Multiple Funktionen des FGF-Signalwegs regulieren die

Multiple Funktionen des FGF-Signalwegs regulieren
die Lateralitätsentwicklung im Krallenfrosch
Xenopus
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
Fakultät Naturwissenschaften
Universität Hohenheim
Institut für Zoologie
vorgelegt von
Isabelle Janina Schneider
aus Stuttgart
2013
Dekan:
Prof. Dr. Heinz Breer
1.berichtende Person:
Prof. Dr. Martin Blum
2.berichtende Person:
Prof. Dr. Heinz Breer
Eingereicht am:
02.12.2013
Mündliche Prüfung am:
23.04.2014
Die vorliegende Arbeit wurde am 21.02.2014 von der Fakultät Naturwissenschaften
der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der
Naturwissenschaften“ angenommen.
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Während der Embryonalentwicklung werden die drei Körperachsen der Wirbeltiere
gebildet, wobei sich die links-rechts (LR) Achse wie in einem kartesischen Koordinatensystem durch die Festlegung der anterior-posterioren und der dorso-ventralen Achse
ergibt. In der weiteren Entwicklung muss die Lateralität etabliert werden, d.h. die
ursprüngliche Symmetrie der LR-Achse muss gebrochen werden, um die asymmetrische
Anordnung der inneren Organe zu ermöglichen. Dabei werden die Organe nicht zufällig,
sondern in einem bestimmten Muster angeordnet. Dies wird durch die Expression der
konservierten
Nodal-Genkaskade
gewährleistet,
die
asymmetrisch
im
linken
Seitenplattenmesoderm exprimiert wird. Der Bruch der Symmetrie, welcher zu dieser
asymmetrischen Nodal-Kaskade führt, wird über einen linksgerichteten Flüssigkeitsstrom
vermittelt, der wiederum durch die rotierende Bewegung motiler Cilien entsteht. Das
Epithel, das den Flüssigkeitsstrom erzeugt, findet sich im Bereich des posterioren
Notochords und weist lateral auf beiden Seiten eine symmetrische Expression von Nodal
auf. Diese frühe bilaterale Nodal-Domäne ist Vorraussetzung für die Induktion der
asymmetrischen
Nodal-Kaskade.
Während
Nodal-Funktion
und
Flüssigkeitsstrom
innerhalb der Wirbeltiere weitgehend konserviert sind, wurden für den FGF-Signalweg
divergierende Funktionen in der Lateralitätsentwicklung von Maus, Huhn, Kaninchen und
Zebrabärbling beschrieben. In dieser Arbeit wurde die Rolle der FGF-Signalaktivität für die
Lateralitätsentwicklung von Xenopus laevis untersucht.
Durch
systemische
Anwendung
eines
Rezeptorantagonisten
in
verschiedenen
Entwicklungsstadien war es möglich, zwei zeitlich unterschiedliche Funktionen von FGF zu
dokumentieren. Zum einen wird der FGF-Signalweg in den frühen Gastrulastadien für die
Expression von FoxJ1 benötigt, dem Masterkontrollgen für motile Cilien, und somit für die
Ciliogenese
des
symmetriebrechenden
Epithels
des
Krallenfrosches,
der
GRP
(„gastrocoel roof plate“). Zum anderen wirkt der FGF-Signalweg auf die bilaterale
Expression von Nodal. Durch deskriptive und funktionelle Untersuchung konnte gezeigt
werden, dass die Nodal-exprimierenden Zellen den somitischen Anteil der GRP darstellen
und ihre Entstehung durch FGF-Funktionsverlust verhindert wird. Interessanterweise steht
der frühe Effekt von FGF auf die Ciliogenese im Einklang mit der beschriebenen Rolle im
Zebrabärbling, während der spätere Effekt der Inhibition, der Verlust der bilateralen NodalDomäne, bereits in der hypomorphen Fgf8 Mausmutanten beschrieben wurde. Die
Zusammenfassung
Beschreibung von zwei zeitlich getrennten Funktionen in Xenopus zeigt somit, dass der
FGF-Signalweg eine stärkere Konservierung aufweisen könnte als bislang angenommen.
Der FGF-Signalweg teilt sich in verschiedene Zweige auf, von denen zwei in der frühen
Embryonalentwicklung von Xenopus eine wichtige Rolle spielen. Hierbei wird über die
FGF-abhängige MAPK-Aktivierung die Induktion des Mesoderms gewährleistet, während
der PLC/PKC/Calcium-Signalweg Einfluss auf morphogenetische Veränderungen nimmt.
Die FGF-vermittelte Wirkung auf die Expression von FoxJ1 stand dabei in einem zeitlichen
Zusammenhang mit der Aktivität des FGF-Signalweges in der Spezifizierung des
Mesoderms. Somit hatte die Rezeptor-vermittelte FGF-Inhibition in frühen Gastrulastadien
starke Defizite in der Expression mesodermaler Markergene und, damit einhergehend,
Blastoporusschlussdefekte zur Folge. Dies konnte durch Inhibition in späteren
Gastrulastadien, in denen die Induktion des Mesoderms als weitestgehend abgeschlossen
gilt und in denen der FGF-Signalweg auf die lateralen GRP-Zellen wirkt, vermieden
werden. Um aufzuklären, welche der beiden intrazellulären Signaltransduktionskaskaden
für die beobachteten Phänotypen verantwortlich waren, wurde der FGF-abhängige
PLC/PKC/Calcium-Signalweg durch den intrazellulären Antagonisten Sprouty1 inhibiert.
Sprouty1-Funktionsgewinnexperimente
zeigten
keinen
negativen
Einfluss
auf
die
Ciliogenese, jedoch hatten sie denselben inhibierenden Effekt auf die somitischen GRPZellen wie die Rezeptor-vermittelte Inhibition des FGF-Signalweges. Dies deutete darauf
hin, dass die FGF-abhängige Entstehung dieser Zellen durch den PLC/PKC/CalciumSignalweg gewährleistet wird. Dass hierbei insbesondere intrazelluläres Calcium für die
Bildung dieser Zellen wichtig ist, ergab sich aus Experimenten mit einem Calciumpermeablen Ionenkanal. Die frühere Funktion von FGF, die Ciliogenese, wurde dagegen
unabhängig vom PLC/PKC/Calcium-Signalweg vermittelt, möglicherweise über den
MAPK-Signalweg.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass der FGF-Signalweg in der
Lateralitätsentwicklung von Xenopus zwei Funktionen spielt, die in Einklang mit einer
konservierten Funktion dieses Signalwegs in der Lateralitätsentwicklung der Wirbeltiere
stehen. Die hier gezogenen Erkenntnisse über die Wirkung des FGF-Signalwegs auf die
lateralen
GRP-Zellen,
liefern
neue
Ansätze
zur
Untersuchung
der
LR-
Achsendeterminierung. Als Sensorzellen des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms spielen
sie eine entscheidende Rolle in der Lateralitätsentwicklung.
Abstract
Abstract
Early embryogenesis governs the formation of the three body axis. Like in a cartesian
coordinate system, the LR-axis is defined by the generation of the anterior-posterior and
the dorso-ventral axis. In the course of laterality specification, the original LR-symmetry
has to be broken to enable the asymmetric arrangement of inner organs in a specific
manner. This is mediated by the expression of conserved gene cascade, namely the
Nodal gene cascade, which is expressed in the left but not in the right lateral plate
mesoderm of the neurula stage embryo. Symmetry breakage, which leads up to this
asymmetric Nodal gene cascade, is manifested by a cilia-based leftward fluid flow. The
flow generating epithelium is located at the posterior end of the notochord and expresses
Nodal in a bilateral symmetrical mode. This early Nodal domain is a prerequisite of the
later asymmetric Nodal gene cascade. Despite the conserved nature of Nodal expression
and of leftward flow, no conservation of the role of the FGF signaling has been described
for mouse, chick, rabbit and zebrafish. In this work the role of FGF signaling in Xenopus
laevis LR-development was investigated. Using of a receptor antagonist to inhibit FGF
signaling revealed two temporally distinguishable functions.
Firstly, FGF signaling in early gastrula stages is required for the proper expression of
FoxJ1, the master control gene of motile cilia. Here, FGF signaling acts in the process of
ciliogenesis of the symmetry-breaking epithelium, which is represented by the GRP
(“gastrocoel roof plate”) in Xenopus. Secondly, FGF acts in a cilia-independent manner on
the bilateral Nodal expression. A series of descriptive and functional studies revealed that
these cells constitute the somitic part of the GRP and that inhibition of FGF signaling leads
to the loss of these cells. Interestingly, the effect on ciliogenesis is consistent with the role
of FGF signaling in zebrafish, whereas the loss of bilateral Nodal expression is in line with
the hypomorpic Fgf8 mutant mouse. The description of these two successive functions in
Xenopus indicates a higher degree of conservation of the role of FGF signaling than
suggested so far.
The FGF signaling pathway splits into several branches, two of which play important roles
in the early development of Xenopus embryos. Activation of MAPK signaling is implicated
in the induction of mesoderm, whereas the PLC/PKC/Calcium signaling branch impacts on
morphogenetic movements. FGF-mediated control of Foxj1 expression was temporally
Abstract
correlated with FGF signaling that acts on mesoderm specification. As a consequence,
mesodermal gene expression and blastopore closure was seriously affected by loss of
FGF signaling at early gastrula stages. By starting inhibition experiments during gastrula
stages, when mesoderm induction is almost finished, general mesoderm specification
defects were avoided but the effect on the somitic GRP cells persisted. To unravel which
FGF-induced signaling branch acted on the two different functions of FGF described here,
the PLC/PKC/Calcium signaling branch was inhibited using the antagonist Sprouty1.
Sprouty1 gain of function experiments had no effect on ciliogenesis, but caused loss of
somitic GRP cells comparable to loss of function experiments using the FGF receptor
antagonist. This suggests that the FGF-dependent formation of these cells is regulated by
the PLC/PKC/Calcium pathway. A specific role of Calcium was supported by experiments
using a calcium-permeable channel. Despite this, ciliogenesis was not affected by
inhibition of PLC/PKC/Calcium, suggesting a role of MAPK for the early function of FGF.
In conclusion, this work demonstrates two functions of FGF signaling in Xenopus LRdevelopment, which furthermore are consistent with a conserved function of FGF signaling
in vertebrate LR-axis determination. Novel insights into the role of FGF signalling in the
very cells which sense leftward flow at the lateral margin of the GRP will open new
approaches to analyse laterality specification in more detail.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Die Embryogenese der Wirbeltiere
1
Xenopus laevis als Modellorganismus der Entwicklungsbiologie
2
Die Entstehung der dorso-ventralen und anterior-posterioren Körperachsen
3
Die Spezifizierung der Keimblätter und Gastrulation
5
Die LR-Achse weist Asymmetrien bezüglich der inneren Organe auf
7
Die Nodal-Genkaskade im linken Seitenplattenmesoderm bestimmt die
die asymmetrische Positionierung der Organe
8
Motile primäre Cilien im Zentrum des Symmetriebruchs
9
Morphogenese und Spezifizierung des LR-Organisators von Xenopus laevis
11
Die Umsetzung des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms:
Morphogen- versus Zwei-Cilien-Modell
14
Die Bedeutung der bilateralen Expression von Nodal für den
Transfer linkspezifischer Information
15
Der Symmetriebruch des Huhns nimmt innerhalb der Wirbeltiere eine
Sonderstellung ein
18
Der FGF-Signalweg als zentraler Regulator der Embryogenese
19
Der FGF-Signalweg
19
Sprouty als negativer Regulator des FGF-Signalwegs
21
FGF-abhängige Induktion und Aufrechterhaltung mesodermaler Gene
21
Die Bedeutung des FGF-Signalwegs für konvergente Extensionsbewegungen
22
FGF-Signalaktivität in der LR-Achsenentwicklung der Wirbeltiere
23
Arbeitshypothese
25
Inhaltsverzeichnis
Ergebnisse
Funktionsverlustexperimente zur Darstellung der FGF-vermittelten Funktion
26
Inhibition der FGF-Signalaktivität bewirkt einen Verlust der asymmetrischen
Genexpression
26
Kompetenz der Seitenplatte zur Expression von Pitx2c nach SU5402-Inkubation
31
FoxJ1-abhängiger Einfluss der FGF-Signalaktivität auf die LR-Achsenentwicklung
32
FoxJ1-/Cilien-unabhängiger Einfluss der FGF-Signalaktivität auf die
LR-Achsenentwicklung
35
FGF-Signalaktivität beeinflusst die paranotochordale Expression
von Xnr1 und Coco
39
Expression der paranotochordalen Xnr1-Domäne tritt in den somitischen
GRP-Zellen auf
43
FGF-Signalaktivität beeinflusst die Bildung somitischer GRP-Zellen
45
Auswirkungen der SU4502-Inkubationen auf mesodermale Genexpressionen
50
Vergleich der SU5402-Inkubationen ab St.12-12,5 mit Inkubationen
ab St.12,5-13
51
Keine verminderte Zellproliferation durch SU5402-Inkubation
54
Keine erhöhte Apoptose durch SU5402-Inkubation
55
Überexpression von Spry1 übt keinen Effekt auf die Expression von FoxJ1 aus
59
Verlust der paranotochordalen Xnr1- und Coco-Domäne nach
Überexpression von Spry1
60
Verlust somitischer GRP-Zellen nach Überexpression von Spry1
61
Geringer Effekt auf mesodermale Genexpression nach Überexpression von Spry1
63
Pkd2-Knockdown führt ebenfalls zum Verlust der somitischen GRP-Zellen
65
Spry1 und Pkd2 wirken gemeinsam auf die paranotochordale Xnr1und Coco-Domäne
66
Thapsigargin-Inkubationsexperimente zur Inhibierung von intrazellulärem Calcium
68
Spry1 und Wnt11b wirken gemeinsam auf die paranotochordale Xnr1- und
Coco-Domäne
70
Inhaltsverzeichnis
Diskussion
FGF-Signalaktivität als Determinante der Lateralitätsentwicklung von Xenopus
73
Konservierte und nicht konservierte Funktionen von FGF-Signalaktivität
75
Warum fehlen Sensorzellen der GRP nach FGF-Funktionsverlust?
80
1) Umspezifizierung zu entodermalen Zellen
80
2) Somitische GRP-Zellen sind schon frühzeitig in den
Somitenverbund integriert
81
3) Somitische GRP-Zellen sind in den epithelialen Bereich der
medialen GRP integriert
81
Welche FGF-vermittelten Signaltransduktionen wirken auf die Lateralitätsentwicklung?
83
PLC/PKC/Calcium-unabhängige Signaltransduktion wirkt auf FoxJ1
84
MAPK-unabhängige Signaltransduktion wirkt auf die
Sensorzellen der GRP
84
FGF-Signalaktivität wirkt über Calcium auf die Sensorzellen der GRP
85
FGF-Signalaktivität könnte über den kanonischen Wnt-Signalweg auf FoxJ1 wirken
87
Modell des Zusammenspiels von Calcium mit anderen Signalwegen in der
Spezifizierung der Sensorzellen des LR-Organisators
91
Material und Methoden
98
Literaturverzeichnis
110
Lebenslauf
127
Danksagung
129
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1
Die GRP bildet sich aus den superfiziellen Mesodermzellen der
Gastrulastadien
12
Abb. 2
Frühe LR-Achsenentwicklung von Xenopus laevis
17
Abb. 3
FGF-vermittelte Signaltransduktion
20
Abb. 4
SU5402-Inkubationen lassen ein Zeitfenster erkennen, indem die
Inhibition der FGF-Signalaktivität den Verlust der asymmetrischen Pitx2cExpression bewirkt
27
FGF-Signalaktivität in der GRP ist notwendig für die Induktion der NodalGenkaskade
30
Kompetenz der Seitenplatte bei SU5402-Inkubationen ab der mittleren/
späten Gastrula
31
Abb. 7
Abhängigkeit der FoxJ1-Expression von der FGF-Signalaktivität
34
Abb. 8
SU5402-Inkubationen ab mittleren/späten Gastrulastadien üben keinen
Effekt auf die Ciliogenese der GRP aus
36
niedrige Konzentrationen von dnFGFR1 üben keinen Effekt auf GRPCilienlänge aus
38
Verlust der paranotochordalen Xnr1-/Coco-Expression durch Inhibition der
FGF-Signalaktivität
40
Abb. 11
Xnr1-Expression in den somitischen Zellen der GRP
44
Abb. 12
Inhibition von FGF-Signaltransduktion führt zum Verlust der somitischen GRP
46
Abb. 13
FGF-Signalaktivität determiniert die somitischen GRP-Zellen
49
Abb. 14
Reduktion mesodermaler Genexpression durch SU5402-Inkubationen
51
Abb. 15
Vergleich zwischen SU5402-Inkubationen ab St.12-12,5 und St.12,5-13
52
Abb. 16
Keine Verminderung der Zellproliferationsrate nach Applikation von SU5402
55
Abb. 17
Keine apoptotischen Zellen im Bereich der GRP nach Applikation
von SU5402
56
Verlust der somitischen GRP-Zellen nach SU5402-Inkubation kann nicht
durch Koinjektion von Bcl-XL verhindert werden
58
Abb. 19
Expressionsanalyse von FoxJ1 und Tekt2 nach Überexpression von Spry1
59
Abb. 20
Expressionsanalyse der Xnr1- und Coco-Domäne nach
Überexpression von Spry1
60
Überexpression von Spry1 führt zum Verlust der somitischen GRP-Zellen
62
Abb. 5
Abb. 6
Abb. 9
Abb. 10
Abb. 18
Abb. 21
Abbildungsverzeichnis
Abb. 22
Expression mesodermaler Marker nach Überexpression von Spry1
64
Abb. 23
Verlust somitischer GRP-Zellen nach Pkd2-Knockdown
65
Abb. 24
Spry1-Überexpression und Pkd2-Knockdown wirken epistatisch auf die
Expression von Xnr1 und Coco
66
Pkd2-Funktionsgewinn rettet den Verlust der paranotochordalen
Xnr1-Expression nach Spry1-Überexpression
67
Thapsigargin-Inkubation bewirkt Verlust der paranotochordalen
Xnr1-Expression
69
Wnt11b-MO und Spry1-mRNA wirken epistatisch auf die Expression
von Xnr1 und Coco
71
Abb. 28
FGF-Signalaktivität in der LR-Achsenentwicklung der Wirbeltiere
76
Abb. 29
Modell: LR-spezifische Funktionen der FGF-Signalaktivität werden über
unterschiedliche Signaltransduktionswege reguliert
83
Abb. 30
Modell der Wirkung von FGF-Signalaktivität auf die Expression von FoxJ1
88
Abb. 31
Modell des Zusammenspiels von Calcium mit anderen Signalwegen in der
Spezifizierung der Sensorzellen
93
Abb. 25
Abb. 26
Abb. 27
Einleitung
Einleitung
Die Embryogenese der Wirbeltiere
In
der
Embryonalentwicklung
vielzelliger
Tiere
finden
wichtige
Prozesse
wie
Furchungsteilungen, Blastulation, Gastrulation, Organogenese und Gewebebildung statt,
wobei die Ausrichtung der Körperachsen und die Körpergrundgestalt des Embryos
festgelegt werden. Die Embryogenese beginnt nach der Befruchtung der Eizelle, indem
sich die entstandene Zygote in den Furchungsteilungen mehrmals schnell hintereinander
bis zur Bildung der Blastula teilt. Nun beginnt die Spezifizierung der Keimblätter, welche im
Zuge der Gastrulation umorganisiert werden, sodass sie an ihren entsprechenden
Positionen zu liegen kommen. Bilateral symmetrische Tiere besitzen als Triploblasten
neben dem Entoderm und Ektoderm ein drittes Keimblatt, das Mesoderm. Nach Abschluss
der Gastrulationsbewegungen befindet sich das Entoderm im Inneren des Embryos, das
Ektoderm bildet die Außenhülle des Embryos und das Mesoderm liegt zwischen Entoderm
und Ektoderm. Während der Organogenese entstehen aus dem Entoderm unter anderem
der Verdauungstrakt und ihm assoziierte Organe. Aus dem Mesoderm werden die
Knochen, die Muskulatur und das Blutgefäßsystem gebildet und aus dem Ektoderm gehen
die Haut und das Nervensystem hervor. Dabei spaltet sich während der Neurulation das
neurale Ektoderm vom hautbildenden Ektoderm ab und wird ebenfalls ins Innere des
Embryos verlagert. Am Ende der Embryonalentwicklung entsteht durch Zellteilung,
Zellwanderung
und
Zelldifferenzierung
ein
Organismus
mit
diversen
Zell-
und
Gewebetypen und drei Körperachsen. Gesteuert wird dies durch eine Handvoll
konservierter
Signalwege,
die
im
Zusammenspiel
agieren
und
jeweils
diverse
musterbildende Prozesse regulieren (Wolpert et al., 2007).
Im Zentrum dieser Arbeit steht der Signalweg der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
(„fibroblast growth factor“; FGF). Dieser ist unter anderem in Entwicklungsprozessen wie
der Induktion von Mesoderm und Neuralgewebe, der anterior-posterioren (AP)
Musterbildung,
der
Extremitäten-Entwicklung,
in
Zellbewegungen
und
in
morphogenetischen Veränderungen involviert (Thisse and Thisse, 2005; Pownall and
Isaacs, 2010). In dieser Dissertation wird die Rolle des FGF-Signalwegs in der
Lateralitätsentwicklung
von
X. laevis
analysiert.
Im
Folgenden
werden
die
Embryonalentwicklung dieses Modellorganismus, bisherige Erkenntnisse über die
1
Einleitung
Entstehung der Links-Rechts (LR) Achsenasymmetrie und wichtige Grundlagen des FGFSignalwegs zusammengefasst.
Xenopus laevis als Modellorganismus der Entwicklungsbiologie
Die Etablierung als international verbreiteter Modellorganismus von X. laevis, der
ursprünglich in Mittel- und Südafrika heimisch ist, ist unter anderem seiner früheren
Verwendung zur Feststellung einer Schwangerschaft zu verdanken. Basierend auf der
Entdeckung von Lancelot Hugben, dass die Injektion des Urins schwangerer Frauen die
Ovulation von X. laevis induziert, verbreitete sich X. laevis in den 1940er und 1950er
Jahren aufgrund der Nachfrage nach Schwangerschaftstest in Europa und Nordamerika.
Für die dort ansässigen Entwicklungsbiologen, welche bis dato auf einheimische
Amphibien und ihre saisonale Ovulation angewiesen waren, bot X. laevis mit seiner
einfachen Haltung und der ganzjährig möglichen Ovulation durch Injektion des
Schwangerschaftshormon Choriongonadotropin einen entscheidenden Vorteil. Neben dem
Feld der Entwicklungsbiologie fand X. laevis auch Anwendung in den damals
aufstrebenden Interessensgebieten der biochemischen, zellulären und genetischen
Vorgänge, womit er sich als Modellorganismus durchsetzte. Methoden der Mikrochirurgie
und Embryonenkultur, wie sie schon für andere Amphibien entwickelt waren, wurden für
die Anwendung bei X. laevis optimiert (Gurdon and Hopwood, 2000). Bis heute bietet X.
laevis viele Vorteile, die ihn zu einem beliebten Modellorganismus machen. Die Größe
seiner Eier ermöglicht eine leichte Handhabung bei der Injektion spezifischer Substanzen
oder gezielte mikrochirurgische Eingriffe, wie z.B. die Transplantation von bestimmten
Gewebearealen. Die externe Entwicklung ist ideal für die zeitlich festgelegte Inkubation mit
Substanzen, die einfach zum Kulturmedium zugegeben und auch wieder ausgewaschen
werden können, während in vivo die dadurch hervorgerufenen Phänotypen zu beobachtet
sind. Die große Anzahl an Eiern (mehrere hundert Eier pro Gelege) ermöglicht zudem die
Manipulation
vieler
Embryonen
zur
quantitativen
Auswertung
der
beobachteten
Phänotypen. Durch die unterschiedliche Pigmentierung der Blastomeren lässt sich schon
im 4-Zellstadium das spätere Zellschicksal der einzelnen Blastomere erkennen. Dadurch
wird eine gezielte Injektion ermöglicht, damit die Manipulation nicht per se den ganzen
Embryo trifft. So wird beispielsweise die Aufdeckung einer Genfunktion in einem
bestimmten
Bereich
des
Embryos
ermöglicht.
Zur
Untersuchung
der
LR-
2
Einleitung
Achsenentwicklung lässt sich damit gezielt die linke oder rechte Seite manipulieren und
die uninjizierte Seite kann als interne Kontrolle dienen.
Die Entstehung der dorso-ventralen und anterior-posterioren Körperachsen
Die frühe Festlegung der Köperachsen ist für die Musterbildung des Embryos
entscheidend. So werden durch die Spezifizierung der AP-Achse, die sich entwickelnden
anterioren Strukturen, wie der Kopf, von posterioren Strukturen, wie dem Schwanz,
räumlich getrennt, während sich Rücken und Bauchstrukturen entlang der dorso-ventralen
(DV) Achse ausrichten.
Die LR-Achse, die später die asymmetrische Ausrichtung der
inneren Organe gewährleistet, wird als letzte der drei Körperachsen spezifiziert. Im
primären Symmetriebruch von Xenopus sind maternale Faktoren des Eies involviert,
welche asymmetrisch entlang der animal-vegetalen Achse abgelegt sind und durch die
somit eine Polarität der unbefruchteten Eizelle entsteht. Von außen betrachtet lässt sich
diese Polarität anhand der Pigmentierung erkennen. So ist die animale Hemisphäre
dunkel pigmentiert und schützt den Embryo vor der mutagenen Wirkung des UV-Anteils
der Sonneneinstrahlung. Die animal-vegetale Achse entspricht in etwa der späteren APAchse. Die Ausrichtung der DV-Körperachse wird durch den Eintrittsort des Spermiums
festgelegt. Durch den Spermiumeintritt, der nur in der animalen Hemisphäre stattfinden
kann, kommt es zu einer Umorganisation von Mikrotubuli und einer Rotation des Zellcortex
in Richtung des Eintrittsorts (Vincent and Gerhart, 1987; Gerhart et al., 1989). Zeitgleich
werden
vegetal
abgelegte
maternale
Faktoren
entlang
der
Rotationsbewegung
verschoben und legen die dorsale Seite fest. Somit entsteht die dorsale Seite gegenüber
dem Spermiumeintrittsorts, welcher wiederum zur ventralen Seite wird.
Die Rotation des Zellcortex kann dabei für die Verschiebung der dorsalen Determinanten
nicht ausreichend sein. So verschiebt sich der Zellcortex durch die Rotation nur um 30
Grad, während die dorsalen Faktoren, ausgehend vom vegetalen Pol bis in Nähe des
Äquators verschoben werden und hierbei die Rotation des Cortex übertreffen. Die
Entdeckung von Membran gebundenen Organellen, die sich schneller als die Rotation in
dorsale Richtung bewegen, legte die Vermutung nahe, dass ihr Transport durch
Motorproteine entlang der Mikrotubuli bewerkstelligt wird. Dabei hängen sowohl die
kortikale Rotation als auch die Verschiebung der dorsalen Determinanten von der
Umorganisation der Mikrotubuli ab. Diese befinden sich unter anderem im subcortikalen
3
Einleitung
Bereich der vegetalen Hemisphäre und organisieren sich nach der Befruchtung zu
parallelen Bündeln, deren Plus-Ende sich in Richtung der dorsalen Seite orientiert
(Weaver and Kimelman, 2004; Houston, 2012).
In Folge der Umlagerung dorsaler Determinanten wird ß-Catenin im Zellkern lokalisiert.
Die Bedeutung, die ß-Catenin für die Spezifizierung der dorsalen Seite inne hat, lässt sich
anhand von Embryonen verdeutlichen, deren maternales ß-Catenin via MorpholinoOligonukleotiden reduziert wurde und die einen Verlust dorsaler Strukturen aufweisen
(Heasman et al., 1994). Ohne Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs wird ßCatenin normalerweise durch einen Proteinkomplex im Cytoplasma festgehalten, der
durch Phosphorylierung via Casein Kinase 1α und Glykogen Synthase Kinase 3 (GSK-3)
zur Ubiquitinylierung und Degradation von ß-Catenin führt. Die Bindung eines WntLiganden an seinen Rezeptor führt im kanonischen Signalweg zur Aktivierung von
Dishevelled (Dsh), welches den Degradationskomplex inhibiert, sodass ß-Catenin
stabilisiert wird und sich im Zellkern anreichern kann. Dort aktiviert ß-Catenin im
Zusammenspiel mit Tcf/Lef Transkriptionsfaktoren die Expression seiner Zielgene (Sokol,
1999; Cadigan and Waterman, 2012).
Als mögliche dorsale Determinanten werden mehrere Moleküle diskutiert, die im Zuge der
cortikalen Rotation und Ausrichtung der Mikrotubuli vom vegetalen Pol der Zelle auf der
dorsalen Seite akkumulieren, um die Stabilisierung von ß-Catenin zu gewährleisten
(Weaver and Kimelman, 2004). Beispielsweise wirken Dsh und GBP („GSK3-binding
protein“), ein Inhibitor der GSK-3, als intrazelluläre Vermittler des kanonischen WntSignalwegs, die auch unabhängig von der extrazellulären Aktivierung durch einen WntLiganden die dorsale Stabilisierung von ß-Catenin gewährleisten. So ist eine dorsale
Anreicherung Dsh-positiver Vesikel-ähnlicher Organellen nach Beendigung des ersten
Zellzyklus zu beobachten (Miller et al., 1999). Mittels GFP-Markierung von Dsh und GBP
konnte für beide Proteine eine Bewegung in Richtung der kortikalen Rotation gezeigt
werden. Dabei kann GBP sowohl an die leichte Kette der Kinesine als auch an Dsh binden
(Weaver et al., 2003). Kinesin-Motorproteine bewegen sich entlang von Mikrotubuli vom
Minus-Ende in Richtung Plus-Ende. Somit könnte der dorsale Transport dieser
Determinanten über die Kinesin-Bewegung entlang der Mikrotubuli vermittelt werden
(Weaver and Kimelman, 2004). Dass zudem eine Liganden-abhängige Aktivierung des
kanonischen Wnt-Signalwegs für die dorsale Stabilisierung von ß-Catenin notwendig ist,
4
Einleitung
zeigt sich durch den Verlust von maternalem Wnt11 oder Wnt5 (Tao et al., 2005; Cha et
al., 2008).
Die Spezifizierung der dorsalen Achse durch ß-Catenin induzierte Genexpressionen
beginnt nach der Midblastula-Transition (Beginn der zygotischen Gentranskription),
während die Anreicherung von kernlokalisiertem ß-Catenin auf der dorsalen Seite des
Embryos schon ab dem 16-32-Zellstadium zu beobachten ist (Larabell et al., 1997). In der
zeitlichen Lücke, die zwischen der Anreicherung von ß-Catenin und der Aktivierung von
Gentranskription besteht, ist ß-Catenin in den Zellkernen der dorsalen Seite wichtig für die
Chromatinmodifikation der Promotorregionen (Blythe et al., 2010).
Die Spezifizierung der Keimblätter und Gastrulation
Die ersten zwölf Zellteilungen in der Entwicklung von Xenopus folgen zeitlich rasch
aufeinander. Während dieser Entwicklungsphase nimmt der Embryo nicht an Größe zu, da
in
diesen
Zellzyklen
die
Replikation
der
DNA,
Mitose
und
Zellteilung
direkt
aufeinanderfolgen, ohne dass dazwischen Phasen des Zellwachstums benötigt werden.
Im Stadium der Midblastula-Transition besteht der Embryo aus etwa 4000 Zellen und hat
die Form einer Kugel. Dieses Stadium ist bei den meisten Wirbeltieren gekennzeichnet
durch einen flüssigkeitsgefüllten Hohlraum, das Blastocoel, welcher durch aktive
Ionentransportvorgänge gebildet wird. Das Blastocoel trennt die animale Polkappe von
dem äquatorialen und vegetalen Bereich. Ab diesem Stadium verlängert sich die Dauer
der einzelnen Zellzyklen, da nun zygotische Gentranskription stattfindet und die Interphase
neben der Synthesephase auch die Lückenphase zur Ergänzung von Zellbestandteilen
aufweist. Ermöglicht wird das späte Einsetzen zygotischer Genaktvität durch maternale
Vorräte, die beispielsweise die Replikation der DNA ermöglichen. Durch weitere maternale
Faktoren wie mRNAs, die für Transkriptionsfaktoren codieren und die schon in der Oocyte
lokalisiert
platziert
werden,
wird
gewährleistet,
dass
verschiedene
Gene
in
unterschiedlichen Arealen des Embryos transkribiert werden (Heasman, 2006). So findet
sich beispielsweise maternale mRNA für den T-Boxtranskriptionsfaktor VegT angereicht in
den vegetalen Zellen (Stennard et al., 1996). VegT ist entscheidend für die Spezifizierung
des vegetalen Pols zu Entoderm und für die Mesoderminduktion in den darüberliegenden
Zellen (Zhang and King, 1996; Zhang et al., 1998; Kofron et al., 1999). Mit Eintreten in die
Midblastula-Transition induziert VegT die Transkription von Zielgene wie die der Nodal5
Einleitung
verwandten Proteine, welche sezernierte Wachstumsfaktoren darstellen und als
Morphogene agieren können (Chen and Schier, 2001).
Morphogene sind dadurch charakterisiert, dass sie über gewisse Distanzen diffundieren
können und in unterschiedlichen Konzentrationen verschiedene Genexpressionen
anschalten. Nodal-verwandte Proteine induzieren in hohen Konzentrationen Entoderm
während niedrigere Konzentrationen für die Induktion von Mesoderm ausreichend sind
(Shen, 2007). Neben VegT wirkt auch nukleäres ß-Catenin auf die Expression Nodalverwandter Proteine, mit der Folge, dass diese in einem von dorsal nach ventral
verlaufenden Gradienten exprimiert werden und bei höherer Aktivität dorsales Gewebe
spezifizieren (Agius et al., 2000; Kimelman, 2006). Der vegetale Pol spezifiziert über die
Nodal-verwandten Proteine das angrenzende Gewebe zu Mesoderm. Das über dem
Mesoderm am animalen Pol liegende Gewebe entwickelt sich zu Ektoderm, da es durch
das Blastocoel vor den induzierenden Faktoren des vegetalen Pols geschützt ist. Somit
gliedert sich das Blastulastadium in einen vegetalen Pol aus Entoderm und einen
animalen Pol aus Ektoderm, mit dem Mesoderm dazwischenliegend im äquatorialen
Bereich, der sogenannten Randzone. Die Information über dorsale versus ventrale
Identität wird durch die Aktivität des kanonischen Wnt-Signalweg vermittelt, der wie bereits
oben beschrieben asymmetrisch auf der dorsalen Seite aktiviert wird. Durch das
Zusammenspiel von ß-Catenin mit anderen maternalen Faktoren wird in der vegetalen
dorsalen Region der Blastula das Nieuwkoop-Zentrum als initiales dorsales Signalzentrum
ausgebildet. Es dient dafür, die Bildung des Spemann-Organisators in den darüber
liegenden dorsalen Zellen der Randzone zu spezifizieren. Der Spemann Organisator als
Signalzentrum ist wichtig für die Musterbildung der AP- und der DV-Achse und induziert
die Bildung des Zentralen Nervensystems (Wolpert et al., 2007). Transplantiert man die
Region des Spemann Organisators in den Bereich der ventralen Randzone so bildet sich
eine zweite dorsale Achse aus (Spemann and Mangold, 1924).
Aus dem dorsalen Mesoderm gehen später die Chorda dorsalis (axial; im Weiteren als
Notochord bezeichnet) und die Somiten (paraxial) hervor, während sich aus dem dorsalen
Ektoderm das Nervengewebe und aus dem ventralen Ektoderm die Haut bilden. Da der
spätere Embryo von außen mit Ektoderm ummantelt ist, müssen das Mesoderm und das
Entoderm im Zuge der Gastrulation ins Innere des Embryos umgelagert werden. Für das
Auftreten von Gastrulationsbewegungen spielen Änderungen in der Zellform, Zelladhäsion
und die Zellmotilität eine wichtige Rolle. Zu Beginn der Gastrulation werden im
6
Einleitung
Äquatorialbereich, auf der dorsalen Seite beginnend, die sogenannten Flaschenhalszellen
gebildet. Durch apikale Konstriktion verändern sie ihre Zellform und bilden eine Vertiefung,
welche die dorsale Urmundlippe festlegt. Die dorsale Urmundlippe entspricht dem
Spemann Organisator. Durch Involution (Einrollen als zusammenhängendes Gewebe) und
konvergente Extensionsbewegungen (siehe unten) wandern die Zellen des Ento- und des
Mesoderms dann ins Keiminnere ein, während durch Epibolie (Ausbreitung über radiale
Interkalation) die Öberfläche des Ektoderms vergrößert wird. Mit fortschreitender
Gastrulation breitet sich die Bildung der Urmundlippe nach ventral aus, sodass sich der
ringförmige Blastoporus bildet. Sind beide Keimblätter eingewandert, wobei das Entoderm
nun den Urdarm, das Archenteron oder Gastrocoel, auskleidet und das Mesoderm im
tiefen Gewebe liegt, kommt es zur Neurulation, der Bildung und Einstülpung des
Neuralrohres. In den Stadien der Neurulation findet zudem auch die Determinierung der
LR-Achse statt (Solnica-Krezel, 2005; Gilbert, 2006; Wolpert et al., 2007).
Die LR-Achse weist Asymmetrien bezüglich der inneren Organe auf
Wirbeltiere weisen von außen betrachtet eine bilaterale Symmetrie auf. So lässt sich
anhand der Augen, Ohren und Gliedmaßen eine spiegelbildliche Anordnung entlang der
Mittellinie erkennen. Die inneren Organe sind dagegen nicht spiegelbildlich aufgebaut,
sondern ordnen sich in ihrer Entwicklung asymmetrisch entlang der LR-Achse an (Wolpert
et al., 2007). Die korrekte Lage und Morphologie der asymmetrisch angelegten Strukturen
zueinander ist entscheidend für ihre Funktion. Ist dies gegeben so spricht man von Situs
solitus. Wenn alle Organe im Bezug zueinander in einer vollständig umgekehrten Position
entlang der LR-Achse angeordnet sind, wird dies als Situs inversus (oder auch Situs
inversus totalis) bezeichnet. Unter Situs ambiguus (oder auch Situs inversus partialis)
versteht man dagegen die Situation, wenn ein Teil der Organe richtig entlang der LRAchse angeordnet ist, während der andere Teil es nicht ist. Zudem können die linke oder
rechte Seite auch die inneren Organe betreffend ein Spiegelbild ihrer selbst darstellen,
dies bezeichnet man dann als Isomerismus (linker Isomerismus: Polysplenia; rechter
Isomerismus: Asplenia; Hackett, 2002). Während der Situs inversus totalis, der mit einer
Häufigkeit von etwa eins zu 8500 auftritt, keine gesundheitsgefährdenden Symptome nach
sich zieht, haben der Situs ambiguus und Organisomerismen oft schwerwiegende Folgen
(Brueckner, 2007; Wolpert et al., 2007).
7
Einleitung
Die
Nodal-Genkaskade
im
linken
Seitenplattenmesoderm
bestimmt
die
asymmetrische Positionierung der Organe
Die asymmetrische Entwicklung entlang der LR-Achse wird über eine innerhalb der
Vertebraten konservierte Genkaskade vermittelt, welche die linke Seite spezifiziert und sie
von der rechten Seite unterscheidbar macht (Hamada et al., 2002). Diese sogenannte
Nodal-Genkaskade tritt im Stadium der Neurulation als Folge des Symmetriebruchs auf.
Damit stellt die LR-Achse die Körperachse dar, die als letzte im Laufe der frühen
Embryonalentwicklung spezifiziert wird.
Die Nodal-Genkaskade wirkt als Determinante der linken Seite, da ihr Vorhandensein im
Seitenplattenmesoderm die linksspezifische Morphologie bestimmt, während ihr Fehlen
die rechtsspezifische Morphologie vermittelt. So weisen beide Körperhälften bei einer
fehlenden Nodal-Genkaskade eine rechtsspezifische Anordnung der inneren Organe
(rechter Isomerismus) auf, während der Organismus einen linken Isomerismus aufweist,
wenn die Genkaskade auf beiden Seiten exprimiert wird (Hamada et al., 2002). Nodal oder
Nodal-verwandte Proteine gehören zu den TGFß-Wachstumsfaktoren und aktivieren wie
die meisten Mitglieder dieser Familie Serin-/Threonin-Kinase-Rezeptoren, welche
wiederum durch Phosphorylierung von Smad Proteinen die Gentranskription regulieren.
Als Dimere aktivieren sie ihren Signalweg über Bindung an Typ-2-Aktivinrezeptoren, die
daraufhin mit Typ-1-Aktivinrezeptoren einen heterotetrameren Komplex bilden, um als
Serin-/Threonin-Kinasen zu agieren. Im Gegensatz zu anderen TGFß-Liganden wie
Derrière oder Aktivin benötigen Nodal-Proteine Korezeptoren der EGF-CFC-Familie. Im
Nodal-Signalweg
führt
die
Rezeptoraktivierung
zur
Phosphorylierung
der
Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3, die daraufhin mit Smad4 einen Komplex
bilden. Dieser Komplex wandert in den Zellkern und reguliert im Zusammenspiel mit
anderen Transkriptionsfaktoren wie FoxH1 oder Mixer die Gentranskription (Shen, 2007b;
Schier, 2009). Während Maus, Huhn und Mensch nur über ein Nodal-Protein verfügen,
existieren mehrere Homologe in den Modellorganismen Krallenfrosch und Zebrabärbling.
Im Krallenfrosch wird das Nodal-verwandte Protein Xenopus-Nodal-related 1 (Xnr1) im
Zuge der asymmetrischen Genkaskade im linken Seitenplattenmesoderm exprimiert
(Lowe et al., 1996).
Die Nodal-Genkaskade beginnt mit der Expression von Nodal/Xnr1 im posterioren Bereich
des Seitenplattenmesoderms und weitet sich in anteriore Richtung aus, da der Nodal8
Einleitung
Signalweg seine eigene Expression im Sinne einer positiven Rückkopplung verstärkt.
