Masterarbeit

Masterarbeit
TALEN- and CRISPR-mediated generation of plant mlo mutants
Ausschreibung
Das Thema der Masterarbeit beschäftigt sich mit dem Aspekt der mlo-basierten Resistenz von Pflanzen
gegenüber Mehltau-Infektionen. Diese Art von Resistenz wurde vor mehr als 30 Jahren in Gerste
entdeckt und liegt in einer loss-of-function-Mutation des Gens mildew resistance-locus O (Mlo)
begründet. Da die mlo-basierte Resistenz komplette Resistenz gegen alle Mehltau-Isolate vermittelt,
stellt sie eine nützliche Methode zur Generierung resistenter Getreide- und Zierpflanzen dar.
Abb. 1: Mechanismus der Genom-Modifikation durch TALENs (Mahfouz and Li, GM crops, 2013)
Bis vor wenigen Jahren war die Einführung von Mutationen an einem bestimmten Locus in Pflanzen
schwierig und sehr zeitaufwändig. Inzwischen gibt es jedoch neue Werkzeuge mit denen sich gezielt
Modifikationen am Pflanzengenom vornehmen lassen, unter anderem die sogenannten TALENs
(transcription activator-like effector nuclease). TALENs bestehen aus zwei wichtigen Domänen, der TALEDomäne welche spezifisch DNA-Sequenzen bindet, und der N-Domäne, welche eine künstlich an die
TALE-Domäne angefügte FokI-Nuklease ist. Durch die TALE-Domäne wird die FokI-Nuklease an einen
bestimmten Locus der DNA lokalisiert und kann dort Doppelstrangbrüche (double-strand brakes, DSB) in
der genomischen DNA der Pflanze auslösen. Oft werden DSBs von der Pflanze statt mit akkurater
homologer Rekombination mithilfe des non-homologous end joining (NHEJ) repariert, einer Reparatur-
Methode die zwei Enden doppelsträngiger DNA miteinander verbindet und oft zu Insertions- oder
Deletions-Mutationen führt. Somit können gezielt Gene in der Pflanze mutiert werden. Ein anderes
Werkzeug das nach einem ähnlichen Mechanismus funktioniert sind die CRISPRs (clusters of regularly
interspaced short palindromic repeats); bei diesen Proteinen wird die Bindung einer bestimmten
Sequenz in der DNA über eine sogenannte komplementäre crRNA vermittelt.
Das Projekt der Masterarbeit soll beide Methoden der Genommodifikation umfassen. Zum einen
werden TALENs in verschiedenen Modell-Pflanzen (Gerste, N. benthamiana, Arabidopsis) getestet, um
sie später dazu zu verwenden Mlo-Gene in Gerste und Arabidopsis zu mutieren und diese Pflanzen
damit resistent gegen Mehltau-Infektionen zu machen. Danach werden diese Pflanzen mit
normalerweise virulentem Mehltau (Blumeria graminis f.sp. hordei für Gerste und Golovinomyces orontii
für Arabidopsis) infiziert um die TALEN-induzierte Resistenz zu verifizieren. Als zweite Methode zur MloMutierung sollen CRISPRs erstellt und getestet werden. Um die TALENs und CRISPRs zu testen, werden
für Gerste und Arabidopsis unterschiedliche Methoden verwendet: TALENs/CRISPRs sollen in Gerste
transient durch particle bombardment exprimiert werden und transgene Zellen werden anschließend
mikroskopisch analysiert; in Arabidopsis sollen die TALENs/CRISPRs stabil durch floral dip eingeführt und
die transgenen Pflanzen später mit Mehltau infiziert werden.
Von Master-Studenten die an der Masterarbeit interessiert sind wird neben Motivation und
Engagement erwartet das Erfahrung im Bereich der Molekularbiologie vorhanden ist. Wenn DU
interessiert bist melde dich bei mir (siehe unten) für eine detailliertere Beschreibung des Projekts.
Kontakt
Stefan Kusch
e-Mail:
[email protected]
Telefon: 0241 80 28130
Prof. Ralph Panstruga
e-Mail:
[email protected]
Telefon: 0241 80 26655
Institute for Biology I
Unit of Plant Molecular Cell Biology
Raum 42 A211
Raum 42 A213