Diagnostic Update März 2011 Aufarbeitung dermaler Mastzelltumoren beim Hund Chirurgisch entnommener dermaler Mastzelltumor nach Diagnose durch FNA Lokale Therapie Systemische Therapie Pathohistologie Ränder Vollständige Entnahme mit Abstand Grading Unvollständige Entnahme Nachresektion mit Abstand Keine weitere lokale Therapie Nachresektion nicht möglich Radiotherapie Low Grade Malignancy Proliferationsanalyse High Grade Malignancy c-Kit Analyse (Immunhistologisches Muster und Sequenzierung sowie PCR Abklärung von Mutationen) niedriger Ki67 hoher Ki67 c-Kit Mutation keine c-Kit Mutation keine weitere systemische Therapie Chemotherapie Einsatz von Thyrosinkinase Inhibitoren c-Kit Pattern I kein Thyrosinkinase Inhibitor Chemotherapie c-Kit Pattern II + III zusätzlich Thyrosinkinase Inhibitor Quelle: MCT-Flowchart der Michigan State University; www.animalhealth.msu.edu Modifiziert durch Dr. H.B. Nothelfer Das kann IDEXX Vet•Med•Labor für Sie leisten: 1.Beurteilung Ihres zytologischen Untersuchungsmaterials 2.Pathohistologische Aufarbeitung Ihrer Tumorentnahme mit Fest stellung eines dermalen (kutanen) Mastzelltumors (im Gegensatz dazu gibt es auch subkutane MCT’s). 3.Grading in Low Grade und High Grade Malignancy (Kiupel et al., Vet Pathol 48, 2011), zusätzlich Mitteilung der bislang bekannten Gradeinteilung von I bis III (Patnaik et al., Vet Pathol 21, 1984) 4.Entnahmeränderbeurteilung am Resektat bzw. an Tumorbettbiopsien sowie Metastasenabklärung im Lymphknoten (falls Material mit einge- sandt wurde; Gewebe oder FNA) 5.Immunhistologische Aufarbeitung mit Antikörpern gegen Ki67 und c-Kit 6.C-Kit Mutationsnachweis: Tandemmutation in Exon 11 sowie in Exonen 8 und 9 mittels Agar Gel-Elektrophorese, Sequenzierung und Analyse des Thyrosin-kinaserezeptorgenomes. All diese Untersuchungen können an dem eingesandten Mastzelltumorgewebe durchgeführt werden. Nur in einem geringen Teil der Fälle ist die Aufarbeitung der DNA durch die Formalinfixation nachhaltig beeinträchtigt. „Was ist was“ bei dermalen Mastzelltumoren? Low Grade versus High Grade (Histologie) Nachdem festgestellt wurde, dass 28 verschiedene, hochqualifizierte Veterinärpathologen bei der Gradierung von 95 Mastzelltumoren eine bis zu 20%ige Ergebnisvarianz produzierten, wurde ein neues, nur noch zweistufiges Einteilungsschema vorgeschlagen, das eindeutigere Abgrenzungskriterien aufweist. Ein High Grade Mastzelltumor wird dadurch qualifiziert, dass mindestens eines der nachfolgenden Kriterien auftritt: a.Mindestens 7 Mitosen pro 10 Blickfelder in hoher Vergrößerung b.Mindestens 3 mehrkernige Tumorzellen (mindestens 3 Kerne) in 10 Blickfeldern in hoher Vergrößerung c.Mindestens 3 bizarre Kerne in 10 Blickfeldern in hoher Vergrößerung d.Karyomegalie (Kernriesen), d. h. mindestens 10% der Tumorzellen zeigen eine Verdoppelung des Kerndurch messers verglichen mit den übrigen Tumorzellkernen Es werden zur Beurteilung jeweils die Blickfelder mit der höchsten mitotischen Aktivität bzw. dem höchsten Grad der Kerngrößenvariation herangezogen. Nach dieser Studie sind bei High Grade Mastzelltumoren die Zeiträume bis zur Metastasenentwicklung oder neuen Tumorentwicklung bzw. die Überlebenszeit signifikant kürzer als bei Low Grade Tumoren. In dieser Studie betrug die mediane Überlebenszeit weniger als 4 Monate für High Grade Tumoren und mehr als 2 Jahre für Low Grade Tumoren. (Quelle: Proposal of a 2 tier histologic grading system for canine cutaneous Mast Cell Tumors to more accurately predict biological behavior. Vet Pathol 48, 2011) Die Patnaik Gradierung in Grad I, II und III werden wir weiter zusätzlich durchführen. Zumindest bei Grad I Tumoren, die vollständig entnommen wurden, ist die Rezidiv- und Metastasierungsgefahr sehr gering. Dies wiederum ist eine Information, an der der Patientenbesitzer sehr interessiert ist. c-Kit = Thyrosinkinaserezeptor (Immunhistologie) C-Kit kommt in sehr vielen