Hierbei agiert der EGF-CFC-Faktor Cryptic als Korezeptor, der unter anderem im
Seitenplattenmesoderm und in der Mittellinie exprimiert wird und durch seine bilateral
symmetrische Expression auch die ektopische Induktion der Nodal-Genkaskade auf der
rechten Seite ermöglicht. Dass Cryptic nicht im paraxialen Mesoderm exprimiert wird,
liefert eine mögliche Erklärung warum sich die asymmetrische Genkaskade nicht auf
diesen Bereich ausbreitet (Shen et al., 1997; Gaio et al., 1999; Yan et al., 1999). Neben
seiner eigenen Expression induziert Nodal die Expression von Lefty-Proteinen, die
ebenfalls zur TGFß-Familie zählen. Lefty-Proteine verhindern durch Interaktion mit EGFCFC-Proteinen oder Nodal selbst die Rezeptorbindung und beschränken so als
Antagonisten die räumlich und zeitliche Expression der Nodal-Genkaskade (Meno et al.,
1998, 2001; Nakamura et al., 2006; Müller et al., 2012). In der Seitenplatte wird neben
Lefty2
die
Expression
des
Homeoboxtranskriptionsfaktor
Pitx2c
als
Teil
der
asymmetrischen Genkaskade von Nodal induziert. Pitx2c überdauert zeitlich die
Expression von Nodal bis zur Bildung der Organanlagen und gilt als Mediator der
asymmetrischen Organmorphogenese (Campione et al., 1999; Schweickert et al., 2000;
Shiratori et al., 2001; Hamada et al., 2002). So weisen Mausembryonen denen spezifisch
Pitx2c in der Seitenplatte fehlt, Defekte in der asymmetrischen Morphogenese vieler
Organe auf (Liu et al., 2001; Shiratori et al., 2006; Simard et al., 2009). Beispielweise
vermittelt Pitx2c die erste morphologische Asymmetrie des Darmrohres bei Amnioten, eine
Schrägstellung zur linken Seite, über Seitenunterschiede in der extrazelullären Matrix und
in Zell-Zelladhesionen des dorsalen Mesenteriums (Davis et al., 2008; Kurpios et al.,
2008).
In allen bisher untersuchten Wirbeltieren, außer dem Huhn, auf das später noch
eingegangen wird, konnte gezeigt werden, dass der Symmetriebruch auf einem von
motilen primären Cilien erzeugten linksgerichteten Flüssigkeitsstrom beruht.
Motile primäre Cilien im Zentrum des Symmetriebruchs
Die den linksgerichteten Flüssigkeitsstrom generierenden Cilien zählen zu den
sogenannten primären Cilien. Primäre Cilien lassen sich auf fast allen Zellen der
Wirbeltiere finden. Als motile Cilien können sie extrazelluläre Flüssigkeitsbewegungen
generieren oder einzelne Zellen bewegen, während immotile Cilien, wie beispielsweise die
9
Einleitung
der Riechzellen oder Photorezeptorzellen, sensorische Funktionen wahrnehmen (Berbari
et al., 2009). Das Axonem, das Skelett des Ciliums, ist aus neun peripheren MikrotubuliDuplets und einer variablen Anzahl zwischen keinem, einem oder zwei inneren
Mikrotubuli-Duplets aufgebaut (Feistel and Blum, 2006). Die benachbarten MikrotubuliDuplets sind bei motilen Cilien durch Dyneinarme verbunden, welche die Motilität
gewährleisten (Hirokawa et al., 2009).
Erste Hinweise, die einen Zusammenhang zwischen motilen Cilien und der korrekten
Etablierung der LR-Achse erkennen ließen, lieferten Untersuchungen des humanen
Karthagener-Syndroms (Afzelius, 1976). Später wurde in der Maus eine mit beweglichen
Monocilien besetzte transiente Struktur, urspünglich als „node“ benannt, beschrieben, die
wichtig für die Bildung der LR-Achsendeterminierung ist (Sulik et al., 1994; Harvey, 1998;
Nonaka et al., 1998). Aufgrund von Untersuchungen zur genaueren Identität dieser
Struktur wird sie bezüglich ihrer Lage auch als posteriores Notochord (PNC) bezeichnet
(Blum et al., 2007). Die Bedeutung ihrer Monocilien wird anhand von Kif3b KnockoutMäusen deutlich. Kif3b codiert für eine Untereinheit des heterotrimeren Kinesin-3Komplexes, wobei Kinesine als Motorproteine für die Ciliogenese essentiell sind. Kif3b
Knockout-Mäuse bilden keine Monocilien auf dem PNC aus und weisen LRAchsendefekte auf (Nonaka et al., 1998). Den Beweis, dass die Motilität dieser Cilien
essentiell ist, lieferten Arbeiten an der „situs inversum viscerum“ (iv) Mauslinie, die eine
randomisierte Expression der asymmetrischen Markergene besitzt (Lowe et al., 1996;
Meno et al., 1996; Campione et al., 1999). Entscheidend war hierbei die Aufdeckung der
für die LR-Defekte kausalen Mutation in der schweren Kette des axonemalen „left-right
dynein“ (lrd), welches in den PNC-Monocilien der Maus exprimiert wird (Supp et al., 1997,
1999). Da axonemale Dyneine die Motiltät von Cilien gewährleisten, sind die Monocilien
des PNC von iv-Mäusen unbeweglich (Okada et al., 1999).
Neben der Maus konnte auch für die Modellorganismen Kaninchen, Zebrabärbling und
Xenopus ein mit motilen Monocilien besetztes Epithel im Bereich des posterioren
Notochords beschrieben werden. Dieses wird im Kaninchen ebenfalls als „node“ oder
PNC, im Zebrabärbling als Kupffer’sches Vesikel (KV) und im Krallenfrosch als Dachplatte
des Gastrocoels („gastrocoel roof plate“;GRP) bezeichnet (Essner et al., 2002, 2005;
Okada et al., 2005; Blum et al., 2007; Schweickert et al., 2007). Die Monocilien sind am
posterioren Pol der jeweiligen Zellen verankert und führen eine rotierende Bewegung aus,
die mit Sicht auf die apikale Seite des Epithels im Uhrzeigersinn verläuft. Durch die
10
Einleitung
konvexe Wölbung der Zelloberfläche ist die Rotationsachse in posteriore Richtung gekippt.
Dies führt dazu, dass sich die Cilien in ihrer linksseitigen Drehung in einiger Distanz zur
Zelloberfläche befinden, während sie sich im Zuge der rechtsseitigen Drehung nahe der
Zelloberfläche befinden. Dies hat wiederum zur Folge, dass die linkseitige Drehung
effektiver wirkt als die rechtsseitige. Dadurch entsteht ein nach links gerichteter
Flüssigkeitsstrom, der durch Applikation fluoreszierender Latex-Kügelchen visualisiert
werden kann (Hirokawa et al., 2006; Schweickert et al., 2007). Da die Etablierung LRasymmetrischer Genexpressionen durch das den Flüssigkeitsstrom-generierende Epithel
gewährleistet wird, kann es auch als Organisator der LR-Achse bezeichnet werden.
Die Bedeutung des LR-Organisators lässt sich im Frosch veranschaulichen, indem man
die Viskosität von Methylcellulose und die Injektion dieser ins Archenteron von
Neurulastadien nutzt, um den linksgerichteten Flüssigkeitsstrom zu unterbinden.
Injektionen, die vor Beginn des linksgerichteten Flüssigkeitsstromes durchgeführt werden,
verhindern bei fast 50% der Embryonen die Induktion asymmetrischer Markergene der
Seitenplatte (Schweickert et al., 2007). Neben dieser mechanischen Inhibition lässt sich
der Flüssigkeitsstrom molekular durch den Knockdown der axonemalen schweren
Dyneinketten („dynein axonemal heavy chain“) Dnah5 und Dnah9, die beide in der GRP
des Krallenfrosches exprimiert werden, inhibieren. Dies hat wie die Applikation von
Methylcellulose ein Fehlen der asymmetrischen Genexpression zur Konsequenz (Vick et
al., 2009). Somit stellt das posteriore Ende des Notochords im Frosch gleichsam den
„Organisator“ der LR-Achse dar und die Morphogenese der GRP ist damit essentiell für
den Symmetriebruch.
Morphogenese und Spezifizierung des LR-Organisators von Xenopus laevis
Vor Beginn der Gastrulation besteht die Randzone aus einer superfiziellen epithelialen
Schicht und den tiefen mesenchymalen Zellen des Mesoderms. Zellen der superfiziellen
Randzone lassen sich in entodermale und mesodermale Zellen einteilen, wobei die
mesodermalen superfiziellen Zellen sich im dorsalen Bereich befinden. Während durch
Involution das tiefe mesenchymale Mesoderm zu seiner endgültigen Lage zwischen der
entodermalen Auskleidung des Gastrocoels und dem Ektoderm zu liegen kommt, stellt das
superfizielle Mesoderm eine Besonderheit dar. Es kleidet nach Abschluss der Gastrulation
das epitheliale Dach des Gastrocoels aus und wird erst gegen Ende der Neurulation durch
11
Einleitung
Ingression in die darunterliegende mesenchymale Schicht verlagert (Keller et al., 2003;
Shook et al., 2004). Im Jahr 2004 wurde das superfizielle Mesoderm von X. laevis
erstmals beschrieben. Durch Biotinylierung von Blastulaembryonen war es möglich,
ausschließlich die epithelialen Zellen zu markieren, um sie von den mesenchymalen
Zellen abzugrenzen und ihre spätere Integration in die tiefen Schichten des Mesoderm zu
verfolgen. Zudem konnte durch eine rasterelektronenmikroskopische Analyse die GRP
näher charakterisiert und die Existenz ihrer Monocilien dargestellt werden. Dabei lassen
sich die GRP-Zellen morphologisch von den flankierenden, großen Entodermzellen
unterscheiden. Die GRP selbst wird in zwei Zonen eingeteilt, in eine mediale und zwei
randständige, deren Zellen entweder der Notochord (medial) oder den Somiten
(randständig) aufliegen. Beide Zonen können optisch anhand der Grenze, die sich in den
tiefen Schichten zwischen dem Notochord und den Somiten erkennen lässt und sich bis
an die Oberfläche des Gastrocoels fortsetzt, unterschieden werden. Posterior setzt sich
die GRP bis in die dorsale Region des „circum blastoporal collars“ (CBC) fort (Shook et al.,
2004). Der CBC stellt eine Verdickung dar, die sich ringförmig um den Blastoporus zieht,
und besteht aus mesodermalem Gewebe, das im Laufe der Entwicklung zur posterioren
Verlängerung der Somiten und des Notochords beiträgt (Keller, 1976; Keller et al., 1989).
Abbildung 1: Die GRP bildet sich aus den superfiziellen Mesodermzellen der Gastrulastadien
(A,B) Schematische Darstellungen eines sagittalen Anschnittes von Embryonen im Gastrula (A) und
Neurulastadium (B). (A) Das superfizielle Mesoderm (grün) befindet sich epithelial oberhalb der dorsalen
Urmundlippe (dl). (B) Nach Einwanderung des Entoderms (gelb) und Mesoderms (rot) wird der Embryo von
außen mit Ektoderm (blau) bedeckt. Die mesodermalen Zellen liegen im tiefen Gewebe zwischen dem
Entoderm und dem Ektoderm. (B’) Das superfizielle Mesoderm bildet transient die Dachplatte des
Gastrocoels (GRP; grün in B’) und wird lateral von entodermalen Zellen („lateral endodermal cells“;LECs)
begrenzt. (C) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der GRP (aus Schweickert et al., 2007). Cilien
fangen im Neurulastadium 14 (C’) an auszuwachsen. Im Neurulastadium 19 (C’’) sind sie vollständig
ausgewachsen und lokalisieren am posterioren Pol der Zelle. a, anterior; an, animal; ar, archenteron; bc,
Blastocoel; bp, Blastoporus; CBC, „circum blastoporal collar“; d, dorsal; l, links; p, posterior; r, rechts; v,
ventral; veg, vegetal; Schemazeichnungen Bernd Schmid, Hohenheim
Da die GRP nur eine transiente Struktur darstellt, werden die lateralen Zellen später durch
apikale Konstriktion und Ingression (X.laevis) in den Verbund der Somiten integriert,
12
Einleitung
während die Zellen der medialen Zone zur Bildung des Notochords oder des Hypochords
beitragen (Shook et al., 2004).
Die Spezifizierung des superfiziellen Mesoderm auf der dorsalen Seite wird durch den
kanonischen Wnt-Signalweg gewährleistet. Hierbei spielt Serotonin, welches mit Beginn
der Blastula-Stadien zunehmend in der superfiziellen Schicht der gesamten Randzone
angereichert wird, eine Rolle als Kompetenzfaktor. Als Folge der Spezifizierung wird das
Masterkontrollgen für motile Cilien FoxJ1, das entscheidend für die spätere Ciliogenese
der GRP ist, im superfiziellen Mesoderm exprimiert (Beyer, Danilchik, et al., 2012). Nach
Einwanderung der Zellen über den Blastoporus nimmt die Expression von FoxJ1 ab,
während die von FoxJ1 aktivierten Gene Dnah9 und Tekt2 (codiert für Tektin2) in der GRP
der Neurulastadien exprimiert werden. Tektin2 stellt ebenfalls ein Cilien-assoziiertes
Protein dar, welches in Verbindung mit der Cilien-Motilität steht (Tanaka et al., 2004;
Stubbs et al., 2008). Im frühen Neurulastadium (Stadium 14) beginnen die Cilien der GRP
auszuwachsen, wobei sie in diesem Stadium meist medial an der apikalen Zelloberfläche
lokalisieren. Mit fortschreitender Neurulation verlängern sich die Cilien und werden an den
posterioren Pol der Zelloberfläche verlagert, sodass sich ab St.17 ein robuster
linksgerichteter Flüssigkeitsstrom ausbilden kann. Dieser ist im St.19/20 nur noch schwach
zu detektieren, da die Zellen der GRP zunehmend in das tiefe Gewebe einwandern
(Schweickert et al., 2007).
Neben dem kanonischen Signalweg, der hier für die initiale Spezifizierung der GRP
entscheidend
ist,
spielen
auch
nicht-kanonische
ß-Catenin-unabhängige
Wnt-
Signaltransduktionen eine Rolle für die Morphogenese der GRP. So vermittelt der nichtkanonische Wnt/PCP („planar cell polarity“) Signalweg, der den Zellen eine Polarität
entlang ihrer planaren Achse verleiht, die posteriore Lokalisierung der Cilien (Antic et al.,
2010; Song et al., 2010).
Ob im Wnt-Signalweg nachgeschaltet zum Rezeptor kanonische oder nicht-kanonische
Signaltransduktionen stattfinden, wird unter anderem durch die unterschiedlichen
Liganden vermittelt. Liganden wie Wnt1, -3a und -8 aktivieren den kanonischen Signalweg
und können so bei Überexpression eine zweite Achse auf der ventralen Seite induzieren,
während Liganden wie Wnt4, -5a und -11 keine achseninduzierende Wirkung aufweisen
(Kohn and Moon, 2005). Wnt11 steht dabei in Bezug zum nicht-kanonischen Wnt/PCPSignalweg und dem Wnt/Calcium-Signalweg (Heisenberg et al., 2000; Tada and Smith,
2000; Kühl, 2004). In der LR-Achsenentwicklung übt dieser Ligand nur einen moderaten
13
Einleitung
Effekt auf die Expression von FoxJ1 aus, während er entscheidend in der Polarisierung
der GRP-Cilien und der Morphogenese der GRP-Zellen mitwirkt (Walentek, 2012).
Die Umsetzung des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms: Morphogen- versus ZweiCilien-Modell
Für
die
Umsetzung
des
biomechanischen
Prozesses
des
linksgerichteten
Flüssigkeitsstroms in eine biochemische linksspezifische Information wurden zwei
Hypothesen postuliert. Im „Morphogen-Modell“ wird angenommen, dass symmetrisch
freigesetzte Faktoren durch den gerichteten Flüssigkeitsstrom auf die linke Seite
transportiert werden, um dort eine Signalkaskade zu starten (Nonaka et al., 1998; Okada
et al., 1999). In diesem Falle sollten die entsprechenden Faktoren jedoch aus dem
medialen Teil des cilienbesetzten Epithels hervorgehen, da gezeigt werden konnte, dass
der von der rechten Seite der GRP generierte Flüssigkeitsstrom nicht für die korrekte LRAchsenetablierung
benötigt
wird
(Vick
et
al.,
2009).
Dem
Morphogen-Modell
gegenübergestellt wird das „Zwei-Cilien-Modell“, welches neben den motilen Cilien
mechanosensorische immotile Cilien zur Detektion des Flüssigkeitsstroms impliziert. Tabin
und Vogan postulierten es im Jahr 2003, basierend auf der Beobachtung, dass Mutationen
welche
die
Motilität
Expressionsmuster
der
Cilien
asymmetrischer
betreffen
eine
Markergene
in
andere
der
Auswirkung
Seitenplatte
auf
haben,
das
als
Mutationen, welche die Bildung der Cilien beinflussen (Wagner and Yost, 2000;
Brueckner, 2001). Die Hypothese mechanosensorischer Cilien wurde dabei von
Hinweisen,
dass
ein
cilienständiger
Polycystin-Komplex
in
Nierenzellen
eine
mechanosensorische Funktion ausübt und durch LR-Achsendefekte bei Knockout-Mäusen
des Polycystischen Nierensyndrom Gens Pkd2 („polycystic kidney disease 2“) unterstützt
(Igarashi and Somlo, 2002; Pennekamp et al., 2002; Yoder, 2002; Tabin and Vogan,
2003). Die Gene Pkd1 und Pkd2 kodieren für die Transmembranproteine Polycystin-1
(PC1) und Polycystin-2 (PC2), die als Heterodimere auf den primären Cilien verschiedener
Zelltypen lokalisieren (Dalagiorgou et al., 2010). Polycystin1, ein G-Protein-gekoppelter
Rezeptor, verfügt über eine große extrazelluläre Domäne, die als Sensor agieren soll,
während
Polycystin-2
einen
Calcium-durchlässigen
Kationenkanal
darstellt.
Im
Zusammenspiel sollen sie beide den Flüssigkeitsstrom entlang von Nierenepithelzellen
mechanosensorisch detektieren und in einen Einstrom von Calcium übersetzen
(Praetorius and Spring, 2001; Nauli and Zhou, 2004).
14
Einleitung
Durch GFP-Markierung des lrd- und Pkd2-Genlokus der Maus lässt sich erkennen, dass
alle Monocilien des PNCs Pkd2-positiv sind, während dagegen die Cilien der
randständigen PNC-Zellen kein lrd exprimieren und unbeweglich sind. Als Folge des
Flüssigkeitsstrom kann ein intrazellulärer Calciumanstieg an der linken Seite des PNCs
beobachtet werden, der abhängig von der Expression von Pkd2 ist (McGrath et al., 2003).
Dabei ist die Lokalisation von Pkd2 in den randständigen Zellen des PNCs für die korrekte
Determinierung der LR-Achse ausreichend (Yoshiba et al., 2012). Anders als für das
Nierenepithel beschrieben agiert PC2 im PNC der Maus unabhängig von PC1, da die
Pkd1-Knockout Maus keine LR-Achsendefekte aufweist (Karcher et al., 2005). Im
Zebrabärbling lässt sich in den entsprechenden Stadien ebenfalls eine intrazelluläre
Calciumerhöung auf der linken Seite des KVs detektieren (Sarmah et al., 2005). Im PNC
der Maus oder im KV von Medaka gewährleistet PC2 im Zusammenspiel mit PC1l1
(„polycystin 1 like 1“), das eine hohe Sequenzähnlichkeit zu PC1 aufweist, die korrekte
Expression linkspezifischer Seitenplattengene (Vogel et al., 2010; Field et al., 2011;
Kamura et al., 2011). Weiterhin wurde auch im Zusammenhang mit dem MorphogenModell ein linksseitiger Calciumanstieg beschrieben (Tanaka et al., 2005).
In X. laevis lokalisiert PC2 ebenfalls auf den Cilien des LR-Organisators (Vick, 2009).
Durch Knockdown von Pkd2 mittels Morpholino-Oligonukleotiden (MO) zeigte sich jedoch,
dass Pkd2 im Frosch schon eine frühe Funktion in der Spezifizierung der GRP spielt. So
weisen Pkd2-MO injizierte Embryonen neben dem Verlust von FoxJ1 und dem damit
einhergehenden Verlust der GRP-Cilien eine gestörte GRP-Morphologie auf (Vick, 2009;
Grüdl, 2012).
Die
Bedeutung
der
bilateralen
Expression
von
Nodal
für
den
Transfer
linksspezifischer Information
Vor Beginn der konservierten asymmetrischen Genkaskade im Seitenplattenmesodem
wird Nodal bilateral im Bereich des posterioren Notochords exprimiert (Levin et al., 1995;
Lowe et al., 1996; Fischer et al., 2002; Long, 2003). In allen untersuchten
Modellorganismen, die einen linksgerichteten Flüssigkeitsstrom generieren, flankiert diese
paranotochordale Nodal-Domäne das symmetriebrechende, cilienbesetzte Epithel des LROrganisators. In der Maus werden die bilaterale Domäne im Bereich des PNCs und die
asymmetrische Domäne in der Seitenplatte von unterschiedlichen genregulatorischen
15
Einleitung
Sequenzen kontrolliert (Adachi et al., 1999; Norris and Robertson, 1999; Saijoh et al.,
2005). Der für die bilaterale Expression zuständige Promotor wird als NDE („node-specific
enhancer“) bezeichnet und liegt circa 10kb upstream des Nodal-Genlokus. Durch gezielten
Knockout dieser Enhancer-Region kommt es neben dem Verlust der bilateralen
Expression
um
das
PNC
zudem
zum
Verlust
der
asymmetrischen
Seitenplattenexpression. Somit ist die frühe PNC-Expression eine Voraussetzung für die
späte asymmetrische Expression von Nodal (Brennan et al., 2002; Saijoh et al., 2003). Die
asymmetrische Seitenplattenexpression wird in der Maus von zwei unterschiedlichen
Enhancer-Regionen kontrolliert, die beide FoxH1-Bindestellen aufweisen und aufgrund
dieser sensitiv auf die Aktivität des Nodal-Signalwegs reagieren (Saijoh et al., 2000, 2005).
Damit eröffnet sich die Möglichkeit, dass das im Bereich des PNCs exprimierte Nodal
selbst den Faktor darstellt, der in die Seitenplatte translokalisiert um dort die
asymmetrische Expression zu induzieren. In diesem Zusammenhang konnte ein weiterer
Wachstumsfaktor der TGFß-Familie (GDF1 in Maus und Derrière in Xenopus) beschrieben
werden, der wie Nodal bilateral das posteriore Notochord flankierend exprimiert wird und
ebenfalls essentiell für die Induktion der Seitenplattenexpression ist (Rankin et al., 2000;
Vonica and Brivanlou, 2007). Sowohl GDF1 als auch Derrière sind in der Lage mit Nodal
zu dimerisieren und sollen dadurch die weite Übertragung (sogenannte „longe range“
Aktivität) des Nodal-Proteins in die Seitenplatte vermitteln (Eimon and Harland, 2002;
Tanaka et al., 2007). Die paranotochordale Expression von GDF1 ist für die anfängliche
Induktion der asymmetrischen Genkaskade im posterioren Bereich der Seitenplatte
essentiell, während in der Seitenplatte exprimiertes GDF1 für die Ausweitung der
asymmetrischen Genkaskade in anteriore Richtung benötigt wird (Tanaka et al., 2007).
Eine weitere Bestätigung, dass paranotochordal exprimiertes Nodal direkt vor Ort die
Seitenplatteninduktion bewerkstelligt und nicht indirekt, z.B. über einen cytoplasmatischen
Signaltransfer vom PNC in die Seitenplatte, lieferten Untersuchungen am Korezeptor
Cryptic, der in diesen Stadien Nodal-Aktivität gewährleistet. So kann in Cryptic KnockoutMäusen, in denen durch ein Transgen Cryptic-Expression spezifisch in der Seitenplatte
wiederhergestellt wird, die asymmetrische Expression von Nodal und seiner Zielgene
Lefty2 und Pitx2c gerettet werden (Oki et al., 2007). Dies zeigt, dass allein die
Seitenplattenexpression von Cryptic ausreichend für die asymmetrische Genkaskade ist
und paranotochordales Nodal somit nicht über Signalaktivität am PNC die linksseitige
Genkaskade induziert.
16
Einleitung
Abbildung 2: Frühe LR-Achsenentwicklung von Xenopus laevis
FoxJ1 wird während der Gastrulastadien im superfiziellen Mesoderm exprimiert. Während den Stadien des
linksgerichteten Flüssigkeitsstroms wird Xnr1(Nodal) symmetrisch auf beiden Seiten der GRP transkribiert
(paranotochordal). Im Nerurulastadium 17 kann ein effektiver linksgerichteter Flüssigkeitsstrom durch die
Applikation fluoreszierender Mikrobeads und Zeitrafferaufnahmen visualisiert werden. Die Bewegung der
einzelnen Partikel wird mit einem Farbgradienten über die Zeit von grün (0 Sekunden) bis rot (25 Sekunden)
dargestellt (Abbildung aus Schweickert et al., 2007). Gegen Ende der Neurulation wird Xnr1 asymmetrisch
im linken Seitenplattenmesoderm exprimiert (Pfeilspitze). Dort induziert es die asymmetrische Expression
des Transkriptionsfaktors Pitx2c, dessen linkspezifische Expression bis zu Beginn der asymmetrischen
Organmorphogenese bestehen bleibt. Eine Woche nach der Befruchtung kann man die asymmetrische
Organmorphogenese einer X. laevis Kaulquappe anhand der Darmwindung (schwarz), der Lage der
Gallenblase (grün) und der Ausrichtung des Herzen (rot) erkennen. LECs, „lateral endodermal cells“; SPM,
Seitenplattenmesoderm
Übereinstimmend damit kann die autokrine-parakrine Nodal-Signalaktivität innerhalb der
bilateralen Domäne durch Überexpression des dominant-negativen ALK4 Rezeptors oder
des dominant-negativen Smad3 unter der Kontrolle des NDE-Enhancers unterbunden
werden, ohne den Verlust der asymmetrischen Genkaskade zu bewirken (Kawasumi et al.,
2011). Die Beschränkung der Genkaskade auf das linke Seitenplattenmesoderm wird
dabei durch einen Nodal-Antagonisten der Cerberus/Dan-Familie (Cerl-2 (Maus), Charon
(Zebrabärbling), Coco (Krallenfrosch)) gewährleistet (Hashimoto et al., 2004; Marques et
al., 2004; Vonica and Brivanlou, 2007). Dieser wird ebenfalls in den Stadien des
linksgerichteten Flüssigkeitsstroms bilateral um das posteriore Notochord exprimiert und
ähnelt somit der frühen Expressionsdomäne von Nodal und GDF1/Derrière. Cerl2/Coco
wird zu Beginn bilateral symmetrisch auf beiden Seiten exprimiert. Diese Symmetrie geht
mit einsetzender Aktivität des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms verloren, sodass die
linke Domäne im Vergleich zur rechten Domäne weniger Expression aufweist (Marques et
al., 2004; Schweickert et al., 2010; Nakamura et al., 2012). Coco stellt somit ein kritisches
Zielgen des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms dar und liefert die Verbindung zwischen
dem
Symmetriebruch
(linksgerichteter
Flüssigkeitsstrom)
und
linksseitiger
Geninduktion/linkseitigem Signaltransfer (Schweickert et al., 2010). Bisher unpublizierte
Daten unseres Labor zeigen, dass der Flüssigkeitsstrom auf noch nicht geklärte Weise
(Zwei
Cilien
Modell
versus
Morphogen-Modell)
über
die
3`UTR
von
Coco
17
Einleitung
posttranskriptionell seine linksseitige Repression bewirkt (unpublizierte Daten von Maike
Getwan). Auch in der Maus wird Cerl2 postranskriptionell über die 3`UTR reguliert
(Nakamura et al., 2012). Dadurch wird linkseitig weniger Cerl2-Protein translatiert und
paranotochordales Nodal-Protein auf der linken Seite von der Cerl2/Coco-Repression
freigelassen, um den Signaltransfer in die Seitenplatte bewerkstelligen zu können. In
Übereinstimmung damit konnte in der Maus gezeigt werden, dass durch die Repression
von Cerl2 linkseitig Nodal frei wirken kann und sich so Nodal-Signalaktivität abhängig vom
Korezeptor Cryptic in der Phosphorylierung von Smad2 im PNC und in der Seitenplatte
wiederspiegelt (Kawasumi et al., 2011).
Der
Symmetriebruch
des
Huhns
nimmt
innerhalb
der
Wirbeltiere
eine
Sonderstellung ein
Im Huhn konnte bislang kein linksgerichteter Flüssigkeitsstrom oder kein zum PNC der
Maus und zur GRP des Frosches äquivalenter epithelialer Bereich mit beweglichen Cilien
beschrieben
werden. Der konservierten
asymmetrischen Genkaskade im
linken
Seitenplattenmesoderm geht ebenfalls eine frühere Nodal-Expressionsdomäne im
posterioren Bereich des Notochords voran. In diesem Bereich nahe des Hensen Knoten
(Organisatorgewebe des Huhns) werden Nodal und eine Reihe anderer Genen
asymmetrisch exprimiert. Beispielsweise werden Nodal und Shh (Sonic Hedgehog) auf der
linken Seite des Hensen Knotens transkribiert, während der Rezeptor cAct-RIIa und Fgf8
auf der rechten Seite des Hensen Knoten exprimiert werden (Levin et al., 1995; Boettger
et al., 1999). Lange Zeit ging man davon aus, dass die asymmetrische Expression von
Shh der von Nodal vorausgeht, diese induziert und über diese die asymmetrische
Seitenplattenexpression von Nodal ermöglicht (Levin et al., 1995; Pagán-Westphal and
Tabin, 1998). Die Asymmetrie von Nodal scheint sich aber zeitgleich mit jener von Shh zu
entwickeln und Shh, welches zudem bilateral im Bereich der Seitenplatte exprimiert wird,
scheint ähnlich wie in der Maus in der Seitenplatte benötigt zu werden (Tsiairis and
McMahon, 2009; Tsikolia et al., 2012). Der asymmetrischen Genexpression um den
Knoten geht die asymmetrische Morphologie des Knoten voran, beide Prozesse sind
dabei die Folge von asymmetrischen linksgerichteten Zellbewegungen. Dies lässt sich
durch pharmakologische Inhibition dieser Zellbewegungen erkennen, die neben der
symmetrischen Morphologie auch zur symmetrischen Expression von Shh und Fgf8 führen
(Dathe et al., 2002; Gros et al., 2009).
18
Einleitung
Der FGF-Signalweg als zentraler Regulator der Embryogenese
Neben dem Nodal-Signalweg spielen noch weitere Signalwege eine wichtige Rolle in der
Etablierung der LR-Asymmetrie. So soll in dieser Arbeit insbesondere die Funktion des
FGF-Signalwegs erforscht werden. In den frühen Entwicklungsstadien von X. laevis, in
denen die Spezifierung des superfiziellen Mesoderms und die Morphogenese der GRP
ablaufen, finden FGF-abhängig Entwicklungsprozesse wie die Induktion des Mesoderms
und des Neuralgewebes, anteriore-posteriore Musterbildung sowie morphogenetische
Veränderungen und die Myogenese statt (Pownall and Isaacs, 2010). Da die GRP von
mesodermalen Ursprung ist, ist eine korrekte Spezifizierung des Mesoderms indirekt
wichtig
für
die
korrekte
Mesodermspezifizierung
Ausbildung
finden
der
während
LR-Achsenasymmetrie.
der
Gastrulation
Zeitgleich
zur
konvergente
Extensionsbewegungen statt, die entscheidend für die Gastrulation und somit für die
Morphogenese der GRP sind. Im Folgenden wird deswegen auf die Abhängigkeit der
Mesoderminduktion und der konvergenten Extensionsbewegungen von einem intakten
FGF-Signalweg eingegangen.
Zunächst sollen jedoch bekannte molekulare Grundlagen des FGF-Signalwegs kurz
erläutert werden, der aufgrund seiner diversen Funktionen wie der Regulierung von Zelldifferenzierung, -adhesion, -bewegung sowie von Zellproliferation und Apoptose für
verschiedenste Prozesse der Embryonalentwicklung notwendig ist (Böttcher and Niehrs,
2005).
Der FGF-Signalweg
FGF-Liganden binden extrazellulär abhängig von Heparansulfat-Proteoglykanen (HSPG)
an ihre Rezeptoren. Daraufhin kommt es zur Dimerisierung zweier Rezeptoren und zur
Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktion, indem verschiedene Tyrosin-Reste der
intrazellulären Rezeptordomänen transautophosphoryliert werden. Diese dienen dann als
Andockstellen zur Rekrutierung von Adapterproteinen oder Signalenzymen, die über eine
SH2- oder PTB-Domäne verfügen, sodass der Rezeptorphosphorylierung unterschiedliche
Signalwege nachgeschaltet sind (Dailey et al., 2005; Pownall and Isaacs, 2010).
19
Einleitung
Abbildung 3: FGF-vermittelte Signaltransduktion
Dem FGF-Rezeptor nachgeschaltet werden verschiedene Signalwege induziert. Über den MAPK-Signalweg
nimmt die FGF-Aktivität Einfluss auf die Genexpression und spielt unter anderem eine Rolle in zellulären
Prozessen wie Proliferation und Differenzierung. Die Aktivierung der Phosphoinositid-3-(PI3-)Kinase und der
Proteinkinase B (PKB) spielt eine Rolle beim Überleben von Zellen, während der PLC/PKC/CalciumSignalweg in Bezug zur Morphologie und Migration von Zellen steht. Sprouty-Proteine können als
intrazelluläre Antagonisten von Raf, Grb2 und PLC agieren. In der frühen Entwicklung von Xenopus agieren
sie als Antagonisten des PLC/PKC/Calcium-Signalwegs. Quellen und nähere Bezeichnung sind im Text
verzeichnet.
Im MAPK („mitogen activated protein kinase“) Signalweg wird über FRS2 („FGFR
substrate
2“)
das
Adaptorprotein
Grb2
und
der
damit
assoziierte
Nukleotid-
Austauschfaktor SOS („son-of-sevenless“) rekrutiert, um dann über das GTP Bindeprotein
Ras eine Phosphorylierungskaskade zu starten, an deren Ende die MAPK ERK
(„extracellular signal-regulated kinase“) steht. Die phosphorylierte MAPK wandert in den
Zellkern ein, um unter anderem Transkriptionsfaktoren der Ets-Familie zu modifizieren und
damit die Transkription von FGF-Zielgenen zu stimulieren. Der MAPK-Signalweg ist oft mit
der Aktivierung von Zellproliferation und Zelldifferenzierung verbunden. In Xenopus spielt
dieser Signalweg eine prominente Rolle in der FGF-induzierten Mesodermspezifizierung
(Umbhauer et al., 1995; Dorey et al., 2010; Pownall and Isaacs, 2010).
Über Grb2 kann auch der Phosphoinositid-3-(PI3-)Kinase-Signalweg eingeschaltet
werden, der über die Aktivierung der Proteinkinase B (Akt) einen Signalweg in Gang setzt,
der unter anderem die Zellen vor Apoptose schützt. Andererseits kann über einen
Phosphotyrosin-Rest im FGF-Rezeptor (FGFR) die Phospholipase Cγ (PLCγ) aktiviert
werden. PLCγ hydrolisiert Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP) zu Diacylglycerol
20
Einleitung
(DAG)
und
Inositol-1,4,5-triphosphat
Proteinkinase C (PKC),
während
IP3
(IP3).
DAG
intrazelluläre
wiederum
aktiviert
Calcium-Freisetzung
die
stimuliert
(Böttcher and Niehrs, 2005; Dailey et al., 2005; Pownall and Isaacs, 2010).
Sprouty als negativer Regulator des FGF-Signalwegs
Proteine der Sprouty-Familie sind als intrazelluläre Inhibitoren der Rezeptor-TyrosinKinasen-vermittelten Signalwege bekannt. Im Sinne einer negativen Rückkopplung wird
die Expression von Sprouty-Genen (Spry) sowohl durch den MAPK- als auch durch den
Calcium-Signalweg induziert (Ozaki et al., 2001; Abe and Naski, 2004). Dabei können
Sprouty-Proteine den MAPK-Signalweg über Bindung von Grb2 oder Raf oder die FGFRezeptor-vermittelte Mobilisierung von intrazellulärem Calcium durch Inhibition von PLCγ
antagonisieren (Christofori, 2003; Akbulut et al., 2010).
In frühen Gastrulastadien von Xenopus werden Spry1 und Spry2 in der mesodermalen
Randzone exprimiert und wirken über die Inhibition des PLC/PKC/Calcium-Signalwegs
negativ auf morphogenetische Zellbewegungen, während sie keinen antagonistischen
Effekt
auf
die
MAPK-vermittelte
Mesodermspezifizierung
ausüben.
Ab
den
mittleren/späten Gastrulastadien nimmt ihre Expression ab. Dadurch sollen sie als
Schalter zwischen MAPK- und PLC/PKC/Calcium-vermittelten Signaltransduktionen
wirken (Nutt et al., 2001; Sivak et al., 2005; Dorey et al., 2010).
FGF-abhängige Induktion und Aufrechterhaltung mesodermaler Gene
Auch wenn Fibroblasten-Wachstumsfaktoren zunächst aufgrund ihrer Eigenschaft
Fibroblasten
zu
stimulieren
mesoderminduzierenden
isoliert
Eigenschaften
wurden,
eines
konnte
FGF-Liganden
bereits
1987
dargestellt
die
werden
(Gospodarowicz, 1974; Gospodarowicz and Moran, 1975; Slack et al., 1987). Aus
Rinderhirn isoliertes FGF2 war in der Lage animales Polkappenektoderm des
Krallenfrosches zu Mesoderm zu differenzieren (Slack et al., 1987). Dass FGF
Signalaktivität auch endogen eine Rolle in der Spezifizierung des Mesoderms spielt,
lieferten Überexpressionsexperimente des dominant-negativen FGF-Rezeptors 1 (dnFGFR1). Durch diese FGFR-Inhibition lässt sich der Verlust von mesodermalen Rumpf21
Einleitung
und Schwanzgewebe beobachten (Amaya et al., 1991). Anders als die TGFßWachstumsfaktoren (Nodal-verwandeten Proteine oder Vg1) gehören Fibroblasten
Wachstumsfaktoren nicht zu den vegetal exprimierten mesoderminduzierenden Signalen,
sondern werden im Zuge der frühen Induktionsphase selbst durch die vegetalen Faktoren
in
der
mesodermalen
Randzone
aktiviert.
FGF-Signalaktivität,
erkennbar
an
phosphoryliertem ERK, lässt sich bis zum Stadium der Midblastula-Transition nur in einem
geringen Maße detektieren und steigt nach Einsetzen zygotischer Gentranskription im
mesodermalen Ring und im dorsalen Ektoderm an (Christen and Slack, 1999; Branney et
al., 2009). Nichtsdestotrotz ist die Mesoderminduktion von FGF-Signalaktivität abhängig.
So lässt sich durch Applikation des mesoderminduzierenden TGFß-Wachstumsfaktors
Aktivin animales Polkappengewebe zu Mesoderm induzieren und viele der dabei
aktivierten Geninduktionen lassen sich durch Überexpression des dnFGFR1 oder
mutanter Formen von Ras oder Raf verhindern (Cornell and Kimelman, 1994; LaBonne
and Whitman, 1994). Höhere Konzentrationen an Aktivin induzieren dorsales Mesoderm,
wohingegen ventrales Mesoderm unter den gleichen Bedingungen induziert wird, wenn
FGF-Signalaktivität inhibiert wird (Lee et al., 2011). Endogen ist FGF-Signalaktivität
beispielsweise für die Induktion und Aufrechterhaltung des panmesodermalen Markers
Xbra oder für die paraxial exprimierten Gene MyoD und Myf 5 essentiell (Amaya et al.,
1993; Isaacs et al., 1994; Fisher et al., 2002). Viele axialen Organisatorgene dagegen
reagieren in ihrer ersten Induktion weniger sensitiv auf FGF-Inhibition und benötigen FGFSignalaktivität vielmehr für die Aufrechterhaltung ihrer Genexpressionen (Fletcher and
Harland, 2008).
Die Bedeutung des FGF-Signalwegs für konvergente Extensionsbewegungen
Die konvergente Extension beschreibt einen Prozess, in dem sich Zellen entlang der einen
Achse aufeinander zubewegen und sich dadurch das Gewebe in der dazu senkrechten
Achse verlängert (Wallingford et al., 2002). Diese Bewegungen finden unter anderem
während der Gastrulation und Neurulation auf der dorsalen Seite des Embryos im
zukünftigen Notochord, somitischen Mesoderm und in der Neuralplatte statt und tragen zur
AP-Verlängerung bei. Ein Großteil der morphogenetischen Veränderungen, die während
der Gastrulation stattfinden, wird von konvergenten Extensionsbewegungen vermittelt
(Keller et al., 1992). Mit Beginn der Gastrulation werden Lamellipodien, die sich an der
mediolateralen Achse der Zellen befinden, stabilisiert, sodass die Zellen eines Gewebes
22
Einleitung
mediolateral interkalieren können. Hierbei ist der Wnt/PCP-Signalweg für die Ausrichtung
der Lamellipodien entlang der planaren Zellachse entscheidend. Im Mesoderm von
Xenopus werden konvergente Extensionsbewegungen durch das Zusammenspiel der
mediolateralen Interkalation und der Notochord-Somiten-Grenze ermöglicht (Wallingford et
al., 2002).
