DNA diagnostics (simple trait) - Ruhr
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Mukoviszidose Cystische Fibrose (CF) - Einführung, Pathogenese - Klinik - Genetik, Mutationen - Wiederholungsrisiko - Gentherapie CF Inzidenz 1/3300 Lebendgeburten Frequenz abhängig von Ethnizität Diagnose >70% im 1. Lebensjahr 90% bis zum 8. Lebensjahr Mutation CFTR-Gen (CF transmembrane conductance regulator) Funktion CFTR H2O Na+ Cl- 1. apikaler Cl-Kanal 2. reguliert andere apikale Kanäle normal CF-Zelle bronchialer CFTR et al. Adenosin ORCC P2Y2 Adenosin KCNJ1 CFTR Na+K+2Cl- ENAC Na/K-ATPase CFTR – Proteinexpression Bronchien Pankreasgang Schweißdrüsen Intestinum Gallenwege Vas deferens CF-Symptome Lunge 52% Gedeihstörung / Ernährungspr. 43% Mekonium-Ileus 21% CBAVD (congenitale bilaterale ♂♂ Aplasie vas deferens, Azoospermie) [Familienanamnese 17%] Nasen-Sinus: CFSymtome Sinusitis Polypen Lunge Atemwegs-Obstr. Bronchiektasen Pneumothorax Leber Gallengangsstau Pankreas Enzymdefizienz Diabetes Intestinum Mekoniumileus DIOS Rektumprolaps Infertilität CBAVD Haut [Cl]- im Schweiß ↓ CF - Diagnose Familienanamnese Schweißtest: [Cl-] 5% falsch negativ nasale Potentialdifferenz Genotypisierung CF - Diagnose pränatal Ultraschall: echodichter Darm, Mekonium-Peritonitis Genotypisierung Chorionzottenbiopsie 10.-12. SSW Amniozentese 13.-16. SSW Vererbungsmodus CF ? A autosomal dominant B autosomal rezessiv C X-chromosomal D mitochondriale Vererbung E multifaktoriell Definition Allele - verschiedene Variationen eines Gens/ DNA-Sequenz an einem definierten Locus der homologen Chromosomen Bevölkerung: bis zu mehrere 100 Allele ein Individuum: normalerweise 2 Allele Definition Compound-Heterozygotie = kombinierte Het. an einem Genort (Locus) bei einer betroffenen Person zwei unterschiedlich mutierte Allele CFTR-Gen, -Protein 5‘ 3‘ Exon Intron N C Glykosylierung Zellmembran Cytoplasma Transmembran Segmente NukleotidBindestelle R Domäne Cl- Mutationsklassen CFTR-Gen Cl- Cl- Cl- Wt CFTR Protein I II III Cl- Cl- Cl- IV V VI Ø Protein Ø Transport Ø Funktion ↓ Funktion G542X … ΔF508 … G551D … R117H … ↓ Protein ↓ ProteinStabilität 3272-26A>G ΔF508 … … Ø ProteinFaltung Fehlregulation Ø Protein RNA ↓↓ Leitungsdefekt Umsatz ↑↑ Protein ↓↓ http://cftr2.org/mutation.php?view=general&mutation_id=23 Mutationen führen zum Verlust der CFTRProteinproduktion. Welche der Aussagen ist am wenigsten wahrscheinlich ? A B C D E Missense-Mutationen Nonsense-Mutationen Frame shift-Mutationen Deletionen von Basen Insertionen von Basen Mutationen M stumme M Ø Aminosäure-Austausch DNA-Polymorphismus ? konservative M Ø Funktionsänderung im Protein frame shift M geänderter Leserahmen nonsense M vorzeitiger Translationsstop CF-Inzidenz Finland 1:15000 Canada 1:900 1:2500 USA Eur. 1:2500 African 1:15000 Latin 1:10000 Native 1:10500 Germany 1:3300 Ireland 1:1400 Portugal 1:6000 Australia 1:2900 New Zealand 1:3200 Detektionsraten von CFTR-M Anteil F508-M Population Belgien Bulgarien Kreta Czech. Republik Dänemark Estland Finnland D Niedersachsen D