Biochemie_Breitling_DNA

Vertretung durch Frank Breitling (Institut für
Mikrostrukturtechnik (IMT), Campus Nord;
www.imt.kit.edu/529.php)
Vorlesungsdoppelstunde am 25.06.2015
Basis der Vorlesung: Stryer, Biochemie, 6. Auflage, Kapitel 4
DNA, RNA und der Fluss der genetischen Information
Wie funktioniert das mit der Vererbung?
Jean-Baptiste de Lamarck:
Begründer der Evolutionstheorie:
gerichtete Höherentwicklung von
Organismen, durch die die
Artenvielfalt entsteht; dabei
werden erworbene Eigenschaften
vererbt.
Charles Darwin: Gerichtete
Höherentwicklung von
Organismen, durch die die
Artenvielfalt entsteht; dabei
werden aus zufälligen Mutationen
diejenigen ausgewählt, die
verbesserte Eigenschaften
vermitteln (natürliche Selektion).
Träger der Erbinformation: Ist die Deoxyribonukleinsäure (DNA). Heute
wissen wir, dass Lamarck zu einem kleineren Teil auch Recht hatte, denn
auch erworbene Informationen können weiter gegeben werden (Epigenetik).
Wie wird die Erbinformation umgesetzt?
Erbinformation: Gene, in dem
Speichermedium DNA
(„Doppelhelix“, Watson & Crick).
Transkription: Kopieren und
vervielfältigen der einzelnen
Gene in messenger RNA
(mRNA; „RNA-Polymerasen“).
Translation: Übersetzen und
vervielfältigen der einzelnen
Geniformationen in Proteine
durch eine Matrizen-gesteuerte
(= mRNA) nanoskalige
Werkzeugmaschine (das
„Ribosom“).
DNA
Transkription
RNA
Translation
Protein
Struktur von Nucleinsäuren
Nukleinsäuren sind lineare, nicht verzweigte Polymere, die in sich
gerichtet sind.
Ribose und Desoxyribose
Die Atome in den Zuckern sind
nummeriert und zur Unterscheidung
von den Atomen der Basen mit
Strichen versehen
Wieso wird die Energie-reiche
Phosphodiesterbindung des DNARückgrats nicht sofort hydrolisiert
(siehe nächste Folie)?
Das Rückgrat von DNA und RNA
Das Rückgrat beider Nucleinsäuren wird durch 3'→5‚ Phosphodiesterbindungen gebildet. Eine Zuckereinheit ist rot hervorgehoben, eine
Phosphatgruppe blau.
Das Rückgrat von DNA und RNA
Die negativen Ladungen stoßen Nucleophile wie z.B. ein Hydoxidion ab. Das
Fehlen der 2‘-OH-Gruppe bei DNA erhöht deren Resistenz gegen Hydrolyse
noch weiter. Das ist sehr wichtig für die Stabilität der Erbinformation!
Purine und Pyrimidine
Die Basenatome werden ohne Striche durchnummeriert. In RNA kommt Uracil
anstelle von Thymin vor. Im DNA- oder RNA-Polymer ist immer das N-9-Atom
eines Purins sowie das N-1-Atom eines Pyrimidins ist mit dem C-1‘-Atom des
Zuckers verknüpft.
Die β-glykosidische Bindung in einem Nucleosid
Schreibt man die Strukturformel des Nucleosids (= eine Einheit von Base +
Zucker) in der Standardorientierung, liegt die Base oberhalb des Zuckers (= bglykosidische Bindung).
Die Nucleotide Adenosin-5'-triphosphat (5'-ATP) und
Desoxyguanosin-3'-monophosphat (3'-dGMP)
Ein Nucleotid ist ein Nucleosid, das über eine Esterbindung mit einer oder
mehreren Phosphatgruppen verbunden ist. Natürlich vorkommende Nucleotide
sind fast immer über die Hydroxylgruppen des C-5‘-Atoms des Zuckers
verestert. Beispiel: ATP = Adenosin-5‘-triphosphat.
Struktur eines DNA-Stranges
Ein DNA-Strang verfügt über ein 5'-Ende, an das in der Regel ein Phosphat
gebunden ist, und ein 3'-Ende mit einer freien Hydroxylgruppe.
Abkürzung dafür: pApCpG bzw. ACG.
