Untersuchungen zur Verteilung ausgewählter Kationen in Plasma

Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
- Chemische Analytik und Endokrinologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Verteilung
ausgewählter Kationen in Plasma und Granula
von nativem, embryonierten
und
lebensmitteltechnologisch verarbeiteten
Hühnereigelb
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Sarina Bäckermann
aus Bremen
Hannover 2007
wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. W. Ternes
1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. W. Ternes
2. Gutachter: PD Dr. G. Glünder
Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2007
Diese Arbeit wurde zum Teil gefördert durch die
Fritz Ahrberg Stiftung, Hannover
Meiner Familie
in
Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung......................................................... 1
2. Schrifttum ........................................................ 5
2.1
Das Hühnerei...............................................................................5
2.1.1
Aufbau des Hühnereies ...............................................................................5
2.1.1.1
Eischale ...................................................................................................... 5
2.1.1.2
Eiklar .......................................................................................................... 5
2.1.1.3
Eigelb.......................................................................................................... 6
2.1.2
Mineralstoffgehalt .....................................................................................11
2.1.3
Technologische Behandlung von Eigelb...................................................15
2.2
2.1.3.1
Gefrieren................................................................................................... 15
2.1.3.2
Zutaten...................................................................................................... 17
2.1.3.3
pH-Wert.................................................................................................... 18
2.1.3.4
Trocknung ................................................................................................ 19
Embryonalentwicklung .............................................................20
2.2.1
Entwicklung des Embryos.........................................................................20
2.2.2
Verbleib der Mineralstoffe während der Embryogenese ..........................22
2.3
Mengenelemente .......................................................................26
2.3.1
2.3.2
Calcium .....................................................................................................26
2.3.1.1
Biologische Bedeutung............................................................................. 26
2.3.1.2
Vorkommen im Ei .................................................................................... 27
Magnesium ................................................................................................29
2.4
Biologische Bedeutung............................................................................. 29
2.3.2.2
Vorkommen im Ei .................................................................................... 30
Spurenelemente .........................................................................31
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.5
2.3.2.1
Eisen ..........................................................................................................32
2.4.1.1
Biologische Bedeutung............................................................................. 32
2.4.1.2
Vorkommen im Ei .................................................................................... 33
Kupfer........................................................................................................36
2.4.2.1
Biologische Bedeutung............................................................................. 36
2.4.2.2
Vorkommen im Ei .................................................................................... 37
Zink ...........................................................................................................38
2.4.3.1
Biologische Bedeutung............................................................................. 38
2.4.3.2
Vorkommen im Ei .................................................................................... 39
Thiamin und seine Phosphatester..............................................40
2.5.1
Chemische Eigenschaften .........................................................................40
2.5.2
Biochemie..................................................................................................41
2.5.3
Thiaminmangel..........................................................................................45
2.5.4
Thiamingehalt in Lebensmitteln ...............................................................46
2.6
2.5.4.1
Allgemein ................................................................................................. 46
2.5.4.2
Thiamin im Ei........................................................................................... 46
Analytische Methoden ..............................................................48
2.6.1
Nachweis von Thiamin..............................................................................48
2.6.2
Elementanalyse mit Atomabsorptionsspektrometrie (AAS).....................55
2.6.2.1
Calcium .................................................................................................... 59
2.6.2.2
Magnesium ............................................................................................... 60
2.6.2.3
Eisen ......................................................................................................... 60
2.6.2.4
Kupfer....................................................................................................... 61
2.6.2.5
Zink .......................................................................................................... 62
3. Material und Methoden.................................. 65
3.1
Behandlung und Fraktionstrennung der Eier............................65
3.1.1
Native Eiproben.........................................................................................65
3.1.2
Eigelbproben mit Zusatz ...........................................................................66
3.1.3
Gefriergetrocknete Eigelbproben mit Zusatz ............................................68
3.1.4
Bruteier......................................................................................................69
3.2
Thiaminanalyse .........................................................................71
3.2.1
Probenmaterial ..........................................................................................71
3.2.2
Probenaufarbeitung ...................................................................................71
3.2.3
3.3
3.2.2.1
Ansetzen der Lösungen ............................................................................ 71
3.2.2.2
Thiaminextraktion .................................................................................... 72
3.2.2.3
Thiaminextraktion aus Plasmaproben ...................................................... 73
3.2.2.4
Thiaminextraktion aus Eiklarproben ........................................................ 74
3.2.2.5
Thiaminextraktion aus Granulaproben..................................................... 74
3.2.2.6
Thiaminextraktion aus Embryoproben..................................................... 75
3.2.2.7
Derivatisierung ......................................................................................... 76
3.2.2.8
Festphasenextraktion ................................................................................ 76
3.2.2.9
Dotierung.................................................................................................. 77
Trennung und Analyse ..............................................................................77
3.2.3.1
Ansetzen der Kalibrierlösungen ............................................................... 77
3.2.3.2
Hochdruckflüssigkeitschromatographie................................................... 77
Mineralstoffanalyse...................................................................79
3.3.1
Chemikalien und Gerätschaften ................................................................79
3.3.2
Probenmaterial ..........................................................................................79
3.3.3
Säureaufschluss .........................................................................................80
3.3.4
Analyse mit Flammen-Atomabsorptionsspektrometrie ............................81
3.3.5
3.3.6
3.4
Apparatur.................................................................................................. 82
3.3.4.2
Ansetzen der Lösungen ............................................................................ 83
3.3.4.3
Bestimmung von Calcium in Granula, Plasma und Eiklar....................... 83
3.3.4.4
Bestimmung von Magnesium in Granula, Plasma und Eiklar ................. 86
3.3.4.5
Bestimmung des Eisengehaltes in der Granulafraktion ........................... 88
3.3.4.6
Bestimmung von Zink in Granula, Plasma und Eiklar............................. 89
3.3.4.7
Bestimmung von Zink in gefriergetrockneten Proben ............................. 91
3.3.4.8
Bestimmung von Zink in nativen Eigelbproben mit Zusatz..................... 91
Analyse mit Graphitrohr-Atomabsorptionsspektrometrie ........................93
3.3.5.1
Apparatur.................................................................................................. 93
3.3.5.2
Ansetzen der Lösungen ............................................................................ 93
3.3.5.3
Kupfer....................................................................................................... 93
3.3.5.4
Eisen ......................................................................................................... 94
Analyse mit ICP-Spektrometrie ................................................................95
Trockenmassebestimmung........................................................96
3.4.1
3.5
3.3.4.1
Analyse......................................................................................................96
Rasterelektronenmikroskopie ...................................................98
3.5.1
Probenvorbereitung ...................................................................................98
3.5.2
Analyse......................................................................................................99
3.6
Statistische Auswertung............................................................99
4. Ergebnisse .................................................... 101
4.1
Thiamin ...................................................................................101
4.1.1
Thiamingehalt in Plasma und Granula nativer Eier ................................101
4.1.2
Thiamingehalt in Plasma und Granula 5 Tage embryonierter Eier ........104
4.1.3
Thiamingehalt in 5 und 7 Tage alten Embryos .......................................107
4.1.4
Wiederfindungsrate, Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze 112
4.2
Mineralstoffe ...........................................................................113
4.2.1
Trockenmassegehalt der Proben .............................................................113
4.2.2
Mineralstoffgehalt in Granula nativer Eier und von Bruteiern ...............113
4.2.3
Mineralstoffgehalt im Plasma nativer Eier und von Bruteiern ...............115
4.2.4
Kupfergehalt im Plasma von Eigelbproben mit Zusätzen ......................117
4.2.5
4.2.6
4.2.4.1
Gefriergetrocknete Proben mit Zusätzen................................................ 117
4.2.4.2
Native Eigelbproben mit Zusätzen ......................................................... 119
Eisengehalt im Plasma von Eigelbproben mit verschiedenen Zusätzen .124
4.2.5.1
Gefriergetrocknete Proben mit Zusatz ................................................... 124
4.2.5.2
Native Eigelbproben mit Zusatz............................................................. 126
Rasterelektronenmikroskopie..................................................................131
5. Diskussion.................................................... 135
5.1
Thiamin ...................................................................................135
5.1.1
Methodenentwicklung und Thiaminanalytik ..........................................135
5.1.2
Thiamin- und Thiaminphosphatgehalte in Proben..................................141
5.1.2.1
Thiamingehalt in Plasma und Granula ................................................... 141
5.1.2.2
Thiamingehalt in Embryos ..................................................................... 143
5.2
Mineralstoffe ...........................................................................145
5.2.1
Trockenmassebestimmung in Granulaproben.........................................145
5.2.2
Mineralstoffgehalt in nativen Eiern in Plasma und Granula...................145
5.2.3
Mineralstoffgehalt in Plasma und Granula 5 Tage embryonierter Eier ..147
5.2.4
Kupfer- und Eisengehalt in technologisch behandelten Proben .............150
5.2.5
5.2.4.1
Veränderung des Kupfergehaltes in Plasmaproben................................ 150
5.2.4.2
Veränderung des Eisengehaltes in Plasmaproben .................................. 153
Rasterelektronenmikroskopie..................................................................156
6. Zusammenfassung........................................ 157
7. Summary ...................................................... 161
8. Anhang......................................................... 165
8.1
Chemikalienverzeichnis ..........................................................165
8.2
Geräteliste................................................................................167
9. Abkürzungsverzeichnis................................ 168
10. Tabellenverzeichnis ..................................... 169
11. Abb. Verzeichnis.......................................... 172
12. Lit. Verzeichnis............................................ 174
Einleitung
1. EINLEITUNG
Das Ei ist als Objekt wissenschaftlicher Forschung in vielerlei Hinsicht
interessant. Vom biologischen Standpunkt aus, da sich, anders als bei
Säugetieren, ein Küken fast vollständig von der Außenwelt abgeschieden, mit
den im Ei zur Verfügung stehenden Nährstoffen, entwickelt. Diese werden aus
den Nährstoffdepots mobilisiert, zum Embryo transportiert und verwertet.
Als Nährstofflieferant ist das Ei auch für die menschliche Ernährung sehr
wertvoll und wird, auch wegen seiner vielen technofunktionellen Eigenschaften,
bei der Zubereitung von Speisen geschätzt.
Fragen aus diesen beiden Gebieten der Forschung rund um das Ei werden auch
in der vorliegenden Arbeit näher beleuchtet. Einige Nährstoffe werden
herausgegriffen und bislang ungeklärte Fragen auf den Gebieten der
Embryogenese und der technologischen Bearbeitung geklärt. Besonders im
Nährstoffdepot Eigelb vorhandene und an Proteine gebundene Nährstoffe sind
in diesem Zusammenhang interessant. Daher fiel die Wahl auf Thiamin, als
proteingebundenes Molekül mit ionischem Charakter und die zum Teil
proteingebundenen Kationen Calcium, Magnesium, Eisen, Kupfer und Zink.
Als essentielles Vitamin ist Thiamin, welches auch als Vitamin B1 bezeichnet
wird, im Eigelb des Eies gespeichert. Das Eigelb selbst kann in eine granuläre
Fraktion und eine wässrige Fraktion unterteilt werden, die sich bei der
Zentrifugation trennen lassen. Welche Verteilung des Thiamins in den beiden
Fraktionen vorliegt, ist aber bislang ungeklärt.
Die Bezeichnung Thiamin ist ein Sammelbegriff und schließt die Formen
Thiaminhydrochlorid, Thiaminmonophosphat, -diphosphat und -triphosphat ein.
Das Thiaminhydrochlorid hat im Körper keine bekannte biologische Aktivität.
