Überlebensfähigkeit von kryokonservierten Mäuseembryonen nach
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Aus dem Institut für Tierzucht und Haustiergenetik der Georg-August-Universität Göttingen Überlebensfähigkeit von kryokonservierten Mäuseembryonen nach Zwischenlagerung bei -18°C oder -79°C Masterarbeit im Fachbereich Fortpflanzungsbiologie und Biotechnik vorgelegt von Stephanie Buhtz Göttingen im Juli 2007 1. Prüfer: Prof. Dr. W. Holtz 2. Prüfer: Prof. Dr. M. Gauly Tag des Kolloquiums: 26.07.2007 Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis .................................................................................. IV Tabellenverzeichnis......................................................................................... V Abkürzungen................................................................................................... VI Verwendete Chemikalien ............................................................................. VIII Verwendete Geräte und Verbrauchsmaterialen ............................................IX 1 Einleitung ....................................................................................................... 1 2 Literatur .......................................................................................................... 3 2.1 Grundlagen der Kryobiologie ........................................................................ 3 2.2 Prozesse beim Gefrieren................................................................................. 4 2.3 Physikalische und chemische Abläufe beim Einfrieren von Zellen .... 6 2.4 Kryoprotektiva - Aufgabe und Wirkung ...................................................... 8 2.4.1 Penetrierende Kryoprotektiva ................................................................ 9 2.4.1.1 Glycerol ............................................................................................... 11 2.4.1.2 Dimethylsulfoxid (DMSO) ............................................................... 12 2.4.1.3 Ethylenglycol (EG)............................................................................ 14 2.4.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva.................................................... 16 2.5 Gefrierverfahren .............................................................................................. 19 2.5.1 Standardgefrierverfahren ...................................................................... 20 2.5.2 Langsames Kryokonservieren ............................................................. 22 2.5.3 Schnelles Kryokonservieren................................................................. 23 2.5.4 Ultraschnelles Kryokonservieren ........................................................ 24 2.5.5 Vitrifikation ................................................................................................ 25 2.6 Auftauen ........................................................................................................ 27 2.7 Ausverdünnungsmethoden.......................................................................... 29 2.7.1 Schrittweises Ausverdünnen und Ausverdünnen mit nicht penetrierenden Kryoprotektiva .......................................................... 29 2.7.2 One-Step-Ausverdünnung..................................................................... 30 2.7.3 Direkte Ausverdünnung von Ethylenglycol...................................... 32 2.8 Kultivierung von Embryonen ....................................................................... 33 I 2.9 Beurteilungsmöglichkeiten für Embryonen............................................. 34 2.9.1 Morphologische Beurteilung ................................................................ 34 2.9.2 Beurteilung nach Fluoreszenzanfärbung mittels FDA................... 35 2.9.3 Beurteilung nach Fluoreszenzanfärbung durch Hoechst A 33342 .................................................................................... 36 3 Material und Methoden................................................................................ 37 3.1 Tiermaterial ....................................................................................................... 37 3.2 Haltungsbedingungen.................................................................................... 37 3.3 Medien ................................................................................................................ 38 3.3.1 Spülmedium .............................................................................................. 38 3.3.2 Kulturmedium ........................................................................................... 41 3.3.3 Kryoprotektivum ...................................................................................... 42 3.3.4 Auftaumedium .......................................................................................... 43 3.3.5 Überschichtungsöl für Kultivierung- und Waschdrops ................ 43 3.4 Behandlung der Embryonenspender......................................................... 44 3.5 Gewinnung der Embryonen.......................................................................... 46 3.6 Beurteilung der gewonnenen Embryonen................................................ 48 3.7 Einfrieren der Embryonen............................................................................. 49 3.7.1 Standartgefrierverfahren........................................................................ 50 3.7.1.1 Haake ................................................................................................... 50 3.7.1.2 Consartic............................................................................................. 51 3.8 Zwischenlagerung der eingefrorenen Embryonen ................................ 53 3.9 Auftauen der Embryonen .............................................................................. 54 3.10 In vitro Kultivierung der Embryonen ....................................................... 55 3.11 Beurteilung von Embryonen ...................................................................... 56 3.11.1 Morphologische Beurteilung .............................................................. 56 3.11.2 Kombinierte FDA-Hoechst-Färbung zur Zytoplasmaaktivitätsbestimmung und Kernzählung ................... 60 3.12 Geräte und Gerätekontrolle........................................................................ 62 3.13 Photographien ............................................................................................... 64 3.14 Statistische Auswertung............................................................................. 64 II 4 Ergebnisse ................................................................................................... 65 4.1 Superovulation................................................................................................. 65 4.2 Embryonengewinnung, -stadium und -qualität....................................... 65 4.3 Zwischenlagerung........................................................................................... 66 4.4 In vitro Kultivierung ........................................................................................ 67 4.5 Vitalfärbung mit FDA und Hoechst 33341 ................................................ 69 4.6 Einfluss der Abstammung der Mutterherkunft auf die Embryonenausbeute ............................................................................. 69 4.7 Einfluss der Abstammung der Mutter auf das Entwicklungsstadium nach 48 Stunden in vitro Kultivierung.............................................. 70 5 Diskussion.................................................................................................... 71 5.1 Superovulation................................................................................................. 72 5.2 Überleben und Weiterentwicklung unter in vitro Bedingungen ......... 75 5.3 Zwischenlagerungseinfluss auf die Weiterentwicklung der kryokonservierten Embryonen........................................................... 76 6 Zusammenfassung ...................................................................................... 79 7 Literaturverzeichnis..................................................................................... 81 Danksagung .................................................................................................. 109 Eidesstattliche Erklärung............................................................................. 110 III Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Abhängigkeit der Überlebensrate von der Kühlrate.............................. 23 Abb. 2: Werktisch mit integriertem Wärmebereich (Varolab, Giessen) und CO2 Kleininkubator C42 (Labotect) ...................................................... 43 Abb. 3: Ip-Injektion von eCG bzw. hCG ............................................................ 44 Abb. 4: Vaginal-Plaque: 1) positiv und 2) negativ am Morgen nach erfolgter Bedeckung............................................................................................ 45 Abb. 5: Zervikale Dislokation ............................................................................ 47 Abb. 6: Eröffnete Bauchhöhle ........................................................................... 47 Abb. 7: Einfriersystem Firma HAAKE, Berlin .................................................... 49 Abb. 8: Einfriersystem Firma CONSARTIC, Schöllkrippen ............................... 49 Abb. 9: Befüllungsschema Kunststoffpaillette................................................... 51 Abb. 10: Kunststoffpaillette mit Entwicklungsstadium, Spezies, Spültag und Stückzahl............................................................................................ 51 Abb. 11: Zwischenlagerung bei -79°C (li.) und -18°C (re.)................................ 54 Abb. 12: Waschschale mit fünf Medium-Waschdrops unter Öl......................... 55 Abb. 13: Kultivierungsschale mit 10 Kultivierungs-Mediumdrops unter Öl........ 56 Abb. 14: Inkubator C60, Labotect, Göttingen.................................................... 56 Abb. 15: Embryo a) "Sehr gut", b) "Gut", c) "Mäßig", d) degeneriert, e) retadiert.......................................................................................... 59 Abb. 16: a) Schlüpfende Blastovyste, b) Geschlüpfte Blastocyste.................... 60 Abb. 17: Aktives (a) bzw. inaktives (b) Zytoplasma - Feststellung mittels FDA 61 Abb. 18: Lebende und tote Kerne - Sichtbarmachung mittels Hoechst H 33342................................................................................ 61 Abb. 19: Arbeitsplatz mit Kleininkubator C42 (Easy Bench, Varolab, Giessen; C42, Labotect, Göttingen) .................................................................. 62 Abb. 20: Kleininkubator C42 (Labotect, Göttingen)........................................... 62 Abb. 21: Messgerät In Control 1051 (Labotect, Göttingen) (Quelle: Labotect, Göttingen) .......................................................................................... 63 Abb. 22: Verwendeter Zeiss Axio Observer A1 (Mitte) (Quelle: Zeiss, Göttingen) .................................................................. 64 IV Tabellenverzeichnis Tab. 1: Zusammensetzung Mäusealleinfutter................................................... 38 Tab. 2: Zusammensetzung der verwendeten Stammlösungen......................... 39 Tab. 3: Zusammensetzung des Spülmediums M2............................................ 40 Tab. 4: Zusammensetzung des Kulturmediums MediCult Universal IVF Medium .......................................................................................... 42 Tab. 5: Behandlungsschema zur Gewinnung von Mäuseembryonen............... 46 Tab. 6: Schema Gefrierprogramm .................................................................... 52 Tab. 7: Entwicklungsstadium und Verteilung gewonnener Eizellen und Embryonen ........................................................................................... 66 Tab. 8: Ergebnisse der in vitro Kultivierung von bei -18°C bzw. -79°C zwischengelagerten kryokonservierten Blastocysten.......................... 68 Tab. 9: Ergebnisse der in vitro Kultivierung von bei -18°C bzw. -79°C zwischengelagerten kryokonservierten Morulae .................................. 68 Tab. 10: Reaktion des Zytoplasmas auf die FDA-Färbung ............................... 69 Tab. 11: Embryonengewinnung aus MPI-Mäusen ............................................ 70 Tab. 12: Embryonengewinnung aus institutseigenen Mäusen ....................... 70 Tab. 13: Mutterherkunft Institutseigen ............................................................ 70 Tab. 14: Mutterherkunft MPI ............................................................................. 70 V Abkürzungen Bl. Blastocyste BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise ca. circa Deg. Degeneriert DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleic acid EBSS Earle´s Buffered Saltsolution eCG equine Chorionic Gonadotropin EG Ethylenglycol ER Entwicklungsrate et al. et altera Exp. Expandiert Exp. - Expandiert, mäßig Exp. ! Expandiert, sehr gut FDA Fluorescein-3`6`-diacetat g Gramm Geschl. Geschlüpft hCG human Chorionic Gonadotropin HSA humanes Serum Albumin IE Internationale Einheiten ip intraperitoneal kg Kilogramm LF Luftfeuchte LN2 flüssiger Stickstoff (-196°C) L! sehr aktiv L aktiv L- schwach aktiv M Mol mg Milligramm Mg Molekulargewicht ml Milliliter VI mm Millimeter Mo Morula mOsmol Auf Osmolalität (Osmol/l) o. Osmolarität (Osmol/kg) bezogene Einheit MPI Max Planck Institut PBS Phosphate Buffered Saline PG Propylenglycol PROH Propandiol PVA Polyvinylalkohol PVP Polyvinylpyrrolidon rel. relativ RT Raumtemperatur Schl. Schlüpfend SR Schlupfrate T tot TR Trächtigkeitsraten ÜR Überlebensrate UV Ultra violett VP Vaginal-Plaque VP+ Vaginal-Plaque positiv VP- Vaginal-Plaque negativ z.B. zum Beispiel µl Mikroliter VII Verwendete Chemikalien Aceton MERCK – Schuchardt, Hohenbrunn Alkohol SIGMA-ALDRICH, Steinheim eCG Intergonan; Intervet, Unterschleißheim Ethylenglycol SIGMA-ALDRICH, Steinheim FDA FDA-Färbung (3,6-Diacetoxyfluoran); SIGMA-ALDRICH, Steinheim Fermacidal® D IC Products SA, CH-Minusio; Vertrieb Labotect, Göttingen hCG Ekluton; Intervet, Unterschleißheim HEPES HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinthansulfonsäure Hoechst A 33342 B2261-25MG; bisbenzimid; SIGMA-ALDRICH, Steinheim Kulturmedium Universal IVF Medium mit Phenolrot, 60 ml; MediCult a/s, DK-Jyllinge M2 eigene Herstellung Mineralöl Mineral oil; SIGMA-ALDRICH, Steinheim Reinstwasser Ampuwa®, Fresenius, Bad Homburg Saccharose Sucrose, S9378; SIGMA-ALDRICH, Steinheim Stickstoff flüssiger Stickstoff (LN2) Vaselin Weißes Vaselin Lichtenstein DAB; Lichtenstein Pharmazeutica GmbH & Co., Mülheim-Kärlich VIII Verwendete Geräte und Verbrauchsmaterialen Brutschrank C60 Labotect, Göttingen Brutschrank CO2 Kleininkubator C42 Labotect, Göttingen Center-Well Schale (60×15mm) Falcon, Heidelberg Digital-pH-Meter pH 525 WTW, Weilheim i.OB Einfriersystem Consartic BV 65/55 Consartic, Schöllkrippen Einfriersystem Haake Kryosta, Typ F-3Q mit Haake, Berlin Programmgeber Typ PG 20 Einmalfilter Filtropur S (0,2 µm) Sarstedt, Nümbrecht Eppendorfgefäß (1 ml) Eppendorf, Hamburg Falcon-Röhrchen (50 ml) Sarstedt, Nümbrecht Feinwaage 2007 MP6 Sartorius, Göttingen Gefrierpailletten 0,25 ml Kunststoffpailletten Minitüb, Landshut Kanüle (0,3×1,0 cm, 2R2) Unimed, CH-Lausanne Kleenex KIMTECH Science, KimberleyClark ® Professional Luer-Einwegspritze (1 ml/2 ml) B-D Plastipak®, Becton Dickinson, Irland Magnetrührer Heidolph, Schwabach Mäusealleinfutter ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest Maus-Polycarbonatkäfig (Typ II: 17×23×14 Ebeco, Castrop-Rauxel cm /Typ III: 23×39×15 cm) Messelektrode WTW pH-Elektrode SenTix WTW, Weilheim i. OB 60 Messgerät In Control 1050 Labotect, Göttingen Mikroskop Axio Observer A1 ZeissMicroImaging GmbH, Göttingen Mikroskop Axioskop (mit Filtersatz 02 u. 09) Zeiss, Göttingen Mikroskop Stereomikroskop SZ 11 Olympus, Hamburg IX Mikroskop Stereomikroskop M8 Wild, Heerebrugg, Wetzlar Parafilm American National Can TM, Greenwich Petrischale (35×10mm) Greiner, Frickenhausen Petrischale (85×15mm) Greiner, Frickenhausen Software Octax EyeWare™ Imaging Soft- Octax, Herborn-MTG Altendorf ware Sterilisator U 50 Memmert, Schwabach Trockenschrank BE 40 Memmert, Schwabach Versiegelungskitt Hämatokrit Brandt, Wertheim Wärmeplatte HT 200 Minitüb, Landshut Wärmeplatte MEDAX SP14 MEDAX Nagel GmbH, Kiel Wärmeschrank Typ 85 Melag Brutschrank Incubat, Berlin Mikrobiologische Sicherheitswerkbank Typ Steag Laminarflow-Prozeß- MRF technik, Pfullingen Werktisch Easy Bench Varolab, Giessen X 1 Einleitung Die Kryokonservierung von Embryonen wird bei einigen Säugern bereits praktiziert und hat schon seit langem in der praktischen Rinderzucht Einzug gehalten. Eine Voraussetzung für eine konventionelle Anwendung der Kryokonservierung ist, dass die Zellen den Einfrierprozess ohne Folgeschäden überstehen. Nur dann kann die Tiefgefrierkonservierung innerhalb der Technik weitere Bedeutung erlangen. Erste erfolgreiche Kryokonservierungsversuche konnten 1972 von WHITTINGHAM, LEIBO und MAZUR für die Maus beschrieben werden. Die Maus wird häufig, wie auch im Falle der Kryotechnik, als Modell verwendet, da die Gewinnung von Embryonen größerer landwirtschaftlicher Nutztiere einen wesentlich größeren Kosten- und Apparateaufwand verursacht. Unter Berücksichtigung einiger spezies-spezifischer Modifikationen, können die bei der Maus gewonnenen Erkenntnisse auf die größeren landwirtschaftlichen Nutztiere übertragen werden. Die Verwendung flüssigen Stickstoffs ist bisher eine übliche Methode, um tiefgekühlte Zellen zu lagern oder auch zu transportieren. Da aber der Transport von Behältern mit flüssigem Stickstoff (LN2) den Vorschriften und gesetzlichen Gegebenheiten für Gefahrguttransporte unterliegt, wäre es speziell für diesen Bereich eine Vereinfachung, könnten in LN2 konservierte Zellen auch bei weniger niedrigen Temperaturen gelagert werden, ohne dass es dabei zu einer Verringerung der Überlebensraten käme. Der überregionale Transport von Gameten und Embryonen könnte somit sehr vereinfacht werden, ohne dass die Kosten für diese Transporte Ausmaße annehmen, die die Ökonomie eines Embryotransfers in Frage stellen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss einer 1-stündigen Zwischenlagerung bei unterschiedlichen Temperaturen deutlich über -196°C (flüssiger Stickstoff), in Bezug auf die in vitro Überlebens- und Weiterentwicklungsrate zu ermitteln. Versuche zu diesem Thema wurden zwar bereits 1973 durch MAURER & BANK und 1977 durch MAURER et al. durchgeführt. Laut Literaturrecherche wurde dieses Thema aber erst 2002 wieder durch MATAR aufgegriffen. Im Un1 terschied zu der Arbeit von MATAR, wurde in dieser Arbeit sowohl auf ein Refreezing der zwischengelagerten Embryonen als auch auf einen Transfer der aufgetauten Embryonen auf Empfängertiere verzichtet, da zunächst geklärt werden sollte, ob die Embryonen generell in der Lage sind eine Zwischenlagerung bei Temperaturen von -18°C oder -79°C zu überstehen. 