Elektronenmikroskopische
Aufnahme des E. coli
Genoms
DNA-Stränge können sehr, sehr
lang sein.
Das Genom von E. coli umfasst
ein einziges DNA-Molekül, das
aus 2x 4,6 Millionen Nucleotiden
besteht.
DR GOPAL MURTI/SCIENCE PHOTO LIBRARY
Der menschliche Chromosomensatz
Quelle:
NATIONAL HEALTH
MUSEEUM, USA
DNA-Stränge können sehr, sehr lang sein.
Das Genom des Menschen umfasst 2x 3 Milliarden Nucleotide, die auf 46
Chromosomen aufgeteilt sind. Zusammen genommen und aneinander gereiht
sind diese DNA-Stränge etwa 2m lang.
Röntgenbeugungsbild einer
hydratisierten DNA-Faser
Das Kreuz in der Mitte ist
für eine helikale Struktur
charakteristisch. Die
starken Bögen auf dem
Meridian rühren von der
Stapelung der Basenpaare her, die 0,34 nm
voneinander entfernt sind.
Watson & Crick
formulierten auf Grund
der Daten von Rosalind
Franklin und von Maurice
Wilkins das Modell der
DNA-Doppelhelix.
Watson-Crick-Modell einer DNADoppelhelix
Der eine Polynucleotidstrang ist blau, der andere
rot dargestellt. Die Purin- und Pyrimidinbasen
sind heller gefärbt als das Zucker-PhosphatGerüst. A) Axiale Ansicht. Entlang der
senkrechten Helixachse wiederholt sich die
Struktur alle 3,4 nm, was zehn Basenresten auf
jeder Kette entspricht. B) Radiale Ansicht, Blick
von oben auf die Helixachse
Strukturformeln der von
Watson und Crick
vorgeschlagenen Basenpaare
Wasserstoffbrücken: Spezifische
Basenpaarungen zwischen A und T
sowie zwischen G und C
stabilisieren die Doppelhelix.
Hydrophober Effekt: Die
hydrophoben Basen lagern sich im
Inneren der Doppelhelix zusammen.
Van-der-Waals-Wechselwirkungen: Eine große Zahl von Atomen der
aufeinander gestapelten Aromaten
hat die ideale Kontaktdistanz.
Elektrostatische Kräfte: Die gleich
geladenen Phosphate befinden sich
möglichst weit voneinander entfernt
außen an der Doppelhelix.
Axiale Aufsicht auf eine
Doppelhelix
Die Basenpaare sind
innerhalb der Helix fast
genau eins auf das
andere gestapelt.
Dient immer ein Strang als
Matrize für den anderen Strang?
Methode um das nachzuweisen:
Auftrennung von 14N-DNA und 15N-DNA
durch Dichtegradientenzentrifugation
A) Eine Aufnahme der UV-Absorption
einer Zentrifugen-zelle zeigt zwei
getrennte DNA-Banden.
B) Densitometrische Auswertung der
Absorptionsfotografie.
Nachweis der semikonservativen
Replikation bei E. coli durch
Dichtegradientenzentrifugation
Die Lage einer DNA-Bande hängt von
ihrem Gehalt an 14N und 15N ab. Nach
einer Generation sind alle DNAMoleküle Hybride mit gleichem 14N- und
15N-Gehalt. (Meselson M, Stahl FW
(1958) Proc Natl Acad Sci USA 44:
671–682.)
Schematische Darstellung der
semikonservativen Replikation
Die Eltern-DNA ist blau gezeichnet, die
neu synthetisierte DNA rot. (Meselson
M, Stahl FW (1958) Proc Natl Acad Sci
USA 44: 671–682.)
Hypochromie
A) Doppelsträngige DNA absorbiert Licht weniger effizient als einzelsträngige
DNA. B) Die Extinktion einer DNA-Lösung bei einer Wellenlänge von 260nm
nimmt zu, wenn die Doppelhelix zu Einzelsträngen schmilzt.
Durch Renaturieren lässt sich der Verwandschaftsgrad verschiedener
einzelsträngiger DNA-Lösungen sehr einfach bestimmen.
Elektronenmikroskopische
Aufnahmen von ringförmiger
mitochondrialer DNA
A) Entspannte Form.
B) Superhelix-(supercoiled-)Form.