Erst
wenn
es
zu
Thiaminphosphaten
umgewandelt
wird,
erfüllt
es
lebensnotwendige Funktionen. Daher ist interessant, ob die Thiaminphosphate
1
Einleitung
schon im Ei für den sich entwickelnden Embryo zur Verfügung stehen, oder erst
in der frühen Embryonalphase gebildet werden. In der Literatur konnten zu
diesem Thema nur Studien zum Thiamingehalt im Herz 20 Tage alter
Hühnerembryos oder zum Vorhandensein bestimmter im Stoffwechsel von
Thiamin relevanter Enzyme gefunden werden (Olkowski und Classen, 1999;
Sanders, 1980; Sawano und Fujita, 1981).
Angaben zu Thiaminphosphaten in den verschiedenen Fraktionen von nativen
Eiern, embryonierten Eiern oder zu dem sich entwickelnden Embryo konnten
dagegen
nicht
gefunden
werden.
Diese
Fragen
zum
Thiamin-
und
Thiaminphosphatgehalt sollen daher in der vorliegenden Arbeit geklärt werden.
Die Methodenentwicklung zum Nachweis von Thiamin ist ein wichtiger Teil der
vorliegenden Arbeit, da diese aufgrund der unterschiedlichen chemischen
Eigenschaften von Thiamin und den Thiaminphosphaten in zahlreichen
vorausgegangenen Arbeiten zu Schwierigkeiten geführt hat und keine zufrieden
stellende Methodik in der Literatur gefunden wurde. Daher wurde, sowohl bei
der Probenaufarbeitung, als auch bei der Analyse mit HPLC und einem
Fluoreszenzdetektor eine neue Möglichkeit der Trennung ausprobiert.
Die für die Entwicklung des Embryos notwendigen Mineralstoffe sind ebenfalls
im Ei enthalten. Die Konzentration der Mineralstoffe in Eigelb und Eiklar, aber
auch in den Fraktionen des Eigelbs im unbebrüteten Ei, ist bekannt. Vor allem
Calcium, Eisen, Kupfer und Zink sind in den Granula des Eigelbs fest gebunden
und daher nicht ohne weiteres verwertbar (Ternes et al., 1994).
Für den sich entwickelnden Embryo werden zwei unterschiedliche Arten der
Nährstoffaufnahme diskutiert. Zum einen die Aufnahme der Granula per
Endozytose in die Zellen, zum anderen ein extrazellulärer Abbau (Bellairs,
1958; Berg und Szekerczes, 1962; Freeman und Vince, 1974). Da ein Großteil
der Mineralstoffe gebunden vorliegt, würden diese entweder bei der Endozytose
der Granula mit aufgenommen oder bei der extrazellulären Verdauung frei und
2
Einleitung
sich im Plasma anreichern. Würden alle gebundenen Ionen ausschließlich per
Endozytose aufgenommen, würde dies womöglich zu einer Anreicherung von
Eisen-, Zink- und Kupferionen in toxischen Konzentrationen führen. Es ließen
sich jedoch in der Literatur keine Angaben zum Mineralstoffgehalt in den
Fraktionen embryonierter Eier finden, so dass unklar ist, ob beim extrazellulären
Abbau Mineralstoffe freigesetzt werden und sich folglich im Plasma anreichern.
Die Bestimmung der Mineralstoffkonzentration im Plasma embryonierter Eier
würde also einen wichtigen Hinweis liefern auf welche Weise die Mineralstoffe
während der Embryogenese freigesetzt und vom Embryo aufgenommen werden.
Um den Mechanismus des extrazellulären Abbaus zu beleuchten, werden
elektronenmikroskopische Aufnahmen der Granula unbebrüteter und bebrüteter
Eier angefertigt um festzustellen, ob Veränderungen der Granula zu erkennen
sind.
Einige Kationen, vor allem Eisen und Kupfer, liegen in den Granula in einem
Komplex vor, so dass diese beim Verzehr eines Eies im Darm eine geringe
Bioverfügbarkeit
aufweisen.
Für
Eisen
wurden
daher
schon
einige
technologische Bearbeitungsverfahren auf ihre Tauglichkeit hin getestet, das
gebundene Eisen frei zu setzen und damit verfügbar zu machen. Nur
Ethylendiamintetraessigsäure
(EDTA)
und
Ascorbinsäure
schienen
diesbezüglich einen Effekt zu haben (Albright et al., 1984; Morris und Greene,
1972; Ternes et al., 1994). Für Kupferionen ließen sich keine Angaben finden,
ob eine technologische Bearbeitung oder der Zusatz von Substanzen zum Eigelb
eine Freisetzung fördert. Daher sollte in einem weiteren Versuchsaufbau der
Einfluss verschiedener Substanzen auf die Freisetzung in den Granula
gebundener Eisen- und Kupferionen untersucht werden, indem der Gehalt im
Plasma bestimmt wurde.
In diesem Zusammenhang sollte auch untersucht werden, ob eine im Technikum
des Instituts neu entwickelte Gefriertrocknungsmethode von Eigelb einen
Einfluss
auf
die
Freisetzung
der
3
Eisen-
und
Kupferionen
hat.
4
Schrifttum
2. SCHRIFTTUM
2.1 DAS HÜHNEREI
2.1.1 Aufbau des Hühnereies
2.1.1.1 Eischale
Die Eischale schützt das Eiinnere vor mechanischer Belastung und gewährleistet
den Wärme-, Gas- und Flüssigkeitsaustausch. Für die späte Entwicklungsphase
des Embryos wird außerdem Calcium aus der Schale (Glaser und Piehler, 1934;
Johnston. und Comar., 1955) für den Knochen- und Muskelaufbau mobilisiert.
Der anorganische Teil der Schale, die Kristallitschicht, besteht zu 95 % aus
Calciumcarbonat und enthält nur einen geringen Anteil anderer Verbindungen,
wie Magnesiumcarbonat, Tricalciumphosphat und Aragonit. Andere Elemente
unter anderem Eisen, Kupfer und Zink kommen nur in Spuren vor (Ternes et al.,
1994). Zur Eischale werden außerdem die Kutikula (Wachsschicht) und die
Eischalenmembranen gezählt (siehe Abbildung 1).
2.1.1.2 Eiklar
Um die Dotterkugel ist das Eiklar angeordnet, das einen dreischichtigen Aufbau
erkennen lässt (Abbildung 1). Innen liegt die innere dünnflüssige Schicht,
gefolgt von der mittleren dickflüssigen Schicht. Ganz Außen liegt das äußere
dünnflüssige Eiklar. In der Längsachse des Eies ziehen die Hagelschnüre, auch
Chalazen genannt, zur Dotterkugel, wo sie mit der Dottermembran verbunden
sind. Dadurch wird die Dotterkugel stabilisiert, wobei eine Drehung um die
Längsachse gewährleistet bleibt, damit die Keimscheibe stets oben liegt. Die
Abgrenzung des Eiklars zur Eischale bildet die zweischichtige Schalenhaut. Sie
spaltet sich am stumpfen Pol des Eies auf und bildet die Luftkammer (Schnorr,
1996).
5
Schrifttum
Das Eiklar stellt ein Flüssigkeitsreservoir dar, schützt das Eigelb vor
mechanischer Einwirkung und enthält antibakterielle Stoffe (Ternes et al.,
1994).
Calcium, Magnesium, Eisen, Kupfer und Zink sind im Eiklar nur in geringer
Konzentration vorhanden, ebenso Thiamin, so dass für diese Substanzen das
Eiklar vermutlich keine Speicherfunktion erfüllt (Waheed et al., 1985).
2.1.1.3 Eigelb
Abbildung 1: Schematischer Aufbau des Eies nach Schnorr (Schnorr, 1996) mit Änderungen nach Ternes
(Ternes et al., 1994)
Das Eigelb (= Dotter) entsteht während der Bildung des Eies aus der weiblichen
Eizelle und enthält daher einen Zellkern und ist von einer Zellmembran
umgeben (Ternes et al., 1994). Laut Schnorr (1996) besteht die Dottermembran
(Vitellinmembran (Burley und Vadehra, 1989)) von Innen nach Außen aus vier
6
Schrifttum
Schichten, dem Plasmalemm, der Lamina perivitellina, der Lamina continua und
der Lamina extravitellina. Mineki und Kobayashi (1997) dagegen konnten in
elektronenmikroskopischen Aufnahmen nur drei Schichten der Dottermembran
darstellen. Das im Inneren enthaltene Dotter besteht zu 3 % aus dem
Bildungsdotter (weiß), einem Überbleibsel aus der frühen Phase der
Dotterentwicklung, und zu 97 % aus dem Nahrungsdotter (gelb). Sie
unterscheiden sich erheblich in Morphologie, chemischer Zusammensetzung
und in ihren physikalischen Eigenschaften.
Das weiße Dotter besteht aus der etwa 6 mm großen, kugeligen Latebra
(Dotterbett), die sich in der Mitte des Dotters befindet und dem Latebrahals, der
zapfenförmig in das Dotter hineinragt. Der Latebrahals erweitert sich an der
Dotterperipherie zum Panderkern, auf dem der abgeflachte Zellkern ruht.
Der Zellkern und das ihm umgebende Bildungsplasma bilden die Keimscheibe
(Schnorr, 1996). Laut Schlesinger (1958) befindet sich auch eine dünne Schicht
weißen Dotters direkt unterhalb der Dottermembran.
Das gelbe Dotter nativer Eier wird während der Dotterbildung in konzentrischer
Schichtung um die Latebra angeordnet, welche bei uneinheitlicher Fütterung
durch unterschiedliche Einlagerung von Pigmenten oder durch Färben, zu
erkennen ist. In 3 - 4 Tage alten embryonierten Eiern dagegen, lässt sich diese
Schichtung durch Färben nicht mehr darstellen (Grau, 1976). Morphologische
Unterschiede des Eigelbs, die die Ringstruktur auch erklären könnten, konnten
von Mineki und Kobayashi (1997) in elektronenmikroskopischen Aufnahmen an
nativem Eigelb nicht festgestellt werden.
7
Schrifttum
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Eigelbpartikel
Das Eigelb kann als eine Suspension aus Partikeln in einer wässrigen Lösung
aus Proteinen (Livetinen) bezeichnet werden (Abbildung 2) (Ternes et al.,
1994). Bereits mit dem Lichtmikroskop sieht man die Dotterkugeln
(=Kügelchen, Dotterkügelchen, engl.: spheres). Ihre Größe schwankt im weißen
Dotter zwischen 4 und 75 µm und sie enthalten wenige, als Tröpfchen (engl.:
droplets) bezeichnete, Partikel. Im gelben Dotter dagegen sind sie 15 bis 150 µm
groß und enthalten Tröpfchen in größerer Anzahl (Ternes et al., 1994). In
elektronenmikroskopischen
Aufnahmen
stellten
sich
die
Dotterkugeln
polyedrisch dar (Woodward und Cotterill, 1987). Sie sind von einer Membran
umgeben und enthalten eine Matrix aus einer wässrigen NaCl-Lösung (Ternes et
al., 1994). Die Tröpfchen in den Dotterkugeln konnten auch von Bellairs (1961)
dargestellt werden. Sie charakterisierte Dotterkugeln ohne, mit einer
einschichtigen und mit einer mehrschichtigen Membran. Außerdem vermutete
8
Schrifttum
sie, dass die Matrix außerhalb der Dotterkugeln des gelben und weißen Dotters
eine ähnliche Beschaffenheit wie die Matrix in ihrem Inneren aufweist.
Die Dotterkugeln sind fragile Gebilde, die durch Belastungen wie Rühren,
Verdünnen und Zentrifugieren zerstört werden. Burly und Vadehra (1989)
beschreiben noch eine andere Art der Dotterkugeln, die unlöslich und gegenüber
mechanischer Belastung stabiler sind.
