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Research Collection Doctoral Thesis Transcriptional regulation and epigenetic control of human TH17 effector function Author(s): Aschenbrenner, Dominik Publication Date: 2015 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-010534886 Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library ISS. ETH NO. 22821 Transcriptional regulation and epigenetic control of human TH17 effector function A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by Dominik Aschenbrenner Mag. rer. nat. University of Vienna, Austria born on 27.06.1983 Vienna, Austria accepted on the recommendation of Prof. Dr. Antonio Lanzavecchia (examiner) Dr. Federica Sallusto (co-examiner) Prof. Dr. Manfred Kopf (co-examiner) Zürich, 2015 Summary - Zusammenfassung 1. Summary TH17 cells represent a distinct subset of CD4+ T helper (TH) cells, characterized by the capability to produce the effector cytokines IL-17A and IL-17F, and that is involved in the immune response against extracellular bacteria and fungi. Besides their crucial role in host defense, TH17 cells have been implicated in autoimmune and chronic inflammatory conditions such as multiple sclerosis (MS), inflammatory bowel diseases (IBD), rheumatoid arthritis (RA), and psoriasis. Groundbreaking studies in the murine model have demonstrated that these cells differentiate in vitro from naïve CD4+ T cell precursors in presence of the cytokines IL-6, TGF-β and IL-23. In humans, TH17 cells have been demonstrated to develop in dependence of a cytokine milieu containing IL-6, IL-1β and IL-23 while TGF-β1 plays an enhancing or inhibitory role in the establishment of this TH phenotype in a concentration-dependent manner. RORγt is considered the lineage specifying transcription factor of TH17 cells. However, efficient differentiation requires combined action and cooperation of several transcription factors including RORα, BATF, IRF4, AHR and c-MAF. In disease settings, two distinct types of TH17 cells have been characterized in mice and humans based on the range of effector cytokine production and the ability to induce disease. While autoreactive TH17 cells that were differentiated in the presence of IL-6, TGF-β and IL-23 were pathogenic in a mouse model of MS, TH17 cells differentiated in the presence of IL-6 and TGF-β were not. Pathogenic TH17 produced IL-17 together with IFN-γ, while non-pathogenic TH17 cells produced IL-17 and the immunoregulatory cytokine IL-10. In addition, each of these phenotypes was associated with a unique gene expression profile. In humans, TH17 cells producing IL-17 and IFN-γ have been found expanded in patients with autoimmune reactions or chronic inflammation. In healthy donors, two types of TH17 cells have been identified that differ for the pattern of cytokines produced and the antigen recognized. Candida albicans-specific TH17 cells co-produced IL-17 and IFN-γ, but not IL-10, while Staphylococcus aureus-specific TH17 cells produced IL-17 without IFN-γ, but held the ability to produce IL-10. In vitro experiments suggested that the difference in TH17 cell phenotypes was imprinted at the time of priming and to depend on the presence of the pro-inflammtory cytokine IL-1β. Indeed, IL-1β was produced in high amounts by monocytes exposed to Candida albicans but not Staphylococcus aureus. These results identify IL-1β as a driving factor for the development of TH17 cells that lack a self-regulatory, anti-inflammatory mechanism. Starting from these findings from our laboratory, my PhD work addressed questions related to the molecular mechanisms that 7 Summary - Zusammenfassung regulate cytokine-gene expression in different types of human memory TH17 cells. First we show that upon stimulation, most TH17 cells transiently downregulated their ability for IL-17 production while a specific subset of TH17 cells, including Staphylococcus aureus-reactive TH17 cells, reciprocally upregulated IL-10 production. The downregulation of IL-17 was dependent on interleukin-2 (IL-2), which induced STAT5 phosphorylation, which competed with STAT3 for binding to the IL17A locus, resulting in downregulation of IL17A