2 2 Literatur 2.1 Grundlagen der Kryobiologie Der Begriff Kryo stammt ursprünglich aus dem Griechischen. Dort bedeutet kryos soviel wie Kälte, Eis. Heutzutage versteht man unter Kryokonservierung die Lagerung von Zellen und Geweben in einem Temperaturbereich von unter -130°C mit dem Ziel, eine möglichst vollständige Erhaltung der ursprünglichen Ausgangseigenschaften des konservierten biologischen Materials zu erreichen. Ein besonderes Augenmerk liegt hier auf der Erhaltung der Lebensfähigkeit des Materials (SCHEIWE & RAU, 1981). Die Herunterkühlung auf sehr tiefe Temperaturen geschieht in der Regel durch die Verwendung von flüssigem Stickstoff (LN2). Der Einsatz flüssigen Stickstoffs wurde durch die Entdeckung der Verflüssigung von Gasen ermöglicht. Das Bemerkenswerte an dem Prozeß der Kryokonservierung ist, dass die Vitalität der Zellen erhalten bleibt, obwohl das ganze biologische System der Zellen in einen Festkörperzustand übergeht. Dadurch kommt der Zellstoffwechsel vollständig zum Stillstand und die biochemischen Abläufe werden unterbrochen. Bisher ist die Kryokonservierung die einzige Möglichkeit, tierische, pflanzliche und menschliche Zellen und Zellverbände über eine beinahe unbegrenzte Zeitdauer in lebensfähiger Form einzulagern und dann zu gegebenem Zeitpunkt wieder zu reanimieren. Von ersten erfolgreichen Versuchen zur Kryokonservierung von Embryonen berichteten WHITTINGHAM et al. (1972) sowie WILMUT (1972). Die einzige bisher bekannte Gefahr für korrekt kryokonservierte Zellen sind Strahlungsschäden an der DNS durch kosmische Strahlung. Da dieser Schädigungsprozess aber erst nach vielen tausend Jahren eine Schädigung bewirken würde, ist er als nicht unbedingt relevant anzusehen (ASHWOOD-SMITH & FRIEDMANN, 1979; MAZUR, 1980; LYON et al., 1981; GLENISTER et al., 1984). Für eine längere Lagerungsdauer werden die zu lagernden Zellen in Stahlbehältern aufbewahrt. Diese sind nach dem Dewar-Prinzip konstruiert, bei dem zwei Behälter unter einem so gering wie möglich gehaltenem Abstand ineinander montiert und durch einen Vakuumbereich voneinander isoliert werden. Sol3 len die Stahlbehälter zur Lagerung verwendet werden, muss der innere Behälter mindestens zu einem Viertel mit flüssigem Stickstoff gefüllt sein. Die Proben werden dann in speziellen Metall- oder Plastikeinsätzen in der kalten Gasphase gehalten bzw., wenn sie festverschlossen sind, in die flüssige Kühlphase eingetaucht. Die auf diese Weise konservierten Proben können Jahre, Jahrzehnte und unter Umständen auch Jahrhunderte lang ohne Einschränkung ihrer Vitalität überstehen. 2.2 Prozesse beim Gefrieren Das Vermögen eines Körpers zur Abkühlung wird durch physikalische Parameter wie zum Beispiel die Fähigkeit zur Wärmeleitung, die Geometrie und auch die Körpergröße beeinflusst. Dadurch ergibt sich eine zellspezifische Definition der Abkühlrate. Eine Kryokonservierung lebender Zellen ohne Kryoprotektiva und ohne, dass die Zellen Schaden nehmen, ist bisher noch nicht möglich. Durch die Fähigkeit der Zellen zur Wärmeleitung und die Diffusionsmöglichkeit der Kryoprotektiva in die Zellen ergeben sich ganz spezielle Temperaturverläufe während des Einfrierens. Während des dynamischen Gefrierprozesses kommt es zwischen dem Intraund Extrazellulärraum der Zellen zu einer Reihe von biophysikalischen Reaktionen. Diese Abläufe werden hauptsächlich von den Membraneigenschaften der zu konservierenden Zellen und von den Veränderungen der Temperatur in Abhängigkeit von der Zeit beeinflusst (SCHWARTZ & DILLER, 1983). Von großer Bedeutung für die Zellen sind die während der Tiefgefrierung ablaufenden Konzentrationsveränderungen der umgebenden Medien und die mechanischen Änderungen in den Zellstrukturen, die durch sich bildende Eiskristalle entstehen (HOBBS, 1974). Eine bedeutende Rolle spielt dabei die Größe der sich bildenden Eiskristalle. Diese wird vor allem durch die Abkühlrate beeinflusst (MAZUR et al., 1974; MAZUR, 1977). Werden flüssige Lösungen mit einer schnellen Abkühlrate eingefroren, kommt es infolge einer unvollständigen Wärmeabfuhr zu einer spontanen Bildung kleiner Eiskristalle. Bei einer langsa4 men Abkühlung hingegen kann die Wärme vollständig abgeführt werden und es entstehen größere Kristalle (MAZUR et al., 1974; DILLER, 1975; FARRANT et al., 1977). Trotz einer abgeschlossenen Kristallisation ist es aber biophysikalisch dennoch möglich, dass kleine Eiskristalle durch Zusammenlagerungen zu größeren Kristallen verschmelzen, ihr Energiepotential erhöhen und durch sogenannte thermische Stöße ihre Position in der Zelle ändern (MAZUR, 1966; LUYET & RAPATZ, 1970; MAZUR, 1977; RALL & POLGE, 1984; MEYBERG, 2007). Ganz allgemein lässt sich der Prozess des Einfrierens in fünf verschiedene Abschnitte unterteilen: 1. Equilibrierungsphase: Die Embryonen werden in der Gefrierschutzlösung equilibriert. 2. Abkühlungsphase: Sie beginnt bei der Körpertemperatur der Zellen und endet mit Erreichen der gewählten Lagerungstemperatur. Es müssen dabei definierte Einfrierraten (°C pro Minute) des jeweiligen Gefriergutes eingehalten werden. 3. Lagerungsphase: Hier werden die Zellen bei mindestens -130°C, in der Regel aber bei -196°C aufbewahrt. 4. Auftau- und Wiedererwärmungsphase: In diese Phase werden die Zellen von der Lagerungstemperatur wieder auf Körpertemperatur erwärmt. Die dabei gewählte Auftaurate ist von der zuvor verwendeten Einfrierrate abhängig. 5. Ausverdünnungsphase: In dieser letzten Phase müssen die verwendeten Kryoprotektiva wieder möglichst vollständig und schnell von den Zellen entfernt werden, da nur dann eine ungestörte Weiterentwicklung im Anschluss an das Auftauen möglich ist (WILLADSEN et al., 1978; RALL et al., 1984). 5 2.3 Physikalische und chemische Abläufe beim Einfrieren von Zellen Ganz ähnlich der fünf verschiedenen Prozessphasen beim Einfrieren, können auch die intra- und extrazellulär ablaufenden Vorgänge während des Einfrierens in sechs Schritte eingeteilt werden: 1. Im Bereich zwischen 37°C und 20°C befindet sich die Zelle in einem physiologischen Bereich und die intra- und extrazellulären Prozesse laufen aufeinander abgestimmt ab. 2. In der Temperaturzone von 20° bis -2°C ist der Stoffwechsel der Zelle bereits stark eingeschränkt. Alle Vorgänge in den Zellen laufen deutlich langsamer ab oder werden sogar gänzlich gestoppt. Aus dem Grunde ist dieser Temperaturbereich von so großer Bedeutung in der Vorbereitung der Zelle zum eigentlichen Einfrieren. 3. Die Temperaturen sinken von -2° auf -15°C ab. Die einsetzende Eisbildung beginnt meistens an Kristallisationskeimen in der extrazellulären Lösung. Die Temperatur, bei der die Kristallisation einsetzt, wird durch die chemische Zusammensetzung der verwendeten Kryoprotektivumslösung festgelegt (MAZUR, 1977; LEIBO & MAZUR, 1978). Als Folge des osmotischen Effektes wird Wasser aus der Zelle herausgezogen. Dadurch dehydriert die Zelle und beginnt zu schrumpfen. Dieses Schrumpfen ist möglich, da ca. 90% des Wassers der Blastomeren in ungebundener Form vorliegt (MAZUR, 1963; MERYMAN et al., 1984). Der Embryo ist in der Lage, bis auf etwa 40% seines ursprünglichen isotonischen Ausgangsvolumens zu schrumpfen, ohne dass er dabei Schäden erleidet (SCHNEIDER & MAZUR, 1984). Durch Auswahl möglichst optimaler Abkühlraten kann den Prozess der intrazellulären Eiskristallbildung optimiert werden. Die Raten sollen langsam genug sein, um eine ausreichenden Dehydrierung zu ermöglichen und schnell genug um die Zellen nicht unnötig den Lösungseffekten der Kryoprotektiva auszusetzen. 4. Es erfolgt ein weiteres Absinken der Temperaturen im Bereich von -15° auf -25°C. In diesem Temperaturbereich setzt auch die intrazelluläre Eisbildung ein. Dabei kommt es zu einer Entmischung und Dislokalisation der Bestandteile des Zytoplasmas. Durch Zugabe von Kryoprotektiva 6 kann die Wasserstruktur dahingehend beeinflusst werden, dass statt einiger großer, viele kleine Eiskristalle gebildet werden, die etwas weniger schädlich für die Zelle sind. Die zunehmende Eiskristallbildung führt zu einer Konzentrationserhöhung gelöster Stoffe in der restlichen Flüssigkeit. Das hat zur Folge, dass der Gefrierpunkt der verbleibenden Flüssigkeit kontinuierlich sinkt (SCHIEWE et al., 1987). 5. Die Temperatur bewegt sich von -25° auf -130°C. Dieser Bereich ist gekennzeichnet durch ein migratorisches Wachstum der großen Eiskristalle auf Kosten der kleineren. Der Vorgang der Umkristallisation läuft zwar mit den stetig geringer werdenden Temperaturen immer langsamer ab, trotzdem hat der Prozess immense Auswirkungen auf die Zelle. Die Beweglichkeit kleinerer Eiskristalle und die damit verbundene Dynamik innerhalb der Zelle führt zu einer Erhöhung des Energiepotentials der Kristalle (Thermische Stösse) und verursacht demzufolge, dass Wassermoleküle immer noch in der Lage sind ihre Positionen wechseln. Das hat wiederum zur Folge, dass bereits vorhandene, größere Eisbezirke weiter wachsen und so zu einer Schädigung der Zellen führen können. Dies ist einer der Gründe warum man kryokonservierte Proben auch nicht über eine längere Zeit bei -80°C aufbewahren und diesen Temperaturbereich möglichst schnell 6. In überwinden diesem letzten sollte. Schritt kommen bei Temperaturwerten von unter 130°C alle Vorgänge fast vollständig zum Stillstand. Das ist der Grund, weshalb heute Langzeiteinlagerungen von lebenden Proben bei mindestens -130°C unter Verwendung von LN2 als Kühlmittel üblich sind. Während des Auftauvorganges laufen all diese Prozesse abermals ab, allerdings in umgekehrter Weise. Für die Zellen bedeutet dieser Umstand eine erneute enorme Belastung und zusätzlichen Stress. Bis heute ist es, trotz der großen Fortschritte auf dem Sektor der Kryoforschung, noch immer nicht möglich, jede Art von Zellen mittels Kryokonservierung haltbar zu machen. 7 2.4 Kryoprotektiva - Aufgabe und Wirkung Um ein Überleben der eingefrorenen Zellen zu erreichen, ist das Vorhandensein von Gefrierschutzmitteln (Kryoprotektiva) von entscheidender Bedeutung. Die Gefrierschutzmittel werden in penetrierende, in die Zelle hineingelangende, und nicht penetrierende, im extrazellulären Raum verbleibende (DOEBBLER, 1966; MERYMAN, 1971; McGANN, 1978; LEIBO, 1981) unterteilt. Trotz intensiver Forschung besteht noch keine ganz gesicherte, genaue Information über die Wirkungsweise der Kryoprotektiva (FAHY, 1986) Es sind allerdings einige Schutzmechanismen und -wirkungen in der Diskussion. Als relativ wahrscheinlich sind die im Folgenden kurz genannten Wirkungen und Mechanismen anzunehmen. Durch den Einsatz von Kryoprotektiva wird eine Verringerung der Temperatur erreicht, bei der die intrazelluläre Eisbildung einsetzt. Außerdem scheinen sie die Zellmembranen zu stabilisieren, indem sie Schäden durch intrazelluläre Kristallbildung sowie Lösungseffekte vermindern (NIEMANN, 1983). SMITH et al. (1951) vermuteten, dass eine Zugabe von Gefrierschutzmitteln dazu führt, dass vermehrt kleine und weniger große, schädigende Eiskristalle gebildet werden. Durch die Wasserbindungsfähigkeit der Kryoprotektiva wird analog der osmolytischen Gegebenheiten eine Verdünnung der Elektrolytkonzentration in der extrazellulären Flüssigkeit erreicht (MAZUR, 1970; FARRANT & MORRIS, 1973), die eine verlangsamte Dehydrierung der Zellen zur Folge hat. Das bedeutet, dass Zellschäden verursachende Vorgänge langsamer ablaufen und extra- und intrazelluläre Ionenkonzentrationen erst ab deutlich tieferen Temperaturen, und damit zu einem für die Zellen weniger kritischen Zeitpunkt, auf schädigende Werte ansteigen (LOVELOCK, 1954; LEIBO, 1977; MERYMAN et al., 1977; LEIBO & MAZUR, 1978; LEHN-JENSEN, 1981; FRIEDLER et al., 1988). WHITTINGHAM konstatierte 1980, dass Kryoprotektiva zwar die Bildung intrazellulären Eises in den Zellen nicht vollständig verhindern, wohl aber schädigende Effekte, verursacht durch zu hohe Ionenkonzentrationen, mildern können. Im Vergleich zu Medien, die keine Kryoprotektiva enthalten, bewirken die penetrierenden und nicht penetrierenden Inhaltsstoffe der Kryoprotektiva während 8 der Konservierungsabläufe, dass es in Lösungen mit Gefrierschutzmittelzugabe zu weniger Zellmembranveränderungen kommt (FARRANT & MORRIS, 1973). Für die verwendeten Kryoprotektiva ist es elementar, dass sie weder während der Abkühlungs- noch während der Auftauphase toxische Wirkungen auf die Zellen ausüben (FARRANT, 1965). FRIEDLER et al. (1988) plädierten trotzdem dafür, die Kryoprotektiva im Anschluss an das Auftauen schnellstmöglich aus den Zellen zu entfernen, da sie bei zu langem Verbleib in den aufgetauten Zellen eine Schädigung bewirken können. Als erstes geeignetes Gefrierschutzmittel für eine Tiefgefrierung von lebenden Zellen und Geweben beschrieben POLGE et al. 1949 den Wirkstoff Glycerin. LOVELOCK & BISHOP entdeckten 1959 Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kryoprotektivum, welches aber heutzutage wegen seiner, im Vergleich mit anderen Kryoprotektiva, erhöhten Zelltoxizität weniger Verwendung findet. Seit dieser Zeit wurden diverse Substanzen auf ihre Eignung als Kryoprotektivum untersucht. So zum Beispiel ein- und mehrfache Alkohole, Amide, Dextrane, Mono- und Disaccharide, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyvinylalkohol (PVA) und Serumproteine. Von diesen Stoffen haben sich allerdings nur wenige als praxistauglich erwiesen. Die den Gefrierschutzmedien zugesetzten Serumproteine sorgen für einen zusätzlichen Membranschutz der konservierten Zellen, scheinen aber weiter keine direkten Schutzmechanismen zu erfüllen (FARRANT, 1981). 2.4.1 Penetrierende Kryoprotektiva Das Kennzeichen penetrierender Gefrierschutzmittel ist das Vermögen, auf Grund eines geringen Molekulargewichtes, durch die Zellmembranen in die Zellen hineinzugelangen (MERYMAN, 1971; LEIBO, 1988). Penetrierende Gefrierschutzmittel verhindern eine extreme intrazelluläre Eisbildung und werden deshalb auch in sehr hohen Konzentrationen von ein bis vier Mol verwendet. Gerade bei diesen Konzentrationshöhen sollten sie möglichst keine toxischen Auswirkungen auf die Zelle haben. 9 Die penetrierenden Kryoprotektiva müssen die Zellmembran durchdringen, um eine osmotische Dehydrierung mit daraus resultierender hoher Elektrolytkonzentration im Inneren der Zelle zu verhindern (MERYMAN, 1971). Nach Zugabe der Gefrierschutzsubstanzen besteht zunächst eine Osmolaritätsdifferenz zwischen der extra- und der intrazellulären Lösung. Durch das Kryoprotektivum erhöht sich die Osmolarität in der extrazellulären Lösung. Um dieses auszugleichen beginnt der Embryo zu schrumpfen. Dies geschieht so lange, bis die Rate des Ausströmens von Wasser der Rate des Einströmens von Kryoprotektivum in den intrazellulären Raum entspricht und so ein Konzentrationsausgleich erreicht wird. Das Ausmaß der anfänglichen Schrumpfung des Embryos steht in Beziehung zur Permeabilität der Zellmembran. Je stärker eine Penetration möglich ist, desto geringer ist die Schrumpfung, da mit dem Gefrierschutzmittel zugleich auch Wasser aufgenommen wird. Beim Schrumpfungsprozess ist es den Zellen möglich, bis auf etwa ein Drittel ihrer Ausgangsgröße zu schrumpfen ohne bleibende Schäden zu erleiden (SCHNEIDER & MAZUR, 1984; LEIBO, 1989). Durch das Wasserbindungsvermögen der penetrierenden Kryoprotektiva wird eine zu starke Dehydrierung der Zellen verhindert. In welchem Umfang ein Gefrierschutzmittel in die Zellen gelangt und auch die Zeitspanne bis zur abgeschlossenen Equilibrierung, ist von verschiedenen Faktoren abhängig. Zu diesen Faktoren gehören die Temperatur bei der die Equilibrierung stattfindet, der Permeabilitätskoeffizient des Kryoprotektivums, der Unterschied zwischen extra- und intrazellulärer Konzentration und die Beschaffenheit der Zelloberfläche. Außerdem besitzt jede Spezies und jedes Embryonalstadium ganz eigene, individuelle Charakteristika bezüglich der Permeabilität (MAZUR, 1977; SCHNEIDER & MAZUR, 1984; FRIEDLER et al., 1988; PEDRO et al., 2005). Die Temperatur hat einen entscheidenden Einfluss auf die Geschwindigkeit der Equilibrierung, da diese bei höheren Temperaturen schneller abläuft als bei niedrigeren. In der Praxis hat sich eine Equilibrierung bei 20°C bis 25°C Raumtemperatur etabliert. Es wird auch vermutet, dass penetrierende Kryoprotektiva bewirken, dass die intra- und extrazelluläre Ionenkonzentration der noch ungefrorenen Restflüssigkeit sich verringert und somit der Gefrierpunkt der intrazellulären Flüssigkeiten sinkt (LOVELOCK, 1954; LEIBO, 1977; MERYMAN et al., 1977; LEIBO & MA10 ZUR, 1978; MAZUR, 1980). Das hat zur Folge, dass unter Verwendung von Kryoprotektiva zum Beispiel bei Mäuseblastomeren erst ab -35°C bis -45°C ein Gefrieren der Intrazellularflüssigkeit eintritt (LEIBO et al., 1977). Als penetrierende Kryoprotektiva finden Stoffe wie Glycerol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethylenglycol (EG), Propandiol (PROH), Ethanol und andere Alkohole Verwendung. DMSO wird nach neueren Erkenntnissen weniger stark verwendet als noch vor einigen Jahren, da es eine ausgesprochen hohe Toxizität besitzt. 1983 berichteten RALL et al. von sehr guten Ergebnissen bei der Kryokonservierung von Mäuseembryonen unter der Verwendung des Alkohols Methanol. Auch andere höherwertige Alkohole wie Ethylenglycol (EG) und Propylenglycol (PG) wurden in der Folgezeit auf ihre Embryonenverträglichkeit getestet. Es zeigte sich sowohl eine gute kryoprotektive Wirkung auf die tierischen Kaninchen- und Mausembryonen als auch auf humane Embryonen (KASAI et al., 1981; MIYAMOTO & ISHIBASHI, 1981, 1983a; NGUYEN et al., 1983; RALL & POLGE, 1984; RENARD et al., 1984; RENARD & BABINET, 1984; TESTART et al., 1985). In der Rinderzucht wird heutzutage bei der Kryokonservierung sehr häufig Ethylenglycol eingesetzt, da dessen Toxizität so gering ist, dass es möglich ist, kryokonservierte Embryonen auch ohne vorherige Ausverdünnung zu übertragen. 2.4.1.1 Glycerol Glycerol als Kryoprotektivum wurde erstmals 1949 von POLGE et al. als Gefrierschutzmittel für eine Kryokonservierung von Geflügelsperma erwähnt. Seit diesem Zeitpunkt ist die Eigenschaft, Toxizität und Dosierung von Glycerol fortlaufend erforscht worden. Bereits 1971 vermerkte MERYMAN, dass Glycerol im Gegensatz zu DMSO im Zellinneren kaum toxische Wirkung hat. BILTON untersuchte 1980 den Einfluss von Glycerol und DMSO auf Rinderembryonen. Es wurden dabei allerdings keine signifikanten Unterschiede festgestellt. In weiteren Versuchen zu der optimalen Konzentrationshöhe stellte sich heraus, dass Glycerol in den Konzentrationen von 1,3 M bis 1,4 M DMSO mit einer Konzentration von 1,3 M bis 1,5 M bei konventionellen Kryokonservierungsverfahren gegenüber im Vorteil ist. Zu die11 sem Schlüssen kamen FALGE et al. (1982), RALL & POLGE (1984), TAKEDA et al. (1987) nach Versuchen mit Mäuseembryonen sowie BOUYSSON & CHUPIN (1982) und PRATHER et al. (1987) nach Versuchen mit Rinderembryonen. RALL & POLGE (1984) begründeten ihre Ergebnisse mit der Aussage, dass DMSO-Lösungen eine geringere Viskosität aufwiesen als GlycerolLösungen. Kommt Glycerol in konventionellen Gefrierverfahren zum Einsatz, wird häufig eine Konzentration von ein bis zwei Mol gewählt. 