Eine detaillierte Untersuchung und Beschreibung des Eigelbs und den
enthaltenen Partikeln präsentierten Mineki und Kobayashi (1997). Sie fertigten
sowohl trans- als auch rastereletronenmikroskopische Aufnahmen verschiedener
Regionen des Eigelbs an. Sie konnten eine Struktur des nativen Eigelbs aus
dicht gepackten polyedrischen Dotterkugeln bestätigen. Diese unterschieden
sich in ihrer Größe und in ihrem Inhalt. Eine Schicht direkt unter der
Dottermembran unterschied sich morphologisch erheblich von dem weiter Innen
liegenden Eigelb. In dieser Rindenschicht identifizierten sie kleine 8 bis 12 µm
große Dotterkugeln, sowie Öltröpfchen. In den Dotterkugeln identifizierten sie
0,3 bis 2,5 µm große Granula. Aufgrund ihrer strukturellen Charakteristika
vermuteten sie, dass diese Strukturen sich noch in einem früheren
Entwicklungsstadium befinden, außerdem schienen sie sich in Lösung zu
befinden. Diese Ergebnisse bestätigen die Vermutung von Schlesinger (1958)
dass sich unter der Dottermembran eine Schicht weißen Dotters befindet. In
dem direkt darunter liegenden Dotter waren die Dotterkugeln mit etwa 22 µm
Durchmesser kleiner als die weiter im Inneren liegenden, mit etwa 60 µm
Durchmesser. Die in ihnen enthaltenen Partikel, die Granula, hatten einen
Durchmesser von 0,25 - 1,75 µm. Die Außen liegenden kleineren Dotterkugeln
enthielten größere Granula, als die größeren Dotterkugeln im Inneren des
Eigelbs. Durch Anfärben konnten sie zeigen, dass die Granula aus 4 nm großen
Proteinpartikeln bestehen. Die Dotterkugeln hatten eine glatte Oberfläche und
entgegen
den
Angaben
von
Bellairs
9
(1961),
konnten
sie
keine
Schrifttum
Membranstrukturen identifizieren. Zwischen den Dotterkugeln befanden sich,
aufgrund ihrer Beschaffenheit und Anfärbbarkeit, Öltröpfchen.
Die Größe der Granula wird auch von anderen Autoren mit einem Durchmesser
von 0,2 und 2 µm angegeben (Bellairs, 1961; Causeret et al., 1991; Chang et al.,
1977a). Durch Ultrazentrifugation des Eigelbs sedimentieren diese, während der
Überstand als Plasma bezeichnet wird. Die Proteine der Ganula bestehen zu
etwa 12 % aus Low-Density-Lipoprotein, zu 16 % aus Phosvitin und zu 70 %
aus Lipovitellin, welches auch als HDL (High-Density-Lipoprotein) der Granula
bezeichnet wird.
Durch Zugabe von NaCl-Lösung, können die Granula in Untereinheiten
aufgebrochen werden (Chang et al., 1977b; Garland und Powrie, 1978; Ternes et
al., 1994). Die beiden flotierenden Schichten (VLDL-Fraktionen) enthalten
Myelinpartikel und die Low-Density-Lipoproteine (LDL) der Granula, während
die drei sedimentierenden Schichten den Phosvitin-Lipovitellin-Komplex
enthalten (Ternes et al., 1994). Das Phosvitin ist ein Phosphoglykoprotein und
das Lipovitellin (HDL) ein Phospholipoprotein. Bei der Dotterbildung wird das
Metalltransportprotein des Huhns, das Vitellogenin, zu Phosvitin und
Lipovitellin gespalten und eingelagert (Ternes et al., 1994).
Das durch Zentrifugation gewonnene Plasma kann durch erneute Zentrifugation
in zwei weitere Fraktionen getrennt werden. In der wässrigen Phase sind
Proteine, die Livetine, gelöst. Die darüber flotierende Schicht enthält LowDensity-Lipoproteine, mit einem Durchmesser von 23 bis 50 nm. Durch
geeignete
Trennverfahren
(Ionenaustauschchromatographie,
Gelfiltration,
Elektrophorese) ließen sich molekulare Unterschiede in den einzelnen
Eigelbfraktionen erkennen, so dass ein a- und ß-Phosvitin und ein a- und ßLipovitellin (HDL) in den Granula und ein a, ß und ?- Livetin im Plasma
charakterisiert wurden. Das d-Livetin und das Apo-Vitellinin machen jeweils
nur 2 % der Livetinfraktion aus (Ternes et al., 1994).
10
Schrifttum
Tabelle 1: Zusammensetzung des Eigelbs
Eigelb
Granula
LowDensityLipoprotein
Phosvitin
a-Phosvitin
ß-Phosvitin
HDL= High-Density-Lipoprotein
LV= Lipovitellin
L= Livetin
1
= Apo-Vitellinin
Plasma
Lipovitellin
(HDL)
Livetine
a- LV
a-L
ß- LV
ß-L
LowDensityLipoprotein
?-L
d-L
Apo-1
Die Low-Density-Lipoproteine des Plasmas sind kugelige Partikel, deren Kern
aus neutralen Lipiden von einer Membran aus Proteinen und Phospholipiden
umschlossen ist. Die Low-Density-Lipoproteine der Granula sind diesen in ihrer
Zusammensetzung ähnlich.
In der Literatur werden die Low-Density-Lipoproteine des Eigelbs zum Teil
auch als Very-Low-Density-Lipoproteine bezeichnet, wobei es sich um dieselbe
Fraktion handelt. Diese kontroverse Bezeichnung resultiert daraus, dass
Lipoproteine im menschlichen Serum mit derselben Dichte wie die Lipoproteine
des Eigelbs als Very-Low-Density-Lipoproteine bezeichnet werden (Biagi,
1964; Ternes et al., 1994).
2.1.2 Mineralstoffgehalt
Der Eisen-, Kupfer- und Zinkgehalt im Ei wird durch eine Erhöhung des
Gehaltes in der Fütterungsration der Henne nicht wesentlich erhöht. Hohe
Gehalte an Kupfer und Zink in der Futterration der Henne führen im Gegenteil
zu einem deutlichen Rückgang der Legeleistung (Richards, 1997).
Untersucht man Eier derselben Henne ist der Mineralstoffgehalt relativ
konstant, kann sich aber von Huhn zu Huhn dagegen deutlich unterscheiden
(Manson et al., 1993). Zu diesen Ergebnissen kamen Manson et al. (1993) als sie
die Mineralstoffgehalte in Eiklar und Eigelb bestimmten und die Varianzen des
11
Schrifttum
Mineralstoffgehaltes in den Eiern einzelner Hennen mit denen der
Gesamtpopulation verglichen.
Tabelle 2: Gehalt und Schwankung einiger Mineralstoffe im Ei
Fraktion
Eigelb
Eiklar
Mineralstoff
Calcium
Magnesium
Eisen
Calcium
Magnesium
Ø Gehalt
µg/g
2550
240
150
180
120
Variationsbereich
Variationskoeffizient
Reproduzierbarkeit
µg/g
%
t
2080- 3130
210- 260
100- 180
90- 260
90- 140
8,1
7,5
11,8
19,9
12,7
0,36
0,19
0,64
0,13
0,57
t= Varianzen zwischen einzelner Hennen/(Varianz zwischen und Varianz innerhalb der Hennen)
nach Manson et al. (1993)
Die Autoren geben an, dass ein Wert von t > 0,3 eine signifikante Abweichung
in der Varianz der Werte zwischen den Hennen und von ein und derselben
Henne bedeutet. Für Calcium und Eisen im Eigelb schwanken die Gehalte
zwischen den Hennen, sind aber in Eiern derselben Henne relativ konstant. Dies
gilt ebenso für Magnesium im Eiklar. Für die anderen Mineralstoffgehalte ist die
Schwankung im Gehalt von Eiern verschiedener Hennen genauso groß wie die
Schwankung in Eiern derselben Henne.
Die Verteilung der Mineralstoffe im Plasma und der Granula des Eigelbs wurde
mit Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt und durch die Dialysierbarkeit
ermittelt inwieweit die Elemente an Proteine gebunden sind (Wakamatu et al.,
1982b).
Eine Übersicht zum Gehalt, der Verteilung und der Dialysierbarkeit ist in
Tabelle 3 dargestellt.
12
Schrifttum
Tabelle 3: Gehalt, Verteilung und Dialysierbarkeit der Mineralstoffe in Eigelbfraktionen
Mineralstoff
Fraktion
Calcium
Gesamteigelb
Plasma
Granula
Gesamteigelb
Plasma
Granula
Gesamteigelb
Plasma
Granula
Magnesium
Eisen
Gehalt
µg/g Tr. M.
2720
580
9880
260
110
790
100
In Spuren
480
Verteilung
%
Dialysierbarkeit
%
16,7
83,3
98,3
1
32,1
67,9
45,5
5,1
1
99
22,9
Nach Wakamatu et al. (1982a)
Anhand dieser Ergebnisse sind die im Plasma enthaltenen Ionen weniger stark
an Proteine gebunden als Ionen in den Granula. Besonders Calcium und
Magnesium scheinen in der Granulafraktion überhaupt nicht in freier Form
vorzukommen, während Calcium fast vollständig in freier Form und Magnesium
gut zur Hälfte in freier Form im Plasma vorliegt. Eisen ist zu einem Großteil in
den Granula vorhanden und dort zu 80 % in gebundener Form, wobei andere
Autoren eine Bindung von über 90 % angeben (Richards, 1997; Ternes et al.,
1994).
Im Rahmen der Untersuchung von Hennen mit einem Gendefekt wurde von
Grau und Roudybush (1979b) der Mineralstoffgehalt in den Fraktionen der Eier
von Kontrolltieren gemessen. Ihre Ergebnisse sind in den Kapiteln über die
einzelnen Mineralstoffe angegeben (siehe 2.3 und 2.4). Eine Übersicht über
Mineralstoffangaben verschiedener Autoren ist nachfolgend aufgeführt.
13
Schrifttum
Tabelle 4: Mineralstoffgehalt im gesamten Ei
Quelle
Everson & Sounders 1957
Cook & Briggs 1973
Cotteril 1977
Souci 1986
Quelle
Mineralstoffgehalt in µg/g Feuchtsubstanz
Calcium
Magnesium
Eisen
Kupfer
540
90
21
1,7
540
110
23
590
124
23
6
560
120
21
-
Zink
13
15
13,5
Mineralstoffgehalt in µg/g Trockenmasse
Calcium
Magnesium
Eisen
Kupfer
2077
346
81
6,5
2053
418
87,5
2332
490
90,9
23,7
1900
460
88
2,38
Zink
50
59,3
50
Everson & Sounders 1957*
Cook & Briggs 1973*
Cotteril 1977*
Souci 2000
* berechnet nach der von den Autoren angegebenen Trockenmasse
Tabelle 5: Mineralstoffgehalt im Eigelb
Quelle
Everson & Sounders 1957
Cook & Briggs 1973
Cotteril 1977
Souci 1986
Quelle
Mineralstoffgehalt in µg/g Feuchtsubstanz
Calcium
Magnesium
Eisen
Kupfer
1470
130
56
2,5
1410
160
55
1360
124
59
1,3
1400
160
72
Mineralstoffgehalt in µg/g Trockenmasse
Calcium
Magnesium
Eisen
Kupfer
177
69,4
20,3
2720
260
100
2905
257
110,7
4,9
2883
327
112,5
2677
244
116
2,6
2820
280
140
2900
780
150
4,8
Grau 1979
Wakamatu 1982
Everson & Sounders 1957*
Cook & Briggs 1973*
Cotteril 1977*
Souci 2000
Romanoff 1967
* berechnet nach der von den Autoren angegebenen Trockenmasse
14
Zink
38
38
38
Zink
46,9
75,1
74,8
1,5
Schrifttum
Tabelle 6: Mineralstoffgehalt im Eiklar
Quelle
Everson & Sounders 1957
Cook & Briggs 1973
Cotteril 1977
Quelle
Mineralstoffgehalt in µg/g Feuchtsubstanz
Calcium
Magnesium
Eisen
60
110
3
90
90
1
90
124
-
Kupfer
4
2
Zink
-
Mineralstoffgehalt in µg/g Trockenmasse
Calcium
Magnesium
Eisen
492
902
24,6
726
726
8,1
841
1159
840
720
9
850
1500
33,3
Kupfer
32,8
18,7
3,4
Zink
62
Everson & Sounders 1957*
Cook & Briggs 1973*
Cotteril 1977*
Souci 2000
Romanoff 1967
* berechnet nach der von den Autoren angegebenen Trockenmasse
2.1.3 Technologische Behandlung von Eigelb
Zur technologischen Behandlung des Eigelbs gehört das Erhitzen, Kühlen,
Trocknen und das Versetzen mit Zutaten. Diese Verfahren werden zum
Konservieren, bei der Verarbeitung von Eigelbprodukten, zur Veränderung der
technofunktionellen Eigenschaften, oder auch zur Beeinflussung des Nähr- und
Genußwertes des Eigelbs genutzt.
