Photodynamische Inaktivierung von Bakterien

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Singulett-Sauerstoff
Photodynamische Inaktivierung von Bakterien
TIM MAISCH
KLINIK UND POLIKLINIK FÜR DERMATOLOGIE DER UNIVERSITÄT REGENSBURG
Die zunehmende weltweite Antibiotika-Resistenz bei der Behandlung von
bakteriellen Infektionen macht alternative Verfahren notwendig. Die
Grundlage eines dieser neuen Verfahren ist die photodynamische Inaktivierung von Bakterien durch reaktive Sauerstoffspezies, vor allem Singulett-Sauerstoff.
ó Grundlage der photodynamischen Inaktivierung von Bakterien ist die Generierung
von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch
einen in Bakterien lokalisierten Photosensibilisator (PS), der durch Licht entsprechender Wellenlänge angeregt wird, in Anwesenheit von Sauerstoff (Abb. 1). Dabei kann man
zwischen zwei photooxidativen Prozessen
unterscheiden[1]: Bei der Typ-I-Reaktion entstehen Radikale, die mit Sauerstoff reagieren
und Oxidationsprodukte bilden. Die Richtung
des Elektronentransfers wird durch das
Redoxpotenzial zwischen PS und Substrat
bestimmt. Bei der Typ-II-Reaktion erfolgt der
Energieübertrag des angeregten PS direkt auf
Sauerstoff. Dabei entsteht der hochreaktive
Singulett-Sauerstoff (1O2), der mit entsprechenden Zielstrukturen in seiner nächsten
Umgebung reagiert. Bei beiden Reaktionen
steht die Photooxidation von Biomolekülen,
die sich in direkter Nachbarschaft zu den ROS
befinden, im Vordergrund. Die Typ-II-Reaktion und damit der 1O2-Sauerstoff spielt die
entscheidende Rolle bei der photodynami-
˚ Abb. 1: Energieschema zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Nach Lichtabsorption
gelangt der Photosensibilisator (PS) von einem Grundzustand S0 in einen angeregten SingulettZustand S1. Der angeregte S1-Zustand kann die Energie als Wärme und als Fluoreszenz wieder
abgeben. Zusätzlich ist die Relaxation in einen Triplett-Zustand (T1) möglich. Bei der Typ-I-Reaktion
kommt es zu einem Ladungstransfer zwischen einem angeregten PS im T1-Zustand und einem
Substratmolekül, wobei ein Elektron oder ein Wasserstoffatom übertragen wird. Es entstehen
Superoxidanionen-Radikale (O2.-) oder Hydroxylradikale (OH.). Bei der Typ-II-Reaktion findet ein
direkter Energieübertrag vom angeregten PS auf Sauerstoff statt. Dies führt zur Relaxation des
PS, aber auch zur elektronischen Sauerstoff-Anregung im Grundzustand (O2(3∑g-), TriplettZustand) in den niedrigsten Singulett-1Δg-Zustand. Dieser sehr reaktive Singulett-1Δg-Zustand wird
auch als 1O2-Sauerstoff bezeichnet.
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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
˚ Abb. 3: Lumineszenznachweis von 1O2Sauerstoff. A, Lumineszenzsignal bei verschiedenen Wellenlängen mit Intensitätsspitze bei 1270 nm. B, typische Abklingrate
von 1O2-Sauerstoff innerhalb von Bakterien
nach Inkubation mit PS und Bestrahlung.
˚ Abb. 2: Experimenteller Aufbau. Bakterien (S. aureus) werden mit PS (Photofrin) inkubiert, in
eine Küvette gefüllt und mit Laserlicht bestrahlt (532 nm, Ring). Detektion von 1O2 erfolgt mit
einem Photomultiplier und entsprechender Computerauswertung.
schen Inaktivierung von Bakterien. So können verschiedene positiv geladene PS aus der
chemischen Gruppe der Phenothiazine,
Phthalozyanine oder Porphyrine erfolgreich
zur Inaktivierung sowohl von multi-resistenten Gram-positiven als auch Gram-negativen
Bakterien eingesetzt werden (Tab. 1)[2, 3].
