Untersuchungen zur Intein-vermittelten Semisynthese modifizierter
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Untersuchungen zur Intein-vermittelten Semisynthese modifizierter Proteine Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt an der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Angela Pöhlmann geb. am 11.05.1977 in Gera (Thüringen) Gutachter: 1. Prof. Dr. F. Bordusa 2. Prof. Dr. N. Sewald Tag der Verteidigung: 30.11.2006 urn:nbn:de:gbv:3-000011195 [http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv%3A3-000011195] INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung und Zielstellung 1 1.1 Einleitung 1 1.2 Zielstellung 4 2 Theoretischer Teil 7 2.1 Synthese modifizierter Proteine 7 2.2 Protease-katalysierte Peptidsynthese 18 2.3 Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen 26 2.3.1 Parvulin 10 - Prototyp der PPIase-Familie der Parvuline 30 3 Ergebnisse und Diskussion 33 3.1 Auswahl geeigneter Ligationsstellen 33 3.2 Synthese rekombinanter Parvulinfragment-Thioester mittels IMPACTTM- 35 CN-System 3.2.1 Synthese der Par63-Thioester 39 3.2.2 Synthese der Par43-Thioester 44 3.3 Initiale Modellreaktionen 48 3.3.1 V8-Protease-katalysierte Ligationsreaktionen 48 3.3.2 Trypsin D189K/K60E-katalysierte Ligationsreaktionen 51 3.3.3 Untersuchungen zur Stabilität der Parvulinfragment-Thioester 56 3.4 Synthese von Parvulin unter kinetischer Kontrolle der 63 Kondensationsreaktionen 3.4.1 Studien zur spontanen Parvulinsynthese 70 3.5 Synthese von Parvulin unter temporärem Schutz der Cystein-Thiol-Funktion 75 4 Zusammenfassung 89 5 Experimenteller Teil 93 5.1 Materialien 93 5.2 Untersuchungen zur Expression und Löslichkeit der Intein-Fusionsproteine 98 5.3 Bestimmung der Spalteffizienz von Thiolen 98 5.4 Präparation kompetenter E. coli Zellen 99 INHALTSVERZEICHNIS 99 5.5 Transformation von E. coli und S. cerevisiae 5.6 Reinigung von DNA 100 5.7 Enzymatische Modifikation von DNA 100 5.8 Polymerasekettenreaktion 100 5.9 Agarose-Gelelektrophorese 101 5.10 Synthese und Reinigung von Proteinen bzw. Proteinfragmenten 102 5.10.1 Intein-vermittelte Synthese und Reinigung rekombinanter Parvulinfragment- 102 Thioester 5.10.2 Chemische Synthese und Reinigung C-terminaler Peptide 104 5.10.3 Rekombinante Synthese und Reinigung von Trypsin D189K/K60E 106 5.11 Einfluß von Harnstoff auf Protease-katalysierte Hydrolysereaktionen 106 5.12 Ligationsreaktionen 107 5.12.1 Enzymatische Ligationsreaktionen 107 5.12.2 Native Chemical Ligation 108 5.13 Untersuchungen zur Stabilität der Parvulinfragment-Thioester 109 5.14 Einführung von Cystein-Schutzgruppen 110 5.15 Proteinanalytik 110 5.16 Bestimmung der PPIase-Aktivität 113 6 Literaturverzeichnis 115 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis A Ac Acm ACN AHPC Am Amp APS b B BAL BL-GSE Boc BSA Bzl Bz CBD CD Ce Cm CT Cyp Da DCM DIEA DMF DNA dNTP DTNB DTT E EA E. coli EDTA EEL EH EP EPL ES ESI ESR FCS FK506 FKBP Fmoc FRET GdmHCl Gp GST h H Absorption AcetylAcetamidomethylAcetonitril Alkylhydroperoxidreduktase 4-AmidinophenylAmpicillin Ammoniumpersulfat Harnstoffabhängigkeit der natürlich logarithmischen Spezifitätskonstanten Dns, Dansyl-, (5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonyl-) backbone amide Linker Glu-spezifische Endopeptidase aus Bacillus licheniformis tert-Butyloxycarbonylbovine serum albumin (Rinderserumalbumin) BenzylBenzoylChitin Binding Domain, Chitin-bindende Domäne aus Bacillus circulans Circulardichroismus CarboxyethylCarboxymethylC-terminal Cyclophilin Molekulargewicht in g mol-1 Dichlormethan Diisopropylethylamin N, N-Dimethylformamid Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonukleosidtriphosphat 5,5’-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) 1,4-Dithiothreitol Extinktion Acylenzym, Ac-E bzw. E-Ac