Die Beurteilung der Resistenz von Hiv unterscheidet sich

Vergleich verschiedener Resistenzbewertungs-Systeme
Dr. Harm Müller, Dr. Nicole Wiese, Dr. Thomas Fenner
Citylabor Dres. Fenner & Partner, Abt. DNA-Analytik und Sequenzierung, Bergstr. 14,
20095 Hamburg, Email: [email protected]
Unter der antiretroviralen Therapie kommt es zur Entstehung von Resistenzen, diese können dann
über die genotypische Resistenzbestimmung analysiert werden. Die Beurteilung der genotypischen
Resistenzbestimmung von HIV unterscheidet sich dabei aber grundsätzlich von einer bakteriologischen Resistenzbestimmung, sie ist keine ja-nein Entscheidung; Zwischen Sensitiv und
Resistent liegt ein sehr differenzierter Graubereich, der möglichst präzise von der vorliegenden
Sequenz abgeleitet werden muss, damit daraufhin eine Therapieentscheidung gefällt werden
kann.
Dabei stellen sich zwei grundsätzliche Fragen:
Lässt der Genotyp eines Patientenvirus die Vermutung zu, dass ein Ansprechen auf ein
bestimmtes Medikament wie bei einem Wildypvirus zu erwarten sein wird? Oder: Lässt der
Genotyp des Virus vermuten, dass bei der Gabe des Medikamentes überhaupt noch mit einem
virologischen Benefit zu rechnen ist? Da sich mittlerweile die Technik der Sequenzierung aufgrund
von kommerziell erhältlichen stan-dardisierten Kits im Allgemeinen auf einem verlässlich hohen
Niveau befindet, liegt der Focus nun auf der Interpretation von Sequenzdaten.
Für die Interpretation von HIV Protease und Reverse Transskriptase stehen verschiedenen
Systeme zur Verfügung: Die sogenannten regelbasierten Algorithmen greifen auf publizierte Daten
zur Korrelation Geno - Phänotyp, das klinische Ansprechen oder aber die Vortherapie zurück. Die
Bewertung der Resistenz einer Mutation für ein einzelnes Medikament ist dabei - das sollte man
nicht vergessen – grundsätzlich eine persönliche Entscheidung des Experten, der den Algorithmus
definiert. Neben diesen regelbasierten Algorithmen sind andere Interpretationssysteme entwickelt
worden, die aufgrund von Geno-Phäno Datenpaaren anhand von neuronalen Netzen oder
selbstlernenden Maschinen genotypische Sequenzdaten interpretieren. Ziel der Interpretationssysteme sollte es dabei sein nicht mehr nur den Phänotyp vorherzusagen sondern auch eine
Aussage über das virologisches Ansprechen zu geben.
In den folgenden Abschnitten soll eine Auswahl der z. Zt. modernsten und am häufigsten
benutzen Interpretationssystemen gegeben werden.
Interpretationssysteme
Virtueller Phänotyp
(www.tibotecvirco.com)
Die Firma Tibotec-Virco bietet auf kommerzieller Basis den sogenannten „Virtual Phänotyp“ an. Für
die Erstellung eines virtuellen Phänotyps kann entweder die Probe für die Genotypisierung oder
aber auch nur die Sequenz an Virco-Tibotec versandt werden. Der virtuelle Phänotyp ist ein
Pattern-matching Algorithmus, der auf der Basis korrelierter Genotyp- und Phänotyp-Daten von
über 10 000 Patientenproben arbeitet (1). Für die Resistenzvorhersage vergleicht das System die
von der Patientensequenz identifizierten Resistenz-relevanten Mutationen und sucht in der
Datenbank nach entsprechenden Datenkorrelaten. Für die Resistenzvorhersage werden dann
phänotypische Resistenzfaktoren der gefundenen Treffer für die einzelnen Medikamente gemittelt.
Die Analyse gibt die Anzahl der Treffer mit entsprechendem Mutationsmuster für jedes
Medikament und die Verteilung der Phänotypen mit entsprechenden Mutationsmuster an. Die IC50
der identifizierten Proben wird anhand eines biologischen, medikamentenspezifischen cut-offs, und
in einer quantitativen Vorhersage der Resistenz ausgegeben.
Geno2Pheno
(www.genafor.org)
Eine Kooperation des Nationalen Referenzzentrums für Retroviren und einer Vielzahl von
hochkarätigen Informatikinstituten etablierte im Rahmen des AREVIR-Projektes, ein Computerbasiertes System, das anhand verschiedener Modelle aus einem Pool von Genotyp-Phänotyp
Datenpaaren die phänotypische Resistenz vorhersagt. Geno2Pheno ist ein reines phänotypisches
Vorhersagesystem aus genotypischen Daten und basiert nicht auf zuvor definierten Regeln.