1983 untersuchten MERRY et al. die Auswirkungen von verschiedenen Glycerol-Konzentrationen auf die in vitro-Entwicklungsraten (ER) nach einer Kryokonservierung und einem schrittweisen Auftauen. Die verwendeten Konzentrationen (1,0 M, 1,4 M, 1,8 M) führten bei den ermittelten in vitro-ER der Embryonen (49%, 44%, 52%) allerdings nicht zu signifikanten Unterschieden. Auch für anderen Tierrassen wurden Versuche zur Höhe der Gefrierschutzmittel-Konzentration durchgeführt. So führten Versuche an Rinderembryonen mit unterschiedlichen Glycerol-Konzentrationen durch KENNEDY et al. 1983 zu keinen eindeutigen Unterschieden. Zu ähnliche Ergebnisse kam LEHNJENSEN (1986), als er Glycerol in den Konzentrationen 0,5 M, 1,0 M und 1,4 M einsetzte. Bei 1,0 M und 1,4 Mol kam es zu keinen signifikanten Unterschieden. Allerdings stellte er bei 0,5 M fest, dass diese Konzentration als nicht ausreichend für einen sicheren Kryoschutz anzusehen ist. An Schafembryonen testeten WARE & BOLAND 1987 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen auf erfolgreiches Kryokonservieren und Auftauen im Zusammenhang mit Saccharose. Dabei stellen sie fest, dass sich eine Konzentration von 2,8 M Glycerol immer toxisch auswirkt; unabhängig davon in welcher Geschwindigkeit das Ausverdünnen mit Saccharose erfolgte. Bei den ultraschnellen Gefrierverfahren kommt Glycerol in multimolarer Konzentration und bei der Vitrifikation in Kombination mit weiteren Kryoprotektiva zum Einsatz. 2.4.1.2 Dimethylsulfoxid (DMSO) LOVELOCK & BISHOP waren 1959 die ersten, die die kryoprotektiven Eigenschaften von DMSO bei der Gefrierkonservierung von Zellen beschrieben. 1972 12 gelang es WHITTINGHAM et al. erstmals eine erfolgreiche Kryokonservierung von Mäuseembryonen durchzuführen. Dabei schien es, dass DMSO Glycerol in seinen protektiven Eigenschaften überlegen sei. In den folgenden Jahren gelang es, weitere Spezies unter Verwendung von DMSO erfolgreich tiefzugefrieren. BANK & MAURER (1974) sowie MAURER & HASEMAN (1976) berichteten von positiven Ergebnissen bei der Kryokonservierung von Kaninchenembryonen. WILLADSEN et al. (1978) und BILTON (1980) froren erfolgreich Rinderembryonen ein und TROUNSON & MOHR gelang 1983 die Konservierung von Humanembryonen. Glycerol und DMSO sind auf Grund ihres molekularen Aufbaus in der Lage, Zellen schneller zu penetrieren als Wasser. Im direkten Vergleich zwischen Glycerol und DMSO ist DMSO jedoch noch deutlich schneller (TROUNSON & MOHR, 1983; AGCA et al., 1997). 1971 stellte MERYMAN fest, dass DMSO die Fähigkeit besitzt, vollständig in die Zelle einzudringen. Laut MIYAMOTO et al. (1998) ist die vollständige Penetration elementare Voraussetzung für einen wirksamen Schutz, da ein Vorhandensein von DMSO allein in der extrazellulären Lösung nicht ausreicht, um eine sichere Kryokonservierung zu gewährleisten. Verschiedene Versuche zur nötigen Konzentrationshöhe von DMSO führten LEIBO & MAZUR 1978 zu der Feststellung, dass eine Verwendung von 1 M DMSO keinen sicheren Schutz bietet. BANK & MAURER (1974), FORGRAVE et al. (1977) und WILLADSEN (1980) kamen in ihren Versuchen an unterschiedlichen Spezies zu dem Schluss, dass DMSO in konventionellen Gefrierverfahren erst ab einer Konzentration von 1,5 M eine ausreichende Schutzwirkung hat. LEHN-JENSEN stellte 1980 durch Messungen an pH-Wert und Osmolarität fest, dass DMSO in Konzentrationen, wie sie beim Kryokonservieren zur Verwendung kommen, deutlich größere pH-Wert Veränderungen und wesentlich größeren osmotischen Stress für die Zellen hervorruft als es bei Glycerol der Fall ist. Dadurch erklärt sich auch die höhere Toxizität von DMSO im Vergleich zu Glycerol (FRIEDLER et al., 1988). Allerdings besitzt DMSO eine gute Bereitschaft zu Glasbildung (FRIEDLER et al., 1988; VALDEZ et al., 1992). und wird aus diesem Grunde häufig als Be- 13 standteil für Vitrifikationslösungen genutzt (ISHIMORI et al., 1992, 1993; VINCENTE & GARCIA-XIMENEZ, 1994). 2.4.1.3 Ethylenglycol (EG) Im Vergleich zu Glycerol (Mg 91,1), DMSO (Mg 78,1) und Propandiol (Mg 76,1) besitzt Ethylenglycol mit 62,1 ein geringeres Molekulargewicht (Mg). Aus diesem Grunde ist es in der Lage, schneller in die Zelle hinein und wieder heraus zu diffundieren, als es den anderen penetrierenden Kryoprotektiva möglich ist. Besonders bei höheren Konzentrationen stellen das erhöhte Permeabilitätsvermögen und die sich so ergebende verringerte Toxizität, verglichen mit anderen Kryoprotektiva, bedeutende Vorteile dar (MAHMOUDZADEH et al. 1993; CSEH et al. 1997). Dass EG eine kryoprotektive Wirkung besitzt, konnten MIYAMOTO & ISHIBASHI 1977 erstmalig anhand kontrollierter Kryokonservierungsversuche an Ratten- und 8-Zell-Mäuseembryonen zeigen. In diversen weiteren Versuchen wurden Unterschiede auf die Überlebensraten (ÜR) von Rinder- und Schafembryonen bei Verwendung von EG oder Glycerol als Gefrierschutzmittel bei konventioneller Kryokonservierung untersucht. Dabei stellte man fest, dass EG im Vergleich zu Glycerol gleiche oder sogar bessere Überlebensraten erzielte (COCERO et al. 1988; LANGE 1995; KLING 1997; BEAL et al. 1998). Bei Versuchen zur Ermittlung verträglicher und wirkungsvoller EG- Konzentrationen verwendeten VOELKEL & HU (1992a; 1992b) Rinderembryonen in den Stadien Morula bis expandierte Blastocyste bei Ethylenglycolkonzentrationen zwischen 1,0 M bis 2,0 M. Dabei stellten sie fest, dass eine Ethylenglycolkonzentration in Höhe von 1,5 M am besten geeignet war. 1999 equilibrierten SOMMERFELD & NIEMANN in vitro-produzierte Tag 7Rinderblastozysten 10 min in Ethylenglycollösungen bei Konzentrationen in Höhe von 1,8 bis 8,9 M bei Raumtemperatur. Die höchste Schlupfrate (SR) erzielten nach 72 h in vitro-Kultivierung mit 98% diejenigen Embryonen, die bei einer Konzentration von 3,6 M equilibriert worden waren. Auch beim one-stepEquilibrieren und Ausverdünnen von zuvor kryokonservierten in vitro14 produzierten Rinderembryonen zeigte sich eine 3,6 M Ethylenglycolkonzentration als beste Konzentrationshöhe. Versuche zu Auswirkungen von unterschiedlich vielen Equilibrierungstufen vor und Ausverdünnungsstufen während des Auftauens nach Kryokonservierung führten McGINNIS et al. 1989 durch. Sie stellten fest, dass es nach Kryokonservierung mit 1,5 M Ethylenglycol keine Unterschiede in den in vitro-ÜR gab. In verschiedenen Untersuchungen wurde festgestellt, dass EG in der Lage ist schneller durch Zellmembranen zu diffundieren als Glycerol. Zusätzlich hat Ethylenglycol auch bei höheren Temperaturen offensichtlich wesentlich weniger toxische Auswirkungen als Glycerol. Diese Eigenschaften führen dazu, dass auf das zeitlich und arbeitstechnisch aufwendige Ausverdünnen des Gefrierschutzmittels beim Auftauen verzichtet werden kann. VOELKER & HU (1992b) stellten in ihren Versuchen fest, dass ein direkter Transfer von, mit Ethylenglycol tiefgefrorenen, Rinderembryonen möglich sei. Diese verbesserte Handhabung (geringerer Material- und Zeitaufwand), besonders für die praktische Umsetzung in der Routine bedeutsam, wurde in weiteren Versuchen wiederholt und ebenfalls bestätigt (McINTOSH & HAZELAGER, 1994; BRACKE et al., 1995; DOCHI et al., 1995; JANOWITZ & HERMANNS, 1995; LANGE, 1995). Dieses sogenannte One-Step-Verfahren ist heute in der Routine weit verbreitet. Ethylenglycol wird aber nicht nur bei der konventionellen Kryokonservierung, sondern auch bei der Vitrifikation und dem ultraschnellen Tieffrieren verwendet. Bei Versuchen zur Vitrifikation zeigte es sich, dass EG weniger toxisch auf die Embryonen wirkte als andere Kryoprotektiva (MAHMOUDZADEH et al., 1993). Für Mäuse- und Rinderembryonen wurden auch beim ultraschnellen Tiefgefrieren gute Schutzwirkungen durch Ethylenglycol nachgewiesen. RAYOS et al. erhielt 1992 sehr gute in vitro-ÜR, nachdem er Ein-Zell-Mauseembryonen für 10 Minuten in 3 M EG und 0,25 M Saccharose equilibriert hatte. NOWSHARI & BREM (1998a) stellten deutlich höhere Schlupfraten (SR) bei ultraschnell tiefgefrorenen, expandierten Mauseembryonen fest, wenn diese nach vorheriger Dehydrierung mit Saccharose, unter Verwendung von 7 M EG anstatt 7 M PROH kryokonserviert wurden. 15 2.4.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva Im Gegensatz zu den penetrierenden Kryoprotektiva, dringen die nicht penetrierenden Gefrierschutzmittel nicht in die Zelle ein, sondern entfalten ihre schützenden Wirkung im extrazellulären Raum. Denn auch ohne Penetration scheint von diesen Substanzen eine kryoprotektive Wirkung auszugehen. Mehrere Autoren vermuten, dass die Gefrierschutzmittel eine Stabilisierung der Zellmembranen bewirken (HEBER, 1968; MAZUR, 1970; LEIBO et al., 1974; MERYMAN, 1974; MAZUR, 1976; BARNETT, 1978; UTSUMI, 1978; RALL et al., 1983). Die in der Kryokonservierung verwendeten nicht penetrierenden Kryoprotektiva gehören zu den Gruppen der Monosaccharide (Galaktose, Fructose, Glucose), den Disacchariden (Saccharose, Trehalose, Lactose), Proteinen, Lipoproteinen sowie Polyvinylpyrrolidon (PVP). Da die Saccharose das in der Praxis am weitesten verbreitete Kryoprotektivum ist (LEIBO, 1988) und auch in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde, wird schwerpunktmäßig auf dieses nicht penetrierende Kryoprotektivum eingegangen. Es ist ausreichend, die nicht penetrierenden Kryoprotektiva in einem niedrigen molaren Konzentrationsbereich einzusetzen, wodurch die Toxizität dieser Substanzen verringert wird (NIEMANN & MEINEKE, 1993). Um die Phase der Dehydration zu unterstützen, werden die nicht penetrierenden Gefrierschutzmittel sowohl in der Equilibrierungsphase vor der Kryokonservierung als auch bei der Ausverdünnung der Kryoprotektiva während des Auftauens eingesetzt, um ein übermäßiges Anschwellen der Embryonen zu verhindern (FRIEDLER et al., 1988). MERYMAN stellt 1971 fest, dass durch den Einsatz von nicht penetrierenden Kryoprotektiva die Zellen in der Lage sind, gelöste Stoffe unter osmotischem Stress penetrieren zu lassen. PVP und Acetamid, als für Embryonen hochtoxische Substanzen, werden heutzutage in der Regel nur noch bei der Vitrifikation eingesetzt (RALL & FAHY, 1985; RALL et al., 1985). In der assistierten Reproduktion kommt PVP zur Immobilisierung der Spermien bei ICSI zur Verwendung - weniger als Schutzsubstanz bei der Kryokonservierung. 16 Dem Gefrierschutzmittel Saccharose selber wird so gut wie keine kryoprotektive Wirkung zugeschrieben (WHITTINGHAM, 1971; WILMUT, 1972; MIYAMOTO & ISHIBASHI, 1976; MERYMAN et al., 1977; KASAI et al., 1981). Sie wird aber als Unterstützung für die Dilution der Kryoprotektiva und bei dem Verfahren der Vitrifikation zur isothermen Dehydrierung verwendet (TAKEDA et al., 1984; KRAG et al., 1985a, 1985b; PEURA et al., 1985; RALL & FAHY, 1985; RALL et al., 1985; WILLIAMS & JOHNSON, 1985). KASAI et al. (1981, 1983) entdeckten, dass es möglich ist, Embryonen über einen begrenzten Zeitraum hinweg in saccharosehaltigen Medien bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes zu lagern. SEIDEL (1989) nahm an, dass eine kryoprotektive Wirkung der Saccharose schon vor dem eigentlichen Kühlprozess einsetzt. Er stellte fest, dass durch Einsatz von 0,2 M bis 0,3 M Saccharose die Zellen soweit vordehydriert werden, dass das Umsetzen in flüssigen Stickstoff (LN2) schon bei deutliche höheren Temperaturen durchgeführt werden kann, ohne das die Zellen beschädigt werden. Diese These wurde auch von MASSIP et al. (1987) und MERMILLOD et al. (1992) unterstützt, die ein Umsetzen bereits ab -25°C für möglich erachteten. Da Saccharose aber als alleiniges Protektivum keine ausreichende Schutzwirkung besitzt (LEIBO, 1989), wird sie in der Regel in Konzentrationen von 0,1 M bis 0,3 M kombiniert mit penetrierenden Kryoprotektiva eingesetzt (LEHNJENSEN, 1984). Um auch bei höheren Kühlraten einen ausreichenden Schutz zu gewährleisten, ist offensichtlich zusätzlich zu den penetrierenden Gefrierschutzmitteln der Einsatz nicht penetrierender Kryoprotektiva sinnvoll, da nur so eine notwendige und schnelle Dehydrierung der Zellen möglich ist (MERYMAN et al., 1977). Beim Auftauen ist der Embryo im Vergleich zur Equilibrierungsphase in Vorfeld der Kryokonservierung einer verringerten extrazellulären KryoprotektivaKonzentration ausgesetzt, was zur Folge hat, dass Wasser relativ schnell in den Embryo einströmt. Dabei kann unter Umständen Wasser so schnell und so stark einströmen, dass der Embryo bis zu seinem Zerreißen anschwillt. Bleibt die Volumenzunahme aber innerhalb der maximal tolerierbaren Grenzen, entstehen an den Zellmembranen keine Schäden. Auf Grund der Molekülgröße ist Saccharose nicht in der Lage, Zellwände zu penetrieren. Sie wird aber als os17 motischer Puffer bei der Entfernung penetrierender Gefrierschutzsubstanzen verwendet, um ein zu starkes Anschwellen zu vermeiden (NIEMANN, 1982; RENARD et al., 1982; LEIBO, 1984; MASSIP et al., 1987). In Versuchen stellten SCHNEIDER & MAZUR (1984) fest, dass Mäuseembryonen fähig sind, bei 23°C für 30 Minuten eine 2,7-fache Volumenzunahme zu überstehen. Wird Saccharose als Puffer verwendet, können die Embryonen bis auf 25% ihres ursprünglichen Volumens schrumpfen ohne das es zu Schäden kommt. Nach abgeschlossener Equilibrierung und Umsetzung in zum Beispiel ein Kulturmedium kehren die Embryonen zu ihrem normalen Volumen zurück (SZELL & SHELTON, 1986; VOELKEL & HU, 1992a). Ein vollständig ablaufender Schrumpfungs- und Reexpandierungszyklus ist neben der morphologischen Beurteilung ein zusätzlicher Hinweis auf Unversehrtheit und Vitalität der Zellen (BIELANSKY et al., 1986). 1989 untersuchten MAPLETOFT et al. die in vitro-Überlebensraten (ÜR) frisch gespülter Mäuseembryonen in Abhängigkeit unterschiedlicher SaccharoseKonzentrationen. Dazu wurden die Embryonen für 10 oder 30 Minuten bei 20°C bzw. 35°C in den Saccharose-Lösungen equilibriert. Bei einer 0,5 M Saccharose-Lösung schienen Zeit und Temperatur nur wenige Auswirkungen zu haben. Bei 1,0 M Saccharose nahmen die in vitro-ÜR nach Verlängerung der Equilibrierungsdauer und einer Temperaturerhöhung deutlich ab. Wurden die Mäuseembryonen einer 2,0 M Konzentration ausgesetzt, waren die ÜR sehr stark verringert. In Versuchen zur Verträglichkeit steigender Saccharose-Konzentrationen (0,0 M bis 1,3 M) bei mit Glycerol kryokonservierten 8-Zell-Mauseembryonen, stellten TAKEDA et al. 1987 im Anschluss an das Ausverdünnen bei steigenden Saccharose-Konzentrationen zunehmend Schäden an der Zona pellucida fest. Durch die Entwicklung des sogenannten, 1983 von LEIBO beschriebenen OneStep-Verfahrens, bei dem das Ausverdünnen bereits in der Gefrierpaillette stattfindet, konnte der Arbeits- und Zeitaufwand bei Auftauen deutlich verringert werden. Dazu werden außer dem Embryo und dem Kryoprotektivum auch zwei Säulen mit Saccharose aufgezogen, die sich beim anschließenden Auftauen in der Paillette vermischen und ein direktes Ausverdünnen ermöglichen. Für Rinderembryonen untersuchten HOOGENKAMP (1984) sowie SCHUBERT (1984) 18 die Glycerol/Saccharose-Verhältnisse und erzielten die besten ÜR bei einem Verhältnis von 1:2. In 1994 von CSEH et al. veröffentlichten Untersuchungen wurden die höchsten Trächtigkeitsraten nach Transfer (38%) bei einer Mi- schung von 1:9 Glycerol/Saccharose erreicht. Aber auch bei der ultraschnellen Kryokonservierung und der Vitrifikation wird Saccharose erfolgreich als nicht penetrierendes Kryoprotektivum zur Unterstützung der Dehydrierung und als Zellschutz eingesetzt. Bei Untersuchungen zur ultraschnellen Tiefgefrierung von Mäuseembryonen setzten RAYOS et al. (1992a, b) eine Kombination von 0,5 M Saccharose und 3 M EG ein. THOMAS et al. (1989) verwendeten ebenfalls 0,5 M Saccharose, aber statt EG 3,5 M Glycerol. Die Ausverdünnung erfolgte unter Verwendung von Saccharose. KASAI et al. (1990) und KASAI (1996) beschrieben eine zur Vitrifikation geeignete Lösung, die als penetrierendes Protektivum Ethylenglycol, als nicht penetrierende Schutzsubstanz 0,5 M Saccharose und als Zusatzstoff das Makromolekül Ficoll enthielt. Saccharose und Ficoll bewirken dabei, dass die EGKonzentration in den Zellen reduziert wird und die Embryonen schnell schrumpfen. Das wiederum führt zu einer Verringerung der Toxizität der Lösung und daher zu einer besseren Überlebenswahrscheinlichkeit der Zellen. 2.5 Gefrierverfahren Die heute verwendeten Kryokonservierungsverfahren werden in das konventionelle, kontrollierte Tiefgefrierverfahren - auch als Standardgefrierverfahren bezeichnet - das ultraschnelle Kryokonservieren und die Vitrifikation eingeteilt. Beim konventionellen Tiefgefrieren kommen die Embryonen vor ihrer Konservierung in eine, das Kryoprotektivum enthaltende Lösung und verbleiben in dieser bis zur abgeschlossenen Equilibrierung. Im Gegensatz dazu wird den Embryonen beim ultraschnellen Tieffrieren und bei der Vitrifikation keine Möglichkeit zur vollständigen Equilibrierung gegeben. Es handelt sich hierbei um eine sogenannte Nonequilibrium-Kryokonservierung. Vor der Kryokonservierung erfolgt eine Dehydrierung der Embryonen, indem sie für einen kurzen Moment in eine Mischung aus nicht penetrierenden und hochkonzentrierten penetrierenden Kryoprotektiva kommen (LEIBO, 1989). 19 Zur Aufbewahrung der kryokonservierten Embryonen wurden in den Anfangszeiten der Kryokonservierung Glasampullen verwendet, die im Laufe der Zeit dann allerdings durch die heute gebräuchlichen Kunststoffpailletten ersetzt wurden. BIELANSKY et al. (1985) stellten in ihren Untersuchungen fest, dass es keine Unterschiede zwischen den Embryoüberlebensraten von Glasampullen und Kunststoffpailletten gab. Die Kunststoffpailletten erwiesen sich aber in der Handhabung von Kryokonservierung, Lagerung und spätere Transfers als vorteilhafter und haben sich daher durchgesetzt (MASSIP et al., 1982). 2.5.1 Standardgefrierverfahren Das Hauptmerkmal des Standardgefrierverfahrens ist, dass Embryonen und Kryoprotektiva nach festgelegten und kontrollierten Schemata auf Lagerungstemperatur heruntergekühlt werden. Auf diese Weise wird versucht, irreparable Schäden durch unkontrollierte intrazelluläre Eiskristallbildung und Lösungseffekte zu verhindern, die zum Zelltod und damit zum Absterben des Embryos führen können. Deshalb werden spezielle, optimierte Kühlraten verwendet, die auf die unterschiedlichen Spezies und Entwicklungsstadien sowie verwendeten Kryoprotektiva genau zugeschnitten sind. Zur Steuerung der Abkühlraten werden programmierbare Temperaturregler verwendet, an denen die jeweils benötigten Kühlraten eingestellt werden können. Beim Standardgefrierverfahren wird bei einer Temperatur von -6°C oder -7°C manuell oder automatisch die Kristallisation der extrazellulären Medien ausgelöst. Durch diesen als „Seeding“ bezeichneten Vorgang wird die Bildung kleiner intrazellulärer Eiskristalle unterstützt und es soll durch diesen Vorgang ebenso verhindert werden, dass es zu einer für den Embryo schädlichen Unterkühlung, dem Supercooling, kommt. Häufig wird die Temperatur im Anschluss an das Seeding noch für einige Minuten auf Seeding-Temperatur gehalten, bevor sie mit definierter langsamer Kühlrate bis auf etwas -32°C weiter abgesenkt und erneut für einige Minuten dort gehalten wird. Im letzten Schritt werden die Zellen durch schnelles Einfrieren, welches in der Regel durch direktes Umsetzen in LN2 erfolgt, auf die Lagerungstemperatur von -196°C gebracht. 