2.1.3.1 Gefrieren
Der Gefrierpunkt für Eigelb liegt bei durchschnittlich -0,601 °C. Um eine
Säurebildung, mikrobielles Wachstum, Verfärbungen und Veränderungen des
Geschmacks zu vermeiden, muss ein langsames Gefrieren verhindert werden.
Daher
werden
Schnellgefrierverfahren
bei
-40
°C
und
hoher
Luftgeschwindigkeit eingesetzt.
Beim langsamen Einfrieren und Auftauen von Eigelb erhöht sich, aufgrund
struktureller Veränderungen, die Viskosität. Diese zumeist irreversible
Änderung des Fließverhaltens von Eigelb wird als Gelbildung bezeichnet. Sie
tritt auf, wenn Eigelb langsam auf -6 °C abgekühlt wird und bei dieser
15
Schrifttum
Temperatur eine längere Zeit gelagert wird. Bei niedrigeren Temperaturen reicht
eine
kürzere
Lagerdauer.
Beim
schnellen
Gefrieren
bei
niedrigeren
Temperaturen kann eine Gelbildung verhindert werden. Um eine Gelbildung zu
vermeiden, können außerdem 10 bis 50 % Saccharose, 0,15 % Papain oder 4 %
Kochsalz sowie Phospholipase A zugesetzt werden. Die Gelbildung kann aber
nicht nur durch Zusätze, sondern auch durch mechanische Einwirkungen, wie
Homogenisieren verhindert werden. Bei der Gelbildung spielen offenbar die
Lipovitelline und die Low-Density-Lipoproteine eine Rolle. Der Gefrierprozess
bewirkt einen Wasserverlust im Eigelb, so dass die Proteine ihre Hydrathülle
verlieren. Außerdem findet eine Konzentration von Proteinen und Salzen in der
restlichen flüssigen Phase statt. Durch diese Bedingungen wird eine Umlagerung
und
Aggregation
von
Lipoproteinen
begünstigt.
Die
strukturellen
Veränderungen können in elektronenmikroskopischen Aufnahmen dargestellt
werden. Nicht gefrorenes Eigelb weist ein feines Netzwerk mit kleinen
Hohlräumen auf. Nach dem Gefrieren und Wiederauftauen erscheint es als ein
gröberes Netzwerk mit größeren Hohlräumen. Mit der Weitmaschigkeit der
Struktur ist die Zunahme der Viskosität korreliert. Die Ursache der Gelbildung
liegt offenbar in dem Plasma des Eigelbs, da dieses beim Einfrieren bei -8 °C
ein Gel bildet, wohingegen eine Granulasuspension in Wasser dies nicht tut.
Eine Gelbildung der Granula findet allerdings ebenfalls statt, wenn bei der
Behandlung die Granula zerstört werden, so dass die Low-Density-Lipoproteine
frei werden. Die aggregierten Proteine konnten als Low-Density-Lipoproteine
identifiziert werden, allerdings sollen auch Livetine an der Aggregation beteiligt
sein (Ternes et al., 1994).
Bislang wird deshalb die thermische Trocknung des Eigelbs im industriellen
Maßstab bevorzugt. Aber auch bei der thermischen Behandlung werden die
technofunktionellen Eigenschaften des Eigelbs verändert, so dass die Nutzung
dieser Eigelbpulver in Eigelbprodukten nur eingeschränkt möglich ist.
Gegenüber frisch hergestellten Produkten haben diese Produkte zudem einen
16
Schrifttum
veränderten Genusswert. Um die technofunktionellen Eigenschaften frischer
Eigelbprodukte zu simulieren müssen andere Zusätze wie Emulgatoren oder
Stabilisatoren zugefügt werden. Von Ternes und Dautel (2007) wurde daher ein
Gefriertrocknungsverfahren entwickelt bei dem die technofunktionellen
Eigenschaften des Eigelbs erhalten bleiben. Das Verfahren ist unter 3.1.3 näher
beschrieben.
2.1.3.2 Zutaten
Durch den Zusatz von Salz (NaCl) wird die Löslichkeit der Proteine der
Granula, durch Zerstörung der Struktur der Granula, erhöht (Causeret et al.,
1992; Hasiak et al., 1972; Ternes et al., 1994; Ternes, 1991).
Der Zusatz von Salz führt zu einer höheren Dialysierbarkeit von Calcium. Die
Differenz von 17,4 % Dialysierbarkeit ohne Zusatz zu 35,4 % mit Zusatz, legt
nahe, dass 18 % des gebundenen Calciums freigesetzt werden. Vermutlich
werden Calciumionen aus den Phosphor-Calcium-Brücken des PhosvitinLipovitellin-Komplexes verdrängt und somit die Granula destabilisiert. Die
Dialysierbarkeit von Eisen konnte dagegen nicht erhöht werden.
Der Zusatz von EDTA zur Granulafraktion führt zu einer fast vollständigen
Dialysierbarkeit von Calcium (99,6 %) und Eisen (94 %), da diese an EDTA
gebunden werden (Causeret et al., 1992). Ein Zusatz von 0,02 M Citronensäure
führte ebenfalls zu einer leichten Erhöhung, wohingegen für 1 M NaCl Lösung
kein Effekt festgestellt werden konnte (Albright et al., 1984). Durch die
Destabilisierung der Granula und den Verlust der Calcium- und Eisenionen
erhöhte sich die Löslichkeit der Proteine der Granula.
Die Dialysierbarkeit der Ionen und die Struktur der Granula kann auch durch
Zusatz von Ionen beeinflusst werden. So führt die Zugabe großer Mengen
Calciumchlorid (CaCl2) zur Destabilisierung der Granula, während eine
geringere Menge die Calciumbrücken gegen pH-Wert Änderungen stabilisiert.
Größere
Mengen
Eisen
dagegen
17
verdrängen
Calcium
von
den
Schrifttum
Phosphatbindungsstellen und die Struktur der Granula gegenüber NaCl wird
stabilisiert (Causeret et al., 1992).
Auch in Mayonnaise ist Eigelb vorhanden und ein Zusatz von Ascorbinsäure,
hat Einfluss auf den Gehalt an freien Eisenionen in Mayonnaise haben, wie von
Jacobsen et al. (1999) festgestellt wurde. Der Gehalt an Eisen im Präzipitat und
in der Emulsionsphase wurde gegen den Gehalt in der wässrigen Phase
gemessen. Je größer der Zusatz von Ascorbinsäure, desto mehr Eisen konnte in
der wässrigen Phase gefunden werden, während gleichzeitig der Gehalt in den
anderen beiden Phasen abnahm. Der Zusatz von Ascorbinsäure betrug zwischen
2,27 und 22,7 mM bei verschiedenen pH-Werten. Der größte Effekt konnte bei
niedrigen pH-Werten beobachtet werden. Eine pH-Wert-Absenkung mit
Essigsäure hatte dagegen keinen solchen Effekt. Ascorbinsäure reduziert an
Phosvitin gebundene, sowie freie Eisen-(III)-Ionen, zu Eisen-(II)-Ionen und
bindet Eisenionen in beiden Oxidationsstufen (Jacobsen et al., 2001). Diese
Ergebnisse decken sich mit Studien, die für Eigelbpulver durchgeführt wurden.
Wird Eigelbpulver mit Ascorbinsäure oder Ascorbinsäure-6-Palmitat versetzt,
kann für beide Zusätze eine Freisetzung von Eisen-(II)-Ionen aus dem Eisen(III)-Phosvitin-Komplex festgestellt werden (Nielsen et al., 2000). Durch
weitere Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass Eisen-(III)-Ionen
wesentlich stärker an Phosvitin gebunden sind als Eisen-(II)-Ionen (Grogan und
Taborsky, 1986).
2.1.3.3 pH-Wert
Bei pH 6,3, der dem des nativen Eigelbs von 6,0 (Burley und Vadehra, 1989) in
etwa entspricht, bilden Lipovitellin, Phosvitin und Low-Density-Lipoproteine in
den Granula einen unlöslichen Komplex. Bei einem pH-Wert unter 4,2 werden
vermutlich die Ionenbrücken aufgebrochen und bei über pH 6,3 führt
wahrscheinlich die Zunahme von elektrostatischer Abstoßung durch negativ
geladene Gruppen (COO-) dazu, dass die Granula destabilisiert werden. In
18
Schrifttum
beiden Fällen nimmt dadurch die Löslichkeit der Proteine der Granula zu
(Causeret et al., 1992; Hasiak et al., 1972; Ternes et al., 1994). Wird der pHWert anschließend wieder auf den ursprünglichen Wert gebracht, vermindert
sich die Löslichkeit wieder. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen
allerdings, dass die Granula dabei irreversibel zerstört werden (Causeret et al.,
1991).
Bei Absenkung des pH-Wertes mit Citronensäure unter pH 2,5 zeigt Eigelb eine
deutliche Gelbildung, die bei pH 3,5 beginnt (Guerrero et al., 2004).
Studien zur Eisenbindung von Phosvitin haben gezeigt, dass eine Absenkung
von pH 6,5 auf pH 3 keinen Einfluss auf an Eisen gebundenes Phosvitin hat
(Castellani et al., 2004).
2.1.3.4 Trocknung
In Fabrikationsanlagen für Eiprodukte wird Eigelb mittels Sprühtrocknung
getrocknet. Es gibt die Möglichkeit der Zentrifugenverstäubung und die
Hochdruck- (Nozzle-) Verstäubung (Ternes et al., 1994). Bei diesen
Trocknungsverfahren werden die Eigelbproteine thermisch geschädigt.
Die Möglichkeit der Gefriertrocknung besteht ebenfalls. Die Nachteile dieser
Methode sind der hohe Energieaufwand, der hohe apparative Aufwand und die
Gefahr der Beeinträchtigung der technofunktionellen Eigenschaften des Eies.
Der Trockensubstanzgehalt des Eiklars beträgt 13,1 ± 8 % und im Eigelb 52,4 ±
1,9 % (Ternes et al., 1994).
19
Schrifttum
2.2 EMBRYONALENTWICKLUNG
2.2.1 Entwicklung des Embryos
Die Entwicklung des Embryos im Hühnerei beträgt von der Ablage eines
befruchteten Eies bis zum Schlupf eines Kükens 22 Tage (Burley und Vadehra,
1989).
Schon direkt nach der Befruchtung im Infundibulum (lat. Trichter) des Eileiters
der Henne bildet sich durch Furchung aus dem Zellkern die mehrschichtige
Keimscheibe (Blastoderm) (Schnorr, 1996). Dabei ruht die Keimscheibe auf
dem Panderkern, steht also in direktem Kontakt zum weißen Dotter. Direkt vor
der Eiablage besteht die Keimscheibe schon aus etwa 60 000 Zellen, aus denen
sich der Embryo und die extraembryonalen Gewebe bilden (siehe Abbildung 1).