Escherichia coli Ethylendiamintetraessigsäure Expressed Enzymatic Ligation Enzym Enzym-Produkt-Komplex Expressed Protein Ligation Enzym-Substrat-Komplex Electrospray Ionization, Elektrosprayionisation Electron Spin Resonance, Elektronenspinresonanz Fluorescence Correlation Spectroscopy, Fluoreszenz-KorrelationsSpektroskopie Tacrolimus FK506-bindendes Protein 9-FluorenylmethoxycarbonylFluorescence Resonance Energy Transfer, Fluoreszenz-Resonanz-EnergieTransfer Guanidiniumhydrochlorid 4-GuanidinophenylGlutathion-S-Transferase human Harnstoff ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS HATU HEPES HIV HN HPLC Ht31 HX IgG IMPACT Intens. IPTG k K kkat kkat/KM KM LB MALDI-ToF MBP MD Me MeOH MESNA MOPS Mth RIR1 Intein Mxe GyrA Intein m/z NCL NMR nonsense Codon NPY NT NTB OD600 p PAGE Pam Par10 PCR PEG pH PhOH PMSF pNA PPIase PR PyBOP RNA RNase RP rpm Rt N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazol [4,5-b]pyridin-1-ylmethylen]-Nmethylmethanaminiumhexafluorphosphat-N-Oxid 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure Human Immunodeficiency Virus, humaner Immunschwäche-Virus Nukleophil bzw. Acylakzeptor High Performance Liquid Chromatography, Hochleistungs-FlüssigkeitsChromatographie protein kinase A anchoring protein Esterabgangsgruppe Immunglobulin G Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag relative oder absolute Intensität Isopropyl-ß-D-thiogalaktopyranosid Geschwindigkeitskonstante Gleichgewichtskonstante Katalysekonstante Spezifitätskonstante Michaelis-Menten-Konstante Luria Broth Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight; Matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionisation Maltose-bindendes Protein Massedifferenz MethylMethanol Mercaptoethansulfonsäure 3-(N-Morpholin)-propansulfonsäure Intein der Ribonucleoside-diphosphate-reductase, α-subunit (RIR) aus Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth) Intein der DNA gyrase subunit A (GyrA) aus Mycobacterium xenopi (Mxe) Verhältnis von Molekülmasse zu Ionenladung Native Chemical Ligation, Natürlich Chemische Ligation Nuclear Magnetic Resonance, Kernspinresonanz Stop Codon Neuropeptid Y N-terminal 2-Nitro-5-thiobenzoesäure optische Dichte, gemessen bei 600 nm phosphoryliert Polyacrylamidgelelektrophorese 4-HydroxymethylphenylacetamidomethylParvulin (10,1 kDa Protein) aus Escherichia coli Polymerasekettenreaktion Polyethylenglykol pH-Wert 4-HydroxyphenylPhenylmethylsulfonylfluorid 4-Nitroanilid Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase Protease Benzotriazol-1-yloxytri(pyrrolidin)phosphoniumhexafluorphosphat Ribonukleinsäure Ribonuklease Reversed Phase Umdrehungen pro Minute Retentionszeit ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS S S. cerevisiae Sce VMA1 Intein SDS Se SPI SPPS Suc t tBu TCEP TEMED TFA THF TI TIS Tricin tRNA Trt TS U UV v Vis V8-Protease Wang X Xa XB Xaa, Yaa YB Z Substrat Saccharomyces cerevisiae Intein der vacuolar ATPase subunit (VMA) aus Saccharomyces cerevisiae (Sce) Natriumdodecylsulfat SulfonylethylSelective Pressure Incorporation Solid Phase Peptide Synthesis, Festphasenpeptidsynthese SuccinylReaktionszeit tert-ButylTris-(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Trifluoressigsäure Tetrahydrofuran tetrahedrales Intermediat Triisopropylsilan N-[Tris(hydroxymethyl)-aminomethan transfer-RNA TritylThioglykolsäure Unit Ultraviolett Reaktionsgeschwindigkeit visible, sichtbar Glu-spezifische Endopeptidase aus Staphylococcus aureus Stamm V8 p-Alkoxybenzyl-Harz Nal, ß-(2-Naphthyl)-L-alanin Blutgerinnungsfaktor Xa, Alphaglobulin Mxe GyrA Intein-CBD individuelle Aminosäuren Sce VMA1 Intein-CBD Benzyloxycarbonyl- Aminosäuren wurden nach dem Ein- bzw. Dreibuchstaben-Code entsprechend UPAC-IUBKommission für biochemische Nomenklatur abgekürzt.