Der FGF-Signalweg reguliert konvergente Extension sowohl auf indirekte als auch auf
direkte Weise. Indirekt wirkt hierbei MAPK-abhängige FGF-Signalaktivität auf die
Expression von Xbra, welches wiederum Wnt11 induziert und darüber den Wnt/PCPSignalweg reguliert (LaBonne et al., 1995; Curran and Grainger, 2000; Tada and Smith,
2000). Direkt und unabhängig von Xbra wirkt der FGF-Signalweg über Zielgene wie NRH
(„neurotrophin receptor homolog“) und Xmc („Xenopus marginal coil“) oder über die
Aktivierung der PLC, die über DAG die PKC an die Zellmembran rekrutiert oder über IP3
einen intrazellulären Calcium-Anstieg bewirkt (Frazzetto et al., 2002; Chung et al., 2005;
Wang and Steinbeisser, 2009). Sowohl die Rekrutierung der PKC an die Zellmembran als
auch intrazelluläres Calcium spielen eine Rolle bei konvergenten Extensionsbewegungen
(Wallingford et al., 2001; Wang and Steinbeisser, 2009).
FGF-Signalaktivität in der LR-Achsenentwicklung der Wirbeltiere
FGF-Signalaktivität spielt eine Rolle in der LR-Achsenentwicklung der Wirbeltiere. Dabei
unterscheiden sich funktionelle Erkenntnisse aus Huhn/Kaninchen, Maus und dem
Zebrabärbling und lassen keine Konservierung dieses Signalwegs erkennen.
In Huhn und Kaninchen wirkt der Ligand FGF8 reprimierend auf die Expression von Nodal.
Dabei weist Fgf8 im Huhn eine asymmetrisch verstärkte Expression auf der rechten Seite
des Hensen Knoten auf (Boettger et al., 1999). Im Kaninchen dagegen wird Fgf8, wie in
den homologen Bereichen von Maus, Zebrabärbling und Xenopus, symmetrisch im
Organisator (Hensen Knoten) exprimiert (Crossley & Martin, 1995; Fischer et al., 2002;
Reifers et al., 1998, Schneider, 2008). Durch die Inhibiton des FGF-Signalwegs kann
Nodal im Huhn und Kaninchen ektopisch im rechten Seitenplattenmesoderm induziert
werden, während die ektopische Applizierung von FGF8-Protein auf der linken Seite zur
Repression der endogenen Seitenplattenexpression führt (Boettger et al., 1999; Rodríguez
23
Einleitung
Esteban et al., 1999; Fischer et al., 2002). Hierbei soll FGF8 im Kaninchen seine
repressive Funktion über Gap Junctions vermittelt ausüben (Feistel and Blum, 2008).
Fgfr1 und Fgf8 Knockout-Mäuse zeigen aufgrund der Funktion von FGF-Signalaktivität für
Gastrulationsbewegungen und die Spezifizierung des Mesoderms schwerwiegende
Defekte,
welche
die Aufdeckung einer spezifischen
FGF-Funktion in
der LR-
Achsenentwicklung unmöglich machen. So weisen Fgf8 Knockout-Mäuse einen Verlust
des embryonalen Mesoderms und Entoderms auf, während Fgfr1 Knockout-Mäuse unter
schweren Wachstumsverzögerungen sowie dem Verlust von paraxialem Mesoderm leiden
und noch während der Gastrulation sterben (Deng et al., 1994; Yamaguchi et al., 1994;
Sun et al., 1999; Ciruna and Rossant, 2001). Mit der hypomorphen Fgf8-Mutanten konnte
erstmals eine Rolle des FGF-Signalwegs in der LR-Achsenentwicklung der Maus
aufgedeckt werden. Hierbei kommt zu einem Verlust der bilateralen paranotochordalen
Nodal-Domäne, was den Verlust der asymmetrischen Nodal-Kaskade nach sich zieht
(Meyers and Martin, 1999; Oki et al., 2010). Zudem wurde in der Maus eine zweite
Funktion beschrieben, in der FGF-Signalaktivität zum Zeitpunkt des linksgerichteten
Flüssigkeitsstroms eine Rolle spielt. Hierbei soll die FGF-abhängige Freisetzung von
extrazellulären Vesikeln, den sogenannten NVPs („nodal vesicular particles“), einen
intrazellulären Calciumanstieg auf der linken Seite bewirken (Tanaka et al., 2005).
Auch im Zebrabärbling konnte eine Funktion des FGF-Signalwegs nachgewiesen werden.
So besitzen ein Drittel der FGF8-mutanten Linie „acerebellar“ kein KV und bildet infolge
dessen LR-Achsendefekte aus (Albertson and Yelick, 2005). Weitere Analysen, in denen
unter anderem die Rezeptor-vermittelte Transduktion des FGFR1 inhibiert wurde, konnten
zeigen dass FGF eine Rolle für die Ciliogenese des KVs spielt (Hong and Dawid, 2009;
Neugebauer et al., 2009; Yamauchi et al., 2009; Liu et al., 2011).
24
Arbeitshypothese
Arbeitshypothese
Die
Forschungsarbeit
der
letzten
Jahre
zeigte,
dass
der
Mechanismus
des
Symmetriebruchs bei den Wirbeltieren weitgehend konserviert ist. Da nachgewiesen
werden konnte, dass bisher als „frühe Determinanten“ bekannte Moleküle ebenfalls
innerhalb des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms wirken, weist immer mehr auf einen
konservierten Mechanismus der LR-Achsendeterminierung hin.
Im Widerspruch zu einem allgemeingültigen Wirkmechanismus steht allerdings, dass der
FGF-Signalweg bei der LR-Achsenentwicklung unterschiedliche Funktionen in den bisher
untersuchten Wirbeltieren zeigte. Eine nicht-konservierte Funktion des FGF-Signalwegs
lässt sich dabei schlecht mit der Konservierung vieler anderer Signalwege vereinbaren. In
dieser Arbeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass auch für die FGF-Signalaktivität eine
funktionelle Konservierung vorliegt. Aufgrund seiner evolutionären Einordnung zwischen
dem Zebrabärbling und den Modellorganismen der höheren Vertebraten Huhn, Kaninchen
und Maus stellt Xenopus einen relevanten Modellorganismus zur Analyse der
Konservierung des FGF-Signalwegs in der Lateralitätsentwicklung dar. Deshalb wurde in
dieser Dissertation die bisher unbekannte Rolle der FGF-Signalaktivität in X. laevis
untersucht. Dabei stellte sich die Frage, wann und in welchem Bereich dieser Signalweg
für die Lateralitätsentwicklung entscheidend ist. Widersprüchliche Erkenntnisse aus
anderen Modellorganismen infolge von Funktionsverlustexperimenten könnten auf der
Beeinträchtigung unterschiedlicher Entwicklungsstadien beruhen. So ist es möglich, dass
der FGF-Signalweg mehrere aufeinanderfolgende Funktionen ausübt, die jeweils
konserviert sind. Diese Hypothese wurde durch zeitlich oder räumlich begrenzte
Modulation des FGF-Signalweges mit Hilfe von Funktionsverlust- und Funktionsgewinnexperimenten untersucht.
25
Ergebnisse
Ergebnisse
Funktionsverlustexperimente zur Darstellung der FGF-vermittelten Funktion
Zur
Darstellung
der
Funktion,
die
der
FGF-Signalweg
endogen
in
der
LR-
Achsenentwicklung von Xenopus spielt, wurden im ersten Schritt Funktionsverlustexperimente durchgeführt. Bei diesen wurden der synthetische Rezeptorantagonist
SU5402 und der dominant-negative FGF-Rezeptors 1 (dnFGFR1) verwendet.
SU5402 inhibiert die FGF-Signaltransduktion, indem es durch Interaktion mit der
katalytischen
Domäne
die
Autophosphorylierung
des
FGF-Rezeptors
unterbindet
(Mohammadi, 1997). Die systemische Inkubation in SU5402 ermöglichte es, die
Embryonalentwicklung zu einem beliebigen Zeitpunkt zu unterbinden. Durch die
anschließende Expressionsanalyse des Markergens Pitx2c ließ sich zeitlich einschränken,
in welchen Stadien der FGF-Signalweg eine Funktion auf die Lateralitätsentwicklung
ausübt.
Die Injektion von dnFgfr1 ermöglichte es, die Signaltransduktion in einem bestimmten
Bereich des Embryos zu unterbinden. Der dnFGFR1 stellt eine Deletionsmutante des
FGFR1 dar. Dieser fehlt die intrazelluläre Tyrosinkinase-Domäne, sie wirkt durch
Dimerisierung mit den endogen exprimierten FGF-Rezeptoren dominant-negativ (Amaya
et al., 1991). Dabei kann eine Deletionsmutante des FGFR1 auch inhibierend auf alle
anderen Rezeptortypen wirken (Ueno et al., 1992).
Inhibition der FGF-Signalaktivität bewirkt einen Verlust der asymmetrischen
Genexpression
Zur Unterdrückung von FGF-Signalaktivität wurden systemische Inkubationen in SU5402haltiger Pufferlösung durchgeführt. Da SU5402 in DMSO gelöst genutzt wurde, wurden die
Kontrollembryonen in DMSO-haltiger Pufferlösung der entsprechenden Konzentration
inkubiert. Bereits in meiner Diplomarbeit konnte ich zeigen, dass die Applikation von
SU5402 während Gastrulastadien zu einem Verlust der asymmetrischen Expression von
Pitx2c im linken Seitenplattenmesoderm führt (Schneider, 2008). Zur Aufklärung des
zugrunde liegenden Wirkmechanismus wurden diese Ergebnisse in der vorliegenden
Arbeit näher analysiert. Um Rückschlüsse ziehen zu können, auf welche LR-relevanten
26
Ergebnisse
Ereignisse die FGF-Signalaktivität Einfluss nimmt, wurden die Inkubationen zu
unterschiedlichen Zeitpunkten gestartet und durch Auswaschen des Inhibitors beendet
(schematisch dargestellt in Abb. 4A).
Abbildung 4: SU5402-Inkubationen lassen ein Zeitfenster erkennen, indem die Inhibition der FGFSignalaktivität den Verlust der asymmetrischen Pitx2c-Expression bewirkt
(A) Zeitskala der LR-Achsenentwicklung von X.laevis. Inkubationen, die zwischen St.10,5 und St.12/12,5
gestartet wurden (hellrot) und im Neurulastadium 17/18 gestoppt wurden, hatten einen Effekt auf die LRAchsendeterminierung, während Inkubationen, die im St.12,5/13 oder im St.15/16 gestartet wurden
(dunkelblau) keinen Effekt ausübten. (B) Prozentuale Anteile der verschiedenen Expressionsmuster von
Pitx2c im Seitenplattenmesoderm. SU5402-Inkubationen beginnend zwischen St.10,5 und St.12/12,5
bewirkten im Vergleich zu DMSO-Kontrollembryonen einen signifikanten Anteil an Embryonen mit fehlender
Pitx2c-Expression (C) Expressionsanalyse von MyoD und Pitx2c im Schwanzknospenstadium. Beispiele
SU5402-behandelter Embryonen mit reduzierter Expression des Somitenmarkers MyoD (SU5402 St.10,5),
leicht verkürzter, nach dorsal gebogener Achse (SU5402 St.11-11,5) oder mit wildtypisch erscheinender APAchse (SU5402 St.12), die einen Verlust von asymmetrischem Pitx2c aufwiesen. Der Kontrollembryo
hingegen exprimierte Pitx2c wildtypisch im linken Seitenplattenmesoderm.
n, Anzahl der Embryonen; n.s., nicht signifikant; SPM, Seitenplattenmesoderm; wt, wildtypisch
27
Ergebnisse
Embryonen, die beginnend ab frühen bis späten Gastrulastadien in SU5402 inkubiert
wurden und deren Inkubation in den Neurulastadien 17/18 beendet wurde, wiesen einen
signifikanten Verlust der Pitx2c-Expression auf (Abb. 4B). Dabei reichten in den
Inkubationsexperimenten ab St.10,5/11 (n=117) oder 11/11,5 (n=285) Konzentrationen
von 30µM SU5402 aus, um einen Expressionsverlust von über 80% hervorzurufen
(p<0,001, Abb. 4B), während Inkubationen ab St.12/12,5 in dieser niedrigen Konzentration
keinen signifikanten Effekt ausübten (nicht gezeigt). Mit einer erhöhten Konzentration von
50-80µM SU5402 ließ sich in den Inkubationsexperimenten ab St.12/12,5 wieder ein
signifikanter Verlust von circa 70% bewirken (n=122, p<0,001, Abb. 4B). Dieser Effekt war
auf ein kleines Zeitfenster beschränkt, selbst hohe Konzentrationen von 80µM konnten bei
Inkubationsexperimenten
ab
St.12,5/13
keine
signifikante
Abweichung
von
der
wildtypischen Pitx2c-Expression hervorrufen (n=245, p=0,926, Abb. 4B). Inkubationsexperimente ab St.15/16 wurden durchgeführt, um die FGF-Signalaktivität in den Stadien
des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms zu inhibieren. Durch Applikation von SU5402 ließ
sich
kein
Einfluss
der
FGF-Signalaktivität
auf
die
Determinierung
der
LR-
Achsenentwicklung während der Stadien des Symmetriebruchs feststellen (n=103,
p=0,102, Abb. 4B). Somit konnte durch diese Experimente ein zeitliches Fenster festlegt
werden, in dem FGF-Signalaktivität bis Ende der Gastrulation für die korrekte
Determinierung der LR-Achse essentiell ist. Der FGF-Signalweg ist demnach bis Ende der
Gastrulation (St.12-12,5) von Bedeutung für die Lateralitätsentwicklung.
Wurde die Applikation von SU5402 bereits vor Erreichen des Gastrulastadiums 11
durchgeführt, hatte dies neben dem Verlust der asymmetrischen Pitx2c-Expression
schwere Gastrulationsdefekte zur Folge. In diesen Embryonen schloss sich der
Blastoporus nicht vollständig, sodass sich die dorsale Achse nicht korrekt bilden konnte
und die Embryonen im Schwanzknospenstadium eine dorsale Kurvatur aufwiesen. In
extremen Fällen führte der Blastoporusschlussdefekt dazu, dass das axiale Gewebe direkt
hinter dem Kopf auseinander klaffte (Abb. 4C, SU5402 St.10,5). Dieser Phänotyp, der auf
Störungen der Mesodermentwicklung und der konvergenten Extensionsbewegungen
zurückzuführen ist, ist ein gut bekanntes Beispiel für die Auswirkungen des Verlusts von
FGF-Signalaktivität (Amaya et al., 1991). Die fehlerhafte Mesoderminduktion ist dabei
anhand der reduzierten Transkription des Somitenmarkers MyoD nachweisbar (Abb. 4C).
Je später die Inkubationen durchgeführt wurden, desto milder fiel der AP-Achsenphänotyp
aus. Embryonen, die ab St.11/11,5 inkubiert wurden, wiesen noch eine leicht verkürzte,
nach dorsal gebogene Achse auf. Embryonen dagegen, die ab St.12/12,5 behandelt
28
Ergebnisse
wurden, ließen nur selten eine Verkürzung der AP-Achse erkennen und verfügten zudem
über eine wildtypische Expression von MyoD (Abb. 4C). SU5402-Inkubationen ab St.15/16
wurden nicht im Neurulastadium sondern im Schwanzknospenstadium gestoppt und
wiesen im Vergleich zu den Kontrollembryonen eine verkürzte AP-Achse auf (nicht
gezeigt).
Zur Bestätigung, dass der durch SU5402 hervorgerufene Effekt auf der Inhibition von
FGF-Signalaktivität beruht und nicht auf unspezifischen Nebenwirkungen des Inhibitors,
wurde zudem dnFgfr1, als mRNA oder als DNA-Konstrukt im pCS2+-Vektor, injiziert. Wie
bereits publiziert, und in Übereinstimmung mit dem Funktionsverlust via SU5402, hatte die
Injektion dieses dominant-negativen Konstruktes Embryonen zur Folge, die eine normale
Kopfentwicklung aufwiesen, aber schwere Defizite ab Höhe des Rumpfes ausbildeten
(nicht gezeigt; Amaya et al., 1991). Gastrulationsdefekte wurden zu einem großen Anteil
durch die Injektion niedrigerer Konzentrationen vermieden.
Um zu bestimmen, in welchem Bereich FGF-Signalaktivität entscheidend ist, wurden
gezielte Injektionen durchgeführt. Eine Funktion des FGF-Signalwegs wurde in Bezug zum
Kupffer`schen Vesikel des Zebrabärblings oder zum PNC der Maus beschrieben. Dabei
trifft man bei Injektionen in den dorsalsten Bereich der Randzone von Embryonen im 4Zellstadium (entsprechend der C1 Blastomere im 32-Zellstadium) den medialsten Anteil
der GRP, während man den lateralen Anteil der GRP durch Injektionen in die dorsolaterale
Randzone (entsprechend der C2 Blastomere im 32-Zellstadium) beeinflusst (Vick, 2009).
Da die Fehlexpression von dnFgfr1 gerade im dorsalen Bereich der Randzone (zukünftige
GRP) häufig Blastoporusschlussdefekte zur Folge hatte, wurden die geringsten noch
wirksamen Konzentrationen ermittelt und injiziert. Dabei bewirkten Injektionen von dnFgfr1
in Form von DNA (5-8pg) oder mRNA (8-12pg) vergleichbare Effekte und wurden
deswegen zusammengefasst. Ein schwacher aber statistisch sehr hoch signifikanter Anteil
an Embryonen mit fehlender Pitx2c-Expression ergab sich bei einer linkseitigen
Fehlexpression in der C2-Region (p<0,001, Abb. 5A). Die rechtsseitige Fehlexpression
(C2) rief dagegen keine signifikante Veränderung im Vergleich zu den Kontrollembryonen
hervor (p=0,055; nicht gezeigt).
Injektionen in den ventrolateralen Bereich der Randzone (entsprechend der C3Blastomere im 32-Zellstadium) zielen auf das Gewebe welches sich gemäß seines
Zellschicksal später im Seitenplattenmesoderm wiederfinden lässt (Vick, 2009).
29
Ergebnisse
So hätte durch solche Injektionen eine mögliche Funktion des FGF-Signalwegs in der
Seitenplatte anhand der Pitx2c-Expression nachgewiesen werden können. Da Letztere
endogen in der linken Seite circa zwei Tage nach der Befruchtung transkribiert wird,
wurde dnFgfr1-DNA (5-8pg) linksseitig injiziert. Allerdings veränderte diese Fehlexpression
die wildtypische Pitx2c-Expression nicht (p=0,061; Abb. 5A).
Abbildung 5: FGF-Signalaktivität in der GRP ist notwendig für die Induktion der Nodal-Genkaskade
Expressionsanalyse von Pitx2c nach linksseitiger Injektion in den Bereich der zukünftigen lateralen GRP
(C2) oder in die zukünftige Seitenplatte (C3) im 4-Zellstadium. DnFgfr1 wurde als mRNA (8-12pg) oder als
+
DNA-Konstrukt (5-8pg) injiziert. Als Kontrolle dienten ß-Gal-mRNA- oder pCS2 -Leervektor-Injektionen der
entsprechenden Konzentrationen sowie uninjizierte Embryonen. (A) Prozentuale Anteile der verschiedenen
Expressionsmuster. Die Injektion in die linke C2-Region bewirkte einen signifikanten Anteil an Embryonen
mit fehlender Pitx2c-Expression im Seitenplattenmesoderm (B) Beispielembryonen mit wildtypisch starker
(wt) oder schwacher Transkription (schwach). n, Anzahl der Embryonen
Zusammengefasst ließ sich erkennen, dass der Funktionsverlust von FGF-Signalaktivität
mittels SU5402-Inkubationen in frühen Gastrulastadien oder mittels Fehlexpression von
dnFgfr1 in der dorsalen Randzone schwere Gastrulationsdefekte zur Folge hatte. Da sich
hierbei keine funktionelle GRP ausbilden konnte, stellte das Fehlen der Pitx2cTranskription einen indirekten Effekt dar. SU5402-Inkubationen ab späten Gastrulastadien
sowie die Injektion von dnFgfr1 in niedrigen Konzentrationen erzielten einen signifikanten
Verlust von Pitx2c. Da hierbei Gastrulationsdefekte umgangen werden konnten, kann man
diesen Verlust als einen spezifischen und direkten Effekt der FGFR-Inhibition auf die LRAchsenentwicklung erachten. Dabei konnte die Funktion des FGF-Signalwegs in der
Lateralitätsentwicklung zeitlich bis zum Ende der Gastrulation (SU5402) eingrenzt werden.
Die gezielte Fehlexpression von dnFgfr1 deutet darauf hin, dass das FGF-Signal exklusiv
im Bereich der GRP benötigt wird. Damit sollte der FGF-Signalweg keinen direkten
Einfluss auf die Seitenplatte haben. Da der Effekt von dnFgfr1 aber im Allgemeinen mit
30
Ergebnisse
10% an beeinträchtigten Embryonen zwar signifikant, aber eher schwach war, sollte durch
SU5402-Inkubation und Expressionsanalyse von Pitx2c untersucht werden, ob die
Seitenplatte nach FGFR-Inhibition kompetent für die Induktion der asymmetrischen
Genkaskade war.
Kompetenz der Seitenplatte zur Expression von Pitx2c nach SU5402-Inkubation
In
Wildtyp-Embryonen
ist
auch
die
rechte
Seite
kompetent
Pitx2c
im
Seitenplattenmesoderm zu exprimieren. Dabei kann man eine ektopische Transkription
von Pitx2c durch Injektion von Xnr1 im Sinne eines Funktionsgewinns in die C3-Region
(zukünftige Seitenplatte) bewirken. Zunächst wurde ein Expressionsvektor mit der
codierenden Sequenz von Xnr1 unter Kontrolle des CMV-Promotors (pCS2+-Vektor) in die
linke oder rechte C3-Region injiziert. Diese sowie uninjizierte Kontrollembryonen wurden
ab den Gastrulastadien 11-12 bis zum Neurulastadium 17/18 entweder in SU5402 oder in
DMSO inkubiert und anschließend im Schwanzknospenstadium 30-33 für eine Pitx2cExpressionsanalyse fixiert (Abb. 6A).
Abbildung 6: Kompetenz der Seitenplatte bei SU5402-Inkubationen ab der mittleren/späten Gastrula
(A) Schematische Darstellung des Experimentes. (B) Die Pitx2c-Analyse nach Inkubation in 50µM SU5402
ab St.11-12 wies einen signifikanten Verlust der Expression auf, der durch Injektion von Xnr1-DNA in die
linke ventrale Randzone (C3) gerettet wurde. Injektionen in die rechte C3-Region und anschließende
Inkubation in SU5402 oder DMSO resultierten vorwiegend in einer Invertierung der asymmetrischen Pitx2cExpression.
li, links; n, Anzahl der Embryonen; re, rechts; SPM, Seitenplattenmesoderm
Die alleinige Applikation von 50µM SU5402 bewirkte den Verlust von Pitx2c in 81% der
Embryonen (n=186, p<0,001, Abb. 6B). Durch vorherige Xnr1-Injektion in die linke Seite
31
Ergebnisse
konnte dieser Effekt auf einen Anteil von 16% gesenkt werden (n=101, p<0,001, Abb. 6B).
Die Injektion in die rechte Seite bewirkte dagegen sowohl bei der SU5402- (86% invers
oder bilateral, n=72, Abb. 6B), als auch bei der DMSO-Inkubation (86% invers oder
bilateral, n=88, Abb. 6B), eine rechtsseitig ektopische Transkription von Pitx2c. Der große
Anteil an Embryonen mit inverser statt bilateraler Expression in der DMSO-Kontrolle steht
in Übereinstimmung mit der berichteten raschen Diffusion des Nodal-induzierten
Antagonisten Lefty (Ohi and Wright, 2007; Müller et al., 2012). Durch den ektopischen
Xnr1-Funktionsgewinn wurde dabei die asymmetrische Genkaskade auf der rechten Seite
vor Beginn der endogene Expression induziert, sodass durch Lefty möglicherweise die
endogene Expression auf der linken Seite unterdrückt wurde.
Die Überexpression von Xnr1 zeigte, dass das Seitenplattenmesoderm bei SU5402Inkubationsansätzen, die ab den Gastrulastadien 11-12 gestartet und im Neurulastadium
17/18 beendet wurden, kompetent für die Transkription von Pitx2c war und somit der
Verlust von Pitx2c einer anderen Ursache zu Grunde lag.
In X. laevis kann der Verlust der asymmetrischen Genexpression auch als Konsequenz
eines
nicht
korrekt
ausgebildeten
linksgerichteten
Flüssigkeitsstroms
entstehen
(Schweickert et al., 2007; Vick et al., 2009). Um zu untersuchen, ob die fehlende
Expression von Pitx2c infolge der inhibierten FGF-Signaltransduktion auf einem gestörten
Flüssigkeitsstrom beruht, wurde zunächst die Transkription von FoxJ1 analysiert. FoxJ1
gilt als Masterkontrollgen motiler Cilien und seine korrekte Transkription ist somit
Vorraussetzung für die Bildung und Beweglichkeit der GRP-Cilien (Stubbs et al., 2008; Yu
et al., 2008).
FoxJ1-abhängiger Einfluss der FGF-Signalaktivität auf die LR-Achsenentwicklung
Im Zebrabärbling führt die Applikation von SU5402 oder der Knockdown des FGFR1 zu
einer Reduktion der Cilienlänge im Kupffer`schen Vesikel. Auch eine Reduktion der GRPCilien im Frosch konnte hierbei durch Fehlexpression von dnFgfr1 beschrieben werden
(Neugebauer et al., 2009). In dieser Arbeit induzierten Injektionen einer vergleichbaren
Konzentration von dnFgfr1 Gastrulationsdefekte, welche die Ausbildung einer funktionellen
GRP verhinderten und damit eine Analyse der GRP-Cilien nicht ermöglichten. Dennoch
ließen sich diese dnFgfr1-injizierten Embryonen sowie Embryonen, die ab frühen
Gastrulastadien in SU5402 inkubiert wurden, auf die Expression von FoxJ1 im
32
Ergebnisse
superfiziellen Mesoderm untersuchen. Embryonen, die vor Erreichen des Stadiums 11 in
SU5402 inkubiert wurden, wiesen eine signifikante Reduktion von FoxJ1 im superfiziellen
Mesoderm auf. Untersucht wurden hierbei Embryonen, die ab dem 128-Zellstadium, ab
St.8/9 oder ab St.10,5-11 in 80µM SU5402 inkubiert wurden (n=57, Abb. 7A’). Die
Transkription von FoxJ1 wurde durch die Inhibition des FGF-Signalwegs insoweit
reduziert, dass in den untersuchten Embryonen nur eine schwache (66%), eine sehr
schwache (33%) oder keine (4%) Genexpression zu erkennen war, wohingegen 94% der
Kontrollembryonen FoxJ1 stark exprimierten (n=71, p<0,001, Abb. 7A’).
Zudem wurden Funktionsverlustexperimente durch Fehlexpression von dnFgfr1 auf die
Transkription von Foxj1 untersucht. Injektionen von dnFgfr1, die im 4-Zellstadium
beidseitig in der C1-Region durchgeführt wurden, ließen bei Injektion von 16pg mRNA
(n=19) im Vergleich zu den Kontrollembryonen (n=13) keine signifikante Reduktion von
FoxJ1 im superfiziellen Mesoderm erkennen (p=0,683, Abb. 7B’). Dagegen bewirkten
hohe Konzentrationen von dnFgfr1-mRNA (240pg, n=27) einen signifikanten Unterschied
gegenüber den Kontrollembryonen (p=0,027, Abb. 7B’) und gegenüber den niedrigen
Konzentrationen von dnFgfr1-mRNA (16pg, p=0,004, Abb. 7B’).
Da der Funktionsverlust von FGF-Signalaktivität mittels SU5402-Inkubation oder durch
Injektion von dnFgfr1 eine negative Wirkung auf die Expression von FoxJ1 im
superfiziellen Mesoderm zeigte, wurde der Funktionsgewinn durch Überexpression des
Liganden Fgf8b untersucht. Hierbei sollte analysiert werden, ob der Funktionsgewinn im
Gegenzug eine positive Wirkung auf FoxJ1 ausübt. Embryonen wurden dazu im 4Zellstadium in die dorsale (C1), dorsolaterale (C2) oder in die ventrale (C4) Randzone
injiziert. In der Tat bewirkte die Überexpression von Fgf8b-DNA (5pg) eine Verstärkung
des FoxJ1-Signals (Abb. 7C). Die Anschnitte in Abb. 7C zeigen, dass sich die ektopisch
induzierte Transkription bei dorsal injizierten Embryonen in den Schichten des tiefen
Mesoderms wiederfand und sich zudem im tiefen Gewebe in Richtung des animalen Pols
ausweitete. Ventrale Injektionen bewirkten ebenfalls eine ektopische Induktion, allerdings
befand sich die ektopische Expression in der superfiziellen Schicht und nicht im tiefen
Gewebe der ventralen Randzone (Abb. 7C).
Die Analyse der FoxJ1-mRNA Lokalisation zeigte, dass SU5402-Inkubationen ab frühen
Gastrulastadien sowie die Fehlexpression an hohen Konzentrationen von dnFgfr1 einen
spezifischen Effekt auf die LR-Achsenentwicklung hatten (Abb. 7A’,B’). Wie auch im
33
Ergebnisse
Abbildung 7: Abhängigkeit der FoxJ1-Expression von der FGF-Signalaktivität
(A-C) Expressionsanalyse von FoxJ1 im superfiziellen Mesoderm von Embryonen im Gastrulastadium. Bilder
zeigen vegetale Ansicht, dorsal oben. (A) Beispielbilder der Expressionsstärken von FoxJ1 nach Inkubation
in SU5402 beginnend ab St.8/9. (A’) Die Applikation von SU5402 vor Erreichen des Gastrulastadiums 11
führte zur einer signifikanten Reduktion von FoxJ1 im Vergleich zur DMSO-Kontrollinkubation. (B)
Beispielbilder der Expressionsstärke von FoxJ1 eines Kontrollembryos und nach beidseitiger Injektion von
16pg oder 240pg dnFgfr1-mRNA in die dorsale Randzone (2xC1) im 4-Zellstadium. Dabei bewirkte nur die
Injektion einer hohen Konzentration des dnFgfr1 eine signifikante Reduktion von FoxJ1 (B’). (C) Ektopische
Induktion von FoxJ1 nach Überexpression von Fgf8b. Kontrollembryo im Vergleich zu Embryonen, die im 4Zellstadium mit Fgf8b-DNA (5pg) beidseitig in die dorsale (2xC1), einseitig in die dorsolaterale (rechts C2)
oder beidseitig in die ventrale (2xC4) Randzone injiziert wurden. Beispielbilder mit den jeweiligen
Anschnitten (gestrichelte schwarze Linie) auf Höhe der wildtypischen oder ektopischen
Expressionsdomänen. Im wildtypischen Kontrollembryo beschränkte sich die Expression auf das
34
Ergebnisse
superfizielle Epithel der dorsalen Seite, während die FoxJ1-Expression durch Fgf8b-Überexpression auf der
dorsalen Seite sowohl superfiziell (orange Pfeilspitze) als auch radial in die tiefen Schichten des Mesoderms
(gelbe Pfeilspitze) erweitert wurde. Oftmals weitete sich die FoxJ1-Expression noch weiter in animaler
Richtung in der tiefen Schicht aus (grüne Pfeilspitzen). Durch ventrale Injektion konnte FoxJ1 in der
superfiziellen Schicht der ventralen Randzone (rote Pfeilspitze) ektopisch induziert werden.
Zebrabärbling konnte so eine Rolle der FGF-Signalaktivität für die Expression von FoxJ1
und somit indirekt für die Bildung der GRP-Cilien beobachtet werden. Allerdings bewirkte
die Injektion von dnFgfr1 in niedrigen Konzentrationen keine erkennbare Abweichung von
der wildtypischen FoxJ1-Transkription (Abb. 7B’), obwohl diese niedrigen Konzentration
dennoch LR-Achsendefekte zur Folge hatten (Abb. 5A). Ob der hierbei auftretende
signifikante Verlust von Pitx2c auf einer weiteren FoxJ1-unabhängigen Funktion des FGFSignalwegs in der LR-Determinierung beruht, sollte durch SU5402-Inkubationen ab
mittleren/späten Gastrulastadien geklärt werden.
FoxJ1-/Cilien-unabhängiger
Einfluss
der
FGF-Signalaktivität
auf
die
LR-
Achsenentwicklung
Für die Analyse der Inkubationen ab mittleren Gastrulastadien wurden Embryonen ab
St.11 in SU5402 (80µM) oder DMSO (0,4%) inkubiert und zum Teil im St.12 für eine
FoxJ1-Analyse fixiert. Zusätzlich wurden Embryonen bis St.17 behandelt und dann
einerseits für die Expressionsanalyse des FoxJ1-Zielgens Tekt2 fixiert (Stubbs et al.,
2008).
Der
andere
Teil
der
im
St.17
gestoppten
Embryonen
wurde
im
Schwanzknospenstadium für die Expressionsanalyse von Pitx2c fixiert, um den Verlust
dieses asymmetrischen Markergens durch SU5402-Inkubation zu kontrollieren.
Sowohl die Transkription von FoxJ1 als auch die von Tekt2 zeigte keine Abschwächung
durch SU5402 im Vergleich zur DMSO-Kontrolle (Abb. 8A). Da Inkubationen ab St.11
keine Blastoporusschlussdefekte aufwiesen, konnten diese Embryonen auf die GRPCilierung
untersucht
werden.
Die
unbeeinträchtigte
Expression
von
FoxJ1
bei
Inkubationsexperimenten ab den mittleren/späten Gastrulastadien spiegelte sich auch in
der rasterelektronenmikroskopischen (REM) Analyse der GRP-Cilien im Neurulastadium
17/18 wieder. Hierfür wurden Aufnahmen des medialen Anteils der GRP nach
SU5402 (40µM)- oder DMSO (0,2%)-Inkubation ab St.11-11,5 (zwei unabhängige
Experimente) mittels ImageJ ausgewertet. Weder in der Cilierungsrate (p=0,482), der
Durchschnittsgröße der Zelloberfläche (p=0,148), der Cilienlänge (p=0,168) oder der
35
Ergebnisse
36
Ergebnisse
Abbildung 8: SU5402-Inkubationen ab mittleren/späten Gastrulastadien üben keinen Effekt auf die
Ciliogenese der GRP aus
(A) Expressionsanalyse des Masterkontrollgens für motile Cilien FoxJ1 im Gastrulastadium (vegetale
Ansicht, dorsal oben) und seines Zielgens Tekt2 im Neurulastadium (ventrale Ansicht auf die GRP von
dorsalen Explantaten) zeigte keine Reduktion der Expressionsstärke durch Inkubation in SU5402. (B) REMAufnahmen der medialen GRP wurden mittels ImageJ bezüglich der Cilierungsrate, der Zellgröße, der
Cilienlänge und der Cilienlokalisation ausgewertet und wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen
SU5402- und DMSO-inkubierten Embryonen auf. (C) Analyse des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms durch
Applikation fluoreszierender Kügelchen auf dorsale Explantate. Die Ausrichtung des Flüssigkeitsstroms nach
links ist beispielhaft anhand eines DMSO- oder SU5402-inkubierten Embryos dargestellt. Dabei ist in den
jeweiligen oberen Abbildungen der mittels Zeitrafferaufnahmen dokumentierte Bereich dargestellt. Die
Partikelbewegungen der einzelnen Mikrobeads konnten durch die maximalen Grauwerte der einzelnen
Zeitrafferaufnahmen dargestellt werden. Da mit dem „ParticleTracker“ Plugin von ImageJ alle
Partikelbewegungen erfasst wurden, wurde in ImageJ eine Maske (Polygon) anhand der
Durchlichtaufnahme erstellt, um speziell die Partikelbewegung innerhalb der GRP (einzelne
Partikelbewegungen in bunt dargestellt) zu analysieren. Mittels eines in der Programmiersprache R
geschriebenen Programms wurden die so erlangten Daten entlang der X- und Y-Koordinaten aufgegliedert.
In den Windrosendiagrammen sind die Projektionen der Richtungsvektoren der Partikel dargestellt, wobei
linksgerichtete Partikel den größten Anteil ausmachten. Die Quantifizierung der Rho-Werte machte deutlich,
dass DMSO- und SU5402-inkubierte Embryonen eine wildtypische Direktionalität (Rho>0,6) hatten. Diese
Analyse wurde mit Hilfe von Thomas Thumberger durchgeführt (Thumberger, 2011). n, Anzahl der
Embryonen
Cilienlokalisation (p=0,641) ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen der DMSO(n=12) und der SU5402- (n=15) Inkubation (Abb. 8B).
Die Funktionalität der GRP-Cilien nach SU5402-Inkubation wurde durch die Analyse des
linksgerichteten Flüssigkeitsstroms verifiziert (Inkubation ab St.11-11,5; 2 unabhängige
Experimente). Dieser Teil der Analyse wurde zusammen mit Thomas Thumberger
durchgeführt (Thumberger, 2011). Von Embryonen im St.17 wurden dorsale Explantate
angefertigt, diese in eine Lösung mit fluoreszierenden Latexkügelchen transferiert, um
dann die Bewegungen der Mikrobeads mikroskopisch anhand von Zeitrafferaufnahmen zu
verfolgen. Mittels des „ParticleTracker“ Plugin von ImageJ konnten die einzelnen
Partikelbewegungen analysiert werden (Sbalzarini and Koumoutsakos, 2005; Schweickert
et al., 2007; Vick et al., 2009). Die Direktionalität der Partikel wurde durch die
dimensionslose Zahl Rho zusammengefasst. Ein Rho-Wert gegen 0 steht für zufällige
Bewegungen, während ein Rho-Wert gegen 1 bedeutet, dass alle Bewegungen in die
gleiche Richtung verlaufen. Der Flüssigkeitsstrom wird dabei als wildtypisch gewertet,
wenn er nach links gerichtet ist und der Rho-Wert zwischen 0,6 und 1 liegt, da Rho-Werte
unter 0,6 auch auf Brownschen Molekularbewegungen beruhen können. Sowohl
DMSO (0,2%)- als auch SU5402 (40µM)-inkubierte Embryonen wiesen einen wildtypischen Flüssigkeitsstrom auf (DMSO: n=9, Ø-Rho-Wert: 0,76; SU5402: n=15, Ø-RhoWert: 0,70; p=0,1521; Abb. 8C).
37
Ergebnisse
Die Ausbildung der GRP-Cilien wurde ebenfalls rasterelektronenmikroskopisch analysiert,
nachdem die FGF-Signalaktivität durch Fehlexpression niedriger Konzentrationen von
dnFgfr1 inhibiert wurde. Embryonen, die nach Injektion niedriger Mengen an dnFgfr1mRNA (8-12pg) einen geschlossenen Blastoporus aufwiesen, wurden im Neurulastadium
17/18 fixiert und die Länge ihrer GRP-Cilien anhand von REM-Aufnahmen ausgemessen.
Dabei ergab sich kein signifikanter Unterschied in der Cilienlänge zwischen den ß-Galinjizierten Kontrollembryonen (n=7) und den dnFgfr1-injizierten Embryonen (n=8, Abb. 9B,
p=0,817). Einhergehend mit der wildtypischen FoxJ1-Expression ließ sich somit auch
durch die Längenausmessung kein Einfluss von niedrigen dnFgfr1-Konzentrationen auf
die Bildung der GRP-Cilien feststellen.
Abbildung 9: niedrige Konzentrationen von dnFgfr1 üben keinen Effekt auf GRP-Cilienlänge aus
Analyse der Cilienlänge im Neurulastadium anhand von REM-Aufnahmen nach beidseitiger Injektion von ßGal- oder dnFgfr1-mRNA (8-12pg) in die dorsale Randzone (2xC1). (A) Aufnahmen eines ß-Gal-injizierten
Kontrollembryos und eines dnFgfr1-injizierten Embryos mit jeweiligen Vergrößerungen im Bereich der GRP.
(B) Die Ausmessung der Cilienlänge ließ keine signifikanten Unterschiede zwischen ß-Gal- und dnFgfr1injizierten Embryonen erkennen. n, Anzahl der Embryonen; n.s., nicht signifikant
Weder SU5402-Inkubationen ab mittleren/späte Gastrulastadien noch Injektionen niedriger
Konzentrationen von dnFgfr1 weisen somit einen Effekt auf die Expression von FoxJ1 und
die Cilierung der GRP nach. Aufgrund der Tatsache, dass diese Experimente dennoch
einen Verlust der asymmetrischen Pitx2c-Expression bewirkten, muss FGF-Signalaktivität
neben ihrer Funktion in der Expressionskontrolle von FoxJ1 noch eine andere Rolle in der
LR-Achsenentwicklung ausüben.
38
Ergebnisse
Die Expression der paranotochordalen Nodal-Domäne ist eine Voraussetzung für die
asymmetrische Geninduktion in der Seitenplatte (Brennan et al., 2002). Deswegen wurde
im nächsten Schritt untersucht, ob diese FGF-abhängig induziert wird.
FGF-Signalaktivität beeinflusst die paranotochordale Expression von Xnr1 und
Coco
Zur Untersuchung der bilateralen Xnr1-Domäne nach SU5402-Applikation, wurden
Inkubationen ab mittleren/späten Gastrulastadien durchgeführt und die Inkubationsansätze
im Neurulastadium 17/18 gestoppt. Ein Teil der Embryonen wurde direkt im Anschluss für
die Expressionsanalyse im Neurulastadium fixiert. Der andere Teil der Embryonen wurde
zur Kontrolle der Experimente im Schwanzknospenstadium für die Analyse von Pitx2c
fixiert. Parallel zum Verlust der Pitx2c-Expression, ließ sich eine starke Reduktion oder der
komplette Verlust der paranotochordalen Xnr1-Domäne feststellen (Abb. 10A). SU5402Inkubationen ab St.12-12,5 hatten wie oben gezeigt einen etwa 70%-igen Verlust von
Pitx2c zur Folge (Abb. 4B). Die Expression von Xnr1 war dabei ebenfalls in einem Anteil
von etwa 70% stark reduziert oder fehlte vollständig (50µM SU5402, n=152, p<0,001,
Abb. 10B). Damit konnte der Verlust der linksseitigen Seitenplattenidentität bei
Inkubationen ab späten Gastrulastadien, trotz wildtypischer FoxJ1-Expression, durch den
Verlust der bilateralen Xnr1-Domäne erklärt werden.