Rheinland-Pfal GR Pelopones/Attica GR Thesalia/Macedonien Ungarn I Friaul I Umbrien Irland Republik Nordirland ΔF508 Population (%) 75 65 46 70 87 64 46 80 52 57 67 44 37 68 73 62 Israel Libanon Niederlande Norwegen Polen P Faro/Beja P Lissabon Russland Slovakei SP Extremadura SP Baskenland Schweden Schweiz Tunesien Türkei Ukraine ΔF508 (%) 32 35 74 67 66 68 48 62 56 46 71 73 43 18 27 54 CFTR-M CFTR-M >2000 M bekannt 100 M bei D-stämmigen Betroffenen D-Population: 7 M mit Frequenz 1% > 50% Betroffene in D F508 homozygot DNA-Sequenzanalyse CF M database (2016) M-Typ n missense 795 40 frame shift Spleiß nonsense 313 228 167 16 11 8 40 52 15 2 3 1 Sequenzvariation 269 13 Unbekannt 128 6 in frame in/del große in/del Promotor Frequenz % M-Analysen compound heterozygot für missense M und 35ΔG Wildtyp mutiert ...GAGCCAGATCT... C→T ...ACACCCCCCAGGATC... 6xC→5xC homozygot 35ΔG Wildtyp mutiert ...ACACCCCCCAGGATC... 6xC→5xC Genotyp/Phänotyp Korrelation F508-homozygot Pankreasinsuffizienz Ø Genotyp/Phänotyp Korrelation bei Lungenbeteiligung CF-Symptomatik: Variabilität durch genetic modifiers Lungen, Nebenhöhlen Infektion, Entzündung, Obstruktion Schweißdrüsen ↑ [Cl]-Konzentration im Schweiß Leber Zirrhose Pankreas exokrine Dysfunktion, Diabetes, Pankreatitis Intestinum Mekonium-Ileus distale intestinale Obstruktion Fortpflanzung obstruktive Infertilität ♂ Atemwegsobstruktion TGFB1, MBL2, EHF, APIP, Chr20q13.2, SLC6A14, SLC9A3 P. aeruginosa-Infektion MBL2, DCTN4, SLC6A14 exokrine Insuffizienz Diabetes-Risiko, -Beginn TCF7L2, CDKAL1, CDKN2A/B, IGF2BP2 SLC26A9 intest. Obstruktionsrisiko MSRA, SLC6A14, SLC26A9, SLC9A3 BMI Chr1036.1, Chr5q14 CFTR-Genotyp genetic modifiers Umwelt-, Zufallsfaktoren DNA-Test sequenzielles Vorgehen: erst häufige Mutationen testen (Kit) dann komplette Sequenzierung ( ) noch teuer klinisches Bild berücksichtigen ! DNA-Diagnostik I Interpretation des DNA-Tests - Mutation oder Polymorphie? II Trias: Beratung DNA-Test Beratung - DD - pränatal (PID) Gendiagnostik-Gesetz GenDG I Arztvorbehalt / prädikt. FA Humangenetik II Einwilligung nach suffizienter Aufklärung III Ergebnis nur an Ratsuchenden IV keine pränatale Untersuchung auf spät manifestierende Erkrankungen ad GendiagnostikGesetz (GenDG) - Aufklärung Wiederholungsrisiko heterozygot heterozygot ? Anlageträger gesund 1/4 Anlageträger Anlageträger 2/4 krank 1/4 Erkrankungsrisiko: 1/4 Wiederholungsrisiko ? Die 20-jähr. klinisch unauffällige Schwester zweier Geschwister mit CF ist schwanger und fragt nach der Wahrscheinlichkeit, dass das Kind CF-betroffen sein wird. Die Familienanamnese des Kindsvaters ist leer hinsichtlich CF. Berechnen Sie die Wahrscheinlichkeit unter der Voraussetzung, dass 1 von 10 000 Neugeborenen von CF betroffen ist. Wiederholungsrisiko heterozygot heterozygot ? Erkrankungsrisiko: 1/4 Risiko für Anlageträgerschaft: 2/3 Anlageträger Anlageträger klinisch gesund 1/3 Anlageträger 2/3 unauffällig Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Populationsgleichgewicht: Verteilung in den Allel- Gameten der