20 Würde kein manuelles, oder das durch neuere Technik ermöglichte, automatische Seeding erfolgen, wäre eine willkürliche, spontane Kristallbildung der Medien die Folge. In Abhängigkeit vom verwendetem Kryoprotektivum tritt diese spontane Eiskristallbildung ab etwa -10°C im extrazellulären und bei etwa -35°C bis -45°C im intrazellulären Raum ein (MAZUR, 1970; BANK, 1973; LEIBO et al., 1978; LEHN-JENSEN & RALL, 1983; RALL & POLGE, 1984; TONER et al., 1991). Im Zuge dieser spontanen Kristallisation innerhalb der Zellen und des Mediums kommt es zu einer Wärmefreisetzung und damit zu einem kurzfristigen Temperaturanstieg. Die dabei entstehenden intrazellulären Eiskristalle würde auf Grund ihrer Größe unweigerlich zum Tod der Embryonen führen (WILLADSEN, 1980; PAVEL, 1985; SEIDEL, 1989; NIEMANN, 1991; STREICHER, 1998; SEIBT, 2003). SOMMERFELD (1997) war es möglich, eine Abhängigkeit von SeedingTemperatur und Kryoprotektivums-Konzentration festzustellen. Nach einer Erhöhung der Ethylenglycol-Konzentration auf 3,6 M sank die Gefriertemperatur auf -11°C ab. Wurde die Temperatur erhöht, konnte die Kristallisation nicht aufrechterhalten werden. Der Umstieg von Glasampullen auf Kunststoffpailletten hatte auch für das erfolgreiche Seeding Vorteile. Wegen des geringeren Paillettendurchmessers und die dünnere Wand der Kunststoffpailletten ist das manuelle Seeding deutlich schneller und präziser möglich, wodurch die Überlebenswahrscheinlichkeit der Embryonen steigt (NIEMANN, 1983). Um für den Embryo unnötigen Stress zu vermeiden, sollte der Kristallisationskern nicht direkt an der den Embryo enthaltenden Säule gesetzt werden, sondern es sollte dafür eine, durch eine Luftblase getrennte, zweite Mediumsäule gewählt werden (DE PAZ et al., 1994). Das Herunterkühlen auf Seeding-Temperatur kann mit unterschiedlichen Kühlraten erfolgen. Je nach Spezies werden die Kühlraten eingestellt. Bei humanen Embryonen wird häufig eine Kühlrate von 2°C/min gewählt. Mäuseembryonen hingegen können offensichtlich auch ohne nachteilige Effekte auf die spätere Vitalität direkt in Seeding-Temperaturen eingesetzt werden. Arbeitstechnisch bedeutet dieses eine deutliche Erleichterung, da die Dauer des Kryokonservierungsprogramms verkürzt werden kann (WILLADSEN, 1980; SCHNEIDER & MAZUR, 1984; PAVEL, 1985). 21 Die Unterscheidung zwischen dem langsamen und dem schnellen Verfahren definiert sich in den Kühlraten im Anschluss an das Seeding. 2.5.2 Langsames Kryokonservieren Das Kennzeichen der langsamen Konservierung sind die Kühlraten von 0,1°C/min bis 0,3°C/min, mit der die Temperatur auf -60 bis -120°C herabgekühlt wird (LEIBO et al., 1974; FALGE et al., 1982; NIEMANN, 1983; LEHNJENSEN, 1984). WHITTINGHAM et al. (1972) sowie WILMUT (1972) gelang es erstmals auf diese Weise ein Überleben von Mauseembryonen zu erreichen. Diese niedrigen Kühlraten wurden gewählt, damit den Zellen die Möglichkeit zur Dehydrierung und osmotischen Equilibrierung gegeben ist. Durch die beinahe vollständige Dehydrierung der Zellen ist es möglich, die unerwünschte intrazelluläre Kristallisation zu umgehen (MAZUR, 1966; MAZUR & SCHNEIDER, 1986). Die Rate der Auftaugeschwindigkeit für dieses Verfahren liegt bei 2°C/min bis 10°C/min (NIEMANN, 1991). Bei graphischer Darstellung von Kühlrate und Überlebensrate zeigt sich das Bild einer Parabel (Abb. 1). Mit steigender Kühlrate steigt auch die Überlebensrate (ÜR). Bei einer mittleren Kühlrate erreicht die ÜR ihr Maximum, um anschließend wieder abzusinken. Als optimalste Kühlrate wird eine Rate angesehen, die langsam genug ist, der intrazellulären Eisbildung entgegenzuwirken, aber wiederum schnell genug ist damit die Zellen nicht länger als unbedingt notwendig den Lösungseffekten ausgesetzt sind (MAZUR, 1970, 1980) 22 Überlebensrate (%) Kühlrate (°C/min) Abb. 1: Abhängigkeit der Überlebensrate von der Kühlrate 2.5.3 Schnelles Kryokonservieren Mit dem schnellen oder auch 2-stufigen Kryokonservierungsverfahren ist eine Methode entwickelt worden, die deutlich schneller und so für die Routine wesentlich praktikabler ist. Als erste konnten WOOD & FARRANT 1980 von erfolgreichen Versuchen mit Mäuseembryonen berichten, die eine langsame Kühlung auf -20°C bzw. -25°C und eine daran direkt anschließende Überführung in flüssigen Stickstoff (LN2) überlebt hatten. In Versuchen mit in DMSO kryokonservierten Rinderblastocysten stellen LEHNJENSEN & GREVE 1980 fest, dass es keinen Unterschied machte, ob die Embryonen nach dem langsamen oder dem schnellen Tiefgefrierverfahren eingefroren wurden. Nach NIEMANN (1982) erklärt sich das dadurch, dass die Embryonen noch weiterhin die Möglichkeit haben, ihr Zellwasser in das noch nicht komplett gefrorene, sie umgebene extrazelluläre Medium abzugeben. Bei einer Temperatur von -42°C sind erst ungefähr 74% der Lösung kristallisiert. Schließt sich hier eine sehr schnelle Temperatursenkung auf bis -150°C an, führt das zu einer Viskositätszunahme der Restflüssigkeit. Weitere Eiskristallbildungen sind dann nicht mehr möglich und die Restflüssigkeit vitrifiziert (RALL, 1981; RALL et al., 1984). 23 Diverse Untersuchungen beschäftigten sich damit, die optimale Temperatur zum Umsetzen zu ermitteln. Dabei zeigte sich, dass der beste Umsetztemperaturbereich in LN2 offensichtlich zwischen -30°C und -35°C liegt (BILTON, 1980; LEHN-JENSEN & GREVE, 1982; FARRANT et al., 1985; SCHIEWE et al., 1985). MASSIP et al. (1987) sowie NIBART & HUMBLOT (1997) konnten von guten Trächtigkeitsraten berichten, nachdem sie die Embryonen bei -25°C umgesetzt hatten. Als Kryoprotektivum verwendeten sie Glycerol und Saccharose und equilibrierten die Embryonen bei Raumtemperatur. Durch die Verwendung von Saccharose dehydrieren die Embryonen soweit, dass es möglich ist, das Kühlen auch schon bei höheren Temperaturen zu beenden. MAZUR (1990) sah die anschließende Auftaugeschwindigkeit als Voraussetzung für ein Überleben von bei -20°C bis -40°C umgesetzten Embryonen an. Nur wenn die Auftaurate schnell genug ist, um eine Rekristallisation zu verhindern, haben die Embryonen eine Überlebenschance. 2.5.4 Ultraschnelles Kryokonservieren Bei diesem Verfahren werden die Embryonen direkt in LN2 getaucht. Dabei bilden sich kleinere intra- und extrazelluläre Eiskristalle. Als verwendete Gefrierschutzsubstanzen kommen recht hoch dosierte penetrierende (2,0 M bis 3,5 M) und nicht penetrierende (0,2 M bis 0,5 M) Kryoprotektiva zum Einsatz (NIEMANN, 1991b). Die nicht penetrierenden Kryoprotektiva, wie zum Beispiel Saccharose, bewirken, dass die Embryonen bereits vor dem Tiefgefrieren relativ weit dehydrieren und dadurch das Risiko intrazellulärer Eisbildung sehr stark reduziert wird (MAZUR, 1990). Zu Beginn der Entwicklung des ultraschnellen Tiefgefrierens war es nur möglich Mäuseembryonen tiefzugefrieren. Inzwischen ist es aber auch möglich weitere Spezies nach diesem Verfahren zu konservieren. Aber auch die Wahl des penetrierenden Kryoprotektivums hat bei diesem Verfahren offensichtlich Auswirkungen auf die Überlebensraten der konservierten Embryonen. So untersuchten GUTIERREZ et al. (1993) den Einfluss von Glycerol, EG und Propandiol in der Konzentration von 3,0 M in Verbindung mit jeweils 24 0,25 M Saccharose auf die Überlebensrate von Mäusemorulae. Dabei stellte sie signifikante Unterschiede zwischen Glycerol (76,1%) und EG (79,5%) im Vergleich zu Propandiol mit 43,6% in vitro-Weiterentwicklungsrate fest. NOWSHARI & BREM (1998a) verglichen in ihren Versuchen mit expandierten Mäuseembryonen die Entwicklungsraten bei der ausschließlichen Verwendung von EG bzw. Propandiol in unterschiedlich hohen Konzentrationen. Es zeigte sich, dass eine Konzentration von 7,0 M den effektivsten Schutz bietet und dass die Schlupfrate nach Verwendung von EG höher lag als nach Propandiolverwendung (84% zu 78%). In wie weit die Equilibrierungsdauer Einfluss auf die Entwicklungsraten hat, untersuchten RAYOS et al. (1992b). Sie ermittelten die optimalste Zeitdauer für in 3,0 M Ethylenglycol und 0,25 M Saccharose equilibrierte Mäuseembryonen. 10 Minuten führten zu den höchsten in vitro-Entwicklungsraten, während bei längeren Zeitspannen von 20 bzw. 30 Minuten die Entwicklungsraten wieder absanken. LEIBO (1989) erklärte das damit, dass es durch die längere Equilibrierung zu einer erhöhten intrazellulären EG-Konzentration kommt, die beim Ausverdünnen des Kryoprotektivums durch das schnelle Einströmen von Wasser zur osmotischen Zellschädigung führt. 2.5.5 Vitrifikation Ebenso wie bei dem ultraschnellen Tiefgefrieren erfolgt auch bei der Vitrifikation ein direktes Umsetzung in LN2. Bei der Vitrifikation wandelt sich die hochkonzentrierte KryoprotektivumsLösung durch sehr schnelle Kühlraten von der flüssigen Phase in einen stabilen, glasartigen Zustand. Zunächst wird sie bei diesem Prozess zunehmend visköser, bevor sie schließlich ganz erstarrt. Ist die Vitrifikation korrekt verlaufen, kommt es zu keiner Eiskristallbildung im Vitrifikationsmedium und auch im Anschluss an die Umsetzung in flüssigen Stickstoff bleibt das Medium klar und durchsichtig. Da die Lösung beim Gefrieren nicht durch die Bildung von Eiskristallen aufkonzentriert wird, können neben den Schäden durch intrazelluläres Gefrieren auch Schäden durch Lösungsef25 fekte umgangen werden (FAHY et al., 1984; FRIEDLER et al., 1988; NIEMANN, 1991a; DOBRINSKY, 1996; STREICHER, 1998). Im Gegensatz zu den anderen Kryokonservierungsverfahren, ist bei der Vitrifikation keine programmierbare Gefriereinheit zwingend notwendig, da durch das direkte Eintauchen in LN2 die sehr schnelle notwendige Kühlrate von bis zu 2000°C/min erreicht wird. Allerdings haben gesteuerte Geräte eine sehr viel genauere Abkühlrate und eine höherer Abkühlleistung von bis zu 130000°C/Min, was wiederum den Einsatz der hochtoxischen Gefrierschutzmittel auf ein Minimum reduzieren kann (Vitmaster™). Denn ein großes Problem stellt bei dem Verfahren der Vitrifikation die Toxizität der sehr hoch konzentrierten Kryoprotektiva dar, die sowohl während der Equilibrierung als auch beim Ausverdünnen während des Auftauprozesses bei Raumtemperatur starke Schäden an den Embryonen verursachen können (FRIEDLER et al., 1988; DE LEEUW et al., 1991; ISHIMORI et al., 1992; RALL, 1992). Von entscheidender Bedeutung für eine gelungene Vitrifikation ist es, diejenige Konzentration an Protektiva zu finden, die maximalen Kryoschutz bei minimalen toxischen Auswirkungen ermöglicht. Aus diesem Grunde hat es sich als positiv erwiesen, Mischungen von verschiedenen Kryoprotektiva zu verwenden, da die vitrifizierenden, aber unter Umständen sehr toxischen Eigenschaften des einen Kryoprotektivums mit den weniger toxischen Eigenschaften eines anderen Kryoprotektivums ausgeglichen werden können (MASSIP et al., 1987). RALL & FAHY waren 1985 die ersten, die von einer erfolgreichen Vitrifikation an Mäuseembryonen berichteten. Als Vitrifikationslösung verwendeten sie eine Mischung aus den Komponenten DMSO, Acetamid, Propandiol sowie Polyethylenglycol und konnten nach einer 48-stündigen in vitro-Kultivierung eine Entwicklungsrate von 87,8% vermerken. Zum Gelingen einer erfolgreichen Vitrifikation tragen, neben der Kombination der Kryoprotektiva, entscheidend die Equilibrierungsdauer der Embryonen in der Vitrifikationslösung und die Temperatur bei der die Equilibrierung stattfindet bei. In gewissem Masse lässt sich die Toxizität beeinflussen, indem man die Equilibrierungstemperatur und auch die Verweilzeit der Embryonen in der Vitrifikationslösung auf ein Minimum reduziert. 26 Deshalb kommen die Embryonen in einem ersten Schritt zunächst in eine niedriger konzentrierte Lösung zum Equilibrieren und anschließend in einem zweiten Schritt für einen sehr kurzen Moment (wenige Sekunden bis etwa eine halbe Minute) bei geringerer Temperatur (4°C) in die eigentliche, hochkonzentrierte Vitrifikationslösung (FRIEDLER et al., 1988; NIEMANN & MEINECKE, 1993). Saccharose wurde erstmals durch KASAI et al. 1990 als VitrifikationslösungsBestandteil verwendet. Sie benutzten eine Mischung aus 40% Ethylenglycol, 30% Ficoll und 0,5 M Saccharose. In seiner Eigenschaft als schnell penetrierendes Kryoprotektivum gelangt EG bei der Equilibrierung rasch in ausreichender Konzentration in die Zellen und auch beim Ausverdünnen ist EG in der Lage, die Zellen schnell wieder zu verlassen. Das bedeutet, dass die Toxizität deutlich gesenkt werden kann, was wiederum dazuführt, dass höhere Überlebensraten erreicht werden. In den Versuchen von KASAI et al. (1990) erfolgte die Embryonenequilibrierung bei Raumtemperatur in einem Schritt von zwei bzw. fünf Minuten. Die Entwicklungsraten zu expandierten Blastocysten erreichten dabei Werte von bis zu 97 bzw. 98%. 2.6 Auftauen Während zum Einfrier- und Gefriervorgang die drei Phasen Vorbereitungsphase, Seeding und Gefrierphase sowie im weiteren Sinne noch die beiden Phasen Schädigungsprozesse und Lagerungsphase gehören, ist der Auftauvorgang selber und die Gefrierschutzmittelausverdünnung dem Prozess des Auftauvorganges zuzuordnen. Der Auftaurate kommt für die spätere Vitalität der Embryonen eine ebenso große Bedeutung zu wie der Kühlrate. WHITTINGHAM et al. (1972) haben Mäuseembryonen mit -0,3°C/min auf -78°C bis -269°C nach dem langsamen Verfahren eingefroren und tauten sie anschließend mit Raten von 4, 25, 215, 450°C/min wieder auf. Die besten Überlebensraten erzielten diejenigen Embryonen, die mit den Auftauraten von 4°C/min bzw. 25°C/min aufgetaut worden waren. 27 Vergleichbare Ergebnisse erhielten WILMUT (1972) aus Untersuchungen mit Mausembryonen und WILLADSEN et al. (1976) nach Versuchen mit Schafembryonen. LEIBO & MAZUR (1978) stellten fest, dass langsam eingefrorene Embryonen auch sehr langsam wieder aufgetaut werden müssen, um eine möglichst große Überlebensfähigkeit der Embryonen zu erreichen. Das erklärt auch, warum schnell kryokonservierte, ultraschnell tiefgefrorene und Embryonen nach Vitrifikation Auftauraten von über 300°C/min benötigen. Bei zu langsamen Auftauraten käme es andernfalls zur intrazellulären Kristallisation und damit zum Zelltod. RALL & POLGE führten 1984 Untersuchungen an 8-Zell-Mauseembryonen durch. Sie equilibrierten die Embryonen in 1,5 M Glycerol und tauten sie nach vorangegangenem Einfrieren mit unterschiedlichen Raten wieder auf. Dabei überlebten die Embryonen, die langsam auf -20°C bis -40°C heruntergekühlt, anschließend direkt in LN2 überführt und mit 2°C/min aufgetaut wurden eine 48-stündige in vitro-Kultivierung nur zu 4 bis 25%. Bei denjenigen Embryonen aber, die ebenfalls langsam auf -25°C heruntergekühlt wurden, um mit 500°C/min schnell wieder aufgetaut zu werden, überlebten 74% der Embryonen die in vitro-Kultivierung. Eine Erklärung für die Abhängigkeit der Überlebensrate von Kühl- und Auftaurate liegt in der Fähigkeit der Eiskristalle zur Rekristallisation. Beim schnellen und ultraschnellen Tiefgefrieren bilden sich viele kleine Eiskristalle, die eine geringe Oberflächenenergie besitzen und aus diesem Grunde thermisch instabil sind. Diese verschmelzen beim langsamen Auftauen in wenige aber größere und dadurch schädigende Eiskristalle. Erfolgt das Auftauen aber ausreichend schnell, schmelzen die kleinen Kristalle, bevor sie untereinander verschmelzen können (MAZUR, 1965; BANK, 1973; RALL et al., 1980). Zum schnellen Auftauen werden die eingefrorenen Pailletten in der Regel in ein warmes Wasserbad getaucht. ELSDEN et al. (1982) tauten Rinderembryonen im 25°C bzw. 37°C warmen Wasserbad auf und verglichen anschließend die Trächtigkeitsraten im Anschluss an einen Transfer dieser Embryonen. Die Trächtigkeitsraten der bei 37°C aufgetauten Embryonen lagen mit 36,5 % über den Resultaten der bei 25°C aufgetauten Embryonen (23,5%). 1990 konservierten SEIDEL et al. Rinderembryonen mit einem Kryoprotektivum, dem sie zusätzlich ein Makromolekül zugesetzt hatten. Embryonen, die vor dem Auftauen 28 im Wasserbad sechs Sekunden an der Luft angetaut wurden, ergaben bessere Trächtigkeitsraten als die Embryonen, die ausschließlich im Wasserbad aufgetaut worden waren. WHITTINGHAM berichtete 1981, dass nach Kryokonservierung von 8-ZellMauseembryonen und einem schnellen Auftauen die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn beim Einfrieren das langsame Kühlen bei -40°C durch Umsetzen in LN2 gestoppt wird. 2.7 Ausverdünnungsmethoden Nahezu alle Kryoprotektiva wirken bei wärmeren Temperaturen toxisch auf den Embryo und müssen aus diesem Grunde vor einer in vitro-Kultivierung oder einem Transfer möglichst vollständig wieder aus den Zellen entfernt werden. Je nach verwendetem Kryoprotektivum und Equilibrierungsdauer enthalten die aufgetauten embryonalen Zellen höhere Konzentrationen an Kryoprotektiva. Kommen die Zellen aus dem Gefrierschutzmedium in physiologische Medien oder Kulturmedien zurück, schwellen sie wegen des osmotischen Gradienten nach Wassereinstrom an. Versuche zu Überlebensrate und maximal tolerierbare Volumenzunahme von Mausembryonen ergaben, dass Ausverdünnungsverfahren gewählt werden sollten, bei denen das Embryonenvolumen zwischen 50% und 200% des isotonischen Volumens liegt (MAZUR & SCHNEIDER, 1986). 2.7.1 Schrittweises Ausverdünnen und Ausverdünnen mit nicht penetrierenden Kryoprotektiva Um übermäßiges Anschwellen zu vermeiden kann auf zwei unterschiedliche Verfahren ausverdünnt werden. Die erste Variante ist das schrittweise Ausverdünnen. Dabei reduziert man die den Embryo umgebende extrazelluläre Konzentration des Kryoprotektivums immer weiter indem der Embryo fortlaufend in Lösungen mit absteigender Konzentration des Kryoprotektivums umgesetzt 29 wird. So kann das Anschwellen des Embryonen in einem, für die Zellen tolerierbaren Rahmen gehalten werden. Ein anderes Verfahren verhindert das Überschreiten des isotonischen Volumens, indem zum Ausverdünnen nicht penetrierende Kryoprotektiva verwendet werden. Durch die nicht penetrierenden Stoffe wird die extrazelluläre Osmolarität konstant gehalten. Das intrazelluläre Kryoprotektivum kann aus den Zellen herausströmen, ohne dass es zu einem zerstörenden Anschwellen des Zellvolumens kommt. Hat auf diese Weise genügend Kryoprotektivum die Zellen verlassen, kann der Embryo, ohne weitere Schäden durch übermäßiges Anschwellen zu nehmen, in isotonisches physiologisches (Kultur-)Medium verbracht werden (LEIBO & MAZUR, 1978; MAZUR, 1985). Das Ausverdünnen mit nicht penetrierenden Kryoprotektiva wie zum Beispiel Saccharose bietet zudem die Möglichkeit zu kontrollieren, ob der Embryo die Kryokonservierung überlebt hat. Ein vitaler Embryo schwillt in einer Saccharose-Lösung nicht übermäßig stark an, schrumpf dafür aber fortlaufend, solange das Kryoprotektivum aus dem Embryo herausdiffundiert. Dieses anfängliche Schrumpfen und anschließende Anschwellen ist ein Zeichen dafür, dass die Funktionen der Zellmembranen noch intakt sind (SCHNEIDER & MAZUR, 1984). 