Mechanismen der GBV-C vermittelten Hemmung der HIV

Mechanismen der GBV-C vermittelten
Hemmung der HIV-1 Replikation
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Dipl. - Biochem. Kristin Eißmann
aus Zeulenroda
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
16.04.2013
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Johannes Barth
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Robert Slany
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1.
Zusammenfassung .......................................................................................................................... 1
2.
Summary ......................................................................................................................................... 2
3.
Einleitung ......................................................................................................................................... 3
3.1.
Die Interferenz des GB Virus C (GBV-C) mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) ... 3
3.2.
Epidemiologie und Klinik von GBV-C ..................................................................................... 5
3.3.
Taxonomie, Struktur und Replikation von GBV-C ................................................................. 6
3.4.
Epidemiologie und Klinik von HIV .......................................................................................... 8
3.5.
Struktur und Replikation von HIV ........................................................................................... 9
3.6.
Therapie von HIV-Infektionen .............................................................................................. 10
3.7.
Virale Entry-Mechanismen und Hüllproteine ........................................................................ 12
4.
Zielsetzung .................................................................................................................................... 16
5.
Materialien ..................................................................................................................................... 17
6.
7.
5.1.
Organismen .......................................................................................................................... 17
5.2.
Plasmide............................................................................................................................... 18
5.3.
Proteine ................................................................................................................................ 20
5.4.
Peptide ................................................................................................................................. 20
5.5.
Antikörper ............................................................................................................................. 21
5.6.
HIV-Inhibitoren ..................................................................................................................... 22
5.7.
Kits ....................................................................................................................................... 22
5.8.
Medien.................................................................................................................................. 23
5.9.
Allgemeine Lösungen und Puffer ......................................................................................... 24
5.10.
Reagenzien und Verbrauchsmaterialien .............................................................................. 28
5.11.
Geräte .................................................................................................................................. 31
Methoden ....................................................................................................................................... 32
6.1.
Zellkultur ............................................................................................................................... 32
6.2.
HIV-Infektionen .................................................................................................................... 33
6.3.
Fusionsuntersuchungen ....................................................................................................... 34
6.4.
Transfektionsverfahren ........................................................................................................ 36
6.5.
Proteinbiochemische Methoden ........................................................................................... 37
6.6.
Immunologische Nachweismethoden .................................................................................. 38
6.7.
Bioinformatik ........................................................................................................................ 39
Ergebnisse ..................................................................................................................................... 40
7.1.
GBV-C Nichtstruktur-Proteine unterdrücken die HIV-1 Replikation ..................................... 40
7.2.
Das GBV-C Glykoprotein E2 inhibiert HIV-1 Entry .............................................................. 44
7.3.
E2-Peptide hemmen die HIV-1 Replikation im Infektionsassay........................................... 49
7.4.
N-terminale E2 Peptide inhibieren HIV-1 Entry.................................................................... 51
7.5.
E2-Peptide beeinflussen die späten Schritte des HIV-1 Entrys ........................................... 53
7.6.
E2-Peptide binden den HIV-1 gp41-Disulfid-Loop ............................................................... 58
7.7.
GBV-C E2 imitiert die gp41-interagierende Region des gp120-Glykoproteins .................... 66
I
Inhaltsverzeichnis
8.
9.
Diskussion ..................................................................................................................................... 71
8.1.
Interferenzmechanismen zwischen GBV-C und HIV-1 ........................................................ 71
8.2.
Hemmung der HIV-1 Fusion durch N-terminale GBV-C E2-Peptide ................................... 74
8.3.
E2-Peptide in der HIV-Therapie – Ein Ausblick ................................................................... 80
Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................................. 82
10. Literaturverzeichnis ....................................................................................................................... 86
11. Publikationen ................................................................................................................................. 98
12. Danksagung................................................................................................................................. 100
II
Zusammenfassung
1.
Zusammenfassung
Eine Koinfektion von HIV-Patienten mit dem nicht-pathogenen GB Virus C (GBV-C) äußert
sich durch deutlich bessere Überlebenschancen und eine verlangsamte Progression zu
AIDS. Frühere Studien zeigten einen deutlichen Einfluss des GBV-C E2-Glykoproteins sowie
des Nichtstruktur-Proteins (NS) 5A auf das HIV-Entry. In der vorliegenden Arbeit sollte
sowohl der Einfluss der GBV-C Nichtstruktur-Proteine auf die HIV-1 Replikation als auch der
HIV-inhibitorische Mechanismus des E2-Proteins untersucht werden. Im ersten Teil wurde
mit Hilfe des Tet-Off-Systems die Einwirkung der GBV-C Proteine NS3, NS4A und NS5A auf
die HIV-1 Replikation bestimmt. Dabei konnte die HIV-hemmende Wirkung von NS3
identifiziert und von NS5A bestätigt werden, wobei das NS4A-Protein keinen Einfluss auf die
HIV-1 Replikation zeigte. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte mit einem Virus-ZellFusionsassay eindeutig gezeigt werden, dass sowohl das GBV-C E2-Protein als auch vom
E2 N-Terminus abgeleitete Peptide (P4-7 und P6-2) den HIV-Eintritt in die Zielzelle
unterdrücken. Des Weiteren führten Infektionskinetiken und diverse Bindungsstudien zu der
Erkenntnis, dass hierbei späte Entry-Schritte nach der (Ko-)Rezeptorbindung, wie z.B. die
Fusion der Virus- mit der Zellmembran, beeinflusst werden. Infektionsassays und weitere
Bindungsstudien ließen erkennen, dass die E2-Peptide direkt mit HI-Virionen und hier
insbesondere
mit
den
gp120-gp41
HIV-Glykoproteinen
interagieren.
Weitere
Kompetitionsstudien sowie direkte Bindungsassays führten letztendlich zur Identifizierung
des Disulfid-Loops des HIV-1 gp41-Proteins als spezifischer Interaktionspartner des
E2-Proteins. Dabei erwiesen sich sowohl Cysteine im Disulfid-Loop als auch im E2
N-Terminus als essentiell. Unabhängig davon konnte durch bioinformatische Analysen eine
Sequenzähnlichkeit zwischen den N-Termini von HIV-1 gp120 und GBV-C E2 aufgedeckt
werden. Literaturrecherchen belegen, dass die N- und C-Termini von gp120 unter anderem
mit dem Disulfid-Loop von gp41 interagieren, um die dynamische nicht-kovalente Verbindung
zwischen gp120 und gp41 zu gewährleisten. Demzufolge kann geschlossen werden, dass
die N-terminalen E2-Peptide bzw. der N-Terminus des E2-Proteins den gp120 N-Terminus
von HIV-1 imitiert und somit in der Lage ist mit dem gp41-Disulfid-Loop zu interagieren.
Dadurch wird wahrscheinlich das gp120-gp41 Interface gestört und die Fusion der Virus- mit
der Zellmembran unterbunden. Struktur-Vorhersagen der E2-Ektodomäne lassen vermuten,
dass der E2 N-Terminus (AS 1-75) unstrukturiert vorliegt und somit flexibel genug ist den
Disulfid-Loop zu erreichen. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass
vom GBV-C E2-abgeleitete cysteinhaltige Peptide in der Lage sind den gp41-Disulfid-Loop
zu binden und die HIV-Fusion zu unterdrücken; diese Erkenntnis kann zur Entwicklung neuer
HIV-1 Entry-Inhibitoren beitragen.
1
Summary
2.
Summary
HIV-1 patients benefit from a coinfection with the non-pathogenic GB Virus C (GBV-C), since
HIV-positive individuals with long-term GBV-C viraemia show distinct better survival rates
and decelerated progression to AIDS. Former studies observed a significant impact of the
GBV-C E2 glycoprotein and the non-structural protein (NS) 5A on HIV entry. In the present
thesis the effect of GBV-C non-structural proteins on HIV-1 replication as well as the
inhibitory mechanism caused by the E2 protein was analyzed. In the first part the tet-off
system was used to study the influence of the GBV-C proteins NS3, NS4A and NS5A on
HIV-1 replication. Thereby, an HIV-inhibitory effect of NS5A and NS3 could be either
approved or identified, whereas the NS4A protein showed no influence on HIV replication. In
the second part of the thesis the inhibition of HIV-1 entry by the GBV-C E2 protein and
E2-derived N-terminal peptides (P4-7, P6-2) was clearly demonstrated using a virus-cellfusion assay. In addition infection kinetics and binding assays verified the impact on late
entry steps after coreceptor binding such as fusion of the virus with the cell membrane.
Further infection and binding assays led to the finding that E2 peptides interact directly with
the gp120-gp41 glycoproteins of the HI virions. Additional competitive and direct binding
assays identified the HIV-1 gp41 disulfide loop as the specific interaction partner of the E2
protein. For this interplay cysteine residues in the disulfide loop as well as in the E2
N-terminus are essential. Independently from these findings, a sequence similarity between
the N-termini of the HIV-1 gp120 and the GBV-C E2 proteins was detected by bioinformatical
analyses. It is believed that the gp120 N- and C-termini primarily interact with the gp41
disulfide loop to allow the dynamic and non-covalent binding of gp120 and gp41.
Accordingly, we propose that N-terminal E2 peptides or the E2 N-terminus, respectively, may
mimic the HIV-1 gp120 N-terminus which may enable the interaction with the gp41 disulfide
loop. Possibly, this may lead to the disruption of the gp120-gp41 interface and the prevention
of the fusion process of the viral with the cellular membrane. Protein structure predictions of
the E2 ectodomain indicate that the E2 N-terminus (AS 1-75) seems to be unstructured and
flexible which might favor the interaction with the disulfide loop. In summary, in this doctoral
thesis it was shown that GBV-C E2-derived cysteine-containing peptides are able to bind the
gp41 disulfide loop and to inhibit the HIV-1 fusion process; a finding that could lead to the
development of new HIV-1 entry inhibitors.
2
Einleitung
3.
Einleitung
3.1. Die Interferenz des GB Virus C (GBV-C) mit dem Humanen
Immundefizienz-Virus (HIV)
Bei HIV-Infizierten treten häufig Infektionen mit dem nicht-pathogenen GB Virus C (GBV-C)
auf, in der Regel sind bis zu 40% der HIV-Positiven mit GBV-C koinfiziert (Mohr and
Stapleton, 2009). Dies ist unter anderem durch ähnliche Übertragungswege der beiden
lymphotropen Viren bedingt. Obwohl Koinfektionen mit anderen Pathogenen meist zu einer
Verschlechterung der Prognose der HIV-Patienten führt, scheint eine GBV-C Koinfektion
Vorteile für HIV-Infizierte zu bieten. Mehrere epidemiologische Untersuchungen weisen
darauf hin, dass eine Koinfektion mit beiden Viren zu einer signifikant erhöhten
Überlebensrate und einer verlangsamten Progression zu AIDS führt (Devereux et al., 1998;
Heringlake et al., 1998; Lefrere et al., 1999; Tillmann et al., 2001; Toyoda et al., 1998;
Williams et al., 2004; Xiang et al., 2001; Yeo et al., 2000). Jedoch gibt es auch Studien, die
den positiven Effekt einer Koinfektion nicht bestätigen konnten (Birk et al., 2002; Bjorkman et
al., 2004; Brumme et al., 2002; Van der Bij et al., 2005). Das Ergebnis einer Meta-Studie
zeigt, dass ein positiver Effekt auf den Verlauf der HIV-1 Infektion bei einer GBV-C
Koinfektion durchaus erzielt werden kann, sofern zwei Kriterien erfüllt sind (Zhang et al.,
2006):
a) die GBV-C Virämie muss in einem frühen Stadium nach der HIV-Serokonversion
vorliegen (< zwei Jahre)
b) die GBV-C RNA muss über mehrere Jahre persistieren.
Tillmann und Mitarbeiter berichteten darüber hinaus, dass selbst nach der Eliminierung von
GBV-C durch neutralisierende E2-Antikörper ein verminderter, aber dennoch positiver Effekt
auf die Überlebens-Wahrscheinlichkeit zu beobachten ist (Tillmann et al., 2001). Im
Gegensatz dazu scheint die Eliminierung der GBV-C Virämie ohne das Auftreten von
neutralisierenden Antikörpern zu einem schnelleren Verlauf der AIDS-Progression zu führen
(Bjorkman et al., 2004; Williams et al., 2004). Des Weiteren reduziert die Mutter-KindÜbertragung von GBV-C die vertikale Transmission von HIV-1 in GBV-C/HIV-1 koinfizierten
Müttern (Supapol et al., 2008). Aktuelle Studien zeigten, dass die Übertragung von GBV-C
durch Bluttransfusionen bei HIV-Patienten zu einer signifikant reduzierten Mortalität führt
(Vahidnia et al., 2012b).
Der genaue Mechanismus, welcher der Interaktion dieser beiden Viren zugrunde liegt,
konnte noch nicht klar definiert werden. Jedoch weisen mehrere Studien in Zellkultur
daraufhin, dass GBV-C direkt auf die HIV-1 Replikation Einfluss nimmt (Abbildung 3-1). Zum
Teil kann die Unterdrückung der HIV-Replikation auf die Induktion anti-retroviraler Faktoren,
3
Einleitung
wie die Chemokine RANTES, MIP-1α, MIP-1β und SDF-1 zurückgeführt werden, welche die
natürlichen Liganden der HIV-Korezeptoren darstellen (Xiang et al., 2004). Auch die
modifizierte Expression des CD4-Rezeptors und der Korezeptoren CXCR4 und CCR5, die
verminderte Expression der Th2-Zytokine, eine Reduktion der T-Zellaktivierung sowie eine
verringerte FAS-vermittelte Apoptose werden diskutiert (Maidana-Giret et al., 2009;
Moenkemeyer et al., 2008; Nattermann et al., 2003; Nunnari et al., 2003; Schwarze-Zander
et al., 2010). Die Arbeitsgruppe um Stapleton konnte für einen Teil der beschriebenen
Phänomene das Nichtstruktur-Protein 5A (NS5A) von GBV-C verantwortlich machen. Sie
konnten zeigen, dass durch die Expression von NS5A die Apoptose der T-Lymphozyten
inhibiert wird; dies könnte zu einem langfristigen Erhalt der T-Lymphozyten beitragen (Xiang
et al., 2006). NS5A führt außerdem zu einer verminderten Expression von CXCR4 und CD4
sowie zur Produktion von SDF-1 und zur Stabilisierung des Th1-Profils (Rydze et al., 2012;
Xiang et al., 2009).
In der Folge konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der HIV-Replikation direkt durch das
GBV-C Oberflächenprotein E2 vermittelt wird. Die Inkubation primärer Zellen oder Zelllinien
mit rekombinantem E2-Protein führt zu einer signifikanten Inhibition der HIV-Replikation
(Jung et al., 2007; Xiang et al., 2012). Weiterführende Experimente unserer Arbeitsgruppe
weisen auf die Inhibition früher HIV-Replikationsschritte wie Bindung des Virus an die Zelle
oder Membranfusion hin, wobei insbesondere der N-terminale Teil des E2-Glykoproteins von
Aminosäure 29 bis 72 diese HIV-Hemmung verursacht (Jung et al., 2007; Koedel et al.,
2011). Des Weiteren wurde auch die Inhibition durch C-terminale Bereiche des E2-Proteins
dargestellt (Herrera et al., 2010; Xiang et al., 2012).
Zusätzlich zeigt das Vorhandensein von GBV-C E2-Antikörpern gute Prognosen für HIV-1
Patienten. Es wurde postuliert, dass E2-Antikörper HIV-1 Partikel direkt binden können und
somit den HIV-1 Eintritt behindern (Mohr et al., 2010).
Abbildung 3-1 – In vivo Effekte einer
GBV-C Infektion, die Einfluss auf die
CD4
CCR5/CXCR4
HIV-Replikation nehmen können
RANTES
SDF-1
MIP-1α
MIP-1β
Die GBV-C Infektion verringert die Expression
der (Ko-)Rezeptoren CD4, CXCR4 und CCR5
und induziert die natürlichen Liganden der
GBV-C
Infektion
Aktivierung
Proliferation
Apoptose
Korezeptoren (RANTES, MIP-1α, MIP-1β und
Körpereigene
Immunabwehr
Potentielle Hemmung
der HIV- Infektion
CD4+-Zellen
SDF-1). Des Weiteren reduziert die GBV-C
Infektion die Aktivierung, Proliferation und
Apoptose
in
T-Zellen.
GBV-C
erhöht
zusätzlich die Expression von Interferonen,
aktiviert pDCs und fördert Th1- Zytokine zu
einer verstärkten zellulären Immunantwort
[modifiziert nach: (Bhattarai et al., 2012)].
4
Einleitung
3.2. Epidemiologie und Klinik von GBV-C
Die Entdeckung von GBV-C geht bis in die 1960er Jahre zurück, als ein Chirurg, mit den
Initialen „GB“, an einer chronischen Hepatitis ungeklärten Ursprungs erkrankte. Nachdem
Primaten mit dem Serum des Chirurgen infiziert wurden, zeigten diese Symptome einer
Leberentzündung (Deinhardt et al., 1967). Deinhardt konnte das Pathogen im Serum der
Primaten mit den damaligen Methoden nicht identifizieren, benannte es aber als das
„GB-Agens“. Im Jahr 1995 isolierten Mitarbeiter der Firma Abbott Laboratories die in dem
„GB-Agens“ enthaltenen tierpathogenen Viren GBV-A und GBV-B, die eine Verwandtschaft
zum humanpathogenen Hepatitis C Virus (HCV) aufwiesen (Schaluder et al., 1995). Ein
Nachweis dieser Viren im Menschen war nicht möglich, es konnten lediglich kreuzreaktive
Antikörper identifiziert werden. Unter Verwendung degenerierter Primer von GBV-A, GBV-B
und HCV konnte im Menschen ein Virusgenom amplifiziert werden, das als GB Virus C
bezeichnet wurde (Leary et al., 1996; Simons et al., 1995). Zeitgleich isolierte die Firma
Genelabs ein unbekanntes und umhülltes RNA-Virus aus dem Serum eines an einer akuten
Non-A non-E Hepatitis Erkrankten, welches sie Hepatitis G Virus (HGV) nannten (Linnen et
al., 1996). HGV und GBV-C stimmen zu 86% in ihrer Nukleotid- und zu 95% in ihrer
Aminosäure-Sequenz überein, sodass es sich um verschiedene Isolate des gleichen Virus
handeln muss (Leary et al., 1996; Zuckerman, 1996). In der vorliegenden Arbeit wird die
Bezeichnung GBV-C verwendet, da Infektionen mit diesem Virus in der Regel
asymptomatisch verlaufen und zu keinen Hepatitiden führen.
Die Übertragung von GBV-C erfolgt hauptsächlich parenteral durch Blut und Blutprodukte
sowie durch sexuelle Übertragungswege. Somit können besonders Hämodialyse-Patienten,
intravenös Drogenabhängige und Transplantationspatienten mit GBV-C infiziert werden
(Aikawa et al., 1996; Alter, 1996; Feucht et al., 1997; Frey et al., 2002; Kao et al., 1997;
Karayiannis et al., 1997; Linnen et al., 1996; Masuko et al., 1996; Roy et al., 2003; Scallan et
al., 1998; Stark et al., 1999).
GBV-C Infektionen sind weltweit verbreitet, wobei es sechs verschiedene Genotypen mit
starken lokalen Unterschieden in der Prävalenz gibt [Abbildung 3-2, (Muerhoff et al., 2005;
Tucker and Smuts, 2000)].
Abbildung 3-2 – Weltweite Verteilung der GBV-C
Genotypen
Phylogenetische Analysen zeigen eine Verteilung der 6
2
2
4
6
1
2,3
Genotypen auf 6 Hauptgruppen: Genotyp 1 in Westafrika,
3
Genotyp 2 in Nord- und Südamerika sowie Europa,
Genotyp 3 in Südamerika und Japan, Genotyp 4 in
Myanmar und Vietnam, Genotyp 5 in Südafrika und
5
Genotyp 6 in Indonesien.
5
Einleitung
Während in Industrienationen GBV-C RNA im Blut in bis zu 5% der Bevölkerung
nachweisbar ist, zeigt sich in Afrika eine etwa zehnmal erhöhte Virämie (Sathar et al., 2000).
Bei einigen Risikogruppen (intravenös Drogenabhängigen, Dialysepatienten, HIV- oder
HCV-Patienten, Homosexuellen) sind zudem Koinfektionen mit anderen parenteral
übertragbaren Viren relativ häufig (Dawson et al., 1996). Besonders HCV-Positive sind zu
20-30% und HIV-Positive bis zu 40% chronisch mit GBV-C infiziert (Alcalde et al., 2010;
Boodram et al., 2011; Mohr and Stapleton, 2009).
GBV-C ist ein lymphotropes Virus, das in B- und T-Zellen repliziert und zu akuten, aber auch
chronischen Infektionen führt (George and Varmaz, 2005; George et al., 2006; Linnen et al.,
1996; Tucker and Smuts, 2000). Etwa 70-80% der Infizierten bilden innerhalb der ersten
Jahre neutralisierende Antikörper gegen das E2-Hüllprotein, was mit dem Verlust der RNAViruslast (Virusklärung) einher geht (Dille et al., 1997; Gutierrez et al., 1997; Lefrere et al.,
1997; Tan et al., 1999; Thomas et al., 1998). In Studien zur Pathogenität von GBV-C
konnten keine assoziierten Erkrankungen nachgewiesen werden (Alter et al., 1997;
Sampietro et al., 1997; Simons et al., 2000; Zignego et al., 1997). Jedoch beschreibt eine
Studie aus Kanada ein erhöhtes Risiko für Non-Hodgkin-Lymphome bei einer vorhandenen
GBV-C Virämie (Krajden et al., 2010).
3.3. Taxonomie, Struktur und Replikation von GBV-C
GBV-C wurde auf Grund der Nukleotidsequenz und Genomorganisation der Familie der
Flaviridae zugeordnet, die drei Gattungen umfasst: die humanpathogenen Flavi- und
Hepaciviren sowie die tierpathogenen Pestiviren (Abbildung 3-3). Bis auf GBV-B, sind die
GB-Viren bisher noch in keine Gattung eingegliedert worden. GBV-B wurde den Hepaciviren
zugeordnet, da zu HCV große Aminosäure- und Strukturhomologien bestehen und es
Hepatitis in Neuweltaffen hervorruft (Stapleton et al., 2011).
Abbildung
–
3-3
Phylogenetischer
Stammbaum der Flaviviridae (Mohr and
Stapleton, 2009)
Drei Gattungen gehören zu den Flaviviridae: die
Gattung der Flaviviren (u.a. Gelbfiebervirus [YFV],
Japanese-Encephalitis-Virus
[JEV],
Typ 2
das
[DV2]
und
Denguevirus
Frühsommer-
meningoenzephalitis-Virus [TBEV]), die Gattung der
Hepaciviren (Hepatitis C Virus [HCV], GB Virus B
[GBV-B]) sowie die Gattung der Pestiviren (u.a. das
Bovine
Virusdiarrhoe-Virus
[BVDV]).
Zusätzlich
gehören zu den Flaviviridae die bisweilen noch nicht
klassifizierten GB Viren A und C (GBV-A, GBV-C).
6
Einleitung
Aktuell wurde dem International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) eine Änderung
dieser Klassifizierung vorgelegt. In dieser wird vorgeschlagen GBV-A, GBV-C und GBV-D
einer eigenen, vierten Gattung, den Pegiviren zuzuweisen (Stapleton et al., 2011). Mit
diesem Namen soll die persistente Infektion (Pe) und die „historische“ Verwandtschaft zu
den GB-Agenzien (g) zusammengefasst werden. Demnach wird empfohlen GBV-C als
humanes Pegivirus (HPgV) und das Schimpansen-GBV-C als SPgVcpz zu bezeichnen, um
den jeweiligen Wirt widerzuspiegeln.
Die infektiösen GBV-C Viren haben einen Durchmesser von etwa 65 nm (Xiang et al., 1999)
und enthalten ein einzelsträngiges, positiv orientiertes RNA-Genom mit einer Länge von
etwa 9100-9400 Basenpaaren (Kim and Fry, 1997; Linnen et al., 1996). Das Genom
(Abbildung 3-4) umfasst einen großen offenen Leserahmen (ORF), der für ein Polyprotein
kodiert und von jeweils einer 5’- und 3’-untranslatierten Region (UTR) flankiert ist. Die
5’-UTR enthält unter anderem eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), an der die
Translation initiiert wird.
Struktur-Gene
structural
genes
non-structural
genes
Nichtstruktur-Gene
p5.6
C-Protein?
E1
5‘ UTR
TM
E2
TM
NS2
NS3
NS4A
NS4B
NS5A
NS5B
3‘ UTR
(+)ssRNA
Abbildung 3-4 – Schematischer Aufbau des GBV-C Genoms
25
198
40
Die Darstellung zeigt den offenen Leserahmen, welcher N-terminal von der 5`- und C-terminal von der 3`-untranslatierten
aa 1(UTR) begrenzt wird. Die Strukturgene E1 und E2 fungieren als glykosylierte virale Hüllproteine, aa
340stellt
Region
p5.6
P1
P2
P4
putative E2 fusion peptide
P3
P6 dar.P8Zu den Nichtstruktur-Proteinen gehören die Proteine NS2 (Thiolprotease), NS3 (Protease
P5
wahrscheinlich
einen
Ionenkanal
P7
P10
P9
und
Helikase),
NS4A/B
P12
P14
(Proteasekofaktoren),P15 NS5A
P17
P11
P13
P16
(Interferon-sensitiver
P18
P20
P19
P21
P23
RNA-Polymerase). Die Existenz eines Kapsidproteins ist nicht eindeutig bewiesen.
Bereich)
P22
P25
und
P24
P27
NS5B
P26
P29
P28
P31
(RNA-abhängige
P30
P33
P32
Zu den Strukturproteinen gehören E1 und E2, glykosylierte Oberflächenproteine, die in die
Membran der Viren eingebaut werden. Mittels einer putativen Signalsequenz werden diese
Proteine durch zelluläre Signalpeptidasen vom Polyprotein abgespalten (Linnen et al., 1996).
P5.6 bildet wahrscheinlich wie p7 von HCV einen Ionenkanal (Penin et al., 2004). Die nichtstrukturellen Proteine werden hingegen von den viruseigenen NS2/3 und NS3/4A Proteasen
prozessiert (Belyaev et al., 1998).
Biophysiologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen lassen darauf schließen,
dass eine Nukleokapsid-Struktur innerhalb des Virus existiert. Diese Vermutungen konnten
bisher jedoch nicht durch einen eindeutig dafür festgelegten Genombereich bestätigt werden
(Xiang et al., 1999; Xiang et al., 1998).
7
Einleitung
3.4. Epidemiologie und Klinik von HIV
Durch die Infektion mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) wird die erworbene
Immunschwäche AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) hervorgerufen, die mit
lebensbedrohlichen opportunistischen Infektionen und Tumoren einhergeht. Erste AIDS-Fälle
wurden Anfang der 1980er Jahre berichtet, woraufhin das HI-Virus 1983 isoliert wurde
(Montagnier et al., 1984; Quagliarello, 1982). In den folgenden Jahren stieg die Zahl der
jährlich neu diagnostizierten Patienten mit AIDS-Manifestationen rasch an. Durch die
Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) im Jahr 1996 geht die Zahl
der AIDS-Todesfälle zurück. Dennoch besteht auf Grund der hohen Variabilität der HI-Viren
wenig Aussicht auf eine vollständige Heilung der Erkrankung.
Das Humane Immundefizienz-Virus wird durch Kontakt mit den Körperflüssigkeiten Blut,
Sperma, Vaginalsekret und Muttermilch übertragen (Butler et al., 2010; Pope and Haase,
2003; Rousseau et al., 2004; Zhu et al., 1996). Die häufigsten Infektionswege stellen
ungeschützter Geschlechtsverkehr, insbesondere bei homosexuellen Männern, sowie
intravenöser Drogenkonsum dar. Das Risiko einer Infektionsübertragung von der Mutter auf
das Kind kann durch Behandlung mit antiretroviralen Medikamenten, einer Geburt mittels
Kaiserschnitt und Abstillen fast vollkommen verhindert werden.
Weltweit wird die HIV-Prävalenz mit 0,8% (ca. 34 Mio. Infizierte) angegeben, wobei die
höchste Prävalenz im subsaharischen Afrika mit 4,9% (ca. 22,5 Mio. Infizierte) vorliegt
(UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic, 2012). Neueste Untersuchungen zeigen
aber, dass sich die Zahl der Neuinfektionen in den letzten 10 Jahren weltweit um 20%
verringerte. 2011 betrug die HIV-Prävalenz in Zentral- und Westeuropa 0,2%, die Zahl der
Neuinfektionen zeigte mit ca. 30.000 Betroffenen jedoch eine leicht steigende Tendenz.
Nach den aktuellen Schätzungen beträgt die Zahl der Menschen, die Ende 2010 in
Deutschland mit HIV/AIDS leben, etwa 70.000; dies beinhaltet ca. 3.000 Neuinfektionen und
ca. 550 AIDS-bedingte Todesfälle (Epidemiologisches Bulletin 46/2010, RKI).
HIV ist ein umhülltes RNA-Virus, das zur Familie der Retroviridae gezählt wird (Coffin et al.,
1997). Zur Gattung der Lentiviren gehören neben HIV-1 unter anderem HIV-2 und SIV. Auf
Grund phylogenetischer Analysen wird HIV-1 in die vier Gruppen M (major oder main), O
(outlier), N (non-M/non-O, new) und P eingeteilt (Coffin et al., 1986; Plantier et al., 2009). Die
Hauptgruppe M wird des Weiteren in elf Subtypen (A1, A2, B, C, D, F1, F2, G, H, J, K)
unterteilt. Eine Koinfektion mit verschiedenen Subtypen kann zur Entstehung von
rekombinanten Formen führen, die, wenn sie epidemiologisch relevant sind, als circulating
recombinant
forms
(CRFs)
bezeichnet
werden
(HIV
http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HelpDocs/subtypes.html).
8
sequence
database:
Einleitung
3.5. Struktur und Replikation von HIV
Die infektiösen Viruspartikel von HIV-1 besitzen einen Durchmesser von etwa 100-120 nm
und sind von einer Lipoproteinhülle umgeben, die sich von der Wirtszelle ableitet. In dieser
Hülle sind eine geringe Anzahl von Glykoprotein-Komplexen (im Mittel 14±7) integriert, die
als Heterotrimere vorliegen und aus einem externen Anteil (gp120) und einem
Transmembran-Protein (gp41) bestehen, die nicht-kovalent assoziiert sind (Chan et al.,
1997; Zhu et al., 2006).
Der erste Schritt im HIV-1 Replikationszyklus (Abbildung 3-5) ist die Bindung des
Glykoproteins gp120 an den zellulären CD4-Rezeptor, wodurch Konformationsänderungen
innerhalb des viralen Glykoproteins induziert werden und im Folgenden die Bindung an den
jeweiligen Korezeptor ermöglichen. X4-trope Viren nutzen den α-Chemokinrezeptor CXCR4
zur Infektion von T-Lymphozyten, während der β-Chemokinrezeptor CCR5 für R5-trope Viren
zur Infektion von Makrophagen und Monozyten dient. Zusätzlich gibt es dualtrope
Virusisolate, die sowohl CXCR4 als auch CCR5 als Korezeptor nutzen können (Doms and
Peiper, 1997; Moore et al., 1997). Nach der Bindung an den Korezeptor erfolgt die Fusion
der Virus- mit der Zielzell-Membran (Doms and Moore, 2000), mit anschließender
Freisetzung des Kapsids in die Wirtszelle und dem Auflösen des Kapsids (Uncoating). Im
Folgenden wird die in den Virionen verpackte RNA durch den Prozess der Reversen
Transkription in DNA-Intermediate umgeschrieben, aktiv in den Kern transportiert und in das
Wirtsgenom integriert (Auewarakul et al., 2005; Sherman and Greene, 2002). Dies macht es
dem Immunsystem faktisch unmöglich das Virus aus dem Organismus zu eliminieren. Nach
Anlagerung zellulärer Transkriptionsfaktoren (z.B. NFκB) an die virale LTR-Region (long
terminal repeat) kommt es zur Transkription im Zellkern. Die ungespleißte mRNA kodiert für
die Polyproteine Pr55Gag und Pr160Gag-Pol, wohingegen das Vorläuferprotein gp160 sowie die
akzessorischen Proteine von HIV-1 von gespleißten mRNA-Molekülen translatiert werden.
Das Vorläuferprotein gp160 wird im Endoplasmatischen Retikulum mehrfach glykosyliert,
trimerisiert und im Golgi-Apparat durch eine zelluläre Protease in gp120 und gp41 gespalten.
Nach dem intrazellulären Transport und der Assoziation der einzelnen Virus-Bestandteile an
der Zellmembran (Assembly) werden nicht-infektiöse, unreife Viruspartikel abgeschnürt
(Budding). Erst nach diesem Schritt prozessiert die virale Protease die Polyproteine, was mit
der Virusreifung und der Ausbildung des charakteristischen kegelförmigen Kapsids
einhergeht (Kohl et al., 1988).
9
Einleitung
3.6. Therapie von HIV-Infektionen
Nach der initialen Infektion mit HIV schließt sich in der Regel eine über mehrere Jahre
dauernde symptomfreie Phase an. Während dieser Zeit erfolgt jedoch eine fortwährende
Virusreplikation, die nach einiger Zeit zur Abnahme der CD4+-Zellzahl und zur Ausprägung
der AIDS-Immundefizienz führt. Die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes ist noch nicht
gelungen; allerdings ist es meist möglich durch HAART die Viruslast bis unter die
Nachweisgrenze (PCR/RT-PCR-Verfahren: < 40 Kopien pro ml Serum) zu verringern und die
Entwicklung von AIDS deutlich zu verzögern oder gar zu verhindern.
Die Behandlung von HIV-Infektionen wird mit einer medikamentösen Kombinationstherapie
von mindestens drei antiretroviralen Wirkstoffen durchgeführt. Ziel dieser Behandlung ist es,
die weitere Replikation des Virus stark zu vermindern und somit die Viruslast unter die
Nachweisgrenze zu reduzieren, die CD4+-Zellzahl zu erhöhen und hierdurch den Ausbruch
von AIDS hinauszuzögern. Dabei werden vornehmlich nukleosidische (NRTIs) und nichtnukleosidische (NNRTIs) Hemmstoffe der Reversen Transkriptase sowie Inhibitoren der
Protease (PIs) verwendet (Carpenter et al., 1998; Metzger et al., 2010). Auch Inhibitoren der
Bindung und Fusion sowie Integrase-Inhibitoren werden, zum Teil noch in Phase III-Studien,
angewendet (Metzger et al., 2010). Eine Übersicht der zurzeit eingesetzten Wirkstoffe findet
sich in Abbildung 3-5.
Abbildung 3-5 – Darstellung einiger zugelassener Medikamente der HAART mit den jeweiligen
Angriffspunkten
10
Einleitung
Eine vollkommene Eliminierung des Virus aus dem Patienten ist trotz antiretroviraler
Therapie
nicht
möglich,
da
HIV
als
integriertes
Provirus
latent
in
Zellen
der
Monozyten/ Makrophagen-Linie persistieren kann. Des Weiteren ist durch Rekombinationen
während der Reversen Transkription und der Anhäufung von Mutationen (Punktmutationen,
Deletionen,
Insertionen),
durch
den
fehlerhaften
Baseneinbau
und
die
fehlende
Korrekturfähigkeit (proof reading), insbesondere durch die zelluläre RNA-Polymerase II
sowie auch durch die Reverse Transkriptase, die Mutationsrate des HI-Virus ca. 106-fach
höher als die des menschlichen Genoms. Diese hohe genetische Variabilität und das
intrazelluläre Virusreservoir von HIV können zur Entstehung von parallel existierenden HIVVarianten sogenannten „Quasispezies“ innerhalb eines Organismus führen. Dabei kann es
insbesondere unter dem Selektionsdruck durch die Therapie zur Resistenzentwicklung
gegen die verwendeten Medikamente kommen. Aus diesem Grund nimmt die kontinuierliche
und lückenlose Einnahme der HIV-Medikamente einen hohen Stellenwert ein, um die
Replikation von HIV möglichst erfolgreich und dauerhaft zu unterdrücken und der Gefahr der
Resistenzentwicklung unter Therapie entgegen zu wirken.
Ein besonderer Fokus liegt in der Verhinderung des Eintritts von HIV-1 in die CD4+-Zelle. Bei
diesem Prozess des Entry gibt es drei Schlüsselstellen, die selektiv gehemmt werden
könnten (Abbildung 3-6):
1. Die Bindung von HIV-1 an den CD4-Rezeptor
2. Die Bindung an Korezeptoren
3. Die Fusion von Virus und Zelle
CD4-Bindung
Korezeptorbindung
Virus-Zell Fusion
Korezeptor-Antagonisten
z.B. Maraviroc, AMD-3100
Fusionsinhibitoren
z.B. Enfuvirtide (T-20)
gp41
CD4-BindungsInhibitoren
z.B. TNX-355
gp120
V3-Loop
CD4
Zellmembran
Zellmembran
Zellmembran
CCR5/CXCR4
Abbildung 3-6 – HIV-Entry
Der Eintritt von HIV-1 in die Wirtszelle mit den drei entscheidenden Schritten und Beispielen für Inhibitoren: Bindung an den
CD4-Rezeptor,
Korezeptor-Bindung
und
Fusion
der
Virus-
mit
der
Zellmembran
(modifiziert
nach:
http://www.trofileassay.com/Viral_Entry.html).
Alle
drei
Wirkstoffklassen,
Bindungsinhibitoren
(TNX-355),
Korezeptor-Antagonisten
(AMD-3100, TAK-779, Maraviroc) und Fusionsinhibitoren (T-20), werden als EntryInhibitoren zusammengefasst (Cohen et al., 2002; Fatkenheuer, 2005; Marks and Gulick,
2004; Schols et al., 1997; Shiraishi et al., 2000).
11
Einleitung
3.7. Virale Entry-Mechanismen und Hüllproteine
Essentielle Schritte der Virusreplikation finden an der Zellmembran statt und benötigen
häufig Wirtszellfaktoren, wie z.B. zelluläre Rezeptoren oder Transportproteine. Virus-Entry
stellt den ersten notwendigen Schritt im HIV-Replikationszyklus dar und ist somit ein
interessantes und wichtiges Ziel für antivirale Therapeutika.