transcription. Further, IL-2-induced STAT5 phosphorylation resulted in decreased RORγt transcription and expression, demonstrating a new function for IL-2 in regulating inflammatory TH17 responses. We further show, that IL-17producing T cells could be recovered from highly enriched IL-10+IL-17– T cells sorted from peripheral blood and inflamed tissue of juvenile idiopathic arthritis (JIA) patients, indicating that the switch from IL-17 to IL-10 production in TH17 cells occurs in vivo. To further characterize IL-10-producing (IL-10+), and non-IL-10-producing (IL-10–) human memory TH17 cells, we performed a wide gene expression analysis and found that, IL-10+ TH17 cells express a distinct gene expression profile compared to IL-10– TH17 cells, indicating that these two cell types are fundamentally different. While IL-10+ TH17 cells expressed a broad range of anti-inflammatory molecules upon activation, IL-10– TH17 cells were characterized by a pro-inflammatory gene signature. We further identified the transcription factor c-MAF to be differentially expressed between these two types of TH17 cells, being highly expressed in activated IL-10+ TH17 cells. We found that c-MAF was essential for IL-10 production in human memory TH17 cells and directly bound to the IL10 locus. In addition, c-MAF directly bound to anti- and pro-inflammatory target gene loci in IL-10+ TH17 cells, where it enhanced antiinflammatory gene expression while, at the same time, suppressed expression of proinflammatory target genes, with a broad impact on the IL-10+ TH17 gene signature. Taken together these results demonstrate that high expression of the transcription factor c-MAF upon TH17 activation is a discriminating factor between two phenotypes of memory TH17 cells that are fundamentally different in the range of pro- and antiinflammatory gene expression and functions based on effector cytokine production. 8 Summary - Zusammenfassung Zusammenfassung TH17 Zellen repräsentieren eine eigenständige Klasse von CD4+ T Helfer Zellen (TH), werden aufgrund der charakteristischen Produktion von IL-17A und IL-17F von anderen TH Zellen unterscheiden und spielen eine entscheidende Rolle in der Immunantwort gegen Pilzinfektionen und Infektionen durch extrazelluläre Bakterien. Neben ihrer zentralen Rolle in der Immunabwehr des Wirtsorganismus stehen Immunantworten durch TH17 Zellen in direktem Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen und chronischen inflammatorischen Erkrankungen wie zum Beispiel Multiple Sklerose (MS), chronische entzündliche Darmerkrankungen (CED; IBD), Rheumatoide Arthritis (RA), und Psoriasis. Bahnbrechende Studien am Mausmodell haben gezeigt, dass diese Zellen in vitro von naiven CD4+ T Zellen in der Gegenwart der Zytokine IL-6, TGF-β, und IL-23 differenzieren. Im Menschen entwickeln sich diese Zellen in einem Zytokinmilieu welches IL-6, IL-1β und IL-23 enthält, wobei TGF-β, in Abhängigkeit der Konzentration, eine fördernde oder inhibierende Wirkung auf die Entwicklung von TH17 Zellen ausübt. RORγt wir als jener Transkriptionsfaktor betrachtet, welcher die Linie der TH17 Zellen spezifiziert. Allerdings benötigt die effiziente Differenzierung von TH17 Zellen das kombinatorische und kooperative Wirken mehrerer Transkriptionsfaktoren: RORα, BATF, IRF4, AHR und c-MAF. Unter Krankheitsbedingungen, in Mäusen und Menschen, wurden aufgrund der Bandbreite an produzierten Effektorzytokinen, und der Fähigkeit Krankheit auszulösen, zwei unterschiedliche Arten von TH17 Zellen charakterisiert. Während autoreaktive TH17 Zellen, welche unter IL-6, TGF-β und IL-23 enthaltenden Bedingungen differenziert wurden, Krankheit in einem Mausmodell für MS verursachen, lösen TH17 Zellen, welche unter IL-6 und TGF-β enthaltenden Bedingungen differenziert wurden keine Krankheitssymptome aus. Krankheit induzierende, pathogene, TH17 Zellen produzierten IL-17 gemeinsam mit IFN-γ, während jene T H17 Zellen die keine Krankheit auslösten, demnach nicht-pathogene TH17 Zellen, IL-17 und das immunregulatorische Zytokin IL10 produzierten. Des weiteren, wurden beide dieser Phänotypen mit einzigartigen Genexpressionsprofilen assoziiert. Im Menschen wurden TH17 