2.7.2 One-Step-Ausverdünnung In diversen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass das penetrierende Kryoprotektivum Glycerin mit Hilfe des nicht penetrierenden Kryoprotektivum Saccharose auch in einem Schritt ausverdünnt werden kann. Die beste Überlebensrate von Embryonen wurde bei Konzentrationen von 1 M Saccharose erzielt. Mit Konzentrationen, die kleiner als 0,8 M Saccharose waren, konnten hingegen keine zufriedenstellenden Überlebensraten mehr erreicht werden (MERRY et al., 1983; HERNANDEZ-LEDEZMA et al., 1988b; DEL CAMPO et al., 1990; SUZUKI et al., 1990). BIELANSKY et al. (1985) untersuchten, inwieweit sich die Überlebensraten von Rinderembryonen nach Ausverdünnen in einem Schritt mit Saccharose oder in 30 mehreren Schritten ohne Saccharose von einander unterschieden. Sie konstatierten, dass die Überlebensrate bei der Ein-Schritt-Methode höher war. MAPLETOFT et al. (1987) verglichen die Auswirkungen der Ein-SchrittMethode mit dem schrittweisen Ausverdünnen mit Saccharose bei Mäuseembryonen. LANDSVERK et al. (1992) und ARRESEIGOR et al. (1998) untersuchten die Auswirkungen dieser beiden Methoden auf Rinderembryonen. Dabei stellten sie fest, dass die zeitaufwendigere Methode der schrittweisen Ausverdünnung in mehreren Schritten keinerlei Vorteile gegenüber der One-StepMethode aufwies. Eine erneute Vereinfachung des Ausverdünnens in einem Schritt ist die von LEIBO (1983) und RENARD et al. (1983) entwickelte One-Step-Methode. Bei diesem Verfahren wird der in Glycerol kryokonservierte Embryo vor dem Transfer direkt in der Paillette ausverdünnt. CHUPIN et al. (1984) und HOOGENKAMP (1984) zogen dazu in der Gefrierpaillette vor dem Kryokonservieren drei unterschiedliche Säulen auf. Die mittlere Säule enthielt in einer Glycerolmenge den Embryo. Diese Säule wurde durch jeweils eine Luftblase von den beiden äußeren Säulen getrennt. Diese äußeren Säulen bestanden entweder alle beide aus einer Saccharose-Lösung oder die eine Säule aus einer Saccharose-Lösung und die zweite Säule aus Medium. CHUPIN et al. (1984) stellten zwischen den Trächtigkeitsraten nach direktem Transfer bei den beiden verschiedenen Varianten keine signifikante Unterschiede fest. HOOGENKAMP (1984) jedoch erreichte mit denjenigen Embryonen, deren Pailletten zwei Säulen Saccharose enthielten, höhere Trächtigkeitsraten (46%) als mit Embryonen, deren Pailletten eine Säule Medium und eine Säule Saccharose enthielten (21%). In Versuchen zu eventuellen Einflüssen der Verweildauer, mit denen die Embryonen dem Gemisch beider Medien bei 37°C bis zum Transfer konfrontiert wurden, warteten PAVEL (1985) und NOHNER (1986) nach dem Auftauen und Schütteln der Pailletten, welches eine Durchmischung der Medien erreichen sollte, unterschiedlich lange. Bei PAVEL (1985) betrug die Trächtigkeitsrate nach einer weniger als zehnminütigen Wartezeit nur 18,5%. Nach einer Wartezeit von mehr als 10 Minuten stieg die Trächtigkeitsrate auf 100% an. NOHNER (1986) dagegen stellte fest, dass die Trächtigkeitsrate mit zunehmender Wartezeit nach dem Ausverdünnen sank. Erzielte er bei 5 bis 15 min Wartezeit noch 31 eine Trächtigkeitsrate von 44,4%, waren es nach 30 bis 60 Minuten Wartezeit lediglich noch 28,6%. Trotz recht guter Trächtigkeitsergebnisse (von 25% bis über 45%) in Feldversuchen hat sich die One-Step-Methode in der Routine des Embryonentransfers noch nicht flächendeckend durchsetzten können (VOELKEL & HU 1992a; STREICHER 1998). 2.7.3 Direkte Ausverdünnung von Ethylenglycol Ethylenglycol hat im Vergleich zu Glycerol den Vorteil, dass es auch bei höheren Temperaturen eine deutlich geringere toxische Wirkung auf Zellen besitzt. Zusätzlich diffundiert Ethylenglycol wesentlich schneller als Glycerol durch die Zellmembranen hindurch. VOELKEL & HU (1992a) untersuchten die in vitroÜberlebensraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren in Abhängigkeit von vier verschiedenen Kryoprotektiva bzw. direktem Ausverdünnen nach Auftauen in PBS. Dabei zeigte sich, dass die Überlebensraten von in Ethylenglycol kryokonservierten Embryonen die Überlebensraten von in Glycerol, DMSO oder Propandiol tiefgekühlten Embryonen überstiegen. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Zeit- und Materialaufwendige schrittweises Ausverdünnen der Kryoprotektiva nach dem Auftauen nicht unbedingt notwendig ist. JANOWITZ & GÖRLACH (1994) hielten fest, dass die Möglichkeit gegeben ist, die Embryonen im Anschluss an das Auftauen ohne Schäden direkt zu übertragen. Untersuchungen von ARRESEIGOR et al. (1998) kamen zu dem Ergebnis, dass die Trächtigkeitsraten (TR) nach einem Direkttransfer von in Ethylenglycol kryokonservierten Rinderembryonen mit denen in Glycerol tiefgefrorenen Embryonen, die dann allerdings in drei Schritten ohne Saccharose oder einem Schritt mit Saccharose ausverdünnt worden waren (47,4% TR gegenüber 45,9 bzw. 47,2% TR), zu vergleichen waren. Durch die guten Trächtigkeitsergebnisse und die stark vereinfachte Handhabung ist dieses One-Step-Verfahren von der Routine in größerem Masse angenommen worden. 32 2.8 Kultivierung von Embryonen Das Weiterentwicklungsvermögen von Embryonen unter Kulturbedingungen ist ein gutes Kriterium, um die Vitalität von Embryonen zu bewerten (SCHNEIDER et al., 1974; TROUNSON et al., 1978b; NIEMANN, 1980). POLGE & WILLADSEN (1978) wie auch LEHN-JENSEN et al. (1981) stellten nach einer 24-stündigen in vitro Kultivierung von kryokonservierten und anschließend wieder aufgetauten Rinderembryonen bei 37°C keine signifikanten Unterschiede zwischen in vitro und in vivo Entwicklungsraten. TROUNSON et al. (1976a, 1978) und MASSIP et al. (1979) hingegen stellten fest, dass die Trächtigkeitsraten deutlich verringert waren, wurden die Embryonen vor dem Transfer einer in vitro Kultivierung ausgesetzt. Eine erste erfolgreiche Kultivierung von Mäuseembryonen gelang HAMMOND 1949. Er kultivierte in seinen Versuchen Mäuseembryonen vom 8-Zellstadium bis zur Blastocyste in einem biologischen Medium, das aus den anorganischen Salzen NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 und NaH2PO4 bestand. Desweiteren setzte er noch Glucose, 5 % Hühnereiweiß sowie Hühnereidotter zu. WHITTEN (1956) war der erste, der über einen erfolgreichen Einsatz eines chemischen Mediums berichtete. Bei dem Medium handelte es sich um eine Krebs-Ringer-Lösung, in der das Hühnereiweiß durch bovines Serumalbumin (BSA) ersetzt worden war. McLAREN & BIGGERS (1958) bewiesen, dass sich in diesem Medium kultivierte Embryonen nach einem Transfer auf Empfängertiere zu ganz normalen Föten weiterentwickelten. BRINSTER (1963) stellte fest, dass es nach Zusatz von Laktat und Pyruvat zum Kulturmedium sogar möglich ist Embryonen ab dem 2-Zellstadium zu kultivieren. Ebenfalls BRINSTER (1965) beschrieb, dass ein Wachstum von Mäuseembryonen vom 2-Zellstadium bis zum Stadium Blastocyste in einem Bereich von 200 bis 354 mOsmol und einem pH-Wert von 5,87 bis 7,78 möglich sei. Als optimalste Bedingungen ermittelte er eine Osmolalität von 276 mOsmol und einen pH-Wert von 6,82. 33 Für eine in vitro Kultivierung von Embryonen wird am häufigsten die Mikrotropfenmethode unter Öl angewandt. Dabei werden ein bis mehrere Mikrotropfen Kultivierungsmedium (ca. 50 bis 100 µl) in einer Petrischale platziert und mit Mineralöl überschichtet. Durch das Öl wird das Medium vor einer Verdunstung geschützt; ein Gasaustausch mit der umgebenden Gasphase ist weiterhin möglich (BRINSTER, 1963). Während einer in vitro Kultivierung müssen laufend die folgenden Parameter kontrolliert werden: Temperatur, Luftfeuchtegehalt und CO2-Gehalt in der Gasphase. Als optimale Werte für eine Mäuse- und Kanincheneizellen-Kultivierung wurden von ALLISTON et al. (1965), ADAMS (1968) und BRINSTER (1969) eine Temperatur von 37°C, eine nahezu 100 %ige rel. Luftfeuchte sowie ein CO2Partialdruck von 5 % angesehen. 2.9 Beurteilungsmöglichkeiten für Embryonen Es gibt die unterschiedlichsten Verfahren, um Embryonen in ihrem Erscheinungsbild zu beurteilen. Die einfachste und häufigste Methode ist die morphologische Beurteilung, in der Regel unter zu Hilfenahme eines Mikroskopes. Weiterhin sind verschiedene Arten der Anfärbung von Embryonen und Zellen entwickelt worden, durch die die Möglichkeit besteht auch morphologisch nicht sichtbare, aber die Qualität beeinflussende Kriterien, sichtbar zu machen. 2.9.1 Morphologische Beurteilung Die morphologische Beurteilung ist die wahrscheinlich am wenigsten aufwendige Methode Zellen und Zellkomplexe zu beurteilen. Eine Klassifizierung der Embryonenqualität erfolgt mit mikroskopischer Hilfe durch eine subjektive Beurteilung in Anlehnung an die Verfahren von LINDNER & WRIGHT (1983) sowie KAUFFHOLDT & THAMM (1985). Die subjektive Beurteilung ist dabei der kritische Punkt in diesem Verfahren, da eine genügend große Erfahrung im Erkennen von guten und schlechten Embryonen und deren verschiedener Stadien notwendig ist. 34 Entscheidende Kriterien bei der Bewertung sind Faktoren wie die Unversehrtheit der Zona pellucida, das Größenverhältnis der Blastomeren untereinander, die Anzahl und Kompaktheit der Blastomeren. Auch sollte ein Entwicklungsstadium, das dem Zeitpunkt der Gewinnung entspricht, vorgefunden werden. Ist dieses nicht der Fall, sollten die Embryonen als retardiert und damit als ein geschädigter, nicht zu verwendender Embryo angesehen werden (MAURER, & HASEMANN, 1976; TROUNSON et al., 1976a/b; ELSDEN et al., 1978; BOLAND et al., 1978). 2.9.2 Beurteilung nach Fluoreszenzanfärbung mittels FDA Um eine Vitalitätsbestimmung von Embryonen mit Farbstoffen durchführen zu können, ist es notwendig, dass der verwendete Farbstoff eine exakte Beurteilung erlaubt und die Entwicklungsfähigkeit der Embryonen nicht verringert wird. Ein fluoreszierender Farbstoff der dieses gewährleisten soll ist Fluorescein-3`6`diacetat, bekannt als FDA. Erste Berichte über die Verwendung von FDA zur Überprüfung der Zellvitalität wurden 1966 durch ROTMAN & PAPERMASTER veröffentlicht. Ende der siebziger Jahre beschrieben SCHILLING et al. die Möglichkeiten einer Bestimmung der Vitalität durch FDA (SCHILLING & DÖPKE, 1978; SCHILLING et al., 1979; SCHILLING & SMIDT, 1979). Anhand des FDAVerfahrens kann einerseits die Integrität der Plasmamembranen, andererseits auch eine positive zytoplasmatische Enzymaktivität nachgewiesen werden. Im Anschluss an eine relativ kurze Inkubationsdauer im Fluoreszenzfarbstoff weisen lebende Embryonen nach einer UV-Anregung eine leuchtende, hellgrüne Farbe auf. Tote Embryonen dagegen lassen keine Reaktionen mehr erkennen. Nach Meinung der zu diesem Thema veröffentlichten Berichte, besteht nach einer Färbung keine Verringerung der in vitro-Weiterentwicklungsrate, verursacht durch Färbung und kurzfristige UV-Bestrahlung. 35 2.9.3 Beurteilung nach Fluoreszenzanfärbung durch Hoechst A 33342 Hinter dem Namen Hoechst A 33342 steht der Fluoreszenzfarbstoff Benzimid, genauer 2`-[4Hydroxyphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,5´bi-1H-bizimidazole. Das Fluorochrome Hoechst A 33342 ist ein DNA-spezifischer Farbstoff, mit dem es möglich ist, das Chromatin in Oozyten und Embryonen sichtbar zu machen. Durch diese Färbemethode kann im Anschluss an eine morphologische Beurteilung eine Aussage über die Anzahl aktiver Kerne und damit die Vitalität der Embryonen gemacht werden (VIUFF et al., 1991). Bei UV-Bestrahlung werden mitotisch aktive Kerne als leuchtend hellblaue und scharf umrandete Komplexe erkennbar. Kerne ohne Aktivität sind nur undeutlich und ohne klare Konturen schwach erkennbar. 36 3 Material und Methoden 3.1 Tiermaterial Die vorliegenden Untersuchungen wurden unter Verwendung dreier verschiedener Mäuseherkünfte durchgeführt: 1. 24 weibliche Tiere entstammten der Linie C57/B6 (Black) aus der Zucht des Max-Planck-Instituts für experimentelle Medizin. 2. 36 weibliche Tiere entstammten der Linie NMRI (Albino) aus der Zucht des Max-Planck-Instituts für experimentelle Medizin. 3. 72 weibliche Tiere entstammten der Linie NMRI (Albino) aus institutseigener Zucht. 3.2 Haltungsbedingungen Die Tiere wurden in einem 10 m2 großen klimatisierten Raum gehalten, in dem mittels Heizung und Klimaanlage die Temperatur bei 22°C bis 25°C gehalten wurde. Durch einen Luftbefeuchter und offene Wasserwannen wurde eine relative Luftfeuchte von 50 - 60 % erreicht. Das Lichtprogramm von je 12 Stunden Hell-/Dunkelphase wurde durch eine Zeitschaltuhr überwacht (Lichtphase von 7.00 bis 19.00 Uhr). Die für Versuchszwecke benötigten weiblichen Tiere wurden in Gruppen von mindestens zwei bis maximal zehn Tieren in Polycarbonatkäfigen von 17×23×14 cm Größe (Typ II) bzw. 23×39×15 cm Größe (Typ III) mit Stahldrahtdeckeln (Ebeco, Castrop-Rauxel) gehalten. Die männlichen Tiere wurden einzeln in entsprechenden Käfigen (17×23×14 cm) gehalten. Mindestens einmal wöchentlich wurden alle Tiere in frisch gereinigte Käfige mit frischer Sägespäne-Einstreu umgesetzt. Als ad-libitum-Fütterung war ein pelletiertes Mäusealleinfutter (Tab. 1, ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest) verfügbar. Trinkwasser erhielten die Tiere aus 25 ml Plastikflaschen mit Tränkdeckel, die mindestens einmal wöchentlich ausgetauscht wurden. 37 Tab. 1: Zusammensetzung Mäusealleinfutter Inhaltsstoff % Zusatzstoffe Menge Rohprotein 19,00 Vit.A 15.000 IE/kg Rohfett 3,30 Vit.D3 1.000 IE/kg Rohfaser 4,90 Vit.E 100 IE/kg Rohasche 6,70 CU 12 mg/kg 3.3 Medien Alle Chemikalien wurden, soweit in der Arbeit nicht anders ausgewiesen, von der Firma Sigma-Aldrich, Steinheim, bezogen und waren zellkulturgetestet. 3.3.1 Spülmedium Die zur Herstellung und anschließenden Aufbewahrung des Embryonenspülmediums M2 benötigten Glasgefäße wurden vor ihrer Verwendung zuerst mit 70 %igem Alkohol gereinigt und danach 5 x mit destilliertem Wasser aus- und abgespült und im Trockenschrank (BE 40, Memmert, Schwabach) bei 55°C getrocknet. Nach vollständiger Trocknung wurden sie mit Alufolie fest verschlossen und unter trockener Hitze im Sterilisator (U 50, Memmert, Schwabach) für mindestens 2h bei 200°C sterilisiert. Zur Herstellung des Spülmediums M2 wurden verschiede Anteile der Stammlösungen A, B, C, D, E (Tab. 2) und Reinstwasser (Ampuwa®, Fresenius, Bad Homburg) verwendet. 38 Tab. 2: Zusammensetzung der verwendeten Stammlösungen Stammlösung A (10-fach konzentriert) Komponente Menge g/100 ml NaCl 5,534 KCl 0,356 KH2PO4 0,162 MgSO4 × 7 H2O 0,293 Natriumlactat 4,349 Glucose 1,000 Penicillin (10.000 IE/ml) 1 ml Streptomycin (10.000 IE/ml) 1 ml Komponente Menge g/100 ml NaHCO3 2,101 Phenolrot 0,010 Komponente Menge g/100 ml Natriumpyruvat 0,036 Komponente Menge g/100 ml CaCl2 × 2 H2O 0,252 Komponente Menge g/100 ml HEPES 5,958 Phenolrot 0,010 Stammlösung B (10-fach konzentriert) Stammlösung C (100-fach konzentriert) Stammlösung D (100-fach konzentriert) Stammlösung E (10-fach konzentrier) Quelle: HOGAN et al., 1986; WHITTEN & BIGGERS, 1968; WHITTEN, 1971; WHITTINGHAM, 1971 39 Fertige Stammlösungen wurden unter der sterilen Werkbank (Mikrobiologische Sicherheitswerkbank Typ MRF, Steag Laminarflow-Prozeßtechnik, Pfullingen) in 100 ml-Flaschen mit einem Einmalfilter steril filtriert (Filtropur S 0,2 µm, Sarstedt, Nümbrecht) und die ersten 5 ml der Filtrationen jeweils verworfen. Anschließend wurden die Stammlösungen in sterile 1 ml-Eppendorfgefäße (Eppendorf, Hamburg) pipettiert und bei -18°C im Gefrierschrank gelagert. Die Stammlösungen A, D und E hielten sich aufgetaut bei +4°C über einen Zeitraum von drei Monaten, die Stammlösungen B und C jedoch nur eine Woche. Daraus ergab sich eine maximale Haltbarkeit des gebrauchsfertig angesetzten M2-Spülmediums von einer Woche bei +4°C. Den benötigten Stammlösungsanteilen entsprechend wurde das M2-Medium am Tag vor Gebrauch unter der sterilen Werkbank angesetzt und bis zur Verwendung bei +4°C aufbewahrt. Tab. 3: Zusammensetzung des Spülmediums M2 Komponenten Menge je 50 ml M2 Stammlösung A (5-fache Konzentration) 10,0 ml Stammlösung B (10-fache Konzentration) 0,80 ml Stammlösung C (100-fache Konzentration) 0,50 ml Stammlösung D (100-fache Konzentration) 0,50 ml Stammlösung E (10-fache Konzentration) 4,20 ml H2O (Ampuwa®) 34,0 ml BSA (Hitzeinaktiviert) 0,20 g Nach Ansetzten des Mediums wurde die Osmolalität ermittelt. Dabei soll die Osmolalität zwischen 270-302 mOsmol/kg-1 liegen (BOXBERGER, 2007). (Dieser Wert gibt bei Flüssigkeiten die Teilchenzahl der osmotisch aktiven Substanzen pro Kilogramm Lösemittel an. Die Osmolalität, also das dynamische Gleichgewicht von Wasser und Salzen ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Zellstruktur, die Anregung der Zellproliferation und muß daher möglichst genau eingehalten werden (BOXBERGER, 2007). Sie errechnet sich nach der Formel: X = Q × (a-b) × a (KOPF, 1988) 40 wobei Q = Mediummenge (ml) a = gemessene Osmolalität (mOsmol/kg-1) b = gewünschte Osmolalität (mOsmol/kg-1) X = Mediummenge (ml), die zur Korrektur entnommen und verworfen werden muß und durch hochreines Wasser ersetzt wird.) Fertiges M2-Medium (HEPES-gepuffert) wurde unter dem Laminarflow in sterile Flaschen filtriert (Filtropur S 0,2 µm, Sarstedt, Nümbrecht), mit autoklavierten Gummistopfen und Parafilm (American National Can TM , Greenwich) versiegelt und im Kühlhaus bei +4°C bis zur Verwendung am nächsten Tag aufbewahrt. (HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinthansulfonsäure) besitzt eine gute Pufferkapazität, hat allerdings in höheren Konzentrationen zytotoxische Effekte und ist stark von der Temperatur abhängig (BOXBERGER, 2007)) Vor der Verwendung wurde am Versuchstag mittels einer Glas-Elektrode (WTW pH-Elektrode SenTix 60, WTW, Weilheim i. OB) der pH-Wert des M2-Mediums gemessen (Digital-pH-Meter pH 525, WTW, Weilheim i.OB) und durch Zufügung von HCl bzw. NaOH auf pH 7,3 bis 7,4 eingestellt. Anschließend wurde das gebrauchsfertige Medium erneut in sterile 50ml-Glasflaschen filtriert, dann erst die BSA Komponente hinzugefügt und mit autoklavierten Gummistopfen und Parafilm verschlossen und im Wärmeschrank (Typ 85, Melag Brutschrank Incubat, Berlin) ohne CO2 Begasung auf 37°C erwärmt. 3.3.2 Kulturmedium Zur Kultivierung der aufgetauten Embryonen wurde gebrauchsfertig bezogenes Universal IVF Medium mit Phenolrot (Medicult a/s, DK-Jyllinge, Fa. Stefan Gück) verwendet. 41 Tab. 4: Zusammensetzung des Kulturmediums MediCult Universal IVF Medium Komponenten Earle’s Balanced Salts Solution (EBSS) Synthetic Serum Replacement (SSR®) (USA: ART Supplement) Human serum albumin (HSA) Glucose Sodium pyruvate Sodium bicarbonate Penicillin 50.000 IE/l Streptomycin 50 mg/l Phenolrot (Quelle: Fa. MediCult; Jyllinge; DK) 3.3.3 Kryoprotektivum Um Gefrierschäden an den Embryonen so gering wie möglich zu halten, wurde ein Gefrierschutzmedium mit den Substanzen Ethylenglycol (EG) (SigmaAldrich, Steinheim) und Saccharose (Sigma-Aldrich, Steinheim) verwendet. Ethylenglycol, als sehr leicht penetrierendes Protektivum, wurde in einer Konzentration von 1,5 Mol, Saccharose, als nicht penetrierendes Protektivum, in der Konzentration von 0,25 Mol zugefügt. Die nötigen Mengen an EG und Saccharose wurden unter dem Laminarflow zu M2-Medium zugegeben, mit einem Magnetrührer (Heidolph, Schwabach) gelöst, anschließend steril in Glasfläschen (20ml) filtriert (Filtropur S 0,2 µm, Sarstedt, Nümbrecht) und mit autoklavierten Gummistopfen und Parafilm verschlossen. Die Haltbarkeit des Kryoprotektivum beträgt bei +4°C maximal eine Woche, es wurde aber vor jeder Verwendung neu angesetzt. Bis zum Gebrauch wurde das Medium bei Raumtemperatur (RT) gehalten. 