ein neues Licht werfen auf das katalytische Potential dieser Familie von Enzymen und die einen
Einblick bieten in diejenigen Prozesse, die der Evolution von Proteinen und Stoffwechselwegen
zugrunde liegen.