Zellen im Körper bei Mensch und Tier vor. Würde dieser Rezeptor in diesen Zellen wegfallen, gingen sie zugrunde. Dieser Rezeptor kann durch Immunhistologie sichtbar gemacht werden. Dabei werden 3 unterschiedliche Verteilungsmuster (Pattern) des Rezeptors in der Zelle unterschieden. In einer Arbeit aus dem Jahr 2004 ist die Prognose im Hinblick auf die Überlebenszeit bei den Pattern 2 und 3 signifikant schlechter als bei einem Pattern 1 (Kiupel et al., Vet Pathol 41, 2004). Die Auswertung umfasst 8 Felder, der vorherrschende Pattern ergibt die Diagnose. Der Pattern ist kein Beweis für eine Mutation. Mutation des c-Kit Genes (Molekularbiologie) Insbesondere eine Tandemmutation im Exon 11, aber auch Mutationen im Exon 8 und 9 werden bei Webster et al. (2006) als eine mögliche Ursache veränderter c-Kit Expression diskutiert. Zemke et al. (Vet Path 39, 2002) zeigen, dass Mutationen häufiger bei höher malignen (Grad II und III nach Patnaik, 1984) Mastzelltumoren auftreten. Es erscheint möglich, dass Thyrosinkinase Inhibitoren bei Fällen mit Mutation eine bessere Wirksamkeit entfalten. In einer retrospektiven Aufarbeitung des Genoms von 65 Mastzelltumoren aus Deutschland (Aupperle et al., 2011, Vortrag, DVG Hofheim) wurde allerdings nur in einem Grad III Tumor eine solche Mutation gefunden. Als Ursache diskutieren die Autoren genetische Unterschiede zwischen den Hundepopulationen in den USA und Deutschland Ki67 = Zellproliferationsmarker (Immunhistologie) Ki67 ist ein Protein, das in allen Phasen des Zellzyklus, außer den ruhenden Zellen, nachweisbar ist. Mittlerweile ist seine Expression bei den MCT des Hundes sehr gut charakterisiert und sein prädiktiver Wert im Hinblick auf die Prognose in verschiedenen Studien bestätigt worden (Abadie et al., JAVMA 11, 1999; Webster et al., Vet Pathol 44, 2007). Immunhistologie Grundsätzlich weist man durch spezifische Antikörper Proteine an und in Zellen bzw. ihre Verteilungsmuster nach. Meist sind dies zweistufige Verfahren, bei denen zunächst AK gegen die Zielstruktur aufgebracht werden und dann in einem zweiten Schritt AKs, die gegen die primären Antikörper gerichtet sind und an ihrem FC-Fragment entweder Farbstoffe oder Enzyme zur Katalyse einer Anfärbung tragen, eingesetzt werden. Häufig ist das Ergebnis dann eine braune Anfärbung der positiven Zellen. Die Beurteilung des c-Kit Pattern ist komplizierter, da hier die Verteilung der Anfärbung in den Tumorzellen qualifiziert werden muss. Pattern 1: Anfärbung nur der Zellmembran Pattern 2: entweder intrazytoplasmatische, angefärbte Stippchen oder paranukleär liegende, angefärbte Klumpen Pattern 3: Hochgradige diffuse, zytoplasmatische Anfärbung und umfangreiche paranukleär liegende Klumpen Bei Ki67 werden jeweils 1000 Tumorzellen ausgezählt. Haben mehr als 93 Zellen von diesen 1000 positiv reagiert, gilt laut Abadie et al. (1999), dass die Hunde trotz vollständiger chirurgischer Entnahme eine signifikant kürzere Überlebenszeit haben bzw. ein früher tumorassoziierter Tod eintritt. Einzelne Zellen mit Pattern 1 Zahlreiche Zellen mit Pattern 2 Im Bild ein Ki67 gefärbter Mastzelltumor. Alle rot gekringelten Zellen wurden als negative Tumorzellen gezählt. Die 8 braun angefärbten Zellen (mit den gelben Kreuzen) sind dagegen positiv. Zellen die nicht als Tumorzellen zu identifizieren sind, hier z. B. segmentkernige Granulozyten und Fibrozyten, werden bei der Berechnung außen vor gelassen. Vorwiegend Pattern 3, besonders deutlich in den pfeilmarkierten Zellen. (Fotos: E. Scanziani DVM, ECVP (MAPLab) FONDAZIONE FILARETE, Milano) IDEXX Vet•Med•Labor Vet Med Labor GmbH Division of IDEXX Laboratories Fachberatung Deutschland Fachberatung Österreich Kostenfreie Servicenummern: Kostenfreie Servicenummern: Mörikestr. 28/3 D – 71636 Ludwigsburg www.idexx.de Tel: 0800 589 2579 Tel: 00800 1234 3399 Tel: 0800 20 89 20 Tel: 00800 1234 3399 Fax: +49 (0)7141 6483 555 D579-0211