42 3.3.4 Auftaumedium Als jeweils frisch angesetztes Auftaumedium diente Universal IVF Medium (MediCult, DK-Jyllinge, Fa. Stefan Gück) versetzt mit 0,5 Mol Saccharose (SigmaAldrich, Steinheim). Die Menge an Saccharose wurde auf einer Feinwaage (2007 MP6, Sartorius, Göttingen) abgewogen und unter Rühren mit einem Magnetrührer in Universal IVF Medium gelöst. Das Auftaumedium wurde unter dem Laminarflow steril in 20ml Mediumflaschen filtriert. Gleich im Anschluss an den Filtrationsprozess wurden 350µl Auftaumedium in die Mitte einer Center-Well Schale (60×15mm, Falcon, Heidelberg) pipettiert; diese wurden auf dem 37°C warmen Werktisch (Easy Bench, Varolab, Giessen) (Abb. 1) erwärmt. Abb. 2: Werktisch mit integriertem Wärmebereich (Varolab, Giessen) und CO2 Kleininkubator C42 (Labotect) 3.3.5 Überschichtungsöl für Kultivierung- und Waschdrops Als Überschichtungsöl für das verwendete Kulturmedium diente Mineral-Öl (Sigma-Aldrich, Steinheim). Auf diese Weise wurde vermieden, dass MikroMedium-Drops austrocknen. Weiterhin können Kontaminationen durch die Ölbarriere reduziert werden. Es erfolgte 24 Stunden vor der Verwendung des Öles eine Ölwaschung zur Equilibrierung des Öles mit dem Medium. Das hatte zur Folge, dass eventuell vorhandene Schadstoffe im Öl in das Medium ausgewaschen wurden und gleichzeitig eine Anreicherung der fettlöslichen Vitamine aus dem Medium in das Öl erfolgte, so dass während der Kultivierungsphase die Vi43 tamine und essentiellen Aminosäuren tatsächlich den Embryonen zur Verfügung standen. Dazu wurde ein steriles 50ml Falcon-Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) mit 20ml MediCult Universal IVF Medium und 30ml Mineral-Öl unter sterilen Bedingungen befüllt. Anschließendes behutsames Schwenken des Röhrchens führte zu einer Vermischung beider Substanzen. Bis zum Gebrauch des Öles wurde das Röhrchen mit lockerem Deckel zur Equilibrierung und Entmischung der Phasen in den Brutschrank (C60, Labotect, Göttingen) bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter Luftfeuchte (LF) gestellt. 3.4 Behandlung der Embryonenspender Zur Embryonengewinnung wurden die Spendertiere hormonell einer Superovulation unterzogen. Dazu wurde den Weibchen im Alter von fünf bis 16 Wochen 47 Stunden vor dem Zusammensetzten der männlichen und weiblichen Tiere zur Auslösung einer Superovulation 7,5 IE eCG (equine chorionic gonadotropin, Intergonan, Intervet, Unterschleißheim) intraperitoneal (ip) an der Linea alba zur Follikelstimulation injiziert (Abb. 2). 5,0 IE hCG (human chorionic gonadotropin, Ekluton, Intervet, Unterschleißheim) wurden direkt vor dem Zusammensetzen der Tiere ip injiziert. Zu Beginn des Versuches wurde 24 Spendertieren um 17.00 Uhr eCG und 47 Stunden später um 16.00 Uhr hCG injiziert. Bei allen restlichen Tieren wurde die eCG-Gabe auf 15.00 Uhr und die hCG-Gabe auf 14.00 Uhr vorgezogen. Abb. 3: Ip-Injektion von eCG bzw. hCG 44 Da nach EDWARDS & GATES (1959) die Ovulation ungefähr 12 Stunden nach Verabreichung des hCG erfolgt, wurden die Embryonenspender im direkten Anschluss an die ip Injektion von 5,0 IE hCG einzeln zu einem Bock im Alter von drei bis elf Monaten zur Verpaarung gesetzt. Bei allen weiblichen Tieren kamen Böcke der NMRI-Linie aus MPI-Herkunft oder institutseigener Zucht zum Einsatz. Die Verpaarung erfolgte in der anschließenden Nacht. Am folgenden Morgen konnte als Beweis für eine erfolgreiche Bedeckung bei den gedeckten Weibchen ein Ejakulationspfropf (Vaginal-Plaque, VP) gefunden werden. Für diese Kontrolle wurden die Spendertiere auf das Käfiggitter gesetzt und am Schwanz angehoben. Der VP zeichnete sich als weißlich-gelblicher, harter Pfropf im vorderen Abschnitt der Vagina ab (Abb. 3). 1) 2) Abb. 4: Vaginal-Plaque: 1) positiv und 2) negativ am Morgen nach erfolgter Bedeckung Ein VP bildet sich etwa 20 bis 30 Minuten nach dem Deckakt, ist für ca. 12 Stunden sichtbar und besteht aus Seminalplasma und abgeschilferten Zellen der Vaginalschleimhaut (HEINEKE & KLAUS, 1975). Da der Deckakt in der Regel in der zweiten Hälfte der Dunkelphase stattfindet, ist der VP bis zum nächsten Morgen zu erkennen. Beim vorliegenden Versuch fand die VP-Kontrolle und Markierung der 'VP+'-Tiere im Zeitraum von 8.00 bis 9.00 Uhr an dem auf die Verpaarung folgenden Morgen statt. Als Tag 1 der Embryonalentwicklung wurde der Tag gewertet, am dem der VP zu erkennen war (Tab. 5). Alle Tiere, sowohl VP+ also auch VP-, wurden bis zur Embryonenspülung drei Tage später in ihren gewohnten Gruppen gehalten, um für die Tiere keinen unnötigen Stress zu erzeugen. 45 Tab. 5: Behandlungsschema zur Gewinnung von Mäuseembryonen Entwicklungsstadium der Lokalisation der Embry- Embryonen onen 1- Zeller Eileiterampulle +2 2- bis 4- Zeller Eileiter +3 8- Zeller bis frühe Morula Eileiter und Uterushorn Morula bis Blastocyste Uterushorn Tag Behandlung -2 eCG -1 ― 0 hCG + ♂ +1 VP- Kontrolle +4 OP (Spülen) 3.5 Gewinnung der Embryonen In Abhängigkeit vom gewünschten Entwicklungszustand der Embryonen sind unterschiedliche Spülzeiten und -orte zu beachten (s. Tab. 5). Um eine hohe Überlebensrate der Embryonen nach dem Auftauen zu gewährleisten, sollten die Stadien späte Morula bis späte Blastocyste verwendet werden (TAO et al., 2001). Aus diesem Grund erfolgte die Embryonengewinnung am vierten Trächtigkeitstag zwischen 10.00 und 12.00 Uhr. Die Tiere wurden durch zervikale Dislokation getötet (Abb. 4) und auf einer 37°C warmen Wärmeplatte (MEDAX SP14, MEDAX Nagel GmbH, Kiel) in Rückenlage positioniert. Das Operationsfeld wurde mit 70%igem Alkohol desinfiziert, auch um zu verhindern, dass Fellbestandteile in die Operationsöffnung gelangen (RAFFERTY, 1970). Durch einen quer zur Linea alba in Höhe der Kniegelenke verlaufenen Hautschnitt wurde der Bauchraum geöffnet und durch manuelles Reißen großflächig eröffnet (Abb. 5). 46 Abb. 5: Zervikale Dislokation Abb. 6: Eröffnete Bauchhöhle Darm und Bauchfett wurden seitlich verlagert, die beiden Uterushörner, als weißlich bis rötliche Stränge erkennbar, freipräpariert und mit einer zweiten sterilen Schere und sterilen Pinzette angehoben. Fettgewebe wurde vorsichtig abgetrennt und die Uterushörner mit der Schere zwischen Ovidukt und Ovar, sowie an der Bifurcatio uteri, entfernt. Anschließend wurden die Uterushörner in einer Petrischale (35×10mm, Greiner, Frickenhausen) in 2 ml frischem, sterilfiltriertem Spülmedium M2 auf einer 37°C warmen Wärmeplatte (MEDAX Nagel GmbH, Kiel sowie HT 200, Minitüb, Landshut) gelagert. Direkt vor dem Spülprozeß wurden die Uterushörner zweimal in frischem M2Medium gespült, um eventuell noch anhaftende Verunreinigungen zu entfernen. Der Eileiter wurde unter dem Stereomikroskop (M8, Wild, Heerebrugg, Wetzlar) 47 bei 100- bis 200-facher Vergrößerung mit einer sterilen Pinzette fixiert und mit einer Skalpellklinge abgetrennt. Das Ausspülen der Embryonen erfolgte dann in einer Petrischale (35×10mm, Greiner, Frickenhausen) unter Kontrolle des Stereomikroskops auf der auf 37°C eingestellten Heizplatte bei 300-facher Vergrößerung. Dazu wurde das zu spülende Uterushorn mit einer Pinzette fixiert und nach Einführung der, auf eine 2ml Einwegspritze (B-D Plastipak®, Becton Dickinson, Irland) aufgesetzten Kanüle (0,3×1,0 cm, 2R2, Unimed, CH-Lausanne), von der Hornspitze in Richtung Uteruskörper mit 1,0ml M2-Medium durchspült. Die Spülflüssigkeit wurde in einer Petrischale (35×10mm, Greiner, Frickenhausen) aufgefangen und nach einer kurzen Verweildauer unter dem Stereomikroskop bei 200- bis 500-facher Vergrößerung auf vorhandene Embryonen durchsucht. Alle gewonnenen Embryonen wurden nach morphologischen Kriterien (Kap. 2.9.1) beurteilt und die als gefriertauglich befundenen anschließend in einer mit 2 ml frischem Spülmedium (37°C) gefüllten Petrischale gesammelt und bis zum Einfrieren im Wärmeschrank (Typ 85, Melag Brutschrank Incubat, Berlin) bei 37°C und gesättigter LF verwahrt. Während des gesamten Versuches dienten zur Handhabung der Embryonen, über einem Bunsenbrenner fein ausgezogene, sterile Pasteurpipetten, die an einen etwa 50 cm langen Mundschlauch aus Silikon und zwischengeseztem Einmalfilter adaptiert wurden. 3.6 Beurteilung der gewonnenen Embryonen Da nach ATTRODT (1985) die Qualität der Embryonen ein wichtiges Kriterium für die späteren Trächtigkeits- und Überlebensraten ist, sollten nach Möglichkeit nur gute und sehr gute Embryonen kryokonserviert werden. Im Anschluss an eine Kontrolle unter dem Stereomikroskop bei 500-facher Vergrößerung erfolgte, je nach Erscheinungsbild, die Klassifizierung der gefundenen Embryonen (Morulae und Blastozysten) in: 1. „gefriertauglich“: Embryonen, die im gewünschten Entwicklungsstadium waren und intakte Morphologie, intakte Zona pellucida, gleichmäßige Form und Struktur und gleichmäßiger Färbung aufwiesen. 48 oder 2. „nicht gefriertauglich“: Embryonen, entweder nicht im gewünschten Entwicklungsstadium und/oder mit morphologisch erkennbaren Abweichungen (z.B. Vakuolenbildung, defekte Zona pellucida, Unterschiede in den Blastomeren). 3.7 Einfrieren der Embryonen Für das Einfrieren der Embryonen fanden zwei programmgesteuerte Gefrierautomaten Verwendung. Zu Beginn der Versuche wurde die Anlage der Firma Haake (Kryosta, Typ F-3Q, Haake, Berlin) mit angeschlossenem Programmgeber (Typ PG 20, Haake, Berlin) (Abb. 6) verwendet. Als Kühlflüssigkeit diente für dieses Gerät 70%iges Ethanol. Im weiteren Verlauf des Versuches wurde auf Grund der vereinfachten Handhabung auf das Einfriersystem BV 65/55 (Consartic, Schöllkrippen), bestehend aus Temperaturregler CL 5500, Gefrierkammer FC5AT und Cryobad (alle Einheiten: Consartic, Schöllkrippen), gewechselt (Abb. 7). Als Kühlflüssigkeit wurde in diesem Fall flüssiger Stickstoff (LN2) verwendet. Abb. 7: Einfriersystem Firma HAAKE, Berlin Abb. 8: Einfriersystem Firma CONSARTIC, Schöllkrippen 49 3.7.1 Standartgefrierverfahren Mittels des Standartgefrierverfahrens wurden die als gefriertauglich eingeordneten Embryonen unter Verwendung des Kryoprotektivums (1,5 Mol EG und 0,25 Mol Saccharose in M2-Medium) eingefroren Dazu wurde die Embryonen mit der Mundpipette unter dem Stereomikroskop aus dem M2-Medium herausgenommen und in 10er-Gruppen in eine mit 350 µl Gefrierschutzmedium gefüllte Center-well-Schale (60×15mm, Falcon, Heidelberg) umgesetzt. 3.7.1.1 Haake Bei Verwendung des HAAKE-Einfrierautomaten verblieben die Embryonen für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf der 37°C warmen Wärmeplatte (HT 200, Minitüb, Landshut) zum Equilibrieren im Kryoprotektivum. Kurz vor Ablauf dieser Frist erfolgte das Aufziehen der equilibrierten Embryonen auf mit Entwicklungsstadium, Spezies, Spültag und Stückzahl gekennzeichnete 0,25 ml Kunststoffpailletten (Minitüb, Landshut) (Abb. 9). Dazu wurde zunächst eine Mediumssäule von etwa 2cm, gefolgt von einer 1cm langen Luftsäule aufgenommen. Als nächstes kam das die Embryonen beinhaltende Kryoprotektivum, wiederum gefolgt von einer 1cm langen Luftblase und einer abschließenden Mediumssäule. Die letzte Kryoprotektivumssäule wurde solange aufgezogen, bis am oberen Ende der Stopfen erreicht war. Die Luftblasen übernehmen dabei die Funktion eines Puffers und verhindern dadurch sowohl das Ansaugen der Embryonen in den Stopfen, als auch ein versehentliches Kristallisationspunktsetzen im Embryonen beinhaltenden Medium (Abb. 8). 50 Versiegelungskitt Medium mit Embryonen Kristallisationskeim Stopfen setzen ....... Luftblase Luftblase Abb. 9: Befüllungsschema Kunststoffpaillette Abb. 10: Kunststoffpaillette mit Entwicklungsstadium, Spezies, Spültag und Stückzahl Die Pailletten wurden abschließend am unteren Ende mit HämatokritVersiegelungskitt (Brandt, Wertheim) fest verschlossen und anschließend senkrecht in das auf -6°C vorgekühlte Alkoholbad des Einfrierautomaten gegeben. Nach fünf Minuten erfolgte manuell die Kristallisationsauslösung (Seeding). Dieses geschah am oberen Ende der Paillette, am zwischen Stopfen und Luftblase eingeschlossenen Gefriermediumssegment, durch kurzes Berühren mit einer in LN2 gekühlten Metallpinzette. Als Kontrolle für korrektes Seeding war eine sich vom Berührungspunkt ausgehende Kristallisation zu beobachten. Im Anschluß an das Seeding wurde die Temperatur noch für fünf weitere Minuten bei -6°C gehalten. Nach dem Umstellen auf den externen Programmgeber und starten desselben wurde das Alkoholbad mit einer konstanten Kühlrate von 0,3°C/min nun auf -32°C heruntergekühlt und nach Erreichen dieser Temperaturstufe für 10 Minuten dort gehalten. Danach erfolgte mit einer in LN2 gekühlten Metallpinzette die direkte Umsetzung der Embryonen in LN2 zur weiteren Lagerung. 3.7.1.2 Consartic Bei Verwendung des CONSARTIC-Einfrierautomaten verblieben die Embryonen für 7 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf der 37°C warmen Wärmeplatte 51 (HT 200, Minitüb, Landshut) zum Equilibrieren im Kryoprotektivum. Kurz vor Ablauf dieser Frist erfolgt auch hier nach dem gleichen Prinzip das Aufziehen der equilibrierten Embryonen auf mit Entwicklungsstadium, Spezies, Spültag und Stückzahl gekennzeichnete 0,25 ml Kunststoffpailletten. Die Pailletten wurde ebenfalls mit Hämatokrit-Versiegelungskitt verschlossen und in die, auf 20°C gehaltene, Gefrierkammer gegeben. Durch drücken der Taste „Run“ am Programmgeber startete das Gefrierprogramm. Die Temperatur wurde mit konstant 2°C/min von +20°C auf -6°C abgesenkt. Nach Erreichen von -6°C und Halten dieser Temperatur für fünf Minuten erfolgte das manuelle Seeding durch Berührung mit einer in LN2 gekühlten Metallpinzette und anschließendes Halten der Temperatur auf -6°C für weitere fünf Minuten. Im Folgenden wurde bei einer konstanten Kühlrate von 0,3°C/min die Temperatur im Inneren der Gefrierkammer auf -32°C heruntergekühlt und nach Erreichen dieser Temperaturstufe für zehn Minuten dort gehalten. Danach wurde die Temperatur im freien Fall auf -163°C abgesenkt; von dieser Stufe aus fand die direkte Umsetzung der Embryonen in LN2 statt. Bei allen folgenden Handgriffen wurden die Kunststoffpailletten ausschließlich mit einer in LN2 gekühlten Metallpinzette am Verschlussstopfen angefasst, um so eine Erwärmung zu vermeiden. Tab. 6: Schema Gefrierprogramm Programmschritt Haake Consarctic Equilibrieren Embr. RT 20 Min. 7 Min. Einsetzen in Kryostat ― × Kühlen auf -6°C × -2°C/min Einsetzen in Kryostat × ― Halten bei -6°C 5 Min. 5 Min. Seeding × × Halten bei -6°C 5 Min. 5 Min. Kühlen auf -32°C -0,3°C/min -0,3°C/min Halten bei -32°C 10 Min. 10 Min. Umsetzen in LN2 × ― Freier Fall auf -163°C ― × Umsetzen in LN2 ― × 52 3.8 Zwischenlagerung der eingefrorenen Embryonen Es wurden insgesamt 573 Embryonen eingefroren. Diese Summe teilte sich in 413 Blastocysten und 160 Morulae auf. Die Unterteilung erfolgte in drei Gruppen (Kontrolle, -18°C, -79°C), die verschiedenen Versuchstemperaturen zu geordnet waren. So weit es Mengenmäßig möglich war, wurden den jeweiligen Gruppen pro Versuchsdurchgang sowohl Blastocysten als auch Morulae eines Embryonen-Spültages zugeordnet. Gruppe Kontroll-Embryonen: Diese Embryonen wurden als Kontrollgruppe verwendet. Sie verblieben bis zu dem Zeitpunkt, an dem auch die übrigen Embryonen des Durchganges kultiviert wurden in LN2. Gruppe -18°C-Embryonen: Embryonen aus dieser Gruppe lagerten für die Zeitspanne von 60 Minuten bei -18°C in der Gefrierzelle. Dazu wurden die Pailletten in einem mit LN2 gefüllten Styroporbehälter in die Gefrierzelle gebracht, mit einer in LN2 gekühlten Metallpinzette herausgenommen und in einen temperierten offenen Styroporkasten gelegt. Hier verblieben sie ab Ablegungszeitpunkt für 1 Stunde. Gruppe -79°C-Embryonen: In dieser Gruppe überdauerten die Embryonen für eine Stunde in Trockeneis bei -79°C. Dazu wurden mit einer heißen Zange Rillen in die, in einem vorgekühlten Styroporkasten mit Deckel, gelagerten Trockeneisplatten hineingebrannt. Um ein gleichmäßiges Liegen der Pailletten zu gewährleisten, waren die Rillen geringfügig länger als die Pailletten. Anschließend wurden die Pailletten mit der in LN2 gekühlten Metallpinzette angefasst und in den fertigen Rillen abgelegt. Eine zweite Trockeneisplatte übernahm die Funktion eines Deckels. So sollte erreicht werden, dass die Pailletten, ohne gequetscht zu werden, von allen Seiten gleichmäßig bei -79°C lagerten. Ab dem Moment des Auflegens der oberen Trockeneisplatte lief die Zwischenlagerungsdauer von 60 Minuten. Um ein schnelles Verdunsten des Trockeneises zu verhindern wurde dieses ebenfalls in die auf -18°C gekühlte Gefrierzelle gebracht. 53 Nach Ablauf der Zwischenlagerung von 60 Minuten wurden die Pailletten zum Auftauen aus dem jeweiligen Lagerungsumfeld entfernt. Im Falle der Gruppe K erfolgte die Herausnahme aus dem flüssigen Stickstoff. Abb. 11: Zwischenlagerung bei -79°C (li.) und -18°C (re.) 3.9 Auftauen der Embryonen Das Auftauen der Embryonen erfolgte nach einer Stunde Zwischenlagerung bei -18°C bzw. -79°C oder im Falle der Kontrollgruppe ohne Zwischenlagerung direkt aus -196°C kaltem flüssigen Stickstoff (LN2) heraus. Dazu wurden die Pailletten zunächst für ca. fünf Sekunden bei Raumtemperatur in der Luft geschwenkt und dann vorsichtig für 20 bis 30 Sekunden in ein 36,6°C bis 37,0°C warmes Wasserbad getaucht. Anschließend wurden die Pailletten mittels eines Kleenex (KIMTECH Science, Kimberley-Clark ® Professio- nal) trockengewischt. Über einer Petrischale (35×10mm, Greiner, Frickenhausen) wurde zunächst mit einer Schere das untere Ende der aufgetauten Paillette abgeschnitten, anschließend unter leichter Schräghaltung der Paillette das obere Ende. Das Gefriermedium mit den Embryonen konnte dadurch herauslaufen. Der in der Paillette verbleibende Rest wurde unter Zuhilfenahme einer 1ml-Luer-Einwegspritze (B-D Plastipak®, Becton Dickinson, Irland) mit aufgesetzter Pipettenspitze vorsichtig herausgeblasen. Die wiedergefundenen Embryonen wurden unter dem Stereomikroskop (SZ 11, Olympus, Hamburg) bei 110-facher Vergrößerung mit einer ausgezogenen ste54 rilen Glaspipette aufgenommen und schnellstmöglich aus dem Gefriermedium heraus in das Auftaumedium umgesetzt. In diesem verblieben sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten zum equilibrieren. 3.10 In vitro Kultivierung der Embryonen Alle gewonnenen und kryokonservierten Embryonen wurden im Anschluss an das Auftauen und Ausverdünnen des Kryoprotektivums für 48 Stunden bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter LF kultiviert. Nach Entnahme aus dem Auftaumediummedium erfolgte ein fünfmaliges Waschen in Mineralöl überschichteten MediCult Universal IVF Medium-Drops (Abb. 11), die zuvor für 24 Stunden bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter LF im Brutschrank (C60, Labotect, Göttingen) equilibriert worden waren. Im Anschluss daran wurden die Embryonen einzeln oder maximal zu zweit in die Drops der endgültigen Kultivierungspetrischalen (85×15mm, Greiner, Frickenhausen) (Abb. 12) übergesetzt. Diese waren ebenso wie das Waschmedium vorher zur 24-stündigen Equilibrierung bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter LF in den Brutschrank (C60, Labotect, Göttingen) (Abb. 13) gegeben worden. In diesem fand auch die sich anschließende in vitro Kultivierung statt. Abb. 12: Waschschale mit fünf Medium-Waschdrops unter Öl 55 Abb. 13: Kultivierungsschale mit 10 Kultivierungs-Mediumdrops unter Öl Abb. 14: Inkubator C60, Labotect, Göttingen (Quelle: Labotect, Göttingen) Die Embryonen wurden jeweils im Abstand von 12 Stunden auf die Weiterentwicklung kontrolliert. Dieses Schema ermöglichte eine gute Verfolgung der weiteren Entwicklung. 