Nachweis von 1O2-Sauerstoff
Zum Nachweis von 1O2-Sauerstoff kann entweder der strahlungslose Übergang (indirekter Nachweis) oder der strahlende Übergang
(direkter Nachweis) bei der Rückkehr in den
Grundzustand verwendet werden. Der indirekte Nachweis verwendet „Quencher“, die
chemisch und photophysikalisch durch 1O2Sauerstoff auf eine möglichst eindeutige Weise
verändert werden. Der größte Nachteil der
indirekten Nachweisverfahren besteht darin,
dass sie nur dann erfolgreich sein können,
wenn die Quencher rechtzeitig an den Ort der
Entstehung des 1O2-Sauerstoffs gelangen.
Beim direkten Nachweis wird der Übergang von 1O2-Sauerstoff in seinen Grundzustand unter Abgabe eines Lumineszenzphotons mit einer Wellenlänge von 1270 nm
gemessen (Abb. 1, 2). Das Signal wird in der
Regel mittels Einzelphotonenzählung bei 1270
nm detektiert (Abb. 2). Auf diese Weise wurde die Bildung von 1O2-Sauerstoff in mit Bengalrosa inkubierten Keratinozyten[4] oder bei
der photodynamischen Inaktivierung von
Bakterien nach Bestrahlung mit sichtbarem
Licht detektiert[5] (Abb. 3). Die zeitaufgelös-
te Messung der Lumineszenz erlaubt die
Bestimmung der Abklingdauer von 1O2-Sauerstoff. So konnte die Abklingdauer von 1O2Sauerstoff in Wasser von 3,5 μs, in wässrigen
Lipidsuspensionen des Phosphatidylcholins
von 10 μs, in reinem Phosphatidylcholin von
14 μs, in Zellen von 9 μs und in Bakterien von
6 μs bestimmt werden[5, 6]. In Zellen und Bakterien ergeben sich unterschiedliche Zeiten,
je nach der subzellulären Lokalisation des
jeweiligen Photosensibilisators[6].
Einfluss von 1O2 und der Sauerstoffkonzentration
Die Effizienz der 1O2-Sauerstoffbildung ist
stark vom vorherrschenden Sauerstoffpartialdruck abhängig. Somit führt die Erzeugung
Photoreaktive Substanzen: kationische Phenothiazine, Phthalocyanine, Porphyrin-Derivate
Parameter
Bedingungen
Anmerkung
geeignet für Klinische Anwendung
PS-Konzentrationen / Inkubationszeiten
0,1–5 μM
5–30 min
• mehrmals wiederholbar
• bisher keine Resistenzen beobachtet
✓
Applizierte Lichtdosis
< 20 J/cm2
• Bestrahlung dauert wenige Minuten
✓
Applikationsform
topisch
• Pharmakokinetik der Salbengrundlage
entscheidend
✓
Toxizität
> 99,999 %
• Reduktion der Koloniebildenden
Einheiten [KBE/ml]
• vergleichbar mit der Effektivität eines
Desinfektionsmittels
• Nosokomiale Dekolonisierung von MRSA
• Wundinfektionen
• Aknebehandlung
Tab. 1: Übersicht Photodynamische Inaktivierung von Bakterien
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von 1O2-Sauerstoff und die nachfolgende oxidative Schädigung der Bakterien lokal zu
einem Sauerstoffverbrauch (1O2-SauerstoffErzeugung = Sauerstoffverbrauch durch Oxidationsvorgänge). Die 1O2-Erzeugung ist ein
selbstlimitierender Prozess, da Sauerstoff
durch oxidative Prozesse mit dem Ziel der
Inaktivierung von Pathogenen verbraucht
wird (Abb. 4).