Der primäre Schritt der Virusinfektion besteht aus der Adsorption (Rezeptor-vermittelte
Anbindung des Virus an die Wirtszelle) und der darauf folgenden Penetration. Dieser Eintritt
der Viren in die Zellen verläuft bei umhüllten bzw. nackten Viren auf unterschiedlichen
Wegen. Viren ohne Hülle können durch Translokation (das Virus durchquert die Membran
der Zielzelle direkt), Genominjektion (das Virus entlässt das Genom über eine Pore in der
Plasmamembran direkt in das Zytoplasma der Wirtszelle) oder über Endozytose die Zellen
infizieren (Rybicki, 2003). Bei umhüllten Viren, wie VSV (Vesikuläres Stomatitis Virus) oder
HIV-1, gelangen die Viruspartikel über Endozytose und anschließender Membranfusion oder
über direkte Plasma-Membranfusion in die Wirtszellen [Abbildung 3-7, (Dimitrov, 2004)].
a) Clathrin-vermittelte
Endozytose
b) Fusion mit der
Zellmembran
Abbildung 3-7 – Zwei verschiedene Wege des
Virus-Entry
a) Clathrin-vermittelte Endozytose (z.B. VSV): Nach der
Adsorption des Virus an die Membran der Zielzelle findet die
Bildung eines Clathrin-beschichteten Vesikels statt. Durch
die Absenkung des pH-Wertes im Inneren des Endosoms
wird die Vesikelmembran aufgelöst und das Virus in das
Zytoplasma der Zelle freigesetzt. b) Fusion mit der
Zellmembran (z.B. HIV-1): Nach der Adsorption des Virus
an Rezeptoren der Zielzelle fusioniert die Virusmembran mit
der Zellmembran der Wirtszelle und das Genom des Virus
wird in das Zytoplasma entlassen (Dimitrov, 2004).
Rhabdoviren, wie VSV, werden über Lipidkomponenten der Zellmembran und Clathrinvermittelte Endozytose aufgenommen [Abbildung 3-7a, (Dimitrov, 2004; Steven and Spear,
2006)].
12
Einleitung
Retroviren, wie HIV-1, hingegen nutzen die spezifischen (Ko-)Rezeptoren CD4 und CXCR4
bzw. CCR5, die von den HIV-1 Glykoproteinen gp120 und gp41, die nicht-kovalent in
Trimeren assoziiert sind, gebunden werden. Dabei ist der initiale Schritt die Bindung von
gp120
an
den
CD4-Rezeptor
Konformationsänderungen
(Maddon
innerhalb
des
et
al.,
viralen
1986).
Diese
Glykoproteins,
Bindung
wodurch
induziert
ein
hoch
konserviertes Epitop freigelegt wird. Des Weiteren wird somit eine Interaktion der V3-Schleife
von gp120 mit dem jeweiligen Korezeptor, CXCR4 oder CCR5, ermöglicht (Alkhatib et al.,
1996; Feng et al., 1996). Durch diesen Prozess werden hoch konservierte CD4-induzierbare
Epitope im Hüllprotein geschützt und entgehen der Überwachung durch das Immunsystem
(Haynes and Montefiori, 2006; Pantophlet and Burton, 2006; Wyatt and Sodroski, 1998).
Nach der Bindung an den jeweiligen Korezeptor erfährt auch die Ektodomäne von gp41 eine
Konformationsänderung (Chan et al., 1997; Sattentau and Moore, 1991). Dabei kommt es
zur Insertion des hydrophoben gp41-NH2-terminalen Endes (gp41-Fusionspeptid) in die
Membran der Zielzelle, ein Mechanismus, der oft mit einer „Schnappfeder“ verglichen wird.
Zwischen dem Fusionspeptid und der Transmembran-Domäne befinden sich nun die beiden
helikalen Wiederholungs-Domänen NHR und CHR (N- und C-Helix) und bilden einen
Übergangszustand aus, die Prehairpin-Intermediärstruktur (siehe Abbildung 3-8). Im
nächsten Schritt lagern sich NHR und CHR aneinander und bilden ein Bündel aus sechs
Helices, das fusionsaktive Hairpin-Trimer (Caffrey et al., 1998; Chan et al., 1997; Lu and
Kim, 1997; Tan et al., 1997). Zum einen bringt diese Coiled-Coil-Struktur die Virusmembran
in die Nähe der Zellmembran, zum anderen wird bei der Hairpin-Bildung Energie frei, die zur
Membranfusion und zur Bildung und Dilatation einer Fusionspore benötigt wird (Doms and
Moore, 2000; Kwong et al., 2000; Tilton and Doms, 2010). Im Unterschied zur
endozytotischen Aufnahme sind die Fusionsproteine dieser Viren bei neutralem pH-Wert
aktiv (Borkow and Lapidot, 2005; Steven and Spear, 2006).
Abbildung 3-8 – HIV-1 Entry-Mechanismus und Konformationen des gp41
Nach der Bindung von gp120 an CD4 und den Korezeptor wird durch eine Konformationsänderung gp41 freigelegt. Es erfolgt
die Insertion des gp41-Fusionspeptids in die Zellmembran der Zielzelle. NHR (HR1; violett) und CHR (HR2; grün) lagern sich
zur 6-Helix-Bündel-Formation zusammen, wodurch die Fusion der beiden Membranen ermöglicht wird (Miller et al., 2005).
13
Einleitung
Virale Hüllproteine sind meist mehrfach an äußeren oder exponierten Bereichen glykosyliert
und werden demnach auch als Glykoproteine bezeichnet. Dieser extrazelluläre Anteil ist
vornehmlich für die Bindung an Rezeptoren notwendig. Da diese Bereiche der Hüllproteine
Angriffspunkte für virusspezifische Antikörper darstellen, können Glykosylierungen als
Schutzschild fungieren. Zusätzlich befinden sich in exponiert gelegenen Epitopen oft
hypervariable Regionen, die durch häufige Mutationen zu einer hohen immunologischen
Flexibilität führen. Glykosylierungen dienen unter anderem als Signal für den intra- und
interzellulären Transport von Proteinen, zur Beeinflussung der Affinität von Liganden zu den
jeweiligen Rezeptoren, der korrekten Faltung und Löslichkeit der Proteine.
Bei umhüllten Viren, wie HIV oder HCV, erfahren die viralen Glykoproteine bei der
Zellanheftung Konformationsänderungen. Diese Hüll- oder Envelope-Proteine sind auf Grund
der Vermittlung des Virus-Zell-Kontaktes und der anschließenden Fusion der beiden
Membranen essentiell für die Infektion einer Wirtszelle.
Die Glykoproteine (envelope protein) von HIV-1, gp120 und gp41, sind nicht-kovalent
assoziierte Trimere, die als funktionelle Spikes (14±7) auf der Oberfläche der Virionen
angeordnet sind (Zhu et al., 2006). Die nicht-kovalente
Verbindung der beiden Proteine wird wahrscheinlich
durch die Interaktion der N- und C-Termini von gp120 mit
den flankierenden Bereichen der NHR- und CHR-Region
und dem Disulfid-Loop von gp41 aufrechterhalten
[Abbildung 3-9, (Caffrey, 2011; Pancera et al., 2010)].
Abbildung 3-9 - gp120 interagiert mit gp41
Durch Mutagenese bestimmte Reste des N- und C-Terminus von gp120, die
mit gp41 interagieren sind in blau hervorgehoben (Pancera et al., 2010).
14
Einleitung
Bei GBV-C findet in Analogie zu HCV die Synthese des viralen Polyproteins auf Grund eines
Signalpeptids am rauen Endoplasmatischen Retikulum (ER) statt. Die Glykoproteine E1 und
E2 von GBV-C besitzen ein Retentionssignal, wodurch diese nach der Translation in der
ER-Membran festgehalten werden. Es handelt sich hierbei um Typ I-TransmembranProteine, welche nur einen Membrandurchbruch mit einer N-terminalen Ektodomäne und
einem C-terminalen hydrophoben Membrananker aufweisen (Op De Beeck et al., 2001). Die
Ektodomänen der Proteine von HCV und GBV-C werden während der Synthese durch
N-Glykosylierung modifiziert. Das E1-Protein von GBV-C besitzt eine Glykosylierungsstelle,
das E2-Protein hingegen ist dreifach glykosyliert (Leary et al., 1996; Simons et al., 2000). E1
und E2 werden als Heterodimere in die Hüllmembran des Viruspartikels eingebaut und sind
an der Zellbindung beteiligt. Die zellulären Rezeptoren hierfür sind jedoch noch nicht
identifiziert (Kaufman et al., 2007; McLinden et al., 2006).
HIV-Patienten sind oft hoch virämisch für GBV-C; demzufolge zirkulieren bis zu 108 VirusPartikel in einem Milliliter Serum. In diesem Zusammenhang hat unsere Arbeitsgruppe
untersucht, inwieweit rekombinantes E2-Protein Einfluss auf die HIV-Replikation nimmt. Es
konnte gezeigt werden, dass dieses Glykoprotein dosisabhängig die HIV-1 Replikation in
vitro inhibiert, wobei der Eintritt des Virus in die Zielzellen beeinflusst wird (Jung et al., 2007;
Koedel et al., 2011). Durch den Einsatz synthetischer Peptide in HIV-Hemmtests, die
überlappend das ganze E2-Glykoprotein repräsentierten, konnten Ködel et al. beschreiben,
dass die wirksamsten Peptide von dem N-terminalen Bereich des E2-Proteins von
Aminosäure 37 bis 64 abgeleitet werden konnten. Diese weisen IC50-Werte zwischen 2 und
0,2 µM auf (Koedel et al., 2011). Des Weiteren konnten Xiang et al. zeigen, dass ein
E2-Peptid aus dem C-terminalen Bereich (AS 276-292) nach intrazellulärer Expression das
Entry von HIV-1 negativ beeinflusst (Xiang et al., 2012). Auch Herrera et al. stellten dar, dass
diverse E2-Peptide aus dem N- und C-terminalen Bereich mit dem Fusionspeptid (FP) von
HIV-1 gp41 interagieren, seine Konformation ändern und somit die HIV-1 Replikation
hemmen (Herrera et al., 2009; Herrera et al., 2010).
Neue Untersuchungen zum E1-Protein zeigen eine Hemmung des HIV-1 Entry durch die
Interaktion mit dem Fusionspeptid von HIV-1 gp41 (Sanchez-Martin et al., 2011a). Auch
einzelne E1-Peptide hemmen die Membranfusion und die Interaktion von HIV-1 gp41-FP mit
Doppelmembranen (Sanchez-Martin et al., 2011b). Die Tatsache, dass sowohl Anteile von
E2 als auch von E1 HIV-inhibitorisch zu sein scheinen, unterstreicht die Relevanz der GBV-C
Glykoproteine für die Suppression des HIV-Eintritts.
15
Zielsetzung
4.
Zielsetzung
HIV-Patienten,
die eine Koinfektion mit GBV-C aufweisen,
zeigten in mehreren
epidemiologischen Studien eine verlangsamte Progression zu AIDS und damit eine
signifikant erhöhte Lebenserwartung. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten in vitro die
Inhibition der HIV-Replikation durch GBV-C Koinfektionen nachweisen. Durch die Expression
von größeren GBV-C Genabschnitten in T-Lymphozyten und anschließender HIV-Infektion
dieser Zellen ließ sich erkennen, dass mehrere Proteine von GBV-C an der HIV-1
Suppression beteiligt sind. Der N-terminale Abschnitt, der u.a. das E2-Glykoprotein enthält,
inhibierte ausschließlich frühe Schritte des HIV-1 Replikationszyklus, während aber auch im
C-terminalen Bereich von NS3 bis NS5 weitere HIV-inhibitorische Elemente vermutet
wurden. Aus diesem Grund sollte zu Beginn der Arbeit der Einfluss der GBV-C NichtstrukturProteine auf die HIV-1 Replikation untersucht werden. Hierfür sollten mit Hilfe des Tet-OffSystems, die Nichtstruktur-Proteine NS3 bis NS5 in HIV-infizierbaren T-Zelllinien induzierbar
exprimiert werden, um anschließend die HIV-inhibitorische Wirkung dieser Proteine
untersuchen zu können. Der Schwerpunkt der Arbeit lag in der Aufklärung des zugrunde
liegenden Mechanismus der HIV-Inhibition durch das E2-Protein. Durch Verwendung eines
Virus-Zell-Fusionsassays sollte die HIV-Entry-Hemmung durch das E2-Protein bzw.
E2-abgeleiteter Peptide bestätigt und der durch das E2 beeinflusste Teilschritt des EntryProzesses bestimmt werden. Im Anschluss daran sollten umfangreiche Bindungsstudien
Erkenntnisse über den E2-Bindungspartner und den exakten Bindungsort liefern. Zusätzlich
sollten die gewonnenen Erkenntnisse mit Hilfe von bioinformatischen Analysen unterstützt
und erweitert werden.
16
Material
5.
Materialien
5.1. Organismen
Escherichia coli
XL1-Blue
lac (F´ proAB lacIqZDM15 Tn10 [TetR]) recA1 endA1 gyrA96
thi-1 hsdR17 supE44 relA1 (Agilent, Waldbronn)
DH5α
F– Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1
hsdR17 (rk– mk+) phoAsupE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ– (Life
Technologies GmbH, Darmstadt)
Eukaryotische Zellen
HEK 293T
humane embryonale Nierenzelllinie (HEK: human embryonic
kidney), transformiert mit Adenovirus 5 und transfiziert mit dem
T-Antigen von SV40 (Graham et al., 1977)
TZM-bl
Derivat der HeLa-Zelllinie JC.53 (JC53-bl clone13), exprimiert
zusätzlich hohe Mengen an CD4 und CCR5 sowie stabil
integrierte Gene von Luciferase und ß-Galaktosidase unter
Kontrolle eines HIV-1 LTR-Promotors (Platt et al., 1998);
erhalten durch das NIH AIDS Research and Reference Reagent
Program, Division of AIDS (von Dr. John C. Kappes, Dr.
Xiaoyun Wu, and Tranzyme Inc.).
CEMx174 5.25M7
Fusionsprodukt
der
humanen
T-Zelllinie
CEM
und
der
B-Zelllinie 721.174 (Salter et al., 1985), exprimiert den HIV-1
Korezeptor CCR5
Jurkat
humane
CD4+-T-Zelllinie;
etabliert
aus
einer
akuten
lymphoblastischen Leukämie (ALL) (Schneider and Schwenk,
1977; Weiss et al., 1984)
PBMC
periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC: peripheral blood
mononuclear cells) heterogene Mischung aus allgemein
kernhaltigen Zellen des Blutes ohne Granulozyten (Vollblut:
Granulozyten [~70%], Lymphozyten [~25%] und Monozyten
[~5%])
17
Material
Humane Immundefizienz-Viren
klinische Isolate (Subtypen):
CXCR4-trop
92UG029 (A), SF33 (B), 92UG021 (D1), 92UG024 (D3),
93BR020 (F2)
CCR5-trop
92TH026 (B), 92BR025 (C), 92UG035 (D2), 93BR029 (F1),
RU570 (G)
X4/R5-dualtrop
V1557 (H)
Laborstämme:
CXCR4-trop
NL4-3 (B)
CCR5-trop
YU-2 (B), ADA (B)
5.2. Plasmide
Xiang et al. konstruierte den GBV-C Klon AF121950 durch Klonierung der Volllängen-cDNA
eines Patienten mit chronischer GBV-C Virämie in den Vektor pCR2.1 (Xiang et al., 2000).
pADAenv
Expressionsplasmid pCAGGS mit dem gp160-Gen für das
R5-trope Hüllprotein ADAenv
pAdVAntage
Expressionsplasmid, das die Virus-RNA Gene VAI und VAII
(Virus Associated I und II) und die Basenpaare 9831-11555 des
Adenovirus
Typ
2
Genoms
enthält.
Kotransfektion
mit
pAdVAntage erhöht die Initiation der Translation und damit die
transiente Proteinexpression durch Bindung von VAI an DAI
(dsRNA-activated inhibitor). DAI wird durch dsRNA aktiviert und
ist eines der Enzyme, die zum antiviralen Abwehrsystem der
Wirtszelle gehören.
pCD4
Expressionsplasmid
pcDNA3,
enthält
als
Insertion
die
Aminosäuren 81-1700 des CD4-Gens
pCCR5
Expressionsplasmid pcDNA3.1 zeo+, enthält als Insertion das
Gen für den Chemokinrezeptor CCR5
pCEP4-E2340-Fc
Expressionsplasmid, welches für ein lösliches GBV-C E2-Fc
Fusionsprotein kodiert; die Nukleotide 1164-2184 des GBV-C
Isolats AF121950 wurden in das BamHI/NotI Fragment des
pCEP4-Fc Vektors kloniert (Birkmann et al., 2001; Jung et al.,
2007).
18
Material
pCMV-BlaM-Vpr
Expressionsplasmid pCMV4-HA-Vpr, enthält zusätzlich als
Insertion BlaM (β-Laktamase) aus dem Vektor pcDNA3.1-BlaM
(Cavrois et al., 2002)
pNL4-3
Expressionsplasmid pUC18, enthält die Fragmente 5’ SmaIEcoRI des proviralen NY5 und 3’ EcoRI-NruI des proviralen
HIV;
provirale
Volllängen-DNA,
Replikations-
und
Infektionskompetent (Adachi et al., 1986)
pNL4-3-R5
isogene Form des X4-tropen HIV-1NL4-3, kodiert die V3-Region
der R5-tropen Variante, Klon 005pf135 (Papkalla et al., 2002)
pNL4-3env
Expressionsplasmid pCAGGS mit dem Gen für das X4-trope
Hüllprotein NL4-3env
pNL4-3.Luc.R-E-
Expressionsplasmid pUC19, enthält das komplette, aber
defekte NL4-3 HIV-Genom, mit je einer Frameshift-Mutation im
env- und vpr-Gen und einem Luciferase-Gen im nef-Gen
(Connor et al., 1995).
pSCT-lacZ alpha N85
Derivat vom Expressionsplasmid pSCT1, exprimiert
den
N-terminalen alpha-Teil von lacZ: Aminosäuren 1-85 mit
Ampicillin-Resistenzkassette (Moosmann and Rusconi, 1996)
pSCT-lacZ omega
Derivat vom Expressionsplasmid pSCT1, exprimiert
den
C-terminalen omega-Teil von lacZ: Deletion der Aminosäuren
10-40
mit
Ampicillin-Resistenzkassette
(Moosmann
and
Rusconi, 1996)
pTet-Off
Expression
des
Tetrazyklin-kontrollierten
Transkriptions-
aktivators (tTA), ein Fusionsprotein aus dem Tet-Repressor
(TetR) und der VP16-Aktivierungsdomäne des Herpes Simplex
Virus, das konstitutiv exprimiert wird.
pTRE2hyg_IRES-GFP
Expressionsplasmid, das die zu exprimierende DNA enthält, die
unter der Kontrolle des tet responsive elements (TRE) steht,
welches sensitiv auf die Expression von tTA reagiert. Zusätzlich
enthält der Vektor eine Hygromycin-Resistenz und ein GFPGen unter Kontrolle einer internen ribosomalen Eintrittsstelle
(IRES) (Xiang et al., 2012).
pVSV-G
Expressionsplasmid pHEF mit dem Gen des Hüllproteins des
Vesikulären Stomatitis Virus (VSV)
19
Material
5.3. Proteine
HIV-1
gp120BaL, Fc-gp120JRCSF, gp41MN
NIH AIDS Reagent Program, Germantown (USA)
gp120IIIB
Immuno Diagnostics, Woburn (USA)
gp120MN
Immune Technology, New York (USA)
gp41IIIB
Abcam, Cambridge (UK)
5.4. Peptide
Basierend auf dem GBV-C Glykoprotein E2 (AF121950, Nukleotide 1164-2184) wurden
20mer Peptide konzipiert und durch EMC Microcollections (Tübingen) synthetisiert.
Basierend auf dem HIV-1 HxB2 Glykoprotein wurden gp120-Peptide (N35, N35s) und gp41Disulfid-Loop-Peptide (Loop36ox, Loop36s) konzipiert und im Rahmen einer Kooperation
durch das Pharmazeutische Institut der Universität Erlangen-Nürnberg synthetisiert. Die
Peptide (siehe Tabelle 5-1 und Tabelle 5-2) sind N-acetyliert und durch Präzipitation bzw.
präparative HPLC hochaufgereinigt. Peptidstocks wurden in 75% DMSO/ H2O gelöst und für
die Versuche in entsprechenden Puffern und Medien mit Protease-Inhibitoren gelöst.
Tabelle 5-1 – Verwendete E2-Peptide mit Position im E2-Protein und Peptid-Sequenz
Peptid
Position AS
Sequenz
P4
31-50
Ac-PTGERVWDRGNVTLLCDCPN
P5
41-60
Ac-NVTLLCDCPNGPWVWVPAFC
P6
51-70
Ac-GPWVWVPAFCQAVGWGDPIT
P9
81-100
Ac-LSCPQYVYGSVSVTCVWGSV
P27
261-280
Ac-PPINNCMPLGTEVSEALGGA
P28
271-290
Ac-TEVSEALGGAGLTGGFYEPL
P29
281-300
Ac-GLTGGFYEPLVRRCSELMGR
P30
291-310
Ac-VRRCSELMGRRNPVCPGYAW
P4-7
37-56
Ac-WDRGNVTLLCDCPNGPWVWV
P6-2
45-64
Ac-LCDCPNGPWVWVPAFCQAVG
P4-7s
37-56
Ac-WDRGNVTLLSDSPNGPWVWV
P6-2s
45-64
Ac-LSDSPNGPWVWVPAFSQAVG
20
Material
Tabelle 5-2– Verwendete HIV-1-Peptide (HxB2) mit Position im Glykoprotein und Sequenz
Peptid
Position AS
Sequenz
N35
31-65
Ac-EKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEV-NH2
N35s
31-65
Ac-EKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFSASDAKAYDTEV-NH2
Loop36ox
588-623
Biotin-X-KDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIW-NH2
Loop36s
588-623
Biotin-X-KDQQLLGIWGSSGKLISTTAVPWNASWSNKSLEQIW-NH2
X: ε-Aminohexanoic acid
5.5. Antikörper
HIV-1
Human α-HIV gp120:
17b, 2G12, F425 B4e8,
NIH AIDS Reagent Program, Germantown (USA)
VRC01, b12, 447-52D
bzw. Polymun Scientific, Wien (Österreich)
Human α-HIV gp41:
2F5, 4E10, 5F3, 246-D,
NIH AIDS Reagent Program, Germantown (USA)
F240, T32, D50, Chessie 8
bzw. Polymun Scientific, Wien (Österreich)
Mouse α-HIV gp120/160:
ID6
NIH AIDS Reagent Program, Germantown (USA)
Sonstige
Goat a-Biotin HRP
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Mouse a-hCD4: B4
NIH AIDS Reagent Program, Germantown (USA)
Mouse a-hCXCR4: 12G5
NIH AIDS Reagent Program, Germantown (USA)
Mouse a-hCD4 PE SK3
Becton Dickinson, Heidelberg
Mouse a-hCD184 PE
Becton Dickinson, Heidelberg
Mouse a-hCD195 PE
Becton Dickinson, Heidelberg
Mouse a-HIS HRP
GenScript Corporation, Piscataway (USA)
Rabbit a-human IgG FITC
Dako GmbH, Hamburg
Rabbit a-human IgG HRP
Dako GmbH, Hamburg
21
Material
5.6. HIV-Inhibitoren
Entry-Inhibitoren
TAK-779
(N,N-dimethyl-N-(4-[[[2(4-methylphenyl)-6,7dihydro-5H- Benzocyclo
hepten-8-yl]carbon-yl]amino]benzyl)-tetrahydro-2H- Pyran-4aminiumchlorid; CCR5-Antagonist; NIH AIDS Reagent
Program, Germantown (USA) (Baba et al., 1999)
Maraviroc (Selzentry)
4,4-difluoro-N-{(1S)-3-[3-(3-isopropyl-5-methyl-4H-1,2,4-triazol4-yl)-8-azabicyclo[3.2.1]oct-8-yl]-1-phenylpropyl}
cyclohexanecarboxamide; CCR5-Antagonist; NIH AIDS
Reagent Program, Germantown (USA)
Bicyclam JM-2987
Hydrobromid-Salz
von
AMD-3100;
1,1’[1,4] phenylenbis (methylen)]-bis
(1,4,8,11-tetra-azacyclo-tetradecan)
octahydrochlorid dihydrat; CXCR4Antagonist; NIH AIDS Reagent Program, Germantown (USA)
(De Clercq et al., 1994)
Fusionsinhibitor
Trimeris/Roche T-20
N-acetyliertes, lineares synthetisches Peptid aus 36 Aminosäuren;
bindet
gp41;
NIH
AIDS
Reagent
Germantown (USA)
5.7. Kits
Die verwendeten Kits wurden gemäß den Protokollen der Herstellerfirmen benutzt.
Cell Line Nucleofector Kit V
Amaxa AG, Köln
Galacto-Star™ Assay System
Applied Biosystems, Darmstadt
LiveBLAzer™ FRET – B/G Loading Kit
Life Technologies GmbH, Darmstadt
(mit CCF2-AM)
Murex HIV Antigen mAb
Abbott Diagnostics, Wiesbaden
®
CellTiter 96 AQueous One Solution
Cell Proliferation Assay
Promega, Mannheim
QIAGEN Endofree Plasmid Maxi Kit
Qiagen, Hilden
Roti Nanoquant
Carl Roth, Karlsruhe
22
Program,
Material
5.8. Medien
Medien für Bakterienkulturen
LB-Medium
1%
Pepton 140
(Lysogeny Broth)
0,5%
NaCl
0,5%
Bacto-Hefe-Extrakt
pH 7.2, autoklaviert
LB-Agarplatten
1,5%
Bactoagar in LB-Medium autoklaviert
NZY-Medium
0,5%
Bacto-Hefe-Extrakt
85 mM
NaCl
1%
Pepton
pH 7.5, autoklaviert
Die Selektion transformierter Bakterienklone erfolgte durch Zugabe von Ampicillin zum
Kulturmedium bzw. den LB-Agarplatten, mit einer Endkonzentration von 100 µg/ml.
Medien für Zellkulturen
DMEM Komplett-Medium
10%
fötales Kälberserum (FKS)
(Dulbecco`s Modified
0,35 mg/ml
L-Glutamin
Eagle Medium)
0,1 mg/ml
Gentamycin
RPMI Komplett-Medium
40%
RPMI
(Roswell Park Memorial
50%
Panserin
Institute)
10%
FKS
0,35 mg/ml
L-Glutamin
170 mM
Penicillin
40 mM
Streptomycin
RPMI Komplett-Medium
10 U/ml
Interleukin-2 (IL-2)
für PBMC (Stimulation)
10 µg/ml
Phytohemagglutinin (PHA)
in RPMI Komplett-Medium
Trypsin-EDTA
140 mM
NaCl
(0,25%ige Lösung)
5 mM
KCl
0,25 mM
Na2HPO4
5 mM
D(+)Glucose
25 mM
Tris
0,01%
EDTA
0,1%
Trypsin
0,5%
Phenolrotlösung
pH 7.5
23
Material
5.9. Allgemeine Lösungen und Puffer
Affinitätschromatographie
Binde-/Waschpuffer
20 mM
Natriumphosphat pH 7.4
500 mM
NaCl
20 mM
Imidazol
20 mM
Natriumphosphat pH 7.4
500 mM
NaCl
500 mM
Imidazol
0,5%
Coomassie Brilliant Blue G-250
25%
Isopropanol
10%
Essigsäure
25%
Methanol
10%
Essigsäure
1 – 1,6%
Agarose in 1 x TAE-Puffer
0,02 µg
Ethidiumbromid/ml
40%
Saccharose
1 mM
EDTA
0,25%
Bromphenolblau
TAE-Laufpuffer
40 mM
Tris-HCl
(Tris Acetate EDTA)
20 mM
NaAc
1 mM
EDTA, pH 8.0
Elutionspuffer
Coomassie-Färbung
Coomassie-Färbelösung
Gelentfärbelösung
DNA-Gele
Agarose
DNA-Auftragspuffer
pH 7.5 (mittels Essigsäure)
ELISA
Carbonatpuffer (0,1M)
0,1 M
NaHCO3
0,1 M
Na2CO3
pH 9.87
Phosphatpuffer (0,1M)
0,1 M
Na2HPO4
0,1 M
NaH2PO4
pH 7.2
Waschpuffer
0,1 M
Phosphatpuffer
0,1%
Tween 20
24
Material
Blockpuffer
0,1 M
Phosphatpuffer
1%
BSA
0,1 M
Phosphatpuffer
0,1%
BSA
Fixierungs-/Permea-
1%
Paraformaldehyd
bilisierungs-Lösung
0,1%
Tween
Probenpuffer
FACS
in PBSo (anschließend vortexen)
Luciferase-Assay
Luciferase Assay-Puffer
Luciferin Stock-Lösung
100 mM
Kaliumphosphatlösung
15 mM
Magnesiumsulfatlösung
10 mM
ATP
250 µM
Luciferin
25 mg
Trockenpulver
3,5 ml
Luciferase Assay-Puffer (25 mM)
Lysispuffer
2x Lysispuffer
für Luciferase-Assay
RIPA-Lysispuffer
62,5 mM
Tris pH 7.8
5 mM
DTT
2,5%
Triton X-100
25%
Glycerol
4,8 mM
1,2-DCTA
150 mM
NaCl
50 mM
Tris-HCl, pH 7.8
1%
Nonidet P-40
0,5%
Natriumdesoxycholat
0,1%
SDS
5 mM
EDTA
0,2 mM
PMSF
1 mg/ml
Pepstatin A
1 µg/ml
Leupeptin
1 µg/ml
Aprotinin
1
Protease Inhibitor Cocktail-Tablette je 1 l
25
Material
Polyacrylamidgelelektrophorese
Sammelgelpuffer
1M
Tris-HCl, pH 6.8
Sammelgel (5 %)
16,3%
Rotiphorese® Gel A
(nach Laemmli)
6,5%
Rotiphorese® Gel B
1 mM
Tris, pH 6.8
0,1%
SDS
0,1%
APS
0,01%
TEMED
25 mM
Tris
250 mM
Glycin
0,1%
SDS
126 mM
Tris-HCl, pH 6.8
4%
SDS
20%
Glycerol
5%
ß-Mercaptoethanol
0,02%
Bromphenolblau
Trenngelpuffer
1,5 M
Tris-HCl, pH 8.8
Trenngel (10 %)
32,5%
Rotiphorese® Gel A
(nach Laemmli)
13%
Rotiphorese® Gel B
2M
Tris, pH 8.8
0,1%
SDS
0,1%
APS
0,04%
TEMED
60 mM
Tris-HCl, pH 7.8
75 mM
KCl
5 mM
MgCl2
0,1%
Nonidet P-40
2,02 mM
EDTA, pH 8.0
5 µg/ml
Poly-A
0,16 µg/ml
Oligo-dT
4 mM
DTT
SDS-Laufpuffer (1 x)
SDS-Probenpuffer (2 x)
RT-Assay
Master-Mix
RT-Master-Mix
32
[α- P]dTTP
10 mCi/ml; 400 Ci/mmol;
NEN Amersham, AA0067
in Master-Mix
26
Material
20 x SSC
3M
NaCl
0,3 M
Na3Citrate x 2 H2O
pH 7.0
Transfektion (Kalziumphosphat)
2 x HEPES-Lösung
50 mM
HEPES
280 mM
NaCl
1,5 mM
Na2HPO4
pH 7.05
Western-Blot
Blockierungspuffer
10%
Magermilchpulver
in PBS-Tween
ECL-Lösung A
ECL-Lösung B
0,1 M
Tris, pH 8.6
25%
Luminol
0,11%
Parahydroxycoumarinsäure
in DMSO
ECL-Lösung Komplett
1%
ECL-Lösung B
0,031%
H2O2-Lösung (30 %)
in ECL-Lösung A
PBS
137 mM
NaCl
(Phosphate Buffered
2,68 mM
KCl
Saline)
7,3 mM
Na2HPO4×2H2O
1,47 mM
KH2PO4
0,49 mM
MgCl2×6H2O
0,91 mM
CaCl2×2H2O
pH 7.3 (mittels Essigsäure)
PBS-Tween
0,1%
Tween 20 in PBS
Transferpuffer (1 x)
25 mM
Tris
(Tankblot)
200 mM
Glycin
20%
Methanol
27
Material
5.10. Reagenzien und Verbrauchsmaterialien
Reagenzien
[α-32P]dTTP 10 mCi/ml, 400 Ci/mmol, AA0067
Hartmann Analytik, Braunschweig
Adenosin-5’-triphosphat-Dinatriumsalz (rATP)
Carl Roth, Karlsruhe
Agarose
Life Technologies GmbH, Darmstadt
Ammoniumperoxiddisulfat (APS)
Carl Roth, Karlsruhe
Ampicillin
GERBU Biochemicals GmbH, Gaiberg
Bakto-Yeast-Extrakt
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
Bromphenolblau
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
β-Mercaptoethanol
Carl Roth, Karlsruhe
Calciumchlorid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Coomassie Brilliant Blue G-250
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DMEM
Life Technologies GmbH, Darmstadt
Doxycyclin hyclat
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Essigsäure
Merck, Darmstadt
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ethanol
Carl Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid (EtBr)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ficoll Separating Solution
Biochrom AG, Berlin
Gentamycin-Sulfat
Life Technologies GmbH, Darmstadt
Glucose
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Glutamin
VWR International GmbH, Darmstadt
Glycin
Merck, Darmstadt
Glycerin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
HiTrap™ Protein A-Säule
GE Healthcare, München
Human Gamma Globulin (IgG)
Jackson Immuno Research, West Grove
Hygromycin B
Carl Roth, Karlsruhe
Interleukin-2 (IL-2)
NIH Reagent Program (zur Verfügung
gestellt von Roche, Penzberg)
Isopropanol
Merck, Darmstadt
Kälberserum (engl.: Fetal Bovine Serum)
PAN biotech GmbH, Karlsruhe
Kanamycin
GERBU Biochemicals GmbH, Gaiberg
LB-Agar
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
Lipofectamine™ 2000
Life Technologies GmbH, Darmstadt
D-Luciferin (synth.)
Roche Diagnostics, Mannheim
Magermilchpulver
Humana Milchunion, Herford
28
Material
Methanol
Merck, Darmstadt
Natriumchlorid (NaCl)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Natriumhydrogencarbonat
Merck, Darmstadt
Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Natriumhydroxid
Merck, Darmstadt
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Carl Roth, Karlsruhe
Ni-NTA Agarose (Ni-beads)
Qiagen, Hilden
Nonylphenyl-polyethylen Glykol (NP-40)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
®
Opti-MEM
Life Technologies GmbH, Darmstadt
TM
Page Ruler
Prestained Protein Ladder
Fermentas, St. Leon Rot
Panserin 401
PAN biotech GmbH, Aidenbach
Paraformaldehyd
Merck, Darmstadt
Pepton from Casein
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Phytohemagglutinin (PHA-P)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Protease Inhibitor Cocktail
Roche Diagnostics, Mannheim
Puromycin-Dihydrochlorid
Carl Roth, Karlsruhe
®
Roti -Nanoquant
Carl Roth, Karlsruhe
Rotiphorese Gel A (Acrylamid)
Carl Roth, Karlsruhe
Rotiphorese Gel B (Bisacrylamid)
Carl Roth, Karlsruhe
RPMI 1640-Medium
Life Technologies GmbH, Darmstadt
Salzsäure (HCl) 25%
Merck, Darmstadt
Sucrose
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
TEMED
Carl Roth, Karlsruhe
TMB Peroxidase Substrate
KPL, Gaithersburg, USA
TMB Peroxidase Substrate Solution B
KPL, Gaithersburg, USA
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)
Carl Roth, Karlsruhe
Triton X-100
Carl Roth, Karlsruhe
Trypanblau
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tween-20
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Wasserstoffperoxid (H2O2)
Merck, Darmstadt
29
Material
Verbrauchsmaterialien
1,5 ml Reaktionsgefäße
SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht
15 ml Reaktionsgefäße
SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht
50 ml Reaktionsgefäße
SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht
Centricon YM-10 Filter
Millipore Corporation, Billerica, USA
DEAE-Filtermatte
PerkinElmer, Waltham, USA
Deckgläser
Carl Roth, Karlsruhe
Einmalspritzen
Becton Dickinson (BD), Heidelberg
Elektroporationsküvetten
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen
FACS-Röhrchen
SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht
Glaswaren
Schott, Mainz
Mikrotestplatten ELISA
SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht
Objektträger
Carl Roth, Karlsruhe
PCR-Reaktionsgefäße
Thermo Fisher, Waltham, USA
PVDF-Membran
Millipore Corporation, Billerica, USA
Reservoirs
Corning, New York, USA
Säulen für Proteinreinigung
Millipore Corporation, Billerica, USA
Sterilfilter
Millipore, Billerica, USA
Szintillationswachs
PerkinElmer, Waltham, USA
Westernblot Kammern + Zubehör
Bio-Rad Laboratories, München
Whatman-Papier
Neolab Migge, Heidelberg
ZellkulturCryo-Gefäße
Nunc, Wiesbaden
Flaschen
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Platten
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Schalen
BD Falcon, Heidelberg
Zellschaber
Corning, New York, USA
Zellzählkammer
P. Marienfeld, Lauda-Königshofen
30
Material
5.11. Geräte
Bakterienbrutschrank
Memmert, Schwabach
Bakterienschüttler Multitron 2
Infors HAT, Bottmingen, Schweiz
BD™ LSR II Durchflusszytometer
Becton Dickinson (BD), Heidelberg
CCD-Kamera LAS-1000
Fuji, Tokio, Japan
Differentialinterferenzkontrastmikroskop BH-2
Olympus, Hamburg
ELISA Precision Microplate Reader
Molecular Devices Emax
Eurofins MWG Operon, Ebersberg
ELISA-Reader AxSYM
Abbott Laboratory, North Chicago, USA
ELISA-Washer
Sorin Biomedica, Düsseldorf
FACSCalibur Durchflusszytometer
Becton Dickinson (BD), Heidelberg
Gelelektrophoresekammer
Bio-Rad Laboratories, München
Gene Pulser Elektroporator
Bio-Rad Laboratories, München
Invertmikroskop Diavert
Leitz GmbH, Wetzlar
Invertmikroskop Zeiss Axiovert 200
Carl Zeiss, Jena
Magnetrührer Heidolph MR 3001
Heidolph, Heilbronn
Mastercycler gradient
Eppendorf, Hamburg
Orion Microplate Luminometer
Berthold Detection Systems, Pforzheim
Netzgerät Power Pac 300
Bio-Rad Laboratories, München
Peristaltikpumpe
Heidolph, Schwabach
Photometer
Eppendorf, Hamburg
Steri-Cult 200 Inkubator
Labotect Labor-Technik, Göttingen
Sterile Werkbank BioGard Hood
The Baker Company, Sanford, USA
Sterilwerkbank
BDK, Sonnenbühl-Genkingen
Ultrazentrifuge L7-55
Beckman Coulter GmbH, Krefeld
UV-Transilluminator
Herolab, Wiesloch
Vakuumpumpe Mini Vac E1
Axon Lab AG
Wallac 1420 Victor multilabel plate reader
PerkinElmer LAS GmbH, Rodgau
Wasserbad
Memmert, Schwabach
Wippschüttler
Gesellschaft für Labortechnik (GFL),
Burgwedel
Zentrifuge Du Pont Sorvall RC 5B
Thermo Scientific, Langenselbold
Zentrifuge Minifuge GL
Heraeus-Christ GmbH, Osterode
Zentrifuge Mikro 24-48
Hettich AG, Bäch
Zentrifuge Mikro 5417 R
Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge Rotina 420R
Hettich AG, Bäch
31
Methoden
6.