Zu den extraembyronalen Strukturen werden die Dottersackmembran, die
Eiklarmembran,
die
Chorioallantoismembran,
Chorionmembran,
die
die
Amnionmembran,
Allantoismembran,
die
die
Vitellinmembran
(Eigelbmembran) und die Schalenmembran gezählt. Die Vitellinmembran wird
bei der Befruchtung von den Spermatozoen durchbrochen und wird während der
ersten 3 bis 4 Tage durch die Entwicklung des Embryos so stark geschädigt,
dass sie am animalen Pol, d.h. in der Nähe der Keimscheibe reißt (Burley und
Vadehra, 1989). Durch die Eiablage wird die weitere Embryonalentwicklung
kurzfristig unterbrochen und erst während des Brütens fortgesetzt. Von der
Keimscheibe aus umwächst die Dottersackmembran, direkt unter der
Vitellinmembran, das Dotter. Bereits nach 2 ½ Tagen haben Blutgefäße die
Dottermembran durchsetzt, so dass der durch die Dottersackepithelzellen
phagozytierte Dotter dem Embryo zugeführt wird (Schnorr, 1996). Am neunten
Tag schließt sich die dreischichtige Dottersackmembran und bildet so den
Dottersack. Um die Kontaktfläche zum Dotter zu erhöhen, besitzt die innere
Schicht Ausstülpungen die in das Eigelb ragen. Über den Ductus
20
Schrifttum
vitellointestinalis ist der Embryo mit der Dottersackmembran verbunden. In der
Dottersackmembran sind verschiedene Enzyme aktiv, die das aufgenommene
Dotter
verstoffwechseln.
Die
Aktivität
der
alkalischen
Phosphatase
beispielsweise ist am 5. bis 7. Tag und die Aktivität der sauren Phosphatase am
9. bis 12. Bebrütungstag am höchsten. Die Tatsache, dass weder Phosvitin noch
Lipovitellin im embryonalen Blut gefunden wurden, legt nahe, dass diese beiden
Proteine bereits in der Dottersackmembran verstoffwechselt werden. In der
Spätphase der Inkubationszeit vermischen sich Eiklar und Eigelb und
Ovalbumin aus dem Eiklar akkumuliert in der Granulafraktion (Burley und
Vadehra, 1989).
Die Amnionmembran wird nach 30 Stunden Inkubationszeit gebildet und
umschließt den Embryo als flüssigkeitsgefüllter Sack, in dem der Embryo
schwimmt. Er hat die Aufgabe den Embryo vor mechanischen Einwirkungen zu
schützen. Die Chorioallantoismembran ist eine zusammengesetzte Membran aus
der Chorionmembran und der Allantoismembran. Die Chorionmembran wächst
zur selben Zeit wie die Amnionmembran, wohingegen die Allantoismembran
erst am zweiten Tag gebildet wird. Die beiden Membranen fusionieren und
umgeben am 11. oder 12. Tag der Embryonalentwicklung den Embryo und die
Amnionhöhle. Wie die Amnionmembran sind sie stark mit Blutgefäßen
durchsetzt. Der Chorionteil der Membran liegt der Eischale an und ist für den
Sauerstoffaustausch und die Aufnahme von Calciumionen und dessen Transport
zuständig. Der innere Allantoisteil der Membran übernimmt den Flüssigkeitsund ebenfalls den Ionentransport. Die beiden Membranen sind über den Urachus
(Nabel) mit dem Embryo verbunden (Burley und Vadehra, 1989).
Das Eiklar verliert während der Inkubationszeit vor allem Flüssigkeit und erst in
der letzten Woche etwa ein Drittel seiner Proteine, die in das Dotter übergehen.
Dephosphoryliertes Ovalbumin kann ab dem 18. Tag im embryonalen Blut
nachgewiesen werden (Burley und Vadehra, 1989).
21
Schrifttum
Abbildung 3: Schematische Aufbau eines Embryo am 10 bis 11 Bebrütungstag (Schnorr, 1996)
Somit zeigt das Eiinnere eines befruchteten Hühnereies bereits nach wenigen
Tagen einen charakteristischen Aufbau: Die Kalkschale mit Schalenhaut schließt
das Eiinnere ein. Die zweischichtige Schalenhaut trennt sich am stumpfen Pol
und bildet eine Luftkammer. Unter der Eischalenhaut liegt das Eiklar, welches
rundherum das Chorion umschließt. Im Chorion liegen die Allantois, die über
den Allantoisstiel mit dem Embryo verbunden ist, sowie der Dottersack und die
Amnionhöhle, die den Embryo schützend umgibt (Schnorr, 1996).
2.2.2 Verbleib der Mineralstoffe während der Embryogenese
Während
der
Embryonalentwicklung
werden
die
Granula
von
den
Endodermalzellen der Dottersackmembran durch Endozytose aufgenommen
(Juurlink und Gibson, 1973; Lambson, 1970; Mobbs und McMillan, 1979).
Bellairs fertigte 1958 elektronenmikroskopische Aufnahmen der Keimscheibe
22
Schrifttum
des Hühnerembryos an und identifizierte die aufgenommenen Granula in den
Zellen (Bellairs, 1958). In den Granula bilden an Phosvitin und Lipovitellin
gebundene Eisen-, Kupfer- und Zinkionen mit Calciumionen einen Komplex.
Werden die Mineralstoffe nicht vorher abgelöst, würden sie bei der Endozytose
der
Granula
ebenfalls
aufgenommen
werden.
Das
in
Phagosomen
aufgenommene Phosvitin und Lipovitellin wird in diesen abgebaut, so dass die
gebundenen Mineralstoffe freigesetzt würden.
Neben diesem intrazellulären Eigelbabbau wird ein extrazellulärer Eigelbabbau
diskutiert, der von Freeman und Vince (1974) zusammengefasst wurde: Vom
zweiten Tag der Embryonalentwicklung an können Hinweise auf eine
extrazelluläre Verstoffwechselung des Eigelbs festgestellt werden. Die
Endodermalzellen der Dottersackmembran setzen Enzyme frei und nehmen die
Abbauprodukte wieder auf. Das gesamte aufgenommene Material wird über den
Blutkreislauf zum Embryo transportiert. Es wurden bislang drei proteolytische
Enzyme gefunden, die an der Hydrolyse von Proteinen beteiligt sind. Da diese
auch in unembryonierten Eiern gefunden wurden, werden sie schon bei der
Eibildung ins Ei eingelagert. Die Proteinaseaktivität ist ab dem vierten Tag
feststellbar und erhöht sich während der Embryogenese weiter. Dadurch werden
Aminosäuren freigesetzt. Ab dem 6. Inkubationstag werden diese auch aktiv
durch ein Transportsystem aufgenommen. Bis zum 13. Tag der Inkubation
werden die Granula stetig abgebaut und ein Transfer von Protein-Stickstoff aus
dem Eigelb in den Embryo ist zu verzeichnen. Die Konzentration gelöster
Proteine nimmt auch durch die Vermischung von Eiklar und Eigelb zu. Für
Phosphat konnte belegt werden, dass es durch eine Phosphoproteinphosphatase,
die im Endoderm und im Eigelb gefunden wurde, freigesetzt wird (Freeman
und Vince, 1974).
Je nach Bedarf des Embryos werden Mineralstoffe entweder in der
Dottersackmembran gespeichert oder in das Blutplasma abgegeben, damit sie
zum Embryo transportiert werden können. Diese Beobachtung konnte
23
Schrifttum
insbesondere für Zink bestätigt werden (Richards und Steele, 1987). Ein
größerer Teil des aufgenommenen Eisens wird direkt in der Dottersackmembran
für den Aufbau von Erythrozyten verwendet (Simkiss, 1991). Kurz vor dem
Schlupf (21. Tag) können in der Dottersackmembran wesentlich höhere
Mineralstoffgehalte als im Eigelb gemessen werden. Metallothionein, als Zink
und Kupfer bindendes und Ferritin als Eisen bindendes Protein können in der
späten Embryonalphase in der Dottersackmembran nachgewiesen werden. Ihnen
wird daher auch eine Speicherfunktion zugesprochen. Transferrin, Albumin und
a-Fetoprotein werden dagegen in der Eigelbmembran zum Transport von
Mineralstoffen gebildet, die dann mit dem Blut über den Vitellin-Kreislauf zum
Embryo transportiert werden. Auf diese Weise kann eine große Menge an
Spurenelementen in der Dottersackmembran gespeichert werden und der
Embryo seinen Bedürfnissen entsprechend mit diesen versorgt werden. Diese
Vermutung legen Schwankungen im Mineralstoffgehalt wie auch im Gehalt der
Mineralstofftransportproteine während der Embryonalentwicklung nahe. Die
Regulation
über
die
Dottersackmembran
gewährleistet,
dass
eine
Unterversorgung oder eine Überversorgung an in hohen Konzentrationen
toxisch wirkenden Spurenelementen vermieden wird. Bei der Messung der
Gehalte an Spurenelementen im sich entwickelnden Embryo fallen eine hohe
Konzentration am fünften Tag und ein Abfallen der Konzentration an den darauf
folgenden Tagen auf. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die Entwicklung der
Dottersackmembran am fünften Tag noch nicht abgeschlossen ist und sie daher
ihre
regulatorische
Funktion
noch
nicht
vollständig
erfüllen
kann.
Möglicherweise ist aber auch ein höherer Bedarf an Spurenelementen die
Ursache für die höhere Konzentration am fünften Tag.
Calcium wird in der späten Phase der Embryonalentwicklung zusätzlich über die
Eischalenmembran und die Chorioallantoismembran aufgenommen.
Experimente mit der Chorioallantoismembran bestätigten dies und legen den
Schluss nahe, dass zwei Calciumpumpen, eine für jede Zellschicht in der
24
Schrifttum
Membran, enthalten sein müssen (Moriarty, 1973). Bis zum 9. oder 10. Tag der
Embryogenese werden 85- 95 % des Calciumbedarfs des Embryos durch das in
den Granula gespeicherte Calcium gedeckt. Danach werden Calciumionen aus
der Eischale mobilisiert (Johnston und Comar, 1955). Dass die Anwesenheit der
Eischale während der Inkubation einen Einfluss auf den Mineralstoffgehalt im
Hühnerembryo hat, konnte durch Untersuchungen an schalenlosen Eiern
bestätigt werden. Die Mineralstoffgehalte im Embryo und im Gesamtei an
Calcium, Magnesium, Kalium und Natrium wurden zwischen dem 8. und 21.
Tag bestimmt. Der Calcium- und Magnesiumgehalt in Embryos, die ohne
Eischale inkubiert wurden, war wesentlich niedriger als der Gehalt in der
Kontrollgruppe. Während der Calciumgehalt im Gesamtei in der Kontrollgruppe
stetig anstieg, war er für die schalenlosen Embryos sehr niedrig.
Dies
ist
ein
Hinweis
darauf,
dass
Calciumionen
während
der
Embryonalentwicklung aus der Eischale mobilisiert werden. Während allerdings
der Calciumgehalt deutlich unterschiedliche Werte, sowohl im Embryo als auch
im Gesamteiinhalt aufwies, konnte kein so deutlicher Unterschied für den
Magnesiumgehalt festgestellt werden. Es wird daher angenommen, dass
Magnesium sowohl aus der Eischale als auch den Granula mobilisiert wird
(Dunn und Boone, 1977).
Welche Rolle die Chorioallantoismembran bei der Versorgung des Embryos mit
anderen Mineralstoffen spielt, ist noch nicht hinreichend aufgeklärt. Eine
Aufnahme von aufgetragenen Metallsalzen konnte zumindest bestätigt werden.
Außerdem wird Metallothionein in der Membran synthetisiert an das das
aufgenommene Zink gebunden wird. Ob allerdings Spurenelemente aus der
Eischale und der Eischalenmembran in vivo aufgenommen werden, ist unklar.
Durch die Vermischung von Eiklar und Eigelb während der Embryogenese,
wird auch an Transferrin gebundenes Eisen aus dem Eiklar in der Synthese von
roten Blutkörperchen genutzt. Für die Amnionmembran konnte bislang keine
25
Schrifttum
Rolle in der Verstoffwechselung von Spurenelementen festgestellt werden
(Richards, 1997).