In der aktuellen Version 2.2 liegen dem System Daten von über 600 Datenpaaren von geno- und
phänotypischer Resistenzbestimmung gegen bis zu 17 unterschiedliche antiretrovirale Medikamente zugrunde. Ziel von Geno2Pheno ist anhand der Analyse mit bioanalytischen Methoden ein
Vorhersagesystem für neue Sequenzen mit unbekanntem Phänotyp zu entwickeln. In diesem
System sollen nicht nur die bekannten Resistenz-relevanten Mutationen für die phänotypische
Vorhersage herangezogen werden, sondern alle für die Entstehung von Resistenz wichtigen
Interaktion von Mutationen in klinischen Proben berücksichtigt werden (2). Die Website ist
kostenfrei zugänglich und leicht und übersichtlich zu bedienen.
Die benutzerdefinierte Patientensequenz kann als Text- oder Fasta-File in das Programm geladen
werden und der Benutzer hat die Möglichkeit, die cut-offs für die einzelnen Medikamente frei zu
wählen oder den Vorgaben des Systems zu folgen.Der Report umfasst einen Vergleich der
Patientensequenz mit der Referenzsequenz, eine Liste aller Aminosäureaustausche sowie im
wesentlichen die Vorhersage der Resistenz für insgesamt 17 antiretrovirale Medikamente in Form
einer Tabelle. Geno2Pheno erarbeitet anhand von sogenannten Entscheidungsbäumen ein
qualitatives Ergebniss (ja/nein), und auch eine quantitative Vorhersage des Resistenzfaktors.
Zur Zeit existieren für Geno2Pheno noch keine am klinischen Erfolg definierte cut-offs.
HIV RT und Protease Sequence Database
(hivdb.stanford.edu)
Die HIV RT und Protease Sequenz Database der Stanford Universität ist eine Online Datenbank,
die verschiedene Sequenzanalyseprogramme zur Verfügung stellt. Diese Web-Site ist sicherlich die
international anerkannteste Informationsquelle zur Interpretation von HIV-Resistenztests. Die
Database emöglicht vielfältigste Suchmöglichkeiten. Im ersten Teil "Database Query Pages"
werden dem Benutzer vielfältige und klar gegliederte Suchmöglichkeiten angeboten; ausgehend
von einem Medikament kann z.B. nach Sequenzen von Patienten gesucht werden, die mit dem
Medikament behandelt wurden oder umgekehrt kann anhand von Mutationen nach deren bisher
publizierten Effekt auf die Resistenz bestimmter Medikamente gesucht werden.
Das Programm HIV-Seq vergleicht benutzerdefinierte Protease- und Reverse TranskriptaseSequenzen mit einer Referenzsequenz, ermittelt die abweichenden Mutationen und bestimmt
deren quantitatives und qualitatives Auftreten im bisherigen Datenbestand bei Therapie-naiven
bzw vortherapierten Patienten. Diese Daten sind wesentlich für eine Qualitäts/Plausibilitätsprüfung
der Ergebnisse, so werden hier z.B. Stopcodons, Frameshifts, oder sogenannte außergewöhnliche
Reste gekennzeichnet. Diese Information erlaubt dem Benutzer ungewöhnliche Mutationen schnell
zu identifizieren und die Rohdaten der Sequenz wiederholt zu überprüfen. Ein Abgleich der
eingespeisten Patientensequenz mit Daten verschiedener Subtypen ermittelt die Subtyp-Sequenz,
die die insgesamt höchste Homologie mit der zu analysierenden Sequenz aufweist. Diese Funktion
ist keine wirkliche Subtypendifferenzierung, liefert aber weitgehend verlässliche Anhaltspunkte für
das Vorliegen eines non-B Subtypes.
Das Hauptprogramm für die Resistenzbestimmung aber ist die beta-Testversion des Drug
Resistance Algorithm, die anhand von benutzerdefinierten Protease und Reversetranskriptase
Sequenzen oder einer Mutationsliste eine Resistenzinterpretation vornimmt (1).
Der Resistenzalgorithmus basiert auf einem Punktesystem, wobei die Resistenzmutationen
anhand ihres resistenzvermittelnden Effektes mit Punkten bewertet werden. Grundlage für dieses
System sind Publikationen über Korrelationen zwischen Geno und Phänotyp, zwischen Genotyp
und bisheriger Therapie und zwischen Genotyp und nachfolgendem klinischem Verlauf.
Anhand von Schwellenwerten werden die summierten Punktwerte in 5 Resistenzkategorien
eingeteilt: susecptible, potential low level of resistance, low level of resistance, intermediate
resistance und high level resistance. Das Ergebniss ist sehr klar gegliedert und nachvollziehbar. Im
ersten Teil der Auswertung werden die Qualität der Sequenz (Stopcodons, Frameshifts usw. )
sowie die Homologie der Patientensequenz zu typische Subtyp-Sequenzen aufgelistet. Der Befund
nennt die Resistenz- und die nicht-Resistenz-relevanten Mutationen, sowie die Resistenzinterpretation für die einzelnen Medikamente. Spezifische Kommentare zum Resitenz-relevanten
Effekt der einzelnen Mutationen und eine Tabelle aller Punktwerte runden die Auswertung ab.