Methoden
6.1. Zellkultur
Kultivierung prokaryotischer Zellen
Zur Selektion Ampicillin-resistenter Klone wurde dem LB-Medium Ampicillin in einer
Endkonzentration von 100 µg/ml zugegeben. E. coli Zellen wurden auf Festmedium im
Brutschrank bei 37°C über Nacht angezüchtet. Die Inkubation von Flüssigkulturen erfolgte
auf einer Schüttelplattform mit ca. 200 rpm bei 37°C über Nacht.
Inkubation und Passagieren eukaryotischer Zelllinien
Alle Zellkulturarbeiten erfolgten unter sterilen Arbeitsbedingungen an einer Sterilwerkbank.
Die Kultivierung aller verwendeten Zelllinien erfolgte in Zellkultur-Platten, -Schalen oder
belüfteten Zellkultur-Flaschen in einem Inkubator bei konstant 37°C, 80% relativer
Luftfeuchte und 5% CO2. Bei einer Konfluenz von ca. 90% der adhärenten Zelllinien wurden
die Zellen mit EDTA-Trypsin gewaschen, durch 1-minütige Inkubation mit EDTA-Trypsin
abgelöst, in frischem Medium (DMEM) resuspendiert und in einem geeignetem Verhältnis in
neue
Zellkulturflaschen
passagiert.
Für
die
verwendeten
Suspensionszellen
(CEMx174 5.25M7, Jurkat) fand meist ein Passagieren im Verhältnis 1:10 in RPMI
Verwendung.
Isolierung und Kultivierung primärer Zellen
Zur Aufreinigung primärer Zellen mittels Ficollgradienten wurden je 10 ml raumtemperierte
Ficolllösung mit je 30-40 ml frischem EDTA-Blut bzw. Buffy Coat vorsichtig überschichtet.
Dieses wurde zuvor mit sterilem PBS 1:2 verdünnt. Die anschließende Zentrifugation fand
bei 2000 x g und Raumtemperatur für 20 min ohne Bremse statt. Die Granulozyten und
Erythrozyten durchdringen das Ficoll und bilden den Blutkuchen. Die der Ficolllösung
aufliegende weißliche Interphase, angereichert mit Leukozyten und Plättchen, wurde
abgenommen und in 40 ml vorgewärmtes PBS überführt. Die Plättchen wurden durch einen
weiteren Zentrifugationsschritt entfernt (10 min, 500 x g, RT) und die Leukozyten in RPMIKomplett-Medium nochmals gewaschen. Die so isolierten Leukozyten wurden auf eine
Zellkonzentration von 1-2 x 106/ml eingestellt und durch die Zugabe von 10 U/ml IL-2 und
10 µg/ml PHA für 3 Tage stimuliert. Bei der weiteren Kultivierung erfolgte die Stimulation nur
mit 10 U/ml IL-2.
32
Methoden
6.2. HIV-Infektionen
Luciferase-Assay
Bei dem Luciferase-Assay handelt es sich um eine
Biolumineszenz-Messung. Das Substrat Luciferin wird
durch Luciferase unter ATP-Verbrauch über LuciferylAMP zu Oxyluciferin und AMP umgesetzt (Abbildung 61). Im letzten Schritt entsteht durch die Absorption von
Sauerstoff die messbare Lumineszenz.
Zwei Tage nach der Infektion mit HIV-LuciferaseReporterviren (Pseudotyp-Viren) bzw. der Infektion von
Luciferase-Reporterzellen durch Wildtyp-Viren wurden
die Zellen bei 300 x g für 10 min zentrifugiert und der
Überstand verworfen. Die Zellen wurden in je 100 μl
Lysispuffer
resuspendiert
und
für
30 min
Abbildung 6-1 – Umwandlung von
Luciferin
zu
Oxyluciferin
durch
Luciferase
bei
Raumtemperatur inkubiert. Für die darauf folgende Auswertung wurden die lysierten Zellen
in eine weiße 96-Lochplatte überführt. Die Biolumineszenz-Messung erfolgte im Orion
Microplate Luminometer von Berthold Detection Systems, nachdem das Zelllysat mit 100 μl
Luciferase Assay-Puffer gemischt wurde.
Herstellung von Virusstocks
293T-Zellen wurden mit den entsprechenden Plasmiden für Virionen mittels Lipofektamine
2000™ (Life Technologies, Darmstadt) unter S3-Bedingungen transfiziert. Nach einer
dreitägigen Kultivierung wurde der virushaltige Überstand durch Zentrifugation (5 min,
300 x g, RT) von letzten Zellen getrennt und mit einem 0,45 µm Filter steril filtriert. Im
Folgenden wurden die Viren durch Zentrifugation in einer Ultrazentrifuge (90 min, 20500 x g,
4°C) durch ein Sucrosekissen pelletiert. Die Viruspellets wurden in geeigneten Mengen
Medium aufgenommen, die Viruskonzentration über einen p24-ELISA (Murex; Abbott
Diagnostics, Wiesbaden) durch die Abteilung Diagnostik (Virologie, Erlangen) quantifiziert
und aliquotiert bei - 80°C gelagert.
Infektion und Kultivierung primärer Zellen bzw. Zelllinien
Jeweils
100 µl
der
Zellkultur
(0,2 x 106/ml
stimulierte
PBMCs,
0,05 x 106/ml
CEMx174 5.25M7) wurden in 96-Lochplatten ausgesät und mit der entsprechenden Menge
an Virusstock sowie Inhibitoren versetzt. Nach einer 4-stündigen Inkubation wurden die
Zellen zweimal mit Medium bzw. PBS gewaschen (5 min, 300 x g, RT) und in Medium
kultiviert. Die Probenahme virushaltiger Zellkulturüberstände erfolgte in der Regel alle 2-3
Tage mit anschließender Zugabe frischen Mediums.
33
Methoden
Messung der Reversen Transkriptase-Aktivität
Die Aktivität der viralen Reversen Transkriptase (RT) wurde ermittelt, um die Anzahl
gebildeter, funktionsfähiger Viren in infizierten Zellkulturen zu bestimmen. Hierfür wurden die
bei -80°C aufbewahrten Zellkultur-Überstände bei 37°C aufgetaut und anschließend letzte
Zellen durch Zentrifugation (5 min, 300 x g, RT) vom Überstand getrennt. 10 µl dieses
Überstandes wurden jeweils mit 50 µl des mit [α-32P]dTTP-markierten RT-Mastermixes in
96-Lochplatten gemischt und bei 37°C für 3 h inkubiert. Nachfolgend wurden jeweils 4 µl der
markierten Ansätze auf DEAE-Membranen aufgetragen, viermal in 2 x SSC-Puffer und
zweimal in vergälltem Ethanol für 10 min auf einem Plattformschüttler gewaschen. Nach
Trocknung der DEAE-Membranen (20 min, 65°C) konnte das Szintillationswachs mit Hilfe
einer 100°C heißen Heizplatte auf die DEAE-Membranen aufgeschmolzen und die
Membranen in Plastikschutztüten eingeschweißt werden. Die RT-Aktivität wurde durch
Messung der radioaktiven Signale im jeweiligen Ansatz an einem Szintillationsmessgerät
quantifiziert. Der Virusgehalt jedes Überstandes wurde in Dreifachansätzen gemessen,
gemittelt und anhand der zur Infektion verwendeten Virusstöcke, quantifiziert.
6.3. Fusionsuntersuchungen
Zell-Zell-Fusionsassay
Der
zellbasierte
Fusionsassay
beruht
auf
der
α-Komplementation
des
Enzyms
β-Galaktosidase aus den beiden Fragmenten alpha (α) und omega (ω) (Holland et al., 2004).
Zur Durchführung des Zell-Zell-Fusionsassays wurden die dafür verwendeten Zellen 2 Tage
vor der Fusion mit der Kalziumphosphat-Methode transfiziert. Dafür wurden 293T-Zellen mit
Plasmiden für das α-Fragment und ein HIV-Hüllprotein (z.B. NL4-3env) bzw. mit Plasmiden
des ω-Fragments und der HIV-(Ko-)Rezeptoren CD4 und CCR5 transfiziert. Am Tag der
Fusion wurden die α- und ω-Zellen in gleicher Menge in einer 24-Lochplatte vereinigt. Nach
etwa 16-18 h erfolgte die Auswertung der HIV-spezifischen Fusion. Dafür wurden die
fusionierten Zellen in 100 µl Lysispuffer (Beta Galactostar) lysiert und mit Reaktionspuffer,
der in einer 50-fachen Verdünnung das β-Galaktosidase Substrat (Beta Galactostar) enthält,
versetzt. Die Lumineszenz-Messung erfolgte im Orion Microplate Luminometer nach einer
Inkubationszeit von 1 h bei Raumtemperatur.
34
Methoden
Virus-Zell-Fusionsassay
Für die Durchführung des virusbasierten Fusionsassays wurden 1 Tag vor Infektion 3x104
TZM-bl Zellen in 96-Lochplatten (flacher Boden) ausgesät. Bei Verwendung von
Suspensionszellen
wurden
3x105
CEMx174 5.25M7-Zellen
oder
1x106
PBMC
in
96-Lochplatten (runder Boden) vorbereitet. Am Tag des Fusionsassays wurden die Zellen
mit Sucrose-gereinigten HIV-1 NL4-3BlaM-Vpr Virionen (5ng p24/Ansatz) infiziert und in einem
Gesamtvolumen von 100 µl für 4 h bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Zellen mit HBSSMedium zweimal gewaschen, um ungebundene Viruspartikel zu entfernen. Die Färbung mit
dem
CCF2-AM
Substrat
wurde
entsprechend
der
Beschreibung
des
Herstellers
durchgeführt. Die Inkubation mit dem Farbstoff erfolgte in 100 µl Lösung üN bei RT.
Anschließend
wurden
die
Zellen
zweimal
mit
HBSS
gewaschen
und
in
1,2%
Paraformaldehyd fixiert. Die Bestimmung der BlaM-Aktivität erfolgte durch Messung der
Emissionsänderung von CCF2-AM (Abbildung 6-2). Dabei wurde die Emission bei 447 nm
(blau/gespaltener Farbstoff) und 520 nm (grün/ungespaltener Farbstoff) nach einer Anregung
bei 409 nm gemessen. Für adhärente Zellen fand die Messung im Wallac 1420 Victor
multilabel plate reader (PerkinElmer LAS GmbH, Rodgau) statt. Die Rate der Virus-ZellFusion wurde aus dem Verhältnis von blauer zu grüner Emission berechnet. Die Auswertung
der BlaM-Aktivität für Suspensionszellen erfolgte durch die Messung der Emissionsänderung
in einem BD™ LSR II Durchflusszytometer (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). Die
Durchflusszytometer-Daten wurden mit BD FACSDiva™ aufgezeichnet und mit dem
Programm FCS Express V3 ausgewertet.
Abbildung 6-2 - FRET-basierte Wirkungsweise des Farbstoffs CCF2-AM (LiveBLAzer™ FRET–B/G Loading Kit
Protokoll, Invitrogen)
35
Methoden
6.4. Transfektionsverfahren
Kalziumphosphat-Methode
Am Vortag der Transfektion wurden etwa 5x105 293T-Zellen/Loch einer 6-Lochplatte
ausgesät, so dass diese bei der Durchführung der Transfektion eine Konfluenz von ca.
70-80% aufwiesen. Bereits 4 h vor der Transfektion wurde das verbrauchte Zellkulturmedium
in den Kulturgefäßen durch frisches Medium ersetzt. Pro Ansatz wurde für die Transfektion
ein DNA-Gemisch bestehend aus 3 µg DNA, 50 µl CaCl2 und MilliQ-H2O in einem Volumen
von 250 µl hergestellt. Unter kräftigem Vortexen wurde das DNA-Gemisch langsam in 250 µl
2xHEBS-Puffer eingetropft. Die Lösung wurde 20 min bei RT inkubiert und anschließend
langsam auf die Zellen gegeben. Präzipitate zeigten sich als kleine, schwarze Punkte in den
Kulturgefäßen. Nach weiteren 4-6 h Inkubation im Inkubator wurde ein Medienwechsel
durchgeführt.
Lipofektion
Adhärente Zellen (TZM-bl) wurden einen Tag vor der Transfektion in Antibiotika-freiem
DMEM ausgesät. Bei einer Konfluenz von ca. 90% erfolgte die Transfektion der Zellen nach
Herstellerangaben mit Lipofektamine™ 2000 (Life Technologies GmbH, Darmstadt).
Elektroporation
Mit Hilfe der Elektroporation wurden Suspensionszellen, wie CEMx174 5.25M7- oder JurkatZellen transfiziert. Dies erfolgte mit dem Nucleofector-Kit V der Fa. Amaxa/Lonza (Köln)
speziell für die Transfektion von Jurkat-Zellen oder mittels eines Gene Pulser Elektroporators
der Fa. Bio-Rad (München).
Am Tag der Transfektion wurden jeweils 2x106 Jurkat-Zellen in 100 µl Nucleofector Solution
(Amaxa) bzw. in 170 µl Opti-MEM Medium resuspendiert. Für jede Elektroporation wurden
4 µg Plasmid-DNA bzw. 2 µg pmaxGFP als Kontrolle verwendet, die für beide Varianten in
etwa 15 µl PBS vorbereitet und anschließend mit 100 µl Zellsuspension vermischt wurden.
Für die Elektroporation mit dem Nucleofector-Kit wurden die entsprechenden AmaxaKüvetten verwendet und die Zellen mit dem Programm X-001 elektroporiert. Für die
Transfektion mit dem Bio-Rad Elektroporator wurden Elektroporations-Küvetten der PEQLAB
Biotechnologie
GmbH
mit
einem
Elektrodenabstand
von
4 mm
verwendet.
Die
Elektroporation wurde bei 975 µF und 250 V durchgeführt.
Abschließend wurden die transfizierten Zellen in vorgewärmtem RPMI-1640 Medium
resuspendiert und in eine 6-Lochplatte ausgesät.
36
Methoden
6.5. Proteinbiochemische Methoden
Anreicherung von Immunoadhäsinen über Agarosebeads
Über eine Ni-NTA Agarose Matrix ist es möglich, Proteine mit His-Tag aus ZellkulturÜberständen
anzureichern
und
zu
reinigen.
Hierfür
wurden
pro
Ansatz
100 µl
Agarosekügelchen-Suspension (entsprechen 50 µg Ni-Agarose mit 100 µg Bindekapazität)
mit PBS gewaschen (10 min, 250 x g) und über Nacht mit 1 ml Zellkultur-Überstand bei 4°C
im Rotator inkubiert. Anschließend wurden die Nickel-Agarosekügelchen zweimal mit PBS
gewaschen, die Proteine durch Zugabe von 20 µl 1xSDS-Probenpuffer und Inkubation der
Ansätze für 10 min bei 95°C eluiert und mit Hilfe eines Western-Blots analysiert.
Reinigung von Immunoadhäsinen über Affinitätschromatographie
Die
Aufreinigung
von
rekombinantem
E2340-Fc-Fusionsprotein
erfolgte
mittels
Affinitätschromatographie aus Zellkultur-Überständen E2-produzierender Zellen. Die bei 4°C
gelagerten Zellkulturüberstände wurden mit einem 0,22 µm Filter steril filtriert, ebenso wie
alle anderen für die Chromatographie verwendeten Puffer. Für die Chromatographie wurde
eine HisTrap™ HP-Säule verwendet, die an eine Peristaltikpumpe (Heidolph, Schwabach)
angeschlossen war. Die Säule wurde mit Bindepuffer equilibriert, danach ZellkulturÜberstand mit einer Flussrate von 0,5-1 ml/min über die Säule gepumpt und im Anschluss
ungebundenes Material mit Waschpuffer entfernt. Die Elution des Proteins erfolgte mit
Elutionspuffer bei einer maximalen Flussrate von 1 ml/min in 5 ml Fraktionen. Nach dem
Waschen der Säule mit H2Obidest. wurde diese bis zur nächsten Verwendung in 20% Ethanol
bei 4°C aufbewahrt. Die Analyse des Proteingehalts in den einzelnen Fraktionen erfolgte
mittels Western Blot. Die Fraktionen mit dem höchsten Proteingehalt wurden anschließend
mit dem Ultrafiltrationskonzentrator Centricon YM-10 umgepuffert, die Proteinmenge
bestimmt und aliquotiert bei -20°C bzw. -80°C gelagert.
SDS-PAGE
Für die Durchführung einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden
diskontinuierliche Polyacrylamidgele (PAA-Gele) verwendet, die entsprechend der Größe
des zu untersuchenden Proteins nach Lämmli (Laemmli, 1970) hergestellt wurden.
Die jeweiligen Proben wurden mit 5x SDS-Probenpuffer versetzt, bei 95-100°C 10 min
denaturiert und auf das Gel geladen. Die Gelelektrophorese erfolgte bei 120 V für etwa
90 min in TRIS-Glycin Laufpuffer. Als Proteinstandard wurden 5 µl des PageRuler™
Prestained Protein Ladder (11-170 kDa; Fermentas, St. Leon-Rot) verwendet.
37
Methoden
6.6. Immunologische Nachweismethoden
Western-Blot
Nach erfolgter Gelelektrophorese wurden die Proteine aus dem SDS-Gel durch das TankBlot-Verfahren mit Hilfe einer Protean-Transfereinheit (Bio-Rad, München) auf PVDFMembranen (Hybond-P; Millipore Corporation, Billerica, USA) übertragen. Die PVDFMembran wurde zuvor in MeOH aktiviert und die Proteine nach Herstellerangaben bei
350 mA für 1 h transferiert. Anschließend wurde die Membran für 1 h bei RT oder über Nacht
bei 4°C in Blockierungspuffer inkubiert. Danach erfolgte die Inkubation mit dem
entsprechenden 1. Antikörper, der teilweise bereits HRP-(horse-radish peroxidase)
gekoppelt vorlag, für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4°C. Teilweise erfolgte nach
dreimaligem Waschen die Inkubation mit dem zweiten HRP-gekoppelten Antikörper. Nach
weiteren drei Waschschritten erfolgte der Nachweis der HRP-konjugierten Antikörper im
Immunoblot durch das ECL-System durch photographische Dokumentation mittels
CCD-Kamera und dem Programm Image Reader LAS-1000 der Fa. Fujifilm Medical Systems
(Valencia, USA).
Anti-HIV-1 gp120/gp41 ELISA
Für
direkte
HIV-1
gp120/gp41-Bindungsassays
wurden
unbeschichtete
96-Loch-
Mikrotestplatten von Sarstedt verwendet. Zuerst erfolgte die Beschichtung der ELISA-Platten
mit rekombinanten HIV-1 gp120- (0,5 µg/ml) bzw. gp41- (0,22 µg/ml) Proteinen oder mit
Streptavidin (4 µg/ml) in 100 µl Carbonatpuffer bei 4°C üN. Nach dem Abkippen der HIV-1
Glykoproteine wurden die Platten mit Blockierungspuffer für 1 h bei RT inkubiert. Nach
viermaligem Waschen mit jeweils 300 µl Waschpuffer folgte bei Streptavidin-beschichteten
Platten die Behandlung mit gp41-Disulfid-Loop-Peptiden (2,5 µM) und im Folgenden die
Inkubation aller Platten mit den Liganden (E2340-Fc, Fc-Kontrolle) in verschiedenen
Verdünnungen in 100 µl Probenpuffer für 3 h bei RT. Zur Durchführung von kompetitiven
ELISAs
wurden
5 µg/ml
des
E2340-Fc
Proteins
bzw.
100 µM
der
monoklonalen
gp41-Antikörper (246-D, F240, T32, D50, 2F5, 4E10, Chessie 8 und 5F3) verwendet. Die
E2-Peptide wurden in steigenden Mengen zugegeben. Nach einem weiteren Waschschritt
erfolgte die Inkubation mit dem 1. Antikörper. Dies war je nach verwendetem Liganden
entweder 100 µl/Ansatz polyklonaler Rabbit a-human IgG HRP Antikörper (1:6000 in
Probenpuffer) oder 100 µl/Ansatz polyklonaler Goat a-Biotin HRP Antikörper (1:4000 in
Probenpuffer). Nach erneutem Waschen folgte die Behandlung mit 100 µl/Ansatz TMB
2-Komponenten Peroxidase bzw. OPD/H2O2 Substratlösung (in Dunkelheit) für höchstens
30 min bei RT. Die Reaktion wurde mit dem entsprechenden Volumen von 1 M H3PO4
abgestoppt und die Absorption bei 450 nm bzw. 492 nm in einem Multi-channel Photometer
(ELISA-Reader AxSym, Abbott) gemessen.
38
Methoden
Sechs-Helix-Bündel (6-HB) ELISA
Der 6-HB ELISA wurde von Dr. Peng Zou (Blood Centre, New York) und Dr. Lu Lu (Fudan
University, Shanghai) im Rahmen einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Shibo
Jiang nach dem in He et al. beschriebenen Protokoll durchgeführt (He et al., 2008). Die
Beschichtung der 96-Lochplatten erfolgte mit dem 6-HB-spezifischen monoklonalen
Antikörper NC-1 IgG, (2 µg/ml in 0.1 M Tris, pH 8.8), danach wurden die Platten mit 2%
Milchpuffer inkubiert. N36 (0,25 µM), E2-Peptide und C34 als Kontrolle wurden in steigenden
Konzentrationen zugegeben. Nach der Inkubation für 30 min bei 37°C erfolgte die Zugabe
von C34-Biotin (0,25 µM), eine Inkubation für 45 min bei 37°C und anschließend sechs
Waschschritte (PBS mit 0,05% Tween-20). Die Absorptionsmessung bei 450 nm fand nach
der Behandlung mit Streptavidin-markierter HRP und dem Substrat TMB statt.
FACS-Analyse (Durchflusszytometrie)
Verschiedene Zelllinien oder stimulierte PBMCs wurden für die FACS-Analyse zweimal in
PBS gewaschen (5 min, 300 x g, RT). Pro Färbeansatz wurden 1x106 Zellen mit den
entsprechenden Antikörpern etwa 30 min bei 4°C inkubiert. Danach erfolgten erneut ein
Waschschritt der Zellen mit PBS (5 min, 300 x g, RT) und die Resuspension in PBS.
Durchflusszytometrische Analysen wurden mit Hilfe des BD FACSCalibur™ und BD™ LSRII
(BD Biosciences, Heidelberg) durchgeführt und mit dem Programm FCSExpress V3
ausgewertet.
Fluoreszenzbasierte Zellsortierung
Grün-fluoreszierende Tet-Off Zellen wurden geerntet, zweimal in PBS gewaschen (5 min,
300 x g, RT) und in PBS/1mM EDTA mit einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml gelöst.
Die Aufkonzentrierung der positiven Zellen erfolgte mittels FACS am Nikolaus-FiebigerZentrum für molekulare Medizin der Universität Erlangen-Nürnberg.
6.7. Bioinformatik
Die bioinformatischen Untersuchungen wurden im Rahmen einer Kooperation von Prof. Dr.
Heinrich Sticht und Kristin Kassler (Institut für Biochemie, Universität Erlangen-Nürnberg)
durchgeführt. Globuläre und ungeordnete Regionen im E2-Protein wurden mit GlobPlot2.3
(Linding et al., 2003) durch die Verwendung von Standardmethoden identifiziert.
Sekundärstrukturvorhersagen des E2-Proteins erfolgten durch die Konsensus-VorhersageMethode des NPS@ Servers (Deleage et al., 1997). Strukturelle Homologe wurden mit dem
bioinfo.pl meta prediction server identifiziert (Ginalski et al., 2003). Das Modellieren erfolgte
mit Modeller6.2 (Sanchez and Sali, 2000), wobei ein single-variable-domain Antikörper (PDB
code: 2Z8W) als Vorlage diente (Henderson et al., 2007). Der Sequenzvergleich zwischen
E2 und gp160 wurde mit LALIGN (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)
und dessen alignment-Option durchgeführt.
39
Ergebnisse
7.
Ergebnisse
Gegenstand dieser Arbeit ist die Aufklärung der Interferenz zwischen dem GB Virus C
(GBV-C) und dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV). In Zellkultur-Experimenten konnte
gezeigt werden, dass GBV-C direkt die Replikation von HIV-1 hemmt, wobei mindestens
zwei GBV-C Proteine für diese Inhibition verantwortlich sind (Jung et al., 2005; Xiang et al.,
2004). Zum einen beeinflusst das Nichtstruktur-Protein NS5A vermutlich frühe Schritte im
HIV-Replikationszyklus, zum anderen vermindert das E2-Glykoprotein das Entry der HI-Viren
in die Wirtszellen (Jung et al., 2007; Koedel et al., 2011; Xiang et al., 2006).
7.1. GBV-C Nichtstruktur-Proteine
Replikation
unterdrücken
die
HIV-1
Um die Wirkung der GBV-C Nichtstruktur-Proteine auf die HIV-1 Replikation zu untersuchen,
sollten die entsprechenden Proteine kontrollierbar in T-Zellen exprimiert werden. Hierfür
wurde das Tet-System etabliert (Gossen and Bujard, 1992; Gossen et al., 1995). Diese
Methode ermöglicht die induzier- oder unterdrückbare Expression von Fremdgenen, wobei
die Transkription in Anwesenheit von Tetrazyklin oder einem Derivat reversibel an- oder
abgeschaltet werden kann. In dieser Arbeit wurde das Tet-off System verwendet, in dem
durch Zugabe des Antibiotikums Doxyzyklin, einem Tetrazyklin-Derivat, die Expression der
Zielgene selektiv gestoppt wird (siehe Abbildung 7-1).
tTA
pTet-Off Regulator-Plasmid
PCMV
tTA bindet TRE und aktiviert Transkription
in Abwesenheit von Doxyzyklin
tetR
Entfernen von
Doxyzyklin
Transkription
TRE PminCMV
Gen X
Transkription
TRE PminCMV
EGFP
Gen X
EGFP
Antwort-Plasmid
Zugabe von
Doxyzyklin
Abbildung 7-1 – Das Tet-Off System
Mit Hilfe des Tet-Off Systems können Proteine kontrolliert exprimiert werden. Dafür werden ein Regulator- und ein AntwortPlasmid in die Zielzellen transfiziert. Das Regulatorkonstrukt kodiert für tTA (tet-responsive transcription activator), welches an
TRE (tet-responsive element) bindet und die Transkription der Zielgene startet. Nach Zugabe von Doxyzyklin wird tTA reversibel
inaktiv und die Transkription der Zielgene gestoppt.
40
Ergebnisse
Das Tet-System besteht aus einem Regulator- und einem Antwort-Plasmid, welche
gemeinsam in den Zielzellen stabil exprimiert werden. Das Regulatorkonstrukt kodiert für den
tetracycline-responsive transcription activator (tTA), einem Fusionsprotein das konstitutiv
exprimiert wird. Das Antwort-Plasmid, ein bicistronischer Vektor, steht unter Kontrolle des
tet-responsive elements (TRE) und kodiert die zu exprimierende cDNA der verschiedenen
GBV-C Gene [kloniert von Dr. S. Jung, (Jung, 2010)] sowie im zweiten Cistron das enhanced
green
fluorescent
protein
(EGFP).
Der
EGFP-kodierenden
Sequenz
ist
zur
Translationsinitiation eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) vorangestellt. In
Abwesenheit von Doxyzyklin bindet tTA an TRE und aktiviert damit die Transkription der
bicistronischen RNA und somit die Expression des gewünschten Gens sowie die des EGFP.
Durch die Expression des fluoreszierenden Proteins ist es mittels fluoreszenzaktivierter
Zellsortierung (FACS) möglich, die Zellen zu selektionieren, die den eingebrachten Vektor
effizient exprimieren.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Transfektion von Jurkat T-Zellen durch
Elektroporation, wobei die Antwort-Plasmide von drei verschiedenen GBV-C NichtstrukturProteinen (NS3, NS4A, NS5A) verwendet wurden. Daraufhin erfolgte die Selektion mit
Hygromycin, um eine stabile Expression zu erlangen. Die Kontrolle der stabilen ProteinExpression erfolgte durch Quantifizierung des EGFP im FACS. Zusätzlich konnten positive
Zellen durch fluoreszenzbasierte Zellsortierung aufkonzentriert werden. Abbildung 7-2 zeigt
die entsprechenden FACS-Daten vor und nach dem Aufsortieren sowie nach Zugabe des
Doxyzyklins, welches die Expression der Zielgene (GBV-C und EGFP) wieder deutlich
hemmt. Eine vollständige Abschaltung der Proteinexpression konnte allerdings nicht erreicht
werden.
Struktur-Gene
structural genes
Nichtstruktur-Gene
non-structural genes
p5.6
E1
5‘ UTR
TM
E2
TM
NS2
NS3
NS4A
NS4B
NS5A
NS5B
3‘ UTR
(+)ssRNA
Vektor
25
aa 1
P1
P3
NS3
NS4A
5,84%
0,44%
P2
P5
NS5A
NS3/4A
198
40
P4
P7
P6
P9
P8
P11
5,35%
P10
P13
P12
P15
P14
P17
P16
P19
P18
P21
P20
P23
P22
P25
P24
P27
nach Aufkonzentrierung:
0,34%
11,49%
aa 340
3,97%
putative E2 fusion peptide
P26
P29
P28
P31
P30
P33
39,64%
66,29%
26,67%
34,97%
0,93%
6,87%
1,20%
5,17%
P32
nach Doxyzyklin-Zugabe:
0,22%
Abbildung 7-2 – Expression der GBV-C Proteine im Durchflusszytometer
Die GBV-C Nichtstrukturproteine NS3, NS4A, die Kombination NS3/4A und NS5A wurden mittels Elektroporation in Jurkat
T-Zellen transfiziert. Die Kontrolle der Expression erfolgte mittels Durchflusszytometrie nach der Transfektion (Reihe 1), nach
dem Aufkonzentrieren durch fluoreszenzbasierte Zellsortierung (Reihe 2) und nach dem Herunterregulieren der Expression
durch Doxyzyklin (Reihe 3).
41
Ergebnisse
Zusätzlich wurde die Expression der Nichtstruktur-Proteine aus den Zelllysaten im WesternBlot überprüft. Da die GBV-C Gene zusätzlich mit einem c-myc-Tag fusioniert waren, erfolgte
der Nachweis durch einen c-myc Antikörper. Eine Bestätigung der Proteinexpression war
hier nur teilweise möglich (Abbildung 7-3). NS3-exprimierende Zellen zeigten eine
entsprechende Bande bei 72 kDa und NS4A konnte mit einer Bande bei 30 kDa
nachgewiesen werden. Im Unterschied dazu war der Nachweis der Expression von NS3,
wenn beide Proteine in Kombination (NS3/4A) transfiziert waren, nicht möglich. Ebenso
58kDa
NS5A
NS3/4A
30kDa
NS4A
72kDa
NS3
Vektor
konnte die Expression des NS5A-Proteins im Western-Blot nicht eindeutig bewiesen werden.
Abbildung 7-3 – Expression der GBV-C Proteine im
kDa
Western Blot
70
Die GBV-C Nichtstrukturproteine NS3, NS4A, die Kombination
55
NS3/4A und NS5A wurden mittels Elektroporation in Jurkat
40
T-Zellen
transfiziert.
Nach
dem
Aufkonzentrieren
durch
fluoreszenzbasierte Zellsortierung erfolgte die Kontrolle der
35
Expression mittels SDS-PAGE und Western Blot. Der Nachweis
25
der Konstruktexpression fand durch einen c-myc Antikörper statt.
Zur Bestimmung der HIV-1-inhibitorischen Wirkung der drei GBV-C Nichtstruktur-Proteine
wurden die proteinexprimierenden Jurkat Tet-Off T-Zellen mit HIV-1NL4-3 infiziert und in
regelmäßigen Abständen Zellkulturüberstände abgenommen, die bei -80°C aufbewahrt
wurden. Die Quantifizierung der HIV-1 Replikation erfolgte durch Messung der aktiven
4000
Reversen
Transkriptase
(RT)-Aktivität
bzw.
der
p24-Antigen-Konzentration
in
den
Überständen (Abbildung 7-4).
3000
1000
2000
2000
1000
1000
0
4
4
7
77
dpi
dpi
tet-off
NS3
NS4A
NS3/4A
Vektor
11
11
NS5A
NS3
dpi
NS4A
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
00
11
4
4
NS3/4A
7
7
dpi
11
11
Zusammenfassung
Hemmung HIV durch GBV-C Proteine
100%
100,0%
RT-Aktivität
p24-Quantifizierung
80%
80,0%
Hemmung der HIV-Replikation
3000
3000
00
HIV-1 p24 Antigenquantifizierung
(x1000pg/ml)
p24
antigen (x1000pg/ml)
p24 Antigen
RT-Aktivität
ccpm[ccpm]
ccpm
Radioaktiver RT-Assay
2000
4000
4000
Hemmung der HIV-1 Replikation
B.
A.
60%
60,0%
Reverse Transkriptase
p24
40%
40,0%
20%
20,0%
0%
0,0%
NS3
NS3
NS4A
NS4A
NS3/4A
NS3/4A
NS5A
NS5A
NS5A
Abbildung 7-4 – Hemmung der HIV-1 Replikation durch GBV-C Nichtstrukturproteine
A. Jurkat Tet-Off Zellen, welche die GBV-C Nichtstrukturproteine NS3, NS4A, NS3/4A und NS5A exprimieren, wurden mit
HIV-1NL4-3 infiziert und der Verlauf der Replikation durch die Messung der aktiven Reversen Transkriptase und p24-Antigen
quantifiziert (Durchführung RT-Aktivität: Dr. André Eißmann, Virologie, Erlangen).
B. Zusammenfassung der gemessenen HIV-1 Hemmung in GBV-C Protein-exprimierenden T-Zellen an Tag 11 nach erfolgter
HIV-1 Infektion.
42
Ergebnisse
Die Ergebnisse in Abbildung 7-4 zeigen eine deutliche Hemmung der HIV-1NL4-3 Replikation
nach Expression der beiden Nichtstruktur-Proteine NS3 und NS5A sowie durch das
Fusionsprotein NS3/4A im Vergleich zu leeren Vektorzellen (grau).
Im Folgenden wurde durch Zugabe von Doxyzyklin die Proteinexpression reduziert und die
HIV-Replikation in voll- oder reduziert-exprimierenden Zellen verglichen (siehe Abbildung 72). Hierbei erfolgte wiederum die Infektion mit X4-tropen HIV-1 (NL4-3) und die Auswertung
der RT-Aktivität (Abbildung 7-5). Dabei konnten die Ergebnisse aus dem Vorversuch
(Abbildung 7-4) bestätigt werden. Zum einen war erneut keine Beeinflussung der HIVReplikation durch das NS4A-Protein nachweisbar, zum anderen führte die Reduktion der
Expression von NS3 bzw. NS5A (rote Linien) zu einer leicht verbesserten Replikationskinetik
von HIV-1NL4-3.
NS3
NS4A
15000
Replikation
12000
12000
durch
GBV-C
+
-
6000
6000
RT-Aktivität [ccpm]
RT-Aktivität [ccpm]
12000
9000
9000
3000
3000
+
-
9000
6000
00
5
7
9
11
14
17
3
5
7
NS3/4A
15000
9
11
14
NS5A
18000
+
-
9000
9000
6000
6000
3000
3000
+
-
15000
RT-Aktivität [ccpm]
12000
12000
12000
5
5
7
7
9
9
dpi
11
11
14
14
17
GBV-C
Proteinexpression zeigten, wurden mit HIV-1NL4-3
Messung der aktiven Reversen Transkriptase
6000
quantifiziert (Durchführung: Dr. André Eißmann,
3
17
die
behandelte Zellen (rot), die eine reduzierte
0
3
3
welche
infiziert und der Verlauf der Replikation durch die
9000
3000
00
Zellen,
NS5A exprimieren (grün) bzw. mit Doxyzyklin-
17
NS5A
dpi
dpi
NS3/4A
15000
Tet-Off
Nichtstrukturproteine NS3, NS4A, NS3/4A und
0
3
Nichtstrukturproteine
Jurkat
3000
RT-Aktivität [ccpm]
RT-Aktivität [ccpm]
Abbildung 7-5 – Hemmung der HIV-1
NS4A
NS3
15000
15000
3
5
5
7
7
9
9
dpi
11
11
dpi
43
14
14
17
17
Virologie, Erlangen).
Ergebnisse
7.2. Das GBV-C Glykoprotein E2 inhibiert HIV-1 Entry
Vorarbeiten unserer Gruppe konnten zeigen, dass das E2-Glykoprotein von GBV-C an der
Hemmung früher Schritte der HIV-1 Replikation beteiligt ist. Durch die Verwendung von
HIV-1 Viruspartikeln, die anstelle der gp120/gp41-Hüllproteine ein heterologes Glykoprotein
inkorporierten, konnte jedoch kein Effekt des E2-Proteins auf die HIV-Replikation
nachgewiesen werden. Dies impliziert, dass sich der HIV-1 inhibitorische Effekt des
E2-Proteins auf die frühen Entry-Schritte beschränkt, die vom HIV-Glykoprotein gp120/gp41
vermittelt werden. Hierbei ist die Inhibition durch die E2-Expression in Zellen aber auch
durch die Inkubation von Zellen mit rekombinantem E2-Protein zu beobachten (Jung et al.,
2007). Deshalb sollten im Folgenden Verfahren etabliert werden, die isoliert den Einfluss des
E2-Proteins auf den Eintritt von HIV-1 in Zellen untersuchen und bestätigen können.
A.
kDa
B.
F1
F2
F3
F4
F5 F6
F7 F8
F9 F10 -
Ü
+
F1
F2
F3
F4
F5 F6
F7 F8
F9 F10 -
Ü
+
130
100
70
55
Abbildung 7-6 - Western Blot (A) und Coomassie-Färbung (B) einer E2-Aufreinigung
Die Proteinaufreinigung über eine HisTrap™ HP-Säule erfolgte durch Elution mit einer 500 mM Imidazol-Lösung in 5 ml
Fraktionen. F1-F10 E2-Fraktionen 1-10; Ü Zellkultur-Überstand E2-produzierender 293T-Zellen;
+ Positivkontrolle E2340-Fc 1 µg; - Negativkontrolle Zellkultur-Überstand 293T-Zellen
Für die E2-Inhibitionsversuche fand ein rekombinantes verkürztes E2340-Fc Fusionsprotein
des Isolates AF121950 (Iowa-Isolat) Verwendung (Jung et al., 2007). Bei diesem Protein
wurde die Transmembran-Domäne durch die humane IgG1-Fc-Domäne und einen myc/HisTag ersetzt und zusätzlich N-terminal um das IgG-Signalpeptid erweitert. Um weiterführende
Untersuchungen der E2-vermittelten HIV-1 Replikationshemmung im Rahmen dieser Arbeit
durchzuführen, wurde rekombinantes E2-Protein aus stabil exprimierenden 293T-Zellen
aufgereinigt.