Der Gehalt von Kupfer, Eisen, Magnesium und Zink vom 5. bis zum 18.
Inkubationstag nimmt, gegen das Embryogewicht aufgetragen, ab. Eine
Erklärung
dafür
wäre,
dass
das
Wachstum
des
Embryos
die
Mineralstoffaufnahme übersteigt. Wird hingegen der absolute Gehalt im
Embryo und im gesamten Ei bestimmt, kann ein Transfer von Mineralstoffen
angenommen werden (Dewar et al., 1974).
2.3 MENGENELEMENTE
Zu den Mengenelementen werden Calcium, Phosphor, Magnesium, Kalium,
Natrium, Chlor und Schwefel gezählt, da jedes von ihnen in einer Konzentration
von mehr als 50 mg pro kg Körpermasse im Organismus vorhanden ist
(Engelhardt und Breves, 2000).
2.3.1
Calcium
2.3.1.1 Biologische Bedeutung
Bei einem erwachsenen Individuum sind 99 % des gesamten Calciumgehaltes
als apatitische Calciumphosphate im Knochen lokalisiert und sorgen für dessen
Stabilität (Engelhardt und Breves, 2000). Fehlt das Calcium im Knochen werden
diese brüchig, dies wird auch als Osteoporose bezeichnet. Die restlichen
Calciumionen
des
Organismus
erfüllen
wichtige
Aufgaben
bei
der
Signalübertragung in den Nerven, bei der Muskelkontraktion, bei der
Hormonproduktion, im Flüssigkeitshaushalt, bei der Herzmuskelkontraktion und
bei der Blutgerinnung (Tolonen, 1990).
26
Schrifttum
2.3.1.2 Vorkommen im Ei
Im Ei kommt Calcium vor allem im Eigelb vor (Tabelle 7) und dort vor allem in
den Granula (Tabelle 8). Die Dialysierbarkeit gibt an, wie viel Prozent der
Calciumionen in freier Form vorkommen. Fast alle Calciumionen in den
Granula sind in einem Komplex aus Lipovitellin und Phosvitin gebunden. Die
im Plasma vorkommenden Calciumionen liegen dagegen fast vollständig in
freier Form vor.
Tabelle 7: Calciumgehalt im Ei
_______
Calcium
Gesamtei
Eigelb
Eiklar
µg/g in der Feuchtsubstanz _________
1
2
3
4
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
1180
1390
630- 2150
1360
150
70
70- 290
90
µg/g Tr. M.
5
1900
2820
840
1: nach Manson et al. (1993), Erste Messreihe
2: nach Manson et al. (1993), Zweite Messreihe
3: nach Shenstone (1968)
4: nach Cotterill et al. (1977)
5: Mineralstoffgehalt nach Souci et al. (2000)
n.a.: nicht angegeben
Tabelle 8: Verteilung und Dialysierbarkeit der Calciumionen im Ei
Calcium
Eigelb
Granula
Plasma
µg/g Tr. M.
2720
9880
580
Verteilung in %
83,3
16,7
Nicht dialysierbar in %
99,0
1,7
Mineralstoffgehalt nach Wakamatu et al. (1982a)
Eine weitaus größere Calciumreserve als das Eigelb ist die Eischale, welche
etwa 10 % des Eigewichtes ausmacht. Die in ihr zu 95 % enthaltenen
anorganischen Calciumsalze bestehen zu 98 % aus Calciumcarbonat und zu
weniger als 1 % aus Magnesiumcarbonat und Tricalciumphosphat (Burley und
Vadehra, 1989;
Ternes
et
al.,
1994).
Grob
geschätzt
enthält
eine
durchschnittliche Eischale von etwa 6 g einen Calciumanteil von etwa 2,5 g.
Dieser Wert von 2 bis 2,5 g Calcium für die Calcifizierung der Eischale wird
auch in der Literatur angegeben (Ternes et al., 1994).
27
Schrifttum
Die Eischale ist somit die größte Calciumreserve im Ei. Die Calciumionen im
Eigelb sind vor allem in den Granula lokalisiert und dort zu 99 % an Proteine
gebunden (Tabelle 5). Die Calciumionen im Eigelb werden während der ersten
10 Tage der Embryonalentwicklung als Calciumquelle genutzt (Causeret et al.,
1991; Johnston und Comar, 1955). In diesen ersten Tagen ist der Abfall der
Calciumkonzentration im Eigelb und Eiklar proportional zum Anstieg des
Calciumgehaltes im Embryo. Nach dem siebten Tag steigt der Calciumgehalt im
Eigelb bis zum 19. Tag stärker an. Vergleicht man außerdem den Calciumgehalt
des
gesamten
Eiinhaltes
am
Anfang
der
Inkubation
mit
dem
Gesamtcalciumgehalt am Ende der Inkubationszeit, dann lässt sich eine
Erhöhung um 400 % verzeichnen, die eine Calciummobilisation aus der
Eischale vermuten lässt.
Eine Zusammenfassung zur Calciummobilisation aus der Eischale präsentierten
Glaser und Piehler (1934). Demnach diffundiert vom Embryo gebildetes
Kohlendioxid (CO2) zur Eischale, wo sich aus dem unlöslichen Calciumcarbonat
(CaCO3) lösliches Calciumhydrogencarbonat (Ca(HCO3)2) bildet, welches
wieder
zum
Embryo
diffundiert.
Ab
dem
siebten
Tag
der
Embryonalentwicklung steigt der Calciumgehalt der Eischalenmembran stark an
und erreicht ein Maximum kurz vor dem Schlupf. Nach dem 9. Tag der
Embryonalentwicklung berührt die Allantoismembran die Eischalenmembran
(Burley und Vadehra, 1989) und man könnte annehmen, dass von den sie
durchziehenden Blutgefäßen nicht nur CO2 abgegeben, sondern auch
Calciumcarbonat aufgenommen wird (Romanoff und Romanoff, 1967). Die
Anwesenheit von Calciumcarbonat in der Membran konnte durch Versuche mit
Bariumhydroxid (Ba(OH)2) bestätigt werden. Während der Embryogenese
können Erosionen in der Eischale und eine Vergrößerung der Poren beobachtet
werden, die die Annahme einer Calciumabsoprtion aus der Eischale erhärten.
Die Vergrößerung der Poren ist darüber hinaus auch notwendig für den
Gasaustausch (Romanoff und Romanoff, 1967).
28
Schrifttum
Insgesamt werden 78 bis 82 % des Calciumsbedarfs des Embryos durch die
Eischale gedeckt und der Rest durch die Calciumionen in den Granula. Obwohl
die Chorioallantoismembran stark mit Blutgefäßen durchsetzt ist und einen
direkten Kontakt zum Embryo hat, soll das aufgenommene Calcium zunächst in
die Granula gelangen und von dort zum Embryo transportiert werden, da der
Calciumgehalt in den Granula ab dem 15. Inkubationstag stark ansteigt (Burley
und Vadehra, 1989).
2.3.2
Magnesium
2.3.2.1 Biologische Bedeutung
Magnesium ist zu 60 % im Knochen und der Rest hauptsächlich in den Zellen,
vor allem Muskelzellen und Organen, lokalisiert (Oberleas et al., 1999). In
Zellen werden Magnesiumionen für die Zellatmung, die Zellteilung und
Enzymproduktion benötigt und für die Aufrechterhaltung der Funktion der
Zellmembran.
In den Muskeln werden Magnesiumionen für die Muskelkontraktion benötigt, so
dass ein Magnesiummangel zu Muskellähmungen führen kann. Sie erfüllen
außerdem wichtige Funktionen im Herzmuskel und sind für einen niedrigen
Blutdruck verantwortlich.
Eine
weitere
wichtige
Funktion
scheinen
Magnesiumionen
bei
der
Immunabwehr zu erfüllen, da offenbar weniger Antikörper gebildet werden,
wenn weniger Magnesium mit der Nahrung aufgenommen wird. In
Patientenstudien war die Milderung der Symptome von immunologisch
bedingten Erkrankungen wie Allergien und Asthma scheinbar mit einer erhöhten
Magnesiumaufnahme
korreliert.
Außerdem
konnte
Histamingehalt im Blut festgestellt werden (Tolonen, 1990).
29
ein
reduzierter
Schrifttum
Eine chronische Unterversorgung an Magnesium führt außerdem zu
Calciumablagerungen in weichem Gewebe und Blutgefäßen, wohingegen eine
schwere akute Unterversorgung zu Gefäßerweiterung, Haarausfall, Zyanose,
Übererregbarkeit und Krämpfen führt, die letztlich auch tödlich sind. Umgekehrt
führt eine zu hohe Magnesiumkonzentration im Blut zur Erweiterung der
Blutgefäße, Durchfall, Blutdruckabfall, Störung des zentralen Nervensystems,
Atem-
und
Herzstillstand.
Vergiftungsfälle
durch
eine
hohe
Magnesiumaufnahme mit der Nahrung sind bislang nicht bekannt (Oberleas et
al., 1999).
2.3.2.2 Vorkommen im Ei
Magnesium ist in allen Kompartimenten des Eies (Tabelle 9; Tabelle 10; Tabelle
11), inklusive Eischale, vorhanden. Für die Embryonalentwicklung benötigtes
Magnesium wird aus den Granula und zu 23,5 % aus der Eischale mobilisiert
(Burley und Vadehra, 1989). Letzteres konnte durch Untersuchungen an
schalenlosen Embryos bestätigt werden (Dunn und Boone, 1977).
Tabelle 9: Magnesiumgehalt im Ei
_______
Magnesium Gesamtei
Eigelb
Eiklar
1
n.a.
110
100
µg/g in der Feuchtsubstanz _______
2
3
4
n.a.
n.a.
n.a.
140
130
120
140
100
120
1: nach Manson et al. (1993), Erste Messreihe
2: nach Manson et al. (1993), Zweite Messreihe
3: nach Shenstone (1968)
4: nach Cotterill et al. (1977)
5: Mineralstoffgehalt nach Souci et al. (2000)
n.a.: nicht angegeben
30
µg/g Tr. M.
5
460
280
720
Schrifttum
Tabelle 10: Magnesiumgehalt in Eigelbfraktionen
Magnesium Eigelb
Granula
Plasma
Lipide d. Granula
µg/g Tr. M.
177
749
73,7
45,2
Mineralstoffgehalt nach Grau und Roudybush (1979a)
Tabelle 11: Verteilung und Dialysierbarkeit der Magnesiumionen im Ei
Magnesium Eigelb
Granula
Plasma
µg/g Tr. M
260
790
110
Verteilung in %
67,9
32,1
Nicht dialysierbar in %
94,9
54,5
Mineralstoffgehalt und Verteilung nach Wakamatu et al. (1982a)
Die Dialysierbarkeit in Tabelle 11 gibt an, wie viele Magnesiumionen frei, dass
heißt ungebunden, in den Fraktionen des Eigelbs vorkommen. In den Granula
liegen demnach fast alle und im Plasma 50 % der Magnesiumionen in
gebundener Form vor.
2.4 SPURENELEMENTE
Spurenelemente kommen in einer Konzentration von unter 100 mg/kg
Trockenmasse im Organismus vor. Dazu gehören Elemente wie Eisen, Kupfer,
Zink, Mangan, Iod, Molybdän, Selen, Fluor, Brom, Chrom, Kobalt und
Silizium, für die ein essentieller Effekt im Organismus nachgewiesen werden
konnte. Für andere im Organismus vorkommende Elemente konnte kein
positiver oder essentieller Effekt in niedrigen Konzentrationsbereichen
nachgewiesen werde. Allen Spurenelementen ist gemein, dass sie in größeren
Konzentrationen toxisch auf den Organismus wirken (Engelhardt und Breves,
2000).