Zellen welche IL-17 und IFN-γ produzieren vermehrt in Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder chronischen inflammatorischen Erkrankungen nachgewiesen. In gesunden Spendern wurden zwei Arten von TH17 Zellen identifiziert, welche sich in ihren Mustern der Zytokinproducktion und der Antigenspezifität unterscheiden. Candida albicans-spezifische TH17 Zellen produzieren IL-17 und IFN-γ, aber nicht IL-10, während Staphylococcus aureus-spezifische TH17 9 Summary - Zusammenfassung Zellen IL-17 ohne IFN-γ produzieren, aber die Fähigkeit besitzen IL -10 zu produzieren. In vitro Experimente haben gezeigt, dass der Unterschied zwischen diesen beiden Phänotypen von TH17 Zellen, während des „Primings“ in Abhängigkeit der Anwesenheit des entzündungsfördernden Zytokins IL-1β geprägt wird. Tatsächlich wurde IL -1β in großen Mengen von Monozyten produziert welche mit Candida albicans in Kontakt kamen, während dies für Staphylococcus aureus nicht der Fall war. Diese Resultate identifizieren IL-1β als einen treibenden Faktorürf die Entstehung von TH17 Zellen, welchen selbst-regulatorische und entzündungshemmende Mechanismen fehlen. Ausgehend von diesen Erkenntnissen aus unserem Labor, habe ich mich während meiner Doktorarbeit mit den molekularen Mechanismen der Genexpression in unterschiedlichen Arten humaner TH17 Zellen beschäftigt. Hier zeigen wir, dass TH17 Zellen nach Stimulierung ihre Fähigkeit für die Produktion von IL-17 herab regulieren, während eine spezifische Gruppe von TH17 Zellen, welche Staphylococcus aureusspezifische TH17 Zellen miteinschließt, in reziproker Weise IL-10 Produktion hoch regulieren. Die Herabregulation der IL-17 Produktion war abhängig von IL-2-induzierter STAT5 Phosphorylierung, und der kompetitiven Bindung von STAT5 und STAT3 an den IL17A locus. Zusätzlich, resultierte IL-2-induzierte STAT5 Phosphorylierung in verringerter RORγt Transkription und Expression. Diese Ergebnisse enthüllen eine neue Eigenschaft von IL-2 in der Regulation von inflammatorischen TH17 Immunantworten. Des weiteren zeigen wir, dass IL-17-produzierende T Zellen aus hoch angereicherten IL10+IL-17– T Zellen aus peripherem Blut oder entzündetem Gewebe von Patienten mit juveniler idiopathischer Arthritis (JIA) zurückgewonnen werden können. Diese Ergebnisse unterstützen die Existenz eines Wechsels von IL-17 zu IL-10 Produktion in TH17 Zellen in vivo. Um IL-10 produzierende (IL-10+) und nicht-IL-10 produzierende (IL-10–) TH17 Zellen weiter zu charakterisieren führten wir eine genomweite Genexpressionsanalyse durch. Die Resultate zeigten weitreichende Unterschiede in den Genexpressionsprofilen von IL10+ und IL-10– TH17 Zellen. Dies deutet auf grundlegende Unterschiede zwischen diesen zwei Arten von TH17 Zellen hin. Interessanterweise zeichneten sich IL-10+ TH17 Zellen durch ein weitreichend entzündungshemmendes Genexpressionsprofil aus, während IL10– TH17 Zellen charakteristischerweise ein entzündungsförderndes Genexpressionsprofil aufwiesen. Wir identifizierten c-MAF als einen differenziell exprimierten Transkriptionsfaktor in diesen zwei Arten von TH17 Zellen, wobei, im speziellen, aktivierte IL-10+ TH17 Zellen eine hohe Expression diese Faktors aufweisen. Wir zeigen, dass c-MAF ein essentieller 10 Summary - Zusammenfassung Faktor für die Expression von IL-10 in humanen TH17 Gedächtniszellen ist und direkt an den IL10 Lokus bindet. Zusätzlich bindet c-MAF direkt an antiinflammatorische und proinflammatorische Loci in IL-10+ TH17 Zellen, wodurch die Expression von entzündungshemmenden Zielgenen gefördert, aber jene von entzündungsfördernden Zielgenen unterdrückt, und somit das Genexpressionsprofil auf breiter Ebene beeinflusst wird. Im Gesamten zeigen diese Resultate, dass die hohe Expression des Transkriptionsfaktors c-MAF in aktivierten TH17 Zellen, ein diskriminierender Faktor zwischen zwei Phänotypen von humanen TH17 Gedächtniszellen darstellt, welche sich fundamental in ihrer Banderbreite der proinflammatorischen und antiinflammatorischen Genexpression unterscheiden. Des weiteren, basierend auf dem Umfang der Zytokinproduktion, unterscheiden sich diese beiden Phänotypen grundlegend in ihrer Funktion. 11