Um näher zu analysieren, ob das Fehlen der Xnr1-Expression nach SU5402-Applikation
auf einem Defekt auf transkriptioneller Ebene beruht, wurde des Weiteren die Expression
des Nodal-Antagonisten Coco untersucht, da Coco in den gleichen Zellen wie Xnr1
exprimiert wird (Vonica and Brivanlou, 2007). Die Expression von Coco war dabei wie die
Expression von Xnr1 nach SU5402-Inkubation reduziert (Abb. 10A). Bei SU5402Inkubationen ab Stadium 12-12,5 war Coco ebenfalls zu fast 70% stark reduziert oder
fehlte vollständig (n=78, p<0,001, Abb. 10B).
39
Ergebnisse
Abbildung 10: Verlust der paranotochordalen Xnr1-/Coco-Expression durch Inhibition der FGFSignalaktivität
40
Ergebnisse
Expressionsanalyse von Xnr1 und Coco im Neurulastadium 17/18. (A,D,E) Beispiele der Expressionsmuster.
Ventrale Ansicht auf die GRP dorsaler Explantate (A,B) Embryonen wiesen nach Inkubation ab St.12 in
DMSO oder SU5402 eine stark reduzierte oder fehlende Expression auf. (B) Der Anteil an Embryonen mit
stark reduzierter oder fehlender Xnr1- oder Coco-Transkription war nach SU5402-Inkubation signifikant.
(C,D) Embryonen wiesen nach einseitiger Injektion von dnFgfr1-mRNA (8-12pg) oder –DNA (5-8pg) in die
dorsolaterale Randzone (C2) im 4-Zellstadium eine stark reduzierte oder fehlende Expression auf der
injizierten Seite auf. (C) Der Anteil an Embryonen mit stark reduzierter oder fehlender Xnr1- oder CocoTranskription war nach Fehlexpression von dnFgfr1 signifikant. (D) Unabhängig vom Expressionsmuster der
injizierten Embryonen konnte eine Verschiebung (schwarz gestrichelte Linie) oder eine normale Ausprägung
(orange gestrichelte Linie) des Blastoporus beobachtet werden. (E,F) Embryonen wiesen nach Injektion von
Fgf8b-DNA (5-8pg) in die dorsolaterale Randzone (C2) im 4-Zellstadium eine Verbreiterung der endogenen
Expressionsdomäne auf (gelbe Pfeilspitze). (F) Die Injektion von Fgf8b-DNA in die rechte Seite bewirkte
einen signifikanten Anteil an Embryonen mit verbreiterter Xnr1- oder Coco- Expression, während die
Expression von Pitx2c im Schwanzknospenstadium unverändert blieb. wt, wildtypisch
Zur Verifizierung, dass der Xnr1/Coco-Expressionsverlust nach SU5402-Inkubation
spezifisch auf der Inhibition von FGF-Signaltransduktion beruht, wurden auch dnFgfr1injizierte Embryonen untersucht. Embryonen, die nach Injektion von dnFgfr1 keinen
Blastoporuschlussdefekt aufwiesen, wurden im St.17/18 für die Expressionsanalyse von
Xnr1 oder Coco fixiert. Wie bei der Applikation von SU5402 konnte ein Effekt beobachtet
werden, wenn in die dorsale Randzone injiziert wurde. RNA (8-12pg)- und DNA (5-8pg)–
Injektionen lieferten wiederum vergleichbare Ergebnisse und wurden zusammengefasst.
Injektionen in die C2-Region hatten einen höheren Anteil von Embryonen mit reduzierter
Transkription als Injektionen in die C1-Region zur Folge. Da einseitige Injektionen
durchgeführt wurden, fanden die Änderungen in der Expressionsstärke unilateral auf der
injizierten Seite statt und die uninjizierte Seite diente als interne Kontrolle. In WildtypEmbryonen kommt es vor, dass die mRNA-Lokalisation auf einer Seite etwas größer ist
als auf der anderen. Es wurden nur Seitenunterschiede gewertet, die das Maß der
wildtypischen Unterschiede überschritten. Dabei war die Expression auf der injizierten
Seite entweder auffällig stark reduziert (Kategorie „reduziert“) oder fehlte vollständig
(Kategorie „fehlend“; Abb. 10D). So ergab sich durch Injektion in die linke (vier
unabhängige Experimente) oder rechte C2-Region (zwei unabhängige Experimente) ein
signifikanter Anteil von 34% (linke Seite, n=53), bzw. 36% (rechte Seite, n=45) an
Embryonen, die eine reduzierte oder keine Expression auf der injizierten Seite aufwiesen
(p<0,001, Abb. 10C). Bei der Expressionsanalyse von Coco ließ sich nach Injektion von
dnFgfr1 ein vergleichbarer Effekt wie auf Xnr1 feststellen. So ergab sich durch Injektion in
die linke (neun unabhängige Experimente) oder rechte C2-Region (zwei unabhängige
Experimente) ein signifikanter Anteil von 43% (linke Seite, n=217), bzw. 38% (rechte
Seite, n=21) an Embryonen, die eine reduzierte oder keine Expression von Coco auf der
injizierten Seite aufwiesen (p<0,001, Abb. 10C).
41
Ergebnisse
Unabhängig davon ob Xnr1 oder Coco in den dnFgfr1-injizierten Embryonen reduziert
waren oder nicht, ließen sich bei manchen Embryonen Auffälligkeiten im Bereich des
Blastoporus erkennen: Die Wölbung des „circum blastoporal collars“ (CBC) war auf der
uninjizierten Seite stärker ausgeprägt als auf der injizierten Seite und der Blastoporus
somit schräg verschoben (schwarz gestrichelt, Abb. 10D). Bei den meisten Embryonen
war dies aber nur leicht oder nicht ausgebildet. Eine direkte Korrelation zwischen der
Expressionsreduktion und einer abnormalen Blastoporusentwicklung bestand dabei nicht,
sodass beide Phänotypen unabhängig voneinander beobachtet wurden.
Neben diesen Funktionsverlustexperimenten wurden Funktionsgewinnexperimente mit
Fgf8b durchgeführt. Dazu wurde Fgf8b-DNA (5-8pg) in die dorsolaterale Randzone (C2)
von Embryonen im 4-Zellstadium injiziert, um den lateralen Bereich der GRP zu treffen.
Anders als der Funktionsverlust hatte die Fgf8b-Überexpression eine Verbreiterung der
Xnr1- und Coco-Domänen auf der injizierten Seite zur Folge. So war bei Injektion in die
rechte Seite in 45% (n=148) Xnr1 und in 43% (n=120) der untersuchten Embryonen Coco
auf der rechten Seite verbreitert (p<0,001, Abb. 10E). Ein Teil der injizierten Embryonen
wurde im Schwanzknospenstadium fixiert und die Expression von Pitx2c analysiert.
Während sich mittels Xnr1-Überexpression auf der rechten Seite die asymmetrische
Genkaskade ektopisch im rechten Seitenplattenmesoderm induzieren lässt, hatte die
Überexpression von Fgf8b auf der rechten Seite trotz Verbreiterung der rechten
paranotochordalen Xnr1-Domäne keinen Effekt auf Pitx2c (p=0,376, Abb. 10E). Dies lässt
sich dadurch erklären, dass zeitgleich auch die Transkription des Xnr1-Antagonisten Coco
auf der rechten Seite anstieg.
Der zeitgleiche Verlust von Xnr1- und Coco-Transkription durch systemische SU5402Inkubation oder durch Fehlexpression von dnFgfr1 legte den Schluss nahe, dass die
Inhibition des FGF-Signalwegs möglicherweise auch das Zellschicksal dieser Zellen
während ihrer Entwicklung beeinflusste. Um daher in einem weiteren Schritt die
Auswirkungen des FGF-Signalverlustes auf die Zellen besser untersuchen zu können,
wurden diese näher charakterisiert.
42
Ergebnisse
Expression der paranotochordalen Xnr1-Domäne tritt in den somitischen GRPZellen auf
Zur Charakterisierung der Xnr1-exprimierenden Zellen wurde eine vergleichende
Expressionsanalyse von Markergenen im Neurulastadium 17/18 durchgeführt. Die GRP
wird seitlich von entodermalen Zellen begrenzt (Shook et al., 2004). Als Markergen für das
Entoderm sparte Panza-Expression den Bereich der GRP aus (Abb. 11A). Shh, das
während Neurulastadien neben seiner Expression in der Bodenplatte des Neuralrohrs
hauptsächlich im Notochord transkribiert wird, nahm dabei den Bereich ein, der medial von
der Xnr1-Domäne ausgespart wurde (Abb. 11C,D). Xnr1-mRNA lokalisierte in den Zellen,
die weder zum Notochord (Shh) noch zum Entoderm (Panza) beitragen. Dies
veranschaulichte die Aussparung, die bei einer zeitgleichen in-situ-Hybridisierung (ISH)
von Shh und Panza ensteht (Abb. 11B). In transversalen Anschnitten ließen sich anhand
der Struktur die Grenzen zwischen dem Notochord, den Somiten und den entodermalen
Zellen erkennen. Das somitische Mesoderm, das wie schon zuvor beschrieben zur GRP
beiträgt und dabei den lateralsten Anteil der GRP ausmacht, war auf der Höhe der GRP
Xnr1-positiv (Abb. 11D’). Der mediale Anteil der GRP war positiv für Shh (Abb. 11C’).
Dnah9 und Tekt2 sind Zielgene von FoxJ1, die im cilierten Epithel der GRP exprimiert
werden (Stubbs et al., 2008; Vick et al., 2009). Dnah9 und Tekt2 wurden sowohl von den
Shh-positiven als auch in den Xnr1-positiven Zellen exprimiert (Abb. 11E,E’,F,F’). Die
Kolokalisation von Xnr1, Tekt2 und Dnah9 zeigt, dass Xnr1-positive Zellen selbst Teil der
GRP sind. Da diese Zellen seitlich von den entodermalen Panza-positiven Zellen
eingegrenzt werden, stellen sie zudem den lateralsten Anteil der GRP dar. Im Anschluss
an eine Xnr1-ISH wurde eine REM-Analyse durchgeführt. Durch die spätere Überlagerung
der Xnr1-ISH-Aufnahme mit der korrespondierenden REM-Aufnahme konnte der
Cilienbesatz der randständigen Xnr1-positiven Zellen und ihr Anteil an der GRP bestätigt
werden (Abb. 11G, Pfeilspitzen zeigen auf Cilien; REM-Aufnahme von Tina Beyer). Die
lateralsten Zellen der GRP, die später in den Somitenverbund integriert werden,
exprimieren wie auch das tiefe somitische Gewebe MyoD als Markergen in diesen
Stadien. Der Vergleich der Xnr1- und MyoD-Expression in transversalen Schnitten wies
die Überlappung beider Genexpressionen im Bereich der somitischen GRP nach und
bestätigte die somitische Identität der Nodal-exprimierenden Zellen (Abb. 11H).
43
Ergebnisse
Abbildung 11: Xnr1-Expression in den somitischen Zellen der GRP
(A-F) Expressionsanalyse der dorsalen Explantate mit korrespondierenden transversalen Anschnitten auf
Höhe der GRP (C’-F’: das somitische Mesoderm ist gestrichelt umrandet). Panza-positive Zellen lassen den
Bereich der GRP frei (A), während Shh nur im medialen Anteil der GRP exprimiert wird (C). Xnr1-Expression
tritt in der Aussparung, die bei gleichzeitiger Anfärbung von Panza und Shh entsteht auf (B), und kolokalisiert
mit der lateralen Transkription von Tekt2 (E) und Dnah9 (F). (G) Überlagerung einer Aufnahme nach Xnr1ISH mit der korrespondierenden REM-Aufnahme des gleichen Embryos. Die Vergrößerung im lateralen
Xnr1-positiven Bereich lässt die Cilierung dieser Zellen erkennen (orangene Pfeilspitzen). (H) Vergleich von
MyoD- und Xnr1-Expression. (H’, H’’) Transversale Schnitte machen deutlich, dass Xnr1-positive Zellen Teil
des MyoD-exprimierenden somitischen Mesoderms sind. (I) REM-Aufnahme. Im transversalen Anschnitt auf
Höhe der GRP wurde der Anteil des somitischen Mesoderms gelb eingefärbt. Die Vergrößerung auf den
epithelialen Anteil dieser Zellen innerhalb der GRP lässt die Cilierung erkennen (Pfeilspitzen zeigen auf die
einzelnen Cilien). Gestrichelte Linie in C, E, D, F, H: Schnittebene der jeweiligen Schnitte; N, Notochord; S,
somitisches Mesoderm
In REM-Analysen sind die somitischen GRP-Zellen optisch gut von den sie flankierenden
entodermalen Zellen und den mesodermalen, medialen GRP-Zellen zu unterscheiden, da
sie als erste den epithelialen Verbund der GRP verlassen und deswegen im Vergleich
etwas eingesunkener sind (Abb. 11I; Shook et al., 2004). Anhand transversaler Anschnitte
44
Ergebnisse
auf Höhe der GRP ließ sich der somitische GRP-Anteil deutlich erkennen (Abb. 11I,
Pfeilspitzen zeigen auf Cilien).
Xnr1 und Coco werden paranotochordal in denselben Zellen transkribiert. In diesem
Abschnitt konnte gezeigt werden, dass diese Zellen Teil der somitischen GRP sind und
den lateralsten Bereich der GRP ausmachen. Die nähere Charakterisierung macht es
möglich, die Wirkung des FGF-Signalverlusts auf die Bildung dieser Zellen zu
untersuchen.
FGF-Signalaktivität beeinflusst die Bildung somitischer GRP-Zellen
Neben einer gemeinsamen FGF-abhängigen Transkriptionskontrolle lässt sich der
zeitgleiche Verlust von Xnr1 und Coco nach Inhibition des FGF-Signalwegs auch durch
einen generellen Verlust der somitischen GRP-Zellen erklären. Ist dem so, sollten keine
somitischen GRP-Zellen im Verbund der GRP zu finden sein. Dies lässt sich anhand von
REM-Analysen der GRP im Neurulastadium 17/18 untersuchen.
Dazu wurden Embryonen aus vier unabhängigen, kontrollierten Inkubationsansätzen
(Verlust der Pitx2c- und Xnr1-/Coco-Expression nach SU5402-Applikation) beginnend im
Stadium 12-12,5 verwendet (50-80µM SU5402; 0,25-0,4% DMSO). In den DMSOKontrollembryonen konnten die lateralen somitischen GRP-Zellen gut von den
entodermalen und medialen GRP-Zellen abgrenzt werden (Abb. 12A). Zum einen verfügen
die somitischen GRP-Zellen im Vergleich zu den lateralen Entodermzellen über eine
kleinere Zelloberfläche und ein längeres Monocilium (Abb. 12A’’), zum anderen setzt sich
morphologisch die Grenze zwischen Notochord und Somiten auch im Epithel der GRP fort.
Transversale Anschnitte, in denen sich das Notochord und das somitische Gewebe gut
voneinander unterscheiden lassen, erleichtern die Differenzierung auf Höhe der GRP. Zur
besseren Veranschaulichung wurde das somitische Mesoderm in silico gelb eingefärbt.
Im Gegensatz zur DMSO-Kontrolle ließen sich in den SU5402-inkubierten Embryonen
keine somitischen GRP-Zellen differenzieren (Abb. 12B). Die Vergrößerung in Abb. 12B’’
verdeutlicht, dass sich oberhalb des tiefen somitischen Mesoderms keine GRP-ähnlichen
Zellen mit langen Cilien im Epithel des Gastrocoels befanden. Dieser Bereich war von
Entoderm-spezifisch großen Zellen, die nur über ein kurzes Cilium verfügten,
eingenommen (Abb. 12B’’). GRP-spezifische Zellen konnten nach Inkubation in SU5402
45
Ergebnisse
46
Ergebnisse
Abbildung 12: Inhibition von FGF-Signaltransduktion führt zum Verlust der somitischen GRP
(A-D) REM-Aufnahmen von Embryonen im Neurulastadium 17 nach Inkubation in 0,3% DMSO (A,A’,A’’,C)
oder 60µM SU5402 (B,B’,B’’,D) ab St.12-12,5; aufgenommen in zwei verschiedenen Perspektiven. Zellen
des somitischen Mesoderms wurden gelb eingefärbt. (A-B) Aufsicht auf den transversalen Anschnitt auf
Höhe der GRP. Dorsale Seite des Anschnitts oben, ventrale Seite des Anschnitts mit GRP und Blastoporus
unten. Die gesamte GRP ist dabei von einer rot gestrichelten Linie eingefasst. (A,A’) Beispielembryo nach
DMSO-Inkubation verdeutlicht Beitrag somitischer Zellen zur GRP. (B,B’) Aufnahme eines Beispielembryos
nach SU5402-Inkubation zeigt, dass somitische Zellen nicht zur GRP beitragen. (A’’,B’’) Vergrößerungen im
Grenzbereich der jeweiligen GRP in A’ und B’ zeigen lange GRP-Cilien (Pfeilspitzen) im Vergleich zu kurzen
Cilien der großen Entodermzellen (Kreis). (C,D) Ventrale Ansicht der GRP der jeweiligen Embryonen aus A
und B, anterior oben. (C) Der mediale noto- und hypochordale GRP-Bereich der DMSO-Kontrolle ist von
einer gelb gestrichelten Linie eingefasst. Der CBC („circum blastoporal collar“) ist wildtypisch gewölbt (rote
Sternchen). (D) Nach SU5402-Inkubation weist der CBC keine Wölbung auf (rote Sternchen; gesamte GRP
gelb gestrichelt umrandet). (E) In zwei unabhängigen Experimenten wurde die Breite der GRP mittels
ImageJ ausgemessen. Dazu wurden für DMSO-Kontrollembryonen zwei verschiedene Werte ermittelt, die
Breite der gesamten GRP (grüne Linie) und die Breite des noto-und hypochordalen Anteils der GRP (lila
Linie). Für SU5402-inkubierte Embryonen konnte nur die Breite der gesamten GRP (lila Linie) ermittelt
werden. Dabei glich sich die gesamte Breite der GRP nach SU5402-Inkubation dem Wert des noto-und
hypochordalen GRP-Anteils der DMSO-Kontrollen an. (A-D) Maßbalken (gelb) entsprechen einer Länge von
50µm (A,B) und 20µm (A’,A’’,B’,B’’,C,D). n: Anzahl der Embryonen; N, Notochord; S, somitisches Mesoderm
nur in dem Bereich beobachtet werden, der bei den DMSO-Kontrollembryonen von den
medialen GRP-Zellen eingenommen wurde.
In zwei dieser Inkubationsansätze wurde die Breite der GRP anhand der REM-Aufnahmen
ausgemessen. Während bei den Embryonen der DMSO-Kontrolle sowohl die Breite der
gesamten GRP, als auch die Breite abzüglich des somitischen Anteils bestimmt wurde,
war es bei den SU5402-inkubierten Embryonen nicht möglich, zwischen diesen
Zellbereichen zu unterscheiden (Abb. 12C,D). Zur Veranschaulichung der Reduktion nach
SU5402 der beiden Inkubationsexperimenten wurde das jeweilige arithmetische Mittel der
gesamten GRP-Breite (Somiten + Notochord + Hypochord) der DMSO-Kontrollen auf 1
gesetzt. Es zeigte sich, das die Breite der GRP durch die Inkubation in SU5402 im
Vergleich zur Breite der Kontrolle signifikant reduziert wurde (p<0,001, Abb. 12E). Die
GRP-Breite glich sich in ihrem Ausmaß mehr dem Wert des nur hypo- und notochordalen
Anteils der Kontrolle an (p=0,0289, Abb. 12E).
Eine weitere Beobachtung, die durch SU5402-Inkubation gemacht werden konnte, war
eine Abflachung im Bereich des CBCs. Während dieser Bereich in Kontrollembryonen eine
Wölbung um den Blastoporus bildet, die anterior im Übergang zur GRP abflacht, wiesen
SU5402-behandelte Embryonen keine solche Wölbung auf (vergleiche Abb. 12 C und D).
Anhand der REM-Analyse ließ sich somit durch die Inkubation in SU5402 eine Reduktion
der GRP auf den medialen noto- und hypochordalen Anteil und ein Verlust der
somitischen GRP-Zellen dokumentieren. Der Beitrag somitischer Zellen zur GRP kann
auch anhand einer MyoD-ISH analysiert werden. Im Falle des Verlusts somitischer GRP47
Ergebnisse
Zellen sollten sich keine MyoD-positiven Zellen auf Höhe der GRP befinden. Hierzu wurde
der dnFGFR1 unilateral überexprimiert und anschließend eine MyoD-Expressionsanalyse
durchgeführt. In transversalen Schnitten ragten MyoD-positive Zellen nur auf der
uninjizierten Seite bis auf die Höhe des Archenteronepithels (Abb. 13A). Die REM-Analyse
von drei unabhängigen Experimente ergab, dass durch unilateraler Injektion von dnFgfr1
bei 64% der untersuchten Embryonen eine Reduktion der somitischen GRP-Zellen auf der
injizierten Seite stattfand, die die Breite des somitischen GRP-Bereichs teilweise nur leicht
verringerte, während in 16% der Embryonen keine somitischen GRP-Zellen auf der
injizierten Seite zu unterscheiden waren (n=25, Abb. 13B).
Zusätzlich sollte die Auswirkung des FGF-Funktionsgewinns auf die lateralen somitischen
GRP-Zellen durch Überexpression von Fgf8b untersucht werden. Dazu wurden die
Embryonen ebenfalls im 4-Zellstadium in die dorsolaterale Randzone (C2) injiziert. Umgekehrt zum Funktionsverlust hatte die Fgf8b-Überexpression eine Verbreiterung der Xnr1Expressionsdomäne auf der injizierten Seite zur Folge. Dies wurde oftmals von einer
generellen Verdickung der injizierten Seite begleitet. Im Gegenzug dazu schien die
uninjizierte Seite teilweise etwas ausgedünnter. In Abb. 13C ist ein Embryo dargestellt, der
im transversalen Anschnitt eine Verbreiterung der Xnr1-positiven Domäne auf der
injizierten Seite aufweist. Dieser Embryo wurde zudem rasterelektronenmikroskopisch
untersucht, um die generelle Verdickung der injizierten Seite zu veranschaulichen
(Abb. 13C,C’).
Während die Verbreiterung der Xnr1- und Coco-Expressionsdomäne in solchen
Embryonen mit einer generellen Größenzunahme der injizierten Seite einherging, wiesen
einige der untersuchten Embryonen auch dann eine verstärkte Xnr-1 oder CocoTranskription auf, wenn die injizierte Seite nicht erkennbar größer war als die uninjizierte
Seite. Somit konnte man eine Vergrößerung des somitischen GRP-Epithels auf der
injizierten Seite beobachten, die nicht von einer generellen Verdickung der injizierten Seite
begleitet wurde (Abb. 13D,D’).
48
Ergebnisse
Abbildung 13: FGF-Signalaktivität determiniert die somitischen GRP-Zellen
49
Ergebnisse
(A-D) Embryonen wurden im Neurulastadium 17/18 bezüglich der Ausbildung somitischer GRP-Zellen
untersucht. (B,B’,C’,D,D’) REM-Aufnahmen. Der Grenzbereich zwischen GRP und Entoderm und zwischen
noto-/hypochordalen und somitischen GRP-Bereich wurde gelb eingestrichelt und die somitischen Zellen
gelb eingefärbt. (A-B) Embryonen, die im 4-Zellstadium linksseitig in die dorsolaterale Randzone (C2) mit
dnFgfr1-RNA (8-12pg) injiziert wurden. (A, A’) ISH auf MyoD. Im Transversalschnitt auf Höhe der GRP
lassen sich auf der injizierten Seite keine somitischen Zellen erkennen (orange Pfeilspitze). (B, B’) Durch
Fehlexpression von dnFgfr1 kam es zur Reduktion somitischer GRP-Zellen auf der injizierten Seite. (B’) In
der Vergrößerung weisen rote Pfeilspitzen auf die langen Cilien des GRP-Epithels, wohingegen die blauen
Pfeilspitzen die kurzen Cilien des Entodermepithels markieren. (C-D) Embryonen, die im 4-Zellstadium
rechtsseitig in die dorsolaterale Randzone (C2) mit Fgf8b-DNA (5pg) injiziert wurden. (C) Ansicht auf
transversalen Anschnitt auf Höhe der GRP nach Xnr1-ISH. Die rechte Xnr1-Expressionsdomäne ist deutlich
vergrößert. (C’) Derselbe Embryo wie in (C) wurde zudem rasterelektronenmikroskopisch aufgenommen.
Dieselbe Aufsicht wie in (C) verdeutlicht die generelle Größenzunahme der injizierten Seite. (D) Embryo,
dessen injizierte Seite keine generelle Größenzunahme und dennoch eine Verbreiterung des somitischen
GRP-Anteils aufweist. (D’) Die Vergrößerung im Bereich der GRP macht Vergrößerung des somitischen
Anteils deutlich. Orangenes Sternchen: somitisches Mesoderm der injizierten Seite; Ar, Archenteron; Ek,
Ektoderm; En, Entoderm; N, Notochord; S, somitisches Mesoderm
FGF-Signalaktivität spielt eine wichtige Rolle in der Induktion und Aufrechterhaltung der
Mesodermspezifizierung. Durch zeitlich exakt definierte SU5402-Inkubationen konnte
nachgewiesen werden, dass FGF-Signalaktivität bis zum Stadium der späten Gastrula für
die Bildung somitischer GRP-Zellen entscheidend ist. Da die Mesodermspezifizierung in
X. laevis mit Erreichen der späten Gastrulastadien als weitgehend abgeschlossen gilt, lag
die
Vermutung
nahe,
dass
der
Verlust
dieser
Zellen
auf
einer
mangelnden
Aufrechterhaltung ihrer mesodermalen Identität beruht. Deswegen wurden im Folgenden
untersucht, inwieweit die Spezifizierung des Mesoderms durch Inhibition von FGFSignalaktivität beeinträchtigt wird.
Auswirkungen der SU4502-Inkubationen auf mesodermale Genexpressionen
Wie stark SU5402 die mesodermale Genexpression beeinflusste, hing vom Zeitpunkt der
Inkubation ab. Wurden Inkubationen in 50-80µM SU5402 im Gastrulastadium 10,5/11
begonnen, so kam es zu einer starken Reduktion der mesodermalen Markergene Xbra
und MyoD in späteren Gastrula- und Neurulastadien (Abb. 14). Inkubationen, die dagegen
erst in den späten Gastrulastadien (ab St.11,5) gestartet wurden, wiesen keine allgemeine
Veränderung der Transkription von Xbra und MyoD in den Neurulastadien auf. Jedoch war
der posterior zur GRP gelegene Bereich des CBCs SU5402-behandelter Embryonen
bezüglich der Xbra- und MyoD-Expression abgeschwächt und MyoD wies eine leichte
Reduktion seiner lateralen Ausbreitung auf (Abb. 14). Inwieweit dieser lokal begrenzte
Effekt auf die Mesodermentwicklung bei SU5402-Inkubationen ab St.12/12,5 entscheidend
für die Entwicklung der LR-Achse ist, sollte im Folgenden untersucht werden.
50
Ergebnisse
Abbildung 14: Reduktion mesodermaler Genexpression durch SU5402-Inkubationen
Gastrulastadien: vegetale Ansicht, dorsal oben. Inkubationen in 80µM SU5402 ab St.10,5-11 bewirkten eine
Reduktion der Xbra- und MyoD-Expression im Gastrulastadium 11,5 und im Neurulastadium 17 (dorsale
Ansicht, anterior oben) im Vergleich zu DMSO-Kontrollembryonen (anterior oben; MyoD: dorsale Ansicht;
Xbra: ventrale Ansicht). SU5402-Inkubationen ab St.11,5 bewirkten nur eine leichte Abschwächung von Xbra
(ventrale Ansicht) und MyoD (dorsale Ansicht) im Bereich des CBCs im Neurulastadium 17 (gelbe
Pfeilspitzen).
Vergleich der SU5402-Inkubationen ab St.12-12,5 mit Inkubationen ab St.12,5-13
Da SU5402-Inkubationen ab St.12-12,5 zum Verlust der asymmetrischen Pitx2c-Domäne
führten, nicht aber SU5402-Inkubationen ab St.12,5-13, wurden beide Inkubationsansätze
in drei unabhängigen Experimenten miteinander verglichen. Dazu wurde in den
verschiedenen Ansätzen jeweils ein Teil beginnend St.12-12,5 in SU5402 oder DMSO und
ein anderer Teil beginnend St.12,5-13 in SU5402 inkubiert und bei allen drei Ansätzen die
Inkubation St.17/18 beendet. Die Embryonen wurden dann entweder direkt im
Neurulastadium für die weitere Analyse fixiert oder erst in den Schwanzknospenstadien
28-33. So konnte mit Hilfe der Expressionsanalyse von Pitx2c der Effekt des Experiments
kontrolliert werden. Die Expressionsanalyse von MyoD machte deutlich, dass die SU5402Inkubation (50µM) sowohl ab St.12-12,5 (n=30, Abb. 15A), als auch ab St.12,5-13 (n=27,
Abb. 15A) zu einer leichten Reduktion der Mesodermspezifizierung im lateralen und
posterioren Bereich führte. Im Vergleich zur DMSO-Kontrolle war die Transkription von
MyoD auf den Bereich anterior zum Blastoporus begrenzt, sodass bei den beiden
verschiedenen SU5402-Ansätzen keine Expression im posterioren Bereich nachgewiesen
werden konnte. Wie bereits beschrieben für SU5402-Inkubationen, die einen Effekt auf
Pitx2c ausübten, führte auch die Applikation von SU5402 ab St.12,5-13 zu einer
vergleichbaren Abflachung des CBCs.
51
Ergebnisse
Abbildung 15: Vergleich zwischen SU5402-Inkubationen ab St.12-12,5 und St.12,5-13
(A) MyoD-Expression im Neurulastadium 17/18. SU5402-Inkubationen (50µM) ab St.12/12,5 oder St.12,5/13
übten lateral (Pfeile) und posterior (Sternchen) eine Reduktion von MyoD aus. (A’,A’’) Von verschiedenen
Embryonen wurden jeweils die Breite des hypo- und notochordalen GRP-Anteils (grüner Balken in A) und
die Breite des somitischen GRP-Anteils (roter Balken in A) anhand von Transversalschnitten mit ImageJ
ausgemessen. (A’) Das arithmetische Mittel der Breite des hypo-und notochordalen GRP-Anteils der DMSOKontrollembryonen wurde auf 1 gesetzt und mit dem arithmetischen Mittel der Breite des hypo- und
notochordalen GRP-Anteils der SU5402-inkubierten Embryonen verglichen. (A’’) Das arithmetische Mittel der
Breite des somitischen GRP-Anteils der DMSO-Kontrollembryonen wurde auf 1 gesetzt und mit dem
arithmetischen Mittel der Breite des somitischen GRP-Anteils der SU5402-inkubierten Embryonen
verglichen. (B) SU-Inkubationen ab St.12-12,5 (80µM) wiesen einen Verlust der bilateralen Xnr1-Domäne
auf. Der generelle Verlust somitischer GRP-Zellen spiegelte sich in dem Verlust der Aussparung, die durch
gleichzeitige Färbung von Shh und Panza entstand, wieder. SU5402-Inkubationen ab St.12,5-13 (80µM)
wiesen nur eine leichte Reduktion der Xnr1-Expression und eine leichte Verschmälerung des somitischen
GRP-Anteils (Shh+Panza) auf.
Damit wurden die exakt gleichen Beeinträchtigungen der mesodermalen Spezifizierung
auch bei SU5402-Inkubation nach dem Zeitfenster, bei dem die Entwicklung der LR-Achse
gestört werden kann, beobachtet. Dieser leichte Effekt auf mesodermales Gewebe
außerhalb der GRP sollte somit nicht kausal für die Entstehung von LR-Defekten nach
FGF-Funktionsverlust sein. Wenn aber das Fehlen der somitischen GRP-Zellen, wie in
52
Ergebnisse
Abb. 12 gezeigt, die Ursache für die Lateralitätsdefekte nach FGF-Funktionsverlust ist,
sollten die somitischen GRP-Zellen bei SU5402-Inkubationen ab St.12,5-13 nicht betroffen
sein. Da diese späten Inkubationen keinen Effekt auf die linksseitige Expression von
Pitx2c hatten, sollten sie folgerichtig im Bereich der GRP mit Wildtyp-Embryonen
vergleichbar sein. Um festzustellen, inwieweit sich Inkubationen ab Stadium 12,5-13 auf
die Bildung somitischer GRP-Zellen auswirkten, wurden Embryonen, die im St.17/18 auf
die Expression von MyoD untersucht wurden, transversal geschnitten (SU5402 St.12-12,5:
n=9; SU5402 St.12,5-13: n=5; DMSO St.12-12,5 n=6). Mit dem Vibratom-angefertigte
Schnitte wurden photographiert und auf Höhe der GRP miteinander verglichen. Dazu
wurde der jeweilige Schnitt verwendet, der den größten Beitrag von MyoD-Expression zum
Epithel der GRP aufwies. Die Breite des somitischen Anteils der GRP und die Breite des
hypo- und notochordalen Anteils der GRP wurden mit ImageJ ausgemessen. Zum einen
wurde das arithmetische Mittel der Breite des hypo- und notochordalen Anteils der DMSOKontrollembryonen auf 1 gesetzt und mit den hypo- und notochordalen Anteilen der beiden
verschiedenen SU5402-Ansätze verglichen. Zwischen den verschiedenen Inkubationen
ergab sich kein signifikanter Unterschied in der Breite dieses medialen GRP-Anteils
(Abb. 15A’; SU5402 St.12-12,5 versus DMSO: p= 0,573; SU5402 St.12,5-13 versus
DMSO: p=1,000). Zum andern wurde das arithmetische Mittel der Breite des somitischen
GRP-Anteils der DMSO-Kontrollembryonen auf 1 gesetzt und wiederum mit den
somitischen Anteilen der beiden verschiedenen SU5402-Ansätze verglichen (Abb. 15A’’).
In der Breite der somitischen GRP ergab sich zwischen allen drei Inkubationen ein
signifikanter Unterschied. SU5402-Inkubationen ab St.12-12,5 wiesen dabei eine stärkere
Reduktion des somitischen Beitrags zur GRP auf als SU5402-Inkubationen ab St.12,5-13
(p<0,001, Abb. 15A’’).
Dies ließ sich ebenfalls anhand der Expressionsanalyse von Xnr1 und Shh+Panza
erkennen (Abb. 15B). Im direkten Vergleich wiesen die ab St.12-12,5 in SU5402
inkubierten Embryonen zu 50% einen Verlust und zu 37% eine Reduktion von Xnr1 auf
(n=59), während die Inkubation ab St.12,5-13 zu 5% eine starke und zu 70% nur eine
leichte Reduktion von Xnr1 bewirkte (n=55). DMSO-behandelte Embryonen wiesen
höchstens eine leichte Reduktion auf, die 20% der Embryonen betraf (n=54). Die
Aussparung der somitischen GRP-Zellen, die bei Doppel-ISH auf Shh+Panza entsteht,
wurde durch SU5402-Inkubationen ab St.12-12,5 zu 52% stark reduziert (n=21). SU5402Inkubationen ab St.12,5-13 (n=14) hatten dagegen im Vergleich zu den DMSO-Kontrollen
(n=12) nur eine leichte Reduktion der Aussparung zur Folge. Somit bewirkte die
53
Ergebnisse
Inkubation ab St.12,5-13 zwar ebenfalls einen Verlust des somitischen Beitrags zur GRP,
dieser war aber weniger ausgeprägt. Damit waren bei den späten Inkubationen ab St.12,513 die somitischen Zellen ausreichend vorhanden, was die Induktion der asymmetrischen
Seitenplattenexpression gewährleistete. Durch das bemerkenswerte enge Zeitfenster,
indem SU5402 einen Einfluss auf die Entstehung der Lateralität hat, konnte somit belegt
werden, dass das Fehlen der somitischen GRP-Zellen mit der Entstehung von LRDefekten korreliert und somit kausal sein kann. Sonstige leichte Beeinträchtigungen der
Mesodermspezifizierung wiesen dagegen keine Korrelation mit LR-Defekten auf und
sollten somit nicht kausal sein.
Der FGF-Signalweg ist neben seiner Rolle in der Mesodermspezifizierung in viele andere
zelluläre
Prozesse
wie
z.B.
Differenzierung,
Migration,
Chemotaxis,
Adhäsion,
Zellüberleben, Proliferation oder Apoptose involviert. Im Folgenden sollte untersucht
werden, ob die Applikation von SU5402 eine Veränderung in Zellproliferation oder
Apoptose bewirkte, welche als mögliche Ursache des Verlusts somitischer GRP-Zellen in
Frage kommt. Sollten die Vorläuferzellen der somitischen GRP nach Erreichen des
Stadium 12/12,5 – FGF abhängig – proliferieren müssen, damit sie einen messbaren
Beitrag zur GRP leisten, müsste sich eine verminderte Zellproliferation zwischen SU5402und
DMSO-inkubierten
Embryonen
nachweisen
lassen.
Sollte
dagegen
FGF-
Signalaktivität für das Überleben der somitischen Zellen essentiell, so müssten
apoptotische Zellen im Bereich der GRP nach SU5402-Inkubation nachgewiesen werden
können.
Keine verminderte Zellproliferation durch SU5402-Inkubation
Während der Chromatinkondensation in proliferierenden Zellen wird das Histon3
phosphoryliert. Proliferierende Zellen können daher durch einen Antikörper nachgewiesen
werden, der spezifisch gegen die Ser10-Phosphorylierung von H3 gerichtet ist. In
Xenopus-Embryonen konnte gezeigt werden, dass dieser phospho-H3 (pH3) Antikörper
Chromosomen während der Prophase/Prometaphase, Metaphase und Anaphase
detektiert (Saka et Smith 2001).
Zum Nachweis der Zellproliferation wurden in zwei kontrollierten, unabhängigen
Experimenten Embryonen ab Stadium 11,5/12 in 60µM SU5402 (n=20) oder 0,3% DMSO
(n=17) inkubiert. Die Inkubationen wurden im St. 12,5, St.13/14 oder St.16 gestoppt und
54
Ergebnisse
die
Embryonen
Immunohistochemie
zu
diesen
(IHC)
fixiert.
unterschiedlichen
Zusätzlich
zur
Entwicklungsstadien
pH3-Detektion
für
wurden
die
durch
Hoechst33342-Färbung die Zellkerne und mit Alexa488-Phalloidin die Zellgrenzen
visualisiert. Anhand von Aufnahmen im Bereich der GRP wurde einerseits die Gesamtzahl
der Zellen und andererseits die Anzahl pH3-positiver Zellen mit dem „CellCounter“ Plugin
von ImageJ ausgezählt. Zwischen SU5402- und DMSO-behandelten Embryonen konnten
keine signifikanten Unterschiede in der Zellproliferationsrate festgestellt werden. So lag die
Zellproliferationsrate bei beiden Ansätzen in den Stadien 12,5 und 13/14 im Durchschnitt
zwischen 7-8% (p=0,869, zusammen dargestellt im Boxplot Abb. 16B), während sie im
Stadium 16 Werte zwischen 6-7% annahm (p=0,094, Abb. 16C).
Abbildung 16: Keine Verminderung der Zellproliferationsrate nach Applikation von SU5402
(A) Beispielembryonen nach IHC mit Antikörpern gegen phospho-Histon3 (rot), Darstellung der Zellgrenzen
mit 488-Palloidin (grün) und Färbung der Zellkerne mit Hoechst33342 (blau) im Bereich der GRP. (B,C)
Vergleich der Zellproliferationsrate in den Stadien 12,5 und 13/14 (B) und im Stadium 16 (C) lässt keinen
signifikanten Unterschied zwischen der DMSO (0,3%)- und der SU5402 (60µM)-Inkubation erkennen. n,
Anzahl der Embryonen.
Keine erhöhte Apoptose durch SU5402-Inkubation
Im nächsten Schritt wurde durch TUNEL-Analyse untersucht, ob die Inkubation in SU5402
eine verstärkte Apoptose zu Folge hatte. Embryonen mit TUNEL-positiven Zellen lassen
sich in Xenopus ab Beginn der Gastrulation im Stadium 10,5 beobachten (Hensey et
Gautier 1998). Das Ausmaß des natürlich auftretenden Zelltodes wird dabei als sehr
variabel beschrieben. Das Spektrum reicht von Embryonen, die keine einzige TUNELpositive Zelle aufweisen, bis zu Embryonen im gleichen Entwicklungsstadium, die
Hunderte von TUNEL-positiven Zellen besitzen. Embryonen mit mehr als fünf TUNELgefärbten
Zellkernen
wurden
dabei
als
TUNEL-positiv
gewertet.
In
den
Entwicklungsstadien 10,5-12,5 und 13, bzw.16/17 konnte so ein Anteil an TUNELpositiven Embryonen von 67%, bzw. 64% beschrieben werden. Mit Einsetzen der
55
Ergebnisse
Neurulation können reproduzierbare Muster von apoptotischen Regionen nachgewiesen
werden, in denen TUNEL-positive Zellen vor allem im Neuroektoderm auftreten (Hensey et
Gautier 1998).
Zur
Überprüfung
des
TUNEL-Assays
wurden
unbehandelte
Embryonen
im
Neurulastadium 17/18 untersucht. Bei Ihnen ließen sich, wie für diese Stadien publiziert,
apoptotische Zellen im Bereich des Neuroektoderms detektieren (Abb. 17 A,B). Zum
Nachweis der Zellapoptose bei behandelten Embryonen wurden in zwei kontrollierten,
unabhängigen Experimenten Embryonen ab Stadium 11,5/12 in 60µM SU5402 oder in
0,3% DMSO inkubiert und in den Entwicklungsstadien 12,5 und 13/14, bzw. in den Stadien
14 und 16 für den TUNEL-Assay fixiert. In diesen frühen Stadien waren TUNEL-positive
Zellen hauptsächlich diffus im Ektoderm und Neuroektoderm verteilt, im posterioren
Bereich der GRP ließen sich bei beiden Inkubationsansätzen jedoch keine apoptotischen
Zellen detektieren. In den Stadien 12,5 und 13/14 war der Anteil TUNEL-positiver
Embryonen nach Inkubation in SU5402 (42%, n=26) im Vergleich zur DMSO-Kontrolle
(38%, n=21) nicht signifikant erhöht (p=0,770). Sowohl bei der SU5402- als auch bei der
DMSO-Inkubation lag hier der Anteil TUNEL-positiver Embryonen etwas unter dem
publizierten Anteil von 67%.