Eltern A (p) a (q) A (p) AA (p2) Aa (pq) a (q) Aa (pq) aa (q2) häufigkeiten ändert sich nicht von einer Generation zur nächsten Genort mit 2 Allelen: p2 q2 + 2pq + = 1 [AA] [Aa] [aa] Normalbevölkerung p2 + 2pq + q2 = 1 [AA] [Aa] [aa] Homozygoten-Frequenz seltene Erkrankung Heterozygoten-Frequenz 1:10 000 (q2) q = 1:100 p=1 2pq = 2:100 = 1:50 Wiederholungsrisiko heterozygot heterozygot ? Risiko für Anlage- Heterozygotenfrequenz 1/50 trägerschaft: 2/3 Erkrankungsrisiko beim Kind: 2/3 x 1/50 x 1/4 = 1/300 (0,33%) Erkrankungsrisiko: 1/4 Präimplantationsdiagnostik (PID) Blastomerendiagnostik „Alternative“: Polkörperdiagnostik Polkörper (PK) Eisprung 1. PK Fertilisation 2. PK 22h nach Spermien-Eindringen Polkörperchen enthält nur Anteile des mütterlichen Genoms Therapie CF Lunge physikalisch, antibiotisch, Transplantation Pankreas Substitution, Diät, Vitamine Leber symptomatisch CBAVD in vitro-Fertilisation CFTR-Gen Alter (Jahre) CFTR-Protein 1. Schwangerschaft Schweißtest NaCl im Schweiß Erstbeschreibung CF Therapie CF Potentiator: Ivacaftor Corrector: Lumacaftor ProduktionsCorrector Ataluren ethische Aspekte CF-Genetik DNA-Test erfordert kompetente humangenetische Beratung Screening problematisch Gen-Therapie: „Prinzip Hoffnung“ CF - Gentherapie Gentherapie M.C.: Gentransfer mit rekombinanter DNA; Ø Erlaubnis; bestraft CF: Adenovirustransfer 1. klinische Studie 1. erfolgreiche Gentherapie: X-SCID China: Gendicine head + neck cancer Adrenoleukodystrophie Leber‘ Amaurosis Hämophilie 2014: Retinitis pigmentosa 1980 1988 1992 1999 2000 2002 2003 2007 2008 2010 2011 2012 2014 2015 Gentransfer in Tumor + ADA-SCID Behandlung JG: OrnitintranscarbAmylase-Defizienz Adenoviren X-SCID Therapie: Lymphproliferat. Arthritis-Phase1/2 klin. Gentherapievers. ? ß-Thalasämie Wiskott-Aldrich Syndrom >2000 klinische Studien in >35 Ländern cursed or inching towards credibility? 2012 in EU: LPLDefizienz CRISPR hum. triploide Embryonen Gentherapie – wofür ? Stufenmodell zur Bewertung gentherapeutischer Eingriffe I Substitutionstherapie mit gentechnisch erzeugten Proteinen II Somatische Gentherapie für genetische Erkrankungen III Somat. Gentherapie für genet. Erkrankungen Ungeborener IV Keimbahn-Therapie für Erbfehler V Keimbahn-Therapie zur Krankheitsprävention (Infektionen) VI Keimbahn-“Therapie” für Risikofaktoren (Sterilität) VII Keimbahn-“Therapie” für Intelligenz, Aggressivität etc. Ethische Probleme/Streitfragen Gentherapie · Biosicherheit (Viren, public health, Datensicherheit…) · in utero-Gentransfer (größere Unsicherheiten, Gentransfer in die Keimbahn?) · Forschung für Keimbahn-Gentransfer regulieren · Tierexperimente (bei Keimbahn-Gentransfer) regulieren Erwachsene CF (US) CF Lebenserwartung: bessere Behandlung, längeres Überleben Erwachsene CF (US) Erwachsene CF (US) CF Lebenserwartung: bessere Behandlung, längeres Überleben Erwachsene CF (US) 70 60 50 Diagnose bei Neugeborenscreening (%) 40 Alter bei Diagnose (Jahre) 30 Erwachsene ≥18 Jahre (%) 20 mittleres Todesalter (Jahre) 10 0 1999 2004 2009 2013 2014