(Mit freundlicher Genehmigung von
Dr. David Clayton.)
DNA kann in einer superhelikalen
Form sehr kompakt verpackt
werden.
Stamm-Schleife-Strukturen
Einzelsträngige DNA- und RNA-Moleküle können Stamm-Schleife-Strukturen
ausbilden. Damit können DNA- und RNA-Moleküle auch viele verschiedene
3D-Strukturen einnehmen.
DNA-Origami
DNA- und RNA-Moleküle können mit sich selbst hybridisieren und so viele verschiedene und vorhersagbare 3D-Strukturen einnehmen. Insofern ist es nicht
überraschend, dass auch RNA-Moleküle enzymatische Aktivität zeigen können.
Komplex organisiertes RNA-Molekül
Einzelsträngige RNA kann sich zu einer komplexen Struktur falten. A) Die Nucleotidsequenz weist in Stamm-Schleife-Strukturen Watson-Crick- und andere, unübliche
Basenpaarungen auf. B) Die dreidimensionale Struktur und eine wichtige Wechselwirkung zwischen drei weit auseinander liegenden Basen. Bei der 3D Struktur (links) sind
Cytidinnucleotide blau, Adenosin rot, Guanosin schwarz und Uridin grün dargestellt. Die
Wasserstoffbrücken innerhalb des Watson-Crick-Basenpaars sind als schwarz gestrichelte Linien gezeichnet, zusätzliche Wasserstoffbrücken als grün gestrichelte Linien.
Die von DNA-Polymerasen katalysierte Polymerisation
(DNA)n Reste + dNTP
(DNA)n+1 Reste + PPi
DNA wird durch Polymerasen repliziert, die ihre Instruktionen von Matrizen
beziehen (analog zu einer „Matrizen-gesteuerten Werkzeugmaschine“).
Die Energie dafür kommt aus der Hydrolyse von PPi:
eine Energie-reiche Verbindung wird geknüpft während zwei Energie-reiche
Bindungen hydrolysiert werden).
Kettenverlängerungsreaktion
Die Bildung einer Phosphodiesterbrücke wird von DNA-Polymerasen
katalysiert. Dazu wird benötigt: (1) alle vier aktivierten Vorstufenmoleküle dATP,
dGTP, dCTP, dTTP und Mg2+ (2) eine Matrize und (3) einen Primer. Außerdem
können (4) viele Polymerasen auch noch Fehler korrigieren „proof-reading“.
Informationsfluss von RNA zu DNA bei Retroviren
Das RNA-Genom eines Retrovirus wird durch die Reverse Transkriptase in
DNA überführt. Das Enzym wird durch die infizierenden Viruspartikel in die
Zelle gebracht. Die Reverse Transkriptase besitzt mehrere Aktivitäten und
katalysiert die Synthese eines komplementären DNA-Stranges, den Abbau der
RNA und die anschließende Synthese des zweiten DNA-Stranges.
Die in der DNA enthaltene Information muss umgesetzt
(„exprimiert“) werden. Dabei spielen unterschiedliche Arten
von RNA eine Rolle:
Typ
rel. Menge
(%)
ribosomale RNA
(rRNA)
80
Transfer RNA
(tRNA)
Messenger-RNA
(mRNA)
15
5
Sed.
koeff. (S)
Masse
Anzahl der
Nucleotide
23
16
5
4
1,2 x 103
0,55 x 103
3,6 x 101
2,5 x 101
3700
1700
120
75
heterogen
Tabelle: RNA-Moleküle in E. coli
Die ribosomale DNA ist der Hauptbestandteil der Ribosomen, in denen die
Basenabfolge in eine Abfolge von Proteinen übersetzt wird.
Die Transfer RNAs transportieren Aminosäuren in aktivierter Form zu den
Ribosomen. Für jede Aminosäure gibt es mindestens eine tRNA.
Die Messenger-RNAs dienen den Ribosomen als Matrize für die Proteinsynthese. Sie tragen die Informationen der verschiedenen Gene in sich.
Es gibt noch einige weitere unterschiedliche Arten von RNA
4. Kleine Kern-RNA-Moleküle („small nuclear RNA“) sind am spleißen der
RNA-Exons beteiligt.