Abbildung 17: Keine apoptotischen Zellen im Bereich der GRP nach Applikation von SU5402
(A-D) Embryonen nach TUNEL-Färbung im Neurulastadium. Anterior oben (A,B: St.18, dorsale Ansicht; C,D:
St.16, dorsale Ansicht; C’,D’: St.16, ventrale Ansicht zeigt GRP). (A, B) TUNEL-Färbung unbehandelter
Embryonen mit TUNEL-positiven Zellen, die im Zuge des programmierten Zelltod im Bereich des
Neuroektoderms auftreten. (C,D) DMSO (0,3%)- oder SU5402 (60µM)-inkubierte Embryonen mit TUNELpositiven Zellen im Ektoderm. (C’, D’) Weder nach DMSO- noch nach SU5402-Inkubation ließen sich
apoptotische Zellen im Bereich der GRP erkennen.
56
Ergebnisse
In den Stadien 14 und 16 war der Anteil TUNEL-positiver Embryonen nach Inkubation in
SU5402 (71%, n=14) im Vergleich zur DMSO-Kontrolle (67%, n=12) ebenfalls nicht
signifikant erhöht (p=0,793). In diesem Experiment lag jedoch die Anzahl TUNEL-positiver
Zellen pro positiv-gewerteten Embryo bei den SU5402-inkubierten Embryonen etwas
höher (nicht gezeigt). Dieser leicht positive Effekt auf die Zellapoptose nach SU5402Inkubation fand hauptsächlich im Ektoderm statt. Wie auch in den Stadien 12,5 und 13/14
waren die TUNEL-gefärbten Zellen in den Stadien 14 und 16 nie im Bereich der GRP
lokalisiert. Somit lieferte die Analyse dieser verschiedenen Entwicklungsstadien keinen
Hinweis darauf, dass der Verlust somitischer GRP-Zellen auf Apoptose beruhte.
Eine andere Möglichkeit zu untersuchen, ob der Verlust somitischer GRP-Zellen auf einer
induzierten Apoptose dieser Zellen beruht, lieferte die Überexpression von Bcl-XL.
Proteine der Bcl2 (B-cell lymphoma 2) Familie wirken entweder pro- oder antiapoptotisch
(Youle and Strasser 2008). Antiapoptotische Proteine der Bcl2-Familie können eine Rolle
bei der Entstehung von Tumoren spielen, indem sie den Zelltod verhindern (Vaux et
al.1988). Durch die Überexpression von Bcl-XL lässt sich in Xenopus-Embryonen sowohl
der natürlich vorkommende programmierte Zelltod als auch die durch chemische
Substanzen induzierte Apoptose unterbinden (Sible et al.1997, Yeo et Gautier 2003,
Johnston et al.2005). Die gezielte Überexpression von Bcl-XL in den somitischen GRPZellen sollte somit die Apoptose dieser Zellen unterbinden. Wenn also der Verlust der
somitischen GRP-Zellen nach Inhibition der FGF-Signalaktivität auf induzierter Apoptose
beruht, sollte die Injektion von Bcl-XL den Verlust dieser Zellen verhindern.
Bcl-XL wurde hierfür als DNA-Konstrukt im pCS2+-Vektor (8pg) in die Region (C2) von 4Zellembryonen injiziert, aus der die somitischen GRP-Zellen entstehen. Injizierte und
uninjizierte Embryonen wurden ab dem Gastrulastadium 12 in SU5402 (60µM) oder
DMSO (0,3%) inkubiert und im Neurulastadium 17/18 für Expressionsanalysen fixiert. Der
durch die SU5402-Inkubation entstehende Verlust der Xnr1- oder Coco-Expression,
konnte durch die zusätzliche Injektion von Bcl-XL nicht gerettet werden (Abb. 18). Die
Transkription von Xnr1 und Coco und die Bildung der somitischen GRP-Zellen können
möglicherweise auch unabhängig voneinander vom FGF-Signalweg beeinflusst werden.
Um indirekt auf die Bildung der somitischen GRP-Zellen schließen zu können, wurde die
durch Shh/Panza Doppelfärbung entstehende Aussparung analysiert.
57
Ergebnisse
Abbildung 18: Verlust der somitischen GRP-Zellen nach SU5402-Inkubation kann nicht durch
Koinjektion von Bcl-XL verhindert werden
Embryonen im St.17/18, ventrale Ansicht auf GRP, anterior oben. Embryonen wurden im 4-Zellstadium mit
Bcl-XL-DNA (8pg) beidseitig in die dorsolaterale Randzone injiziert. Bcl-XL-injizierte oder uninjizierte
Embryonen wurden ab St.12 in 60µM SU5402 inkubiert und mit DMSO (0,3%)-Kontrollembryonen
verglichen. Durch Inkubation in SU5402 kam es zu einem Verlust der bilateralen Xnr1- und Coco-Domäne
und zu einer Reduktion der Aussparung in den somitischen GRP-Zellen, die durch kombinierte Shh und
Panza ISH entsteht. Weder Xnr1 noch Coco noch die Aussparung konnten durch die Überexpression von
Bcl-XL gerettet werden.
Die Koinjektion von Bcl-XL konnte die starke Reduktion dieser Aussparung in SU5402inkubierten Embryonen nicht vermindern (Abb. 18). Durch die Injektion von Bcl-XL konnte
damit das Ergebnis der TUNEL-Analyse, dass keine durch SU5402-induzierte Apoptose
im Bereich der somitischen GRP-Zellen stattfindet, bestätigt werden. Somit ließ sich weder
eine gestörte Zellproliferation noch eine verstärkte Apoptose als Ursache des Verlusts
somitischer GRP-Zellen nachweisen.
58
Ergebnisse
Um zu verstehen, wie ein Signalweg auf einen bestimmten Prozess wirkt, kann es hilfreich
sein zu wissen, welche dem Signalweg nachgeschaltete Signaltransduktion dabei Einfluss
nimmt. Sprouty1 (Spry1) als Antagonist der PLC/PKC/Calcium-vermittelten Transduktion
des FGF-Signalwegs in Xenopus wurde überexprimiert, um spezifisch diesen Signalzweig
zu inhibieren (Sivak et al., 2005). Ein Einfluss auf die Induktion von FoxJ1 oder die Bildung
der somitischen GRP-Zellen sollte in diesem Falle bedeuten, dass der FGF-Signalweg
über PLC/PKC/Calcium auf diese LR-spezifischen Funktionen des FGF-Signalwegs wirkt.
Überexpression von Spry1 übt keinen Effekt auf die Expression von FoxJ1 aus
Um zu analysieren, ob die Überexpression von Spry1 einen Effekt auf die Expression von
FoxJ1 oder Tekt2 ausübt, wurde in drei unabhängigen Experimenten Spry1-mRNA (560800pg) beidseitig in die dorsale Randzone (C1-2 Region) injiziert.
Abbildung 19: Expressionsanalyse von FoxJ1 und Tekt2 nach Überexpression von Spry1
(A,B) Kontrollembryonen im Vergleich mit Embryonen nach Injektion von 640pg Spry1-mRNA in die dorsale
Randzone des 4-Zellstadiums. (A) Gastrulastadien mit wildtypischer FoxJ1-Expression im superfiziellen
Mesoderm. Vegetale Ansicht, dorsal oben (B) Neurulastadien mit Tekt2-Expression in der GRP. Im Spry1injizierten Embryo beschränkt sich die Expression auf den medialen Anteil der GRP (eingefasst dargestellt
durch gelbe gestrichelte Linie).
Trotz Überexpression von Spry1 wiesen alle Embryonen eine unverändert starke
Transkription von FoxJ1 (n=58) oder Tekt2 (n=79) auf (Abb. 19 A,B). Bei einem großen
Anteil der Spry1-injizierten Embryonen (n=35/79) beschränkte sich jedoch die Expression
auf den medialen Bereich der GRP, die laterale Expression in den somitischen GRPZellen war nicht zu erkennen. Die Überexpression von Spry1 führte also im Gegensatz zu
der Rezeptor-vermittelten Unterbindung des FGF-Signalwegs zu keiner Beeinträchtigung
der FoxJ1-Expression und betraf im Falle von Tekt2 nur die lateralen GRP-Zellen.
59
Ergebnisse
Verlust der paranotochordalen Xnr1- und Coco-Domäne nach Überexpression von
Spry1
Im Folgenden sollte geklärt werden, ob die Überexpression von Spry1 einen Effekt auf die
paranotochordale Expression von Xnr1 und Coco ausübt. Dazu wurden 320-800pg Spry1mRNA im 4-Zellstadium unilateral in die linke oder rechte C2-Region injiziert.
Abbildung 20: Expressionsanalyse der Xnr1- und Coco-Domäne nach Überexpression von Spry1
Expressionsanalyse von Xnr1 und Coco im Neurulastadium 17/18 nach Injektion von 320-800pg Spry1mRNA in die linke oder rechte (gekennzeichnet als rechts injiziert) dorsolaterale Randzone (C2) im 4Zellstadium. (A) Beispiele der Expressionsmuster, ventrale Ansicht auf die GRP. Embryonen wiesen nach
Überexpression von Spry1 eine stark reduzierte oder fehlende Expression auf. Unabhängig vom
Expressionsmuster der injizierten Embryonen konnte eine Verschiebung (schwarz gestrichelte Linie) oder
eine normale Ausprägung (orange gestrichelte Linie) des Blastoporus beobachtet werden. (B) Der Anteil an
Embryonen mit stark reduzierter oder fehlender Xnr1- oder Coco-Transkription war nach Injektion von Spry1
sehr hoch signifikant.
60
Ergebnisse
Bei der Expressionsanalyse im Neurulastadium 17/18 wurden, wie bei der Auswertung
nach Injektion von dnFgfr1, leichte Unterschiede zwischen der linken und rechten Seite,
wie sie in ihrer Stärke auch in Wildtyp-Embryonen vorkommen, nicht gewertet.
Embryonen, die eine über das Wildtyp-Niveau hinaus verringerte Expression aufwiesen,
wurden zur Kategorie „reduziert“ gezählt und den Embryonen mit vollständigem Verlust
(Kategorie „fehlend“) gegenübergestellt. Durch die Überexpression von Spry1 kam es zu
einer verminderten Expression von Xnr1 und Coco. Die unilaterale Injektion von Spry1mRNA führte zu einem Anteil von 53% (linksseitig, n=102) oder 60% (rechtsseitig, n=215)
an Embryonen, deren Xnr1-Expression auf der injizierten Seite der Kategorie „reduziert“
oder „fehlend“ zugeordnet werden konnte. Dabei war der vollständige Expressionsverlust
(Kategorie „fehlend“) nur selten zu beobachten (p<0,001, Abb. 20 A,B). Der expressionsmindernder Effekt auf Coco fiel nach Überexpression von Spry1 vergleichbar zu dem
Effekt auf Xnr1 aus. Die unilaterale Injektion von Spry1-mRNA führte zu einem Anteil von
56% (linksseitig, n=72) oder 50% (rechtsseitig, n=113) an Embryonen, deren CocoExpression der Kategorie „reduziert“ oder „fehlend“ zugeordnet werden konnte, wobei
auch hier die letztere Kategorie nur selten vertreten war (p<0,001, Abb. 20 A,B). Wie für
den Funktionsverlust nach Fehlexpression von dnFgfr1 beschrieben, bewirkte Sprouty1 in
manchen Embryonen eine Verminderung der CBC-Wölbung auf der injizierten Seite.
Dieser Effekt war unabhängig vom Verlust der Xnr1- oder Coco-Transkription (Abb. 20A).
Der
Expressionsverlust
von
bilateralem
Xnr1
und
Coco,
wie
er
durch
die
Rezeptorblockierung via SU5402 oder durch den dnFGFR1 zustande kommt, konnte also
auch durch die Überexpression von Spry1 bewirkt werden. Da ein Verlust dieser
Expressionsdomänen nicht zwingend mit dem generellen Verlust somitischer Zellen
einhergehen muss, wurde nachfolgend die Bildung dieser Zellen nach Injektion von Spry1
untersucht.
Verlust somitischer GRP-Zellen nach Überexpression von Spry1
Zur genaueren Analyse, ob der Verlust der Xnr1- und Coco-Expression auch bei
Überexpression von Spry1-mRNA mit dem generellen Verlust somitischer GRP-Zellen
einhergeht, wurden weitere Expressionanalysen und REM-Untersuchungen durchgeführt.
Derrière wird wie Coco und Xnr1 in den somitischen GRP-Zellen exprimiert (Vonica and
Brivanlou, 2007). Weiterhin lassen sich diese Zellen durch die Expressionslücke, die bei
61
Ergebnisse
Abbildung 21: Überexpression von Spry1 führt zum Verlust der somitischen GRP-Zellen
(A-E) Embryonen im Neurulastadium 17/18, ventrale Ansicht auf GRP. (A,A’,B,B’) Kontrollembryonen im
Vergleich zu Embryonen, die im 4-Zellstadium mit 800pg Spry1-mRNA in die rechte dorsolaterale Randzone
(C2) injiziert wurden. Expressionsanalysen von Derrière (A) und Shh+Panza (B) ließen verminderte
Expression (A’) und verminderte Aussparung (B’) im somitischen GRP-Bereich der injizierten Seite
erkennen. (C,D) REM-Aufnahmen von Embryonen, die im 4-Zellstadium mit 800pg Spry1-mRNA in die linke
dorsolaterale Randzone (C2) injiziert wurden. In den jeweiligen Vergrößerungen wurde der Grenzbereich
zwischen GRP und Entoderm und zwischen noto-/hypochordalen und somitischen GRP-Bereich gelb
eingestrichelt, die somitischen Zellen wurden gelb eingefärbt. (C) Embryo mit Verschmälerung des
somitischen GRP-Anteils auf der injizierten Seite. In den Auschnitten aus G’ (blauer und orangener Kasten)
weisen rote Pfeilspitzen auf die langen Cilien des GRP-Epithels, wohingegen die blauen Pfeilspitzen die
kurzen Cilien des Entodermepithels markieren. (D,E) Embryonen bei denen keine somitischen GRP-Zellen
auf der injizierten Seite ausgemacht werden konnten. (C,D) Symmetrisch ausgebildeter Blastoporus. (E) Das
circumblastoporale Gewebe konzentriert sich stärker auf der uninjizierten Seite, sodass der Blastoporus
leicht verschoben wirkt.
einer Doppelfärbung von Panza und Shh entsteht, visualisieren. Die Expressionsanalyse
von Derriere und Shh/Panza nach unilateraler Überexpression von Spry1 deutete auf
einen Verlust somitischer GRP-Zellen auf der injizierten Seite hin (Abb. 21A’,B’). Die REMAnalyse bestätigte diesen Befund. Hierbei wiesen 27% der Embryonen wildtypisch
somitische GRP-Zellen auf der injizierten Seite auf, während die Breite der somitischen
62
Ergebnisse
GRP bei 50% der Embryonen reduziert war (Abb. 21C) und sich in 23% der Embryonen
keine somitischen Zellen auf der injizierten Seite unterscheiden ließen (n=22, Abb. 21D,E).
Zusammengefasst zeigte die Injektion von Spry1 keinen Effekt auf die frühe Funktion des
FGF-Signalwegs in der LR-Achsenentwicklung (Expression von FoxJ1), wohingegen die
zweite Funktion (Bildung somitischer GRP-Zellen) beeinträchtigt wurde. Da Sprouty1
nachgeschaltet zum FGF-Signalweg als Antagonist von PLC/PKC/Calcium agiert, scheint
dieser Signalzweig die Bildung der somitischen GRP-Zellen zu vermitteln. Mesodermale
Genexpressionen
wurden
im
Folgenden
analysiert,
um
abzusichern,
dass
die
Überexpression von Spry1 wie publiziert, keinen Effekt auf den FGF-abhängigen MAPKSignalweg ausübt (Nutt et al., 2001; Sivak et al., 2005).
Geringer Effekt auf mesodermale Genexpression nach Überexpression von Spry1
Um zu überprüfen ob und gegebenenfalls welchen Effekt die Überexpression von Spry1
auf die MAPK-abhängige Spezifizierung des Mesoderms ausübt, wurden Embryonen im 4Zellstadium in die dorsale Randzone injiziert (560-800pg Spry1-mRNA). Im Gastrula- und
Neurulastadium wurde durch Expressionsanalyse die Transkription der Mesodermmarker
Xbra und MyoD in Spry1-injizierten Embryonen mit Kontrollembryonen verglichen.
In vier unabhängigen Experimenten konnte im Gastrulastadium eine leichte Reduktion von
Xbra im dorsal medialen Bereich (bilaterale Injektionen in die C1-Region, n=37) und von
MyoD im dorsolateralen Bereich (unilaterale Injektion in die C2-Region, n=51) festgestellt
werden. Die Reduktion fiel selbst bei hohen Konzentrationen von 800pg Spry1-mRNA pro
Injektion mild aus und bewirkte bei Xbra höchstens eine Verschmälerung der dorsalen
Expression (Abb. 22B). Die Reduktion des MyoD-Signals war im Unterschied zur
Kontrollseite zwar zu erkennen (Abb. 22F), jedoch nicht vergleichbar mit dem Verlust
mesodermaler Genexpression, wie er durch die Rezeptor-vermittelte Inhibition hervorgerufen wird. Embryonen, die im Neurulastadium auf ihre Genexpression untersucht
wurden, wiesen keinen Unterschied zwischen den Spry1-injizierten und den uninjizierten
Kontrollembryonen auf (Abb. 22C,D,G,H).
So hatte Sprouty1 einen leichten Effekt auf die MAPK-abhängige Mesodermspezifizierung,
der leicht in Gastrulastadien, nicht aber in Neurulastadien zu erkennen war. Somit kann
man sagen, dass Sprouty1 sich hier als schwacher Antagonist der MAPK-vermittelten
63
Ergebnisse
Geninduktion bemerkbar machte. Aufgrund der vorliegenden Experimente kann nicht völlig
ausgeschlossen werden, dass der FGF-Signalweg in späten Gastrulastadien über die
MAPKinase auf die Entstehung der Lateralität wirkt. Der schwache Effekt auf die
Mesodermspezifizierung und die in der Literatur beschriebene Funktion von Sprouty1 als
Antagonist des PKC/PLC/Calcium-Signalzweigs deuten jedoch darauf, dass der Verlust
somitischer Zellen nach FGF-Funktionsverlust über PKC/PLC/Calcium vermittelt wird.
Abbildung 22: Expression mesodermaler Marker nach Überexpression von Spry1
(A,B;E,F) Gastrula: vegetale Ansicht, dorsal oben. (C,D,G,H) Neurula: ventrale Ansicht, dorsal oben.
(A,C,E,G) Kontrollembryonen. (B,D,F,H) Embryonen nach Injektion von Spry1-mRNA (640pg) im 4Zellstadium in die dorsale Randzone (beidseitig: 2xC1; B,D) oder in die dorsolaterale Randzone (rechtsseitig
C2; F,H) im 4-Zellstadium. Die Injektion von Spry1 bewirkte eine leichte Reduktion von Xbra (B, gelbe
Pfeilspitze) oder MyoD (F, rote Pfeilspitze) im dorsalen Bereich der Randzone im Gastrulastadium, ließ aber
keine Veränderung der Xbra- (D) oder MyoD- (H) Expression im Neurulastadium erkennen.
Der Funktionsverlust von Pkd2, das für einen Calcium-permeablen Kanal codiert, führt
ebenfalls zum Verlust der paranotochordalen Xnr1-Domäne (Vick, 2009). Damit weist er
eine Parallele zur Inhibition des FGF-Signalwegs via Sprouty1 auf. Dies liefert einen
weiteren Hinweis, dass der FGF-Signalweg nicht über die MAPK, sondern über
PKC/PLC/Calcium auf die somitischen GRP-Zellen wirkt. In diesem Falle sollte der für den
Pkd2-Knockdown beschriebene Verlust der bilateralen Xnr1-Domäne ebenfalls auf einem
generellen Verlust dieser Zellen beruhen. Dadurch würde sich insbesondere die
Freisetzung von intrazellulärem Calcium als ein essentieller Faktor für die Bildung der
somitischen GRP-Zellen herausstellen.
64
Ergebnisse
Pkd2-Knockdown führt ebenfalls zum Verlust der somitischen GRP-Zellen
Für die Pkd2-Funktionsverlustexperimente wurde 1pmol Pkd2-MO unilateral in die linke
oder rechte C2-Region von Embryonen im 4-Zellstadium injiziert. Wie von Vick (2009)
gezeigt, hatten die Injektionen des Pkd2-MOs die Reduktion oder den vollständigen
Verlust der paranotochordalen Xnr1-Domäne im Neurulastadium 17/18 zur Folge
(Abb. 23A’). Dies traf zudem auch auf die Expressionsdomäne von Coco zu (Abb. 23B’).
Abbildung 23: Verlust somitischer GRP-Zellen nach Pkd2-Knockdown
(A-C) Embryonen im Neurulastadium 17/18, ventrale Ansicht auf GRP. (A,A’,B,B’) Kontrollembryonen im
Vergleich mit Embryonen, die im 4-Zellstadium mit 1pmol Pkd2-MO in die linke dorsolaterale Randzone (C2)
injiziert wurden. (A’) Expressionsanalyse von Xnr1 (A’) oder Coco (B’) machte Reduktion (A’) oder
vollständigen Verlust (B’) der Expression im somitischen GRP-Bereich der injizierten Seite deutlich. (C)
REM-Aufnahmen eines Embryos, der im 4-Zellstadium mit 1pmol Pkd2-MO in die linke dorsolaterale
Randzone (C2) injiziert wurde. Der Grenzbereich zwischen GRP und Entoderm und zwischen noto/hypochordalen und somitischen GRP-Bereich wurde gelb eingestrichelt, die somitischen Zellen wurden gelb
eingefärbt. Auf der injizierten Seite konnten keine somitischen GRP-Zellen ausgemacht werden. In den
Ausschnitten (blauer und orangener Kasten) weisen rote Pfeilspitzen auf die langen Cilien des somitischen
GRP-Anteils, wohingegen lila Pfeilspitzen auf die langen Cilien des medialen GRP-Anteils deuten.
So wiesen Embryonen aus drei unabhängigen Experimenten nach Injektion des Pkd2MOs einen Anteil von 39% mit stark reduzierter Coco-Expression und einen Anteil von
65
Ergebnisse
22% mit vollständigem Expressionsverlust von Coco auf der injizierten Seite auf (n=59),
während die Kontrollembryonen wildtypische Seitenunterschiede aufwiesen (n=82,
p<0,001). In REM-Aufnahmen konnte durch die gezielte Injektion in den dorsolateralen
Bereich der Randzone (C2-Region) der generelle Verlust somitischer GRP-Zellen
beobachtet werden (Abb. 23C). Somit lag nahe, dass ein Calciumsignal für die Bildung der
somitischen GRP-Zellen essentiell ist. Um zu klären ob Sprouty1 als Antagonist des FGFSignalwegs insbesondere über die Inhibition von Calcium auf die somitischen GRP-Zellen
wirkt, wurden kombinierte Experimente mit Pkd2-MO und Pkd2-mRNA durchgeführt.
Spry1 und Pkd2 wirken gemeinsam auf die paranotochordale Xnr1- und CocoDomäne
66
Ergebnisse
Abbildung 24: Spry1-Überexpression und Pkd2-Knockdown wirken epistatisch auf die Expression
von Xnr1 und Coco
(A) Expressionsanalyse von Xnr1 und Coco im Neurulastadium 17. Embryonen, die im 4-Zellstadium
rechtsseitig in die dorsolaterale Randzone (C2) mit Pkd2-MO (0,5pmol) oder Spry1-mRNA (160pg) injiziert
wurden, zeigten insgesamt eine stärkere Expression als die kombinierte Injektion von Pkd2-MO und Spry1mRNA in den gleichen Konzentrationen. (B) Quantifizierung der Expressionsanalyse macht die signifikante
Verstärkung des Anteils an Embryonen mit reduzierter oder fehlender Expression nach kombinierter
Injektion im Vergleich zu Einzel-Injektionen deutlich. re, rechts
Um zu untersuchen, ob Spry1 und Pkd2 im gleichen Signalweg wirken, wurden EpistasisExperimente durchgeführt. Separate Injektionen von 0,5pmol Pkd2-MO oder von 160pg
Spry1-mRNA hatten nur einen geringen Anteil an Embryonen mit reduzierter Xnr1- oder
Coco-Expression zur Folge (Abb. 24). Die simultane Injektion von Pkd2-MO und Spry1mRNA bewirkte dagegen einen signifikant verstärkten Anteil an Embryonen, die eine
reduzierte oder keine Expression von Xnr1 oder Coco auf der injizierten Seite aufwiesen
(p<0,001, Abb. 24).
Ergänzend zu diesen Experimenten wurde untersucht, ob sich der Verlust der Xnr1Expression bei Spry1-Überexpression durch eine Verstärkung der intrazellulären CalciumKonzentration retten ließ. Dabei wurde davon ausgegangen, dass die Injektion von Pkd2mRNA, wie beschrieben, einen Anstieg an intrazellulärem Calcium bewirkt (Koulen et al.,
2002).
Abbildung 25: Pkd2-Funktionsgewinn rettet den Verlust der paranotochordalen Xnr1-Expression
nach Spry1-Überexpression
(A) Expressions-Analyse von Xnr1 im Neurulastadium 17/18. Embryonen, die im 4-Zellstadium rechtseitig in
die dorsolaterale Randzone (C2) mit Spry1-mRNA (320pg) injiziert wurden, wiesen eine reduzierte Xnr1Expression auf der injizierten Seite auf, die durch Koinjektion von Pkd2-mRNA (960pg) gerettet wurde. (B)
Quantifizierung der Expressionsanalyse macht die sehr hoch signifikante Verminderung des Anteils an
Embryonen mit reduzierter oder fehlender Expression nach kombinierter Injektion im Vergleich zur Spry1EinzeIinjektion deutlich.
In
vier
unabhängigen
Experimenten
wurde
Spry1-mRNA
einseitig
in
solchen
Konzentrationen (320-800pg/8nl) injiziert, die eine signifikante Reduktion der Xnr167
Ergebnisse
Domäne bewirkten. Die Koinjektion von Pkd2-mRNA konnte diesen Effekt signifikant
senken (p<0,001, Abb. 25). Die Spry1-vermittelte Reduktion der Xnr1- und CocoExpression
ließ
sich
somit
sowohl
von
Pkd2-Funktionsverlust-
als
auch
von
Funktionsgewinnexperimenten modulieren. Die hierbei nachgewiesenen Effekte deuten
an, dass Sprouty1 die FGF-abhängige Bildung der somitischen GRP-Zellen über die
Inhibition der Freisetzung von intrazelluären Calcium-Ionen unterbindet.
Der Effekt den der Pkd2-Funktionsverlust und der Spry1-Funktionsgewinn auf die
somitischen Zellen ausüben, lässt sich mit einer Rolle von intrazellulärem Calcium für die
Bildung dieser lateralen GRP-Zellen vereinbaren. Pkd2 spielt in Xenopus bereits in frühen
Gastrulastadien eine Rolle in der Morphogenese der GRP (Vick, 2009). Eine Möglichkeit
intrazellulären Calcium-Wellen insbesondere zu festgelegten Zeitpunkten zu inhibieren,
liegt in der Anwendung eines spezifischen Inhibitors, dessen Einsatz im nachfolgenden
Absatz beschrieben wird.
Thapsigargin-Inkubationsexperimente zur Inhibition von intrazellulärem Calcium
Ein initialer Einstrom von Calcium kann den weiteren intrazellulären Anstieg durch die
Freisetzung von Calcium aus dem Endoplasmatischen Retikulum induzieren. Das aus
Thapsia garganica isolierte Thapsigargin wirkt als Inhibitor der endoplasmatischretikulären Calcium-ATPase. Thapsigargin inhibiert die Freisetzung von intrazellulärem
Calcium, indem es die Auffüllung des Endoplasmatischen Retikulums als intrazellulären
Calciumspeicher verhindert (Treiman et al., 1998). In Xenopus kann die Entstehung von
intrazellulären Calcium-Wellen im Bereich der dorsalen Randzone durch die Applikation
von Thapsigargin unterbunden werden. Dies führt zu Störungen der konvergenten
Extensionsbewegungen, sodass im Gastrulastadium behandelte Embryonen Blastoporusschlussdefekte aufweisen (Wallingford et al., 2001).
Thapsigargin wurden im Rahmen dieser Arbeit angewendet, um den Einfluss von Calcium
auf die somitischen Zellen zu analysieren. Hierfür wurde eine Expressionsanalyse von
bilateralen Xnr1 durchgeführt. Um die Funktionalität von Thapsigargin im Vorfeld
abzusichern, wurden Embryonen ab dem Gastrulastadium 10,5 bis zum Neurulastadium
15 in einer Dosis von 4µm Thapsigargin oder 1% DMSO inkubiert und anschließend
morphologisch untersucht. Während in den DMSO-Kontrollembryonen kein Unterschied zu
68
Ergebnisse
den
unbehandelten
Kontrollembryonen
festgestellt
werden
konnte,
wiesen
alle
Thapsigargin-behandelten Embryonen einen offenen Blastoporus auf (nicht gezeigt). Dies
steht in Einklang mit der Störung von konvergenten Extensionsbewegungen.
Für die Untersuchung der bilateralen Xnr1-Domäne wurden Inkubationsexperimente zu
verschiedenen Zeitpunkten gestartet. Durch Inkubationen ab dem späten Gastrulastadium
11,5 konnten Blastoporusschlussdefekte vermieden werden. Die Thapsigargin-inkubierten
Embryonen erschienen jünger, da sich ihre Neuralfalten noch nicht ihrem Stadium
entsprechend geschlossen hatten, was durch eine Inhibition der konvergenten
Extensionsbewegungen im Neuroektoderm mittels Thapsigargin zu erklären war
(Abb. 26C). Inkubationen beginnend ab St.11,5 bewirkten einen Verlust (45%, Abb. 26D)
oder eine Reduktion (55%, Abb. 26E) der bilateralen Xnr1-Domäne (n=22). Auffallend war,
dass bei Embryonen mit reduzierter Xnr1-Domäne die beiden Expressionshälften nah
aneinander liefen und die mediale Aussparung des Notochords teilweise stark verkleinert
wurde (Abb. 26E).
Abbildung 26: Thapsigargin-Inkubation bewirkt Verlust der paranotochordalen Xnr1-Expression
(A-E) Neurulaembryonen im St.17/18, anterior oben. (A,C) dorsale Ansicht auf die Neuralfalten. (B,D,E)
Ventrale Ansicht auf GRP. (A,B) DMSO-Kontrollembryo mit geschlossenen Neuralfalten und wildtypisch
starker Xnr1-Expression. (C,D) Thapsigargin-inkubierter Embryo mit Neuralrohrschlussdefekt und fehlender
Xnr1-Expression. (E) Thapsigargin-inkubierter Embryo mit stark reduzierter Xnr1-Expression und
vermindertem Abstand der beiden Expressionshälften
Die Inkubation in Thapsigargin zeigt, dass Calcium am Ende der Gastrulation auf die
somitischen GRP-Zellen wirkt. Auch Liganden des nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs wie
Wnt11 wirken über die Mobilisierung von intrazellulärem Calcium (Kühl, 2004). Die frühe
Funktion, die Wnt11b in der Morphogenese der GRP-Zellen spielt, könnte über den nichtkanonischen Wnt/Calcium-Signalweg gesteuert werden, da der hierbei beobachtete
Phänotyp bei Funktionsverlust an den Funktionsverlust von Pkd2 erinnert (Walentek,
2012). Weiterhin konnte eine Funktion für die bilaterale Xnr1- und Coco-Expression
beschrieben werden.
69
Ergebnisse
Im Weiteren sollte daher untersucht werden, ob der Wnt-Signalweg über dieselbe
Signaltransduktion wie der FGF-Signalweg Einfluss auf die somitischen GRP-Zellen
nimmt. Dazu wurden Epistasis-Experimente durchgeführt, in denen der Wnt-Signalweg
durch MO-Knockdown von Wnt11b ausgeschaltet wurde, während der FGF-Signalweg
durch die Überexpression von Spry1 inhibiert wurde.
Spry1 und Wnt11b wirken gemeinsam auf die paranotochordale Xnr1- und CocoDomäne
Vorab wurde die Spezifität des Wnt11b-Knockdowns auf den Verlust der bilateralen
Expressionsdomäne untersucht. Hierfür wurde der Wnt11b-MO allein oder in Kombination
mit Wnt11b-DNA injiziert. Durch die Injektion von 1pmol Wnt11b-MO konnte die Xnr1Expression auf der injizierten Seite im Vergleich zu Kontrollembryonen signifikant reduziert
werden (34%, n=76, p<0,001, Abb. 27A’). Durch Koinjektion von 8pg Wnt11b-DNA ließ
sich der Verlust der Xnr1-Expression dagegen signifikant senken (8%, n=66, p<0,001,
Abb. 27A’). Durch die Injektion von 8pg Wnt11b-DNA konnte ein starker Effekt auf das
Schließen der Neuralfalten beobachtet werden (Abb. 27A, gelber Pfeil). Zudem wurden die
Expressionshälften der bilateralen Xnr1-Domäne über das wildtypische Maß voneinander
getrennt (Abb. 27A). Diese beiden Phänotypen traten bei Koinjektion von Wnt11b-MO
vermindert auf und lassen sich durch konvergente Extensionsstörungen, wie sie sowohl
beim
Funktionsverlust
als
auch
beim
Funktionsgewinn
von
PCP-Komponenten
beschrieben wurden, erklären.
Im Zuge von Epistasis-Experimenten hatten separate Injektionen von 0,5pmol Wnt11b-MO
oder von 160pg Spry1-mRNA nur einen geringen Anteil an Embryonen mit reduzierter
Xnr1- oder Coco-Expression zur Folge. Die simultane Injektion von Wnt11b-MO und
Spry1-mRNA bewirkte dagegen einen signifikant verstärkten Anteil an Embryonen, die
eine reduzierte oder fehlende Expression von Xnr1 oder Coco auf der injizierten Seite
aufwiesen (Tab.1, Abb. 27B,B’).
Xnr1
Coco
Spry1-mRNA versus Spry1 mRNA + Wnt11b-MO
p<0,001
p<0,001
Wnt11b-MO versus Spry1-mRNA + Wnt11b-MO
p=0,004
p<0,001
Tabelle 1: Signifikanzen der Epistasis-Experimente von Spry1-mRNA und Wnt11-MO
70
Ergebnisse
Abbildung 27: Wnt11b-MO und Spry1-mRNA wirken epistatisch auf die Expression von Xnr1 und
Coco
(A) Expressionsanalyse von Xnr1 im Neurulastadium 17/18 (anterior oben; obere Reihe: ventrale Ansicht;
untere Reihe: dorsale Ansicht). (A,A’) Embryonen, die im 4-Zellstadium rechtsseitig in die dorsolaterale
Randzone (C2) mit 1pmol Wnt11b-MO injiziert wurden wiesen einen signifikanten Verlust der rechten
Expressionshälfte auf (roter Pfeil in A), der durch Koinjektion von 8pg Wnt11b-DNA sehr hoch signifikant
gerettet werden konnte. (A) Die alleinige Überexpression von 8pg Wnt11b-DNA bewirkte
Neuralrohrschlussdefekte (gelber Pfeil), die durch Koinjektion von Wnt11b-MO vermindert wurden. (A’)
71
Ergebnisse
Quantifizierung der Expressionsanalyse. (B,B’)) Expressionsanalyse von XnrI und Coco im Neurulastadium
17/18. Embryonen, die im 4-Zellstadium rechtsseitig in die dorsolaterale Randzone (re C2) mit Spry1-mRNA
(160pg) oder Wnt11b-MO (0,5pmol) injiziert wurden zeigten, zeigten insgesamt eine stärkere Expression als
Embryonen nach kombinierter Injektion von Wnt11b-MO und Spry1-mRNA in den gleichen Konzentrationen.
(B) Quantifizierung der Expressionsanalyse. Diese macht die Verstärkung des Anteils an Embryonen mit
reduzierter oder fehlender Expression nach kombinierter Injektion im Vergleich zu Einzel-Injektionen
deutlich.
Für Pkd2 und Wnt11b, deren Genprodukte im Zusammenhang mit der Erhöhung der
intrazellulären Calcium-Konzentration stehen, konnte somit ein Einfluss auf die
somitischen GRP-Zellen nachgewiesen werden. Eine Rolle von Calcium in der Regulation
dieser Zellen wurde durch Thapsigargin-Inkubationsexperimente bestätigt. Im Bezug zur
FGF-Signalaktivität konnte gezeigt werden, dass Sprouty1 als Antagonist des FGFabhängigen PKC/PLC/Calcium-Signalwegs, sowohl in der Pkd2- als auch in der Wnt11b–
vermittelen Signaltransduktion mitwirkt. Inwiefern Calcium die Bildung somitischer GRPZellen regulieren könnte, wird unter anderem in der folgenden Diskussion erörtert.
72
Diskussion
Diskussion
FGF-Signalaktivität als Determinante der Lateralitätsentwicklung von Xenopus
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Unterbindung der Rezeptor-vermittelten
Signaltransduktion den Verlust der asymmetrischen Seitenplattenexpression zur Folge
hat, und weisen somit eine Rolle des FGF-Signalwegs in der LR-Achsendeterminierung
von Xenopus nach. Durch die Inhibition von FGF-Signalaktivität konnten zwei spezifische
Funktionen in Xenopus beschrieben werden.
(1) Die frühe Funktion äußert sich in der Induktion von FoxJ1 im Gastrulastadium und
damit in der Spezifizierung des späteren LR-Organisators (Abb. 28). Die Expression von
FoxJ1 ist entscheidend für die korrekte Entwicklung der LR-Achse, da dieser
Transkriptionsfaktor übergeordnet die Expression von Genen aktiviert, welche für Bildung
und Beweglichkeit der Cilien verantwortlich sind (Yu et al., 2008). So verfügen FoxJ1
Knockout-Mäuse nur über kurze und immotile Cilien im PNC (Alten et al., 2012). Der
Morpholino-Knockdown von FoxJ1 in Xenopus und Zebrabärbling bewirkt die Reduktion
der Länge und der Anzahl der Cilien in der GRP oder im Kupffer’schen Vesikel (KV)
(Stubbs
et
al.,
Flüssigkeitsstroms,
2008).
was
Dadurch
in
kommt
Xenopus
es
zum
einen
Verlust
Verlust
des
der
linksgerichteten
asymmetrischen
Seitenplattenexpression nach sich zieht (Vick et al., 2009; Beyer et al., 2012).
(2) FGF-Signalaktivität wirkt in Xenopus auf die lateralen somitischen Zellen der GRP
(Abb. 28). Diese Nodal-/Coco-exprimierenden Zellen ließen sich im Rahmen dieser Arbeit
durch vergleichende Markergenanalysen und rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen
näher charakterisieren (publiziert in Schweickert et al., 2010). Durch ihre Zugehörigkeit zur
GRP ergibt sich die Möglichkeit, dass der linksgerichtete Flüssigkeitsstrom direkt auf diese
Zellen wirkt. In Medaka kann man ebenfalls anhand von transversalen Schnitten
erkennen, dass Charon- als auch Spaw-exprimierende Zellen einen direkten Anteil am
Epithel des KVs ausmachen (Hojo et al., 2007). Nodal sowie Cerl2 werden auch in der
Maus von den lateralen Zellen des PNCs, den sogenannten „Crown cells“ exprimiert,
welche sensitiv auf den Flüssigkeitsstrom reagieren (Oki et al., 2009; Nakamura et al.,
2012; Yoshiba et al., 2012). Im Folgenden werden die Nodal(Spaw)-/Coco(Cerl2, Charon)exprimierenden Zellen als Sensorzellen des LR-Organisators bezeichnet. Durch FGFR73
Diskussion
Inhibition ab späten Gastrulastadien kam es zum spezifischen Verlust dieser Zellen. Dabei
korrelierte der Anteil an Embryonen, die keine oder eine stark reduzierte Expression von
Nodal aufwiesen, mit dem Anteil an Embryonen, die einen Verlust an Pitx2c-Expression
aufwiesen. Dies steht im Einklang damit, dass in Xenopus die paranotochordale NodalDomäne, wie in der Maus, eine Voraussetzung der asymmetrischen Genkaskade in der
Seitenplatte ist (Brennan et al., 2002; Saijoh et al., 2003; Schweickert et al., 2010).
Da der FGF-Signalweg in konvergenten Extensionsbewegungen beteiligt ist und diese in
Verbindung zum Wnt/PCP-Signalweg stehen, stellte sich die Frage, ob durch die
Rezeptor-vermittelte
Inhibition
die
Polarisierung
der
Cilien
beeinträchtigt
wurde
(Wallingford et al., 2002). Nach Inhibtion des FGF-Signalwegs ab mittleren/späten
Gastrulastadien ließ sich teilweise eine leichte Verzögerung des Neuralrohrschlusses
ausmachen.
Dies
war
wahrscheinlich
ein
Resultat
gestörter
konvergenter
Extensionsbewegungen das sich jedoch zeitnah nach Beenden der Inkubation
normalisierte (nicht gezeigt). Aufgrund einhergehender konvergenter Extensionsdefekte
bei
Inhibition
von
FGF-Signalaktivität
hätte
man
anhand
der
rasterelektronen-
mikroskopischen Aufnahmen SU5402-inkubierter Embryonen vielmehr eine Verbreiterung
der GRP erwartet, jedoch war diese aufgrund der fehlenden somitischen GRP-Zellen
verschmälert (Abb. 12D). Zudem wiesen die Cilien eine wildtypische Polarisierung auf
(Abb. 8B). FGF scheint somit hier keine Rolle auf die PCP-vermittelte Polarisierung der
Cilien und Morphogenese der medialen GRP zu spielen. Zwar werden der FGF- und der
PCP-Signalweg für konvergente Extensionsbewegungen benötigt, jedoch agiert der FGFSignalweg beispielsweise über NRH („neurotrophin receptor homolog“) parallel und
unabhängig vom PCP-Signalweg (Wallingford et al., 2002; Chung et al., 2005). Auch die
Aktivierung von PKC, die im Zusammenhang mit dem FGF- und PCP-Signalweg steht,
kann unabhängig vom PCP-Signalweg in der konvergenten Extension wirken (Choi and
Han, 2002).