3.11 Beurteilung von Embryonen 3.11.1 Morphologische Beurteilung In dieser Arbeit wurden Embryonen in der ersten Phase lediglich lichtmikroskopisch beurteilt, am Ende zusätzliche einer fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung mit FDA und Hoechst unterzogen. Die erste morphologische Beurteilung erfolgte gleich bei der Gewinnung der Embryonen. Für die Versuche zuge- 56 lassen wurden die Stadien Morula und Blastozyste. Als nicht zulässig galten jüngere Stadien, degenerierte Embryonen sowie unbefruchtete Eizellen. Die nächsten morphologischen Klassifizierungen der Embryonen erfolgten bereits während der Rehydrierungsphase im Auftaumedium sowie während des Waschens. Die Weiterentwicklung der Embryonen in vitro bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter LF im Brutschrank C60 (Labotect, Göttingen) wurden nach 12/24/36/48 Stunden unter dem Stereomikroskop (SZ 11, Olympus, Hamburg sowie Axio Observer. A1, ZeissMicroImaging GmbH, Göttingen) 50- bis 200-facher Vergrößerung kontrolliert. Die Morula- Embryonen wurden eingeteilt in: Grade I • „Sehr gut“: Embryonen mit guter Morphologie und Entwicklungsgeschwindig- keit. Die Blastomeren sind gleichmäßig in Form und Farbe und haben eine hervorragende Erscheinung mit intakter Zona pellucida. Grade II • „Gut“: Dem Entwicklungsstand entsprechende Embryonen mit geringfügigen Abweichungen und Unregelmäßigkeiten in der morphologischen Beschaffenheit (z.B. einzelne ausgeschleuste Blastomeren, geringe Vesikelbildung, unregelmäßige Zellformen, Farbveränderungen). Grade III • „Mäßig“: gewisser Grad an Veränderungen (z.B. Schäden an der Zona pellucida, mehrere ausgeschleuste Blastomere, geringe Vakuolenbildung in den Blastomeren). Grade IV • „Degeneriert und retardiert“: Embryonen mit starken Abweichungen in der morphologischen Beschaffenheit ((keine Rehydrierung, starke Zelllysis, zerfallene Blastomere mit Vakuolen sowie dunklen Punkten, verlorene Zona pellucida, kollabierte Embryonen). 57 Die Blastozysten – Embryonen wurde eingeteilt in: Grade I • „Sehr gut“: Gut expandierte Embryonen mit gut cavertiertem Blastocoel sowie sehr guter Differenzierung zwischen ICM und Tropfektoderemzellen, die eine sichelförmige Struktur haben. Die Zona pellucida ist ausgedünnt (Abb. 14a). Grade II • „Gut“: Embryonen mit geringerem Durchmesser und reduzierter Blastocoelbildung und kaum verdünnter Zona pellucida (Abb. 14b). Grade III • „Mäßig“: Embryonen ohne Ausdünnung der Zona pellucida und einem insgesamt dunklen Erscheinungsbild durch beginnende Degenerationen der Zellen (Abb. 14c). Grade IV • „Degeneriert und retardiert“: Embryonen mit starken Abweichungen in der morphologischen Beschaffenheit (keine Rehydrierung, starke Zelllysis, zerfallene Blastomere mit Vakuolen sowie dunklen Punkten, verlorene Zona pellucida, kollabierte Embryonen) (Abb.14d+e). 58 a) c) b) d) e) Abb. 15: Embryo a) "Sehr gut", b) "Gut", c) "Mäßig", d) degeneriert, e) retardiert Zusätzlich erfolgte während der gesamten Kultivierungsdauer die Einteilung des Entwicklungsverlaufes in die Gruppen 1. „kompaktierend“: Übergangsstadium von Morula zu Blastocyste 2. „expandierend, Beginn“: beginnende Expandierung der Blastocyste 3. „expandierend“: deutliche, aber noch nicht abgeschlossene Expandierung der Blastocyste 4. „expandierend - “: deutliche, aber weniger stark ausgeprägte oder gleichmäßige Expandierung der Blastocyste 5. „expandierend ! “: deutliche, nahezu abgeschlossene Expandierung der Blastocyste 6. „schlüpfend“: sich öffnende Zona pellucida mit Freisetzung Embryo (Abb. 15a) 7. „geschlüpft“: Embryo der die Zona pellucida verlassen hat (Abb. 15b) 8. „kollabiert“: zusammengefallener Zellverband der Blastocyste 9. „degeneriert“: zerfallene Blastomere, sehr viele degenerierte Zellen, sehr stark geschrumpfte innere Zellmasse oder Vakuolenbildung, Zelllysis 59 a) b) Abb. 16:a) Schlüpfende Blastocyste, b) Geschlüpfte Blastocyste 3.11.2 Kombinierte FDA-Hoechst-Färbung zur Zytoplasmaaktivitätsbestimmung und Kernzählung Die FDA-Färbung (3,6-Diacetoxyfluoran, SIGMA-ALDRICH, Steinheim) ist eine Möglichkeit, tote von lebenden Embryonen zu unterscheiden. Lebende Embryonen leuchten in einem sehr hellen Grün (Abb. 16a), während tote Embryonen keine oder nur noch kaum sichtbare Signale aussenden (Abb. 16b) (SCHILLING & DÖPKE, 1978; SCHILLING et al., 1979; SCHILLING & SMIDT, 1979). Die zu färbenden Embryonen wurden zunächst dreimal in 37°C warmen MediCult Universal IVF Medium gewaschen und dann in FDA-haltiges MediCult Universal IVF Medium gegeben. Für die FDA-Lösung wurde zunächst eine FDAStammlösung von 5mg FDA/ml Aceton (Merck, Darmstadt) angesetzt. Diese wurde auf eine Verdünnung von 2µl/2ml MediCult Universal IVF Medium gebracht (DIDION et al., 1990). Von der Verdünnung wurden anschließend 10µl abgenommen und in einen Mediumdrops von 50µl eingeben. Die Embryonen wurden darin für jeweils 1,5 Minuten auf der 37°C warmen Werkbank inkubiert. Daran anschließend erfolgte eine erneute dreimalige Waschung in MediCult Universal IVF Medium. Im nächsten Schritt wurden die Embryonen zur Anfärbung der mitotisch aktiven Kerne in eine Hoechst-Farbstoff H 33342 (Sigma-Aldrich, Steinheim) enthaltende Lösung umgesetzt. Aktive Kerne strahlen daraus folgend in leuchtendem Hellblau. Inaktive tote Kerne zeigen keine Antwort mehr (Abb. 17) (VIUFF et al., 1991). Auch hier wurde zunächst eine Stammlösung in der Dosierung von 1mg Hoechst H 33342/ml Aqua dest. (PURSEL et al., 1985) angesetzt. Diese wurde 60 dann auf 10µl/50µl MediCult Universal IVF Medium verdünnt. Zum Inkubieren blieben die Embryonen im Hoechst-Farbstoff zwei Minuten auf der 37°C warmen Werkbank. An diesen Schritt schloss sich wiederum ein dreimaliges Waschen in MediCult Universal IVF Medium an. Zur nachfolgenden mikroskopischen Beurteilung wurden die Embryonen auf einen Objektträger, auf den vorher zwei Vaseline-Streifen (Weißes Vaselin Lichtenstein DAB, Lichtenstein, Mülheim-Kärlich) aufgebracht waren, mittig positioniert und mittels eines Deckgläschens fixiert. Dabei war darauf zu achten, dass die Embryonen nur leicht angequetsch wurden. Die FDA-Beurteilung wurde bei 100-facher (für Photographien) bzw. 400-facher Vergrößerung mit einem Axioskop (Axioskop, Zeiss, Göttingen), Filtersatz 09 (Zeiss, Göttingen), einer Anregung von 450-490nm (BP Erregerfilter) und einer Emission von 520nm (Interferenzfilter FT 510, Sperrfilter LP 520) vorgenommen. Die Klassifizierung durch Hoechst-Färbung erfolgte ebenfalls bei 100-facher bzw. 400-facher Vergrößerung auf dem Axioskop (Axioskop, Zeiss, Göttingen) unter Verwendung des Filtersatzes 02 (Zeiss, Göttingen), der Anregung von 365nm (Erregerfilter G 365) und einer Emission von 420nm (Interferenzfilter FT 395, Sperrfilter LP 420). a) b) Abb. 17: Aktives (a) bzw. inaktives (b) Zytoplasma - Feststellung mittels FDA Abb. 18: Lebende und tote Kerne - Sichtbarmachung mittels Hoechst H 33342 61 3.12 Geräte und Gerätekontrolle Der für die Kontrollen genutzte Arbeitsplatz zeichnet sich durch eine Edelstahlwerkbank mit großem integriertem Wärmefeld aus (Easy Bench, Varolab, Giesen). Abb. 19: Arbeitsplatz mit Kleininkubator C42 (Easy Bench, Varolab, Giessen; C42, Labotect, Göttingen) Ein kleiner Brutschrank (C 42, Labotect, Göttingen) mit 6% CO2, 37°C und gesättigter LF sorgte auch in diesem Bereich für eine adäquate Zwischenkultur, so dass die Embryonen kaum einem Kultivierungstress unterlagen. Abb. 20: Kleininkubator C42 (Labotect, Göttingen) 62 Alle Werte der Inkubatoren und Wärmefelder wurde in dreitägigem Rhythmus mit dem Messgerät In Control 1050 (In Control1050, Labotect, Göttingen) auf Genauigkeit kontrolliert. Abb. 21: Messgerät In Control 1051 (Labotect, Göttingen) (Quelle: Labotect, Göttingen) Zur Temperaturmessung wurde der Temperaturfühler in den Innenraum des Brutschrankes gehängt, die innere und äußere Tür geschlossen und das Messprogramm gestartet. Nach gleicher Verfahrensweise erfolgte auch die Messung des CO2-Gehalts. Zur Überprüfung der relativen Luftfeuchte wurde an dem für externe Probenentnahmen vorgesehenen Anschluss (Sample port) ein Silikonschlauch mit zwischengeschalteter Kondensationsfalle angeschlossen und das Messprogramm gestartet. Bei Abweichungen des Istwertes von Sollwert erfolgte die entsprechende Korrektur in der Programmierung des Brutschrankes. Einmal wöchentlich erfolgte die Reinigung der Inkubatoren um möglichen Keimbefall zu eliminieren. Dazu wurden die zuvor ausgeräumten Geräte innen mit Fermacidal® D (Fermacidal® D, IC Products SA, CH-Minusio, Vertrieb Labotect, Göttingen) ausgewischt. Der Inkubator C42 wurde mit neuem, zweifach destilliertem Wasser aufgefüllt, in das vier Hübe Fermacidal® D gegeben wurden. Bei dem mit aktiver Sterilbefeuchtung ausgestatteten Brutschrank C60 wurde der externe Wasservorratsbehälter auf seinen Füllstand kontrolliert und gegebenenfalls aufgefüllt. 63 3.13 Photographien Die Bilder während der Entwicklungskontrollen wurden mit dem Zeissmikroskop Axio Observer. A1 (ZeissMicroImaging GmbH, Göttingen) (Abb. 22) bei 200- bis 400-facher Vergrößerung und bei den Fluoreszenzaufnahmen mit dem Axioskop (Zeiss, Göttingen) bei 100-facher Vergrößerung unter Verwendung von Octax EyeWare™ Imaging Software (Octax, Herborn-MTG Altendorf) aufgenommen. Abb. 22: Verwendeter Zeiss Axio Observer A1 (Mitte) (Quelle: Zeiss, Göttingen) 3.14 Statistische Auswertung Die Ergebnisse und Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den Versuchsgruppen (-18°C und -79°C) hinsichtlich Überlebens- und Weiterentwicklungsrate wurden mit Hilfe des SAS-Programms 9.1 berechnet und auf Signifikanzen mit dem Chi-Tests überprüft. 64 4 Ergebnisse 4.1 Superovulation Es wurden 132 weibliche Mäuse im Alter von vier bis neun Wochen mittels der Hormone eCG und hCG stimuliert. 83 Tiere (62,9 %) wiesen am Morgen nach der Zusammensetzung mit dem Bock bei der Kontrolle auf eine erfolgte Bedeckung einen Vaginal-Plaque (VP) auf. Unabhängig davon ob die Tiere einen VP aufgewiesen hatten, wurden sie drei Tage nach der Bedeckung getötet und die Embryonen gespült. Dieses Vorgehen wurde gewählt, da Erfahrungen der Arbeitsgruppe ergeben hatten, dass auch Tiere ohne VP verwendbare Embryonen liefern können. Von den 132 Spendermäusen hatten 80 ovuliert, das entspricht 60,6 % der hormonell stimulierten und 96,4 % der positiv auf einen VP kontrollierten Tiere. 4.2 Embryonengewinnung, -stadium und -qualität Die 132 gespülten Mäuse ergaben insgesamt 1023 Eizellen und Embryonen. Das ergibt ein Mittel von 7,8 Eizellen und Embryonen je gespülter Maus (SD 12,2; Spanne: 0 bis 57). Wurden nur die Mäuse zur Berechnung herangezogen, die ovuliert hatten, ergab sich ein Mittelwert von 12,8 Eizellen und Embryonen pro Maus (SD 13,49; Spanne 0 bis 57). Die zahlenmäßige Verteilung der insgesamt gewonnenen Eizellen und Embryonen ist Tabelle 7 zu entnehmen. 65 Tab. 7: Entwicklungsstadium und Verteilung gewonnener Eizellen und Embryonen Entwicklungsstadium Anzahl % Blastocyste 531 51,9 Morula 279 27,3 Degenerierter Embryo 91 8,9 Unbefruchtete Eizelle 88 8,6 Sonstiges Stadium 34 3,3 Summe 1023 100 Von den insgesamt 531 gewonnenen Blastocysten wurden 410 (77,2 %) als gefriertauglich bewertet. Von den 279 Morulae wurden 167 (59,9 %) als gefriertauglich beurteilt. Das bedeutet, dass pro behandelter Maus 3,1 gefriertaugliche Blastocysten und 1,3 gefriertaugliche Morulae gewonnen wurden. Pro ovulierter Maus ergab das im Mittel 5,1 gefriertaugliche Blastocysten sowie 2,1 gefriertaugliche Morulae. Insgesamt wurden 577 Embryonen kryokonserviert. 4.3 Zwischenlagerung Die Kontrollgruppe umfasste 164 Embryonen, die sich aufteilten auf 109 Blastocysten (Bl.) und 55 Morulae (Mo.). Insgesamt 172 Embryonen (127 Bl., 45 Mo.) wurden bei -18°C zwischengelagert, weitere 170 (130 Bl., 40 Mo.) bei -79°C. Überdies wurden 55 Embryonen (31 Bl., 24 Mo.) einer Zwischenlagerung von 72 Stunden bei -18°C, bzw. -79°C ausgesetzt oder als Kontrollgruppe verwendet. Sechzehn Embryonen (13 Bl., 3 Mo.) waren bereits im Vorfeld aufgetaut worden, um an ihnen die Technik des Auftauens zu üben. 66 4.4 In vitro Kultivierung Für die Untersuchungen wurden insgesamt 430 Embryonen (309 Bl., 121 Mo.) kultiviert. Diese teilten sich in 140 Embryonen (91 Bl., 49 Mo.) der Kontrollgruppe, 142 (107 Bl., 35 Mo.) bei -18°C und 148 (111 Bl., 37 Mo.) bei -79°C gelagerte Embryonen auf. Die Ergebnisse der in vitro Kultivierung von bei -18°C bzw. -79°C zwischengelagerten Embryonen sowie für die Embryonen der Kontrollgruppe sind den Tabellen 8 und 9 zu entnehmen. 67 Tab. 8: Ergebnisse der in vitro Kultivierung von bei -18°C bzw. -79°C zwischengelagerten kryokonservierten Blastocysten Wiederfindungsrate Gruppe Morphologischer Zustand nach in vitro Kultivierung (%) Anzahl Embryonen Nach 12 h Anzahl Nach 24 h Nach 48 h % Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Kontrolle 109 91 83,5 60,4 18,7 20,9 - - 59,3 12,1 28,6 - - 73,6 4,5 15,4 3,3 2,2 -18°C 127 107 84,3 74,8 16,8 8,4 - - 79,4 5,6 15,0 - - 86,9 3,7 8,5 0,9 - -79°C 130 111 85,4 74,8 13,5 11,7 - - 80,2 7,2 12,6 - - 85,6 4,5 8,1 0,9 0,9 Tab. 9: Ergebnisse der in vitro Kultivierung von bei -18°C bzw. -79°C zwischengelagerten kryokonservierten Morulae Wiederfindungsrate Gruppe Morphologischer Zustand nach in vitro Kultivierung (%) Anzahl Embryonen Nach 12 h Anzahl Nach 24 h Nach 48 h % Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Kontrolle 55 49 89,1 65,3 22,5 10,2 2,0 - 69,4 24,5 4,1 2,0 - 85,7 4,1 6,1 - 4,1 -18°C 45 35 77,8 65,7 25,7 8,6 - - 71,4 11,8 17,1 - - 85,7 5,7 8,6 - - -79°C 40 37 92,5 64,9 18,9 13,5 2,7 - 70,3 5,4 18,9 0,9 0,9 75,7 5,4 10,8 5,4 2,7 68 4.5 Vitalfärbung mit FDA und Hoechst 33341 Im Anschluss an die abschließende morphologische Beurteilung nach 48 Stunden in vitro Kultivierung wurden alle als expandiert sowie gut expandiert klassifizierten Embryonen angefärbt. Das entsprach 131 der insgesamt 430 kultivierten Embryonen. Je nach Intensität der Reaktion des Zytoplasmas auf den FDA-Farbstoff wurde dabei unterschieden in tot (T), schwach aktiv (L -), aktiv (L) und sehr aktiv (L !). Die Ergebnisse sind Tabelle 10 zu entnehmen. Als Reaktion auf Hoechst 33341 ließen sich im UV-Licht noch bei 120 Embryonen Zellkerne erkennen. Im Mittel waren dies 13,1 sichtbare Zellkerne pro angefärbtem Embryo (SD 13,0; Spanne 0 bis 65). Tab. 10: Reaktion des Zytoplasmas auf die FDA-Färbung T L- L L! Anzahl % Anzahl % Anzahl % Anzahl % 80 61,1 25 19,1 10 7,6 16 12,2 4.6 Einfluss der Abstammung der Mutterherkunft auf die Embryonenausbeute Da bei der Gewinnung der Embryonen aufgefallen war, dass die Mäuse, die von einem MPI-Herkunft bezogen worden waren deutlich mehr und auch morphologisch bessere Embryonen lieferten als die im Institutsbestand gezogenen, wurden die Ergebnisse zusätzlich noch nach Herkunft der Mütter (MPI = M, Institut = I) aufgeschlüsselt. Die Ergebnisse sind in Tabellen 11 und 12 angeben. 69 Tab. 11: Embryonengewinnung aus MPI-Mäusen Stadium Mittelwert SD Min. Max. Blastocyste 11,8 13,6 1 48 Morula 7,3 5,8 1 27 Degeneriert 2,7 1,3 1 5 Unbefruchtet 2,6 2,1 1 10 Tab. 12: Embryonengewinnung aus institutseigenen Mäusen Stadium Mittelwert SD Min. Max. Blastocyste 9,4 6,2 1 22 Morula 5,9 4,2 1 13 Degeneriert 3,1 2,9 1 11 Unbefruchtet 3,2 2,9 1 12 4.7 Einfluss der Abstammung der Mutter auf das Entwicklungsstadium nach 48 Stunden in vitro Kultivierung Da sich die morphologische Entwicklung nach 48stündiger in vitro Kultivierung unterschied, je nachdem welche Mutterherkunft die Embryonen hatten, wurden die Ergebnisse danach differenziert (Tabelle 13 und 14). Tab. 13: Mutterherkunft Institutseigen Gruppe Morphologischer Zustand nach 48 h in vitro Kultivierung in % Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Kontrolle 83,2 10,5 6,3 - - -18°C 86, 9,6 3,7 - - -79°C 93,0 4,7 1,6 - 0,7 Tab. 14: Mutterherkunft MPI Gruppe Morphologischer Zustand nach 48 h in vitro Kultivierung in % Deg. Exp. Exp.! Schl. Geschl. Kontrolle 59,9 8,6 26,4 2,7 2,4 -18°C 79,6 6,7 13,2 0,5 - -79°C 75,6 6,9 15,1 1,5 0,9 70 Der Einfluss der Mutterherkunft hatte einen hoch signifikanten Einfluss (p<0,001) bei dem Merkmal tot bzw. lebendig. Die Anzahl der toten Embryonen bei Institutsherkunft war signifikant höher als bei Embryonen aus MPI-Zucht. Als „tot“ wurden dabei alle degenerierten Embryonen und als „lebendig“ alle Embryonen der Stadien Exp., Exp.!, Exp.-, Schl. und Geschl. bezeichnet. Bei der Überprüfung hinsichtlich der Signifikanzen zeigte sich, dass bei -18°C die Herkunft der Mutter keinen signifikanten Einfluss (p>0,05) auf die Entwicklung ausübte. Bei den Gruppen Kontrolle sowie -79°C zeigte sich allerdings ein hoch signifikanter Einfluss (p<0,001) der Herkunft auf das Entwicklungsstadium. Ebenfalls von hoch signifikantem Einfluss war das Entwicklungsstadium zum Zeitpunkt der Kryokonservierung (Blastocyste oder Morula). Die Überlebensrate der Morulae war signifikant höher als bei den Blastocysten. Wurde der Beobachtungszeitpunkt in Korrelation zu der Zwischenlagerungstemperatur gesetzt, ergab sich nur beim Beobachtungszeitpunkt 36 h nach Kultivierungsbeginn ein niedrig signifikanter Einfluss auf die Entwicklung (p<0,01). Zu den übrigen Zeitpunkten (12/24/48 Stunden) zeigten sich keine Unterschiede (p>0,05). 71 5 Diskussion Das Ziel dieser Arbeit war es, festzustellen ob es möglich ist kryokonservierte und in flüssigem Stickstoff gelagerte Mäuseembryonen über einen Zeitraum von einer Stunde bei Temperaturen von -18°C oder -79°C z.B. für Transportzwecke zwischenzulagern. Dafür wurden Morulae und Blastocysten von superovulierten Spendern gewonnen, kryokonserviert und anschließend für eine Stunde bei -18°C bzw. -79°C zwischengelagert 5.1 Superovulation Wie schon von HOGAN et al. 1986 berichtet und von OZGUNEN et al. (2001) bestätigt, hängt bei Mäusen eine erfolgreiche Superovulation maßgeblich von dem Alter und Körpergewicht der Mäuse, der gespritzten Hormonmenge, der Zuchtlinie sowie den Haltungsbedingungen ab. HOOGENKAMP & LIWING (1982) gaben an, dass die optimale Hormonmenge für jede Linie separat ermittelt werden muss, da das Optimum zwischen den unterschiedlichen Zuchtlinien teilweise stark schwankt. Die anfangs in diesem Versuch angewandte Hormondosierung (7,5 IE eCG und 5,0 IE hCG) wurde auf Grund der positiven Ergebnisse der Arbeitsgruppe Reischl & Al Yakoub (2006) gewählt. Wegen der teilweise sehr geringen Erfolge der Superovulation wurde nach Erfahrungsaustausch mit anderen, ebenfalls superovulierte Mäuse verwendenden Arbeitsgruppen (WOLF, 2006; NOWSHARI, 2006) auf eine leicht verringerte Hormondosierung (5,0 IE eCG und 5,0 IE hCG) gewechselt. Der zum Kontrollzeitpunkt durch einen VP als gedeckt gekennzeichnete Anteil Mäuse lag mit 62,9 Prozent bei einem eher unbefriedigenden Niveau. HOOGENKAMP & LEWING (1982) erreichten eine Deckrate von 85 %, SMORAG et al. (1981) von 61 %, SCHMIDT et al. (1985) von 59 % und MATAR (2002) von 76 %, wobei allerdings andere Hormondosierungen und Mäuselinien verwendet wurden. 