Die Aufreinigung
aus
Zellkultur-Überständen erfolgte über
HisTrap™
HP-Säulen mit anschließender Elution durch eine 500 mM Imidazol-Lösung in 5 ml Aliquots.
Mittels Coomassie-Färbung der Protein-enthaltenden Fraktionen konnte gewährleistet
werden, dass der Reinigungsgrad der Proteine ausreichend hoch (>80-90%) war (Abbildung
7-6 B). Der spezifische Nachweis des rekombinanten E2-Proteins fand im Western-Blot mit
einem HRP-gekoppelten anti-human IgG-Antikörper statt, welcher den Fc-Teil des Proteins
bindet. In Abbildung 7-6 A ist dieser E2-Nachweis nach einer Aufreinigung und der Elution in
zehn Fraktionen dargestellt. Der Vergleich mit der Positivkontrolle, welche aus einer früheren
Aufreinigung stammt, zeigt hohe Mengen an E2-Protein in den Fraktionen 2 bis 4. Diese
Fraktionen wurden für nachfolgende Versuche vereinigt und in PBS umgepuffert. Danach
erfolgte ein weiterer Western-Blot zur Kontrolle sowie die Bestimmung der aufgereinigten
Protein-Menge mittels Roti Nanoquant (Daten nicht gezeigt).
44
Ergebnisse
Um den Einfluss des E2-Poteins insbesondere auf den HIV-Eintritt zu untersuchen, wurden
zwei verschiedene HIV-spezifische Entry-Assay etabliert und durchgeführt.
Während der HIV-1 Virusinfektion fusioniert die Virus- mit der Zellmembran, nachdem das
gp120/gp41-Glykoprotein von HIV-1 mit dem CD4-Rezeptor und dem entsprechenden
Korezeptor (CCR5 oder CXCR4) eine Bindung eingegangen ist und aufeinanderfolgende
Konformationsänderungen des gp120/gp41-Trimers stattgefunden haben. Diese HIV-1
spezifische Membranfusion kann mit Zell-Zell-Fusionsassays simuliert werden, wenn eine
Zellfraktion die HIV-Hüllproteine und eine andere Zellfraktion die HIV-Rezeptoren exprimiert.
Um die Zellfusion zu verfolgen, kann man die Synzytienformierung auswerten oder einen
Reporter verwenden, der erst durch die Fusion beider Zellfraktionen aktiviert wird. Im
Rahmen dieser Dissertation wurde deshalb die α-Komplementation durchgeführt. Als
Reporter wird hierbei die Aktivität der ß-Galaktosidase gemessen, ein Enzym, das nur als
Tetramer enzymatisch aktiv ist. Bei der sogenannten α-Komplementation kann dieses
Tetramer in zwei Fragmente geteilt werden, das N-terminale α-Peptid (Aminosäuren 1-80)
und das C-terminale ω-Fragment (Aminosäuren 80-1029), die in trans komplementieren
können [Abbildung 7-7 A; (Moosmann and Rusconi, 1996; Ullmann et al., 1967)]. Die
räumlich getrennte Expression der beiden Fragmente führt zur enzymatischen Inaktivität. Bei
einer Fusion beider Zellfraktionen treffen die beiden ß-Galaktosidase-Fragmente aufeinander
und die Enzymaktivität wird wieder hergestellt.
A.
B.
RLU/s
α peptide
β-Galaktosidase
ω peptide
Moosmann et al., Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 6
Aktives lacZ-Tetramer
lacZ-
Abbildung 7-7 – Der Zell-Zell-Fusionsassay
A. Das Enzym β-Galaktosidase kann in das N-terminale α- und
das C-terminale ω-Fragment unterteilt werden (Moosmann and
Fusion
Rusconi, 1996).
B. 293T-Zellen wurden entweder mit den Plasmiden für das
α-Fragment und ein virales Hüllprotein oder mit den Plasmiden
lacZ-α
lacZ-ω
für das ω-Fragment und den HIV-Rezeptoren kotransfiziert.
Zwei Tage nach Transfektion fand die durch die viralen
Glykoproteine vermittelte Zell-Zell-Fusion statt. Die Messung
der Enzymaktivität (in RLU/s) wurde mit Hilfe des BetaGalactostar-Kits durchgeführt.
45
Transfektion von
293T Zellen mit
lacZ-α und NL4-3env
oder ADAenv
lacZ-ω und CD4/CXCR4
oder CD4/CCR5
Ergebnisse
Zur Durchführung des Zell-Zell-Fusionsassays (Abbildung 7-7 B) wurden zwei verschiedene
293T-Zellpopulationen hergestellt. Die eine Fraktion wurde mit den Plasmiden des
α-Fragmentes und der HIV-spezifischen Hüllproteine (pNL4-3env oder pADAenv), die andere
293T-Fraktion mit den Plasmiden der ω-Fragmente und der HIV-Rezeptoren CD4 und CCR5
bzw. CXCR4 transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion erfolgte die Vorinkubation der
Zellen mit dem E2340-Fc Protein und die Zusammenführung (Fusion) der Zellen. Um
unspezifische Reaktionen durch eine Bindung des Fc-Anteils vom E2340-Fc Fusionsprotein
an zelluläre Bindungsstellen auszuschließen, wurde kurz vor der E2340-Fc Zugabe eine
Inkubation mit humanem Immunglobulin durchgeführt. Diverse HIV-Entry-Inhibitoren, wie der
Fusionsinhibitor T-20 bzw. die Korezeptorantagonisten AMD-3100 und TAK-779, dienten als
Kontrolle der Fusionshemmung. Nach der üN-Inkubation beider Zellfraktionen wurde die
Aktivität der ß-Galaktosidase mittels des Beta-Galactostar Tests im Luminometer gemessen.
Die Ergebnisse, in Abbildung 7-8 dargestellt, zeigen vergleichbare Fusionsdaten für X4- und
R5-trope HIV-Hüllproteine.
R5-trope Zell-Zell-Fusion
100%
100%
80%
80%
Hemmung der Zell-Zell-Fusion
Hemmung der Zell-Zell-Fusion
Hemmung der Zell-Zell-Fusion
X4-trope Zell-Zell-Fusion
100%
100%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
0%
80%
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
0%
(3 µM)
++ AMD-3100
AMD-3100
++
T-20
(0,3 µM)
T-20
++
Fc Fc
(21nM)
+ E2(340)-Fc (21nM)
+E2(340)Fc
+
(6 µM)
+TAK-779
TAK-779
+ T-20
(0,3 µM)
+ T-20
+ Fc
(21nM)
+ Fc
+ E2(340)-Fc (21nM)
+E2(340)Fc
Abbildung 7-8 - Einfluss des E2-Proteins auf die HIV-spezifische Zell-Zell-Fusion
Zwei Tage vor der Zell-Zell-Fusion wurden 293T-Zellen dem Protokoll entsprechend transfiziert. Am Tag der Fusion wurden die
Zellen mit AMD-3100 (3 µM), TAK-779 (6 µM), T-20 (0,3 µM), dem Fc- oder E2340-Fc Protein (je 21 nM) für 30 min vorinkubiert
und die α- und ω-Zellen üN vereinigt. Die Auswertung erfolgte durch Messung der Lumineszenz ausgelöst durch das
funktionale Enzymtetramer β-Galaktosidase. Dargestellt ist die Hemmung vorbehandelter im Vergleich zu Mock-behandelten
Zellen im X4-bzw. R5-tropen Kontext.
Die Vorinkubation mit den Entry-Inhibitoren T-20, AMD-3100 und TAK-779 führt wie erwartet
zu einer deutlichen Hemmung der Zell-Zell-Fusion. Hierbei ist T-20 als Fusionsinhibitor bei
beiden Tropismen wirksam. AMD-3100, welches CXCR4 bindet, ist ausschließlich bei der
Fusion wirksam, die durch ein X4-tropes Hüllprotein vermittelt wird; entsprechend wirkt
TAK-779, als CCR5-Antagonist nur, wenn die Zellen bei der Zell-Zell-Fusion ein R5-tropes
HIV-Hüllprotein exprimieren. Nach der Vorinkubation mit dem rekombinanten E2340-Fc
Protein konnte jedoch kein wesentlicher Einfluss auf die Effizienz der Zell-Zell-Fusion
nachgewiesen werden, wohingegen die Fc-Kontrolle (Negativ-Kontrolle) allein eine
Hemmung der HIV-1 Fusion von 30-50% zeigt. Da vermutet wurde, dass der Zell-ZellFusionstest mitunter nicht die physiologischen Bedingungen widerspiegelt, wie sie bei einer
46
Ergebnisse
Virus-Zell-Fusion vorliegen, wurde im Weiteren ein HIV-1 spezifischer Virus-Zell-Fusionstest
etabliert und angewendet.
Für den Virus-Zell-Fusionsassay, der von Cavrois und Mitarbeitern (2002) entwickelt wurde,
werden intakte infektiöse HIV-Partikel verwendet, die das Enzym ß-Laktamase inkorporiert
haben. Nach der Fusion der Virus- mit der Zellmembran kann die β-Laktamase in das
Zytoplasma der Zielzelle gelangen und dort einen Zellfarbstoff enzymatisch prozessieren.
Für diesen Assay wurde die kodierende Sequenz von ß-Laktamase an das vpr-Gen von
HIV-1 fusioniert. Da beim Budding dieses Fusionsprotein ebenso effizient wie das natürliche
Vpr-Protein in das HIV-Partikel inkorporiert wird, können so enzymhaltige HIV-1 Virionen
hergestellt werden (Abbildung 7-9). Die HIV-Zielzellen werden nach der Infektion mit CCF2,
einem fluoreszierenden Substrat von β-Laktamase (BlaM), gefärbt. Dessen Spaltung kann
durch FACS-Analyse, Fluoreszenzspektroskopie oder -mikroskopie sichtbar gemacht
werden. Deutliche Vorteile dieses Assays bestehen zum einen in der Tatsache, dass man
statt modifizierter Zellen HI-Virionen verwenden kann und man zum anderen nicht auf
transfizierbare Zellen beschränkt ist. Somit kann diese Methode mit unterschiedlichsten
HIV-empfänglichen Zelllinien sowie mit primären Zellen durchgeführt werden und spiegelt
folglich die realen Bedingungen einer Virusinfektion wider.
409nm
HIVBlaM-Vpr
Virionen
520nm
CCF2
293T Zellen
Transfektion von 293T-Zellen
mit BlaM-Vpr und proviraler DNA
Infektion von HIV-Zielzellen
mit HIVBlaM-Vpr
und CCF-2 Färbung
447nm
gespaltenes
CCF2
Analyse
mittels Durchflusszytometrie oder
Fluoreszenzspektroskopie
Abbildung 7-9 – Der Virus-Zell-Fusionsassay
Zur Produktion infektiöser Viren wurden 293T-Zellen mit proviraler DNA (NL4-3; NL4-3-R5) und einem Plasmid für ein
β-Laktamase (BlaM)-Vpr-Fusionsprotein transfiziert. Die über Sucrose aufgereinigten BlaM-Viren können Zelllinien oder primäre
Zellen über die HIV-Rezeptoren infizieren. Nach der Infektion ändert sich durch die Spaltung des β-Laktamrings in CCF2 das
Fluoreszenz-Emissionsspektrum von grün (520 nm) zu blau (447 nm) nach einer Anregung bei 409 nm, wobei die Analyse im
Fluorometer oder Durchflusszytometer erfolgen kann.
47
Ergebnisse
Für die Versuchsreihe wurde der X4-trope HIV-Laborstamm NL4-3 mit inkorporiertem
β-Laktamase (BlaM)-Vpr-Fusionsprotein (NL4-3BlaM-Vpr) verwendet. Zur Herstellung dieser
Viren wurden 293T-Zellen mit einem infektiösen HIV-Klon (pNL4-3) und einem Plasmid
transfiziert, welches für das BlaM-Vpr-Fusionsprotein kodiert (siehe Abbildung 7-9). Aus dem
Zellkultur-Überstand wurden die infektiösen Viren geerntet und über ein Sucrosekissen
angereichert. Als Zielzellen wurden die HIV-empfänglichen Zelllinien TZM-bl und
CEMx174 5.25M7 verwendet. Die TZM-bl Zelllinie ist ein Abkömmling einer Zervix-KarzinomZelllinie (HeLa). Die CEMx174 5.25M7 Zellen entstammen einer Fusion aus B- und T-Zellen.
Beide Zelllinien exprimieren sowohl CD4 als auch die HIV-Korezeptoren CXCR4 und CCR5
auf der Oberfläche. Nach der Vorinkubation der Zielzellen mit den Entry-Inhibitoren T-20
oder AMD-3100 sowie dem E2340-Fc und Fc-Protein wurde die Infektion mit NL4-3BlaM-Vpr
Virionen durchgeführt. Der Abbildung 7-10 ist zu entnehmen, dass die Entry-Inhibitoren T-20
und AMD-3100 bei beiden Zelllinien erwartungsgemäß zu einer deutlichen Hemmung der
Virus-Zell-Fusion führen. Des Weiteren ist aber auch eine Hemmung durch das
rekombinante E2340-Fc Protein zu verzeichnen, während die Fc-Kontrolle zu keiner
nennenswerten Behinderung der Virus-Zell-Fusion führt (Abbildung 7-10). Somit konnte
durch die Verwendung eines HIV Virus-Zell-Fusionsassays eindeutig gezeigt werden, dass
das GBV-C E2-Protein den Eintritt von HIV-1 in die Zelle hemmt.
B. CEMx174 5.25M7
CE M xR5, 5ng X 4; E 2; 17. 05. 2010
100%
100%
80%
80%
80%
80%
Hemmung d er Virus-Zell-Fusio n
100%
100%
Hemmung der Virus-Zell-Fusion
Hemmung der Virus-Zell-Fusion
A. TZM-bl
60%
60%
60%
60%
40%
40%
40%
40%
20%
20%
20%
20%
0%
0%
T20
+0,3µM
T-20
2µM AMD-3100
+ AMD-3100
+ Fc
21nM Fc
21nM E2(340)-Fc
+E2(340)Fc
0%
0%
+ T-20
T-20
+ AMD-3100
AMD-3100
+15µgFcFc
+E2(340)30µg E2 Fc
Abbildung 7-10 – Einfluss des E2-Proteins auf die HIV-1-spezifische Virus-Zell-Fusion
TZM-bl (A) oder CEMx174 5.25M7-Zellen (B) wurden nach der Zugabe von HIV-Entry-Inhibitoren (0,3 µM T-20, 2 µM
AMD-3100), Fc- oder E2340-Fc Protein (je 21 nM) mit NL4-3BlaM-Vpr Virionen für 4 h bei 37°C infiziert. Die Analyse der Virus-ZellFusion erfolgte durch Messung der Fluoreszenzänderung bei 520 nm oder 447 nm nach einer Anregung bei 409 nm im
Fluorometer (A) oder Durchflusszytometer (B). Dargestellt ist die Hemmung vorbehandelter im Vergleich zu mock-behandelten
Zellen.
48
Ergebnisse
7.3. E2-Peptide hemmen die HIV-1 Replikation im Infektionsassay
Weiterführende Untersuchungen zur suppressiven Wirkung des E2-Proteins wurden mit
E2-abgeleiteten 20mer-Peptiden durchgeführt, für die in Vorarbeiten unserer Gruppe eine
HIV-inhibierende Wirkung beschrieben werden konnte. Dabei zeigte sich, dass insbesondere
die Peptide HIV-inhibitorisch waren, die den N-Terminus von Aminosäure (AS) 29 bis 72 des
E2-Proteins repräsentieren. In einem Infektionsassay in TZM-bl Zellen erwiesen sich die
Peptide P5 (AS 41-60), P4-7 (AS 37-56) und P6-2 (AS 45-64) bzw. eine Kombination aus
beiden Peptiden P4762 (AS 37-64) am wirksamsten (IC50 0,1 bis 2 µM). Bei der
Untersuchung der Wirkungsbreite der Peptide offenbarten sich aber Unterschiede in der
Hemmbarkeit primärer Isolate (Koedel et al., 2011). Um sicherzustellen, dass diese
Differenzen nicht auf die Reporter-Zelllinie zurückzuführen sind, wurde im Rahmen dieser
Arbeit die antiretrovirale Aktivität der E2-Peptide auch in primären Zellen (PBMC, Abbildung
7-11 A) und in einer lymphoiden HIV-Reporter-Zelllinie (CEMx174 5.25M7, Abbildung 711 B) getestet. Dafür erfolgte die Infektion der Zellen mit verschiedenen Primärisolaten nach
Zugabe der hemmenden E2-Peptide P4-7, P5 und P6-2 sowie der Negativkontrolle P28. Die
Positivkontrolle war in allen Ansätzen T-20, das als Fusionsinhibitor wirksam ist. In
regelmäßigen Abständen wurde die Effizienz der HIV-Infektion quantifiziert. Bei den
Infektionsansätzen mit CEMx174 5.25M7-Zellen wurde die Aktivität des Reporters
(Luciferase), der in diesen Zellen unter der Kontrolle eines HIV-LTR steht, direkt aus dem
Zelllysat bestimmt. Bei den PBMC wurde die HIV-Infektion quantifiziert, indem im ZellkulturÜberstand anstelle von HIV-Antigen (p24) direkt infektiöses HIV ermittelt wurde. Hierfür
wurden die PBMC-Zellüberstände auf die HIV-Reporter-Zelllinie CEMx174 5.25M7 überführt
und die erfolgreiche HIV-Infektion wurde wiederum mittels des Luciferase-Reporters
bestimmt.
Der Vergleich der HIV-1 Replikationshemmung eines R5-tropen Primärisolat (HIV-192TH026) in
primären Zellen bzw. einer T-Zelllinie ist in Abbildung 7-11 dargestellt. Das Peptid P28, als
Negativkontrolle, zeigt wie erwartet keinerlei Hemmung der HIV-1 Replikation. Die Peptide
P4-7, P5 und P6-2 weisen ein ähnliches Hemmverhalten auf, welches sich jedoch in den
verwendeten Zelllinien unterscheidet. Eine Zusammenfassung der Daten für das
inhibitorische E2-Peptid P6-2 auf die Replikation aller untersuchten HIV-Isolate zeigt Tabelle
7-1. Die Inhibition der Replikation durch die E2-Peptide ist nicht bei allen HIV-1 Stämmen zu
beobachten, was vergleichbar zu den Versuchen in TZM-bl Zellen ist. In primären Zellen
scheinen die E2-Peptide ein breiteres Wirkungsspektrum vorzuweisen als in Zelllinien. Somit
hängt die Eigenschaft der E2-Peptide, bestimmte HIV-Isolate zu hemmen, nicht nur vom
HIV-Isolat, sondern auch von dem verwendeten Zellsystem ab.
49
Ergebnisse
A. PBMC
B. CEMx174 5.25M792TH026 (R5)
92TH026 (R5)
160%
160%
120%
140%
140%
100%
100%
120%
120%
80%
80%
100%
100%
Hemmung
Hemmung
Hemmung der HIV-192TH026
Replikation
120%
80%
80%
60%
60%
60%
60%
40%
40%
40%
40%
20%
20%
0%
0%
20%
20%
5µl T20
10µg 4-7
T-20
P4-7
10µg 5
10µg 6-2
P5
P6-2
E2-Peptide
10µg 28
P28
0%
0%
5µl T20
T-20
10µg 4-7
10µg 5
P4-7
10µg 6-2
P5
P6-2
E2-Peptide
10µg 28
P28
Abbildung 7-11 - Hemmung der HIV-1 Replikation durch E2-Peptide
Darstellung des Einflusses der E2-Peptide (20 µM) und T-20 (6 nM) auf die Replikation des R5-tropen HIV-192TH026 in PBMC (A)
und CEMx174 5.25M7-Zellen (B). Die Quantifizierung der Hemmung erfolgte durch Infektion von CEMx174 5.25M7-Zellen mit
Überständen der PBMC (nach 7-10 Tagen) bzw. nach Zelllysat-Entnahme der CEMx174 5.25M7-Zellen (nach 3 Tagen). Die
Infektiosität wurde mit Hilfe des Luciferase-Assays bestimmt. Die Hemmung berechnete sich aus der Differenz der Aktivität
wt-infizierter und Inhibitor-inkubierter Zellen.
Tabelle 7-1 – Reaktivität von HIV-1 Stämmen
Interferenz zwischen P6-2 und HIV-1 Stämmen auf
a
verschiedenen Zelllinien
Tropismus
b
TZM-bl
CEMx174-M7-R5
PBMC
HIV-1
Stamm
Subtyp
92UG029
A
X4
+
+
+
SF33
B
X4
+
+
n.d.
YU-2
B
R5
+
-
+
JRCSF
B
R5
-
-
-
92TH026
B
R5
-
-
+
92UG035
D2
R5
-
-
n.d.
92UG024
D3
X4
+
+
+
93BR029
F1
R5
-
-
n.d.
93BR020
F2
X4
-
-
-
RU570
G
R5
+
+
+
V1557
H
X4/R5
-
-
n.d.
a
+ Hemmung der HIV-1 Replikation >70%; – Hemmung der HIV-1 Replikation <30%.
b
veröffentlicht in (Koedel et al., 2011). n.d.: nicht durchgeführt.
50
Ergebnisse
7.4. N-terminale E2 Peptide inhibieren HIV-1 Entry
Nachdem die Hemmung der HIV-1 Replikation durch die GBV-C E2-abgeleiteten Peptide auf
unterschiedlichen Zelllinien und primären Zellen gezeigt werden konnte, sollte auch der
Einfluss der E2-Peptide auf die frühen Schritte des HIV-1 Replikationszyklus, wie Bindung
oder Fusion, untersucht werden. Dies erfolgte, wie beim E2-Protein, mit dem etablierten
Virus-Zell-Fusionsassay. Hierbei wurde sowohl der Einfluss der N-terminalen E2-Peptide P4
(AS 31-50) und P6 (AS 51-70) als auch der C-terminalen E2-Peptide P27 bis P30 (jeweils
20mere von AS 261 bis insgesamt 310) auf die Fusionseffizienz eines X4-tropen
(NL4-3BlaM-Vpr) und eines R5-tropen HIV-Isolates (NL4-3-R5BlaM-Vpr) untersucht. Als Zielzellen
wurden Zelllinien (CEMx174 5.25M7-Zellen; TZM-bl Zellen) sowie PBMC verwendet. Die
Bestimmung der β-Laktamase Aktivität erfolgte durch Messung der Emissionsänderung des
Farbstoffs CCF2. Dabei wurde die Emission bei 447 nm (blau/gespaltener Farbstoff) und
520 nm (grün/ungespaltener Farbstoff) nach einer Anregung bei 409 nm gemessen. Die
Auswertung erfolgte bei Suspensionszellen (PBMC und CEMx174 5.25M7-Zellen) mittels
durchflusszytometrischer Analyse (Abbildung 7-12). Der Einfluss der Peptide auf den HIV-1
Eintritt in die adhärenten TZM-bl Zellen wurde mittels Fluorometer quantifiziert (Abbildung 713).
A. PBMC
R5
8,0%
1
2
10
10
1,3%
1
3
2
10
1,3%
1
10 1
10 1
10 1
2
3
4
5
2
3
4
510 1
2
3
4
2
3
4
5
10
10
10
10 10
10 10 10 10 10 10 10 10
10
10 410 10 10
Pacific
Blue-A
5ng X4
+10µgBlue-A
28
5ng X4 +10µg 29
5ng 10
X4 +10µg
Pacific
5ng X4
+10µg
6
10
10
10
1,6%
1
3
2
+ P28
5
10
4
10
3
10
2
1,9%
1
10
Pacific Blue-A
4
10
3
10
2
10
10,6%
1
10 1
10 1
10 1
2
3
4
5
2
3
4
5
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Pacific Blue-A
Pacific
Blue-A
+ P29
5
10
10
2
10
3
4
Pacific Blue-A
10
10
10
9,2%
10 1
10
5
10
10
10
1
10
2
10
3
4
Pacific Blue-A
+ P4
Pacific
Blue-A
5
4
3
2
10
0,6%
10
10
10
2
3
2
3
10
10
10
10
10
10
8,2%
10
2
10
3
10
4
Pacific Blue-A
10
25,6%
1
10 1
10 10
5
+ P4
1
10
1
10
4
X4 Pacific
+ 10µg Blue-A
4
5
4
2
10
10
0,6%
1
3
2
0,5%
1
4
3
2
4
10
3
10
2
8,4%
1
Pacific Blue-A
10
4
10
3
10
2
10
13,1%
1
10 1
5
10 10
10
2
10
3
4
14,1%
1
10 1
10
5
10
Pacific Blue-A
10
2
10
3
2
10
10
+ P6
10
10
10
10
10
4
Pacific Blue-A
10
1,2%
1
10
3
2
10
10
5
4
3
2
10
3
10
2
10
0,9%
1
+ P27
5
4
3
2
10
10
10
10
24,8%
1
10
10 101
5
10
2
10
3
10
4
Pacific Blue-A
Mock
5
10
4
3
2
10
10
10
36,2%
1
10
2
10
3
10
4
10
4
10
3
10
2
0,1%
10
2
3
2
3
10
5
Pacific Blue-A
10
10
10
10
10
10
1,0%
10
2
10
3
10
4
Pacific Blue-A
Infizierte Zellen (447nm)
10
10
10
2
10
3
2
3
10
2
10
3
4
5
10
Pacific Blue-A
10
10
10
510
10
3
2
10
10
10
0,5%
10
10
3
10
4
Pacific Blue-A
10
10
0,4%
1
10
2
10
4
10
1
2
3
4
10
10
10
Blue-A
R5 Pacific
+ 10µg 27
+ P27
5
4
3
2
10
4
3
2
10
10
10
10
10
3
10
4
Pacific Blue-A
1,4%
1
10
1
2
3
4
5
10
10
10
10
10 10
Blue-A
R5 Pacific
+ 10µg 30
5
2,1%
2
+ TAK-779
5
10
1
10
1
10 10
5
R5 + TAK-779
+ T-20
5
+ P6
1
10
1
10 10
5
4
Blue-A
R5Pacific
+ 20µg 6
5
4
10
2,4%
1
10 1
10 10
5
+ P4
1
10
1
10
4
R5 Pacific
+ 20µg 4Blue-A
5
4
R5 + T20
NL4-3-R5
10
1
10 1
10
+ P30
5
10
1
5
10 10
25ng R5
Mock
5
10
4
10
10
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
10
10
10
10 10
10
10
10
10
10 10
Blue-A
Blue-A
X4 Pacific
+ 10µg 27
X4 Pacific
+ 10µg 30
1,0%
2
3
10
5
10
1
10
1
5
10 10
4
X4Pacific
+ 10µg Blue-A
6
5
4
3
10
4
Qdot 655-A
2
10
10
5
+ AMD3100
Qdot 655-A
3
10
Qdot 655-A
10
10
5
Pacific Blue-A
Qdot 655-A
10
10
Qdot 655-A
4
1
10 1
10
10
3
+ TAK-779
4
10 1
2
3
4
510 1
2
3
4
5
5
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
5ng X4
+10µgBlue-A
28
5ng X4
+10µgBlue-A
29
Pacific
Pacific
Pacific
Blue-A
+ P29
+ P6
+ P28
5
5
10
10
10 1
10 1
2
3
4
2
3
4
5
10 10 10 10 10 10 10 10 10
10
X4 + AMD-3100
+ T-20
Qdot 655-A
5
10
Qdot 655-A
2
10
X4 + T20
NL4-3
Qdot 655-A
5
Qdot 655-A
Nicht-Infizierte Zellen (520nm)
Qdot 655-A
Qdot 655-A
Mock
10
3
10
10
5
R5
5ng X4
Mock
10
10
16,5%
1
10
3,2%
X4
10
2
10
4
Infizierte Zellen (447nm)
B. CEMx174 5.25M7
4
3
10
1
5
10
0,6%
1
10
TAK-779
+ T-20
5
Qdot 655-A
2
10
4
10
Qdot 655-A
3
+ P6
5
2
Qdot 655-A
10
4
3
10
10 1
10 1
2
3
4
5
2
3
4
5
10 10
10
105ng 10
10 10 10 105ng 10
X4 +10µg 6
X4 +10µg 4
Qdot 655-A
10
Pacific
Blue-A
+ P4
5
Qdot 655-A
10
Qdot 655-A
10
10
4
Qdot 655-A
3
10
Qdot 655-A
10
10
NL4-3-R5
5
Qdot 655-A
0,6%
1
10
10
10
Qdot 655-A
2
10
10
T-20
25ng R5
Mock
4
Qdot 655-A
3
10
Mock
10
Qdot 655-A
2
10
4
5
Qdot 655-A
3
10
10
4
+ AMD3100
5
Qdot 655-A
10
4
+ T-20
5
Qdot 655-A
10
10
Qdot 655-A
10
10
4
AMD-3100
T-20
NL4-3
5
Qdot 655-A
10
5ng X4
Mock
Qdot 655-A
Mock
Qdot 655-A
Qdot 655-A
Qdot 655-A
Nicht-Infizierte Zellen (520nm)
X4
5
10
510
+ P30
5
4
3
2
2,6%
1
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
Pacific Blue-A
Abbildung 7-12 - Einfluss E2-Peptide auf die HIV-1-spezifische Virus-Zell-Fusion in Suspensionszellen
Suspensionszellen (PBMC [A] und CEMx174 5.25M7 [B]) wurden 1 h mit den Kontrollen T-20 (0,3 µM), AMD-3100 (2 µM) und
TAK-779 (6 µM) sowie mit den E2-Peptiden (50 µM) inkubiert. Danach erfolgten die Infektion mit HIV-1 NL4-3BlaM-Vpr bzw.
NL4-3-R5BlaM-Vpr und die Inkubation für 4 h bei 37°C. Nach 2 Waschschritten wurden die Zellen üN mit dem Farbstoff CCF2-AM
behandelt und die Infektionsrate mittels Durchflusszytometer bestimmt. Die Daten zeigen jeweils einen exemplarischen
Versuch der Virus-Zell-Fusion.
51
Ergebnisse
TZM-bl
X4
R5
Hemmung der Virus-Zell-Fusion [%]
80
80%
80
80%
60
60%
60
60%
40
40%
40
40%
20
20%
0%0
25ng R5
100
100%
Hemmung der Virus-Zell-Fusion [%]
Hemmung der Virus-Zell-Fusion
5ng X4
100
100%
20
20%
T20
+ T-20
AMD3100
+ AMD-3100
+Pep
P44
+P6
Pep 6
Pep 27
+P27
Pep 30
+P30
0
0%
+ T-20
T20
+ TAK-779
TAK779
+Pep
P44
+P66
Pep
+P27
Pep 27
+P30
Pep 30
E2-Peptide
E2-Peptide
Abbildung 7-13 – Einfluss der E2-Peptide auf die HIV-1-spezifische Virus-Zell-Fusion in adhärenten Zellen
TZM-bl Zellen wurden 1 h mit den Kontrollen T-20 (0,3 µM), AMD-3100 (2 µM) und TAK-779 (6 µM) sowie mit den E2-Peptiden
(50 µM) inkubiert. Danach erfolgten die Infektion mit HIV-1 NL4-3BlaM-Vpr bzw. NL4-3-R5BlaM-Vpr und die Inkubation für 4 h bei
37°C. Nach 2 Waschschritten wurden die Zellen üN mit dem Farbstoff CCF2-AM inkubiert und die Infektionsrate mittels Wallac
1420 Victor multilabel plate reader bestimmt. Die Daten zeigen jeweils einen exemplarischen Versuch der Hemmung der VirusZell-Fusion. Die prozentualen Angaben wurden im Vergleich zu mock-behandelten Zellen berechnet.
In allen Zelllinien und primären Zellen konnte eine deutliche Hemmung der Virus-Zell-Fusion
von sowohl des verwendeten X4-tropen als auch des R5-tropen HIV-Isolats durch die
N-terminalen E2-Peptide P4 und P6 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu ist keine
HIV-hemmende Wirkung C-terminaler E2-Peptide (P27-P30) nachweisbar (Abbildung 7-13).
52
Ergebnisse
7.5. E2-Peptide beeinflussen die späten Schritte des HIV-1 Entrys
Im Folgenden sollte nun der Teilschritt des HIV-Entrys identifiziert werden, welcher durch die
E2-Peptide beeinflusst wird. Die Infektion von HIV beginnt mit der Bindung an die
Rezeptoren CD4 und die Korezeptoren CXCR4 oder CCR5. Da die Expression der
HIV-Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzellen eine große Rolle für die Effektivität der
Infektion spielt (Reeves et al., 2002), sollte zuerst überprüft werden, inwieweit E2-Peptide
Einfluss auf die Präsentation von diesen Rezeptoren nehmen. Hierbei kamen primäre Zellen
(PBMC) sowie TZM-bl Zellen, die sowohl CD4 als auch die Korezeptoren exprimieren, zum
Einsatz. Nach Inkubation der Zellen mit verschiedenen Positivkontrollen zeigte sich mittels
durchflusszytometrischer Analyse deutlich die Regulierbarkeit der Rezeptoren (Abbildung 714). Der Phorbol-Ester PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) führt zur verminderten
Oberflächen-Präsentation des CD4-Rezeptors, PMA und SDF1-α zur Reduktion des
Korezeptors CXCR4 während RANTES die Internalisierung von CCR5 induziert. Wie in
Abbildung 7-14 ersichtlich ist, zeigten die E2-abgeleiteten Peptide keinen wesentlichen
Einfluss auf die CD4- oder Korezeptor-Präsentation. Somit kann ein Einfluss der GBV-C
E2-Peptide
auf
die
Oberflächen-Präsentation
der
HIV-Rezeptoren
als
möglicher
Wirkmechanismus der GBV-C E2-Peptide ausgeschlossen werden.
PBMC; CXCR4
PBMC; CD4
100%
100%
100%
100%
CD4
80%
80%
100%
*
80%
60%
40%
20%
20%
40%
60%
60%
40%
*
40%
0% PMA
PMA
P4-7
P4-7
P6-2
P6-2
P28
P28
*
40%
20%
20%
0% PMA SDF1-α P4-7
0%
0%
60%
40%
20%
20%
CCR5
80%
**
Downregulation of CCR5
60%
Downregulation of CXCR4
60%
PBMC; CCR5
100%
CXCR4
80%
80%
Downregulation of CD4
Hemmung der Expression
A. PBMC
PMA
SDF
P4-7
P6-2
P6-2
P28
P28
0% RANTES P4-7
0%
Rantes
P4-7
P6-2
P6-2
P28
P28
B. TZM-bl
100%
100%
100%
**
80%
80%
Downregulation of CXCR4
**
CXCR4
80%
**
60%
60%
40%
40%
40%
20%
20%
20%
60%
40%
20%
60%
60%
40%
0%
PMA
0% PMA SDF1-α P4-7
0%
P4-7
P4-7
P6-2
P6-2
P28
P28
60%
40%
**
20%
20%
0% PMA
CCR5
80%
Downregulation of CCR5
CD4
80%
Downregulation of CD4
Hemmung der Expression
100%
100%
80%
TZM-bl; CCR5
TZM-bl; CXCR4
TZM-bl; CD4
100%
PMA
SDF
P4-7
0% RANTES P4-7
0%
P6-2
P6-2
P28
P28
Rantes
P4-7
P6-2
P6-2
P28
P28
Abbildung 7-14 – Effekt der E2-Peptide auf die Expression der HIV-Rezeptoren
Die CD4-, CXCR4- und CCR5-Expression wurde auf PBMC (A) und TZM-bl-Zellen (B) nach Vorinkubation mit E2-Peptiden
(25 µM), Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA; 40 ng/ml), SDF1-α (1 µg/ml) oder RANTES (50 nM) mittels DurchflusszytometerAnalyse bestimmt. Dargestellt ist die Hemmung der Expression durch den RTCN-Wert (ratio-to-cell-negative), der den
Quotienten aus der Prozentzahl positiver Zellen und der Fluoreszenzintensität von Peptid-inkubierten im Vergleich zu mockinkubierten Zellen darstellt. Wilcoxon rank-sum test (zweiseitig): *: p<0.05; **: p<0.01 (mock- vs. Inhibitor-inkubierte Zellen).
53
Ergebnisse
Im Folgenden sollte mit dem bereits etablierten Virus-Zell-Fusionsassay untersucht werden,
ob die E2-Peptide auf frühe (CD4-Bindung) oder spätere (Korezeptor-Bindung bzw.
anschließende Membranfusion) HIV-1 Entry-Schritte Einfluss nehmen. Dafür kam ein
besonderer Versuchsaufbau, der sogenannte temperature-arrested state (TAS) zum Einsatz.
Hierbei lässt man die HIV-1 NL4-3BlaM-Vpr-Partikel durch Aufzentrifugieren (Spin-inoculation)
bei einer Temperatur von 4°C an die Zielzellen binden. Dadurch interagieren die Viren
lediglich mit dem CD4-Rezeptor und der Fusionsprozess arretiert in einem intermediären
Stadium (Henderson and Hope, 2006; Melikyan et al., 2000). Konformationsänderungen, die
nach der gp120/CD4-Bindung erfolgen und die Korezeptor-Bindung, die 6-Helix-BündelAusbildung und die Fusion mit der Zielzell-Membran bewirken, sind bei Temperaturen unter
28°C nicht möglich (Gallo et al., 2001; Jacobs et al., 2007). Erst nach der gp120/CD4Bindung erfolgt die Zugabe der Inhibitoren. Im Anschluss daran wird der temperaturearrested state bei 23°C für 1 h aufrechterhalten bis die Temperaturerhöhung auf 37°C erfolgt,
um die vollständige Infektion (Korezeptor-Bindung und Fusion) der Zellen zu ermöglichen.
Somit wird, im Gegensatz zum normalen Versuchsaufbau, beim TAS-Experiment der
Einfluss der Inhibitoren nach der CD4-Bindung auf spätere Eintrittsschritte ermittelt.