Die Lateralitätsentwicklung der Wirbeltiere weist viele konservierte Prozesse auf. So
konnte die Nodal-Kaskade im linken Seitenplattenmesoderm in allen untersuchten
Wirbeltieren
beschrieben
Flüssigkeitsstrom
als
werden
(Hamada
symmetriebrechender
et
al.,
2002).
Mechanismus
Der
wurde
linksgerichtete
neben
dem
Säugermodell Maus, im Kaninchen, im Amphibienmodell und in den Knochenfischen
Zebrabärbling und Medaka nachgewiesen (Nonaka et al., 1998; Essner et al., 2005a;
Okada et al., 2005; Hojo et al., 2007; Schweickert et al., 2007). Das Huhn im Gegensatz
74
Diskussion
könnte den Flüssigkeitsstrom als symmetriebrechenden Mechanismus sekundär verloren
haben, nachdem sich asymmetrische Zellbewegungen zur Gewährleistung der Lateralität
entwickelt hatten, jedoch ist hier die Situation unklar. Eine weitere Konservierung lässt sich
im Ursprung des PNC, der GRP und des KVs erkennen. Diese transienten Strukturen
entwickeln sich im posterioren Bereich des Notochords aus mesodermalen Zellen, die
schon zuvor in der Entwicklung als Zellen des äußeren Zellgewebes einen epithelialen
Charakter aufwiesen (Shook et al., 2004; Blum et al., 2007, 2009; Schweickert et al., 2007;
Oteíza et al., 2008).
Inwieweit die beiden hier beschriebenen Funktionen der FGF-Signalaktivität in anderen
Wirbeltieren konserviert sind, wird im Folgenden diskutiert.
Konservierte und nicht konservierte Funktionen von FGF-Signalaktivität
Wie in Xenopus wird FoxJ1 im Zebrabärbling während den Gastrulastadien in den
Vorläuferzellen des KV, den sogenannten DFCs („dorsal forerunner cells“) exprimiert und
reagiert hierbei sensitiv auf die Inhibition von FGF-Signalaktivität (Abb.28; Aamar and
Dawid, 2008; Neugebauer et al., 2009). Anders als in Xenopus führt die Unterbindung des
FGF-Signalwegs
zu
einem
signifikanten
Anteil
an
Embryonen
mit
bilateraler
Seitenplattenexpression (Neugebauer et al., 2009). Neben dieser bilateralen Induktion
wurde auch eine Invertierung oder der Verlust der asymmetrischen Genexpression in
Bezug zu FGF-abhängigen Ciliendefekten beschrieben (Hong and Dawid, 2009; Liu et al.,
2011). Die unterschiedliche Interpretation des FGF-Signalverlusts zwischen Xenopus und
Zebrabärbling, könnte die Folge der unterschiedlichen Architektur des LR-Organisators
beider Organismen sein. Damit einher geht, dass auch die direkte Inhibition des
Flüssigkeitsstroms via Dnah9-Knockdown in Xenopus und Zebrabärbling in ihrer
Auswirkung auf die asymmetrische Seitenplattenexpression variiert. Im Zebrabärbling ist
hierbei eine Randomisierung asymmetrischer Markergene zu erkennen, während in
Xenopus ein Verlust dieser zu beobachten ist (Essner et al., 2005; Vick et al., 2009).
FGF-Signalaktivität wirkt im Zebrabärbling auf die Expression von Charon (Hong and
Dawid, 2009). Dies bedeutet, dass der FGF-Signalweg wie in Xenopus Einfluss auf die
Spezifizierung der Sensorzellen des LR-Organisators nimmt. Jedoch wurde bisher keine
Funktion des FGF-Signalwegs für die Expression von paranotochordalem Spaw im
75
Diskussion
Abbildung 28: FGF-Signalaktivität in der LR-Achsenentwicklung der Wirbeltiere
Drei zeitlich aufeinanderfolgende Ereignisse der LR-Achsenentwicklung werden von FGF-Signalaktivität
beeinflusst. (1) In Xenopus und Zebrabärbling spielt der FGF-Signalweg eine Rolle in der Spezifizierung des
LR-Organisators, indem er die Expression von FoxJ1 kontrolliert. (2) In Xenopus und in der Maus wirkt sich
der FGF-Signalweg auf die Spezifizierung der Sensorzellen des LR-Organisators aus. Durch frühe Inhibition
des FGF-Signalwegs im Kaninchen konnte die Inhibition der asymmetrischen Seitenplattenexpression
beobachtet werden, möglicherweise als sekundäre Folge des Expressionsverlust der paranotochordalen
Nodal-Domäne. In diesem Fall würde der FGF-Signalweg auch hier Einfluss auf die Spezifizierung der
Sensorzellen nehmen. (3) Während den Stadien des Signaltransfers ist der FGF-Signalweg in Kaninchen
und Huhn essentiell für die Repression der Nodal-Kaskade auf der rechten Seite. Quellen und nähere
Details sind im Text erläutert.
Zebrabärbling beschrieben. Die bilaterale Seitenplattenexpression, welche in Bezug zur
Inhibition des FGF-Signalwegs auf Höhe des Rezeptors im Zebrabärbling auftritt, deutet
indirekt darauf hin, dass grundsätzlich noch ausreichend Spaw im Bereich des KVs
76
Diskussion
exprimiert wird (Neugebauer et al., 2009). Allerdings wurden in diesem Zusammenhang
keine schwerwiegenden Effekte in Bezug zum axialen und paraxialen Mesoderm
beschrieben, wie sie durch Inhibition des dnFGFR1 zuvor dokumentiert wurden (Griffin et
al., 1995, 1998; Neugebauer et al., 2009). Somit könnte die Stärke oder die transiente
Dauer der hier angewendeten Inhibition zwar ausreichend für einen Verlust von FoxJ1Expression sein, nicht aber für einen vollständigen Verlust von paranotochordalem Spaw.
Da durch FGF-Inhibition die Expression von Charon negativ beeinflusst wird, würde in
diesem Fall selbst ein kleiner Rest an paranotochordalem Spaw ausreichen um die
Seitenplattenexpression zu induzieren (Hong and Dawid, 2009). Interessanterweise wurde
erwähnt, dass im Zebrabärbling neben der frühen FGFR-Inhibition im Gastrulastadium, die
zu verkürzten Cilien führt, eine spätere Applikation zu Cilien-unabhängigen LR-Defekten
führt, die bis dato nicht weiter untersucht wurden (Neugebauer et al., 2009). Eine
genauere Analyse von SU5402-Inkubationen ab späten Gastrulastadien könnte im
Zebrabärbling einen Verlust der paranotochordalen Spaw-Domäne aufdecken, womit
diese Funktion des FGF-Signalwegs auch im Zebrabärbling konserviert wäre.
Indirekt lässt sich bereits jetzt eine Funktion von FGF vermuten. So ist der FGF-Signalweg
im Zebrabärbling, wie auch in Xenopus und in der Maus für die Expression des T-Box
Transkriptionsfaktors Brachyury (no tail, ntl im Zebrabärbling) notwendig, und Brachyury
wiederum reguliert im Sinne einer positiven Rückkopplung die Expression von FGF (Griffin
et al., 1995; Schulte-Merker and Smith, 1995; Ciruna and Rossant, 2001). In allen drei
Modellorganismen bewirkt der Verlust von Brachyury eine fehlende oder stark reduzierte
Expression von bilateralem Nodal (King et al., 1998; Amack et al., 2007; Gourronc et al.,
2007; Andre, 2009). Möglicherweise nimmt Brachyury hierbei über FGF Einfluss auf die
Sensorzellen.
Auch in der Lateralitätsentwicklung der Maus wirkt der FGF-Signalweg über die Regulation
der Sensorzellen. So konnten Meyers und Martin (1999) anhand einer hypomorphen Fgf8Mausmutanten zeigen, dass der Funktionsverlust einen Verlust der paranotochordalen
Nodal-Expression nach sich zieht (Abb. 28). Ob dabei der FGF-Signalweg wie in Xenopus
für die Expression von Cerl2 oder die generelle Bildung dieser Sensorzellen benötigt wird,
wurde bis dato noch nicht untersucht. Um aufzuklären, ob die Sensorzellen in der Maus
FGF-abhängig gebildet werden, könnte man dabei durch Immunohistochemie (IHC)
untersuchen. So lassen sich die Cilien der lateralen PNC-Zellen in der Maus von den
medialen Zellen unterscheiden, da sie im Gegensatz zu diesen kein lrd („left-right dynein“)
exprimieren. Im Falle eines Verlusts dieser Sensorzellen in hypomorphen Fgf877
Diskussion
Mausmutanten sollten sich somit keine lrd-negativen Zellen im PNC detektieren lassen.
Zudem sollte eine rasterelektronenmikroskopische Analyse eine Verkleinerung des PNCs
aufdecken.
Die Frage, ob der FGF-Signalweg in der Maus eine frühere Rolle bei der Etablierung der
FoxJ1-Expression spielt, bleibt bisher infolge mangelnder Analyse unbeantwortet. Um
einen möglichen Ciliendefekt nach FGF-Signalverlust aufzudecken, müsste man die
Bildung (z.B. IHC auf das Cilienstrukturprotein Tubulin oder Rasterelektronenmikroskopie)
und Funktionalität (Analyse des Cilienschlages mit einer Hochgeschwindigkeitskamera) in
hypomorphen Fgf8-Mutanten untersuchen. Allerdings ließe sich anhand der hypomorphen
Fgf8-Mauslinie aufgrund des partiellen Funktionsverlustes im Falle einer unbeeinträchtigten Cilienentwicklung ein FGF-abhängiger Einfluss nicht ausschließen. Denkbar
wäre hier, um schwere Entwicklungsstörungen zu umgehen, wie sie bei Fgfr1 als auch bei
Fgf8 Knockout-Mäusen vorkommen, eine konditionelle Mauslinie bei der Fgfr1 von loxPSeiten flankiert wird (Xu et al., 2002) und die Cre-Rekombinase unter Kontrolle eines
Hormon-regulierten Promotors exprimiert wird. Durch zeitspezifische Injektion von
Tamoxifen in schwangere Mäuse könnte eine FGF-abhängige Funktion für die Entstehung
der Lateralität nach den für die Gastrulation kritischen Stadien untersucht werden.
In Xenopus konnte die Unterbindung der FGF-Signalaktivität während der Stadien des
linksgerichteten
Flüssigkeitsstroms
keinen
weiteren
Einfluss
auf
die
Lateralitätsentwicklung belegen. Im Gegenzug dazu wurde in der Maus eine weitere
Funktion in diesem Entwicklungszeitraum beschrieben. So soll es durch FGF-Aktivität zur
Freisetzung von sogenannten NVPs („Nodal vesicular particles“) kommen. Diese sollen
Shh und Retinsäure enthalten und durch den Flüssigkeitsstrom auf die linke Seite
transportiert werden, um in Folge asymmetrisch einen intrazellulären Calciumanstieg auf
der linken Seite zu bewirken. Hierbei wurde publiziert, dass FGF-Signalaktivität sowohl für
die Generierung eines intrazellulären Calciumanstiegs als auch für eine Vesikelfreisetzung
benötigt wird. Allerdings wurde kein funktioneller Effekt auf die Expression der
linksseitigen Nodal-Kaskade gezeigt und ob der FGF-Signalweg über die gewährleistete
Vesikelfreisetzung auf Calcium wirkt (Tanaka et al., 2005). Die NVP-Hypothese, wie sie
hierbei aufgestellt wurde, kann aus folgenden Gründen in Frage gestellt werden: erstens
wurde in der Maus nachgewiesen, dass Retinsäure für die Induktion der asymmetrischen
Seitenplattenexpression nicht notwendig ist und zweitens dass Shh in der Seitenplatte,
78
Diskussion
nicht aber im Bereich des PNCs für die korrekte LR-Achsenentwicklung benötigt wird
(Niederreither et al., 2001; Tsiairis and McMahon, 2009).
In Huhn und Kaninchen soll der FGF-Signalweg reprimierend auf die Expression der
Nodal-Kaskade wirken (Abb. 28). Dabei könnte sich die repressive Funktion von FGF in
Kaninchen und Huhn im Laufe der Evolution als Folge unterschiedlicher Anforderungen
zur Gewährleistung der Repression der asymmetrischen Genexpression im rechten
Seitenplattenmesoderm etabliert haben. Einen Unterschied zwischen Kaninchen und
Huhn im Vergleich zu den Modellorganismen Xenopus, Zebrabärbling und Maus lässt sich
beispielsweise in der Architektur dieser Embryonen erkennen. So entwickeln sich Huhn
und Kaninchen als flache Keimscheibe. Dies hatte möglicherweise einen Einfluss auf die
Generierung unterschiedlicher Transfer- und Repressionsmechanismen.
Allerdings wurden in Kaninchen und Huhn Experimente zum Funktionsgewinn und
Funktionsverlust
auf
kultivierte
Embryonen
durchgeführt.
Die
hier
beschriebene
Anwendung von FGF8-Protein getränkten Kügelchen ist dabei insofern bedenklich, da
Fgf8 endogen nicht in den entsprechenden Bereichen exprimiert wird und hierbei der
Funktionsgewinn von der endogenen Funktion abweichen kann (Boettger et al., 1999;
Rodríguez Esteban et al., 1999; Fischer et al., 2002). Auch für den Funktionsverlust
problematisch ist, dass die extrauterine Entwicklung von Kaninchenembryonen in frühen
Stadien selbst ohne Anwendung von Inhibitoren LR-Achsendefekte induzieren kann
(Fischer et al., 2002; Bitzer, 2008).
Im Kaninchen könnte eine frühere, zweite Funktion von FGF ebenfalls auf die
Sensorzellen des LR-Organisators wirken. Im Rahmen von frühen FunktionsverlustExperimenten ließ sich der Verlust asymmetrischer Markergene in der Seitenplatte
dokumentieren (Abb. 28; Bitzer 2008). Dies könnte wie in Xenopus und Maus im Verlust
der paranotochordalen Nodal-Domäne begründet sein. Auch eine Wirkung von FGF bei
der Regulation von FoxJ1 lässt sich im Kaninchen anhand bisher durchgeführter
Experimente nicht ausschließen, da diese nicht ausreichend früh kultiviert werden können,
um
mittels
systemischen
Inkubationsexperimenten
einen
frühen
Effekt
auf
die
Spezifizierung des LR-Organisators zu erzielen.
Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass die frühe Funktion der FGF-Signalaktivität in
Xenopus der im Zebrabärbling ähnelt, während ein Effekt auf die Sensorzellen des LROrganisators auch bei der Maus detektiert werden kann. Dies könnte bedeuten, dass
79
Diskussion
FGF-Signalaktivität in der LR-Determinierung der Wirbeltiere stärker konserviert ist als
bislang vermutet wurde. Die bisherige Divergenz der beobachteten Phänotypen könnte
somit auf der Art des Signalverlustes und dem Mangel an zeitlicher Auflösung beruhen.
Warum fehlen Sensorzellen der GRP nach FGF-Funktionsverlust?
SU5402-Inkubationen, die in späten Gastrulastadien begonnen wurden, zeigten, dass zu
diesem Zeitpunkt spezifisch die somitischen GRP-Zellen noch sensitiv auf FGFSignalaktivität reagieren. Da der FGF-Signalweg in zelluläre Prozesse wie Apoptose und
Zellproliferation verwickelt ist, wäre der Verlust somitischer GRP-Zellen auf einfache
Weise - entweder durch induzierte Apoptose oder durch verminderte Zellproliferation in
Folge des FGF-Funktionsverlustes - zu erklären gewesen (Böttcher and Niehrs, 2005;
Dorey and Amaya, 2010). Allerdings konnte weder mittels TUNEL-Färbung (Apoptose)
noch durch pH3-Markierung (Zellproliferation) eine entsprechende Auswirkung der FGFRInhibition entdeckt werden.
Als mögliche Ursache eines Fehlens somitischer Zellen im Verbund der GRP zum
Neurulastadium 17/18 sind weitere Möglichkeiten zu betrachten: erstens, die somitischen
GRP-Zellen haben sich zu entodermalen Zellen umspezifiziert, zweitens, die somitischen
Zellen haben ihre epitheliale Anordnung früher verlassen und sind schon in den tiefen
Verbund der Somiten integriert, oder drittens, sind in den epithelialen Bereich der
medialen GRP eingewandert.
1) Umspezifizierung zu entodermalen Zellen
Stubbs und Kollegen konnten 2008 zeigen, dass durch Überexpression von FoxJ1 in den
lateral zur GRP gelegenen Entodermzellen GRP-ähnliche Cilien mit einer vergleichbaren
Länge entstehen. Die Entodermzellen sind somit in der Lage allein durch den Besitz von
Foxj1 GRP-ähnliche Cilien auszubilden. Da die FGFR-Inhibition ab St.11 keine
Auswirkung auf die FoxJ1-Expression hatte, wäre zu erwarten gewesen, dass bei einer
Respezifizierung der somitischen GRP-Zellen zu entodermalen Zellen, diese lange GRPähnliche Cilien ausbilden. Allerdings konnten durch die rasterelektronenmikroskopische
Analyse nur kurze unpolarisierte Cilien, wie sie auch sonst im Entoderm zu beobachten
sind, in den lateral zur GRP gelegenen Zellen detektiert werden (Abb. 12B’’). Jedoch ist
80
Diskussion
nicht vollkommen auszuschließen, dass die Expression von FoxJ1 in den somitischen im
Gegensatz zu den medialen GRP-Zellen auch nach St.11 noch sensitiv auf die FGFInhibition reagiert. Dies würde bedeuten, dass FoxJ1 noch ab St.12/12,5 zu beeinflussen
wäre, da dies der späteste Zeitpunkt war, bei dem durch SU5402 ein signifikanter Verlust
somitischer GRP-Zellen beobachtet werden konnte. Dies kann allerdings in Frage gestellt
werden, da zu diesem Zeitpunkt die endogene FoxJ1-Expression bereits abnimmt.
2) Somitische GRP-Zellen sind schon frühzeitig in den Somitenverbund integriert
Die Analyse des FoxJ1-Zielgens Tekt2 wies korrelierend zur wildtypischen FoxJ1Expression nach SU5402-Inkubation eine vergleichbar starke Expression wie nach
Inkubation in DMSO auf (Abb. 8A; Stubbs et al., 2008). In transversalen Anschnitten auf
Höhe der GRP konnten keine Tekt2-positiven Zellen in dem tiefen Bereich der Somiten
ausgemacht werden (nicht gezeigt). Dies spricht dagegen, dass die somitischen GRPZellen durch FGFR-Inhibition schon frühzeitig in den Verbund der Somiten eingewandert
sind. Allerdings könnten spezifische Genexpressionen der somitischen GRP-Zellen
indirekt durch ihren Ausschluss aus dem Verbund der GRP verloren gegangen sein. Um
eine endgültige Aussage treffen zu können, ob sich diese Zellen nach Inhibition des FGFSignalwegs im tiefen Gewebe befinden, bedarf es dies auf eine andere Weise genauer zu
untersuchen. Ray Keller konnte die Entstehung der GRP aus dem superfiziellen
Mesoderm durch Biotinylierung der Embryonen im Blastulastadium darstellen (Shook et
al., 2004). Auf diese Weise markiert man die gesamte GRP und auch das entodermale
Epithel und damit eignet sich diese Methode nicht um spezifisch den Verbleib der
somitischen GRP nachzuverfolgen. Jedoch markiert man hiermit spezifisch die
superfiziellen, nicht aber die tiefen Mesodermzellen. So sollte der Verlust somitischer
GRP-Zellen infolge einer frühzeitigen Ingression dadurch gezeigt werden können, dass
sich nach Inkubation in SU5402 oder DMSO im Neurulastadium oder auch später
vergleichbar viele Biotin-markierte Zellen in den Somiten wieder finden lassen.
3) Somitische GRP-Zellen sind in den epithelialen Bereich der medialen GRP integriert
Gemäß der späteren Zellschicksale gliedert sich die mesodermale Randzone von
Xenopus entlang der dorsoventralen Achse in verschiedene Bereiche (Dale and Slack,
1987a, 1987b). Während der frühen Gastrulation können die unterschiedlichen Bereiche
anhand von spezifischen Expressionsdomänen definiert werden. Zellen erlangen so
81
Diskussion
aufgrund ihrer Position unterschiedliche Zellschicksale und grenzen sich dort voneinander
ab, wo sich die verschiedenen Zellpopulationen berühren. Differenzielle Zell-Zell-Adhesion
wird hierfür als entscheidender Faktor betrachtet. Die Abgrenzung gewährleistet, dass sich
Zellpopulationen getrennt voneinander entwickeln können (Reintsch et al., 2005). Bei
konvergenten Extensionsbewegungen des axialen (Notochord) und paraxialen (Somiten)
Gewebes interkalieren so einzelne Zellen innerhalb ihrer Zellpopulation, ohne die Grenze
zu den benachbarten Strukturen zu überschreiten. Morphologisch lassen sich somitische
und notochordale Zellen schon ab der mittleren Gastrula unterscheiden (Keller et al.,
1989).
Durch Manipulation von Genexpressionen lässt sich bewirken, dass Zellen ein neues
Zellschicksal annehmen und Zellgrenzen überschreiten. Beispielsweise integrieren
notochordale Zellen, die nach Einsetzen der Midblastula-Transition ß-Catenin ektopisch
überexprimieren, in die Somiten. Die somitische Zellen dagegen finden sich durch die
Inhibition von ß-Catenin im Notochord wieder (Reintsch et al., 2005). Eine Integration
dieser Zellen lässt sich selbst noch in späten Gastrulastadien beobachten, also zu dem
Zeitpunkt, in dem mittels Inkubation in SU5402 ein spezifischer Verlust der somitischen
GRP-Zellen bewirkt werden konnte.
Neben ß-Catenin sind in Bezug zur Gewebetrennung des Notochords und der Somiten die
Protocadherine PAPC (paraxiales Protocadherin) und AXPC (axiales Protocadherin) in der
homophilen Zell-Zell Aggregation und in der Zellsortierung involviert. PAPC wird zum Ende
der Gastrulation vom somitischen Mesoderm exprimiert, während AXPC im Notochord
exprimiert wird (Kim et al., 1998; Kuroda et al., 2002). Somitische Zellen benötigen somit
die Expression von PAPC für die Zelladhesion mit anderen PAPC-exprimierenden Zellen,
wobei die Transkription von PAPC abhängig vom FGF-Signalweg ist (Kim et al., 1998;
Branney et al., 2009). Der Verlust an FGF-Signalaktivität in späten Gastrulastadien könnte
sich
so
spezifisch
auf
die
Identität
der
somitischen
GRP-Zellen
und
ihre
Adhesionseigenschaften ausgewirkt haben und ihre Integration in den medialen Bereich
der GRP bewirkt haben. Dass in diesem Zusammenhang die Inhibition des FGFSignalwegs zu keiner auffallenden Verbreiterung des medialen Anteils der GRP führte,
könnte dabei Folge der konvergenten Extensionsbewegungen sein.
Um zu untersuchen, ob sich somitische GRP-Zellen nach Inhibition der FGF-Signalaktivität
im medialen Bereich der GRP eingegliedert haben, könnte man lacZ als Reportergen
unter die Kontrolle eines schon zu Beginn der Inkubation (Ende Gastrula) spezifisch in den
82
Diskussion
Somiten nicht aber im Notochord exprimierten Gens (z.B. PAPC) setzen. Auch wenn sich
durch eine Umspezifizierung der Zellen das Expressionsprofil ändert, sollte durch den
späten Beginn der SU5402-Inkubation bereits lacZ exprimiert worden sein. Die Analyse
der ß-Galactosidase-Aktivität könnte dann zeigen, ob sich somitische Zellen im medialen
Bereich der GRP wiederfinden lassen.
Welche
FGF-vermittelten
Signaltransduktionen
wirken
auf
die
Lateralitäts-
entwicklung?
Die
zwei
Funktionen,
die
der
FGF-Signalweg
zu
den
unterschiedlichen
Entwicklungszeitpunkten in der LR-Achsenentwicklung von Xenopus spielt, könnten
hierbei von verschiedenen Signaltransduktionswegen abhängen. Da die Spezifizierung
des superfiziellen Mesoderms in späten Blastula-/frühen Gastrulastadien von der FGFSignalaktivität abhängig ist, könnte hier der MAPKinase-Signalweg entscheidend sein.
Abbildung 29: Modell: LR-spezifische Funktionen der FGF-Signalaktivität werden über
unterschiedliche Signaltransduktionswege reguliert
Da der FGF-Signalweg in späten Blastula-/frühen Gastrulastadien über MAPKinase eine Rolle in der
Spezifizierung des Mesoderms spielt, wird die FGF-abhängige Spezifizierung des superfiziellen Mesoderms
möglicherweise ebenfalls über den MAPK-Signalweg gesteuert. Gegen Ende der Gastrulastadien soll es zu
einem Wechsel von der MAPK- zur
PLC/PKC/Calcium-vermittelten Signaltransduktion kommen.
Konvergente Extensionsbewegungen hängen dabei von intrazellulären Cacliumkonzentrationen ab. Auch die
Spezifizierung der Sensorzellen in den späten Gastrulastadien wird FGF-abhängig über Calcium reguliert.
Dagegen wirkt der FGF-Signalweg in späten Gastrulastadien spezifisch in der LRAchsenentwicklung, indem er die Bildung der Sensorzellen kontrolliert. Die zweite
83
Diskussion
Funktion fällt somit in das Zeitfenster, in dem ein Wechsel von der MAPK- zur
PLC/PKC/Calcium-vermittelten Signaltransduktion stattfinden soll (Abb. 29; Sivak et al.,
2005).
PLC/PKC/Calcium-unabhängige Signaltransduktion wirkt auf FoxJ1
Mittels Inhibitionsexperimenten ließ sich zeigen, dass der FGF-Signalweg in frühen
Gastrulastadien für die Expression von FoxJ1 im superfiziellen Mesoderm essentiell ist
(Abb. 7A). Da der FGF-Signalweg zu diesem Entwicklungszeitpunkt über die MAPK auf
die Embryogenese von Xenopus wirkt, lässt sich indirekt mutmaßen, dass auch die FoxJ1Expression von der Aktivierung der MAPK-Signaltransduktion abhängt. Im Einklang damit
hatte die Überexpression von Spry1 und somit die Inhibition des PLC/PKC/CalciumSignalwegs keinen Einfluß auf die Expression von FoxJ1 (Abb. 19A).
Im Gegensatz zu SU5402, welches jegliche Signaltransduktion nachgeschaltet zum FGFRezeptor unterbindet, lässt sich durch MEK-Inhibitoren wie U0126 spezifisch der MAPKSignalweg inhibieren (Sivak et al., 2005). Um weiterführend zu untersuchen, ob die
Expression von FoxJ1 über die MAPK-vermittelte Signaltransduktion abhängig vom FGFSignalweg ist, müsste man spezifisch diesen Signalzweig inhibieren. Die Anwendung von
U0126 in frühen Gastrulastadien könnte hierbei genutzt werden und sollte im Falle einer
MAPK-abhängigen Induktion von FoxJ1 zu dessen Expressionsverlust führen.
MAPK-unabhängige Signaltransduktion wirkt auf die Sensorzellen der GRP
Durch die Unterbindung der Rezeptor-vermittelten FGF-Signaltransduktion in späten
Gastulastadien konnten Defekte bei der Mesodermspezifizierung der Randzone
umgangen werden. Nichtsdestotrotz spielt FGF-Signalaktivität eine Rolle in der weiteren
Spezifizierung und Aufrechterhaltung mesodermaler Genexpressionen. So hatte die
Inhibition
eine
leichte
Abschwächung
mesodermaler
Gene
(Xbra,
MyoD)
im
Neurulastadium zur Folge. Dabei war hauptsächlich das posterior zur GRP gelegene
Mesoderm betroffen, während das entlang der AP-Achse auf Höhe der GRP gelegene
Mesoderm Expression von MyoD (Somiten) und Xbra (Notochord) aufwies. Bei MyoD
konnte auch eine Reduktion der lateralen Ausbreitung beobachtet werden. Embryonen,
84
Diskussion
deren FGF-Signaltransduktion zeitlich etwas später, beginnend ab St.12,5-13 inhibiert
wurde, wiesen dieselbe Reduktion dieser mesodermalen Genexpressionen auf, ohne
jedoch unter LR-Achsendefekte zu leiden (Abb. 4B, Abb. 15A). Dies spricht dafür, dass
die Abschwächung mesodermaler Gene infolge der FGFR-Inhibition nicht kausal mit
Störungen der Lateralitätsentwicklung zusammenhängt und dass der Verlust somitischer
Zellen unabhängig von der MAPK-abhängigen Mesodermspezifizierung stattfindet.
Der Verlust somitischer GRP-Zellen durch die Überexpression von Spry1 unterstützte,
dass die späte Funktion des FGF-Signalwegs unabhängig von der MAPK auf die Bildung
der Sensorzellen wirkt. Jedoch konnte in dieser Arbeit ein leicht negativer Effekt von Spry1
auf die Mesoderminduktion festgestellt werden. Die Reduktion fiel allerdings relativ mild
aus und war nur in Gastrulastadien auszumachen, also zu einem Zeitpunkt, indem die
späten SU5402-Inkubationen noch nicht begonnen worden waren. In späteren Stadien
hatte sich die Expression mesodermaler Marker auf ein wildtypisches Maß erholt. Zudem
wurde die Reduktion von MyoD in Gastrulastadien in allen injizierten Embryonen
beobachtet, während die Reduktion von XnrI oder Coco höchstens 60% der Embryonen
betraf. Dies spricht dafür, dass Sprouty1 unabhängig vom MAPK-Signalweg Einfluss auf
die somitischen GRP-Zellen nimmt.
FGF-Signalaktivität wirkt über Calcium auf die Sensorzellen der GRP
Der Verlust somitischer GRP-Zellen nach Überexpression von Spry1 legt nahe, dass
nachgeschaltet zur Aktivierung des FGF-Rezeptors der PLC/PKC/Calcium-Signalweg
Einfluss auf die Bildung der Sensorzellen des LR-Organisators nimmt. Dass hierbei
insbesondere die intrazelluläre Freisetzung von Calcium von Bedeutung ist, lässt sich aus
Funktionsverlustexperimenten von Pkd2 herleiten. So hatte der Knockdown von Pkd2
neben dem bereits beschriebenen Verlust der paranotochordalen Xnr1-Domäne den
generellen Verlust der somitischen GRP-Zellen zur Folge (Abb. 23; Vick, 2009). EpistasisExperimente von Pkd2-MO und Spry1-mRNA und Rescue-Experimente von Spry1-mRNA
mit Pkd2-mRNA unterstützen dabei, dass Sprouty1 über die Inhibition von Calcium FGFabhängig auf die Sensorzellen der GRP Einfluss nimmt.
Im Gegensatz zur Überexpression von Spry1, die einen spezifischen Effekt auf die
Sensorzellen ausübte, hat der Funktionsverlust von Pkd2 Auswirkungen auf die
85
Diskussion
Spezifizierung des gesamten superfiziellen Mesoderms. Die Injektion von Pkd2-MO wirkt
hier negativ auf die Expression von FoxJ1 und seinen Zielgene (Vick, 2009; Grüdl, 2012).
Übereinstimmend dazu konnte auf rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen, die im
Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden, beobachtet werden, dass im Gegensatz zu
SU5402, dnFgfr1 oder Spry1 nach Pkd2-MO auch teilweise die medialen Zellen der GRP
kein langes Monocilium aufwiesen (nicht gezeigt). Aufgrund der gezielten Injektion in den
lateralen Teil der GRP war dieser Effekt nur leicht zu beobachten.
Der generell schwere Phänotyp des Pkd2-Funktionsverlusts korreliert damit, dass Calcium
in der frühen Entwicklung in mehr Prozessen als nur in der Bildung somitischer GRPZellen beteiligt ist. Calcium-Wellen, welche in den Blastula- und Gastrulastadien von
Xenopus- und Zebrabärbling-Embryonen auftreten, wirken in vielen musterbildenden
Prozessen
mit
(Webb
and
Miller,
2006).
Im
Zebrabärbling
sind
dynamische
Calciumanstiege während der Gastrulastadien essentiell für die Bildung des KV und in
Xenopus wird neben Pkd2 der Serotoninrezeptor 5HTR3c, der unter anderem einen
Calcium durchlässigen Ionenkanal bildet, für die korrekte Spezifizierung des superfiziellen
Mesoderms benötigt (Schneider et al., 2008; Vick, 2009; Oteiza et al., 2010; Beyer et al.,
2012).
Der Pkd2-Funktionsverlust inhibiert intrazelluläre Calciumanstiege auf einer anderen
Ebene als Sprouty1. Neben den Cilien lokalisiert PC2 größtenteils im ER als Calciumaktivierter Calcium-Kanal, der durch Interaktion mit dem IP3-Rezeptor den intrazellulären
Calciumanstieg unabhängig vom FGF-Signalweg moduliert (Li et al., 2005; Qian and
Noben-Trauth, 2005; Mekahli et al., 2012). Sprouty-Proteine wirken dagegen negativ auf
die Calcium-regulierende Signaltransduktion des FGF-Signalwegs, indem sie PLCγ und
somit die Umsetzung von PIP zu DAG und IP3 inhibieren (Akbulut et al., 2010). Generell
können also Calciumanstiege trotz Überexpression von Spry1 stattfinden. Da SproutyProteine endogen während der Gastrulation im Mesoderm exprimiert und erst zu Ende der
Gastrulation
herabreguliert
werden,
sollten
theoretisch
keine
FGF-induzierten
Calciumanstiege während der frühen Entwicklung erfolgen. Durch die zeitlich begrenzte
Inhibition via SU5402 konnte gezeigt werden, dass der FGF-Signalweg in späten
Gastrulastadien auf die Bildung der somitischen GRP-Zellen wirkt. Die Überexpression
von Spry1 könnte so ektopisch in einem Zeitfenster am Ende der Gastrulation inhibierend
86
Diskussion
auf Calcium wirken. Im Gegensatz zu frühen Calcium-abhängigen Prozessen reagieren
die Sensorzellen auf diese Weise sensitiv auf die FGF-vermittelte Regulation von Calcium.
Dass Calcium am Ende der Gastrulation auf die Sensorzellen der GRP wirkt, wurde durch
die Anwendung eines Inhibitors (Thapsigargin), der die intrazellulären Calciumspeicher
des Endoplasmatischen Retikulums dezimiert, bestärkt (Abb. 26; Treiman et al., 1998).
Durch Funktionsverlustexperimente des Liganden Wnt11b, der unter anderem den
nichtkanonischen Wnt/Calcium-Signalweg aktiviert, konnte ebenfalls ein Effekt auf die
Sensorzellen beobachtet werden (Abb. 27; Kühl, 2004; Walentek et al., 2013). Dass der
Knockdown von Wnt11b zum Verlust der bilateralen Nodal- und Coco-Expression führte
und epistatisch mit Spry1 wirkte, unterstützt die Hypothese, dass dieser Ligand über den
Wnt/Calcium-Signalweg auf die Sensorzellen Einfluss nimmt.
FGF-Signalaktivität könnte über den kanonischen Wnt-Signalweg auf FoxJ1 wirken
In Xenopus und im Zebrabärbling konnte gezeigt werden, dass die Expression von FoxJ1
abhängig vom kanonischen Wnt-Signalweg ist (Beyer, Danilchik, et al., 2012; Caron et al.,
2012). Da der kanonische Wnt-Signalweg essentiell für die zygotische Induktion der
Organisatorgene und somit für die Spezifizierung der dorsalen Seite ist, scheint er ein
geeigneter Faktor für die Spezifizierung des superfiziellen Mesoderms zu sein (Heasman,
2006). Im Folgenden soll diskutiert werden, wie der FGF-Signalweg auf die Expression
von FoxJ1 Einfluss nehmen könnte. Hierzu wird ein Modell vorgeschlagen, wie FoxJ1Expression über den kanonischen Wnt-Signalweg gewährleistet und dabei auf den
dorsalen Bereich beschränkt wird und wie der FGF-Signalweg darin integriert werden
könnte (Abb. 30).
ß-Catenin lässt sich, abhängig von maternalen Faktoren und der kortikalen Rotation, vor
Beginn
der
Midblastula-Transition
ausschließlich
auf
der
dorsalen
Seite
der
Blastulastadien 8-8,5 kernlokalisiert detektieren (Schohl and Fagotto, 2002). Von St.8,5 an
findet sich ß-Catenin jedoch zunehmend auch im ventralen und lateralen Bereich der
zukünftigen mesodermalen Randzone, was ebenfalls durch maternale Faktoren vermittelt
wird (Schohl and Fagotto, 2003). Dass die Induktion von Organisatorgenen dennoch
ausschließlich auf der dorsalen Seite stattfindet, wird hier durch den zeitlichen Aspekt der
Signalintensität erklärt. Nukleäres ß-Catenin reichert sich zuerst auf der dorsalen Seite an,
87
Diskussion
Abbildung 30: Modell der Wirkung von FGF-Signalaktivität auf die Expression von FoxJ1
Der kanonische Wnt-Signalweg (kernlokalisiertes ß-Catenin) induziert FGF-abhängig die Expression von
FoxJ1. Der BMP-Signalweg reprimiert den kanonischen Wnt-Signalweg im ventrolateralen Bereich, während
der kanonische Wnt-Signalweg im tiefen Mesoderm von PAPC antagonisiert wird. Serotonin ist stark in der
superfiziellen Schicht der animalen Kappe angereicht und wirkt positiv auf den kanonischen Wnt-Signalweg,
sodass FoxJ1 auf der dorsalen Seite im superfiziellen Mesoderm exprimiert wird. Der FGF-Funktionsverlust
wirkt sich negativ auf den kanonischen Wnt-Signalweg aus und die Expression von FoxJ1 geht verloren.
Durch FGF-Funktionsvgewinn wird der kanonische Wnt-Signalweg verstärkt, sodass ektopisch FoxJ1
induziert wird. Ektopische FoxJ1-Expression tritt dabei ventral nur in dem Bereich auf wo auch Serotonin den
kanonischen Wnt-Signalweg ausreichend verstärkt. Auf der dorsalen Seite ist die FGF-induzierte
Verstärkung des kanonischen Wnt-Signalwegs ausreichend, um die FoxJ1-Expression ins tiefe Gewebe des
Mesoderms auszuweiten.
wodurch es schnell einen hohen Pegel erreicht, welcher für die Induktion der
Organisatorgene benötigt wird. Ventral wird dieser Pegel erst später (ab St.8,5
88
Diskussion
zunehmend) erreicht, zu einem Zeitpunkt, in dem er nicht mehr ausreichend für die
Induktion der Organisatorgene ist (Schohl and Fagotto, 2003). Die Einschränkung von
Organisatorgenen auf das dorsale Mesoderm wird zudem durch den zygotisch aktivierten
BMP-Signalweg gewährleistet, der ab Beginn der Midblastula-Transition im ventrolateralen
Bereich aktiv ist und repressiv auf organisatorspezifische Genexpressionen wirkt (Marom
et al., 2005). BMP-Signalaktivität könnte so auch repressiv auf die Wnt-abhängige
Spezifizierung des superfiziellen Mesoderms und die Expression von FoxJ1 wirken
(Abb. 30). Im Rahmen einer Doktorarbeit unseres Labors konnte nach Anwendung von
Cycloheximide, einem Inhibitor der Proteinsynthese, eine ektopische Expression von
FoxJ1 in der ventralen Randzone beobachtet werden (Beyer, 2011). Dies deutet darauf
hin, dass FoxJ1 durch die Aktivierung zygotischer Genaktivität (z.B. BMP) auf den
dorsalen Bereich beschränkt wird. Wenn FoxJ1 in Xenopus , wie im Zebrabärbling gezeigt,
direkt durch ß-Catenin induziert wird, dann liefert die von maternalen Faktoren
gewährleistete Anreicherung von ß-Catenin in der ventrolateralen Mesodermzone eine
Erklärung weshalb durch Cycloheximide FoxJ1 ektopisch induziert werden kann (Caron et
al., 2012). Während die Cycloheximide-Experimente eine Rolle des maternalen WntSignalwegs in der Induktion von FoxJ1 implizieren, konnte zudem gezeigt werden, dass
auch zygotische Wnt-Aktivität die Expression von FoxJ1 kontrolliert (Walentek et al.,
2012).
Serotonin als Kompentenzfaktor des kanonischen Wnt-Signalwegs findet sich stark
angereichert im superfiziellen Epithel der animalen Hemisphäre und beschränkt so die
Spezifizierung des superfiziellen Mesoderms auf die epitheliale Schicht. Der Verlust von
FoxJ1-Expression nach Knockdown des Serotonin-Rezeptors 3 lässt sich durch
Überexpression von Xdsh und ß-Catenin retten (Beyer et al., 2012). Dass hierbei die
Induktion von FoxJ1 trotz des Funktionverlustes von Serotonin ausschließlich in der
epithelialen Schicht stattfindet, lässt sich möglicherwiese durch PAPC erklären. PAPC wird
im tiefen Gewebe der mesodermalen Randzone exprimiert und inhibiert hier durch
Interaktion mit Casein Kinase 2 beta den kanonischen Wnt-Signalweg in diesem Bereich
(Kietzmann et al., 2012). Somit stellt dieses Protocadherin neben Serotonin einen weiteren
Faktor dar, der die Einschränkung der Spezifizierung des superfiziellen Mesoderms und
somit der Expression von FoxJ1 auf die epitheliale Schicht gewährleisten könnte
(Abb. 30).