72 Als nur bedingt zufriedenstellend anzusehen war der Anteil der gewonnenen Eizellen und Embryonen mit 7,8 pro Spender auf die Gesamtheit der gespülten Tiere bezogen. Die zur Weiterzucht verwendeten Vergleichstiere erreichten ohne Hormonstimulation Wurfgrößen von bis zu 16 Jungen. Zufriedenstellend war der Anteil der Mäuse die ovuliert hatten, bezogen auf die als gedeckt gekennzeichneten Tiere mit 96,4 %. Nur bedingt zufriedenstellend war die Höhe der gewonnenen Menge an Eizellen und Embryonen mit im Mittel 12,8 je Tier. Gleiches gilt für die Höhe der Rate an gewonnenen Morulae (27,3 %) und Blastocysten (51,9 %) aus den Spendertieren die ovuliert hatten. Die zuweilen nur bedingt akzeptablen Ergebnisse nach Superovulationsinduktion bei der Gewinnung der Embryonen könnten auf dem Alter und Gewicht, den Haltungsbedingungen sowie dem Inzuchtgrad der verwendeten Mäuse beruhen. GATES beobachtete 1971, dass das Alter, die physische Verfassung und auch ein möglichst optimales Gewicht (13 bis 14 g) in großem Ausmaß die Anzahl gewonnener Embryonen nach einer Superovulation beeinflusst. Auch MINTZ (1967) gab an, dass es wichtig ist, präpuberale Mäuse zu verwenden, da Tiere mit einem eigenen Zyklus nach einer Hormonbehandlung deutlich schlechtere Ergebnisse liefern. HOOGEN (1968) gab als das geeignetste Alter für eine erfolgreiche Superovulation den Zeitraum zwischen dritter und sechster Lebenswoche an. Dieses wurde 1993 durch KOVACS et al. bestätigt, die ebenfalls festgestellt hatten, dass postpuberale Tiere nach einer Hormonbehandlung weniger Eizellen ovulierten und auch eine geringere Embryonengewinnungsrate aufwiesen. Das ist insofern interessant, als Mäuse in der Regel drei bis vier Wochen nach der Geburt abgesetzt werden und mit etwa sechs bis acht Wochen geschlechtsreif werden. Die Tatsache, dass präpuberale Weibchen besser auf eine Hormongabe ansprechen als geschlechtsreife, konnte auch in der vorliegenden Untersuchung beobachtet werden. Die bei Versuchsbeginn zur Verfügung stehenden bereits geschlechtsreifen Weibchen wiesen nach einer hormonellen Stimulation deutlich weniger Embryonen bei der Spülung auf, als die zum Vergleich herangezo73 genen Wurfgrößen der ohne Hormonbehandlung zur Weiterzucht genutzten Weibchen des selben Wurfes oder der gleichen Altersklasse verpaart mit den identischen Zuchtböcken wie bei den gespülten Tieren. Als optimales Haltungsklima wird für Mäuse eine Raumtemperatur (RT) zwischen 22°C bis 25°C und eine rel. Luftfeuchte (LF) von 50 bis 60 % angenommen. Ellendorf et al. (1970) berichteten, dass sowohl deutlich niedrigere oder höhere Temperaturen als auch vom Optimalwert abweichende rel. LF sich deutlich negativ auf die Fruchtbarkeit der Mäuse auswirken. Auf Grund der baulichen und technischen Gegebenheiten im Mäusehaus des Institutes waren die zu den Versuchen herangezogenen Mäuse mitunter suboptimalen Haltungsbedingen ausgesetzt. So waren die als optimal anzusehenden Werte nicht zu jeder Zeit erfüllbar. Dieses könnte ein weiterer Grund für die schlechteren Ergebnisse bei der Embryonengewinnung sein. HOGAN et al. veröffentlichten 1986, dass die Linien CBA, C57 und BALB und deren Kreuzungen sehr gute Ovulationsrate hervorbringen. Die im Versuch eingesetzte NMRI-Linie wird häufig als Rezipient bei Transferversuchen eingesetzt; sie ist aber eigentlich ebenfalls für eine gute Vitalität bekannt, die nach einer Superovulation mit einer größeren Anzahl gewonnener Embryonen einhergeht. Insofern ist die doch recht geringe Reaktion auf die Superovulationsbehandlung etwas verwunderlich. Es ist allgemein bekannt, dass sich Inzucht auf bestimmte Merkmale wie z.B. Wurfgröße und damit auf die Anzahl ovulierter Eizellen positiv auswirken kann. Bei einer zu stark steigenden Homozygotie kann es jedoch zu einer Veränderung züchterisch relevanter Merkmale wie z.B. der Fruchtbarkeit, des Wachstums oder der Vitalität im Allgemeinen kommen (KÖHLER, 1989). Das kann dazu führen, dass die Tiere eher auf Krankheiten ansprechen und damit unter Umständen eine geringere Lebenserwartung haben (WEIß et al., 1996). SMIDT & MONZAVIFAR (1969) berichteten, dass es häufig in Folge von zunehmender Inzucht zu einem Sinken der Fruchtbarkeit kommt. 74 Da der institutseigene Mäusebestand starke Inzucht aufwies, könnte dieser Umstand auch eine Erklärung dafür sein, dass es nach Austausch der Mäusepopulation zu einem deutlichen Anstieg der gewonnenen und als tauglich beurteilten Embryonen kam. 5.2 Überleben und Weiterentwicklung unter in vitro Bedingungen Ein recht zuverlässiges und einfaches Beurteilungsverfahren für die Überprüfung der Unversehrtheit von Embryonen im Anschluss an das Auftauen ist die Beobachtung der Weiterentwicklungsrate in vitro unter Verwendung eines geeigneten Kulturmediums und geeigneter Kulturbedingungen (SCHNEIDER et al., 1974; BILTON & MOORE, 1976a; TROUNSON et al., 1978; AL-HASANI et al., 1986; LEIBO, 1990). Das in den Versuchen zur Kultivierung verwendet verbrauchsfertige Medicult Universal IVF-Medium ist ein im Bereich der humanen Reproduktion verwendetes Medium auf Basis Earle´s Gepufferter Salzlösung (EBSS). Bevor Medien im humanen Bereich zum Einsatz kommen, müssen sie am Mausmodell erfolgreich getestet worden sein und dort gute Ergebnisse gebracht haben. Das in den vorliegenden Versuchen verwendete Medium war zu Beginn der eigentlichen Untersuchung in Vorversuchen, die dem Erlernen der Techniken dienen sollen, zur Kultivierung frischer wie auch kryokonservierter Mäuseembryonen eingesetzt worden. Durch die dabei beobachteten guten bis sehr guten Ergebnisse führten zu der Entscheidung dieses Medium auch für die eigentlichen Versuche zu nutzen. Bei dem Medium war, da es kein HEPES enthielt, eine CO2-Begasung in Höhe von mindestens 5% notwendig. Die Einstellung des Brutschrankes wurde im Abgleich mit dem dazugehörigen Messgerät InContol 1050 sehr genau justiert. Dieser Brutschrank zeichnet sich besonders durch den sterile Wasserzufuhr aus, die eine absolut kontaminationsfreie Atmosphäre durch ein neuartiges Wassereinspritzsystem gewährleistet. Im Unterschied zu den sonst häufig in den in vitro Kultivierungen muriner Embryonen eingesetzten Medien, enthielt 75 das verwendete Medium als Serumkomponente humanes Serum Albumin (HSA). Das könnte ein Grund sein, warum weniger Blastocysten schlüpften als es auf Grund ihrer Entwicklung anzunehmen war. LADD et al. stellt 1982 in Versuchen fest, dass Mäuseembryonen in absteigender Reihenfolge offensichtlich die besten Weiterentwicklungsraten bei Verwendung von fetalem Kälberserum (FCS), Lämmerserum sowie bovinem Serumalbumin (BSA) aufweisen. ARIFF et al. (1988) dagegen erzielten bei Verwendung von BSA als Serumkomponente eine Weiterentwicklungsrate von 90 % während einer in vitro Kultivierung von 2-Zell-Mäuseembryonen hin zum Blastocystenstadium. Beim Auftauen der Embryonen wurde sehr großer Wert auf eine vollständige Entfernung des Kryoprotektivums gelegt, da wie SCHNEIDER & MAZUR (1984) und CHUPIN (1986) feststellten, eine unzureichende Ausverdünnung von Kryoprotektiva zu einer verringerten Entwicklungsrate der aufgetauten Embryonen führen kann. 5.3 Zwischenlagerungseinfluss auf die Weiterentwicklung der kryokonservierten Embryonen Anders als erwartet, entwickelten sich nach einer Stunde Zwischenlagerung nicht nur Embryonen aus der Kontrollgruppe (ohne Zwischenlagerung) weiter, sondern auch Embryonen aus den Zwischenlagerungstemperaturen -18°C und -79°C. Auch fiel der erwartete Unterschied in Bezug auf überlebende und tote Embryonen zwischen den Versuchsgruppen -18°C und -79°C erstaunlich gering aus. Das lässt vermuten, dass es bei einer Temperaturerhöhung über den Zeitraum von einer Stunde zu weniger Schäden an den Embryonen kommt als weithin angenommen wird. MAURER & Bank (1973) sowie MAURER et al (1977) lagerten kryokonservierte 8-Zell-Mäuse-embryonen bei -44°C, -88°C und -196°C ein. Dabei stellten sie nach anschließender in vitro Kultivierung fest, dass je höher die Lagertemperatur ist, desto geringer die Überlebens- und Weiterentwicklungsrate der Embryonen ausfällt. Die Ursachen für diese Beobachtungen können nicht definitiv benannt werden, wahrscheinlich ist aber, dass viele einzelne Faktoren Einfluss haben. So könnte 76 einerseits die bei höheren Temperaturen stärker wirkende Toxizität der Kryoprotektiva sich negativ auswirken (KASAI et al., 1981), andererseits könnte auch eine eventuell ablaufende Umkristallisation der beim schnellen Einfrieren auf -196°C gebildeten kleinen intrazellulären Eiskristalle in größere schädliche Eiskristalle Einfluss haben. Beim Prozess des schnellen Einfrierens bilden sich viele kleine, für die Zellen unschädliche intrazelluläre Eiskristalle (LEIBO et al., 1974; FARRANT et al., 1977; RALL, 1981; JONDET et al., 1984), die aber beim Auftauvorgang ebenfalls eine schnelle Auftaurate (350°C bis 500°C/min) benötigen, damit es nicht zu einer Umkristallisation in größere und damit schädigende Kristalle kommt (WILLADSEN et al., 1978; WOOD et al., 1978; BILTON, 1980). Physikalischen Gesetzen nach, muss je nach verwendeter Lösung bis zu einer Temperatur von etwa -80°C mit einer Positionsverschiebung der Eiskristalle gerechnet werden, die ein Zusammenschmelzen einzelner Kristalle in größere Komplexe bewirkt (MEYBERG, 2007) und eine gewisse Dynamik in der Zelle zu Schädigungen führt. Ein zusätzlich weiterer, beeinflussender Faktor könnte die Qualität der kryokonservierten Embryonen sein. So stellte zum Beispiel MAHABIR (2000) fest, dass je besser die Spendertiere auf eine Superovulation reagiert hatten, desto besser auch die Qualität der gewonnenen Embryonen ausfiel. Das würde sich mit den Beobachtungen in diesem Versuch decken, die sich bei allen Behandlungen (Kontrollgruppe, -18°C, -79°C) ein deutlich besseres Überleben derjenigen Embryonen zeigen, die an Spültagen gewonnen worden waren, bei denen die Spenderinnen eine sehr gute Reaktion auf die Superovulation gezeigt hatten. Nicht ohne positiven Effekt könnte auch der Einsatz des moderneren Einfriersystems der Firma Consartic gewesen sein. Durch die Computerchip gesteuerte Programmierung des Ablaufes des Programmes ist eine extrem genaue Einhaltung der Einfrierraten gewährleistet, sowie auch die einheitliche Wiederholbarkeit der verschiedenen Kryozyklen. Die Verwendung des Kleininkubators C42 wird sich ebenfalls positiv auf die Erhaltung der Vitalität der Embryonen ausgeübt haben, denn alle Embryonen wurden immer nur kurz zu Waschvorgängen aus der optimalen Atmosphäre herausgenommen und waren somit nur ganz geringen Zellkulturstress unterworfen. Die Gewinnung der Embryonen wurde sehr steril und temperaturstabil 77 durchgeführt, da die Werkbank aus gut zu säuberndem Edelstahl mit integriertem Wärmefeld bestand. Ähnliche Untersuchungen wie die der vorliegenden Untersuchungen waren 2002 durch MATAR durchgeführt worden, die allerdings eine 72-stündige Zwischenlagerung bei -5°C, -18°C und -79°C mit sofort anschließendem Refreezing und im nächsten Schritt einen Transfer auf Empfängertiere bzw. in vitro Kultivierung beinhalteten. Aus ihren Ergebnissen schlussfolgerte sie, dass eine Versuchswiederholung mit der Temperaturstufe -79°C nur dann sinnvoll ist, wenn ein optimiertes Kryoprotektivum, reduzierte Lagerungsdauer und anstatt einem sofortigen Refreezing zuvor ein vollständiges Auftauen und danach erneutem Einfrieren eventuell sinnvoll wäre. Die in dem eigenen Versuch gewonnenen Resultate lassen vermuten, dass die kryokonservierten Embryonen in der Lage sind, eine kurzfristige Erhöhung der Temperatur mit direkt anschließender in vitro Kultivierung zu tolerieren. Um diese Beobachtungen noch einmal zu überprüfen und gegebenenfalls zu festigen wäre es sinnvoll, die Versuche mit Embryonen, ausschließlich von gut superovulierten Spenderinnen gewonnen, zu wiederholen. In diesem Zusammenhang wäre es auch interessant festzustellen, wie sich eine Verlängerung der Zwischenlagerungsdauer auf das Überleben der Embryonen auswirken würde und ob eine Übertragung der Technik auch auf andere Spezies möglich ist. 78 6 Zusammenfassung Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Einflüsse einer 60-minütigen Zwischenlagerung auf die Entwicklungsrate von bei -18°C und -79°C auf zuvor in flüssigem Stickstoff (-196°C) kryokonservierte Mäuseembryonen zu untersuchen. Um bei den Spendertieren ein Erhöhung der zu gewinnenden Embryonen pro Tier zu erreichen wurden insgesamt 132 Spendertiere mit zu Beginn der Versuche 7,5 IE eCG und 5,0 IE hCG und im weiteren Verlauf der Versuche mit 5,0 IE eCG und 5,0 IE hCG hormonell behandelt. Von diesen Tieren wurden nach Spülung der Eileiter und Uterushörner insgesamt 1023 Eizellen und Embryonen gewonnen. 410 Blastocysten und 167 Morulae wurden als gefriertauglich angesehen und mittels des Standartgefrierverfahrens folgendermaßen kryokonserviert: Im Anschluss an eine 20-minütige Equilibrierung im Kryoprotektivum (1,5 M EG und 0,25 M Saccharose) bei Raumtemperatur, bei der bereits ein Aufziehen der Embryonen auf die Kryopailletten stattfand, wurden die Pailletten in ein auf -6°C gekühltes Alkoholbad (Gerät Haake) bzw. in die auf -6°C gekühlte Gefrierkammer (Gerät Consartic) gegeben und fünf Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Nach Ablauf der fünf Minuten erfolgte das Seeding durch eine in LN2 gekühlte Metallpinzelle. Nach dem Seeding erfolgte ein weiteres Halten der Temperatur für fünf Minuten bei -6°C. Anschließend wurde die Temperatur mit einer Kühlrate von 0,3°C/min bis auf -32°C abgesenkt und dort für noch einmal zehn Minuten gehalten, bevor ein direktes Umsetzen in LN2 (Gerät Haake) bzw. die Absenkung der Temperatur in der Gefrierkammer in freiem Fall auf -196°C (Gerät Consartic). Bis zum Beginn der Versuche verblieben die Embryonen zur Lagerung in LN2. Für die Versuche wurden die Embryonen zu gleichen Gruppen in Kontrollgruppe, Lagerung bei -18°C und Lagerung bei -79°C aufgeteilt. Nach Lagerung und Auftauen bzw. bei der Kontrollgruppe nur nach dem Auftauen wurden die Embryonen unter in vitro Bedingungen über die Zeitspanne von 48 Stunden auf ihre Entwicklungsraten beobachtet. 79 Die Kultivierung fand unter Verwendung des MediCult-Universal-IVF-Mediums bei 37°C, 6% CO2 und gesättigter LF im Brutschrank (C60, Labotect, Göttingen) statt. Am Ende der 48-stündigen in vitro Kultivierung waren in der Kontrollgruppe 73,6 % der Blastocysten degeneriert und 26,4 % lebend. Bei dem ursprünglichen Stadium Morula waren 85,7 % degeneriert und 14,3 % lebend. Bei der Versuchsgruppe mit einer -18°C Zwischenlagerung waren aus der Gruppe der Blastocysten 86,9 % degeneriert und 13,1 % lebend. Bei den Morulae waren 85,7 % degeneriert und 14,3 % lebend. In der Versuchsgruppe -79°C Zwischenlagerung waren nach 48 Stunden 85,6 % der Blastocysten degeneriert, 14,4 % lebend und bei den Morulae waren 75,7 % degeneriert und 24,3 % lebend. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die Embryonen bei dem Prozess der Zwischenlagerung zwar deutlich geschädigt werden, ein Überleben aber dennoch möglich zu sein scheint. Eine Möglichkeit der Schädigung wäre eventuell in der Veränderung der Eiskristallstruktur von kleinen zu größeren Kristallen durch die Lagerung bei höheren Temperaturen zusehen und oder eine Toxizitätszunahme der Kryoprotektiva, ebenfalls durch die Erhöhung der Temperatur hervorgerufen. Es könnte als Überlegung ebenso noch hinzugezogen werden, ob eventuell eine nicht optimale Embryonenqualität - verursacht durch eine schlechte Reaktion der Spendertiere auf die Superovulationsbehandlung - wie auch die mit Blastocyste und Morula schon relativ weit fortgeschrittene Embryonalentwicklung die insgesamt schlechten Ergebnisse zusätzlich gefördert haben. Insofern wäre es interessant, die durchgeführten Ergebnisse noch einmal mit Embryonen aus Spülvorgängen mit besseren Reaktionen auf eine Superovulationsbehandlungen, früheren Embryonalstadien und eventuell auch anderen Kryokonservierungsmethoden wie zum Beispiel der Vitrifikation durchzuführen. 80 7 Literaturverzeichnis ADAMS, C.E. (1968): Probleme der Eiübertragung bei Haustieren. Z. Tierz. Züchtungsbiol. (1968); 84: 319-329. AL-HASANI, S., TOLKSDORF, A., DIEDRICH, K., VAN DE VEN, H., KREBS, D. (1986): Successful in vitro fertilization of frozen-thawed rabbit embryos. ALLISTON, C.W., HOWARTH jr., B., ULBERG, U.C. 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WILMUT, I. (1972): The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. (1972); 11 (2): 1071-79. 107 WOLF (2006): Mäusehaus Humangenetik - persönliche Gespräche. WOOD, M.J., FARRANT, J., WHITTINGHAM, D.G., LEE, H., HALSLEY, A. (1978): Survival of mouse embryos after rapid thawing. Cryobiology (1978); 15: 680-681. WOOD, M.J., FARRANT, J. (1980): Preservation of mouse embryos by twostep freezing. Cryobiology (1980); 17: 178-180. 108 Danksagung Herrn Professor Dr. W. Holtz möchte ich für die Überlassung des interessanten Themas, der Möglichkeit zur Erlernung reproduktionsmedizinischer Techniken und Methoden sowie für die vielfältigen Ideen und Anregungen während der Anfertigungszeit dieser Arbeit danken. Bei Herrn Professor Dr. M. Gauly möchte ich mich für das Interesse an meinem Thema und der Bereitschaft zur Übernahme des Korreferates bedanken. Unsagbar zum Gelingen dieser Arbeit hat die Unterstützung der Firmen Consarctic, Gück Zellkulturbedarf, Labotect, MTG, Varolab und Zeiss MicroImaging beigetragen. Durch Dauerleihgaben der Geräte und Bereitstellung von Medien konnten die Versuche auf höchstem technischen Niveau erfolgen, was die Qualität der Aussagekraft der Versuche sicher maßgeblich mit beeinflußt hat. In diesem Zusammenhang sei auch die Firma Dragon IVF International genannt, auf deren Initiative hin diese große Kooperation zwischen Universität und Industrie erstmals stattfinden konnten. Erste technische Einführungen zum Thema wurden von Frau Dr. Judith Reischl gegeben, der ich auch zu großem Dank verpflichtet bin. Herrn Azzam Al Yakub möchte ich für die freundschaftliche Zusammenarbeit meinen besonderen Dank ausdrücken. Für die schnelle und qualifizierte Hilfe bei der statistischen Auswertung möchte ich Frau Bianca Lind danken. Den Kollegen und Kolleginnen insbesondere Frau Elisabeth Stüwe, Herrn Peter Ludewig und Frau Birgit Sohnrey möchte ich für die motivierende, freundschaftliche Arbeitsatmosphäre danken. Ein ganz herzliches Dankeschön geht an Dr. Manzoor Nowshari, Frau Dr. Manuela Ropeter-Scharfenstein, Herrn Dr. Klaus Nebendahl, Herrn Wolf (Humangenetik) sowie allen Freunden und Mitarbeitern am Institut für Tierzucht und Haustiergenetik. 109 Eidesstattliche Erklärung Mit meiner Unterschrift versichere ich, die vorliegende Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt zu haben Göttingen, den 23.07.2007 ............................................... (Stephanie Buhtz) 110