Richards trug die Gehalte für Eisen, Kupfer und Zink zusammen und stellte sie
als absoluten Gehalt in einem 58 Gramm Ei einander gegenüber. Von diesen
waren 19 Gramm Eigelb und 34 Gramm Eiklar (Richards, 1997).
31
Schrifttum
Tabelle 12: Absoluter Spurenelementgehalt im Ei
Eisen
Zink
Kupfer
Eigelb
µg in 19 g
1017
571
37
Eiklar
µg in 34 g
53
5
10
nach Richards (1997)
Es wird deutlich, dass im Eigelb wesentlich höhere Gehalte an Eisen-, Kupferund Zink vorhanden sind, als im Eiklar. Im Eigelb werden also diese
Mineralstoffe gespeichert.
2.4.1
Eisen
2.4.1.1 Biologische Bedeutung
Eisenionen sind vor allem im Hämoglobin der roten Blutkörperchen lokalisiert,
außerdem im Myoglobin des Muskels und in Organen und im Knochenmark.
Das Eisenion im Hämoglobin der roten Blutkörperchen bindet Sauerstoff und ist
somit für dessen Transport verantwortlich. Außerdem ist Eisen in Enzymen
vorhanden (Tolonen, 1990). Dazu gehören Cytochromoxidase, Peroxydasen,
Katalasen,
Dehydroxygenasen,
Xanthinoxidase.
Neben
NADH-Cytochrom-Reduktase
Sauerstofftransport
spielt
Eisen
und
beim
Elektronentransport und Energieumsatz eine Rolle (Engelhardt und Breves,
2000).
Die Notwendigkeit der Eisenionen für die Entwicklung des aviären Embryos
wurde bereits 1968 von Savage experimentell bestimmt (Savage, 1968). Dass
Eisenionen essentiell für die Entwicklung von Zellen sind, konnte ebenfalls
durch Untersuchung an Zellkulturen bestätigt werden. Die Anwesenheit von
Eisen, ob drei- oder zweiwertig, in freier Form oder an Transferrin gebunden,
machte das Wachstum der Zellkulturen erst möglich. In Abwesenheit von
32
Schrifttum
Eisenionen war das Wachstum bei allen Zellkulturen spärlich oder fand nicht
statt. Untersucht wurden Zellkulturen aus Hühnermuskel-, Hühnerherz-,
Hühnerretinapigment-, Hühnerfibroblasten- und Hühnerspinalnervenzellen. Der
genaue Aufnahmemechanismus in die Zelle von freien und an Transferrin
gebundenen Eisenionen ist allerdings noch unklar, wobei eine an einen Rezeptor
gekoppelte Aufnahme diskutiert wird (Saito et al., 1982).
Wichtigstes Symptom eines Eisenmangels ist eine Anämie, also ein
Erythrozytenmangel. Dieser führt letztlich auch zu einem Sauerstoffmangel des
Organismus. Ein Eisenmangel führt aber auch zu Schleimhautveränderungen im
Magen und im Darm und verringert die Aufnahme von Vitamin B12.
Im Zwölffingerdarm werden Eisen-(II)-Ionen durch ein Eisentransportprotein
aktiv resorbiert. Eisen-(III)-Ionen werden durch eine Ferroxidase zu Eisen-(II)Ionen reduziert (Schümann und Weiss, 2002). Der niedrige pH-Wert im
Zwölffinderdarm begünstigt die Lösung von Eisensalzen und damit deren
Resorption (Engelhardt und Breves, 2000). Aufgrund des bedarfsorientierten
Aufnahmemechanismus im Darm und der generell geringen Bioverfügbarkeit
von
Eisen,
ist
eine
Vergiftung
durch
oral
aufgenommenes
Eisen
unwahrscheinlich, kommt aber bei Aufnahme hoher Konzentrationen löslicher
Eisensalze vor. Die Symptome sind charakteristisch für Vergiftungen und
schließen Erbrechen, Magenkrämpfe, Schock, Atemnot und generalisierte
Muskelkrämpfe ein. Charakteristisch ist außerdem schwarzer Durchfall
(Oberleas et al., 1999).
2.4.1.2 Vorkommen im Ei
Die im Ei vorkommenden Eisenionen sind vor allem im Eigelb lokalisiert
(Tabelle 13) und dort in der Granulafraktion (Tabelle 14 und Tabelle 15).
33
Schrifttum
Tabelle 13: Eisengehalt im Ei
_______
Eisen
Gesamtei
Eigelb
Eiklar
1
n.a.
60
n.a.
µg/g in der Feuchtsubstanz ______
2
3
4
n.a.
n.a.
n.a.
80
40 - 110
60
n.a.
0,1
0,1
µg/g Tr. M.
5
88
140
9
1: nach Manson et al. (1993), Erste Messreihe
2: nach Manson et al. (1993), Zweite Messreihe
3: nach Shenstone (1968)
4: nach Cotterill et al. (1977)
5: Mineralstoffgehalt nach Souci et al. (2000)
n.a.: nicht angegeben
Tabelle 14: Eisengehalt in Eigelbfraktionen
Eisen
Gesamteigelb
Granula
Plasma
Lipide der Granula
µg/g Tr. M.
69,4
400
7,56
10,1
Mineralstoffgehalt nach Grau und Roudybush (1979a)
Tabelle 15: Verteilung und Dialysierbarkeit der Eisenionen im Ei
Eisen
Eigelb
Granula
Plasma
µg/g Tr. M.
100
480
In Spuren
Verteilung in %
99,0
1
Nicht dialysierbar in %
77,1
n.a.
Mineralstoffgehalt und Verteilung nach Wakamatu et al. (1982a)
n.a.: nicht angegeben
Die in den Granula vorhandenen dreiwertigen Eisenionen sind zu 95 % an
Phosvitin, einem Phosphoprotein, gebunden (Greengard. et al., 1964). Das
Lipovitellin des Lipovitellin-Phosvitin-Komplexes kann ebenfalls Eisenionen
binden (Richards, 1997). Daher ist auch die Dialysierbarkeit der Eisenionen
gering. An aus Hühnereiern isoliertes Phosvitin sind 2 bis 3 Eisenionen pro
Molekül gebunden. Wird Eisen zu einer Phosvitinlösung zugesetzt, binden etwa
65 bis 70 Eisenionen pro Molekül. Eisen-(II)-Ionen werden dabei zu Eisen-(III)Ionen oxidiert (Taborsky, 1980).
Da die Bindungskapazität des im Ei vorkommenden Phosvitins somit noch nicht
erschöpft ist, können auch Eisenionen aus gleichzeitig aufgenommenen
Nahrungsmitteln gebunden werden (Callender et al., 1970; Morris und Greene,
34
Schrifttum
1972; Rossander et al., 1979; Ternes et al., 1994). Die Resorptionsrate von nicht
an Häm gebundene Eisenionen wird von 1,5 % bis 10 % beim Menschen
angegeben (Bjoern-Rasmussen und Hallberg, 1979; Moore, 1965; Schulz und
Smith, 1958). Bei einem Eisenmangel kann die Resorptionsrate auf 30 %
gesteigert werden (Schümann und Weiss, 2002). Die an Phosvitin gebundenen
Eisenionen
haben,
durch
die
feste
Bindung,
eine
äußerst
geringe
Bioverfügbarkeit, die auch durch 40 minütiges Erhitzen bei 110 °C nicht erhöht
werden kann (Albright et al., 1984). Auch ein Zusatz von Citronensäure und
Kochsalz (Albright et al., 1984) hat keinen Effekt, obwohl die Granula bei
Zusatz von 0,58 molarer NaCl-Lösung bereits vollständig gelöst vorliegen
(Morris und Greene, 1972; Ternes, 1991). Der Zusatz von Ascorbinsäure
(Jacobsen et al., 2001; Morris und Greene, 1972) und EDTA (Albright et al.,
1984) dagegen bewirkt eine Freisetzung des an Phosvitin gebundenen Eisens.
Der Grund hierfür ist, dass Ascorbinsäure dreiwertige zu zweiwertigen
Eisenionen reduziert und mit ihnen einen gut wasserlöslichen Komplex bildet
(Windisch und Leitzmann, 1984). Nielsen et al. vermuteten hierin den Grund für
eine verstärkte Lipidoxidation in mit Ascorbinsäure angereicherter Mayonnaise
durch frei vorliegende Eisen-(II)-Ionen (Nielsen et al., 2000).
Castellani et al. (2004) untersuchten die Eisenbindung an Phosvitin bei
verschiedenen pH-Werten und Ionenstärken. Die stärkste Bindung von 115 µg
Eisen pro mg Phosvitin konnte bei pH 6,5 und einer Ionenstärke von 0,15 M
festgestellt werden. Sie fanden außerdem heraus, dass, sobald das Eisen unter
günstigen
Bedingungen
gebunden
war,
eine
starke
Ansäuerung
die
Bindungseigenschaften des Phosvitins nicht mehr beeinflusste. Außerdem
konnte die Bindungskapazität des Phosvitins nicht durch hohe Temperaturen
von 90 °C für 60 Minuten und einem Druck von 600 MPa gemindert werden.
Im Eiklar ist Eisen an Conalbumin gebunden. Dieses Protein gehört zu den
Transferrinen (metallbindende Proteine) und wird auch als Ovotransferrin
bezeichnet.
Dem
Conalbumin
wird
35
weniger
eine
Rolle
in
der
Schrifttum
Mineralstoffspeicherung, als vielmehr eine Rolle in der mikrobiellen Abwehr
zugesprochen, da das an Conalbumin gebundene Eisen für Mikroorganismen
nicht mehr verfügbar ist (Ternes et al., 1994).
2.4.2 Kupfer
2.4.2.1 Biologische Bedeutung
Die Kupferionen im Organismus sind an Eisenstoffwechsel, Zellatmung,
Pigmentierung,
Keratinisierung
(Verhornung),
Fettstoffwechsel
und
Immunfunktion beteiligt und haben eine Bedeutung für die Reproduktion und
das Nervensystem.
Kupferionen sind Bestandteil einiger Enzyme im Organismus, dazu gehören
Oxidasen, Tyrosinasen und Ceruloplasmin. Außerdem sind sie Bestandteil von
Metalloproteinen wie Erythrocuprein, Hepatocuprein und Cerebrocuprein
(Engelhardt und Breves, 2000). Zusammen mit Zinkionen im SOD
(Superoxiddismutase)-Enzym kommen sie in roten Blutkörperchen und in allen
Geweben vor und haben dort die Aufgabe freie Sauerstoffradikale zu
neutralisieren. In dem Plasmaprotein Ceruloplasmin kommen allein acht
Kupferatome vor. Es reguliert den Hormon-, Adrenalin-, Noradrenalin-,
Serotonin- und Melatoningehalt im Organismus. Außerdem spielt es eine Rolle
bei der Synthese von roten Blutkörperchen und neutralisiert freie Radikale.
Mit
der
Nahrung
aufgenommene
Kupferionen
werden
in
niedriger
Konzentration durch einen aktiven sättigbaren Transportvorgang resorbiert und
in hohen Konzentration auch durch Diffusion. Die Aufnahme erfolgt sowohl im
Magen, als auch im Dünndarm (Schümann, 2002).
Die Notwendigkeit für das Wachstum von aviären Embryos wurde von Savage
1968 bestätigt, indem sie Hühner mit einer kupferfreien Diät fütterten und die
Embryos der Eier dieser Hennen untersuchten (Savage, 1968). Ein
36
Schrifttum
Kupfermangel führt zur Störung des Eisenstoffwechsels und Anämie,
Knochenschäden und Störungen und Schäden im Herzkreislaufsystem (Oberleas
et al., 1999).
2.4.2.2 Vorkommen im Ei
Die in den Granula lokalisierten Kupferionen sind vor allem an Lipovitellin,
aber auch an Phosvitin des Lipovitellin-Phosvitin-Komplexes gebunden
(Richards, 1997).