Unserer Arbeitsgruppe ist es gelungen, das
Ratenverhältnis der 1O2-Sauerstoff-Lumineszenz als Indikator für den aktuellen Sauerstoffpartialdruck innerhalb lebender Bakterien einzusetzen. Denn die entstehende Lumineszenz-Leistung bei 1270 nm wird als proportional zur momentanen 1O2-SauerstoffKonzentration angenommen[5]. Dies ist von
besonderer Bedeutung, um eine Abschätzung
der lokalen Sauerstoffkonzentration bei der
Generierung von 1O2-Sauerstoff direkt innerhalb von Bakterien zu erhalten (viele Bakterien : wenig/viel Sauerstoff vs. wenige Bakterien : wenig/viel Sauerstoff). Diese Erkenntnisse sind wichtig, um eine erfolgreiche Inaktivierung von Bakterien zu erzielen. Denn bei
bakteriellen Infektionen liegen die Keime als
Agglomerate/Biofilme unterschiedlicher Konzentrationen vor und sind auch einem unterschiedlichen Sauerstoffpartialdruck ausgesetzt, der die Generierung von 1O2-Sauerstoff
und somit auch das Ausmaß der oxidativen
Schädigung (Inaktivierung von Bakterien)
beeinflussen kann (Abb. 5). So konnte in
Abhängigkeit von der Bakteriendichte eine
effiziente Reduktion der Keimzahl nicht
erreicht werden, was auf eine unzureichende
Sauerstoffversorgung oder zu geringe Bildung
von 1O2-Sauerstoff zurückzuführen ist[5, 7].
Daher könnte eine fraktionierte Bestrahlung
eine effizientere Reduktion der Keimzahl
bewirken, da in den Bestrahlungspausen der
Sauerstoffverbrauch wieder kompensiert
werden könnte und somit eine optimale
Generierung von 1O2-Sauerstoff gewährleistet
ist.
ó
˚ Abb. 4: Messung des Sauerstoffgehaltes in Bakterienlösung. Der Sauerstoffverbrauch wurde
vor, während und nach der Bestrahlung bei unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen gemessen. Die geraden Linien zeigen den Sauerstoffverbrauch nach Ausschalten des Laserlichts, nach
Detektion der 1O2-Lumineszenz (graue Säule), die gestrichelten Linien zeigen den zunehmenden
Sauerstoffverbrauch in Abhängigkeit von der Bakterienkonzentration bei kontinuierlicher Bestrahlung (blau: einzelne Bakterien, rot: Agglomerate).
˚ Abb. 5: Abklingrate der Lumineszenzsignale von 1O2-Sauerstoff. Die Abklingraten der Lumineszenzsignale von 1O2-Sauerstoff sind abhängig von der Bakterienkonzentration. Der Nachweis der
Lumineszenz von 1O2-Sauerstoff kann als Sensor zur intrazellulären Sauerstoffkonzentration verwendet werden. Dies ist wichtig, da der Sauerstoffgehalt ein essenzieller Faktor ist, der die Effizienz der antibakteriellen photodynamischen Therapie maßgeblich beeinflusst, vor allem, wenn
Bakterien als Biofilm ohne ausreichende Sauerstoffversorgung wachsen.
Literatur
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Photochem. Photobiol. Sci. 3: 907–917.
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Photochem. Photobiol. 68: 675–678.
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[5] Maisch, T., Baier, J., Franz, B., Maier, M., Landthaler, M.,
Szeimies, R. M., Bäumler, W. (2007): The role of singlet oxygen and oxygen concentration in photodynamic inactivation
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[6] Baier, J., Maier, M., Engl, R., Landthaler, M., Bäumler, W.
(2005): Time-resolved investigations of singlet oxygen luminescence in water, in phosphatidylcholine, and in aqueous
suspensions of phosphatidylcholine or HT29 cells. J. Phys.
Chem. B 109: 3041–3046.
[7] Demidova, T. N., Hamblin, M. R. (2005): Effect of cellphotosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 2329–2335.
Korrespondenzadresse:
Dr. rer. nat. Tim Maisch
Klinik und Poliklinik für
Dermatologie
Universität Regensburg
Franz-Josef-Strauss-Allee 11
D-93053 Regensburg
Tel.: 0941-944 8944
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