5. Der RNA-Proteinkomplex des Signalerkennungspartikels. Dieser Komplex
„verschickt“ neu gebildete Proteine, die ein Signalpeptid tragen, durch die
Membran des endoplasmatischen Retikulums z.B. für den Export aus der Zelle
heraus.
6. Mikro-RNA (miRNA) ist eine Klasse von kleinen (etwa 20 Nucleotide lang)
nicht-codierenden RNAs, die an komplementäre mRNAs binden und deren
Translation blockieren.
7. Small interfering RNAs (siRNA) ist eine Klasse von kleinen RNAs, die an
komplementäre mRNAs binden und deren Abbau bewirken.
8. Der RNA-Bestandteil der Telomerase. Dieses Enzym bewirkt, dass die
Telomere (Enden) der Chromosomen bei der DNA-Replikation erhalten
bleiben.
RNA-Polymerase
Dieses große Enzym
besteht aus vielen
Untereinheiten, darunter
β- (rot) und β'-Einheiten
(gelb), die eine Art
Zange bilden, von der die zu transkribierende DNA festgehalten wird. Man
beachte, dass das Aktivitätszentrum in
der Mitte der Struktur ein Mg2+-Ion (grün) enthält. Die gewundenen Schläuche, aus
denen das Protein in der Darstellung besteht, entsprechen dem Rückgrat der
Polypeptidkette. (Zeichnung nach IL9Z.pdb.)
Transkriptionsmechanismus der Kettenelongationsreaktion,
die von der RNA-Polymerase katalysiert wird
Die Bildung einer Phosphodiesterbrücke wird von RNA-Polymerasen
katalysiert. Dazu wird benötigt: (1) alle vier aktivierten Vorstufenmoleküle ATP,
GTP, CTP, UTP und Mg2+ (2) und eine Matrize. Einen Primer benötigen RNAPolymerasen nicht. Fehler korrigieren („proof-reading“) können sie auch nicht.
Komplementarität zwischen mRNA und DNA
Die Basensequenz der mRNA (rot) ist das Gegenstück zur Sequenz
der DNA-Matrize (blau). Die hier abgebildete Sequenz stammt aus dem
Tryptophanoperon, einem DNA Segment, das Gene für fünf Enzyme
enthält, welche die Tryptophansynthese katalysieren. Der andere DNAStrang (schwarz) wird als codierender Strang bezeichnet, weil er
dieselbe Sequenz wie das RNA-Transkript aufweist (wobei U durch T
ersetzt ist).
Promotoren für die Transkription von A) Prokaryoten und
B) Eukaryoten
Angegeben sind die Consensussequenzen. Das erste transkribierte Nucleotid
wird mit +1 bezeichnet. Das benachbarte Nucleotid auf seiner 5'-Seite
(upstream) trägt die Nummer –1. Die angegebenen Sequenzen sind die des
codierenden DNA-Stranges.
Es gibt noch viele weiter regulatorische DNA-Sequenzen, z.B. Enhancer, die
ziemlich weit entfernt sein können von dem regulierten Gen.
Die Basensequenz am 3'-Ende
eines mRNA-Transkripts in E. coli
Einer stabilen Stamm-Schleife-Struktur
folgt eine Sequenz aus Uridin-(U-)Resten.
Was anfängt, muss auch aufhören. Die
RNA-Polymerase „stolpert“ nach getaner
Arbeit am 3‘-Ende regelrecht über
Terminator-Sequenzen.
Die Modifikation von mRNA
Bei Eukaryoten wird Messenger-RNA nach der Transkription modifiziert: Das
5'- Ende wird mit einer „Kappe“ oder Cap versehen, das 3'-Ende mit einem
Poly(A)-Schwanz.
Der codierende Bereich liefert die Anheftungsstellen für die >20 verschiedenen
tRNAs (über spezifische Wasserstoffbrücken), die dadurch die Abfolge der
Nucleotide in eine Abfolge von Aminosäuren übersetzen.
Bindung einer Aminosäure an
ein tRNA-Molekül
Die Aminosäure (blau) ist mit der 3'Hydroxylgruppe des endständigen
Adenylats der tRNA verestert.
Dadurch wird die Aminosäure
chemisch aktiviert (für die Bildung
einer Peptidbindung muss Energie
investiert werden).
Auf der anderen Seite der tRNA
befindet sich das Anticodon mit der
die tRNA an die mRNA Matrize
angepasst wird.