Die Ergebnisse der Entry-Kinetik (nach CD4-Bindung; schwarze Balken) zeigt Abbildung 715 in Gegenüberstellung mit der normalen Inkubation, die ausschließlich bei 37°C
durchgeführt und bei der die Inhibitoren kurz vor der HIV-Inokulation zugegeben wurden (vor
CD4-Bindung; graue Balken). Als Kontrollen wurden HIV-Entry-Inhibitoren eingesetzt, die
entweder früh auf die Interaktion zwischen gp120 und CD4 wirken (anti-gp120 Antikörper
b12 [α-CD4-binding site] und anti-CD4 Antikörper B4) oder die spät auf die KorezeptorBindung (AMD-3100) oder die anschließende Fusion (gp41-Antikörper 2F5) Einfluss
nehmen. Hierbei war deutlich erkennbar, dass die E2-Peptide P4-7 und P6-2, entsprechend
den Kontrollinhibitoren für die späteren Schritte (AMD-3100 und 2F5), sowohl unter normalen
als auch unter TAS-Bedingungen volle HIV-inhibitorische Aktivität zeigten. Im Unterschied
dazu war die Wirkung der Antikörper b12 und B4 auf die Virus-Zell-Fusion unter TASBedingungen signifikant reduziert (Abbildung 7-15). Dies resultiert aus den nicht mehr
erreichbaren Bindungsstellen (CD4-Bindungsstelle an gp120 bzw. CD4-Rezeptor) nach
bereits erfolgter CD4-Bindung. Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass die
inhibitorischen E2-Peptide erst nach der gp120-CD4-Bindung in den Entry-Prozess von
HIV-1 eingreifen.
54
Ergebnisse
Temperature-arrested;
**
** TZM-bl (X4)
vor CD4-Bindung
nach CD4-Bindung
80%
80%
Inhibition of virus fusion [%]
Hemmung der Virus-Zell-Fusion
100%
100%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
0%
0,5µg/ml
2F52F5 (αgp41)
α-gp41
10µM
AMD3100 (α- 0,3µg/ml
b12b12 (αAMD-3100
CXCR4)
CD4-binding site)
α-CXCR4
α-CD4-bs
0,3µg/ml
B4B4 (αCD4)
P4-7
P4-7
α-CD4
P6-2
P6-2
E2-Peptide
P28
P28
Abbildung 7-15 – Hemmung der Virus-Zell-Fusion vor bzw. nach CD4-Bindung
TZM-bl Zellen wurden unter Normal- oder temperature-arrested state (TAS)-Bedingungen mit HIV-1 NL4-3BlaM-Vpr im Virus-ZellFusionsassay infiziert. Unter normalen Versuchsbedingungen erfolgte die Zugabe der Inhibitoren (0,5 µg/ml 2F5; 10 µM
AMD-3100; 0,3 µg/ml b12 und B4; 40 µM E2-Peptide) gleichzeitig mit den viralen Partikeln zu den Zielzellen (vor CD4-Bindung;
graue Balken). Im TAS-Experiment fand nach viraler CD4-Bindung bei 4°C eine Vorinkubation der Zielzellen mit den Inhibitoren
bei 23°C für 1 h statt (nach CD4-Bindung; schwarze Balken). Die HIV-1 spezifische Fusion erfolgte bei 37°C für 2 h. Nach 2
Waschschritten wurden die Zellen üN mit dem Farbstoff CCF2-AM inkubiert und die Infektionsrate mittels Fluorometer bestimmt.
Die Daten zeigen Mittelwerte der Hemmung der Virus-Zell-Fusion aus 5 Experimenten. Die prozentualen Angaben wurden im
Vergleich zu Mock-behandelten Zellen berechnet. Wilcoxon rank-sum test (zweiseitig): **: p<0.01
Um zu bestätigen, dass die E2-Peptide nicht mit der initialen Bindung von gp120 an CD4
interferieren, sondern erst nach der CD4-Rezeptorbindung aktiv sind, wurde ein gp120/CD4Bindungsassay durchgeführt. Hierbei wurde der Einfluss der E2-Peptide auf die Bindung von
rekombinanten gp120-Proteinen an zellulär exprimiertes CD4 untersucht. Nach der
Vorbehandlung von transient CD4-exprimierenden 293T-Zellen mit den E2-abgeleiteten
Peptiden P4-7, P6-2, P28 sowie mit spezifischen Kontrollen erfolgte im Anschluss die
Inkubation mit den rekombinanten gp120-Proteinen (HIV-1JRCSF Fc-gp120 oder HIV-1BaL
gp120) und die Analyse der gp120-Bindung an CD4 mittels Durchflusszytometrie (Abbildung
7-16 A) oder Western-Blot (Abbildung 7-16 B). Sowohl die FACS- als auch die ImmunoblotAuswertung zeigt deutlich die Abnahme der gp120-CD4-Bindung nach Zugabe von löslichem
CD4 (sCD4) oder VRC01, einem gp120-Antikörper, der die CD4-Bindungsstelle erkennt. Die
Negativkontrolle TAK-779 bindet den Korezeptor CCR5 und hat somit keinen Einfluss auf die
gp120-CD4-Bindung.
Auch
die
Inkubation
mit
den
E2-Peptiden
Einschränkung der gp120-Bindung an CD4 (Abbildung 7-16 A und B).
55
führt
zu
keiner
Ergebnisse
A.
gp120-CD4-Bindung
gp120-CD4 Bindung
120%
120%
*
100%
100%
*
80%
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
0%
gp120
gp120
B.
+sCD4
+sCD4
+1µl VRC01 +Tak-779
+Tak-779
+Pep.4-7
+Pep.6-2
+Pep.28
+VRC01
+P4-7
+P6-2
+P28
α-CD4-bs α-CCR5
E2-Peptide
Abbildung 7-16 - E2-Peptide hemmen nicht die HIV-1 gp120-CD4-Bindung
A. 293T-Zellen, die transient CD4 exprimierten, wurden mit den E2-Peptiden (40 µM) sowie spezifischen Kontrollen, die gp120
(1 µM sCD4, 3 µg/ml VRC01) oder CCR5 (10 µM TAK-779) binden, vorbehandelt. Danach erfolgte die Inkubation mit löslichem
HIV-1JRCSF Fc-gp120 Protein und die FACS-Analyse der CD4-Bindung durch Färbung mit FITC-konjugiertem α-human IgG pAK.
Die Mock-gp120-CD4-Bindung wurde als 100% Bindung festgelegt und daraus die entsprechenden Hemmdaten berechnet.
Wilcoxon rank-sum test (zweiseitig): *: p<0.05;
B. 293T-Zellen, die transient CD4 exprimierten, wurden mit E2-Peptiden (0,2 mM) sowie spezifischen Kontrollen, die gp120
(0,8 µM sCD4, 40 µg/ml VRC01) oder CCR5 (40 µM TAK-779) binden, vorbehandelt. Danach erfolgten die Inkubation mit
löslichem HIV-1BaL gp120-Protein, die Lyse der Zellen und die Analyse der CD4-Bindung nach SDS-PAGE und Western Blot.
Rekombinantes HIV-1BaL gp120-Protein (5 ng) wurde als Referenz aufgetragen.
56
Ergebnisse
Im nächsten Schritt sollte der Einfluss der E2-Peptide auf die Korezeptor-Bindung untersucht
werden. Hierfür wurden die rekombinanten HIV-1BaL und HIV-1IIIB gp120-Proteine verwendet,
deren Bindung an CCR5 bzw. CXCR4 durch Western Blot-Analyse bestimmt wurde. Für eine
effektive Bindung von rekombinantem gp120-Protein an die Korezeptoren war die Zugabe
von sCD4 notwendig. Danach erfolgte die Inkubation mit dem rekombinanten E2340-Fc
Protein, der Fc-Kontrolle und den E2-Peptiden sowie mit spezifischen Kontrollen. Die
CCR5-Antagonisten TAK-779 und Maraviroc bzw. gp120-V3-loop-bindende Antikörper
447-52D und F425 B4e8 dienten als Positivkontrollen und verhinderten die gp120-CCR5Bindung komplett und die gp120-CXCR4-Interaktion zu 50% (densitometrische Auswertung,
Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu konnten erwartungsgemäß die Antikörper VRC01
(anti [a]-CD4-binding site [bs] des gp120) und 5F3 (α-CHR des gp41) keine Hemmung der
Korezeptor-Bindung vermitteln. Auch hier konnte kein Einfluss der E2-Peptide oder des
E2-Proteins auf die gp120-CCR5 bzw. gp120-CXCR4-Bindung gezeigt werden (Abbildung 717). Somit inhibieren die E2-Peptide weder die CD4- noch die Korezeptor-Bindung von
gp120 sondern wirken auf spätere HIV-Entry-Schritte ein.
B.
A.
Abbildung 7-17 - E2-Peptide hemmen nicht die HIV-1 gp120-CCR5/CXCR4-Bindung
293T-Zellen, die transient CCR5 bzw. CXCR4 exprimierten, wurden mit E2-Peptiden (0,2 mM), E2340-Fc und Fc-Protein (je
0,6 µM) sowie spezifischen Kontrollen, die gp120 (40 µg/ml VRC01, 160 µg/ml 447-52D, 200 µg/ml F425 B4e8), gp41
(40 µg/ml 5F3) oder CCR5 (40 µM TAK-779, 40 µM Maraviroc) binden, vorbehandelt. Danach erfolgten die Inkubation mit
löslichem HIV-1BaL bzw. HIV-1IIIB gp120-Protein, die Lyse der Zellen und die Analyse der CCR5- bzw. CXCR4-Bindung
mittels SDS-PAGE und Western Blot. Rekombinantes HIV-1 gp120-Protein (5 ng) wurde als Referenz aufgetragen.
57
Ergebnisse
7.6. E2-Peptide binden den HIV-1 gp41-Disulfid-Loop
Basierend auf den bisherigen Ergebnissen sollte im Folgenden festgestellt werden, ob die
hemmende Wirkung der E2-Peptide durch Bindung an die Virionen oder durch zelluläre
Bindung hervorgerufen wird. Dafür wurden CEMx174 5.25M7-Zellen oder Sucroseaufgereinigte NL4-3BlaM-Vpr-Partikel mit den E2-Peptiden P4 und P6 sowie mit spezifischen
Kontrollen mit bekannten viralen oder zellulären Zielstrukturen vorinkubiert. Vor der
eigentlichen HIV-1 Infektion im Virus-Zell-Fusionsassay wurden die vorinkubierten Zellen
bzw. viralen Partikel gründlich gewaschen, um nicht gebundene Inhibitoren zu entfernen.
Wie in Abbildung 7-18 deutlich zu erkennen ist, war nach dem Vorinkubieren der
CEMx174 5.25M7-Zellen mit den E2-Peptiden kein inhibitorischer Effekt mehr nachweisbar.
Im Gegensatz dazu führten die Kontrollen B4 und AMD-3100, welche die HIV-1
(Ko-)Rezeptoren auf den Zielzellen binden, erneut zu einer eindeutigen Hemmung der HIV-1
spezifischen Bindung und Fusion (Abbildung 7-18 A). Im Unterschied dazu ist nach der
Vorinkubation der viralen Partikel mit den E2-Peptiden wiederum eine deutliche Suppression
der Infektion zu erkennen. Dies ist vergleichbar mit den HIV-1 bindenden Antikörpern 4E10
(α-gp41) sowie b12 und 2G12 (α-gp120). Entsprechend führt 12G5, welches CXCR4 auf den
Zielzellen bindet, in diesem Ansatz zu keiner Suppression (Abbildung 7-18 B). Aus diesen
Ergebnissen kann man schlussfolgern, dass eine direkte Interaktion der E2-Peptide mit
viralen Strukturen der HIV-1 Partikel stattfindet, während eine zelluläre Bindung nicht für die
beobachtete Hemmung verantwortlich sein kann.
A. Zellbindung
B. Virusbindung
100%
Hemmung der Virus-Zell-Fusion
Hemmung der Virus-Zell-Fusion
100%
80%
60%
40%
20%
0%
b12
2G12
α-gp120
B4
AMD-3100
α-CD4 α-CXCR4
80%
60%
40%
20%
0%
P4
P6
E2-Peptide
12G5
α-CXCR4
4E10
α-gp41
b12
2G12
α-gp120
P4
P6
E2-Peptide
Abbildung 7-18 – E2-Peptide hemmen den HIV-1 Entry durch Bindung an die Viruspartikel
A. CEMx174 5.25M7-Zellen wurden mit den E2-Peptiden (je 50 µM) und Kontrollen (je 0,1 µg/µl) für 1 h inkubiert, intensiv
gewaschen (zweimal 10 min, 250 x g) und mit NL4-3BlaM-Vpr infiziert. Die α-gp120 Antikörper b12 und 2G12 dienten als
Negativkontrollen, der α-CD4 Antikörper B4 und der CXCR4-Antagonist AMD-3100 als Positivkontrollen.
B. NL4-3BlaM-Vpr Viruspartikel wurden mit den E2-Peptiden (je 50 µM) sowie mit Kontrollen (je 0,1 µg/µl) für 1 h inkubiert,
intensiv gewaschen (30 min, 35.000 x g) und zum Infizieren von CEMx174 5.25M7-Zellen verwendet. Der α-CXCR4 Antikörper
12G5 diente als Negativkontrolle, die α-gp120 Antikörper b12 und 2G12 sowie der α-gp41 Antikörper als Positivkontrolle.
Die Virus-Zell-Fusion wurde jeweils mittels Durchflusszytometrie bestimmt und die prozentualen Angaben in Relation zu Mockbehandelten Zellen berechnet. Die Säulen zeigen Durchschnittswerte von zwei unabhängigen Experimenten, wobei jedes in
Triplikaten durchgeführt wurde.
58
Ergebnisse
Im Weiteren sollte der genaue Bindungspartner der E2-Peptide auf den HIV-1 Partikeln
bestimmt werden. Naheliegend ist dabei die mögliche Interaktion mit den Glykoproteinen
gp120 und gp41, die als nicht-kovalent gebundene Trimere (~14±7) in die virale LipidDoppelschicht integriert sind (Zhu et al., 2006). Für den Bindungsnachweis von E2-Peptiden
an die HIV-1 Hüllproteine (Env) wurde ein X4-tropes Env-Expressionsplasmid (NL4-3env) in
293T-Zellen transient exprimiert und die potentielle Bindung fluoreszenzmarkierter
E2-Peptide durch FACS-Analysen untersucht. Neben einer schwachen Hintergrund-Bindung
der E2-Peptide an die verwendeten Zellen (Daten nicht gezeigt), konnte eine deutliche
Steigerung der Peptidbindung an Zellen, die HIV-1 X4 Env auf der Oberfläche präsentierten,
gemessen werden (Abbildung 7-19, graue Balken). Auch hier diente das C-terminale
E2-Peptid P28 als Negativkontrolle, bei dem keinerlei Zunahme der Affinität gemessen
werden konnte. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die inhibitorischen
E2-Peptide P4-7 und P6-2 an die HIV-Glykoproteine binden.
Eine zusätzliche Steigerung der Bindung konnte nach der Vorinkubation der HIV-1
Hüllprotein-exprimierenden Zellen mit sCD4 gemessen werden (Abbildung 7-19, schwarze
Balken). Dies lässt vermuten, dass die Konformationsänderungen, die nach der
CD4-Bindung stattfinden, die Interaktion mit den E2-abgeleiteten Peptiden erhöhen.
Entweder wird die optimale Zielstruktur erst nach der CD4-Bindung durch eine
Konformationsänderung gebildet oder die Zielstruktur wird durch die Konformationsänderung
freigelegt, wie z.B. Anteile des gp41-Proteins.
Abbildung 7-19 – E2-Peptide binden an HIV-1 gp160
293T-Zellen, die transient HIV-1 Glykoproteine NL4-3env (X4-trop) oder ein Kontrollplasmid exprimieren, wurden mit sCD4 und
FITC-markierten E2-Peptiden (1 µM) inkubiert und die Bindung durch FACS-Analyse bestimmt. Der Anstieg der Bindung wurde
durch die Berechnung des RTCN-Wertes im Vergleich zu Mock-transfizierten Zellen normalisiert. Die Säulen zeigen
Durchschnittswerte von drei unabhängigen Experimenten, wobei jedes in Duplikaten durchgeführt wurde. Wilcoxon rank-sum
test (zweiseitig): *p<0,05 (Vektor- vs. X4 Env-transfizierte Zellen)
59
Ergebnisse
Um dem Hinweis nachzugehen, dass E2-Peptide HIV-1 Glykoproteine binden, wurden im
Folgenden direkte Bindungs-ELISAs durchgeführt. Hierfür wurden die rekombinanten HIV-1
Glykoproteine gp120 (gp120IIIB; gp120MN) und gp41 (gp41IIIB; gp41MN) verwendet. Wie in
Abbildung 7-20 zu erkennen ist, weisen die eingesetzten gp41-Proteine zum Teil Deletionen
des Fusionspeptids, der Transmembran-Domäne und der zytoplasmatischen Domäne auf.
FP
512
gp41IIIB
gp41MN
NHR
536
C-C loop
590
CHR MPER
628
660
TM
684
CP
705
856
ectodomain
466
753
ectodomain
676
538
705
769
Abbildung 7-20 – Darstellung der im ELISA verwendeten gp41-Proteine
Linearer Aufbau des HIV-1 gp41-Proteins (oben) und der beiden im ELISA verwendeten Proteine. Gp41 besteht aus dem
Fusionspeptid (FP), den helikalen Wiederholungsdomänen (NHR und CHR), die durch den Disulfid-Loop (C-C-Loop) verbunden
sind, der membranproximalen externen Region (MPER), der α-helikalen Transmembran-Domäne (TM) und der
zytoplasmatischen Domäne (CP). Dem Klon gp41IIIB fehlt der C-terminale Teil von CP, beim gp41MN wurde FP, TM und der
C-terminale Teil von CP deletiert.
Erste Bindungsstudien fanden mit biotinylierten E2-Peptiden statt. Da sich diese Peptide
nicht nur an die getesteten HIV-1 Glykoproteine, sondern auch unspezifisch an die
Plattenoberfläche anlagerten, konnten aus diesem Versuchsansatz keine eindeutigen
Aussagen getroffen werden (Daten nicht gezeigt). Aus diesem Grund wurde in den
folgenden Experimenten statt der biotinylierten Peptide rekombinantes E2340-Fc Protein und
als Kontrolle die Fc-Domäne verwendet. Wie in Abbildung 7-21 A deutlich zu erkennen ist,
konnte keine Bindung des E2340-Fc Proteins an die rekombinanten gp120-Proteine
nachgewiesen
werden.
Allerdings
zeigte
das
E2-Protein
eindeutig
eine
konzentrationsabhängige Bindung an beide gp41-Proteinvarianten, wobei die Fc-Kontrolle
keinerlei Interaktion zeigte.
Um zu untersuchen, inwieweit die N-terminale GBV-C E2-Region, von der die Peptide P4-7
und P6-2 abgeleitet sind, für diese Bindung an gp41 verantwortlich ist, wurde ein
kompetitiver ELISA durchgeführt. Dafür erfolgte erneut die Beschichtung der Platten mit
rekombinantem gp41MN-Protein, das daraufhin mit einer konstanten Konzentration E2340-Fc
zusammen mit steigenden Mengen an E2-Peptiden (P4-7, P6-2, P9 bzw. P28) inkubiert
wurde. Dem Ergebnis aus Abbildung 7-21 B (linkes Diagramm) ist deutlich zu entnehmen,
dass die Bindung zwischen E2 und gp41 durch die E2-abgeleiteten HIV-inhibitorischen
Peptide P4-7 bzw. P6-2 dosisabhängig unterbunden wird. Die Negativkontrollen P9 und P28
zeigten keinerlei Effekt. Das E2-Peptid P9 (AS 81-100 des E2-Proteins) wurde als
zusätzliche Kontrolle verwendet, da es durch seine hydrophobe Zusammensetzung und dem
Gehalt an Cysteinen weitgehend vergleichbar mit den inhibitorischen E2-Peptiden ist.
60
Ergebnisse
Innerhalb der N-terminalen E2-Peptide befinden sich zwei (P4-7) bzw. drei (P6-2) Cysteine.
Wurden diese Cysteine durch Serin-Reste ausgetauscht, waren die N-terminalen E2-Peptide
(P4-7s; P6-2s) nicht mehr in der Lage, um die gp41-Bindung zu konkurrieren. Dies impliziert,
dass die Cysteine in P4-7 und P6-2 für eine effektive Bindung an gp41 essentiell sind
(Abbildung 7-21 B, rechtes Diagramm). Mit diesen Bindungsstudien konnte gezeigt werden,
dass das GBV-C E2-Protein mit der Ektodomäne von gp41 interagiert und dass die Bindung
an gp41 innerhalb der N-terminalen E2-Region (AS 37-64) erfolgt, welche durch die Peptide
P4-7 und P6-2 repräsentiert wird. Die Cystein-Reste innerhalb dieser Region scheinen
maßgeblich zur Bindungsaffinität an gp41 beizutragen.
A. Bindung E2(340)-Fc an gp41
gp120
gp41
gp41 IIIB binding
2.5
2,5
gp41 binding [OD 450]
E2 (340)-Fc
Fc
1,5
1.5
1,0
1.0
0,5
0.5
0.0
0,0
10
10
11
0,1
0.1
HIV-1 IIIB
0,8
0.8
HIV-1 IIIB
2,0
2.0
OD 450nm
gp160-Bindung [OD450]
Bindung an gp120 MN
0,01
0.01
0.6
0,6
Fc
0,4
0.4
0,2
0.2
0.0
0,0
10
10
0,001
0.001
E2(340)-Fc
11
0,1
0.1
0,01
0.01
0,001
0.001
0,0001 0.00001
0,00001
0.0001
Protein [µM]
protein concentration [µM]
gp41 MN binding
E2 (340)-Fc
gp41 binding [OD 450]
2,0
2.0
Fc
1,5
1.5
1,0
1.0
0,5
0.5
0,0
0.0
10
10
1
0,1
1
0.1
HIV-1 MN
2,5
2.5
HIV-1 MN
OD 450nm
gp160-Bindung [OD450]
Bindung an gp120 MN
2,5
2.5
0,01
0,001
0.01
0.001
Protein [µM]
2,0
2.0
E2(340)-Fc
Fc
1,5
1.5
1,0
1.0
0,5
0.5
0.0
0,0
10
10
11
0,1
0.1
0,01
0.01
0,001
0.001
0,0001 0.00001
0,00001
0.0001
protein concentration [µM]
Proteinkonzentration
[µM]
Proteinkonzentration [µM]
B. Bindung E2-Peptide an gp41
Kompetition E2-Peptide
3,0
3.0
2,5
2.5
2,0
2.0
0,5
0.5
P4-7
P6-2
P9
P28
gp41 binding
1,0
1.0
gp41 binding
gp41-Bindung [OD450]
Kompetition E2-Peptide
1,5
1.5
1,5
1.5
1,0
1.0
P4-7
P4-7s
P6-2
P6-2s
0,5
0.5
0,0
0.0
0,001
0.001
0,010
0.01
0,100
0.1
1,000
Peptid [µM]
1
10,000
10
100,000
100
0,0
0.0
0,001
0.001
0,010
0.01
0,100
1,000
0.1 Peptid [µM] 1
10,000
10
100,000
100
E2-Peptidkonzentration [µM]
E2-Peptidkonzentration [µM]
Abbildung 7-21 – E2340-Fc und E2-Peptide binden gp41
A. Bindung der rekombinanten Proteine E2340-Fc und Fc an rekombinante HIV-1 Glykoproteine (gp41IIIB, gp41MN, gp120IIIB bzw.
gp120MN) (Durchführung: Sebastian Müller, Virologie Erlangen).
B. In Kompetitions-Assays wurden E2-Peptide in steigenden Mengen, zusammen mit dem rekombinanten E2340-Fc Protein
(5 µg/ml), zu gp41MN-beschichteten ELISA-Platten gegeben.
Nach der Inkubation mit einem Rabbit α-human IgG HRP Antikörper und der Zugabe einer 2-Komponenten PeroxidaseSubstratlösung erfolgte die Absorptionsmessung bei 450 nm in einem Multi-channel Photometer.
61
Ergebnisse
Im Folgenden sollte nun die exakte E2-Bindungsregion innerhalb des HIV-1 gp41-Proteins
eingegrenzt werden. Vorangegangene ELISA-Bindungsversuche, in denen ein fast
vollständiges gp41-Protein (gp41IIIB) und eine Deletionsvariante (gp41MN) eingesetzt wurden,
zeigten keine wesentlichen Unterschiede in der E2-Bindungsaktivität. Demzufolge ist
anzunehmen, dass die hydrophoben Bereiche, die in der gp41-Deletionsvariante fehlten,
also das Fusionspeptid (FP), die Transmembranregion (TM) sowie der C-terminale Anteil
des zytoplasmatischen Bereiches (CP) nicht maßgeblich an der E2-Bindung beteiligt sind
(siehe Abbildung 7-20 und Abbildung 7-21 A). Um weitere Bereiche innerhalb des
gp41-Proteins auf die Interaktion mit E2 oder mit HIV-inhibitorischen E2-Peptiden zu testen,
führte im Rahmen einer Kooperation Prof. Shibo Jiang (New York Blood Center, USA) einen
6-Helix-Bündel (6-HB)-ELISA durch. Bei diesem kompetitiven ELISA wurde auf eine Bindung
der E2-Peptide an die helikalen Wiederholungs-Domänen (NHR, CHR) von HIV getestet. Für
diesen 6-HB-ELISA wurden Platten mit dem capture-Antikörper NC-1 beschichtet, der nicht
die einzelnen NHR- oder CHR-Peptide erkennt, sondern nur stabil ausgebildete
6-HB-Strukturen (Chan et al., 1997; Jiang et al., 1998; Weissenhorn et al., 1997). Zusammen
mit den NHR- und biotinylierten CHR-Peptiden (Abbildung 7-22 A) wurden steigende
Mengen an E2-Peptiden oder nicht-biotinyliertes C34 als Positivkontrolle auf die NC-1beschichteten Platten gegeben und 6-HB-Strukturen detektiert.
A. 6-HB-Peptide
FP
512
gp41IIIB
gp41MN
466
NHR
536
C-C loop
590
CHR
628
TM
MPER
660
684
856
ectodomain
N-, C-Peptide:
N36 (546-581)
753
C34 (628-661)
ectodomain
676
538
705
N-, C-Peptide
N36 (546-581)
B. 6-HB-Bildung
Hemmung der 6-HB-Bildung
CP
705
769
Abbildung 7-22 - Einfluss der E2-Peptide
auf die Ausbildung des 6-Helix-Bündels
C34 (628-661)
A. Illustration der im 6-Helix-Bündel (6-HB)-ELISA
100%
verwendeten N- und C-Peptide, N36 und C34.
80%
B. Die inhibitorische Aktivität der E2-Peptide P4-7,
P4-7
P6-2
P28
C34
60%
40%
P6-2 und P28 sowie des C34 als Kontrolle auf die
Ausbildung des 6-HB erfolgte durch einen ELISA.
Dabei wurde der monoklonale Antikörper NC-1, der
die 6-HB-Anordnung zwischen C34-Biotin und N36
20%
erkennt, verwendet.
Die Bindung von 6-HB-
Strukturen wurde mit einem α-Biotin-Antikörper
0%
0,01
0,1
1
100 detektiert (Durchführung: Dr. Dr. Shibo Jiang, New
10
E2-Peptidkonzentration [µM]
York Blood Center, USA).
62
Ergebnisse
Die Durchführung des ELISA zeigte, dass, im Gegensatz zur Positivkontrolle C34, die
E2-Peptide nicht mit den 6-HB-Peptiden N36 und C34 interagieren und somit die Ausbildung
des Bündels nicht beeinträchtigt wird (Abbildung 7-22 B). Somit ist anzunehmen, dass die
E2-Bindungsstelle nicht innerhalb der helikalen Wiederholungs-Regionen NHR und CHR
liegen kann bzw. die E2-Peptide nicht die Ausbildung des 6-HB verhindern.
Zur weiteren Eingrenzung der E2-Bindungsregion im gp41-Protein wurden verschiedene
monoklonale gp41-Antikörper mit bekannten Bindungsepitopen verwendet. Dabei sollte
untersucht werden, inwieweit HIV-inhibitorische E2-Peptide mit den jeweiligen Antikörpern
um den spezifischen gp41-Bindungsort konkurrieren. Für diese Versuchsreihen wurden die
monoklonalen Antikörper 246-D, F240, T32, D50, 5F3, 2F5, 4E10 und Chessie 8 verwendet.
Die jeweiligen gp41-Bindungsorte der Antikörper sind in Abbildung 7-23 A skizziert und in
Tabelle 7-2 genauer aufgeführt.
A. gp41-Antikörper
FP
512
NHR
536
C-C loop
590
CHR MPER
628
660
TM
684
CP
705
856
ectodomain
gp41IIIB
466
gp41MN
753
ectodomain
676
538
705
769
B. gp41-Antikörper-Kompetition
F240
C-C-Loop
F240
gp41-Bindung [OD450]
gp41-Bindung [OD 450]
gp41-Bindung [OD 450]
246-D
NHR/C-C-Loop
246-D
C-C-Loop
2,0
2.0
2,0
2.0
C-C-Loop
1,5
1.5
1,5
1.5
1.5
1,5
1,0
1.0
1,0
1.0
1.0
1,0
0,5
0.5
0,5
0.5
0,5
0.5
0,0
0.0
0,1
0.1
11
10
10
100
100
0,0
0.0
1000
0,1
0.1
1000
11
5F3
CHR
100
100
1000
1000
0.0
0,0
0,1
0.1
D50
CHR/MPER
2,0
2.0
1,5
1.5
1,5
1.5
1,0
1.0
1,0
1.0
1,0
1.0
0,5
0.5
0,5
0.5
0,5
0.5
11
10
10
100
100
0,0
0.0
0,1
1000
1000
0.1
11
10
10
100
100
1000
1000
0,0
0.0
0,1
0.1
4E10
MPER
1,5
1.5
1,0
1.0
1,0
1.0
0.0
0,0
0,01
0.01
0,5
0.5
0,1
0.1
11
10
10
100
100
E2-Peptidkonzentration [µM]
1000
1000
0.0
0,0
0,1
0.1
100
100
1000
1000
100
100
1000
1000
MPER
11
10
10
Chessie 8
CP
2,0
2.0
2,0
2.0
10
10
2F5
MPER
2F5
E2-Peptidkonzentration [µM]
Chessie 8
CP
4E10
MPER
3,0
3.0
11
2,0
2.0
1,5
1.5
0.0
0,0
0,1
0.1
C-C-Loop
D50
CHR/MPER
5F3
CHR
2,0
2.0
10
10
T32
C-C-Loop
T32
2.0
2,0
P4-7
P4-7s
P6-2
P6-2s
P28
11
10
10
100
100
1000
1000
E2-Peptidkonzentration [µM]
Abbildung 7-23 – E2-Peptide kompetitieren mit gp41-bindenden Antikörpern
A. Darstellung der gp41-Bindungsepitope der im ELISA verwendeten Antikörper.
B. Kompetitiver Bindungs-ELISA von E2-Peptiden mit verschiedenen gp41-bindenden Antikörpern an gp41MN, wobei die
E2-Peptide mit steigender Konzentration zugegeben wurden. Der Nachweis der Peptidbindung erfolgte mit einem α-BiotinAntikörper und die Absorptionsmessung bei 450 nm in einem Multi-channel Photometer (Durchführung: z.T. Sebastian Müller,
Virologie Erlangen).
63
Ergebnisse
Tabelle 7-2 – Zielstrukturen von gp41-bindenden Antikörpern
*
Antikörper
Epitop
Sequenz gp160
Referenzen
246-D
Disulfid-Loop
590-597
[QQLLGIWG]
(Xu et al., 1991)
F240
Disulfid-Loop
592-606
[LLGIWGCSGKLICTT]
(Cavacini et al., 1998)
T32
Disulfid-Loop
596-612
[WGCSGKLICTTAVPWNA]
(Earl et al., 1997)
5F3
CHR
650-657
[QNQQEKNE]
Polymun Scientific,
Austria
D50
CHR/MPER
642-665
[IHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK]
(Earl et al., 1997)
2F5
MPER
660-670
[LLELDKWASLW]
(Purtscher et al., 1994)
(Muster et al., 1994)
4E10
MPER
671-680
[NWFDITNWLW]
(Stiegler et al., 2001)
Chessie 8
CP
727-732
[PDRPEG]
(Abacioglu et al., 1994)
*Numerierung entsprechend HIV-1HXB2 gp160 (HIV databases: http://www.hiv.lanl.gov). Hervorgehobene
Buchstaben stellen die Hauptbindungsstelle des Epitops dar, angrenzende Aminosäuren können die
Bindungseffizienz erhöhen.
Die ELISA-Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von zwei Antikörpern (F240 und T32) durch
die E2-Peptide P4-7 und P6-2 konzentrationsabhängig verhindert werden konnte (Abbildung
7-23 B). Die Bindung der restlichen Antikörper wurde nicht beeinflusst. Die Antikörper F240
und T32 erkennen beide den immunkompetenten Disulfid-Loop des gp41-Proteins. Die
Epitope der beiden Antikörper überlappen teilweise miteinander, so dass man daraus
schließen kann, dass das E2-Epitop innerhalb der gp41-Reste 596-612 liegt. Des Weiteren
wurden die Serinvarianten der beiden E2-Peptide auf ihre Kompetitionsfähigkeit mit den
oben aufgeführten Antikörpern getestet. Erneut zeigte sich keine Beeinflussung der Bindung
des F240-Antikörpers bzw. kaum eine Beeinflussung des T32-Antikörpers an den gp41Disulfid-Loop durch die Serin-Peptide.
64
Ergebnisse
Um zu bestätigen, dass das E2-Protein an den gp41-Disulfid-Loop bindet, wurde ein direkter
Bindungs-ELISA im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Dr. Jutta Eichler und Dipl.-Biochem.
Andrea Groß durchgeführt. Hierfür wurde ein biotinyliertes 36mer gp41-Disulfid-Loop-Peptid
(AS 588-623 von HIV-1HxB2 gp160) an Streptavidin-beschichtete Platten gebunden. Das
eingesetzte gp41-Disulfid-Loop-Peptid wurde als oxidierte Version (geschlossener Loop) und
lineare Variante (Austausch der Cystein-Reste gegen Serine) verwendet. Die Ergebnisse
dieses Versuches zeigen eindeutig eine dosisabhängige und direkte Bindung des GBV-C
E2340-Fc Proteins an das oxidierte gp41-Peptid, wobei die Fc-Kontrolle lediglich eine geringe
Hintergrund-Affinität zeigte. Die Bindung des E2340-Fc Proteins an die lineare Variante des
gp41-Proteins war deutlich vermindert (Abbildung 7-24).
Disulfid-Loop-Bindung [OD 492]
1,2
1,2
1,01
0,8
0,8
Loop36ox + E2-Fc
Loop36ox + Fc
Loop36s + E2-Fc
Loop36s + Fc
p<0,05
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,00
0,1
0,0001
1
10
0,001
0,01
100
0,1
1000
1
Proteinkonzentration [µM]
Abbildung 7-24 – E2(340)-Fc bindet den gp41-Disulfid-Loop
Bindung der rekombinanten Proteine E2(340)-Fc und Fc in steigenden Konzentrationen an den HIV-1 gp41-Disulfidloop, der mit
einer Konzentration von 50 µM an die ELISA-Platte gebunden war. Nach der Inkubation mit einem HRP-α-human Antikörper
und der Zugabe einer Peroxidase-Substratlösung erfolgte die Absorptionsmessung bei 492 nm in einem Multi-channel
Photometer (Durchführung: Andrea Groß, Pharmazie Erlangen). Die statistische Signifikanz (Wilcoxon rank-sum test,
zweiseitig) p<0.05 wurde bei einer Proteinkonzentration größer als 0,003 µM erreicht (Loop36ox+E2340-Fc vs. Loop36ox+Fc).
Zusammenfassend konnte sowohl mit indirekten als auch mit direkten Bindungsstudien der
gp41-Disulfid-Loop als spezifischer Bindungspartner des GBV-C E2 N-Terminus identifiziert
werden. Des Weiteren wurde deutlich, dass eine oxidierte Form des Loops durch das
E2-Protein gebunden wird, während die lineare Variante mit Cystein-Serin-Austauschen
deutlich ineffizienter gebunden werden konnte.
65
Ergebnisse
7.7. GBV-C E2 imitiert die gp41-interagierende Region des
gp120-Glykoproteins
Innerhalb des nativen HIV-1 Env-Trimers liegen spezifische intra- und intermolekulare
Wechselwirkungen vor, die zur Bildung eines funktionellen Trimers notwendig sind und die
Konformationsänderungen während des Eintritts in die Zielzellen ermöglichen. Somit sind
Peptide oder kleine Moleküle, die einer Sequenz innerhalb des Trimers ähneln, mögliche
Inhibitoren der korrekten Env-Faltung und könnten dadurch auch die HIV-1 Infektion
verhindern. Peptide, wie z.B. Enfuvirtid (T-20) (Wild et al., 1994), SJ-2176 (Jiang et al., 1993)
oder N36 (Lu and Kim, 1997), fungieren als sehr wirksame Fusionsinhibitoren, da sie gp41
NHR- oder CHR-Sequenzen widerspiegeln und somit die Interaktion zwischen diesen
Sequenzen und die Ausbildung der 6-HB-Struktur des gp41 verhindern.
Um zu testen, ob die HIV-inhibitorischen E2-Peptide gegebenenfalls Ähnlichkeiten zu
Bereichen in gp160 aufweisen, die für intra- oder intermolekulare Wechselwirkungen relevant
sein könnten, führte unser Kooperationspartner Prof. Dr. Heinrich Sticht Sequenzvergleiche
zwischen dem GBV-C E2-Protein und dem HIV-1 gp160 durch. Dabei konnte eine
Ähnlichkeit zwischen den N-Termini von E2 und gp120 detektiert werden (Abbildung 7-25 A).
Die E2-Abschnitte AS 33-46 und AS 54-70 zeigen Sequenzähnlichkeiten von 85,7% bzw.
76,5%
zu
den
N-terminalen
gp120-Bereichen
von
AS 41-54
bzw.
AS 34-50.
Bemerkenswerterweise deckt sich diese E2-Region (AS 33-70), die Ähnlichkeiten zum
gp120 N-Terminus aufweist, fast ausschließlich mit dem Sequenzabschnitt von AS 29-72
des E2-Proteins, von dem in Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe HIV-1 inhibitorische
E2-Peptide (P4-4 bis P6-5) abgeleitet werden konnten [Abbildung 7-25 B; (Koedel et al.,
2011)].
66
GBV-C E2
GERVWDRGNVTLLC
33
46
Ergebnisse
76.5% Ähnlichkeit (23.5% Identität) in 17 aa
A.
34
50
85.7% Ähnlichkeit (42.9% Identität) in 14 AS
gp120 41 LWVTVYYGVPVWKEATT
54
.::.... . : ...:
gp120
GVPVWKEATTTLFC
: .::.
...::.:
GBV-C E2
VWVPAFCQAVGWGDPIT
GBV-C E2 GERVWDRGNVTLLC
54
70
33
46
B)
76.5% Ähnlichkeit (23.5% Identität) in 17 AS
34
50
gp120
LWVTVYYGVPVWKEATT
.::.... . : ...:
GBV-C E2 VWVPAFCQAVGWGDPIT
54
70
B.