89
Diskussion
In vielen Prozessen wirkt der Wnt-Signalweg im Zusammenspiel mit dem FGF-Signalweg
(Pownall and Isaacs, 2010). Beispielsweise lässt sich die Repression die Groucho auf den
kanonischen Wnt-Signalweg ausübt durch MAPK-vermittelte Phosphorylierung verhindern
(Burks et al., 2009). Der FGF-Signalweg könnte somit als Kompetenzfaktor des WntSignalwegs dienen, sodass seine Inhibition den Verlust von FoxJ1-Expression nach sich
zieht (Abb.30). Im Einklang mit dem FoxJ1-Phänotyp nach FGF-Funktionsverlust, führte
der Funktionsgewinn mittels Injektion von DNA des Liganden Fgf8b zu einer ektopischen
Induktion von FoxJ1. FGF könnte hierbei über die Verstärkung des Wnt-Signalwegs FoxJ1
induzieren. Bei ventraler Injektion wurde diese ektopische Expression ausschließlich im
superfiziellen Mesoderm der ventralen Seite beobachtet, also in dem Bereich in welchem
die ektopische FGF-Aktivierung nach Einsetzen der Midblastula-Transition auf Serotonin
und kernlokalisiertes ß-Catenin trifft. Die FGF-vermittelte Verstärkung könnte hierbei nur
im Serotonin-positiven Bereich ausreichend stattfinden, während der FGF-Signalweg nicht
in der Lage wäre die repressiven Faktoren der ventralen Zone (z.B. BMP) im tiefen
Gewebe zu überwinden (Abb. 30).
Im Gegensatz zur ventralen wurde durch die dorsale Überexpression von Fgf8b die
Expression von FoxJ1 auch in den tiefen Zellschichten ektopisch induziert. Einerseits
könnte die FGF-Signalaktivität hier über eine direkte Verstärkung des kanonischen WntSignalwegs
die
Überwindung
der
repressiven
PAPC-Eigenschaften
vermitteln.
Andererseits könnte man auch vermuten, dass der FGF-Signalweg über die Inhibition von
PAPC positiv auf den kanonischen Wnt-Signalweg wirkt. Diese Hypothese beruht auf der
Beobachtung, dass sich FoxJ1 ebenfalls durch Überexpression von Spry1 ektopisch in der
tiefen Schicht des dorsalen Mesoderms induzieren lässt (eigene Beobachtung). Endogen
wird Sprouty1 von PAPC gebunden und inhibiert (Wang et al., 2008). Wäre Sprouty1
umgekehrt auch in der Lage durch Bindung an PAPC dessen antagonistische Aktivitäten
auf den kanonischen Wnt-Signalweg zu unterbinden, könnte dies die ektopische Induktion
von FoxJ1 nach Überexpression von Spry1 erklären. Da Spry1 selber durch den FGFSignalweg induziert wird, kann diese Hypothese eine Erklärung liefern, wie durch den
FGF-Funktionsgewinn FoxJ1 im tiefen Gewebe induziert werden könnte.
Andererseits lässt sich bisher nicht ausschließen, dass kernlokalisiertes ß-Catenin in
Xenopus über die Aktivierung des FGF-Signalwegs auf FoxJ1 wirkt. So induziert ßCatenin im mesodermalen Ring die Induktion von FGF3 und trägt so zur Aktivierung des
FGF-abhängigen MAPK-Signalwegs und der Spezifizierung des Mesoderms bei (Schohl
and Fagotto, 2003). Letztere Möglichkeit scheint aus folgenden Gründen nicht
90
Diskussion
wahrscheinlich: Anders als maternale Wnt-Aktivität ist der FGF-Signalweg vor Einsetzen
der Midblastula-Transition nur in geringem Ausmaß aktiv und während der Wnt-Signalweg
früh ausschließlich die Spezifizierung der dorsalen Seite gewährleistet, wirkt der FGFSignalweg auf die Spezifizierung der gesamten mesodermalen Randzone. Weiterhin
würde sich damit nicht erklären lassen, wie durch die Anwendung von Cycloheximide die
ektopische Induktion von FoxJ1 bewirkt werden kann. FGF als permissiver und
verstärkender Faktor des Wnt-Signalwegs könnte dagegen gewährleisten, dass ß-Catenin
nach Einsetzen der Midblastula-Transition ausreichend stark agieren kann, während es
durch die Inhibition von FGF nur vermindert wirkt. In diesem Falle sollte die durch die
FGFR-Inhibition
hervorgerufene
Reduktion
von
FoxJ1
durch
eine
zusätzliche
Überexpression der Wnt-Signalkomponenten dvl2 oder ß-Catenin überwunden werden.
Würde jedoch der FGF-Signalweg nachgeschaltet zum Wnt-Signalweg wirken, so sollte
die Überexpression von Wnt-Signalkomponenten nicht in der Lage sein, die Inhibition von
FGF auf Höhe des Rezeptors zu unterbinden.
Zu bedenken bleibt, dass der frühe Verlust von Rezeptor-vermittelter FGF-Signalaktivität
starke Auswirkungen auf die generelle Mesodermentwicklung ausübt. Dieser Effekt lässt
sich zeitlich nicht von der Spezifizierung des superfiziellen Mesoderms trennen. Trotz der
entscheidenden Rolle des FGF-Signalwegs als Regulator des Mesoderms, kann der
Ciliendefekt, der sich durch Inhibition dieses Signalwegs im Zebrabärbling ergibt, durch die
Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs gerettet werden (Griffin et al., 1995; Caron
et al., 2012). Dass der kanonische Wnt-Signalweg hierbei den durch FGFR-Inhibition
verursachten Ciliendefekt retten kann zeigt, dass die Mesodermspezifizierung dennoch
ausreichend stattgefunden hat. Weiterhin könnte FGF auch über die Regulation von Xbra
wirken. So gehen Lateralitätsdefekte infolge des Funktionsverlustes von Brachyury in
Maus und Xenopus mit Ciliendefekten und einer gestörten Morphologie des LROrganisators einher (Andre, 2009).
Modell des Zusammenspiels von Calcium mit anderen Signalwegen in der
Spezifizierung der Sensorzellen des LR-Organisators
In der Literatur sind mehrere Signalwege beschrieben worden, die an der Regulation der
Sensorzellen mitwirken. In Abb. 31 ist ein Modell dargestellt, das über verschiedene
91
Diskussion
Möglichkeiten der Wirkung von Calcium auf die Sensorzellen spekuliert und Erkenntnisse
aus anderen Signalwegen integriert.
Der FGF-Signalweg induziert die Freisetzung von intrazellulärem Calcium über die
Aktivierung der PLC. Calcium wiederum aktiviert die PKC und könnte hierüber die
Morphogenese der Zellen beeinflussen (Slusarski and Pelegri, 2007). So ist die PKC unter
anderem in der Abgrenzung von unterschiedlichen Gewebedomänen involviert und
reguliert über cdc42 die Adhesion von Zellen (Winklbauer et al., 2001; Choi and Han,
2002; Webb and Miller, 2006). Wenn der FGF-Signalweg über Calcium auf die
Adhesionseigenschaften der somitischen GRP-Zellen Einfluss nimmt, könnte dies
beispielsweise bewirken, dass diese nicht in den medialen Bereich der GRP oder nicht
frühzeitig in den Somitenverbund integriert werden. Zudem sind intrazelluläre CalciumWellen mit der Generierung von Zellpolarität verknüpft und werden für koordinierte
Zellbewegungen
benötigt
(Shindo
et
al.,
2010).
Der
Verlust
der
spezifischen
Genexpression der Sensorzellen (Nodal/Coco/Derrière) nach Inhibition des FGFSignalwegs könnte indirekt die Folge der Calcium-abhängigen Aufrechterhaltung von
somitischen Zellen im Epithel der GRP sein. Allerdings könnte Calcium auch unabhängig
von der Morphogenese dieser Zellen eine zusätzliche Funktion in der Regulation von
Gentranskription ausüben.
Ein
Signalweg,
dem
eine
direkte
transkriptionelle
Kontrolle
der
Sensorzellen
nachgewiesen werden konnte, stellt der Notch-Signalweg dar (Abb. 31). In der Maus
reguliert der Notch-Signalweg nachgeschaltet zu FGF die Induktion der paranotochordalen
Nodal-Domäne (Krebs et al., 2003; Przemeck, 2003; Raya et al., 2003; Oki et al., 2010).
Die Enhancer-Region, über die spezifisch bilaterales Nodal (NDE-Enhancer) induziert
wird, weist zwei funktionelle CSL Bindestellen auf. CSL Proteine agieren als Mediatoren
des Notch-Signalwegs. Durch Aktivierung des Notch-Signalwegs translokalisiert die
intrazelluläre Domäne des Notch-Rezeptors („Notch intracellular domain“; NICD) in den
Zellkern und induziert im Zusammenspiel mit CSL die Gentranskription. Dll1 KnockoutMäusen
und
Notch1/2
homozygoten
doppelmutanten
Mäusen
fehlt
somit
die
paranotochordale und asymmetrische Nodal-Expression (Krebs et al., 2003; Raya et al.,
2003). Auch in Xenopus und Zebrabärbling spielt der Notch-Signalweg eine Rolle. Sowohl
der Rezeptor Notch, als auch sein Ligand Delta, weisen hierfür ebenso wie in der Maus
eine entsprechende Expression im Bereich der GRP und des KVs auf (Niikura et al., 2006;
Sakano et al., 2010). Im Einklang damit führt in Xenopus der Funktionsverlust von Notch
92
Diskussion
mittels
Morpholino-Oligonukleotid
Knockdown
zum
Verlust
der
bilateralen
und
asymmetrischen Nodal-Domäne (Sakano et al., 2010). Im Zebrabärbling lassen
Funktionsgewinn und -verlust indirekt auf eine Rolle des Notch-Signalwegs in der
Regulation der paranotochordalen Nodal-Domäne schließen. So kommt es durch
Überexpression von NICD oder DeltaD (Funktionsgewinn) zur bilateralen Expression von
Seitenplattengenen, während die Inkubation in DAPT oder der Knockdown von Smarcd3
Abbildung 31: Modell des Zusammenspiels von Calcium mit anderen Signalwegen in der
Spezifizierung der Sensorzellen
Durch Interaktion des Notch Rezeptors (Sensorzelle) mit seinem Liganden Dll1, der auf der benachbarten
Zelle lokalisiert (paraxiale Mesodermzelle) wird der Notchsignalweg aktiviert. Die intrazelluläre Domäne von
Notch (NICD) wird abgespalten, wandert in den Zellkern und aktiviert über CSL die Transkription
sensorspezifischer Genexpressionen (Nodal/Coco). Zic3 beeinflusst hierbei auf unbekannte Weise die
Notch-vermittelte Geninduktionen und wird selber von Brachyury in einer FGF/Calcium-abhängigen Weise
induziert. Nachgeschaltet zur FGF-Rezeptoraktivierung wird über den MAPK-Signalzweig MyoD-Expression
reguliert. MyoD wiederum induziert die Expression von Dll1, wobei das Calcium-bindende Protein
Calmodulin in der MyoD-vermittelten Genkontrolle permessiv wirkt. In diesem Modell wirkt intrazelluläres
Calcium FGF-abhängig über Dll1 und Zic3 auf die Genexpression der Sensorzellen. Zudem aktiviert Calcium
PKC und nimmt darüber Einfluss auf die Morphogenese dieser Zellen.
93
Diskussion
(codiert für Baf60c: positiver Regulator des Notch-Signalwegs: Funktionsverlust) einen
Verlust der asymmetrischen Seitenplattengene nach sich zieht (Raya et al., 2003;
Kawakami et al., 2005; Niikura et al., 2006; Takeuchi et al., 2007).
Calcium könnte hierbei Einfluss auf den Notch-Signalweg nehmen, indem es die
Transkription des Liganden Dll1 in den benachbarten paraxialen Zellen kontrolliert. In
Xenopus wirkt der FGF-Signalweg über MyoD auf die Expression von Dll1 (Wittenberger
et al., 1999; Fisher et al., 2002; Fletcher and Harland, 2008). In vorläufigen Experimenten,
die innerhalb dieser Arbeit durchgeführt wurden, konnte durch den MorpholinoOligonukleotid Knockdown von MyoD der Verlust der Nodal- und Coco-Expression erzielt
werden (nicht gezeigt). Der FGF-abhängige Calcium-Signalweg könnte hierbei über
Calmodulin permessiv auf die MyoD-induzierte Expression von Dll1 wirken (Abb. 31).
Beispielsweise ermöglicht in Fibroblasten Calcium-sensitives Calmodulin die MyoDvermittelte Gentranskription und somit die Differenzierung zu Myoblasten (Hauser et al.,
2008). Zudem würde in diesem Kontext auch die MAPK-vermittelte Signaltransduktion des
FGF-Signalwegs über die Expressionskontrolle von MyoD eine Rolle spielen (Abb. 31).
In der Maus wird die Transkription von Dll1 durch den Transkriptionsfaktor Tbx6
angeschaltet, sodass die Inhibition von FGF-Signalaktivität einhergehend mit dem Verlust
von bilateralem Nodal den Verlust von Tbx6 und Dll1 aufweist (White and Chapman, 2005;
Oki et al., 2010). Das zu Tbx6 der Maus homologe Gen spadetail wird im Zebrabärbling
ebenfalls vom FGF-Signalweg induziert und für die Expression der paranotochordalen
Nodal-Expression benötigt (Griffin et al., 1998; Amack et al., 2007; Gourronc et al., 2007).
In Xenopus lässt sich eindeutig erkennen, dass Nodal- und Coco- dasselbe
Expressionsmuster in den somitischen Sensorzellen der GRP aufweisen (Schweickert et
al., 2010). Hierbei würde sich das gleiche Expressionmuster leicht durch eine gemeinsame
Genkontrolle beider Gene verwirklichen lassen. Wenn hierbei Calcium über den NotchSignalweg auf die Genexpression wirkt, so bedeutet dies, dass der Notch-Signalweg
generell die spezifische Genexpression der Sensorzellen kontrolliert. Dies lässt sich mit
Experimenten aus der Maus vereinbaren, wo die Applikation von DAPT sowohl den
Verlust der paranotochordalen Nodal als auch Cerl2-Expression verhindert. Hiervon sind
auch andere Gene wie GDF1, die in derselben Domäne exprimiert werden, betroffen
(Kitajima et al., 2013). Allerdings führt kontrovers dazu der Knockdown von Smarcd3 zu
einem Verlust von bilateralem Nodal, ohne Cerl-2 und GDF1 zu beeinträchtigen (Takeuchi
94
Diskussion
et al., 2007). Auch im Zebrabärbling gibt es widersprüchliche Beschreibungen der
Funktion des Notch-Signalwegs. Zum einen führt die Inhibition mittels DAPT zu einem
Verlust von Nodal-Expression, während in einer anderen Publikation DAPT den Verlust
von Charon, nicht aber von Nodal, zur Folge hat (Kawakami et al., 2005; Gourronc et al.,
2007). Die genaue Funktion des Notch-Signalwegs in der Regulation der Sensorzellen
bleibt damit noch offen.
Denkbar ist auch, dass Calcium über den Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Zic3, der zur GliSuperfamilie zählt, auf die Gentranskription der Sensorzellen wirkt (Abb. 31). In Xenopus
wird Zic3 im Mesoderm und Neuroektoderm exprimiert und ist abhängig von FGFRezeptoraktivität und intrazellulären Calciumanstiegen (Kitaguchi et al., 2000; Leclerc et
al., 2003; Marchal et al., 2009). Die Transkription von Zic3 im Mesoderm von Xenopus
findet während der Gastrulastadien statt. Dies deutet an, dass Zic3 bei einer Funktion in
der Spezifizierung des LR-Organisators schon früh in den Vorläuferzellen wirkt. Eine
Funktion von Zic3 in der LR-Achsenentwicklung von Xenopus konnte nachgewiesen
werden (Kitaguchi et al., 2000). Der Knockdown von Zic3 hat einen hohen Anteil an
Embryonen mit bilateraler oder fehlender Pitx2c-Expression zur Folge (Cast et al., 2012).
Hierbei werden die LR-Defekte von konvergenten Extensionsdefekten begleitet, die
möglicherweise auf einem gestörten PCP-Signalweg beruhen und somit das bilaterale
Expressionsmuster erklären könnten (Walentek et al., 2012). Das Fehlen der
Seitenplattenexpression dagegen könnte Folge einer fehlenden paranotochordalen Nodal
Domäne sein. In der Maus wurde bereits eine Funktion von Zic3 in der Regulation der
bilateralen Nodal-Domäne nachgewiesen (Purandare et al., 2002). Heterozygote Zic3Mäuse, die LacZ unter der Kontrolle des NDE-Enhancers exprimieren, weisen Expression
nur in einzelnen Zellen der paranotochordalen Domäne auf. Da der Genlokus von Zic3
sich auf dem X-Chromosom befindet, fällt die Mutation in männlichen Embryonen stärker
aus und die Expression eines Reportergens, das unter Kontrolle des bilateralen NodalEnhancers steht, fehlt meist vollständig (Ware et al., 2006). Wenn auch bisher nicht
feststeht wie genau Zic3 auf den Nodal-Enhancer wirkt, wird Zic3 in der Maus am richtigen
Ort exprimiert, um in der Genexpressionskontrolle der Sensorzellen regulierend
mitzuwirken (Elms et al., 2004).
Auch der Funktionsverlust von Brachyury wirkt sich, wie bereits in Maus und Xenopus
beschrieben, auf die Sensorzellen aus, da er den Verlust der paranotochordalen NodalExpression zur Folge hat (King et al., 1998; Andre, 2009). Durch die Überexpression von
95
Diskussion
Brachyury lässt sich in Xenopus relativ zeitnah die Expression von Zic3 induzieren
(Kitaguchi et al., 2002). Somit könnte Brachyury als direkter Faktor die Transkription von
Zic3 kontrollieren, wobei FGF-abhängige Calciumaktivität als permessiver Faktor agieren
würde (Abb. 31). Dies liefert eine Erklärung wie Brachyury auf die Expression der
bilateralen Nodal-Domäne wirkt. Zic3 wiederum könnte möglicherweise zusammen mit
dem Notch-Signalweg auf die Transkription der Sensorzellen Einfluss nehmen.
Die Spezifizierung der Sensorzellen findet nicht nur in Xenopus, sondern zumindest auch
in der Maus Calcium-abhängig statt. Im Einklang mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte
kürzlich gezeigt werden, dass bereits während der Spezifizierung dieser Zellen
symmetrisch auftretende intrazelluläre Calcium-Wellen für die Determinierung der LRAchse entscheidend sind. Diese werden Pkd2-unabhängig generiert und sind für die
Induktion der paranotochordalen Nodal- und Cerl-2 Expressionsdomänen essentiell
(Takao et al., 2013). Im Huhn wurde in diesem Kontext zuerst eine Rolle für extrazelluläres
Calcium in der Induktion von Nodal über die Regulation von Notchaktivität beschrieben
(Raya et al., 2004). Später konnte auch die Notwendigkeit von intrazellulärem Calcium für
die Nodal-Expression nachgewiesen werden (Garic-Stankovic et al., 2008).
Seine wohl prominenteste Rolle in der LR-Achsenentwicklung der Wirbeltiere spielt
Calcium zu dem Entwicklungszeitpunkt, in welchem der linksgerichtete Flüssigkeitsstrom
stattfindet. Die Sensorzellen detektieren dabei den Flüssigkeitsstrom entweder mechanooder chemosensorisch und übersetzen ihn in einen linksseitigen intrazellulären
Calciumanstieg (McGrath et al., 2003; Sarmah et al., 2005; Francescatto et al., 2010;
Takao et al., 2013). Calcium wirkt jedoch schon zu einem früheren Stadium in der
Spezifizierung
des
zukünftigen
LR-Organisators.
So
werden
Pkd2
und
der
Serotoninrezeptor 5HTR3 für die Bildung des superfiziellen Mesoderms benötigt (Vick,
2009; Beyer et al., 2012). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der FGFSignalweg hierbei eine Rolle spielt, jedoch Calcium-unabhängig und vermutlich über eine
positive Regulation des kanonischen Wnt-Signalwegs. Zudem konnte eine weitere FGFabhängige Funktion von Calcium in der Spezifizierung der Sensorzellen von Xenopus
beschrieben werden. Somit lassen sich bisher drei Calcium-abhängige Entwicklungszeiträume in der frühen Lateralitätsentwicklung erkennen. Inwieweit diese Funktionen
innerhalb der Wirbeltiere konserviert sind, bleibt zu klären.
96
Diskussion
Die Daten dieser Arbeit zeigen, wie der FGF-Signalweg regulierend auf die Entstehung
der Lateralität von Xenopus laevis wirkt. Dabei konnte beschrieben werden, dass der FGFSignalweg auf zwei unterschiedliche Entwicklungsphasen wirkt. Über die Expression von
FoxJ1 reguliert er die Ciliogenese des LR-Organisators und somit den Mechanismus des
Symmetriebruchs. Über die lateralen GRP-Zellen als Sensorzellen des LR-Organisators
reguliert er die Übersetzung des Symmetriebruchs in eine linksspezifische Information.
Beide Prozesse sind essentiell für die Etablierung der Lateralität. Die Beschreibung dieser
beiden Funktionen kann dabei zum Verständnis beitragen wie auch andere Signalwege
mit Bezug zum FGF-Signalweg in die Lateralitätsentwicklung integriert sein können.
Weiterhin zeigt die Aufdeckung dieser beiden Funktionen in Xenopus, dass der FGFSignalweg innerhalb der Wirbeltiere eine stärkere Konservierung im Prozess der LRAchsendeterminierung aufweist, als es bislang angenommen wurde. Damit unterstützen
die hier gewonnenen Erkenntnisse über den FGF-Signalweg eine Konservierung des
symmetriebrechenden Mechanismus der Wirbeltiere.
97
Material und Methoden
Material und Methoden
Chemikalien, Kits, Hilfswerkzeuge
Material
Agar
Agarose LE
Agarose Low Melt
Albumin Fraktion V (BSA)
Aluminium-Probenteller
Ammoniumacetat
Ampicillin-Natriumsalz
AmplicapTM SP6High Yield Message Make Kit
Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments
Bakterienschalen 10 cm
BM-Purple AP-Substrat
Boehringer-Blocking-Reagenz
BSA (bovine serum albumin)
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2*2H2O)
Calciumnitrat-Tetrahydrat (Ca(NO3)2*4H2O)
CAS-BlockTM
CHAPS
Chloroform
Cystein
Deckgläschen
Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs)
Digoxigenin-dNTP-Labeling Mix
Digoxigenin-11-dUTP
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dithioreitol (DTT)
DNA-Purification-Kit (Easy-Pure)
DNAse I
Essigsäure
Ethanol
Ethidiumbromid
Ethylendiamintetraessigsäure EDTA
Ethylenguanintetraessigsäure EGTA
Ethyl-p-Aminobenzoat (Benzocain)
Ficoll
Filtereinheiten
FluospheresR Carboxylate-modified Microspheres,
0.5µm, yellowgreen
Formaldehyd
Formamid
Gelatine
Gentamycin
Glaswaren Schott
Glucose
Glutaraldehyd (25%)
Glycerol
Glycin
HCG (humanes Choriongonadotropin)
HCl (37%)
Hefeextrakt
Hefe-RNA (Torula)
Heparin
Hepes
Hoechst 33342
Injektionsnadeln Sterican (0,4x20 mm, Gr. 20)
Injektionsspritzen F1, 1 ml
IPTG
Bezugsquelle
AppliChem
Genaxxon Bioscience
Roth
AppliChem
Plano
Roth
AppliChem
Biozym
Roche
Greiner
Roche
Roche
Promega
Roth
Roth
Invitrogen
AppliChem
Merck
AppliChem
Roth
Promega
Roche und Promega
Roche
Roth
Promega
Biozym
Thermo Scientific
AppliChem
Roth
Roth
Roth
Roth
Sigma
AppliChem
Whatman
Molecular Probes
Roth
Roth
Merck
Biochrome
Duran
AppliChem
Roth
Roth
Applichem
Sigma
Merck
Roth
Sigma
AppliChem
AppliChem
Molecular Probes
B.Braun
B.Braun
Roth
98
Material und Methoden
Isopropanol (2-Propanol)
Kaliumacetat
Kaliumchlorid
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
Ladepuffer-DNA IV (10x)
Lambda-DNA
Leitfähige Haftaufkleber
Ligase (T4-Ligase)
Magnesiumchlorid (MgCl2)
Magnesiumsulfat (MgSO4)
Maleinsäure
Methanol
mMESSAGE mMACHINE SP6
M-MLV Reverse Transkriptase
Multiwell Platten (24 Well)
Mowiol
Natriumacetat
Natriumcitrat
Natriumchlorid
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)
Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4*H2O)
Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
Natriumhydroxid (NaOH)
Objektträger, geschnitten
Oligonukleotide
Paraformaldehyd (PFA)
PBS+ (DPBS)
Petrischalen (Plastik)
Penstrep (Pencillin und Streptomycin)
Pfu DNA Polymerase
pGEM®-T-Easy-Vektor
488Alexa-konjugiertes Phalloidin
Phenol/Chloroform (Rotiphenol)
Pipetten (Einweg-Pasteur-Pipetten)
Pipettenspitzen
PureYield Plasmid Midiprep System
Präparationsbesteck
Proteinase K
Reaktionsgefäße
Restriktionsenzyme und Puffer
RhodaminB-Dextran
RNAse A
RNAse-Inhibitor (RNAsin)
Saccharose
Skalpelle
Sp6-RNA-Polymerase
Sterilfilter
SU5402
T3-RNA-Polymerase
T7-RNA-Polymerase
Taq-DNA-Polymerase (Go-Taq)
Terminal-deoxynucleotidyl-Transferase
Thapsigargin
Trifast PeqGold
Tris
Triton X-100
Trypsin
Trypton
Tween20
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Kit
X-Gal
Roth
Roth
AppliChem
AppliChem
AppliChem
Promega
Plano
Promega
Merck
Roth
Roth
Roth
Ambion
Promega
Greiner
Hoechst
Roth
Roth
AppliChem
Merck
Roth
Roth
Roth
Roth
Knittel
MWG-Biotech AG
AppliChem
Gibco
Multimed
Gibco
Promega
Promega
Molecular Probes/Invitrogen
Roth
Sarstedt
Sarstedt/Eppendorf
Promega
Fine Science Tools
Roth
Eppendorf/Sarstedt
Promega
Molecular Probes
Roth
Promega
AppliChem
Bayha
Promega
Schleicher und Schuell
Calbiochem
Promega
Promega
Promega
Invitrogen
AppliChem
PEQLAB Biotech.
AppliChem
Serva
Roth
AppliChem
Roth
Promega
Roche
99
Material und Methoden
Ziegenserum
Sigma
Organismen
Versuchstiere
Afrikanischer Krallenfrosch Xenopus laevis
Es wurden Xenopus laevis Frösche verwendet, die von Guy Pluck, Xenopus express, Ancienne Ecole de
Vernassal, Le Bourg 43270, Vernassal, Haute-Loire, Frankreich stammten. Die Frösche wurden artgerecht
in einem zwölfstündigen Lichtzyklus in den Tierställen des Instituts für Zoologie Hohenheim gehalten.
Bakterienstamm
E.coli XL1-Blue
q
r
Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacI ZDM15 Tn10 (Tet )]
(aus dem Bakterienvorrat des Instituts für Zoologie, Hohenheim)
Internet-Datenbanken und Programme
Froschdatenbank Xenbase: http://www.xenbase.org/common/; Bowes et al., 2008
Sequenzdatenbank GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; Benson et al., 2005
Literaturverwaltungsprogramm Mendeley: http://www.mendeley.com/
Programme zur Bildverarbeitung, -bearbeitung:
ImageJ: Abràmoff, 2004; Anwendungsbezogene Skripte und Makros für die Analyse wurden von Thomas
Thumberger erstellt (Thumberger, 2011).
Adobe Suite CS3: Photoshop und Illustrator
Geräte
Fluoreszenz-Stereomikroskop: Leica MZ FLIII
Fluoreszenzmikroskop: Zeiss Axio Imager. M1
Gelkammern: ThermoEC ClassicTM mit Consort Elektrophoresis Power E844
Kritisch-Punkt-Trockner: Leica EM CPD030
Konfokales Laser-Scan-Mikroskop: LSM 700
Micropipette Puller : P-87, Sutter Instrument
Mikroskop: Zeiss Axioskop2 mot plus
Photometer: Eppendorf Bio Photometer
Rasterelektronenmikroskope:
LEO DSM 940A, Zeiss
NeoScope JCM-5000, Jeol
Stereomikroskop: Zeiss Discovery V.12 A SteREO
Sputtergerät: Leica EM SCD005
Taumelrollenmischer: TRM-V, IDL
Thermocycler : Peltier Thermal Cycler PTC-200; Biozym
Vibratom: Leica VT 1000
Kulturmedien, Puffer, Lösungen
In-situ-Hybridisierung
Alkaline Phosphatase Puffer (AP1-Puffer), pH 9,5
100mM TRIS pH9.5; 100mM NaCl, 50mM MgCl2
100
Material und Methoden
Blockierungslösung
10g Boehringer-Blocking-Reagenz in 800ml PBS bei 70°C gelöst; Nach Abkühlen: Zugabe von 100ml
Ziegenserum (hitze-inaktiviert), mit PBS auf 1l aufgefüllt; steril filtiert; Zugabe von 1ml Tween20
Hybridisierungslösung
12,5M Formamid; 10g/l Boehringer Blocking-Reagenz; 0,75M NaCl; 75mM Natriumcitrat; 0,5% (v/v) Tween
20; 5mM EDTA; 0,1% CHAPS; 1mg/ml Torula-RNA; 0.1mg/ml Heparin; pH 7,0
MAB (Maleic Acid Buffer)
150mM NaCl; 100mM Maleinsäure; pH 7,5
10xPBS (Phosphate Buffered Saline)
1,37M NaCl; 100mM Na2HPO4; 27mM KCl; 18mM; KH2PO4; pH 7,4
1xPBSw
137mM NaCl; 10mM Na2HPO4; 2,7mM KCl; 1,8mM KH2PO4; 0.1% (v/v) Tween 20; pH 7,4
1xPBST
137mM NaCl; 10mM Na2HPO4; 2,7mM KCl; 1,8mM KH2PO4, 0.1% (v/v) Triton-X-100; pH 7,4
20xSSC (Sodium Citrate Buffer)
3M NaCl; 300mM Natriumcitrat; pH 7,0
Froschexperimente
5xMBSH (Modified Barth`s Saline mit HEPES)
440mM NaCl; 50mM HEPES; 12mM NaHCO3; 5mM KCl; 4mM MgSO4*7H2O; 2mM CaCl2; 1,7mM
Ca(NO3)2*4H2O; 0,5mg/ml Streptomycin; 500U/ml Penicillin; pH 7,4
10xMEMFA
1M MOPS; 20mM EGTA; 10mM MgSO4; pH 7,4
1xMEMFA
100mM MOPS; 2mM EGTA; 1mM MgSO4; 3,7% (v/v) Formaldehyd; pH 7,4
Gurdon`s Puffer
88mM NaCl; 15mM HEPES; 15mM Tris-HCl; 1mM KCl; pH 7,6
Ficoll-Lösung
2%Ficoll in 1xMBSH lösen
Cystein-Lösung
2% Cystein in H2O lösen, auf pH 8,0 einstellen
Bakterienkultur
SOC-Medium (Super Optimal Catabolite repression medium)
20g/l Trypton; 10mM MgSO4; 10mM MgCl2; 10mM NaCl; 5g/l Hefeextrakt; 2,5mM KCl; 3,6g/l Glucose
LB-Medium (lysogeny broth medium)
10g/l Trypton, 12,2mM NaCl, 5g/l Hefeextrakt; pH 7,0
DNA-Präparation
P1 (Resuspensions-Puffer)
50mM Tris-HCl, 10mM EDTA (pH 8,0); 100µg/ml RNAseA
P2 (Lysis-Puffer)
0,2M NaOH; 1% (v/v) SDS
P3 (Neutralizations-Puffer)
3M Kaliumacetat pH 5,1
101
Material und Methoden
Rasterelektronenmikroskopie
Sörensen Phophat-Puffer (PB-Puffer)
Stammlösung A: 0,2M NaH2PO4*H2O
Stammlösung B: 0,2M Na2HPO4
für 0,1M PB-Puffer pH 7,4: 19ml A, 81ml B, 100ml H2O
für 0,1M PB-Puffer pH 7,0: 39ml A, 61ml B, 100ml H2O
Sonstige
Mowiol
96g Mowiol 4-88; 24g Glycerol; 24ml H2Odd; 2 Stunden rühren; Zugabe von 48ml 0,2M TRIS pH8,5; 2
Stunden rühren bei 50°C; 15 Minuten bei 5000rpm zentrifugieren; Überstand bei -20°C lagern
50x TAE-Puffer (Tris Acetate EDTA electrophoresis buffer)
2M Tris pH 8,5, 1M Essigsäure, 50mM EDTA (pH 8,0); pH 8,5
Allgemeine Molekularbiologische Methoden
Isolierung der Gesamt-RNA aus embryonalem Gewebe
Zur Isolierung der Gesamt-RNA wurden 3-4 Embryonen in 1ml Trifast (PEQGold) mazeriert und bei RT
lysiert. Danach wurden 200µl Chloroform hinzugegeben, 15 Sekunden gevortext, weitere 5 Minuten inkubiert
und dann 5 Minuten zentrifugiert (RT/14000rpm). Anschließend wurde aus der oberen wässrigen Phase die
Gesamt-RNA mit 500µl Isopropanol gefällt. Nach kurzem Vortexten wurde 10 Minuten bei RT inkubiert und
dann 15 Minuten bei 4°C/14000rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das RNA-Pellet mit
75%Ethanol gewaschen. Nach ausreichendem Trocknen des RNA-Pellets wurde dieses in 30µl sterilen
Wasser resuspendiert und der Gehalt mittels photometrischer Bestimmung ermittelt. RNA wurde bis für die
weitere Verwendung bei -80°C eingelagert.
cDNA-Herstellung durch reverse Transkription
1µg RNA wurde umgeschrieben in cDNA mit 0,5µl einer Bibliothek an zufälligen Primersequenzen (random
hexamers, Promega). Dafür wurde das Gemisch an RNA und Primer mit H2Odd auf ein Endvolumen von 14µl
gebracht, auf 70°C erhitzt um sekundäre RNA-Strukturen aufzuschmelzen und anschließend auf Eis schnell
abgekühlt, um das Anheften der Primer zu ermöglichen. Danach wurden 5µl M-MLV RT Puffer (5x), 1,25µl
dNTPs (10mM), 1µl M-MLV Reverse Transkriptase und 3,75µl Wasser hinzu gegeben. Nach 10 Minuten bei
RT und 60 Minuten bei 50°C wurde die Reaktion durch die Inkubation bei 70°C für 15 Minuten abgestoppt.
Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Zur Amplifikation von DNA–Sequenzen, die beispielsweise für die Herstellung von Antisense-RNA zur
Expressionsanalyse eines Gens mittels in-situ-Hybridisierung dienten, wurde die Taq-Polymerase
verwendet. Sollten dagegen codierende DNA-Sequenzen oder andere DNA-Konstrukte amplifiziert werden,
die für spätere Mikroinjektionsexperimente verwendet wurden, so wurde die Pfu-Polymerase verwendet, da
diese eine geringere Fehlerrate aufweist.
Für eine Taq-Polymerase-PCR wurde ein 25µl Ansatz bestehend aus 1µl cDNA, 5µl GoTaq-Puffer (5x),
2,5µl dNTPs, 1µl 10mM spezifischer Primer 1 (forward), 1µl 10mM spezifischer Primer2 (reverse), 0,2µl TaqDNA-Polymerase und 14,3µl Wasser in ein PCR-Gefäß pipettiert. Für die Negativ-Kontrolle wurde die cDNA
durch Wasser ersetzt.
Für eine Pfu-Polymerase-PCR wurde ein 50µl Ansatz bestehend aus 1µl cDNA oder 1µl Plasmid-DNA
(verdünnt auf 10pg/µl), 5µl Pfu-Puffer (10x), 5µl dNTPs, 1µl 10mM spezifischer Primer 1 (forward), 1µl 10mM
spezifischer Primer2 (reverse), 1µl Pfu-Polymerase und 28µl Wasser in ein PCR-Gefäß pipettiert.
Die Amplifikation im Thermocycler beinhaltete folgende Schritte:
(1) 5 Minuten Denaturierung bei 95°C (Auftrennung der Doppelstänge der DNA)
(2) 30 Sekunden Denaturierung bei 95°C
(3) 30 Sekunden Anlagerung bei 55°C (Anlagerung der Primer je nach
Schmelztemperatur)
(4) 45 Sekunden Elongation bei 72°C (Zweitstrangsynthese durch DNA-Polymerase,
wobei Elongationszeit von der Sequenzlänge des Produktes und von der verwendeten DNAPolymerase abhängt)
(5) Zurück zu Schritt (2), 35 Zyklen (Taq-Polymerase), 15 Zyklen (Pfu-Polymerase)
(6) Kühlung auf 8°C bis zur Entnahme der Proben aus dem Thermocycler
102
Material und Methoden
Im Falle der Pfu-Polymerase-PCR wurde die Amplifikation im Thermocycler nach erneuter Zugabe von PfuPolymerase (0,8µl) mit dem gleichen Programm ein weiteres Mal wiederholt. Sollte das PCR-Produkt
anschließend in den pGEM-T Easy Vektor kloniert werden, so wurde mittels Taq-Polymerase die NukleotidBase Adenin an das 3’ des PCR-Produktes angefügt. Hierzu wurden 5µl amplifizierte PCR-DNA, 2µl 5x
Colorless GoTaq-Puffer (ohne Farbstoffe, da anschließend keine Gelelektrophorese durchgeführt wurde),
0,4µl 5mM dATPs, 1µl Taq-Polymerase zusammenpipettiert und dieser Ansatz bei 70°C 20 Minuten
inkubiert.
Eine geringe Menge an unaufgereinigtem PCR Produkt wurde qualitativ durch Gelelektrophores überprüft.
Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren
Die Auftrennung erfolgte mittels eines 1%-igen Agarosegels (1g Agarose auf 100ml 1xTAE-Puffer), welches
mit Ethidiumbromid (0,4µg/ml) versetzt wurde, in einer 1x TAE-Puffer gefüllten Gelelektrophoresekammer
bei 100-120 Volt. Zur Größenbestimmung der DNA-Fragmente wurde zusätzlich ein geeigneter DNAFragmentlängenstandard (spezifisch restriktionsfragmentierte DNA des Phagen lambda) aufgetragen. Die
Nukleinsäurefragmente wurden durch Fluoreszenz unter einem UV-Transilluminator bei 312 nm (TCP 20 M,
Vilber Lourmat) sichtbar gemacht und konnten so photographiert werden.
Ligation in pGEM-Teasy
Das 3‘ adenylierte PCR-Produkt wurde anschließend in den pGEM-T Easy Vektor (Promega) kloniert. Hierzu
wurde ein 5µl Ansatz aus 2,5µl Ligationspuffer (2x), 0,5µl pGEM-T Easy, 0,5µl T4 DNA Ligase, 0,5µl Wasser
und 1µl des 3‘ adenylierten PCR-Produktes angesetzt, der über Nacht bei 4°C bis zur Transformation in
kompetente E.coli-Bakterien inkubiert wurde.
Transformation der Bakterien mit Plasmid-DNA
Für die Transformation wurde die Plasmid-DNA zu 100µl chemisch kompetenten Bakterien (E.coli XL1-blue)
gegeben, die zuvor auf Eis angetaut wurden. Dieser Ansatz wurde für 30 Minuten auf Eis inkubiert, damit
sich die DNA gleichmäßig verteilt und an den Zellen anheften konnte. Der danach durchgeführte
Hitzeschock für 90 sec bei 42 °C bewirkte, dass die Membran der Bakterien permeabilisiert wurde und die
DNA aufgenommen werden konnte. Die Bakterien wurden anschließend 2 Minuten auf Eis inkubiert. Danach
wurden 400µl SOC-Medium zugegeben. Die Bakterien wurden für 1 Stunde bei 37°C im Heizblock inkubiert.
Währenddessen vermehrten sich die transformierten Zellen und bildeten die bei erfolgreicher Aufnahme des
Plasmids gewonnene Antibiotikaresistenz gegen das Selektionsmedium aus. Die erhaltenen 500 µl wurden
franktioniert auf Selektions-Agarplatten (100µg/ml Ampicillin, 0,5mM IPTG, 80µg/ml XGal) ausgestrichen und
lichtgeschützt über Nacht bei 37°C inkubiert. IPTG (Isopropyl-beta D-thiogalaktopyranosid) diente der
Bindung und Inhibierung eines Repressors des ß-Galaktosidase-Gens, während das lichtempfindliche
Substrat X-Gal, von dem Enzym ß-Galaktosidase umgesetzt wird. Der pGEM-T Easy Vektor enthält ein ßGalaktosidase-Gen in seiner multiple cloning site (MCS). Wenn das PCR-Produkt korrekt in die MCS ligiert
wird, wird das ß-Galaktosidase-Gen dabei zerstört und eine Blaufärbung bleibt aus. Dadurch konnten
selektiv die weißen Kolonien von den Agarplatten isoliert werden, die den Plasmid-Vektor mit einem Insert
enthielten.
Mini-Präparation von Plasmid-DNA
Für die Mini-Präparation wurden einzelne, weiß gefärbte Bakterien-Kolonien von den Selektions-Agarplatten
mit Hilfe einer Pipettenspitze in ca. 3ml LB-Selektionsmedium (mit 100µg/ml Ampicillin) transferiert und über
Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Am nächsten Morgen wurden von dieser Flüssigkeit ca. 1,5ml in
Eppendorfröhrchen überführt und für 5 Minuten bei 5000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und das Bakterienpellet in 100µl P1-Lösung mittels Vortexen resuspendiert. Für die Lyse der Zellen wurde
200µl P2-Puffer hinzugegeben und für 5min bei RT inkubiert. Anschließen wurden mit 150µl P3 Puffer
neutralisiert und die Suspension für 20min auf Eis inkubiert. Die Ansätze wurden bei 14000 rpm und 4°C für
10 Minuten zentrifugiert und danach der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Dann wurde 1ml Ethanol (20°C) zugegeben, gevortext und die DNA für mindestens 30 Minuten bei -20°C gefällt. Die präzipierte DNA
wurde nochmals für 10 Minuten bei 14000 rpm abzentrifugiert, das DNA-Pellet mit 500µl 75% Ethanol
(-20°C) gewaschen und anschließend bei 14000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Ethanol-Überstand
wurde verworfen, das Pellet circa 10 Minuten an der Luft getrocknet und in 50µl H2Odd resuspendiert.