Allgemeine Darstellung einer
Aminoacyl-tRNA
Die Aminosäure ist an das 3'Ende der RNA gebunden. Das
Anticodon ist die Matrizenerkennungsstelle. Man beachte
die Kleeblattstruktur der tRNA
mit zahlreichen Wasserstoffbrücken (grüne Punkte)
zwischen den Basen.
Die spezifische Verknüpfung
der 20 verschiedenen
Aminosäuren an „ihre“ tRNA
wird durch Aminoacyl-tRNASynthetasen katalysiert.
Der genetische Code
1. Je drei Basen codieren eine Aminosäure.
2. Der Code ist nicht überlappend.
3. Es gibt keine Zeichensetzung, außer „Start“ und „Stopp“.
4. Der Code ist degeneriert.
Startsignal: Formyl-Methionin
Die erste Aminosäure eines
Proteins, die bei E. coli eingebaut
wird, ist immer ein formyliertes
Methionin. Die entsprechende
tRNA erkennt das Starttriplett
AUG (manchmal auch GUG).
Bei Eukaryonten wird nichtformyliertes Methionin an der
ersten Position eingebaut.
Die Initiation der Proteinsynthese
Sowohl in Prokaryoten (A) als auch in Eukaryoten (B) ist für die
Initiation der Proteinsynthese ein besonderes Startsignal erforderlich
Der genetische Code ist nahezu universell
Codon
Standard
Code
mitochondrialer
Code
UGA
UGG
AUA
AUG
AGA
AGG
Stop
Trp
Ile
Met
Arg
Arg
Trp
Trp
Met
Arg
Stopp
Stopp
Tabelle: Besondere Codons in den Mitochondrien des Menschen
Der genetische Code stimmt in allen Lebewesen überein, er ist
universell, allerdings hat man einige kleiner Änderungen in mindestens
16 Lebewesen gefunden. Meist ist dabei die Bedeutung der dritten, am
wenigsten wichtigen Base des Tripletts verändert worden.
Die meisten eukaryontischen Gene sind Mosaike aus Exons
und Introns
Ein durchschnittliches menschliches Gen enthält 8 Introns. Einige Gene
können aber auch 100 Introns enthalten, die 50 bis 10,000 Nucleotide
lang sein können.
Die Identifizierung von nichtcodierenden Introns mithilfe der
Elektronenmikroskopie
Ein mRNAMolekül (rot)
wird mit genomischer DNA
hybridisiert, die
das ge-suchte
Gen enthält. A)
Bei einem kontinuierlichen
Gen ist eine
einzige Schleife aus einzelsträngiger DNA
(blau) zu
erkennen.
B) Enthält das Gen ein Intron, sind zwei Schleifen von einzelsträngiger DNA
(blau) und eine Schleife von doppelsträngiger DNA (blau und grün) zu sehen.
Zusätzliche Schleifen zeigen dementsprechend weitere Introns an.
Transkription des β-GlobinGens und Prozessierung der
RNA
Die Transkription des Gens
ergibt zunächst das
Primärtranskript, das dann durch
Hinzufügen der Cap-Struktur
und der Poly(A)-Sequenz
modifiziert wird. Introns werden
herausgeschnitten und es
entsteht die mRNA.
Consensussequenz für das Spleißen von mRNA-Vorläufern
Komplexe aus Proteinen und kleinen RNAs, die sog. Spleißosomen,
erkennen Signale im Primärtranskript und entfernen auf die Base exakt
das Intron.
Das Spleißen ist ein evolutionär sehr, sehr altes Verfahren (mindestens
1 Milliarde Jahre). Zellextrakte von Säugerzellen können Hefe mRNA
spleißen.
Exon shuffling
Durch Rekombination lassen sich Exons beliebig mischen, wodurch sich das
genetische Repertoire erweitert.
Alternatives Spleißen
Alternatives Spleißen erzeugt mRNA-Moleküle, die Matrizen für unterschiedliche Formen eines Proteins sind – etwa für einen membrangebundenen
Antikörper auf der Oberfläche eines Lymphocyten (A) und für sein lösliches
Gegenstück, das von der Zelle sezerniert wird (B). Der membrangebundene
Antikörper ist in der Plasmamembran mit einem helikalen Segment (gelb)
verankert, das durch ein eigenes Exon codiert wird.