10
20
30
40
50
60
70
GAPASVLGSRPFDYGLKWQSCSCRANGSRIPTGERVWDRGNVTLLCDCPNGPWVWVPAFCQAVGWGDPITHW
----------------------------RIPTGERVWDRGNVTLLCDC-----------------------------------------------------PTGERVWDRGNVTLLCDCPN-----------------------------------------------------GERVWDRGNVTLLCDCPNGP-----------------------------------------------------RVWDRGNVTLLCDCPNGPWV-----------------------------------------------------WDRGNVTLLCDCPNGPWVWV-----------------------------------------------------RGNVTLLCDCPNGPWVWVPA-----------------------------------------------------NVTLLCDCPNGPWVWVPAFC------------------------------------------------------TLLCDCPNGPWVWVPAFCQA------------------------------------------------------LCDCPNGPWVWVPAFCQAVG------------------------------------------------------DCPNGPWVWVPAFCQAVGWG-----------------------------------------------------PNGPWVWVPAFCQAVGWGDP-----------------------------------------------------GPWVWVPAFCQAVGWGDPIT-----------------------------------------------------WVWVPAFCQAVGWGDPITHW
E2
4-4
4
4-5
4-6
4-7
4-8
5
6-1
6-2
6-3
6-4
6
6-5
Abbildung 7-25 - Ähnlichkeit der N-Termini von gp120 und E2 (Durchführung: Prof. Dr. Heinrich Sticht,
Institut für Biochemie, Universität Erlangen-Nürnberg)
A. Dargestellt sind die zwei Abschnitte mit hoher Sequenzähnlichkeit der N-Termini von HIV-1 gp120 und GBV-C E2.
B. Die beiden detektierten Regionen befinden sich im N-terminalen Teil von E2 (AS 33-46, grün und AS 54-70, orange).
Zusätzlich gezeigt sind die HIV-1-inhibitorischen E2-Peptide (Koedel et al., 2011), die vollständig den Sequenzabschnitt
abdecken, der die Gleichartigkeit zu gp120 aufweist.
Mutagenese-Analysen des gp160-Proteins sowie aktuelle Kristallstrukturen von gp120
weisen darauf hin, dass die nicht-kovalente Bindung zwischen gp120 und gp41 durch die
Wechselwirkung des N- und C-Terminus von gp120 mit Teilen des NHR bzw. CHR und des
Disulfid-Loops von gp41 vermittelt wird (Abrahamyan et al., 2003; Binley et al., 2000; Jacobs
et al., 2005; Kim et al., 2008; Pancera et al., 2010; Sen et al., 2008; Wang et al., 2008).
Jedoch sind bis heute keine hochauflösenden Strukturanalysen zur gp120-gp41-Interaktion
publiziert (Caffrey, 2011). Deshalb wurde im Folgenden der gp120-Bereich, der mit dem
GBV-C E2-Protein Sequenzähnlichkeiten aufweist, sowie der gp41-Disulfid-Loop-Bereich,
der die Antikörper T32 und F240 bindet, in den strukturellen Zusammenhang von gp120 und
gp41 gebracht.
67
Ergebnisse
Abbildung 7-26 A zeigt die N-terminale Region von gp120, die eine Sequenzähnlichkeit zu
den inhibitorischen GBV-C E2-Peptiden aufweist (blau). Durch Mutagenesestudien wurde
nachgewiesen, dass innerhalb dieser Region Aminosäure-Reste (Abbildung 7-26 B, grün
markiert) liegen, die wahrscheinlich an der gp41-Interaktion beteiligt sind (Binley et al., 2000;
Jacobs et al., 2005; Sen et al., 2010). Abbildung 7-26 C wiederum zeigt in magenta und
orange die Bereiche des Disulfid-Loops, die von den Antikörpern T32 und F240 gebunden
werden und deren Bindung durch die E2-Peptide P4-7 und P6-2 kompetitiert werden kann. In
grün sind die gp120-interagierenden Reste des gp41-Trimers dargestellt, die sich innerhalb
oder in der Nähe der Antikörper-Epitope von T32 und F240 befinden (Abbildung 7-26 D).
A.
B.
Abbildung
Regionen
–
7-26
von
Funktionell
HIV-1
gp120
wichtige
und
gp41
(Durchführung: Prof. Dr. Heinrich Sticht, Institut für
Biochemie, Universität Erlangen-Nürnberg)
A. und B. zeigen das Monomer gp120, dessen
N-terminale Region (blau) starke Ähnlichkeit zu den
inhibitorischen
C.
E2-Peptiden
zeigt.
Mittels
Mutationsanalysen identifizierte Reste, die für die
D.
gp120-gp41-Interaktion
relevant
sind
[zusammengefasst in (Caffrey, 2011)], sind zusätzlich
in grün dargestellt (B).
C. und D. zeigen die Struktur des gp41-Trimers.
Hervorgehoben ist der Disulfid-Loop, der durch die
beiden Antikörper T32 (AS 596-612, magenta) und
F240 (AS 592-606, magenta und orange) erkannt wird.
Mittels Mutationsanalysen identifizierte Reste, die für
die
gp120-gp41-Interaktion
relevant
sind,
sind
zusätzlich in grün dargestellt (D).
Diese Analyse identifiziert einen wesentlichen Teil des gp120-gp41 Interaktionsbereiches
(grün markierte Aminosäuren) und lässt vermuten, dass die HIV-inhibitorischen E2-Peptide
P4-7 und P6-2 , die vom E2 N-Terminus abgeleitet sind, durch die Sequenzähnlichkeit mit
dem gp120 N-Terminus in der Lage sind, die Interaktion von gp120 mit dem gp41-DisulfidLoop zu stören.
68
Ergebnisse
Unter der Voraussetzung, dass die Sequenzähnlichkeit der N-Termini von GBV-CE2 und
HIV-1gp120, die Bindung des E2-Proteins bzw. der E2-Peptide an gp41 ermöglicht, sollte ein
entsprechendes N-terminales gp120-Peptid ebenfalls in der Lage sein, die E2-gp41
Interaktion zu stören. Um diese Annahme zu überprüfen, wurden im Folgenden E2-gp41
Kompetitions-Assays mit dem N-terminalen gp120-Peptid N35 (AS 31-65) durchgeführt.
Dieses Peptid repräsentiert den N-terminalen gp120-Bereich, der mit gp41 interagieren soll
und welcher u.a. auch die E2-ähnliche Region beinhaltet. Hierbei konnte eine deutliche
Hemmung der E2-Bindung an gp41 durch die Zugabe von N35 beobachtet werden
(Abbildung 7-27). Dies zeigt eindeutig, dass E2 und gp120 um die gleiche Bindungsstelle am
gp41-Protein konkurrieren. Erwartungsgemäß zeigt der Kompetitions-Assay, dass das gp120
Peptid N35 im Vergleich zu den E2-Peptiden (P4-7 IC50=11,6 µM bzw. P6-2 IC50=7,0 µM)
eine deutlich stärkere gp41-Affinität (IC50=0,7 µM) aufweist. Auch die Serinvariante N35s
(C54S) verhindert konzentrationsabhängig die E2-gp41 Interaktion (IC50=4,6 µM), aber
deutlich geringer als das Wildtyp-Peptid (N35).
Abbildung 7-27 – GBV-C E2 und HIV-1 gp120 binden die gleiche Region im HIV-1 gp41
Kompetitiver Bindungs-ELISA von E2- und gp120-Peptiden mit rekombinantem E2340-Fc Protein an gp41MN, wobei die Peptide
mit steigender Konzentration zugegeben wurden. Der Nachweis der Peptidbindung erfolgte mit einem Rabbit α-human IgG HRP
Antikörper und die Absorptionsmessung bei 450 nm in einem Multi-channel Photometer. Wilcoxon rank-sum test (zweiseitig):
*: p<0.05; **: p<0.01 (N35 bzw. N35s vs. P28; P4-7 bzw. P6-2 vs. P28 [Daten nicht gezeigt])
Die Ergebnisse der Sequenzvergleiche in Kombination mit den Kompetitionsstudien
untermauern deutlich die Hypothese eines Mimikry-Phänomens zwischen den N-Termini der
nicht-verwandten Glykoproteine GBV-CE2 und HIV-1gp120. Diese strukturelle Ähnlichkeit
scheint die Bindung des E2 N-Terminus an die gp120-Bindungsstelle im gp41-Protein, dem
Disulfid-Loop, zu ermöglichen und zur Störung der Membranfusion zwischen dem HI-Virus
und der Zelle zu führen.
69
Ergebnisse
Die atomare Struktur des GBV-C E2-Glykoproteins ist bisher nicht bekannt. Deshalb führte
unser Kooperationspartner Prof. Dr. Heinrich Sticht computerbasierte Strukturanalysen des
E2-Proteins durch, um Hinweise zu erhalten, ob eine Interaktion des GBV-C E2 N-Terminus
mit gp41 sterisch möglich ist. Die Ergebnisse der Struktur-Vorhersagen und der globulären
Analysen sind in Abbildung 7-28 illustriert. Diese Methodik ließ eine übereinstimmende
Vorhersage über die E2-Ektodomäne von Aminosäure 1 bis 195 zu. Es konnte im Bereich
von Aminosäure 76 bis 195 eine gefaltete, globuläre Domäne vorhergesagt werden, die eine
Immunglobulin-ähnliche Struktur aufweist. Demgegenüber steht der N-terminale Abschnitt
(AS 1-75), der unstrukturiert zu sein scheint und somit keine definierte Sekundärstruktur
ausbildet. Dieser nicht-strukturierte Abschnitt beinhaltet die HIV-1 inhibitorische Region. Zur
Veranschaulichung sind in Abbildung 7-28 die Aminosäure-Reste der hemmenden Peptide
P4-7 in rot, P6-2 in blau und die überlappenden Reste in violett hervorgehoben. Somit lässt
die Struktur-Vorhersage des GBV-C E2-Proteins vermuten, dass der E2 N-Terminus
durchaus flexibel und deshalb in der Lage ist mit gp41 zu interagieren und daraus
resultierend den Eintritt von HIV-1 in die Zielzellen zu verhindern.
Abbildung 7-28 – Vorhersage der
Sekundärstruktur
des
GBV-C
E2-Proteins
Das Modell zeigt die N-terminale Region
(AS 1-195)
des
Dargestellt
sind
ähnliche
GBV-C
E2-Proteins.
die
Immunglobulin-
Domäne
(AS 76-195)
entsprechend der sekundären Struktur,
sowie der ungefaltete N-Terminus (AS 175),
welcher
3-dimensionale
keine
globuläre
Struktur
ausbildet.
Cysteine, die vermutlich Disulfidbrücken
ausbilden, sind als Rauten dargestellt. Die
HIV-1 inhibitorischen E2-Peptide P4-7 und
P6-2
sind
überlappend
in
rot
in
violett
und
blau,
bzw.
veranschaulicht
(Durchführung: Prof. Dr. Heinrich Sticht,
Institut
für
Biochemie,
Erlangen-Nürnberg).
70
Universität
Diskussion
8.
Diskussion
8.1. Interferenzmechanismen zwischen GBV-C und HIV-1
Die Prävalenz des nicht-pathogenen GB Virus C ist besonders bei einigen Risikogruppen
sehr hoch und Koinfektionen mit anderen parenteral übertragbaren Viren sehr häufig. So
sind HIV-Positive bis zu 40% chronisch mit GBV-C infiziert (Mohr and Stapleton, 2009), eine
Interferenz zwischen GBV-C und HIV-1 wird allerdings kontrovers diskutiert. Mehrere
epidemiologische Studien zeigten, dass die Koinfektion mit GBV-C für HIV-Patienten zu
besseren Überlebenschancen und einer verlangsamten AIDS-Progression führt (Nunnari et
al., 2003; Tillmann et al., 2001; Vahidnia et al., 2012a; Williams et al., 2004; Xiang et al.,
2001). Allerdings konnten andere Untersuchungen den positiven Effekt einer Koinfektion
nicht bestätigen (Birk et al., 2002; Brumme et al., 2002; Van der Bij et al., 2005). Diese Daten
zusammenfassend, zeigt eine Metastudie den positiven Effekt einer Koinfektion, wenn die
GBV-C Virämie in einem frühen Stadium nach der HIV-Serokonversion vorliegt und die
GBV-C RNA über mehrere Jahre persistiert (Zhang et al., 2006).
Dem vielfach beschriebenen positiven Effekt einer GBV-C Infektion in HIV-Patienten scheint
ein vielschichtiger inhibitorischer Mechanismus zugrunde zu liegen, der noch nicht
vollständig aufgeklärt ist.
Eine Studie konnte zeigen, dass nicht nur HIV-Patienten mit einer GBV-C-Virämie, sondern
auch mit E2-Antikörpern bessere Überlebenschancen als GBV-C negative Patienten
(Tillmann et al., 2001) haben. Stapleton und Kollegen beschreiben, dass E2-Antikörper
sowohl HIV-Isolate neutralisieren als auch HIV-Gag-Partikel immunpräzipitieren können
(Mohr et al., 2010). Schlussfolgernd wird die Interaktion der GBV-C E2-Antikörper mit einem
zellulären Antigen auf HIV-Partikeln vermutet, unabhängig vom vorhandenen HIV-Hüllprotein
(Mohr et al., 2010). Weiterführende Experimente konnten dementsprechend die Bindung an
Phosphatidylinositole (PI[4]P) zeigen (Jung, 2010), die für HIV-Entry-Prozesse notwendig zu
sein scheinen (Barrero-Villar et al., 2008). Fraglich ist jedoch, ob die Induktion von
kreuzreaktiven, neutralisierenden E2-Antikörpern ausreicht, um tatsächlich die gezeigten,
hohen Überlebenschancen von HIV-Patienten zu bewirken.
In vitro-Untersuchungen zeigten auch die Hemmung der HIV-Replikation durch einzelne
GBV-C Proteine (Jung et al., 2007; Xiang et al., 2006). Im ersten Teil dieser Arbeit wurde
durch kontrollierte Transkriptionsaktivierung mit Hilfe des Tet-Systems die inhibitorische
Wirkung der GBV-C Nichtstruktur-Proteine NS3, NS4A, NS3/4A und NS5A untersucht. Ein
großes Problem stellte dabei die kontrollierte Proteinexpression dar. Der ExpressionsNachweis konnte lediglich mit Hilfe von EGFP in der durchflusszytometrischen Analyse
erbracht werden. Der exakte Nachweis der GBV-C Proteine im Immunoblot sowie das
71
Diskussion
komplette Abschalten der Proteinexpression durch Zugabe von Doxyzyklin war nicht bei
allen Proteinen möglich bzw. nahm einen sehr langen Zeitraum ein. Des Weiteren konnte
nach dem Entfernen von Doxyzyklin erst nach mehreren Wochen wieder die volle
Expression der GBV-C Proteine erreicht werden. Ein wirklich gut-kontrollierbarer Phänotyp
konnte somit mit diesem System nicht erreicht werden. Nach der im Durchflusszytometer
nachgewiesenen Expression der GBV-C Nichtstruktur-Proteine erfolgte die Infektion mit
einem X4-tropen HIV-Laborstamm (NL4-3) und die Auswertung der Replikationshemmung
durch Quantifizierung der RT-Aktivität und des p24-Antigens. Das NS4A-Protein führte zu
keiner Beeinflussung der HIV-Replikation. Die durch Xiang et al. beschriebene HIV-1
inhibitorische Wirkung von NS5A konnte in diesem Modell bestätigt werden (Xiang et al.,
2006).
Xiang und Mitarbeiter postulieren, dass die hemmende Wirkung des NS5A-Proteins auf HIVEntry-Prozesse stattfindet, indem eine verminderte Expression der (Ko-)Rezeptoren CD4
und CXCR4 sowie die Sekretionssteigerung des Chemokins SDF-1, die durch BystanderEffekte auch auf benachbarte, nicht-infizierte Zellen wirken kann, induziert wird (Xiang et al.,
2006; Xiang et al., 2009). Auch im Rahmen dieser Arbeit wurde die OberflächenPräsentation der HIV-Rezeptoren nach der NS5A-Expression untersucht. Hierbei konnte
lediglich die verminderte CD4-Expression bestätigt werden, wobei eine geringere
CD4-Präsentation auch schon nach der Expression des Tet-off Vektors zu beobachten war,
die aber durch NS5A noch gesteigert werden konnte. Eine modifizierte CXCR4-Expression
war jedoch nicht nachweisbar (Eissmann, unveröffentlichte Daten).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe des Tet-Off-Systems zusätzlich das NS3-Protein
als ein zweites Nichtstruktur-Protein von GBV-C identifiziert, das Einfluss auf die HIV-1
Replikation nimmt. Eine aktuelle Publikation, in der die Suppression der HIV-1 Replikation
durch die NS3 Serinprotease beschrieben wird, bestätigt diese Aussage (George et al.,
2012). Das NS3-Protein beinhaltet sowohl eine virale Serinprotease als auch eine
Helikase/ATPase-Aktivität. Insbesondere für die Protease-Aktivität wird NS4A als Kofaktor
benötigt. Dieser bindet wahrscheinlich NS3 und vermittelt eine Anlagerung an spezifische
Membranabschnitte, die der Virusreplikation dienen. Da diese Funktionen von dem nah
verwandten HCV abgeleitet wurden, ist es wahrscheinlich, dass GBV-C NS3/4A, genau wie
das entsprechende HCV-Protein, die Spaltung von MAVS (Mitochondrial Antiviral-Signaling)
bedingt. Es wurde gezeigt, dass die HCV-Serinprotease in den RIG-I Signalweg eingreift,
indem MAVS von der mitochondrialen Membran abgespalten wird (Kawai et al., 2005;
Meylan et al., 2005; Seth et al., 2005). Dadurch wird seine Funktion als RIG-I Adaptorprotein
aufgehoben und die nachgeordnete Aktivierung von IRF3 und NFκB unterbunden (Baril et
al., 2009). RIG-I ist ein zu den Helikasen gehörender intrazellulärer Rezeptor, der nach
Virusinfektion eine Immunantwort des angeborenen Immunsystems auslöst. Am Ende dieser
72
Diskussion
Signalkaskade wird u.a. NFκB, IRF3, IRF7 und die Ausschüttung antiviraler Zytokine wie
IFN-β aktiviert (Seth et al., 2006). Zusätzlich zu HCV wurde auch für GBV-B publiziert, dass
die
Protease
NS3/4A
MAVS
spaltet
und
damit
angeborene
antivirale
Verteidigungsmechanismen verhindert (Chen et al., 2007). Somit ist es wahrscheinlich, dass
auch das GBV-C NS3/4A-Protein zur MAVS-Spaltung führt. Weiterführend könnte man
postulieren, dass eine MAVS-Spaltung auch zur viralen Interferenz von GBV-C und HIV
beiträgt, da die Aktivierung des zellulären Transkriptionsfaktors NFκB verhindert wird.
Neueste Untersuchungen zeigen, dass HIV-RNA selbst wie genomische RNA den RIG-Iabhängigen Signalweg aktiviert, um u.a. NFκB zu induzieren (Berg et al., 2012), was evtl.
durch die Interferenz mit GBV-C verhindert werden kann.
In der Literatur wird eine Vielzahl an möglichen Interaktionen beschrieben, welche die
Interferenz von
HIV-1
und
GBV-C
erklären
könnten.
Zahlreiche immunologische
Modifikationen wie die Induktion von Chemokinen, die CD4- und Korezeptor-Modulation, das
Verhindern des Th2-Cytokinprofils, die Reduktion der T-Zellaktivierung sowie die
Herunterregulierung der FAS-vermittelten Apoptose (Jung et al., 2005; Maidana-Giret et al.,
2009; Moenkemeyer et al., 2008; Nattermann et al., 2003; Nunnari et al., 2003; SchwarzeZander et al., 2010; Xiang et al., 2004). Für einen Teil der beschriebenen immunologischen
Veränderungen, wie die Sekretion des Chemokins SDF-1 und die verminderte Expression
der (Ko-)Rezeptoren, ist wahrscheinlich die Expression des NS5A-Proteins verantwortlich.
Das NS3-Protein führt lediglich zu einer erhöhten Ausschüttung antiviraler Zytokine und der
Hemmung
der
NFκB-Aktivierung
innerhalb
einer
Zelle.
Eine
Beeinflussung
der
HIV-Replikation durch NS5A und NS3 wäre somit nur in koinfizierten Zellen oder durch
Bystander-Effekte möglich. Die Zahl der HIV-positiven Zellen im peripheren Blut ist sehr
gering, da nur eine von 104-105 Zellen virale Proteine oder mRNA exprimiert bzw. 0,01-0,1 %
der CD4+ T-Zellen infiziert sind (Fauci, 1988; Harper et al., 1986). Die Rate GBV-C positiver
CD4+ T- sowie B-Lymphozyten ist mit ca. 15% relativ hoch (George et al., 2006), aber ob
oder inwieweit eine Koinfektion der Zellen mit beiden Viren in vivo oder in vitro existiert,
konnte noch nicht gezeigt werden. Ein Interferenzmechanismus, der koinfizierte Zellen
voraussetzt, ist aber in vivo nicht relevant. Ein bedeutender Einfluss auf die HIV-Replikation
erfolgt durch das GBV-C E2-Glykoprotein (Jung et al., 2007; Xiang et al., 2012). Dabei
inhibieren sowohl der N- als auch der C-terminale Abschnitt frühe HIV-Replikationsschritte
(Herrera et al., 2010; Koedel et al., 2011; Xiang et al., 2012). Eine direkte Interaktion des
GBV-C
E2-Hüllproteins,
auch
als
Heterodimer
mit
dem
E1-Protein,
mit
HIV-
Oberflächenstrukturen zur Unterdrückung der Infektion einer Zelle ist nachvollziehbar, da
diese Proteine auf der Virusoberfläche präsentiert werden. Die Koinfektion einer Zelle mit
beiden Viren ist somit für die Interferenz nicht notwendig. Der zugrunde liegende
HIV-inhibitorische Mechanismus des E2-Proteins wird im folgenden Abschnitt beschrieben.
73
Diskussion
8.2. Hemmung der
E2-Peptide
Der
Hauptteil
der
HIV-1
vorliegenden
Fusion
Arbeit
durch
beschäftigt
N-terminale
sich mit
der
GBV-C
Aufklärung
des
Wirkmechanismus der GBV-C E2-vermittelten HIV-Inhibition. Dabei wurde insbesondere der
Einfluss N-terminaler E2-Peptide auf das HIV-Entry näher untersucht (Koedel et al., 2011).
Bei der Bestimmung der Wirkungsbreite dieser Peptide zeigten sich deutliche Unterschiede
in der Hemmbarkeit primärer HIV-Isolate in TZM-bl Zellen (Koedel et al., 2011). Um zu
testen, ob die Sensitivität gegenüber E2-Peptiden eine eindeutig virale Eigenschaft oder
durch das Zusammenspiel von Zelle und Virus bedingt ist, wurden im Rahmen dieser Arbeit
eine weitere Zelllinie (CEMx174 5.25M7-Zellen) und primäre Zellen (PBMCs) herangezogen.
Dabei stellte sich heraus, dass die Wirkbreite der E2-Peptide in den beiden ReporterZelllinien vergleichbar ist, während bei Verwendung primärer Zellen die Wirksamkeit der E2Peptide etwas breiter zu sein scheint. Hier zeigte sich, dass die E2-Peptide zusätzlich zwei
von vier Isolaten hemmen konnten, die auf Zelllinien nicht oder nur intermediär gehemmt
wurden (Koedel et al., 2011). Somit richten sich die inhibitorischen Fähigkeiten der
E2-abgeleiteten Peptide nicht nur nach dem HIV-Isolat, sondern auch nach dem
verwendeten Zellsystem. Eine Erklärung dafür kann die unterschiedliche Expression der
HIV-Korezeptoren auf Reporter- und primären Zellen sein. Reporterzellen exprimieren eine
weitaus größere Menge der Korezeptoren auf der Zelloberfläche. So wird z.B. der CCR5Rezeptor nur bis zu ca. 14% auf Lymphozyten (Lee et al., 1999), jedoch mindestens zu 97%
auf TZM-bl Zellen präsentiert (Eissmann, unveröffentlichte Daten), sodass der HIV-EntryProzess wahrscheinlich beschleunigt stattfinden kann. Die Beobachtung, dass die
Korezeptor-Dichte mit der Reaktivität von Inhibitoren korrelieren kann, ist nicht ungewöhnlich
und auch für den CHR-bindenden Peptidinhibitor T-20 beschrieben (Reeves et al., 2002).
In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass zur Zellkultur
hinzugegebenes rekombinantes E2-Protein ausschließlich HIV-1 Env-präsentierende
Pseudoviren hemmt, nicht jedoch heterologe Pseudoviren. Daraus kann indirekt geschlossen
werden, dass frühe HIV-Replikationsschritte durch das E2-Protein unterdrückt werden (Jung
et al., 2007). Um zu beweisen, dass das E2-Protein tatsächlich auf das HIV-1 spezifische
Entry wirkt, sollte im Rahmen dieser Doktorarbeit der E2-Effekt mit einem direkten HIVFusionsassay untersucht werden. Mit einem virusfreien Zell-Zell-Fusionsassay konnte jedoch
keinerlei HIV-Suppression nachgewiesen werden, was durch den Versuchsaufbau erklärt
werden kann. Im Vergleich zur natürlichen Virus-Infektion fusionieren hierbei zwei
unterschiedlich transfizierte Zellen miteinander, die entweder eine große Menge an
HIV-Rezeptoren oder HIV-Glykoproteinen auf der Zelloberfläche exprimieren. Auf einem
HIV-Partikel sind jedoch lediglich 14 (±7) Hüllprotein-Trimere vorhanden, von denen
wahrscheinlich nur ein bis drei an der Infektion beteiligt sind (Zhu, 2006). Somit spiegelt ein
74
Diskussion
Zell-Zell-Fusionsassay nicht die physiologischen Bedingungen wider, die bei einer VirusZellfusion vorliegen. Des Weiteren ist auch eine Zelltyp-spezifische Hemmung durch das
E2-Protein möglich. In dem zellbasierten Fusionsassay wurden lediglich 293T-Zellen
verwendet, in denen noch keine HIV-1 Hemmung durch GBV-C nachgewiesen wurde. Aus
den aufgeführten Gründen fand im Folgenden ein virusbasierter Fusionsassay Verwendung,
der durch die Infektion mit enzymhaltigen HI-Virionen die Entry-Prozesse von HIV-1 näher
am biologischen System untersucht (Cavrois et al., 2002). Mit diesem Virus-ZellFusionsassay konnte gezeigt werden, dass sowohl das E2-Protein als auch N-terminal
abgeleitete E2-Peptide die HIV-Infektion von Zelllinien (TZM-bl und CEMx174 5.25M7Zellen) sowie primären Zellen (PBMC) effektiv verhindern (Koedel et al., 2011). Durch diese
Ergebnisse wurden bereits veröffentlichte Daten unserer Arbeitsgruppe zur Hemmung früher
HIV-Replikationsschritte durch GBV-C E2 untermauert (Jung et al., 2007). Das genaue
zeitliche Fenster der inhibitorischen Wirkung der E2-Peptide konnte mit Hilfe des Virus-ZellFusionsassays
unter
sogenannten
temperature-arrested
state
Bedingungen
näher
eingegrenzt werden. Die Ergebnisse zeigten, dass die E2-Peptide nach der CD4-Bindung
aktiv sind. Dies ist im Einklang mit Versuchen, die den Einfluss auf andere frühe Schritte
untersuchten. Zum einen modifizieren die E2-Peptide nicht die Präsentation der
HIV-(Ko-)Rezeptoren auf den Zielzellen, zum anderen wird auch nicht die Bindung von
gp120 an CD4 bzw. die Korezeptoren beeinflusst. Folglich deuten die Untersuchungen auf
die Suppression der späten HIV-Entry-Schritte hin, wie die Fusion der Membranen.
Weitere Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit beschäftigten sich mit der Eingrenzung
der E2-Zielstruktur. Es konnte gezeigt werden, dass eine Vorinkubation von HIV-Partikeln mit
E2-Peptiden, nicht aber von HIV-Zielzellen, zur Unterdrückung des HIV-Entrys führt. Nach
der Inkubation und dem gründlichen Waschen der Zielzellen bzw. der Virionen war lediglich
nach der Virusbehandlung die Unterdrückung des HIV-1 Entrys zu beobachten. Dieses
Ergebnis war unerwartet, da in Bindungsstudien, in denen FITC-markierte E2-Peptide
verwendet wurden, eine starke Bindung der E2-Peptide an 293T-Zellen beobachtet werden
konnte. Es scheint jedoch, dass eine Anlagerung der E2-Peptide an Zellen oder
Zellmembranen zu keiner Einschränkung des HIV-Entry-Prozesses führt. Auf diesem Wissen
aufbauend wurde die Interaktion mit den HIV-1 Hüllproteinen in Zell-Bindungsstudien
analysiert.
Obwohl,
wie
bereits
erwähnt,
eine
deutliche
Hintergrund-Affinität
von
FITC-markierten E2-Peptiden zu nicht-transfizierten Zellen bestand, war eine deutlich
erhöhte Bindung der E2-Peptide an HIV-1 Env-exprimierende Zellen zu beobachten. Diese
Bindung wurde signifikant nach der Zugabe von sCD4 gesteigert. Diese Beobachtung
impliziert, dass die Zielsequenz der E2-Peptide besser erreichbar ist, wenn gp120 an CD4
gebunden hat oder sich erst nach der CD4-Bindung ein konformelles Epitop bildet.
75
Diskussion
Im Folgenden sollte der Bindungspartner der E2-Peptide mittels ELISA bestimmt werden.
Erste
Bindungsstudien
zeigten
dabei
eine
hohe
Affinität
der
Peptide
zu
den
HIV-Glykoproteinen, wobei durch verschiedene Kontrollen festgestellt werden konnte, dass
die E2-Peptide sehr sticky sind und somit auch unspezifisch, z.B. an vorbehandelte ELISAPlatten binden. Um dieses Problem zu umgehen, wurde anstelle eines Peptid-Protein- ein
Protein-Protein-Bindungsnachweis
etabliert.
Entsprechend
wurde
in
den
folgenden
Bindungsstudien das E2340-Fc Protein verwendet und die direkte Interaktion mit dem
gp41-Protein
des
HIV-1
Glykoproteins
nachgewiesen.
In
weiterführenden
Kompetitionsversuchen verdrängten steigende Mengen der E2-Peptide P4-7 und P6-2 das
E2-Protein vom gp41. Dies impliziert, dass der N-terminale Teil des E2-Proteins, der durch
diese Peptide repräsentiert wird, spezifisch an gp41 bindet. Ein erster Hinweis auf den
genauen Bindungsort des E2 N-Terminus im gp41-Protein konnte durch die Verwendung
unterschiedlicher gp41-Proteine (Deletionsmutanten) erhalten werden. Demzufolge scheint
die E2-Interaktion nicht mit dem N-terminalen Fusionspeptid, der Transmembranregion oder
dem C-terminalen Teil der cytoplasmatischen Domäne des gp41-Proteins zu erfolgen. Des
Weiteren konnte keine Bindung an das NHR-Peptid N36 bzw. das CHR-Peptid C34
nachgewiesen
werden.
Jedoch
konnte
durch
Kompetitions-Bindungsversuche
mit
verschiedenen gp41-bindenden Antikörpern der Disulfid-Loop des HIV-1 gp41-Proteins als
Interaktionspartner der E2-Peptide identifiziert werden. Zusätzlich bestätigte sich in diesen
Versuchen, dass E2-Peptide nicht mit Antikörpern um den Bindungsort konkurrieren, die mit
anderen gp41-Bereichen, wie CHR, MPER oder CP wechselwirken. Schließlich konnte
dieser Hinweis des HIV-1 gp41 Disulfid-Loops als E2-Bindungsort durch einen direkten
Bindungstest, in dem synthetische Disulfid-Loop-Peptide (Loop36ox) eingesetzt wurden,
bestätigt werden.
Die N-terminale HIV-1 inhibitorische E2-Region enthält drei Cystein-Reste (Cys46, Cys48
und Cys60). Vorarbeiten in unserer Gruppe zeigten bereits, dass der Austausch dieser
Cysteine durch Serine zu dem Verlust der HIV-inhibitorischen Aktivität führte (Koedel et al.,
2011). In Übereinstimmung mit diesen Daten waren die Serin-Peptide (P4-7s und P6-2s)
nicht mehr in der Lage mit dem E2-Protein um die gp41-Bindung zu konkurrieren. Auch die
gp41-Disulfid-Loop-Region beinhaltet
zwei
hoch-konservierte Cysteine,
die
für
die
E2-Interaktion wichtig zu sein scheinen. Demzufolge ist es möglich, dass die Cystein-Reste
der inhibitorischen E2-Peptide mit den beiden gp41-Cysteinen interagieren bzw. den
Oxidationszustand der Cysteine im Disulfid-Loop ändern. In diesem Zusammenhang konnte
gezeigt werden, dass verschiedene virale Hüllproteine von einem dynamischen ThiolDisulfid-Austausch
abhängig
sind,
um
die
Virus-Zell-Fusion
zu
ermöglichen
[zusammengefasst in (Fenouillet et al., 2007)]. Im Fall von HIV-1 führt nach der
CD4-Bindung eine Zelloberflächen-assoziierte Reduktase-Aktivität zur Spaltung der
76
Diskussion
Disulfidbrücken innerhalb des gp120-Proteins. Diese Spaltung ist für die Einleitung der
darauffolgenden Membranfusion notwendig (Barbouche et al., 2005). Die Rolle der hochkonservierten Cysteine des Disulfid-Loops ist jedoch noch nicht vollständig erforscht
(Ashkenazi et al., 2011). In diesem Zusammenhang müsste in weiterführenden Studien der
Einfluss von reduzierenden Agenzien auf die Wirkung der E2-Peptide untersucht werden.
Der gp41-Disulfid-Loop stellt eine immundominante Region dar [Cluster I; (Earl et al., 1997)],
die dauerhaft oder zumindest teilweise erreichbar ist (Xu et al., 1991). Jedoch haben
Antikörper, die gegen Cluster I gerichtet sind, keine maßgebliche HIV-1 neutralisierende
Kapazität. Der Grund hierfür könnte in der spezifischen Größe liegen. Antikörper erreichen
wahrscheinlich durch sterische Probleme den Disulfid-Loop nicht zur richtigen Zeit, während
Peptide die notwendige Flexibilität besitzen. Wie ist dann aber die Wirkungsweise des
nativen E2-Proteins in vivo zu erklären? In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Heinrich Sticht
konnten computerbasierte Strukturanalysen der GBV-C E2-Ektodomäne zeigen, dass die
N-terminale Region (AS 1-75) unstrukturiert vorliegt und somit keine Sekundärstruktur
ausbildet. Diese E2-Region, welche die inhibitorischen Peptide P4-7 und P6-2 beinhaltet, ist
dadurch sehr flexibel und könnte somit durchaus in der Lage sein, den Disulfid-Loop von
gp41 zu erreichen.
Das HIV-1 Glykoprotein besteht aus dem Oberflächen- (gp120) und dem TransmembranProtein (gp41), die nicht-kovalent miteinander verbunden sind. Mehrere Gruppen konnten die
Interaktion des N- und C-Terminus von gp120 mit dem Disulfid-Loop sowie Anteilen des
NHR und CHR von gp41 nachweisen (Binley et al., 2000; Helseth et al., 1991; Jacobs et al.,
2005; Kim et al., 2008; Wang et al., 2008). Weiterführende Erkenntnisse über das
gp120-gp41 Zusammenspiel während der verschiedenen Phasen einer HIV-Infektion sind
jedoch sehr begrenzt. Somit gilt es noch herauszufinden, wie gp120 gp41 in der
metastabilen Konformation im ungebundenen Trimer bzw. nach der CD4-Bindung stabilisiert,
aber nach der Korezeptor-Bindung die gp41-Umlagerungen unterstützt. Erst eine kürzlich
veröffentlichte
Kristallstruktur
der
gp120-Kernregion,
die
auch
die
intakte
gp41-
Interaktionsebene zeigt, lässt drei räumlich getrennt liegende und strukturell bewegliche
Schichten im gp120 erkennen (Pancera et al., 2010). Die konformative Beweglichkeit dieser
Lagen ist wahrscheinlich wichtig, um die gp120-Bewegungen von gp41 auszugleichen. Dies
wird zusätzlich dadurch unterstützt, dass die gp120 N- und C-Termini teilweise flexibel zu
sein scheinen, so dass Interaktionen mit gp41 im Trimer Bewegungen der gp120-Termini
zulassen (Pancera et al., 2010). Diese Beweglichkeit der Termini liefert auch eine Erklärung
dafür, dass die Interaktionen des gp120 N-Terminus mit gp41 durch flexible Peptide imitiert
werden können. Interessanterweise konnte im Rahmen dieser Arbeit durch bioinformatische
Analysen eine Sequenzähnlichkeit der N-Termini von GBV-CE2 und HIV-1gp120 aufgedeckt
werden. Wahrscheinlich sind deshalb die E2-Peptide in der Lage mit dem gp120 N-Terminus
77
Diskussion
um die Bindung an den gp41-Disulfid-Loop zu konkurrieren. Tatsächlich ließ sich durch
Kompetitionsversuche in dieser Arbeit bestätigen, dass die inhibitorischen E2-Peptide und
ein entsprechendes N-terminales gp120-Peptid (AS 31-65) die gleiche Bindungsstelle im
gp41 besitzen. Zusammenfassend deuten die experimentellen Daten in Kombination mit den
bioinformatischen Vorhersagen darauf hin, dass der GBV-CE2 N-Terminus den HIV-1gp120
N-Terminus imitiert und somit mit gp120 um die Bindung an den gp41-Disulfid-Loop
konkurriert. Demzufolge wird wahrscheinlich durch das E2-Protein bzw. die N-terminalen
E2-Peptide der Kontakt zwischen gp120 und gp41 gestört, wodurch das aufeinander
abgestimmte Zusammenspiel zwischen Stabilisierung (nativer, ungebundener Zustand) und
Destabilisierung (rezeptorgebundener und folgende Zustände) von gp120 und gp41
behindert wird. Dies ist jedoch notwendig für die komplexe Abfolge der verschiedenen HIV-1
Entry-Schritte. Insbesondere könnte durch die E2-Bindung an den gp41-Disulfid-Loop die
Flexibilität von gp41 gestört werden, die zur 6-HB Ausbildung notwendig ist oder es könnte
die Membran-Erreichbarkeit von gp41 eingeschränkt sein, die für das Verschmelzen der
Virus- mit der Zellmembran wichtig zu sein scheint (Ashkenazi et al., 2012).