Restriktionsverdau von DNA-Fragmenten
1µg DNA oder 5µl der Plasmid-DNA aus dem Mini-Präp, 0,5µl Restriktionsenzym (10U/µl), 2µl 10x Puffer
und 0,2µl BSA wurden mit Wasser auf ein Endvolumen von 20µl gebracht. Dieser Reaktionsansatz wurde
bei 37°C für mindestens 2 Stunden inkubiert und anschließend mittels Gelektrophorese aufgetrennt.
103
Material und Methoden
Midi-Präparation von Plasmid-DNA mit dem PureYield Midiprep Kit
100ml LB-Selektionsmedium (LB-Medium, 100µg/ml Ampicillin) wurden mit 1ml der getesten Bakterienkultur
über Nacht bei 37°C inkubiert. Diese Bakterienkultur wurde in einen Zentrifugenbecher überführt,
zentrifugiert (10 Minuten/4000 rpm) und die Plasmid-DNA entsprechend des „PureYield Plasmid Midiprep
System“ Protokoll von Promega und unter Verwendung der Vakuum-Methode isoliert. Zur Überprüfung der
Qualität und Ausbeute der DNA wurde die Konzentration dieser DNA-Lösung photometrisch bestimmt.
Mittels Sanger-Sequenzierung (MWG-Biotech AG) wurde die Sequenz überprüft.
+
Bei einer anschließenden Klonierung des DNA-Inserts in den pCS2 -Vektor wurde das DNA-Insert mittels
Restriktionsverdau aus dem pGEM-T Easy Vektor geschnitten (Ansatz 50µl), durch Gelaufreinigung (Easy
+
Pure, Biozym) isoliert und mit dem ebenfalls geschnittenen pCS2 -Vektor (Rupp et al., 1994) ligiert und die
Orientierung durch Sequenzierung kontrolliert.
Linearisierung der Plasmid-DNA
Für die Linearisierung der Plasmid-DNA wurden 20µg DNA, 5µl Restriktionsenzym, 10µl 10xPuffer, 1µl BSA
mit Wasser auf ein Endvolumen von 100µl gebracht. Der Restriktionsverdau erfolgte über Nacht bei 37°C.
Für die Aufreinigung der linearisierten DNA wurden am nächsten Morgen 10µl Ammoniumacetat-Lösung (5M
Ammoniumacetat, 100mM EDTA) und 220µl Ethanol hinzugegeben, gevortext und für mindestens 15
Minuten bei -20°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Zentrifugationschritt bei 4°C/14000rpm für 20
Minuten. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet an der Luft kurz getrocknet und in 20µl Wasser
resuspendiert.
In-vitro Transkription von mRNA
+
Als Template für die in-vitro Transkription der mRNA diente das gewünschte DNA-Insert im pCS2 -Vektor.
+
Dabei gewährleistet der pCS2 -Vektor aufgrund seines SV40 Polyadenylierungssignals, dass die
transkribierte mRNA über einen Poly-A-Schwanz am 3’-Ende verfügt. Für die in-vitro Transkription wurden
7
der linearisierte Plasmid-Vektor, SP6 RNA-Polymerase Mix (Promega), NTPs und ein Ribo m GAP-Analog
(Promega) eingesetzt um dadurch RNA zu erhalten die wie eukaryotischer mRNA eine 5‘ CAP Struktur
besitzt. Da RNA sehr schnell degradiert, erfolgten alle Schritte auf Eis, entsprechend der Angaben der
Hersteller (Ambion oder Applicap). Nach zweistündiger Inkubation des Transkriptionsansatzes wurde zum
Abbau der Template-DNA 1µl DNase zugesetzt und für 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurde eine
Phenol-Chloroform-Extraktion mit darauffolgender Isopropanol-Fällung durchgeführt. Die capped-RNA wurde
als 1µl Aliquots bei -80°C gelagert. Die Konzentration wurde photometrisch gemessen und auf einem Gel
eine mögliche Degeneration der mRNA überprüft.
Photometrische Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren
Zur Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren wurde die Extinktion von UV-Strahlen der Wellenlänge
260 und 280 nm beim Durchqueren einer Nukleinsäurelösung in einem Biophotometer (Eppendorf)
gemessen. Als Leerprobe wurde das entsprechende Lösungsmittel verwendet. Zur Bewertung der Reinheit
der Nukleinsäure dient das Extinktionsverhältnis von 260 und 280 nm. Ein optimaler Reinheitswert liegt bei
circa 1,8 für DNA und 2,0 für RNA.
Arbeiten mit Xenopus laevis
Stimulation der Eiablage von Xenopus laevis Weibchen:
Die Ovulation wurde durch subkutane Injektion des humanen Hormons Choriongonadotropin in den dorsalen
Lymphsack induziert. Dazu wurden Weibchen eine bis zwei Wochen zuvor durch die Injektion einer kleinen
Menge Choriongonadotropin (50µl) auf die gewünschte Ovulation vorbereitet. Nach Induktion der Ovulation
mittels einer größeren Menge an Choriongonadotropin, die je nach Größe der Weibchen zwischen 400-600µl
variierte, kam es circa 10-12 Stunden später zur gewünschten Eiablage. Für die Experimente wurden
ausschließlich Eier verwendet die direkt vom Weibchen abgelegt wurden. Das direkte Ablaichen wurde
hierfür durch behutsames Massieren des Bauches angeregt, um dann die Eier in einer Petrischale
aufzusammeln.
In-vitro Befruchtung der Eier
Für die in-vitro Befruchtung wurden die Hoden aus einem zuvor getöteten Männchen isoliert. Dabei reichte
ein kleines Stück von circa 2 mm² für die Befruchtung eines Geleges aus. Der restliche Hoden wurde in
1xMBSH bei 4°C aufbewahrt und für max. 2 Wochen für weitere Befruchtungen verwendet. Für die
104
Material und Methoden
anschließende Verwendung wurde das Hodenstück in 1ml 1xMBSH mazeriert und auf die Eier verteilt. Die
Salzkonzentration des 1xMBSH wurde durch Zugabe von Wasser gesenkt, so dass sich die Spermien
bewegen konnten. 40 Minuten nach der Befruchtung wurden die Eier für max. 7 Minuten in einer 2%-igen
Cysteinlösung (pH 8,0) inkubiert und leicht geschwenkt um die Gallerthülle der Eier zu entfernen. Die
Cysteinlösung wurde anschließend durch mehrmaliges Waschen in 0,1xMBSH entfernt. Für die weitere
Kultivierung wurden die Embryonen in 0,1xMBSH/1%Agrar-Schälchen oder für die Mikroinjektion in 1xMBSH
überführt.
Mikroinjektion
+
Für die Mikroinjektion von mRNA, kodierender DNA (im pCS2 -Vektor, Rupp et al., 1994), oder MorpholinoOligonukleotiden wurden die Embryonen in 1xMBSH/1%Agar-Schälchen mit 2%Ficoll-Lösung umgesetzt.
Dabei wirkt die hohe Viskosität des Ficolls einem Austreten der injizierten Flüssigkeit und des
Zellcytosplasmas entgegen.
Die Injektionsnadeln wurden mit Hilfe eines Micropipette Pullers hergestellt. Dazu wurde eine Glaskapillare
(1mm Durchmesser, Glass thinW, World Precision Instruments) eine Vorrichtung eingespannt, in der Mitte
erhitzt und parallel dazu auseinander gezogen, so dass zwei Injektionsnadeln entstanden. Für die Injektion
musste die feine Spitze unter dem Stereomikroskop mit einer Uhrmacherpinzette abgebrochen werden. Die
mRNA, DNA oder der Morpholino-Oligonukleotid wurde mit isotonischem Gurdon’s-Puffer verdünnt, in die
Injektionsnadeln aufgezogen und in Embryonen im 4-Zellstadium mittels eines Injektionsapparat der Firma
Havard Apparatus, der über einen Druckluftanschluss den nötigen Druckaufbau generierte, injiziert. Das
Volumen des Injektionstropfens wurde mittels des Injektionsdruckes und der Messung des
Tröpfchendurchmesser anhand von Millimeterpapier auf 8nl eingestellt. Die im Text angegebene injizierte
Menge in pg (bei mRNA und DNA) oder in pmol (bei Morpholino-Oligonukleotiden) entspricht also der
Menge in einem Injektionsvolumen von 8nl (bei beidseitiger Injektion zweimal 8nl). Beispielsweise wurde für
eine Injektion von 8pg eine Injektionslösung mit der Konzentration von 1ng/µl injiziert. Die Injektionen wurden
unter Verwendung eines Stereomikroskops und eines Mikromanipulators zur Ermöglichung von präzisen
Bewegungen durchgeführt.
Anhand der Pigmentierung lässt sich das spätere Zellschicksal der Blastomeren erkennen. So sind die
beiden ventralen Blastomeren eines Embryos im 4-Zellstadium in Folge der kortikalen Rotation nach der
Befruchtung im idealen Fall dunkel pigmentiert (Klein, 1987). Die Eier richten sich nach Entfernen der
Gallerthülle aufgrund der schweren dotterreichen vegetalen Hemisphäre mit dem animalen Pol nach oben
an. Aus den beiden Informationen (ventral/dorsal versus animal/vegetal) lassen sich automatisch die linke
und rechte Seite identifizieren. Dies ermöglicht eine gerichtete Injektion, wodurch beispielsweise spezifisch
auf der linken oder rechten Seite Genfunktionen manipuliert werden können (siehe Vick et al., 2009).
Alle Injektionen wurden durch Koinjektion eines „lineage tracers“ (RhodamineB-Dextran) unter einem
Stereomikroskop mit UV-Quelle (LEJ ebq100 isolated) kontrolliert.
Injizierte mRNA, DNA:
Bcl-XL: Fusionskonstrukt von Myc und der kodierenden Sequenz von Bcl-XL (X.laevis R11). Zur Verfügung
gestellt von Ralph Rupp, München. (Hensey and Gautier, 1997)
dnFgfr1: dominant-negatives Deletionskonstrukt des FGF-Rezeptor 1 (Xenopus). Deletionssequenz im
modifizierten pSP64T Vektor (pXFD/Xss) zur Verfügung gestellt von Edgar Pera, Lund (Schweden), erstmals
publiziert in (Amaya et al., 1991).
+
Für DNA-Injektionen in den pCS2 -Vektor kloniert, dabei wurden folgende Primer verwendet:
XFD-EcoRI-forward: 5’ GAATTCATGGTCTCCGGAATGTCCCTC 3’
XFD-XhoI-revers: 5’CTCGAGTCACGGGTGCTTCATTTTAAAGATAA 3’
+
Linearisierung des pCS2 -Vektors erfolgte mit SacII und in-vitro Transkription der mRNA mit Sp6 RNAPolymerase.
+
Fgf8b: kodierende Sequenz (Xenopus) im pCS2 -Vektor. Für die Klonierung wurden folgende Primer
verwendet:
Primer 1 (forward): 5` ATGAACTACATCACCTCCATCCTG 3`
Primer 2 (reverse): 5` CTCGATATTCAAGTTCTCGGTAG 3`
Die Sequenz wurde nach Amplifikation (Pfu-Polymerase und anschließendes Anfügen eines 3’A-Überhangs
mittels der Taq-Polymerase) in den pGEM-Teasy Vektor kloniert und nach Restriktionsverdau (EcoRI) und
+
Gelaufreinigung in den pCS2 -Vektor (ebenfalls EcoRI) kloniert. Orientierung wurde mittels Sequenzierung
überprüft.
Linearisierung erfolgte mit SacII und in-vitro Transkription der mRNA mit Sp6 RNA-Polymerase.
105
Material und Methoden
Spry1: Fusionskonstrukt von Myc und der kodierenden Sequenz von Sprouty1 (Xenopus) im modifizierten
+
pCS2 -Vektor (CS4
BamH1 Schnittstelle durch Bgl2 Schnittstelle ersetzt). Zur Verfügung gestellt von
Herbert Steinbeisser, Heidelberg; erstmals publiziert siehe Hanafusa et al. 2002. Linearisierung erfolgte mit
NotI und in-vitro Transkription der mRNA mit Sp6 RNA-Polymerase.
+
Pkd2: kodierende Sequenz (Xenopus) im pCS2 -Vektor (Tran et al., 2010). Linearisierung erfolgte mit NotI
und in-vitro Transkription der mRNA mit Sp6 RNA-Polymerase.
+
Wnt11b: kodierende Sequenz (Xenopus) im pCS2 -Vektor (Tada and Smith, 2000).
+
Xnr1: kodierende Sequenz von Xnr1 (Xenopus) im pCS2 -Vektor (Campione et al., 1999).
Injizierte Morpholino-Oligonukleotide (Gene Tools, LLC, Philomath, USA):
Pkd2-MO: 5’ GGTTTGATTCTGCTGGGATTCATCG 3’ (Tran et al., 2010)
Wnt11b-MO: 5’ TAACCCAGTGACGGGTCGGAGCCAT 3’ (Walentek et al., 2013)
Inkubationexperimente
SU5402 wurde lichtgeschützt in DMSO auf eine Stammlösung von 20mM gelöst, aliquotiert und für bis zu 6
Monate bei -20°C aufbewahrt.
Thapsigargin lag in einer Stammlösung von 2mM in DMSO gelöst vor, die aliquotiert und lichtgeschützt bei 20°C aufbewahrt wurde.
Inkubationen wurden in 24-Multiwell Platten lichtgeschützt bei RT durchgeführt. Die jeweiligen Aliquots
wurden aufgetaut, gevortext und die entsprechende Menge je nach verwendeter Konzentration zum
vorgelegten Kulturmedium (0,1xMBSH) pipettiert.
Durch mehrmaliges Auf- und Abziehen wurde die Pipettenspitze ausgewaschen und durch anschließendes
Rühren der Pipettenspitze die Vermischung von SU5402/Thapsigargin und MBSH beschleunigt.
Embryonen wurden mit einer 5ml Einwegpipette in das vorbereitete Kulturmedium transferiert. Durch
mehrmaliges Waschen in 0,1xMBSH wurde die Inkubation zum gewünschten Zeitpunkt beendet.
Fixierung von Embryonen
Embryonen wurden bis zum gewünschten Stadium kultiviert, in 5ml Glasfläschen transferiert und in frisch
hergestelltem 1xMEMFA für 1,5-2 Stunden bei RT auf dem Taumelrollenmischer oder über Nacht bei 4°C
fixiert. Für die in-situ-Hybridisierung wurden die Embryonen anschließend in Ethanol gewaschen, danach
etwa 20min bei RT auf dem Taumelrollenmischer inkubiert und nach einem weiteren Ethanolwechsel bei 20°C aufbewahrt.
Expressionsanalyse mittels in-situ-Hybridisierung (ISH)
In-vitro Transkription der Digoxygenin-markierten RNA-Sonde
1µg der jeweiligen linearisierten Plasmid-DNA (pGEM-Teasy Vektor oder pBluescript Vektor) wurden für die
Transkription der Antisense-Sonde verwendet. Je nach Orientierung der Template-DNA wurden 2µl von
Sp6-, T7- oder T3-RNA-Polymerase (10U/µl) in einen Reaktionsansatz mit 4µl Transkriptionspuffer, 0,5µl
RNasin (40 Units/µl), 2µl DTT, 2µl Digoxigenin-dNTP-Labeling-Mix und der Template-DNA pipettiert und mit
sterilem Wasser auf 20µl aufgefüllt. Dieser Ansatz wurde anschließend für 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurden zum Abbau der DNA 2µl DNAse (1Unit/µl) hinzupipettiert und für 15 Minuten bei 37°C
inkubiert. Zur Aufreinigung der RNA-Sonde wurden 30µl Wasser, 5µl Ammoniumacetat und 165µl Ethanol in
den Reaktionsansatz pipettiert, gevortext und die RNA für mindestens 30 Minuten bei -20°C gefällt.
Anschließend wurde bei 4°C/14000rpm für 25 Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und das RNAPellet in 40µl Formamid/ Wasser (1:1) aufgenommen und bei -80°C gelagert.
In-situ-Hybridisierung
Mittels ISH wurden spezifische Genexpression im Granzpräparat oder auf dorsalen Explantaten analysiert.
Dieses Protokoll wurde ursprünglich im De Robertis Labor entwickelt (Belo et al., 1997). Es dauert 3 Tage
bis die Embryonen in die Färbelösung überführt werden können. An Tag1 wird das Gewebe für die
Antisense-RNA mittels Proteinase K Verdau und dem Einsatz des nicht-ionischen Detergent Tween 20
permeabilisiert, die dann über Nacht mit der endogenen mRNA hybridisiert. Am zweiten Tag wird die
Antisense-Sonde ausgewaschen und die Embryonen werden auf die Inkubation im Antikörper, der spezifisch
gegen Digoxigenin gerichtet ist, vorbereitet. Über Nacht inkubieren die Embryonen dann im Digoxigenin-
106
Material und Methoden
Antikörper. Unspezifische Bindungen sollen am dritten Tag durch extensive Waschschritte entfernt werden.
Am Ende von Tag 3 werden die Embryonen in die Färbelösung umgesetzt. Der Digoxigenin-Antikörper ist an
Alkalische Phosphatase, einem Enzym das die Farbreaktion katalysiert, gekoppelt (Anti-Digoxigenin-AP Fab
Fragments). Durch Umsetzung der Embryonen in die Färbelösung (BM Purple) ermöglicht die Farbreaktion
die räumliche Expression eines Gens zum gewählten Entwicklungszeitpunkt zu visualisieren.
Tag1: Bis auf den Proteinase K-Schritt wurden alle Schritte auf Eis durchgeführt. Die in Ethanol gelagerten
Embryonen wurden durch eine absteigende Alkoholreihe: 75%, 50%, 25% Ethanol in PBS rehydriert.
Anschließend wurden die Embryonen dreimal für mindestens 5 Minuten in PBSw gewaschen. Die
Neurulastadien wurden auf Agarschälchen in PBS geschnitten (ventrales Gewebe wurde entfernt). Die
Embryonen wurden erneut in PBSw gewaschen. Dann Inkubation in 10µg/µl Proteinase K in PBSw bei RT
für 15 Minuten um das Gewebe durchlässig zu machen. Anschließend wurde der Proteinase-K Verdau mit
2mg/ml Glycin in PBS- gestoppt. Embryonen wurden dreimal für mindestens 5 Minuten in PBSw gewaschen,
in 4%PFA/0,2%Glutaraldehyd in PBS für 15 Minuten nachfixiert und dreimal für mindestens 5 Minuten in
PBSw gewaschen. Anschließend wurde das Gewebe mit Hybridisierungsblockinglösung geblockt, um somit
unspezifische Hindergrundhybridisierungen zu vermeiden. Dafür wurde zunächst PBSw durch eine 1:2
Verdünnung der Hybridisierungslösung in PBSw ersetzt und anschließend wurde die jeweilige Lösung durch
unverdünnte Hybridisierungslösung ersetzt. Die Embryonen wurden dann im Wasserbad bei 65°C für 3
Stunden vorhybridisiert. Kurz vor Ablaufen der drei Stunden wurde die Antisense-RNA vorbereitet. Dazu
wurde 1µl der Sonde in 100µl Hybridisierungslösung pipettiert, dies wurde für 5 Minuten bei 95°C
aufgekocht, anschließend direkt auf Eis gesetzt, dann zu den Embryonen in 900µl Hybridisierunglösung
dazugegeben und über Nacht bei 70°C im Wasserbad inkubiert.
Tag2: Embryonen wurden 2x 30 Minuten bei 70°C in 100% Hybridisierungslösung gewaschen. Die Lösung
wurde ein weiteres Mal durch 800µl Hybridisierungslösung ersetzt. Nach 5 Minuten bei 70°C wurden in drei
Schritten (je 5 Minuten, 70°C) jeweils 400µl 2xSCC (pH 4,5) hinzugefügt ohne die Lösung zu ersetzen.
Anschließend wurde 2x 30Minuten bei 70°C in 2xSCC (pH 7,0) gewaschen. Es folgten vier Waschritte in
MABw, wobei 2x 10 Minuten bei RT, gefolgt von 2x 30 Minuten bei 70°C. Dann wurden die Embryonen 3x
10 Minuten bei RT in PBSw gewaschen und für 2 Stunden im Antikörper-Blockingpuffer bei 4°C inkubiert um
unspezifische Antikörperbindungen später zu vermeiden. Der Antidigoxygenin Antikörper gekoppelt mit
Alkalischer Phosphatase wurde 1:10000 im Blockingpuffer verdünnt und zeitgleich in den 2 Stunden bei 4°C
vorgeblockt. Nach den 2 Stunden, wurde der Blockingpuffer in den Embryonengläschen durch das
Antikörper-Blockingpuffer-Gemisch ersetzt und bei 4°C über Nacht inkubiert.
Tag3: Die Inkubation der einzelnen Waschschritte fand bei RT auf dem Taumelrollenmischer statt. Zuerst
wurden die Embryonen 6x 0,1%BSA in PBSw gewaschen, 1x 5 Minuten und 5x 45 Minuten. Es folgten 2x
30 Minuten in PBS und 2x 30 Minuten in AP1-Puffer. Dann wurden die Embryonen in die Färbelösung
(Gemisch aus 1:1 AP1-Puffer und BM Purple), das sich vorgelegt in 12-Wellplatten befand, gebracht. Diese
Wellplatten wurden über Nacht bei RT lichtgeschützt inkubiert. In der Regel hatte die enzymatische
Farbreaktion bis zum nächsten Morgen ausreichend stark stattgefunden und konnte gestoppt werden.
Hierfür wurden die Embryonen mehrere Male in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Embryonen
schrittweise in Methanol überführt und bei 100%Methanol/-20°C aufbewahrt. Zur Auswertung der
Embryonen wurden diese Schrittweise in PBS rehydriert.
Anfertigung von histologischen Schnitten mit einem Vibratom-Mikrotom
Der zu schneidende Embryo wurde in 1ml einer Gelatine-Albumin-Mischung (2,2g Gelatine, 135g
Rinderalbumin, 90g Saccharose in 450ml PBS äquibriliert). In eine Einbettkasette wurde 1ml GelatineAlbumin-Mischung gegossen, der kurz zuvor 70µl Glutaraldehyd (25%) zugegeben wurde. Nach dem
Aushärten der Mischung wurde der Embryo mit einer 5ml Einwegpipette in die Einbettkasette überführt und
nach Ausrichten des Embryos mit derselben Mischung übergossen. Nach Aushärten des Blockes wurde
dieser aus der Einbettkasette gelöst und mit einer Rasierklinge unter dem Binokular getrimmt und auf eine
Metallplatte geklebt. Diese wurde in die Halterung des Vibratoms eingespannt und mit PBS übergossen.
Schnitte mit einer Dicke von 30µm wurden angefertigt und auf einen Objektträger überführt. Anschließend
wurden die Schnitte mit Mowiol eingedeckelt.
Analyse proliferierender Zellen mittels phosphoHiston3(pH3)-Immunhistochemie (IHC)
Die Embryonen wurden im gewünschten Stadium 1 Stunde bei RT in 4%PFA fixiert. Danach wurden sie 3x
10 Minuten in PBS gewaschen. Da mittels pH3-Färbung detektiert werden sollte, ob spezifisch im Bereich
der zukünftigen GRP ein Unterschied in der Zellproliferation zwischen SU5402- und DMSO-inkubierten
Embryonen bestand, war der ventrale Bereich für die Auswertung nicht relevant. Dieser Bereich wurde
weggeschnitten, so dass der Hohlraum des Archenterons zerstört wurde und die Lösungen leicht das schon
im Zuge der Gastrulation eingewanderte Gewebe erreichen konnten. Die Embryonen wurden dazu auf
107
Material und Methoden
Agarschälchen geschnitten, 3x 10 Minuten in PBST gewaschen und in einer mit PBST 1:10 verdünnten
CAS-Block-Lösung für 2 Stunden bei RT geblockt. Anschließend wurde die verdünnter CAS Lösung
abgenommen und die Embryonen in primärer Antikörperlösung (Anti-phospho-Histone H3 (Ser10),
Kaninchen, Millipore), 1:140 in CAS-Lösung verdünnt, bei 4°C über Nacht inkubiert. Durch drei
Waschschritte je 30 Minuten in PBS wurden ungebundener Antikörper und unspezifische AntikörperBindungen entfernt. Da der sekundär Antikörper (Anti-Rabbit IgG, F(ab‘)2Fragment Cy3) konjugiert mit dem
lichtempfindlichen Fluorophor Cy3 vorlag, erfolgte der Inkubationsschritt mit ihm 1:150 verdünnt in CAS
unter Lichtausschluss über Nacht bei 4°C. Am nächsten Morgen wurde 3x 15 Minuten in PBS gewaschen.
Anschließend folgten die Phalloidin- und Hoechst-Färbung.
Phalloidinfärbung
Zu Anfärbung des F-Aktinzytoskelettes und Markierung der Zellgrenzen wurde eine Färbung mit Phalloidin,
einem hochtoxischem Alkaloid des weißen Knollenblätterpilzes (Amanita phalloides) durchgeführt. Phallodin
wurde als Lithiumsalz und als Konjugat mit dem grünen Fluorophor Alexa 488 bezogen, 1:40 in PBS
verdünnt und für 30 min bei RT auf der Rüttelplatte mit den Embryoschnitten inkubiert. Anschließend wurde
mit PBS mehrmals gewaschen.
Hoechst-Färbung der DNA
Der blau fluoreszierender Farbstoff Hoechst 33342 wurde zum Anfärben der Zellkerne verwendet und hierfür
1:10000 in PBST verdünnt und 1 Stunde bei RT inkubiert. Anschließend erfolgten einige Waschschitte in
PBS .
Die Proliferation wurde mit einem konfokalen Laser-Scan-Mikroskop (LSM 700, Objektiv A-Plan 10x/0,25
Ph1) dokumentiert. Die Auszählung proliferierender versus nicht-proliferierender Zellen erfolgte mittels des
„CellCounter“ Plugins von ImageJ anhand von Aufnahmen, die den Bereich der GRP abdeckten.
TUNEL-Markierung apoptotischer Zellen
(nach Hensey and Gautier, 1998)
Diese Methode beruht darauf, dass die durch die Apoptose entstehenden DNA-Fragmente an ihren 3’-OHEnden durch das Enzym TdT (Terminal-deoxynucleotidyl-Transferase) markiert werden und dadurch die
betroffenen Zellkerne visualisiert werden können.
Die Embryonen wurden im gewünschten Stadium 1 Stunde bei RT in MEMFA fixiert und anschließend 2x
30 Minuten in Methanol gewaschen. Durch eine absteigende Alkoholreihe: 75%, 50%, 25% Methanol in
PBSw wurden die Embryonen schrittweise rehydriert. Wie bei der pH3-Färbung angegeben wurden die
Embryonen geschnitten und anschließend 2x 15 Minuten in PBSw und 2x 15 Minuten in PBS gewaschen.
Dann wurden sie 1 Stunde bei RT in TdT-Puffer gewaschen und nach Zugabe von neuem TdT-Puffer,
Digoxygenin-dUTP (1µM) und TdT (150U/ml) konnte bei Inkubation über Nacht bei RT die Enzymreaktion
stattfinden. Am nächsten Tag wurden die Embryonen 2x 30 Minuten bei 65°C in 1mM EDTA/PBS , 4x 1
Stunde in PBS bei RT und 2x 10 Minuten PBSw bei RT gewaschen. Anschließend wurden die Embryonen
1 Stunde bei RT in Blockinglösung vorblockiert. Der Digoxygenin-Antiköper gekoppelt mit Alkalischer
Phosphatase wurde parallel dazu in Blockinglösung inkubiert (1:5000). Die Blockinglösung ohne Antiköper
wurde ersetzt und die Inkubation des Antikörpers fand über Nacht bei 4°C statt. Die Waschritte am dritten
Tag zur Entfernung des nicht-gebundenen Antikörpers und unspezifische Antikörperbingen erfolgten alle bei
RT. Es wurde 6x 1 Stunde in PBSw und 2x30 Minuten in PBS gewaschen. Über Nacht wurden die
Embryonen in PBS bei 4°C gelagert. Zur Vorbereitung auf die Färbelösung wurden die Embryonen am
nächten Tag 2x 30 Minuten bei RT in AP1-Puffer gewaschen und dann in die Färbelösung (Gemisch aus 1:1
AP1-Puffer und BM Purple) überführt. Die enzymatische Farbreaktion trat nach wenigen Stunden Inkubation
bei RT statt. Die Embryonen wurden eine Stunde in MEMFA nachfixiert.
Bei der Auswertung wurden Embryonen mit mehr als fünf gefärbten Zellen als TUNEL-positiv gewertet.
Analyse des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms
Die Analyse des linksgerichteten Flüssigkeitsstroms erfolgte nach Schweickert et al., 2007 und Thumberger,
2011. Embryonen wurden bis zum Neurulastadium 17 kultiviert. Für die Freilegung der GRP wurde die
Vitellinmembran entfernt und dorsale Explantate angefertigt. Die Präparation wurde in 1%Agaroseschächen
(1xMBSH) mit 1xMBSH als Präparationsmedium durchgeführt. Die dorsalen Explantate wurden in einer
1/2500 Verdünnung von fluoreszierenden Latexpartikeln (FluoSpheres) in 1xMBSH in eine Vaselinkammer
auf einem Objekträger überführt, mit der GRP nach oben ausgerichtet und eingedeckelt. Die Bewegung der
fluoreszierenden Latexpartikel wurde dann unter dem Mikroskop (Axioskop2, Zeiss) mittels einer CCD
Kamera (AxioCam HSm, Zeiss) und Zeitrafferaufnahmen (AxioVision 4.6, Zeiss) verfolgt.
Mittels des ImageJ plugin „ParticleTracker“ wurden die Partikelbewegungen analysiert (Sbalzarini and
Koumoutsakos, 2005). Durch Erstellen einer Maske wurden nur Partikelbewegungen im Bereich der GRP
ausgewertet. Die qualitative und quantitative Auswertung erfolgte mit einem von Thomas Thumberger
108
Material und Methoden
geschriebenen Skript im statistischen Programm R (R Development Core Team: http://www.r-project.org/)
zur Erstellung der Windrosendiagramme. Um die Brownsche Molekularbewegung auszugrenzen wurden nur
Partikelspuren verwendet, die mindestens einen Rho-Wert von 0.6, also Direktionalität, vorwiesen und auf
mindestens 10 aufeinanderfolgenden Bildern detektiert werden konnten.
Rasterelektronenmikroskopie
Embryonen wurden bis zum gewünschten Stadium (Neurulastadium 17/18) kultiviert und in 4%PFA und
2,5% Glutaraldehyd 1 Stunde bei RT oder über Nacht bei 4°C fixiert. Anschließend wurden die Embryonen
3x 10Minuten in 0.1M Phosphate Puffer (PB, pH 7,4) gewaschen. Zur Freilegung der GRP wurden dorsale
Explantate angefertigt. Die Präparation wurde in 1%Agaroseschächen (PBS ) und 0.1M PB-Puffer als
Präparationsmedium durchgeführt. Die Embryonen wurden wiederum 3x 10 Minuten in 0,1M PB-Puffer
gewaschen und in 1% OsO4/0,1M PB-Puffer für 1 Stunde bei 4°C nachfixiert. OsO4 besitzt eine hohe
Elektronendichte und lagert sich an biologischen Makromolekülen an, sodass der Kontrast später bei den
rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen erhöht wird. Durch ausgiebiges Waschen in 0,1M PB-Puffer
(mindestens 5x 10 Minuten) wurde freies OsO4 entfernt. Die Embryonen wurden durch eine aufsteigende
Alkoholreihe: 25%, 50%, 75%, 2x 100% entwässert und bis zum Trocknungsprozess bei -20°C gelagert.
Mittels eines Kritisch-Punkt-Trockners wurde der Alkohol bei 10°C und einem hohen Druck gegen flüssiges
Kohlendioxid ausgetauscht. Durch Erhöhung der Temperatur (40°C) wurde das Kohlendioxid in die
Gasphase überführt und langsam über ein Ventil aus der Trocknungskammer abgeleitet. Die getrockneten
Embryonen wurden vorsichtig mit einer Uhrmacherpinzette auf einen, mit einem leitfähigen Haftaufkleber
überzogenen, Aluminium-Probenteller überführt und in einem Sputtergerät mit einer dünnen Goldschicht
überzogen (100sec bei 40mA, Arbeitsabstand 55mm). Gold als Edelmetall und dadurch als guter
elektrischer Leiter besitzt die Eigenschaft, einstrahlende Elektronen wieder zurück zu streuen. Mit dieser
Eigenschaft ist es überhaupt erst möglich Oberflächenstrukturen abzurastern. Embryonen wurden mit einem
Rasterelektronenmikroskop (Zeiss oder Jeol) untersucht und die Bilder digital abgespeichert.
Die Auswertung der GRP-Zellen bezüglich Zellgröße und Cilierungseigenschaften erfolgte, indem ein
größendefinierter Ausschnitt der zentralen GRP (1000x1000Pixel; 1000Pixel entsprachen einer Länge von
circa 86µm) einer Aufnahme (500-fache Vergrößerung) mittels ImageJ analysiert wurde. Hierfür wurde ein
von Thomas Thumberger erstelltes Makro verwendet (Thumberger, 2011). Die Zellgröße, Cilienlänge und
statistische Signifikanzen wurden weiterführend im statistischen Programm R berechnet und dargestellt (R
Development Core Team: http://www.r-project.org/).
Photodokumentation und Bildbearbeitung
Die dorsalen Explantate oder Embryonen im Ganzpräparat wurden nach der ISH mittels eines Zeiss
Stereomikroskops (Discovery.V12) und einer digitalen Farbkamera (AxioCam HRc, Zeiss) aufgenommen.
Die Aufnahme der Vibratom-Schnitte erfolgte mit einem Zeiss Axioskop 2 Mikroskop und derselben
Farbkamera. Die so erhaltenen Bilder wurden im TIF-Format in Adobe Photoshop Version CS3 importiert
und weiterverarbeitet. Dabei wurden die Embryonen freigestellt und ein gleichmäßiger Hintergrund
verwendet, um den Vergleich der Embryonen zu erleichtern. Helligkeit, Kontrast sowie Gradiationskurven
wurden teilweise nachbearbeitet, ohne jedoch dabei das Ergebnis der ISH zu verfälschen. Die Einteilung der
Embryonen in Kategorien erfolgte blind, ohne das Wissen über die jeweilige Behandlung der Embryonen.
Zur Anfertigung einer Abbildung wurden die einzelnen Bilder mittels Adobe Illustrator Version CS3 arrangiert
und beschriftet.
Statistische Analyse
Die statistische Analyse erfolgte mittels des 2x2-Felder Chi-Quadrat-Test (http://www.datenconsult.de/index.html; letzter Zugriff November 2013) oder wurde mittels des Mann-Whitney-U Test durch
ein statitisches Programm in R berechnet (R Development Core Team: http://www.r-project.org/).
Die Signifikanzlevels wurden angegeben mit: signifikant*: p<0.05; hoch signifikant**:p<0.01; Sehr hoch
signifikant***:p<0.001.
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126
Lebenslauf
Curriculum vitae
Persönliche Daten
Nachname:
Schneider
Vorname:
Isabelle Janina
Nationalität:
deutsch
Geburtstag und-ort:
29.11.1982, Stuttgart
Familienstand:
ledig
Schulische und universitäre Ausbildung
Seit 2008:
Doktorarbeit an der Universität Hohenheim
Institut für Zoologie, Prof. Dr. Martin Blum
2002-2008:
Studium der Biologie an der Universität Hohenheim
Hauptfach: Zoologie
1.Nebenfach: chemische Ökologie
2.Nebenfach: Tierphysiologie
Abschluss: Diplom, Note: 1,5
1993-2002:
Max-Born-Gymnasium Backnang
Abschluss: Abitur, Note: 2,5
Fähigkeiten
Technische Fähigkeiten:
DNA-/RNA-Präparation, PCR, Klonierung, in-situ-Hybridisierung,
Immunohistochemie, Mikrochirugie/ Transplantation (Xenopus),
Mikroinjektion (Xenopus), systemische Inkubationen (Xenopus) ,
konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie
Sprachkenntnisse:
Englisch
Französisch
IT- Kenntnisse:
MS-Office XP (Word, Excel, PowerPoint),
Adobe Photoshop, Adobe Illustrator,
AxioVision, Image J, Programmiersprache R
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Lebenslauf
Wissenschaftlichen Konferenzen & Weiterbildung
„International Joint Meeting of German Society for Cell Biology and Society for
Developmental Biology”
Heidelberg, 20.03.-23.03.2013
„Cell Biology shapes the Embryo”, 13th DGZ Young Scientist Meeting“
Jena, 20.09.-22.09.2012
„14th International Xenopus Conference”
Giens Peninsula, Frankreich, 09.09.-13.09.2012
„Cell and developmental biology of Xenopus”
Cold Spring Harbor, Vereinigte Staaten, 09.04.-20.04.2010
„German-Italian Xenopus Meeting”
Villa Vigoni, Italien, 26.10.-29.10.2009
„18. Wissenschaftliche Tagung der Gesellschaft für Entwicklungsbiologie“
Hannover, 25.03.-28.03.2008
Publikationen
Walentek, P., Schneider, I., Schweickert, A., Blum, M., 2013. Wnt11b Is Involved In Cilia- Mediated
Symmetry Breakage During Xenopus Left Right Development. PLoS ONE 8, e73646.
Beyer, T., Danilchik, M., Thumberger, T., Vick, P., Tisler, M., Schneider, I., Bogusch, S., Andre, P.,
Ulmer, B., Walentek, P., Niesler, B., Blum, M., Schweickert, A., 2012. Serotonin signaling is
required for Wnt-dependent GRP specification and leftward flow in Xenopus. Current biology:
CB 22, 33–9.
Schweickert, A., Vick, P., Getwan, M., Weber, T., Schneider, I., Eberhardt, M., Beyer, T., Pachur,
A., Blum, M., 2010. The nodal inhibitor coco is a critical target of leftward flow in Xenopus.
Current biology: CB 20, 738–43.
128
Danksagung
Meinem Doktorvater Prof. Dr. Martin Blum möchte ich an allererster Stelle danken: für die
Überlassung dieses interessanten Themas, seine Begeisterungsfähigkeit, die Möglichkeit während
meiner Doktorarbeit an Konferenzen teilzunehmen, seine Unterstützung bei der Erstellung dieser
Arbeit und den Freiraum beim Forschen.
Prof. Dr. Breer möchte ich für die Bereitschaft zur Begutachtung dieser Arbeit danken.
Prof. Doz. Dr. Axel Schweickert möchte ich sehr herzlich für seine unablässige Hilfsbereitschaft,
seine wertvolle Kritik und seine stützende Funktion im Labor danken.
Ausdrücklich möchte ich mich bei Bärbel Ulmer und Peter Walentek bedanken. Für die
anregenden Diskussionen, die wertvollen Ratschläge, die tolle Hilfe und die schöne Zeit, die mir
immer in Erinnerung bleiben wird.
Bärbel Ulmer gilt mein größter Dank. Sie hat mich von Anfang an begleitet, bestärkt und ich danke
ihr für ihre beständige Bereitschaft zu konstruktiver Kritik aber vor allem für ihre Freundschaft.
Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei allen aktuellen und ehemaligen Kollegen. Für die
nette Atmosphäre und die schöne Zeit im oder auch außerhalb des Labors. Tina Beyer danke ich
darüber hinaus, für die Vielzahl an Dingen, die ich von ihr lernen konnte und ihre umfassende und
freundschaftliche Unterstützung. Thomas Thumberger danke ich für seine Hilfe bei technischen
Fragen und seine große Unterstützung bei der Analyse des „flows“. Anja Bühler, Anna Iwanska
und Anna Schäfer möchte ich überdies für ihre Hilfsbereitschaft danken. Besonders bedanken
möchte ich mich auch bei Silke Schmalholz und Susanne Bogusch für ihre aufbauende Art und
ihre fabelhafte Hilfe. Bei Kerstin Feistel möchte ich mich zudem für ihren fachlichen Rat bedanken.
Ein großer Dank geht außerdem an Paul Brekner, Norbert Kretschmer, Dennis Shcherbakov, Silke
Schmalholz und Annegret Bäuerle für die Hilfe im Tierhaus, die technische Unterstützung oder den
administrativen Beitrag. Danke auch an all denjenigen, die mir auf vielfältige Weise zur Seite
gestanden sind.
Nicht zu vergessen meine Freunde: herzlich und großen Dank für den jahrelangen Rückhalt und
für die erholsamen Stunden, insbesondere an Franziska Eisenbeiss.
Meinen Eltern danke ich zutiefst, dass sie immer für mich da sind. Ebenso meinen Geschwistern
Ines, Ivonne, Jasmin und Marius, die mir unglaublich den Rücken gestärkt haben und auf die ich
mich immer verlassen kann. Danke für Alles
Zuletzt danke ich Sven und dem Frosch für ihre Gesellschaft. An Sven ein besonders großes und
herzliches Dankeschön für seine Fürsorge, Geduld, Aufmerksamkeit und seine beruhigende Art,
die mir vieles einfacher gemacht hat.
129
Eidesstattliche Versicherung gemäß § 7 Absatz 7 der Promotionsordnung der
Universität Hohenheim zum Dr. rer. nat.
1. Bei der eingereichten Dissertation zum Thema
“Multiple Funktionen des FGF-Signalwegs regulieren die Lateralitätsentwicklung
im Krallenfrosch Xenopus „
handelt es sich um meine eigenständig erbrachte Leistung.
2. Ich habe nur die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt und mich keiner
unzulässigen Hilfe Dritter bedient. Insbesondere habe ich wörtlich oder sinngemäß
aus anderen Werken übernommene Inhalte als solche kenntlich gemacht.
3. Ich habe nicht die Hilfe einer kommerziellen Promotionsvermittlung oder
-beratung in Anspruch genommen.
4. Die Bedeutung der eidesstattlichen Versicherung und der strafrechtlichen Folgen
einer unrichtigen oder unvollständigen eidesstattlichen Versicherung sind mir
bekannt.
Die Richtigkeit der vorstehenden Erklärung bestätige ich: Ich versichere an Eides
Statt, dass ich nach bestem Wissen die reine Wahrheit erklärt und nichts
verschwiegen habe.
Stuttgart, den 02.12.2013