Ein sehr interessantes Tool bietet das Programm HIValg der Stanford Database. Es ermöglicht die
simmultane Interpretation von verschiedenen genotypischen Interpretationsalgorithmen. Unter
anderen sind die neben der Betaversion des Stanforddatabase folgende Regelbasierte Algorithmen
implementiert: Rega Algorithm v.5.5 Rega-Institut, Leuven Belgien, ANRS AC11 09/2002, Agence
Nationale de Recherche sur le SIDA, Frankreich
ANRS
AC11
09/2002,
Agence
Nationale de Recherche sur le SIDA
(www.hivfrenchresistance.org)
Im Unterschied zu der bisherigen Praxis versucht die französische Arbeitsgruppe ANRS AC-11
durch statistische Auswertung geeigneter Daten, einzelne Mutationen bzw. Mutationsmuster direkt
mit dem klinischen Ansprechen zu korrelieren. Die Daten der NARVAL Studie stellen dabei die
Basis für diese Auswertung.
Durch eine univariante Analyse wurden zunächst einzelne Mutationen ermittelt, die mit einem
geringeren virologischen Ansprechen assoziiert sind. In einem weiteren Schritt wurde die Anzahl
der so identifizierten Mutationen stufenweise in Bezug zur entsprechenden Viruslastabsenkung
gesetzt. Der Algorithmus wird 2 mal jährlich aktualisiert und kann über die Stanford-Database
direkt für die Rohdatenanalyse verwendet werden. Der Algorithmus ist ansonsten in Tabellenform
zu beziehen. Durch seine einfache Handhabung und übersichtliche Darstellung hat dieser
Algorithmus in Frankreich eine weite Verbreitung gefunden und ist Bestandteil der französischen
Richtlinien zur Therapie von HIV-Patienten.
RetroGramTM-Decision Support System
(www.retrogram.com)
Die Interpretationssoftware RetroGram kann kostenlos nach einer erfolgreichen Registrierung
genutzt werden. Das System beruht auf einem Regelwerk, das aber nicht wie z.B. beim ANRS oder
der Stanford Database öffentlich zugänglich ist. Die aktuell gültige Version 1.6i ist über das
Internet nutzbar. Für die Sequenzinterpretation muss eine Liste aller Aminosäureaustausche
gegenüber dem Wildtyp angegeben werden, d.h.eine direkte Analyse der DNA-Sequenz erfolgt
nicht. Im Drug Resistance Report werden diese Abweichungen als relevant, natural oder
unreportet klassifiziert.
Die eigentliche Interpretation kategorisiert die Medikamente in 4 Gruppen (A,B,C,D), und zwar
nicht anhand ihrer Resistenz sondern für die Therapie. Eine Besonderheit des Systems sind
spezifische Regeln für die Verwendung von Proteaseinhibitoren mit pharmakologischem Ritonavir
Booster dadurch können Viren mit identifiziert werden, die aufgrund der höheren erreichbaren
Plasmaspiegel unter Umständen noch ausreichend gehemmt werden können.
Ausblick
Die vorgestellten Interpretationssysteme stellen dem Anwender sehr komfortable Hilfen für die
Befundung der HIV-Resistenzbestimmung zur Verfügung. Die Vorhersagepräzision der
Interpretationssysteme liegt in der Regel bei 70-90 %, wobei sehr deutlich festgestellt werden
muss, dass alle Systeme unterschiedlich sind und daher in besonderen Fällen auch
unterschiedliche Interpretationen liefern. Besonders gut ist die Vorhersagepräzision für die Gruppe
der NNRT-Inhibitoren und für einzelne NRT-Inhibitoren (z.B. Epivir). In der Gruppe der NRTInhibitoren gibt es aber auch Medikamente wie Videx, Hivid und Zerit die mit den meisten
Interpretationssystemen ungenauere Vorhersagen erreichen. Leider gibt es bisher auch nur
wenige Algorithmen für die Bewertung von geboosterten PI-Regimen.
Für den Anwender ist es aus den erwähnten Gründen wesentlich, sich nicht ausschließlich auf ein
System zu verlassen, sondern mehrere Systeme zu vergleichen und dabei, falls möglich, die
entscheidungsrelevanten Rationalen zu verfolgen und zu bewerten. Alle Systeme werden von den
Betreibern in der Regel bei Publikation neuer Erkenntnisse aktualisiert, leider jedoch oft mit
monatelangen Verzögerungen: Es ist daher trotz der prinzipiell recht hohen Qualität der Systeme
angeraten, darüber hinaus nicht den eigenen Blick für neue Daten und Erkenntnisse zu verlieren.
1. Shafer R:Genotypic Testing for Human Immunodeficiency Virus Typ1 Drug Resistance, Clinical
Microbiology Rev. 2002;15:247-277
2. Schmidt B, Walter H, Zeitler N, Korn K:Genotypic Drug Resistance Interpretation Systems –
The cutting edge of Antiretroviral Therapy. AIDS Rev. 2002; 4:148-156