Die HIV-inhibitorische Relevanz des E2-Glykoproteins wird durch die Untersuchungen
anderer Arbeitsgruppen unterstützt (Herrera et al., 2010; Mohr and Stapleton, 2009; Xiang et
al., 2012). Herrera und Mitarbeiter beobachteten ebenfalls eine Hemmungsaktivität des
GBV-C E2 N-Terminus (AS 31-78) auf das HIV-Entry (Herrera et al., 2010). Zusätzlich
wurden jedoch auch nachfolgende Abschnitte in Richtung des C-Terminus als HIV-hemmend
charakterisiert, die in unserer Arbeitsgruppe wahrscheinlich nicht identifiziert wurden, da in
vorhergehenden Suchtesten eine geringere E2-Peptidmenge (10 µM statt 500 µM)
eingesetzt wurde (Herrera et al., 2010; Koedel et al., 2011). Eine derartige Steigerung der
eingesetzten Peptidmenge kann aber leicht zu unspezifischen Wirkungen führen. Des
Weiteren können unsere Daten nicht die Unterdrückung der HIV-Replikation durch die
Interaktion mit dem HIV-Fusionspeptid bestätigen, die Herrera und Mitarbeiter postulieren
(Herrera et al., 2010). Jedoch wäre es durchaus möglich, dass, neben der Assoziation des
E2
N-Terminus
mit
dem
gp41-Disulfid-Loop,
andere
E2-Bereiche
mit
dem
gp41-Fusionspeptid interagieren. Weiterhin konnte die inhibitorische Wirkung auf das HIVEntry durch die Expression des E2-Proteins in Jurkat-Zellen bestätigt werden (Xiang 2012).
Xiang et al. grenzten dabei die aktive Domäne auf 17 Aminosäuren (AS 276-292) im
C-terminalen Bereich ein. Dies entspricht allerdings dem in dieser Arbeit als Negativkontrolle
verwendetem Peptid P28. Tatsächlich ist auch bei Xiang und Mitarbeitern dieses Peptid in
Zellkultur nicht aktiv, sondern muss mit Tat fusioniert sein, um von der Zelle aufgenommen
zu werden. Somit wirkt dieser C-terminale Bereich ausschließlich intrazellulär und hat
wahrscheinlich einen völlig anderen Wirkmechanismus als der N-terminale Bereich.
78
Diskussion
Der in dieser Arbeit beschriebene Mechanismus, in dem das GBV-C E2-Protein den
Zelleintritt von HIV-1 unterdrückt, basiert auf einer direkten Interaktion zweier viraler
Glykoproteine. Durch die membranständige Position des E2-Proteins sind HIV/GBV-C
koinfizierte Zellen für die Interferenz nicht notwendig. Somit ist der hier beschriebene
Mechanismus wahrscheinlich der relevanteste in vivo. Bis zu 108 GBV-C Viruspartikel
zirkulieren in einem Milliliter Serum von HIV-Patienten (Jung et al., 2005; Tillmann et al.,
2001). Wenn GBV-C mit anderen Flaviviren vergleichbar ist, werden ca. 180 Kopien des E2
auf der Virusoberfläche präsentiert (Lindenbach and Rice, 2003). Somit könnten 1x109
virusständige E2-Proteine je Milliliter Serum zirkulieren.
Zusätzlich ist auch das
Vorhandensein von freiem sowie Exosomen-gebundenem E2-Protein möglich, wie es auch
für andere Viren wie HIV und HCV beschrieben ist (Gould et al., 2003; Masciopinto et al.,
2004). Des Weiteren wird auch ein geringer Prozentsatz des E2-Proteins an der
Plasmamembran von GBV-C infizierten Zellen präsentiert. Demzufolge ist wahrscheinlich
weitaus mehr E2 im Serum vorhanden, als von der Viruslast zu berechnen ist. Zusätzlich
könnte auch durch die E2-Produktion in Lymphozyten eine lokale Anreicherung im
lymphatischen Gewebe erreicht werden, die zu einer HIV-Hemmung führen kann.
Entsprechend dieser Präsenz des E2-Proteins kann der in vitro erreichte IC50-Wert von 6 nM
auch in vivo möglich sein (Jung, 2010). In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass
neben der spezifischen gp41-Bindung, die E2-Peptide auch unspezifisch an zelluläre
Membranen binden. Die HIV-inhibitorischen Peptide besitzen ein Tryptophan-reiches Motiv
(WVWV), welches mit der Lipid-Bindungsdomäne von T-20 (WASLWNWF) vergleichbar sein
könnte (Liu et al., 2007). Das E2 wäre dann am HI-Virus präsent und könnte den gp41Disulfid-Loop binden, sobald dieser erreichbar ist.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Interaktion des GBV-C E2 N-Terminus mit
dem gp41-Disulfid-Loop die HIV-1 Fusion deutlich hemmt. Somit ist der Disulfid-Loop ein
neues, erfolgversprechendes Ziel der HIV-1 Entry-Hemmung und die N-terminalen
E2-Peptide können als Grundlage für die Entwicklung neuer Fusionsinhibitoren genutzt
werden.
79
Diskussion
8.3. E2-Peptide in der HIV-Therapie – Ein Ausblick
Peptide sind auf Grund ihrer geringen Größe und spezifischen Bindungseigenschaften sehr
gut geeignet, um Protein-Protein-Interaktionen zu stören und deshalb ideale Kandidaten zur
Entwicklung von innovativen Medikamenten (Huther and Dietrich, 2007). Mehr als 140
Peptide werden klinisch genutzt und mehr als 400 Peptide befinden sich in einer
präklinischen Phase. Dies bedeutet im Durchschnitt einen jährlichen Anstieg von mehr als
15% (Huther and Dietrich, 2007). Peptide werden zur Behandlung verschiedener
Erkrankungen, wie z.B. Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, Hepatitis oder Morbus
Alzheimer genutzt. Auch in der HIV-Therapie haben Peptide eine bedeutende Rolle
eingenommen. Wesentliche Forschungsarbeit in der Entwicklung neuer HIV-Inhibitoren
wurde bereits in den frühen 1990er Jahren geleistet und seit 2003 ist der Fusionsinhibitor
Enfuvirtid (Fuzeon® bzw. T-20) als HIV-Medikament zugelassen (Duffalo and James, 2003).
T-20 ist ein vom CHR-abgeleitetes Peptid mit hoher antiviraler Aktivität im unteren
nanomolaren Bereich [ca. 6 nM; (Cai and Jiang, 2010)]. Dieses Peptid bindet vornehmlich an
korrespondierende NHR-Sequenzen von gp41 und verhindert so die Ausbildung des SechsHelix-Bündels (6-HB) und die anschließende Membranverschmelzung von Virus und Zelle.
Aber die Tatsache, dass T-20 zweimal am Tag subkutan injiziert werden muss, kombiniert
mit einer häufigen Resistenzentwicklung, hat den Einsatz von T-20 stark limitiert. Seitdem
wurden weitere Peptid-Inhibitoren entwickelt, die von gp41 NHR- oder CHR-Sequenzen
abgeleitet
sind
und
mit
ihrem
entsprechenden
Gegenpart
in
gp41
interagieren
[zusammengefasst in (Cai and Jiang, 2010)]. Trotz erhöhter antiviraler Aktivität hat bis jetzt
jedoch, meist auf Grund von Unverträglichkeiten oder schlechter Bioverfügbarkeit, noch
keines dieser Peptide Einzug in die Klinik genommen [zusammengefasst in (Cai and Jiang,
2010)].Die Identifizierung der N-terminalen GBV-C E2-Peptide führt eine völlig neue Klasse
von HIV-Fusionsinhibitoren ein, die, bedingt durch strukturelle Ähnlichkeit mit dem
gp41-interagierenden gp120-Protein, mit dem gp41-Disulfid-Loop interagieren. Jedoch
zeigen diese Peptide ein eingeschränktes Wirtsspektrum und eine antivirale Aktivität, die im
unteren mikromolaren Bereich liegt (Koedel et al., 2011). Um präklinische Studien zu
rechtfertigen, müsste für die GBV-C E2-Peptide primär eine Optimierung des IC50-Wertes in
den nanomolaren Bereich erfolgen.
Ein interessantes Beispiel liefert die Isolierung und Optimierung von VIRIP, ein im Serum
natürlich vorkommendes Peptid, welches ein Abbauprodukt von Alpha-1-Antitrypsin darstellt.
Die Arbeitsgruppe um Kirchhoff konnte dieses Peptid aus Hämofiltraten isolieren und zeigen,
dass es das N-terminal gelegene Fusionspeptid von gp41 bindet und somit den HIV-1 EntryProzess unterdrückt (Munch et al., 2007). Eine verbesserte anti-retrovirale Potenz von VIRIP
(VIR-576) um zwei Größenordnungen konnte durch einzelne Aminosäure-Austausche
80
Diskussion
erreicht werden. Dieser Ansatz könnte auch für die E2-Peptide eine Möglichkeit der PeptidOptimierung darstellen, z.B. durch Aminosäure-Austausche in Richtung des HIV-1 gp120
N-Terminus, dem natürlichen Bindungspartner des Disulfid-Loops. Tatsächlich konnte in
ersten Versuchen gezeigt werden, dass auch ein Peptid, das den HIV-1 gp120 N-Terminus
repräsentiert, eine HIV-inhibierende Wirkung zeigt (Eissmann, uveröffentlichte Daten). Des
Weiteren bieten Veränderungen der Positionen der Cystein-Reste und die Variierung des
Redoxstatus dieser Cysteine zusätzliche Optimierungsmöglichkeiten, da die Cystein-Reste
sowohl der E2-Peptide als auch des Disulfid-Loops für die Interaktion essentiell zu sein
scheinen. Weitere Optimierungsstrategien können von der Entwicklung der CHR- und NHRPeptide abgeleitet werden. Die Kombination von verschiedenen Peptid-Fusionsinhibitoren,
die unterschiedliche Zielsequenzen binden, führte zur Entwicklung von optimierten
Inhibitorkandidaten. Die Arbeitsgruppe von Shibo Jiang konnte beispielsweise durch die
Verknüpfung von T-20, einem Peptid der ersten Generation, mit T1144, einem
Fusionsinhibitor der dritten Generation, Synergismen erhalten und eine Steigerung der antiretroviralen Aktivität um bis zu drei Größenordnungen erzielen (Pan et al., 2009). Eine
vergleichbare Strategie könnte durch die Entwicklung von Chimären aus E2- und DisulfidLoop flankierenden CHR- oder NHR-Peptiden verfolgt werden. Dies könnte zum einen die
Bindungsaffinität der E2-Peptide erhöhen und zum anderen könnten sich auch hier durch die
Kombination zweier unterschiedlicher Peptidinhibitoren synergistische Effekte ergeben.
Ein Nachteil von Peptid-Fusionsinhibitoren sind jedoch die hohen Kosten der Herstellung und
die Schwierigkeit der regelmäßigen Verabreichung durch Injektionen, die auf Grund der
schnellen Proteolyse von Peptid-Medikamenten notwendig ist. Aber auch hierfür sind
Lösungsansätze in der Literatur zu finden, bei denen durch die kovalente Verknüpfung von
Peptiden mit 3- Maleimidopropionic -Säure, die eine schnelle und irreversible Konjugation mit
humanem Serumalbumin zur Folge hat, die Stabilität und Bioverfügbarkeit deutlich erhöht
werden konnte (Stoddart et al., 2008; Xie et al., 2010). Ein deutlicher Vorteil von GBV-C
E2-abgeleiteten Peptiden liegt in der Vermutung, dass GBV-C E2 oder E2-Peptide gut
verträglich sein müssten, da hoch-virämische GBV-C-positive Individuen, die eine Viruslast
von bis zu 108 GBV-C Partikel pro Milliliter Plasma aufweisen, keinerlei gesundheitliche
Einschränkungen haben. Des Weiteren ist die Wahrscheinlichkeit von Resistenzbildungen
bei E2-Peptiden als sehr gering einzuschätzen, da die Bindung an den hoch-konservierten
Disulfid-Loop erfolgt.
Zusammenfassend bieten die E2-Peptide sehr gute Möglichkeiten der effizienten
HIV-Infektionshemmung
durch
strukturelle
Mimikry
und
der
Nachahmung
von
Bindungsdomänen innerhalb des gp120-gp41 Interface. Die Weiterentwicklung dieser neuen
Klasse
von
Peptid-Fusionsinhibitoren
könnte
Medikament der HAART führen.
81
somit
zu
einem
vielversprechenden
Abkürzungsverzeichnis
9.
Abkürzungsverzeichnis
°C
Grad Celsius
6-HB
Sechs-Helix-Bündel
AIDS
engl.: acquired immunodeficiency syndrome
ALL
akute lymphoblastische Leukämie
AMP
Adenosinmonophosphat
APS
Ammoniumperoxodisulfat
AS
Aminosäure
ATP
Adenosintriphosphat
BlaM
β-Laktamase
BSA
Bovines Serumalbumin
BVDV
Bovine-Virusdiarrhoe-Virus
CCD
engl.: charged-coupled device
CCPM
engl.: corrected counts per minute
CCR5
CC-Motiv-Chemokin-Rezeptor 5
CD4
engl.: cluster of differentiation 4
CHR
engl.: C-terminal heptad repeat
CP
engl.: cytoplasmic domain
CRF
engl.: circulating recombinant forms
CXCR4
CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4
DAI
engl.: dsRNA-activated inhibitor
DEAE
Diethylaminoethylcellulose
DMEM
engl.: Dulbecco´s modified Eagle medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
engl.:deoxyribonucleic acid
DTT
Dithiothreitol
dTTP
Desoxythymidintriphosphat
DV
Denguevirus
E. coli
Escherichia coli
ECL
engl.: enhanced chemiluminescence
EDTA
engl.: ethylenediaminetetraacetic acid
EGFP
engl.: enhanced GFP
ELISA
engl.: enzyme linked immunosorbent assay
ER
Endoplasmatisches Retikulum
82
Abkürzungsverzeichnis
et al.
lat.: et alia
FACS
engl.: fluorescence activated cell sorting
FITC
Fluorescein isothiocyanat
FP
Fusionspeptid
FRET
Förster-Resonanzenergietransfer
g
Erdschwerebeschleunigung
GBV-C
GB Virus C
GFP
Grün-fluoreszierendes Protein
gp
Glykoprotein
h
Stunde
HAART
hochaktive antiretrovirale Therapie
HBSS
engl.: Hank's balanced salt solution
HCV
Hepatitis C Virus
HEK
engl.: human embryonic kidney
HGV
Hepatitis G Virus
His-Tag
engl.: polyhistidine tag
HIV
humanes Immundefizienz-Virus
HPgV
humanes Pegivirus
HPLC
engl.: high-performance liquid chromatography
HRP
engl.: horse-radish peroxidase
IC50
mittlere inhibitorische Konzentration
IgG
Immunglobulin G
IL-2
Interleukin-2
IRES
interne ribosomale Eintrittsstelle
JEV
engl.: japanese encephalitis virus
kDa
Kilodalton
LB
engl.: lysogeny broth
LTR
engl.: long terminal repeat
μg
Mikrogramm
μl
Mikroliter
μm
Mikrometer
μM
mikromolar
min
Minute
mM
millimolar
83
Abkürzungsverzeichnis
MIP-1
engl.: macrophage inflammatory protein 1
MPER
membranproximale externe Region
mRNA
engl.: messenger RNA
Nef
engl.: negative factor
NFκB
engl.: nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells
NHR
engl.: N-terminal heptad repeat
NIH
National Institutes of Health
Ni-NTA
Nickel -Nitrilotriessigsäure
NNRTI
Nichtnukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren
NRTI
Nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren
NS
Nichtstrukturprotein
ORF
engl.: open reading frame
PAA
Polyacrylamid
pAK
polyklonaler Antikörper
PBMC
engl.: peripheral blood mononuclear cells
PBS
engl.: phosphate buffered saline
PBSo
engl.: phosphate buffered saline without Mg2+ and Ca2+
PCR
engl.: polymerase chain reaction
pDC
plasmazytoide dendritische Zelle
PE
Phycoerythrin
PHA
Phytohemagglutinin
PI
Protease-Inhibitoren
PMA
Phorbol-12-myristat-13-acetat
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
PVDF
Polyvinylidenfluorid
RANTES
engl.: regulated and normal T cell expressed and secreted
RLU/s
engl.: relative light units per second
RNA
engl.: ribonucleic acid
rpm
engl.: revolutions per minute
RPMI
engl.: Roswell Park Memorial Institute
RT
Raumtemperatur
RT
Reverse Transkriptase
RTCN
engl.: ratio to cell negative
sCD4
engl.: soluble CD4
SDF-1
engl.: stromal cell-derived factor 1
84
Abkürzungsverzeichnis
SDS
engl.: sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE
engl.: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SIV
engl.: simian immunodeficiency virus
SPgVcpz
Schimpansen-Pegivirus
SSC
engl.: saline sodium citrate
TAE
engl.: Tris acetate EDTA
TAS
engl.: temperature-arrested state
TBEV
engl.: Tick-borne encephalitis virus
TEMED
Tetramethylethylendiamin
TetR
Tet-Repressor
Th-1
T-Helferzellen Typ 1
TM
Transmembran-Domäne
TRE
engl.: tet responsive element
Tris
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
tTA
Tetrazyklin-kontrollierter Transkriptionsaktivator
üN
über Nacht
UTR
engl.: untranslated region
V
Volt
VA
engl.: virus associated
Vpr
virales Protein R
VSV
Vesikuläres Stomatitis Virus
wt
Wildtyp
YFV
engl.: yellow fever virus
85
Literaturverzeichnis
10. Literaturverzeichnis
(UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic, 2012).
Abacioglu, Y.H., Fouts, T.R., Laman, J.D., Claassen, E., Pincus, S.H., Moore, J.P., Roby, C.A., KaminLewis, R., and Lewis, G.K. (1994). Epitope mapping and topology of baculovirus-expressed HIV-1 gp160
determined with a panel of murine monoclonal antibodies. AIDS Res Hum Retroviruses 10, 371-381.
Abrahamyan, L.G., Markosyan, R.M., Moore, J.P., Cohen, F.S., and Melikyan, G.B. (2003). Human
immunodeficiency virus type 1 Env with an intersubunit disulfide bond engages coreceptors but requires
bond reduction after engagement to induce fusion. J Virol 77, 5829-5836.
Adachi, A., Gendelman, H.E., Koenig, S., Folks, T., Willey, R., Rabson, A., and Martin, M.A. (1986).
Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells
transfected with an infectious molecular clone. J Virol 59, 284-291.
Aikawa, T., Sugai, Y., and Okamoto, H. (1996). Hepatitis G infection in drug abusers with chronic hepatitis
C. N Engl J Med 334, 195-196.
Alcalde, R., Nishiya, A., Casseb, J., Inocencio, L., Fonseca, L.A., and Duarte, A.J. (2010). Prevalence and
distribution of the GBV-C/HGV among HIV-1-infected patients under anti-retroviral therapy. Virus Res 151,
148-152.
Alkhatib, G., Broder, C.C., and Berger, E.A. (1996). Cell type-specific fusion cofactors determine human
immunodeficiency virus type 1 tropism for T-cell lines versus primary macrophages. J Virol 70, 5487-5494.
Alter, H.J. (1996). The cloning and clinical implications of HGV and HGBV-C. N Engl J Med 334, 15361537.
Alter, H.J., Nakatsuji, Y., Melpolder, J., Wages, J., Wesley, R., Shih, J.W., and Kim, J.P. (1997). The
incidence of transfusion-associated hepatitis G virus infection and its relation to liver disease. N Engl J Med
336, 747-754.
Ashkenazi, A., Merklinger, E., and Shai, Y. (2012). Intramolecular interactions within the human
immunodeficiency virus-1 gp41 loop region and their involvement in lipid merging. Biochemistry 51, 69816989.
Ashkenazi, A., Viard, M., Wexler-Cohen, Y., Blumenthal, R., and Shai, Y. (2011). Viral envelope protein
folding and membrane hemifusion are enhanced by the conserved loop region of HIV-1 gp41. FASEB J 25,
2156-2166.
Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., and Puthavathana, P. (2005).
Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology 337, 93-101.
Baba, M., Nishimura, O., Kanzaki, N., Okamoto, M., Sawada, H., Iizawa, Y., Shiraishi, M., Aramaki, Y.,
Okonogi, K., Ogawa, Y., et al. (1999). A small-molecule, nonpeptide CCR5 antagonist with highly potent
and selective anti-HIV-1 activity. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5698-5703.
Barbouche, R., Lortat-Jacob, H., Jones, I.M., and Fenouillet, E. (2005). Glycosaminoglycans and protein
disulfide isomerase-mediated reduction of HIV Env. Mol Pharmacol 67, 1111-1118.
Baril, M., Racine, M.E., Penin, F., and Lamarre, D. (2009). MAVS dimer is a crucial signaling component of
innate immunity and the target of hepatitis C virus NS3/4A protease. J Virol 83, 1299-1311.
Barrero-Villar, M., Barroso-Gonzalez, J., Cabrero, J.R., Gordon-Alonso, M., Alvarez-Losada, S., MunozFernandez, M.A., Sanchez-Madrid, F., and Valenzuela-Fernandez, A. (2008). PI4P5-kinase Ialpha is
required for efficient HIV-1 entry and infection of T cells. J Immunol 181, 6882-6888.
Belyaev, A.S., Chong, S., Novikov, A., Kongpachith, A., Masiarz, F.R., Lim, M., and Kim, J.P. (1998).
Hepatitis G virus encodes protease activities which can effect processing of the virus putative nonstructural
proteins. J Virol 72, 868-872.
86
Literaturverzeichnis
Berg, R.K., Melchjorsen, J., Rintahaka, J., Diget, E., Soby, S., Horan, K.A., Gorelick, R.J., Matikainen, S.,
Larsen, C.S., Ostergaard, L., et al. (2012). Genomic HIV RNA induces innate immune responses through
RIG-I-dependent sensing of secondary-structured RNA. PLoS One 7, e29291.
Bhattarai, N., Rydze, R.T., Chivero, E.T., and Stapleton, J.T. (2012). GB Virus C Viremia Is Associated With
Higher Levels of Double-Negative T Cells and Lower T-Cell Activation in HIV-Infected Individuals Receiving
Antiretroviral Therapy. J Infect Dis 206, 1469-1472.
Binley, J.M., Sanders, R.W., Clas, B., Schuelke, N., Master, A., Guo, Y., Kajumo, F., Anselma, D.J.,
Maddon, P.J., Olson, W.C., et al. (2000). A recombinant human immunodeficiency virus type 1 envelope
glycoprotein complex stabilized by an intermolecular disulfide bond between the gp120 and gp41 subunits
is an antigenic mimic of the trimeric virion-associated structure. J Virol 74, 627-643.
Birk, M., Lindback, S., and Lidman, C. (2002). No influence of GB virus C replication on the prognosis in a
cohort of HIV-1-infected patients. Aids 16, 2482-2485.
Birkmann, A., Mahr, K., Ensser, A., Yaguboglu, S., Titgemeyer, F., Fleckenstein, B., and Neipel, F. (2001).
Cell surface heparan sulfate is a receptor for human herpesvirus 8 and interacts with envelope glycoprotein
K8.1. J Virol 75, 11583-11593.
Bjorkman, P., Flamholc, L., Naucler, A., Molnegren, V., Wallmark, E., and Widell, A. (2004). GB virus C
during the natural course of HIV-1 infection: viremia at diagnosis does not predict mortality. Aids 18, 877886.
Boodram, B., Hershow, R.C., Klinzman, D., and Stapleton, J.T. (2011). GB virus C infection among young,
HIV-negative injection drug users with and without hepatitis C virus infection. J Viral Hepat 18, e153-159.
Borkow, G., and Lapidot, A. (2005). Multi-targeting the entrance door to block HIV-1. Curr Drug Targets
Infect Disord 5, 3-15.
Brumme, Z.L., Chan, K.J., Dong, W.W., Mo, T., Wynhoven, B., Hogg, R.S., Montaner, J.S.,
O'Shaughnessy, M.V., and Harrigan, P.R. (2002). No association between GB virus-C viremia and
virological or immunological failure after starting initial antiretroviral therapy. Aids 16, 1929-1933.
Butler, D.M., Delport, W., Kosakovsky Pond, S.L., Lakdawala, M.K., Cheng, P.M., Little, S.J., Richman,
D.D., and Smith, D.M. (2010). The origins of sexually transmitted HIV among men who have sex with men.
Sci Transl Med 2, 18re11.
Caffrey, M. (2011). HIV envelope: challenges and opportunities for development of entry inhibitors. Trends
Microbiol 19, 191-197.
Caffrey, M., Cai, M., Kaufman, J., Stahl, S.J., Wingfield, P.T., Covell, D.G., Gronenborn, A.M., and Clore,
G.M. (1998). Three-dimensional solution structure of the 44 kDa ectodomain of SIV gp41. EMBO J 17,
4572-4584.
Cai, L., and Jiang, S. (2010). Development of peptide and small-molecule HIV-1 fusion inhibitors that target
gp41. ChemMedChem 5, 1813-1824.
Carpenter, C.C., Fischl, M.A., Hammer, S.M., Hirsch, M.S., Jacobsen, D.M., Katzenstein, D.A., Montaner,
J.S., Richman, D.D., Saag, M.S., Schooley, R.T., et al. (1998). Antiretroviral therapy for HIV infection in
1998: updated recommendations of the International AIDS Society-USA Panel. Jama 280, 78-86.
Cavacini, L.A., Emes, C.L., Wisnewski, A.V., Power, J., Lewis, G., Montefiori, D., and Posner, M.R. (1998).
Functional and molecular characterization of human monoclonal antibody reactive with the
immunodominant region of HIV type 1 glycoprotein 41. AIDS Res Hum Retroviruses 14, 1271-1280.
Cavrois, M., De Noronha, C., and Greene, W.C. (2002). A sensitive and specific enzyme-based assay
detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes. Nat Biotechnol 20, 1151-1154.
Chan, D.C., Fass, D., Berger, J.M., and Kim, P.S. (1997). Core structure of gp41 from the HIV envelope
glycoprotein. Cell 89, 263-273.
87
Literaturverzeichnis
Chen, Z., Benureau, Y., Rijnbrand, R., Yi, J., Wang, T., Warter, L., Lanford, R.E., Weinman, S.A., Lemon,
S.M., Martin, A., et al. (2007). GB virus B disrupts RIG-I signaling by NS3/4A-mediated cleavage of the
adaptor protein MAVS. J Virol 81, 964-976.
Coffin, J., Haase, A., Levy, J.A., Montagnier, L., Oroszlan, S., Teich, N., Temin, H., Toyoshima, K., Varmus,
H., Vogt, P., et al. (1986). What to call the AIDS virus? Nature 321, 10.
Coffin, J.M., Hughes, S.H., Varmus, H.E., and editors. (1997). Retroviruses. Cold Spring Harbor (NY): Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Cohen, C.J., Dusek, A., Green, J., Johns, E.L., Nelson, E., and Recny, M.A. (2002). Long-term treatment
with subcutaneous T-20, a fusion inhibitor, in HIV-infected patients: patient satisfaction and impact on
activities of daily living. AIDS Patient Care STDS 16, 327-335.
Connor, R.I., Chen, B.K., Choe, S., and Landau, N.R. (1995). Vpr is required for efficient replication of
human immunodeficiency virus type-1 in mononuclear phagocytes. Virology 206, 935-944.
Dawson, G.J., Schlauder, G.G., Pilot-Matias, T.J., Thiele, D., Leary, T.P., Murphy, P., Rosenblatt, J.E.,
Simons, J.N., Martinson, F.E., Gutierrez, R.A., et al. (1996). Prevalence studies of GB virus-C infection
using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Med Virol 50, 97-103.
De Clercq, E., Yamamoto, N., Pauwels, R., Balzarini, J., Witvrouw, M., De Vreese, K., Debyser, Z.,
Rosenwirth, B., Peichl, P., Datema, R., et al. (1994). Highly potent and selective inhibition of human
immunodeficiency virus by the bicyclam derivative JM3100. Antimicrob Agents Chemother 38, 668-674.
Deinhardt, F., Holmes, A.W., Capps, R.B., and Popper, H. (1967). Studies on the transmission of human
viral hepatitis to marmoset monkeys. I. Transmission of disease, serial passages, and description of liver
lesions. J Exp Med 125, 673-688.
Deleage, G., Blanchet, C., and Geourjon, C. (1997). Protein structure prediction. Implications for the
biologist. Biochimie 79, 681-686.
Devereux, H., Sabin, C.A., Kinson, Z., Brown, D., Griffioen, A., Dusheiko, G.M., and Lee, C.A. (1998).
Influence of HIV-1 infection on GBV-C infection in multiply infected haemophilic patients. J Med Virol 56,
316-320.
Dille, B.J., Surowy, T.K., Gutierrez, R.A., Coleman, P.F., Knigge, M.F., Carrick, R.J., Aach, R.D., Hollinger,
F.B., Stevens, C.E., Barbosa, L.H., et al. (1997). An ELISA for detection of antibodies to the E2 protein of
GB virus C. J Infect Dis 175, 458-461.
Dimitrov, D.S. (2004). Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nat Rev Microbiol 2,
109-122.
Doms, R.W., and Moore, J.P. (2000). HIV-1 membrane fusion: targets of opportunity. J Cell Biol 151, F9-14.
Doms, R.W., and Peiper, S.C. (1997). Unwelcomed guests with master keys: how HIV uses chemokine
receptors for cellular entry. Virology 235, 179-190.
Duffalo, M.L., and James, C.W. (2003). Enfuvirtide: a novel agent for the treatment of HIV-1 infection. Ann
Pharmacother 37, 1448-1456.
Earl, P.L., Broder, C.C., Doms, R.W., and Moss, B. (1997). Epitope map of human immunodeficiency virus
type 1 gp41 derived from 47 monoclonal antibodies produced by immunization with oligomeric envelope
protein. J Virol 71, 2674-2684.
Fatkenheuer, G. (2005). [New kinds of AIDS drugs inhibit HIV entry into the cell. Entry inhibitors soon for
oral administration]. MMW Fortschr Med 147 Spec No 1, 46-48.
Fauci, A.S. (1988). The George M. Kober lecture. Basic immunology: the path to the delineation of the
immunopathogenic mechanisms of HIV infection. Trans Assoc Am Physicians 101, clx-clxxiii.
Feng, Y., Broder, C.C., Kennedy, P.E., and Berger, E.A. (1996). HIV-1 entry cofactor: functional cDNA
cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor. Science 272, 872-877.
88
Literaturverzeichnis
Fenouillet, E., Barbouche, R., and Jones, I.M. (2007). Cell entry by enveloped viruses: redox considerations
for HIV and SARS-coronavirus. Antioxid Redox Signal 9, 1009-1034.
Feucht, H.H., Fischer, L., Sterneck, M., Broelsch, C.E., and Laufs, R. (1997). GB virus C transmission by
blood products. Lancet 349, 435.
Frey, S.E., Homan, S.M., Sokol-Anderson, M., Cayco, M.T., Cortorreal, P., Musial, C.E., and Di Bisceglie,
A. (2002). Evidence for probable sexual transmission of the hepatitis g virus. Clin Infect Dis 34, 1033-1038.
Gallo, S.A., Puri, A., and Blumenthal, R. (2001). HIV-1 gp41 six-helix bundle formation occurs rapidly after
the engagement of gp120 by CXCR4 in the HIV-1 Env-mediated fusion process. Biochemistry 40, 1223112236.
George, S.L., and Varmaz, D. (2005). What you need to know about GB virus C. Curr Gastroenterol Rep 7,
54-62.
George, S.L., Varmaz, D., and Stapleton, J.T. (2006). GB virus C replicates in primary T and B
lymphocytes. J Infect Dis 193, 451-454.
George, S.L., Varmaz, D., Tavis, J.E., and Chowdhury, A. (2012). The GB virus C (GBV-C) NS3 serine
protease inhibits HIV-1 replication in a CD4+ T lymphocyte cell line without decreasing HIV receptor
expression. PLoS One 7, e30653.
Ginalski, K., Elofsson, A., Fischer, D., and Rychlewski, L. (2003). 3D-Jury: a simple approach to improve
protein structure predictions. Bioinformatics 19, 1015-1018.
Gossen, M., and Bujard, H. (1992). Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracyclineresponsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 5547-5551.
Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W., and Bujard, H. (1995). Transcriptional
activation by tetracyclines in mammalian cells. Science 268, 1766-1769.
Gould, S.J., Booth, A.M., and Hildreth, J.E. (2003). The Trojan exosome hypothesis. Proc Natl Acad Sci U
S A 100, 10592-10597.
Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., and Nairn, R. (1977). Characteristics of a human cell line
transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol 36, 59-74.
Gutierrez, R.A., Dawson, G.J., Knigge, M.F., Melvin, S.L., Heynen, C.A., Kyrk, C.R., Young, C.E., Carrick,
R.J., Schlauder, G.G., Surowy, T.K., et al. (1997). Seroprevalence of GB virus C and persistence of RNA
and antibody. J Med Virol 53, 167-173.
Harper, M.E., Kaplan, M.H., Marselle, L.M., Pahwa, S.G., Chayt, K.J., Sarngadharan, M.G., Wong-Staal, F.,
and Gallo, R.C. (1986). Concomitant infection with HTLV-I and HTLV-III in a patient with T8
lymphoproliferative disease. N Engl J Med 315, 1073-1078.
Haynes, B.F., and Montefiori, D.C. (2006). Aiming to induce broadly reactive neutralizing antibody
responses with HIV-1 vaccine candidates. Expert Rev Vaccines 5, 347-363.
He, Y., Cheng, J., Li, J., Qi, Z., Lu, H., Dong, M., Jiang, S., and Dai, Q. (2008). Identification of a critical
motif for the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp41 core structure: implications for designing
novel anti-HIV fusion inhibitors. J Virol 82, 6349-6358.
Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., and Sodroski, J. (1991). Human immunodeficiency virus type 1
gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.
J Virol 65, 2119-2123.
Henderson, H.I., and Hope, T.J. (2006). The temperature arrested intermediate of virus-cell fusion is a
functional step in HIV infection. Virol J 3, 36.
Henderson, K.A., Streltsov, V.A., Coley, A.M., Dolezal, O., Hudson, P.J., Batchelor, A.H., Gupta, A., Bai, T.,
Murphy, V.J., Anders, R.F., et al. (2007). Structure of an IgNAR-AMA1 complex: targeting a conserved
hydrophobic cleft broadens malarial strain recognition. Structure 15, 1452-1466.
89
Literaturverzeichnis
Heringlake, S., Ockenga, J., Tillmann, H.L., Trautwein, C., Meissner, D., Stoll, M., Hunt, J., Jou, C.,
Solomon, N., Schmidt, R.E., et al. (1998). GB virus C/hepatitis G virus infection: a favorable prognostic
factor in human immunodeficiency virus-infected patients? J Infect Dis 177, 1723-1726.
Herrera, E., Gomara, M.J., Mazzini, S., Ragg, E., and Haro, I. (2009). Synthetic peptides of hepatitis G virus
(GBV-C/HGV) in the selection of putative peptide inhibitors of the HIV-1 fusion peptide. J Phys Chem B
113, 7383-7391.
Herrera, E., Tenckhoff, S., Gomara, M.J., Galatola, R., Bleda, M.J., Gil, C., Ercilla, G., Gatell, J.M.,
Tillmann, H.L., and Haro, I. (2010). Effect of synthetic peptides belonging to E2 envelope protein of GB
virus C on human immunodeficiency virus type 1 infection. J Med Chem 53, 6054-6063.
Holland, A.U., Munk, C., Lucero, G.R., Nguyen, L.D., and Landau, N.R. (2004). Alpha-complementation
assay for HIV envelope glycoprotein-mediated fusion. Virology 319, 343-352.
Huther, A., and Dietrich, U. (2007). The emergence of peptides as therapeutic drugs for the inhibition of
HIV-1. AIDS Rev 9, 208-217.
Jacobs, A., Quraishi, O., Huang, X., Bousquet-Gagnon, N., Nault, G., Francella, N., Alvord, W.G., Pham,
N., Soucy, C., Robitaille, M., et al. (2007). A covalent inhibitor targeting an intermediate conformation of the
fusogenic subunit of the HIV-1 envelope complex. J Biol Chem 282, 32406-32413.
Jacobs, A., Sen, J., Rong, L., and Caffrey, M. (2005). Alanine scanning mutants of the HIV gp41 loop. J Biol
Chem 280, 27284-27288.
Jiang, S., Lin, K., and Lu, M. (1998). A conformation-specific monoclonal antibody reacting with fusionactive gp41 from the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol 72, 10213-10217.
Jiang, S., Lin, K., Strick, N., and Neurath, A.R. (1993). Inhibition of HIV-1 infection by a fusion domain
binding peptide from the HIV-1 envelope glycoprotein GP41. Biochem Biophys Res Commun 195, 533-538.
Jung, S. (2010). GB Virus C Proteine interferieren mit der Replikation von HIV-1.
Jung, S., Eichenmuller, M., Donhauser, N., Neipel, F., Engel, A.M., Hess, G., Fleckenstein, B., and Reil, H.
(2007). HIV entry inhibition by the envelope 2 glycoprotein of GB virus C. Aids 21, 645-647.
Jung, S., Knauer, O., Donhauser, N., Eichenmuller, M., Helm, M., Fleckenstein, B., and Reil, H. (2005).
Inhibition of HIV strains by GB virus C in cell culture can be mediated by CD4 and CD8 T-lymphocyte
derived soluble factors. Aids 19, 1267-1272.
Kao, J.H., Liu, C.J., Chen, P.J., Chen, W., Hsiang, S.C., Lai, M.Y., and Chen, D.S. (1997). Interspousal
transmission of GB virus-C/hepatitis G virus: a comparison with hepatitis C virus. J Med Virol 53, 348-353.
Karayiannis, P., Hadziyannis, S.J., Kim, J., Pickering, J.M., Piatak, M., Hess, G., Yun, A., McGarvey, M.J.,
Wages, J., and Thomas, H.C. (1997). Hepatitis G virus infection: clinical characteristics and response to
interferon. J Viral Hepat 4, 37-44.
Kaufman, T.M., McLinden, J.H., Xiang, J., Engel, A.M., and Stapleton, J.T. (2007). The GBV-C envelope
glycoprotein E2 does not interact specifically with CD81. Aids 21, 1045-1048.
Kawai, T., Takahashi, K., Sato, S., Coban, C., Kumar, H., Kato, H., Ishii, K.J., Takeuchi, O., and Akira, S.
(2005). IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat Immunol 6,
981-988.
Kim, J.P., and Fry, K.E. (1997). Molecular characterization of the hepatitis G virus. J Viral Hepat 4, 77-79.
Kim, S., Pang, H.B., and Kay, M.S. (2008). Peptide mimic of the HIV envelope gp120-gp41 interface. J Mol
Biol 376, 786-797.
Koedel, Y., Eissmann, K., Wend, H., Fleckenstein, B., and Reil, H. (2011). Peptides derived from a distinct
region of GB virus C glycoprotein E2 mediate strain-specific HIV-1 entry inhibition. J Virol 85, 7037-7047.
90
Literaturverzeichnis
Kohl, N.E., Emini, E.A., Schleif, W.A., Davis, L.J., Heimbach, J.C., Dixon, R.A., Scolnick, E.M., and Sigal,
I.S. (1988). Active human immunodeficiency virus protease is required for viral infectivity. Proc Natl Acad
Sci U S A 85, 4686-4690.
Krajden, M., Yu, A., Braybrook, H., Lai, A.S., Mak, A., Chow, R., Cook, D., Tellier, R., Petric, M., Gascoyne,
R.D., et al. (2010). GBV-C/hepatitis G virus infection and non-Hodgkin lymphoma: a case control study. Int
J Cancer 126, 2885-2892.
Kwong, P.D., Wyatt, R., Sattentau, Q.J., Sodroski, J., and Hendrickson, W.A. (2000). Oligomeric modeling
and electrostatic analysis of the gp120 envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus. J Virol 74,
1961-1972.
Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227, 680-685.
Leary, T.P., Muerhoff, A.S., Simons, J.N., Pilot-Matias, T.J., Erker, J.C., Chalmers, M.L., Schlauder, G.G.,
Dawson, G.J., Desai, S.M., and Mushahwar, I.K. (1996). Sequence and genomic organization of GBV-C: a
novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis. J Med Virol 48, 60-67.
Lee, B., Sharron, M., Montaner, L.J., Weissman, D., and Doms, R.W. (1999). Quantification of CD4, CCR5,
and CXCR4 levels on lymphocyte subsets, dendritic cells, and differentially conditioned monocyte-derived
macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5215-5220.
Lefrere, J.J., Loiseau, P., Maury, J., Lasserre, J., Mariotti, M., Ravera, N., Lerable, J., Lefevre, G., MorandJoubert, L., and Girot, R. (1997). Natural history of GBV-C/hepatitis G virus infection through the follow-up
of GBV-C/hepatitis G virus-infected blood donors and recipients studied by RNA polymerase chain reaction
and anti-E2 serology. Blood 90, 3776-3780.
Lefrere, J.J., Roudot-Thoraval, F., Morand-Joubert, L., Petit, J.C., Lerable, J., Thauvin, M., and Mariotti, M.
(1999). Carriage of GB virus C/hepatitis G virus RNA is associated with a slower immunologic, virologic,
and clinical progression of human immunodeficiency virus disease in coinfected persons. J Infect Dis 179,
783-789.
Lindenbach, B.D., and Rice, C.M. (2003). Molecular biology of flaviviruses. Adv Virus Res 59, 23-61.
Linding, R., Russell, R.B., Neduva, V., and Gibson, T.J. (2003). GlobPlot: Exploring protein sequences for
globularity and disorder. Nucleic Acids Res 31, 3701-3708.
Linnen, J., Wages, J., Jr., Zhang-Keck, Z.Y., Fry, K.E., Krawczynski, K.Z., Alter, H., Koonin, E., Gallagher,
M., Alter, M., Hadziyannis, S., et al. (1996). Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:
a transfusion-transmissible agent. Science 271, 505-508.
Liu, S., Jing, W., Cheung, B., Lu, H., Sun, J., Yan, X., Niu, J., Farmar, J., Wu, S., and Jiang, S. (2007). HIV
gp41 C-terminal heptad repeat contains multifunctional domains. Relation to mechanisms of action of antiHIV peptides. J Biol Chem 282, 9612-9620.
Lu, M., and Kim, P.S. (1997). A trimeric structural subdomain of the HIV-1 transmembrane glycoprotein. J
Biomol Struct Dyn 15, 465-471.
Maddon, P.J., Dalgleish, A.G., McDougal, J.S., Clapham, P.R., Weiss, R.A., and Axel, R. (1986). The T4
gene encodes the AIDS virus receptor and is expressed in the immune system and the brain. Cell 47, 333348.
Maidana-Giret, M.T., Silva, T.M., Sauer, M.M., Tomiyama, H., Levi, J.E., Bassichetto, K.C., Nishiya, A.,
Diaz, R.S., Sabino, E.C., Palacios, R., et al. (2009). GB virus type C infection modulates T-cell activation
independently of HIV-1 viral load. Aids 23, 2277-2287.
Marks, K., and Gulick, R.M. (2004). New antiretroviral agents for the treatment of HIV infection. Curr
HIV/AIDS Rep 1, 82-88.
Masciopinto, F., Giovani, C., Campagnoli, S., Galli-Stampino, L., Colombatto, P., Brunetto, M., Yen, T.S.,
Houghton, M., Pileri, P., and Abrignani, S. (2004). Association of hepatitis C virus envelope proteins with
exosomes. Eur J Immunol 34, 2834-2842.
91
Literaturverzeichnis
Masuko, K., Mitsui, T., Iwano, K., Yamazaki, C., Okuda, K., Meguro, T., Murayama, N., Inoue, T., Tsuda, F.,
Okamoto, H., et al. (1996). Infection with hepatitis GB virus C in patients on maintenance hemodialysis. N
Engl J Med 334, 1485-1490.
McLinden, J.H., Kaufman, T.M., Xiang, J., Chang, Q., Klinzman, D., Engel, A.M., Hess, G., Schmidt, U.,
Houghton, M., and Stapleton, J.T. (2006). Characterization of an immunodominant antigenic site on GB
virus C glycoprotein E2 that is involved in cell binding. J Virol 80, 12131-12140.
Melikyan, G.B., Markosyan, R.M., Hemmati, H., Delmedico, M.K., Lambert, D.M., and Cohen, F.S. (2000).
Evidence that the transition of HIV-1 gp41 into a six-helix bundle, not the bundle configuration, induces
membrane fusion. J Cell Biol 151, 413-423.
Metzger, D.S., Woody, G.E., and O'Brien, C.P. (2010). Drug treatment as HIV prevention: a research
update. J Acquir Immune Defic Syndr 55 Suppl 1, S32-36.
Meylan, E., Curran, J., Hofmann, K., Moradpour, D., Binder, M., Bartenschlager, R., and Tschopp, J.
(2005). Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.
Nature 437, 1167-1172.
Miller, M.D., Geleziunas, R., Bianchi, E., Lennard, S., Hrin, R., Zhang, H., Lu, M., An, Z., Ingallinella, P.,
Finotto, M., et al. (2005). A human monoclonal antibody neutralizes diverse HIV-1 isolates by binding a
critical gp41 epitope. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 14759-14764.
Moenkemeyer, M., Schmidt, R.E., Wedemeyer, H., Tillmann, H.L., and Heiken, H. (2008). GBV-C
coinfection is negatively correlated to Fas expression and Fas-mediated apoptosis in HIV-1 infected
patients. J Med Virol 80, 1933-1940.
Mohr, E.L., and Stapleton, J.T. (2009). GB virus type C interactions with HIV: the role of envelope
glycoproteins. J Viral Hepat 16, 757-768.
Mohr, E.L., Xiang, J., McLinden, J.H., Kaufman, T.M., Chang, Q., Montefiori, D.C., Klinzman, D., and
Stapleton, J.T. (2010). GB virus type C envelope protein E2 elicits antibodies that react with a cellular
antigen on HIV-1 particles and neutralize diverse HIV-1 isolates. J Immunol 185, 4496-4505.
Montagnier, L., Chermann, J.C., Barre-Sinoussi, F., Klatzmann, D., Wain-Hobson, S., Alizon, M., Clavel, F.,
Brun-Vezinet, F., Vilmer, E., Rouzioux, C., et al. (1984). Lymphadenopathy associated virus and its
etiological role in AIDS. Princess Takamatsu Symp 15, 319-331.
Moore, J.P., Trkola, A., and Dragic, T. (1997). Co-receptors for HIV-1 entry. Curr Opin Immunol 9, 551-562.
Moosmann, P., and Rusconi, S. (1996). Alpha complementation of LacZ in mammalian cells. Nucleic Acids
Res 24, 1171-1172.
Muerhoff, A.S., Leary, T.P., Sathar, M.A., Dawson, G.J., and Desai, S.M. (2005). African origin of GB virus
C determined by phylogenetic analysis of a complete genotype 5 genome from South Africa. J Gen Virol 86,
1729-1735.
Munch, J., Standker, L., Adermann, K., Schulz, A., Schindler, M., Chinnadurai, R., Pohlmann, S., Chaipan,
C., Biet, T., Peters, T., et al. (2007). Discovery and optimization of a natural HIV-1 entry inhibitor targeting
the gp41 fusion peptide. Cell 129, 263-275.
Muster, T., Guinea, R., Trkola, A., Purtscher, M., Klima, A., Steindl, F., Palese, P., and Katinger, H. (1994).
Cross-neutralizing activity against divergent human immunodeficiency virus type 1 isolates induced by the
gp41 sequence ELDKWAS. J Virol 68, 4031-4034.
Nattermann, J., Nischalke, H.D., Kupfer, B., Rockstroh, J., Hess, L., Sauerbruch, T., and Spengler, U.
(2003). Regulation of CC chemokine receptor 5 in hepatitis G virus infection. Aids 17, 1457-1462.
Nunnari, G., Nigro, L., Palermo, F., Attanasio, M., Berger, A., Doerr, H.W., Pomerantz, R.J., and
Cacopardo, B. (2003). Slower progression of HIV-1 infection in persons with GB virus C co-infection
correlates with an intact T-helper 1 cytokine profile. Ann Intern Med 139, 26-30.
92
Literaturverzeichnis
Op De Beeck, A., Cocquerel, L., and Dubuisson, J. (2001). Biogenesis of hepatitis C virus envelope
glycoproteins. J Gen Virol 82, 2589-2595.
Pan, C., Cai, L., Lu, H., Qi, Z., and Jiang, S. (2009). Combinations of the first and next generations of
human immunodeficiency virus (HIV) fusion inhibitors exhibit a highly potent synergistic effect against
enfuvirtide- sensitive and -resistant HIV type 1 strains. J Virol 83, 7862-7872.
Pancera, M., Majeed, S., Ban, Y.E., Chen, L., Huang, C.C., Kong, L., Kwon, Y.D., Stuckey, J., Zhou, T.,
Robinson, J.E., et al. (2010). Structure of HIV-1 gp120 with gp41-interactive region reveals layered
envelope architecture and basis of conformational mobility. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 1166-1171.
Pantophlet, R., and Burton, D.R. (2006). GP120: target for neutralizing HIV-1 antibodies. Annu Rev
Immunol 24, 739-769.
Papkalla, A., Munch, J., Otto, C., and Kirchhoff, F. (2002). Nef enhances human immunodeficiency virus
type 1 infectivity and replication independently of viral coreceptor tropism. J Virol 76, 8455-8459.
Penin, F., Dubuisson, J., Rey, F.A., Moradpour, D., and Pawlotsky, J.M. (2004). Structural biology of
hepatitis C virus. Hepatology 39, 5-19.
Plantier, J.C., Leoz, M., Dickerson, J.E., De Oliveira, F., Cordonnier, F., Lemee, V., Damond, F., Robertson,
D.L., and Simon, F. (2009). A new human immunodeficiency virus derived from gorillas. Nat Med 15, 871872.
Platt, E.J., Wehrly, K., Kuhmann, S.E., Chesebro, B., and Kabat, D. (1998). Effects of CCR5 and CD4 cell
surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1.
J Virol 72, 2855-2864.
Pope, M., and Haase, A.T. (2003). Transmission, acute HIV-1 infection and the quest for strategies to
prevent infection. Nat Med 9, 847-852.
Purtscher, M., Trkola, A., Gruber, G., Buchacher, A., Predl, R., Steindl, F., Tauer, C., Berger, R., Barrett, N.,
Jungbauer, A., et al. (1994). A broadly neutralizing human monoclonal antibody against gp41 of human
immunodeficiency virus type 1. AIDS Res Hum Retroviruses 10, 1651-1658.
Quagliarello, V. (1982). The Acquired Immunodeficiency Syndrome: current status. Yale J Biol Med 55,
443-452.
Reeves, J.D., Gallo, S.A., Ahmad, N., Miamidian, J.L., Harvey, P.E., Sharron, M., Pohlmann, S., Sfakianos,
J.N., Derdeyn, C.A., Blumenthal, R., et al. (2002). Sensitivity of HIV-1 to entry inhibitors correlates with
envelope/coreceptor affinity, receptor density, and fusion kinetics. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 1624916254.
Rousseau, C.M., Nduati, R.W., Richardson, B.A., John-Stewart, G.C., Mbori-Ngacha, D.A., Kreiss, J.K., and
Overbaugh, J. (2004). Association of levels of HIV-1-infected breast milk cells and risk of mother-to-child
transmission. J Infect Dis 190, 1880-1888.
Roy, K.M., Bagg, J., Kennedy, C., Cameron, S., Simmonds, P., Lycett, C., Hunter, I., and Taylor, M. (2003).
Prevalence of GBV-C infection among dental personnel. J Med Virol 70, 150-155.
Rybicki (2003). Viral entry into animal cells. Principles of Molecular Virology; Allan J Cann 3rd edition.
Rydze, R.T., Xiang, J., McLinden, J.H., and Stapleton, J.T. (2012). GB virus type C infection polarizes T-cell
cytokine gene expression toward a Th1 cytokine profile via NS5A protein expression. J Infect Dis 206, 6972.
Salter, R.D., Howell, D.N., and Cresswell, P. (1985). Genes regulating HLA class I antigen expression in TB lymphoblast hybrids. Immunogenetics 21, 235-246.
Sampietro, M., Fracanzani, A.L., Corbetta, N., Amato, M., Mattioli, M., Molteni, V., Fiorelli, G., and Fargion,
S. (1997). High prevalence of hepatitis C virus type 1b in Italian patients with Porphyria cutanea tarda. Ital J
Gastroenterol Hepatol 29, 543-547.
93
Literaturverzeichnis
Sanchez-Martin, M.J., Busquets, M.A., Girona, V., Haro, I., Alsina, M.A., and Pujol, M. (2011a). Effect of
E1(64-81) hepatitis G peptide on the in vitro interaction of HIV-1 fusion peptide with membrane models.
Biochim Biophys Acta 1808, 2178-2188.
Sanchez-Martin, M.J., Hristova, K., Pujol, M., Gomara, M.J., Haro, I., Alsina, M.A., and Busquets, M.A.
(2011b). Analysis of HIV-1 fusion peptide inhibition by synthetic peptides from E1 protein of GB virus C. J
Colloid Interface Sci 360, 124-131.
Sanchez, R., and Sali, A. (2000). Comparative protein structure modeling. Introduction and practical
examples with modeller. Methods Mol Biol 143, 97-129.
Sathar, M., Soni, P., and York, D. (2000). GB virus C/hepatitis G virus (GBV-C/HGV): still looking for a
disease. Int J Exp Pathol 81, 305-322.
Sattentau, Q.J., and Moore, J.P. (1991). Conformational changes induced in the human immunodeficiency
virus envelope glycoprotein by soluble CD4 binding. J Exp Med 174, 407-415.
Scallan, M.F., Clutterbuck, D., Jarvis, L.M., Scott, G.R., and Simmonds, P. (1998). Sexual transmission of
GB virus C/hepatitis G virus. J Med Virol 55, 203-208.
Schaluder, G.G., Dawson, G.J., Simons, J.N., Pilot-Matias, T.J., Gutierrez, R.A., Heynen, C.A., Knigge,
M.F., Kurpiewski, G.S., Buijk, S.L., Leary, T.P., et al. (1995). Molecular and serologic analysis in the
transmission of the GB hepatitis agents. J Med Virol 46, 81-90.
Schneider, U., and Schwenk, H.U. (1977). Characterization of "T" and "non-T" cell lines established from
children with acute lymphoblastic leukemia and non-Hodgkin lymphoma after leukemic transformation.
Haematol Blood Transfus 20, 265-269.
Schols, D., Este, J.A., Henson, G., and De Clercq, E. (1997). Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents,
are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res 35, 147-156.
Schwarze-Zander, C., Neibecker, M., Othman, S., Tural, C., Clotet, B., Blackard, J.T., Kupfer, B.,
Luechters, G., Chung, R.T., Rockstroh, J.K., et al. (2010). GB virus C coinfection in advanced HIV type-1
disease is associated with low CCR5 and CXCR4 surface expression on CD4(+) T-cells. Antivir Ther 15,
745-752.
Sen, J., Jacobs, A., and Caffrey, M. (2008). Role of the HIV gp120 conserved domain 5 in processing and
viral entry. Biochemistry 47, 7788-7795.
Sen, J., Yan, T., Wang, J., Rong, L., Tao, L., and Caffrey, M. (2010). Alanine scanning mutagenesis of HIV1 gp41 heptad repeat 1: insight into the gp120-gp41 interaction. Biochemistry 49, 5057-5065.
Seth, R.B., Sun, L., and Chen, Z.J. (2006). Antiviral innate immunity pathways. Cell Res 16, 141-147.
Seth, R.B., Sun, L., Ea, C.K., and Chen, Z.J. (2005). Identification and characterization of MAVS, a
mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell 122, 669-682.
Sherman, M.P., and Greene, W.C. (2002). Slipping through the door: HIV entry into the nucleus. Microbes
Infect 4, 67-73.
Shiraishi, M., Aramaki, Y., Seto, M., Imoto, H., Nishikawa, Y., Kanzaki, N., Okamoto, M., Sawada, H.,
Nishimura, O., Baba, M., et al. (2000). Discovery of novel, potent, and selective small-molecule CCR5
antagonists as anti-HIV-1 agents: synthesis and biological evaluation of anilide derivatives with a
quaternary ammonium moiety. J Med Chem 43, 2049-2063.
Simons, J.N., Desai, S.M., and Mushahwar, I.K. (2000). The GB viruses. Curr Top Microbiol Immunol 242,
341-375.
Simons, J.N., Pilot-Matias, T.J., Leary, T.P., Dawson, G.J., Desai, S.M., Schlauder, G.G., Muerhoff, A.S.,
Erker, J.C., Buijk, S.L., Chalmers, M.L., et al. (1995). Identification of two flavivirus-like genomes in the GB
hepatitis agent. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 3401-3405.
94
Literaturverzeichnis
Stapleton, J.T., Foung, S., Muerhoff, A.S., Bukh, J., and Simmonds, P. (2011). The GB viruses: a review
and proposed classification of GBV-A, GBV-C (HGV), and GBV-D in genus Pegivirus within the family
Flaviviridae. J Gen Virol 92, 233-246.
Stark, K., Doering, C.D., Bienzle, U., Pauli, G., Hamouda, O., Engel, A.M., and Schreier, E. (1999). Risk
and clearance of GB virus C/hepatitis G virus infection in homosexual men: A longitudinal study. J Med Virol
59, 303-306.
Steven, A.C., and Spear, P.G. (2006). Biochemistry. Viral glycoproteins and an evolutionary conundrum.
Science 313, 177-178.
Stiegler, G., Kunert, R., Purtscher, M., Wolbank, S., Voglauer, R., Steindl, F., and Katinger, H. (2001). A
potent cross-clade neutralizing human monoclonal antibody against a novel epitope on gp41 of human
immunodeficiency virus type 1. AIDS Res Hum Retroviruses 17, 1757-1765.
Stoddart, C.A., Nault, G., Galkina, S.A., Thibaudeau, K., Bakis, P., Bousquet-Gagnon, N., Robitaille, M.,
Bellomo, M., Paradis, V., Liscourt, P., et al. (2008). Albumin-conjugated C34 peptide HIV-1 fusion inhibitor:
equipotent to C34 and T-20 in vitro with sustained activity in SCID-hu Thy/Liv mice. J Biol Chem 283,
34045-34052.
Supapol, W.B., Remis, R.S., Raboud, J., Millson, M., Tappero, J., Kaul, R., Kulkarni, P., McConnell, M.S.,
Mock, P.A., Culnane, M., et al. (2008). Reduced mother-to-child transmission of HIV associated with infant
but not maternal GB virus C infection. J Infect Dis 197, 1369-1377.
Tan, D., Matsumoto, A., Conry-Cantilena, C., Melpolder, J.C., Shih, J.W., Leuther, M., Hess, G., Gibble,
J.W., Ness, P.M., and Alter, H.J. (1999). Analysis of hepatitis G virus (HGV) RNA, antibody to HGV
envelope protein, and risk factors for blood donors coinfected with HGV and hepatitis C virus. J Infect Dis
179, 1055-1061.
Tan, K., Liu, J., Wang, J., Shen, S., and Lu, M. (1997). Atomic structure of a thermostable subdomain of
HIV-1 gp41. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 12303-12308.
Thomas, D.L., Vlahov, D., Alter, H.J., Hunt, J.C., Marshall, R., Astemborski, J., and Nelson, K.E. (1998).
Association of antibody to GB virus C (hepatitis G virus) with viral clearance and protection from reinfection.
J Infect Dis 177, 539-542.
Tillmann, H.L., Heiken, H., Knapik-Botor, A., Heringlake, S., Ockenga, J., Wilber, J.C., Goergen, B.,
Detmer, J., McMorrow, M., Stoll, M., et al. (2001). Infection with GB virus C and reduced mortality among
HIV-infected patients. N Engl J Med 345, 715-724.
Tilton, J.C., and Doms, R.W. (2010). Entry inhibitors in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res 85,
91-100.
Toyoda, H., Fukuda, Y., Hayakawa, T., Takamatsu, J., and Saito, H. (1998). Effect of GB virus C/hepatitis G
virus coinfection on the course of HIV infection in hemophilia patients in Japan. J Acquir Immune Defic
Syndr Hum Retrovirol 17, 209-213.
Tucker, T.J., and Smuts, H.E. (2000). GBV-C/HGV genotypes: proposed nomenclature for genotypes 1-5. J
Med Virol 62, 82-83.
Ullmann, A., Jacob, F., and Monod, J. (1967). Characterization by in vitro complementation of a peptide
corresponding to an operator-proximal segment of the beta-galactosidase structural gene of Escherichia
coli. J Mol Biol 24, 339-343.
Vahidnia, F., Petersen, M., Rutherford, G., Busch, M., Assmann, S., Stapleton, J.T., and Custer, B. (2012a).
Transmission of GB virus type C via transfusion in a cohort of HIV-infected patients. J Infect Dis 205, 14361442.
Vahidnia, F., Petersen, M., Stapleton, J.T., Rutherford, G.W., Busch, M., and Custer, B. (2012b).
Acquisition of GB virus type C and lower mortality in patients with advanced HIV disease. Clin Infect Dis 55,
1012-1019.
95
Literaturverzeichnis
Van der Bij, A.K., Kloosterboer, N., Prins, M., Boeser-Nunnink, B., Geskus, R.B., Lange, J.M., Coutinho,
R.A., and Schuitemaker, H. (2005). GB virus C coinfection and HIV-1 disease progression: The Amsterdam
Cohort Study. J Infect Dis 191, 678-685.
Wang, J., Sen, J., Rong, L., and Caffrey, M. (2008). Role of the HIV gp120 conserved domain 1 in
processing and viral entry. J Biol Chem 283, 32644-32649.
Weiss, A., Wiskocil, R.L., and Stobo, J.D. (1984). The role of T3 surface molecules in the activation of
human T cells: a two-stimulus requirement for IL 2 production reflects events occurring at a pre-translational
level. J Immunol 133, 123-128.
Weissenhorn, W., Dessen, A., Harrison, S.C., Skehel, J.J., and Wiley, D.C. (1997). Atomic structure of the
ectodomain from HIV-1 gp41. Nature 387, 426-430.
Wild, C.T., Shugars, D.C., Greenwell, T.K., McDanal, C.B., and Matthews, T.J. (1994). Peptides
corresponding to a predictive alpha-helical domain of human immunodeficiency virus type 1 gp41 are potent
inhibitors of virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 9770-9774.
Williams, C.F., Klinzman, D., Yamashita, T.E., Xiang, J., Polgreen, P.M., Rinaldo, C., Liu, C., Phair, J.,
Margolick, J.B., Zdunek, D., et al. (2004). Persistent GB virus C infection and survival in HIV-infected men.
N Engl J Med 350, 981-990.
Wyatt, R., and Sodroski, J. (1998). The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and
immunogens. Science 280, 1884-1888.
Xiang, J., Daniels, K.J., Soll, D.R., Schmidt, W.N., Labrecque, D.R., and Stapleton, J.T. (1999).
Visualization and characterization of GB virus-C particles: evidence for a nucleocapsid. J Viral Hepat 6
Suppl 1, 16-22.
Xiang, J., George, S.L., Wunschmann, S., Chang, Q., Klinzman, D., and Stapleton, J.T. (2004). Inhibition of
HIV-1 replication by GB virus C infection through increases in RANTES, MIP-1alpha, MIP-1beta, and SDF1. Lancet 363, 2040-2046.
Xiang, J., Klinzman, D., McLinden, J., Schmidt, W.N., LaBrecque, D.R., Gish, R., and Stapleton, J.T.
(1998). Characterization of hepatitis G virus (GB-C virus) particles: evidence for a nucleocapsid and
expression of sequences upstream of the E1 protein. J Virol 72, 2738-2744.
Xiang, J., McLinden, J.H., Chang, Q., Kaufman, T.M., and Stapleton, J.T. (2006). An 85-aa segment of the
GB virus type C NS5A phosphoprotein inhibits HIV-1 replication in CD4+ Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci
U S A 103, 15570-15575.
Xiang, J., McLinden, J.H., Kaufman, T.M., Mohr, E.L., Bhattarai, N., Chang, Q., and Stapleton, J.T. (2012).
Characterization of a peptide domain within the GB virus C envelope glycoprotein (E2) that inhibits HIV
replication. Virology 430, 53-62.
Xiang, J., McLinden, J.H., Rydze, R.A., Chang, Q., Kaufman, T.M., Klinzman, D., and Stapleton, J.T.
(2009). Viruses within the Flaviviridae decrease CD4 expression and inhibit HIV replication in human CD4+
cells. J Immunol 183, 7860-7869.
Xiang, J., Wunschmann, S., Diekema, D.J., Klinzman, D., Patrick, K.D., George, S.L., and Stapleton, J.T.
(2001). Effect of coinfection with GB virus C on survival among patients with HIV infection. N Engl J Med
345, 707-714.
Xiang, J., Wunschmann, S., Schmidt, W., Shao, J., and Stapleton, J.T. (2000). Full-length GB virus C
(Hepatitis G virus) RNA transcripts are infectious in primary CD4-positive T cells. J Virol 74, 9125-9133.
Xie, D., Yao, C., Wang, L., Min, W., Xu, J., Xiao, J., Huang, M., Chen, B., Liu, B., Li, X., et al. (2010). An
albumin-conjugated peptide exhibits potent anti-HIV activity and long in vivo half-life. Antimicrob Agents
Chemother 54, 191-196.
Xu, J.Y., Gorny, M.K., Palker, T., Karwowska, S., and Zolla-Pazner, S. (1991). Epitope mapping of two
immunodominant domains of gp41, the transmembrane protein of human immunodeficiency virus type 1,
using ten human monoclonal antibodies. J Virol 65, 4832-4838.
96
Literaturverzeichnis
Yeo, A.E., Matsumoto, A., Hisada, M., Shih, J.W., Alter, H.J., and Goedert, J.J. (2000). Effect of hepatitis G
virus infection on progression of HIV infection in patients with hemophilia. Multicenter Hemophilia Cohort
Study. Ann Intern Med 132, 959-963.
Zhang, W., Chaloner, K., Tillmann, H.L., Williams, C.F., and Stapleton, J.T. (2006). Effect of early and late
GB virus C viraemia on survival of HIV-infected individuals: a meta-analysis. HIV Med 7, 173-180.
Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Jr., Chertova, E., Lifson, J.D., Grise, H., Ofek, G.A., Taylor, K.A., and Roux, K.H.
(2006). Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes. Nature 441, 847-852.
Zhu, Q.Y., Scarborough, A., Polsky, B., and Chou, T.C. (1996). Drug combinations and effect parameters of
zidovudine, stavudine, and nevirapine in standardized drug-sensitive and resistant HIV type 1 strains. AIDS
Res Hum Retroviruses 12, 507-517.
Zignego, A.L., Ferri, C., Giannini, C., La Civita, L., Careccia, G., Longombardo, G., Bellesi, G., Caracciolo,
F., Thiers, V., and Gentilini, P. (1997). Hepatitis C virus infection in mixed cryoglobulinemia and B-cell nonHodgkin's lymphoma: evidence for a pathogenetic role. Arch Virol 142, 545-555.
Zuckerman, A.J. (1996). Alphabet of hepatitis viruses. Lancet 347, 558-559.
97
Publikationen
11. Publikationen
Originalarbeiten:
Eissmann, K., Mueller, S., Sticht, H., Jung, S. Zou, P., Jiang, S., Gross, A., Eichler, J., Fleckenstein,
B., and Reil, H. (2012). HIV-1 Fusion is Blocked through Binding of GB Virus C E2-derived Peptides to
the HIV-1 gp41 Disulfide Loop. PLoS One, 8(1):e54452.
Koedel, Y., Eissmann, K., Wend, H., Fleckenstein, B., and Reil, H. (2011). Peptides derived from a
distinct region of GB virus C glycoprotein E2 mediate strain-specific HIV-1 entry inhibition. J Virol 85,
7037-7047.
Abstracts:
2013:
Eißmann K., Müller, S., Sticht, H., Zou, P., Jiang, S., Eichler, J., Groß, A., Jung, S., Ködel, Y.,
Fleckenstein, B., & Reil, H. New target for HIV-1 fusion inhibition- structural mimicry between the Ntermini of HIV-1 gp120 and GB Virus C E2 enables E2 to compete with gp120 for gp41 binding. 23rd
Annual Meeting of the "Gesellschaft für Virologie", March 06-09, 2013, Kiel, Germany
2012:
Eißmann, K., Müller, S., Sticht, H., Zou, P., Jiang, S., Eichler, J., Groß, A., Jung, S., Ködel, Y.,
Fleckenstein B., & Reil H. GB Virus C E2 N-terminus interacts with the HIV-1 gp41 disulfide loop
th
region, a new HIV-1 entry inhibition mechanism, 19 International Symposium on Hepatitis C and
related viruses, October 05-09, 2012, Venice, Italy.
Eißmann K., Müller S., Ködel Y., Zhou P., Jiang S., Fleckenstein B, & Reil, H.,. GBV-C E2-derived
th
peptides act as HIV fusion inhibitors by blocking HIV-1 gp41 functions. 22 Annual Meeting of the
"Gesellschaft für Virologie", March 14-17, 2012, Essen, Germany.
Eißmann, K., Müller, S., Jung, S., Ködel, Y., Zou, P., Jiang, S., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2012).
Blocking the 6-helix-bundle formation of HIV-1 gp41 by GBV-C E2-derived peptides mediates
th
inhibition of HIV-1 entry. 19 CROI, Seattle, USA.
Jung, S., Tenckhoff, S., Müller, S., Donhauser, N., Eißmann, K., Schuster, T., Tillmann, H., Helm, M.,
Fleckenstein, B., & Reil, H. (2012). Relationship between E2 point mutations and the HIV-1 inhibitory
th
phenotype of clinical GBV-C isolates. 19 CROI, Seattle, USA.
2011:
Eißmann, K., Ködel, Y., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2011). GBV-C E2 peptides can act as new HIV-1
st
fusion inhibitors. 21 Annual Meeting of the Society for Virology (GfV), Freiburg.
Eißmann, K., Ködel, Y., Wend, H., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2011). HIV fusion inhibitors derived
th
from a flaviviridae glycoprotein. 18 International Symposium on Hepatitis C Virus and Related
Viruses, Seattle, USA.
Jung, S., Wend, H., Donhauser, N., Eißmann, K., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2011). Binding of the
anti-gp41 antibodies 4E10 and 2F5 to recombinant GBV-C E2 protein emphasizes the possibility to
th
elicit broad HIV-1 neutralizing antibodies by heterologous glycoproteins. 18 CROI, Boston, USA.
2010:
rd
Eißmann, K., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2010). GBV-C E2 protein inhibits HIV-1 fusion events. 3
International Symposium on Regulators of Adaptive Immunity, Erlangen.
98
Publikationen
Eißmann, K., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2010). Establishment of several fusion assays for testing
th
HIV-1 inhibitory ability. 4 European Congress of Virology, Cernobbio, Lake Como.
Jung, S., Eißmann, K., Wend, H., Donhauser, N., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2010). Cross reactive
th
GBV-C anti-E2 antibodies broadly neutralize HIV via targeting of viral membrane lipids. 4 European
Congress of Virology, Cernobbio, Lake Como.
Reil, H., Jung, S., Wend, H., Eißmann, K., Donhauser, N., & Fleckenstein, B. (2010). Broad HIV
neutralizing antibodies can be elicited by the GBV-C glycoprotein E2 and neutralize HIV via a 2F5-like
th
mechanism. 17 CROI, San Francisco, USA.
2009:
Ködel, Y., Eißmann, K., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2009). A mechanism of viral interference –
Identification of HIV-inhibitory peptides derived from GBV-C surface protein E2. IZKF DoktorandenWorkshop, Erlangen.
Jung, S., Wend, H., Hänel, K., Donhauser, N., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2009). Mimicry between
th
GB Virus C and HIV: Antibodies directed against the GBV-C E2 neutralize HIV. 16 International
Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses, Nice, France.
Ködel, Y., Jung, S., Hänel, K., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2009). Mechanism of the GBV-C E2
glycoprotein mediated HIV inhibition. Internationales IZKF-Symposium, Kloster Banz, Bad Staffelstein.
Hänel, K., Jung, S., Wend, H., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2009). Distinct viral interference
mechanisms by different GBV-C proteins on HIV-1 replication. Deutsch-ÖsterreichischSchweizerischer AIDS-Kongress (SÖDAK), St. Gallen, Schweiz.
Hänel, K., Jung, S., Wend, H., Ködel, Y., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2009). Localization of HIV
th
replication steps influenced by different GB Virus C proteins. 19 Annual Meeting of the Society for
Virology (GfV), Leipzig.
Hänel, K., Jung, S., Wend, H., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2009). Localization of HIV replication steps
th
influenced by different GB Virus C proteins. 16 CROI, Montreal, Canada.
2008:
Jung, S., Hänel, K., Eichenmüller, M., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2008). GBV-C E2 glycoprotein
impairs HIV replication in vitro soon after membrane fusion but prior reverse transcription. XVII
International AIDS Conference, Mexico City, Mexico.
Hänel, K., Jung, S., Wend, H., Stapleton, J., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2008). Characterization of
nd
HIV-1 inhibitory mechanisms mediated by proteins of GBV-C. 2 International Symposium on
Regulators of Adaptive Immunity, Erlangen.
Hänel, K., Jung, S., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2008). E2, a novel and potent HIV entry inhibitor
th
derived from the non-pathogenic GBV-C – Characterization of the detailed mechanism. 15
Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI), Boston, USA.
2007:
Hänel, K., Jung, S., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2007). E2, a novel and potent HIV entry inhibitor
rd
derived from the non-pathogenic GBV-C – Characterization of the detailed mechanism. 3 European
Congress of Virology, Nürnberg.
Jung, S., Hänel, K., Fleckenstein, B., & Reil, H. (2007) HIV entry inhibition by clinical GBV-C isolates
rd
– influence of the envelope protein E2. 3 European Congress of Virology, Nürnberg
99
Danksagung
12. Danksagung
Mit der Fertigstellung dieser Dissertationsschrift ist es auch an der Zeit denjenigen zu
danken, die mich begleitet und unterstützt haben:
Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Dr. Heide Reil für das überaus spannende Projekt, die
ausgezeichnete Betreuung dieser Doktorarbeit, ihre Geduld und ihr zeitliches Engagement.
Herrn Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein danke ich für die Möglichkeit diese Promotion am
Institut für Klinische und Molekulare Virologie anzufertigen sowie seine fachliche
Unterstützung und Betreuung. Außerdem gilt mein Dank Frau Prof. Dr. Jutta Eichler und
Herrn Prof. Dr. Heinrich Sticht für ihren wissenschaftlichen Rat und die freundliche
Unterstützung. Des Weiteren danke ich Herrn Prof. Dr. Thomas Harrer für die fachlichen
Diskussionen als Mentor während der Zeit im Graduiertenkolleg 1071. Weiterhin möchte ich
Herrn Prof. Dr. Robert Slany für die Bereitschaft zur Begutachtung dieser Arbeit danken.
Hinsichtlich der sehr angenehmen und abwechslungsreichen Zeit im Graduiertenkolleg 1071
gilt mein Dank Frau Privatdozentin Dr. Brigitte Biesinger.
Ich danke dem Graduiertenkolleg 1071 sowie dem Büro für Gender und Diversity und
der Graduiertenschule der FAU Erlangen-Nürnberg für die finanzielle Unterstützung ohne
die ein Abschluss der Promotion nicht möglich gewesen wäre.
Bei meinen Kollegen am Institut und meinen Mitstreitern im Graduiertenkolleg bedanke ich
mich für die sehr angenehme Zeit mit ihnen und die Unterstützung, die mir stets von ihnen
gegeben wurde. Hierbei möchte ich mich besonders bei Holger Wend, Sebastian Müller
und Yvonne Ködel für die gute, wenn auch nicht immer einfache, Zusammenarbeit und
Mithilfe bedanken. Weiterhin bedanke ich mich bei den Mitarbeitern der Diagnostik für die
angenehme Arbeitsatmosphäre und die vielen p24-ELISA. Ein Dankeschön geht auch an die
Mitarbeiter
anderer
Arbeitsgruppen
besonders
an
Stefan
Sörgel
für
die
vielen
Berechnungen, seinen fachlichen Beistand, sorgfältiges Korrekturlesen und vieles anderes,
sowie natürlich an Kirsten Fraedrich und Friedrich Hahn für die tatkräftige Unterstützung
im Laboralltag und den Spaß auch außerhalb des Instituts.
Ein besonders großes Dankeschön geht an meine Familie und Freunde für die großartige
Unterstützung, den bedingungslosen Rückhalt und die manchmal erforderliche Ablenkung.
Ich danke euch für euer Vertrauen in mich und meine Fähigkeiten!
Das größte Dankeschön geht aber an meinen Mann André! Danke, dass du immer ein
offenes Ohr für meine kleinen und großen Probleme hattest! Danke, für dein Vertrauen, dein
Glaube an mich und deine bedingungslose Unterstützung! Danke, dass du immer da warst!
Natürlich möchte ich an dieser Stelle auch meine kleine Nele nicht vergessen. Du hast im
letzten Jahr immer für die nötige Abwechslung, gute Laune und ganz viel Freude gesorgt!
Euch beiden, meiner kleinen Familie, möchte ich diese Arbeit widmen!
100