Obwohl auch die Eischale Kupfer enthält ist bislang nicht geklärt, ob es sich
hierbei auch um ein Nährstoffdepot handelt, oder ob die Henne durch
Ablagerung in der Eischale überschüssiges Kupfer ausscheidet (Richards, 1997).
Conalbumin und Ovalbumin binden im Eiklar Kupferionen (Richards und
Steele, 1987; Ternes et al., 1994).
Der Kupfergehalt im gesamten Ei wird von Souci et al. mit 2,38 µg/g in der
Trockenmasse angegeben (Souci et al., 2000). Der Gehalt der Kupferionen in
Eigelbfraktionen ist in Tabelle 16 dargestellt.
Tabelle 16: Kupfergehalt in Eigelbfraktionen
Kupfer
Eigelb
Granula
Plasma
Lipide in der Granula
µg/g Tr. M.
20,3
20,6
20,5
15,6
Mineralstoffgehalt nach Grau und Roudybush (1979a)
Vergleicht man den Gehalt im Eigelb mit Angaben anderer Autoren (siehe Seite
11 Tabelle 5) erscheint der von Grau und Roudybush angegebene Gehalt zu
hoch, so dass auch die dargestellte Kupferverteilung in den Eigelbfraktionen
möglicherweise nicht den tatsächlichen Verhältnissen entspricht (siehe auch
4.2.2 und 4.2.3).
37
Schrifttum
2.4.3 Zink
2.4.3.1 Biologische Bedeutung
Zinkionen sind im ganzen Organismus gleichmäßig verteilt, so dass keine
speziellen Organe als Speicherorgane aufgrund erhöhter Zinkkonzentration
identifiziert werden können. Bei einem Mangel an Zinkionen wird allerdings das
im Knochenmark, Nieren und Hoden gespeicherte Zink als erstes mobilisiert
(Oberleas et al., 1999).
Bislang konnten Zinkionen als Bestandteil von fast 100 Enzymen identifiziert
werden. Dazu gehören Anhydrasen, Carboxypeptidasen, Dehydrogenasen,
alkalische Phosphatase, Ribonuclease und DNA-Polymerase (Engelhardt und
Breves, 2000). Zinkionen werden für den Hormonhaushalt, das Wachstum, die
Hautneubildung, die Wundheilung, die Immunfunktionen, bei der Wasser- und
Kationenbilanz (Engelhardt und Breves, 2000), sowie beim Knochenaufbau, bei
der Produktion von Proteinen, bei der Regulation der RNA- und Insulinsynthese
und im Kohlenstoffwechsel benötigt. Außerdem ist es Bestandteil der KupferZink-Superoxiddismutase, einem Enzym, welches freie Sauerstoffradikale
unschädlich macht. Das Enzym welches bei der Vitamin A-Synthese Retinol zu
Retinal umwandelt, enthält ebenfalls Zinkionen. Bei der Umwandlung von
Linolsäure zu ?-Linolsäure in der Protaglandinsynthese werden ebenfalls
Zinkionen benötigt (Tolonen, 1990). In Experimenten mit embryonierten Eiern
konnte gezeigt werden, dass Zinkionen für die normale Entwicklung und das
Wachstums des aviären Embryos essentiell sind (Savage, 1968). Symptome
eines Zinkmangels sind Wachstumsstörungen, Appetitlosigkeit, vermindertes
Haarwachstum, Störungen der Hautbildung, Hodenatrophie und Störungen im
weißen Blutbild. Eine Zinkvergiftung führt vor allem zu allgemeinen
Vergiftungserscheinungen wie Erbrechen, Durchfall und Magenkrämpfen
(Oberleas et al., 1999).
38
Schrifttum
2.4.3.2 Vorkommen im Ei
Die Zinkionen im Ei sind zum überwiegenden Teil im Eigelb lokalisiert (Tabelle
17) und dort in der Granulafraktion zu 90 % an das Lipovitellin des PhosvitinLipovitellin-Komplexes gebunden. Zinkionen können aber ebenfalls an
Phosvitin gebunden vorliegen (Richards, 1997).
Zink bindendes Protein im Eiklar ist das Ovalbumin.
Tabelle 17: Zinkgehalt im Ei
Zink
Gesamtei
Eigelb
Eiklar
µg/g Tr. M.
50
62
1,5
Mineralstoffgehalt nach Souci et al (2000)
Tabelle 18: Zinkgehalt in Eigelbfraktionen
Zink
Eigelb
Granula
Plasma
Lipide der Granula
µg/g Tr. M.
46,9
288
2,19
*
Mineralstoffgehalt nach Grau und Roudybush (1979a)
*Gehalt unter Nachweisgrenze
Die Zinkionen sind also wie die Eisenionen vor allem in den Granula des
Eigelbs lokalisiert. Es konnten in der Literatur keine Angaben gefunden werden,
die die von Grau und Roudybush gefundene Verteilung bestätigen.
39
Schrifttum
2.5 THIAMIN UND SEINE PHOSPHATESTER
2.5.1
Chemische Eigenschaften
Das Thiaminmolekül besteht aus einem Pyrimidinring und einem Thiazolring,
die durch eine Methylgruppe verbunden sind. Die Ethylgruppe am Thiazolring
trägt im Falle von Thiamin eine Hydroxygruppe (Abbildung 4).
Abbildung 4: Thiamin und Thiaminphosphate
R
NH2
C
N
H3C
H
N
Pyrimidinring
H
N
+
S
Thiamin
O
H H
C C
H3C
OH
R
O P OH Thiaminmonophosphat
R
OH
H H
O
Thiazolring
O
R O P O P OH
OH
OH
O
O
Thiamindiphosphat
O
O P O P O P OH
R
OH
OH
Thiamintriphosphat
OH
Reines Thiamin bildet eine feste, kristalline Struktur und erscheint weiß. Es löst
sich gut in Wasser und Methanol und weniger gut in Ethanol (Eisenbrand,
2006). Bei pH 2 bis 4 ist es in Wasser gelöst über einen längeren Zeitraum
stabil. Die Stabilität hängt nicht nur vom pH-Wert sondern auch von
Lichteinwirkung
und
Temperatur
ab.
Je
stärker
die
Licht-
oder
Temperatureinwirkung, desto schneller der Zerfall. Dabei wird die Verbindung
zwischen Thiazol- und Pyrimidinring gespalten.
Die
Hydroxygruppe
am
Thiamin
kann
durch
eine
oder
mehrere
Phosphatgruppen substituiert sein (Abbildung 4). In pflanzlichen und tierischen
Organismen kommen sowohl Thiaminmono-, -di-, als auch -triphosphat in
40
Schrifttum
unterschiedlicher Häufigkeit vor. Thiamindiphosphat wird ebenfalls als
Thiaminpyrophosphat bezeichnet.
Grundsätzlich sind auch die Phosphatester des Thiamins in saurer wässriger
Lösung unter Lichtausschluss und bei niedriger Temperatur stabil. Je mehr
Phosphatgruppen vorhanden sind, desto eher werden diese bei ungünstigen
Lagerungsbedingungen abgespalten. Thiamin und seine Phosphatester sollen
dennoch in gefrorenem Zustand über mehrere Monate stabil sein. Eine wässrige
Thiamindiphosphatlösung bei pH 2 bis 6 und 0 °C ist für 6 Monate stabil,
ebenso eine wässrige Thiamintriphosphatlösung bei einer Temperatur zwischen
-20 °C und -80 °C. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen beschleunig den
Zerfall der Thiamine (Ball, 2004; Egi und Kawasaki, 2003; Kawasaki und Egi,
2000a; Lonsdale, 2006).
2.5.2
Biochemie
Mit der Nahrung aufgenommenes Thiamin wird, sofern es Phosphatgruppen
trägt,
durch
Phosphatasen
dephosphoryliert.
Durch
einen
aktiven
Transportmechanismus mit Beteiligung von Natriumionen wird es im
Duodenum (Zwölffingerdarm) und im vorderen Jejunum (Dünndarm) in die
Enterozyten (Darmzellen) aufgenommen (Ball, 2004). Neben diesem aktiven
Transport ist eine passive Diffussion möglich, die beim hydrophilen Thiamin
gering, bei lipophilen Thiaminanaloga, beispielsweise Benfothiamin (Lonsdale,
2006), dagegen gut ist (Bitsch, 1997). In den Zellen wird ein Austritt aus der
Zelle durch Phosphorylation, vor allem zu Thiamindiphosphat, verhindert.
Intrazelluläre Thiaminphosphate werden durch mikrosomale Phosphatasen
wieder dephosphoryliert und können dann aus der Zelle in den Blutkreislauf
transportiert werden. Im Blutkreislauf sind 20 bis 30 % des Thiamins an
Plasmaproteine gebunden, Thiaminmonophosphat liegt dagegen frei vor. Über
die Pfortader gelangt das Thiamin im Blut zur Leber wo es durch die
41
Schrifttum
Thiaminpyrophosphokinase zu Thiamindiphosphat metabolisiert wird. Diese
Reaktion ist auch in anderen Geweben möglich. Im Gehirn und Nervengewebe
finden verschiedene Reaktionen statt. Da Thiamintriphosphat für die
Nervenfunktion eine Rolle spielt wird es aus Thiamindiphosphat durch die
Thiaminpyrophosphat-ATP-Phosphoryltransferase
gebildet.
Im
nervalen
Gewebe kommen ebenfalls drei Phosphatasen vor (Thiamintriphosphatase,
Thiaminpyrophosphatase,
Thiaminmonophosphatase),
die
das
Thiamintriphosphat stückweise abbauen, so dass es letztlich als Thiamin vorliegt
(Ball, 2004).
Die Hälfte des Gesamtthiamingehaltes des Organismus ist in der Muskulatur
verteilt und der Rest in Leber, Herz, Niere und Gehirn. Die biologische
Halbwertszeit beträgt 9 bis 18 Tage, so dass eine ständige Zufuhr von Thiamin
mit der Nahrung notwendig ist.
Die Ausscheidung von überschüssigem Thiamin und seiner Spaltprodukte
erfolgt hauptsächlich über die Niere, wobei freies Thiamin neben bis zu 18
vermuteten Metaboliten (z.B.: Thiamincarbonsäure, Pyramin= 2,5-Dimethyl-4aminopyrimidin, Pyrimidincarbolsäure, 4- Methylthiazol-5-Essigsäure, Thiazol
(Ariaey- Nejad et al., 1970; Matsuo und Suzuoki, 1969)) ausgeschieden werden.
Durch Schwitzen können ebenfalls hohe Thiaminmengen verloren gehen,
wohingegen mit der Galle nur minimale Mengen abgegeben werden (Ball,
2004).
Thiaminpyrophosphat ist bei zwei Reaktionen als Coenzym im Organismus
beteiligt. Zum einen spaltet es leicht Bindungen neben Carbonylgruppen, wie
zum Beispiel bei einer Decarboxylierung. Zum anderen kann es eine aktivierte
Aldehydgruppe von einem Kohlenstoffatom auf ein anderes übertragen. Der
funktionelle Teil des Thiaminpyrophosphats ist der Thiazolring.
Im Organismus ist Thiaminpyrophosphat als essentieller Co-Faktor an folgenden
Reaktionen beteiligt:
42
Schrifttum
Tabelle 19: Enzyme mit Thiaminpyrophosphat
Enzym
Pyruvat-Dehydrogenase
a-Ketoglutarat-Dehydrogenase
Acetolacetat-Synthetase
Funktion
Synthese von Acetyl-CoA
Citronensäurezyklus
Biosynthese von Valin und Leucin
Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex ist in den Mitochondrien lokalisiert und
ein wichtiger Teil der Zellatmungskette. Diese besteht aus mehreren Stufen:
Zunächst wird aus Glucose in der Glycolyse Pyruvat gebildet. Das Pyruvat wird
im Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA und CO2 oxidiert. Das
Acetyl-CoA wird als Substrat im Citronensäurezyklus vollständig zu CO2
abgebaut, wobei letztlich ein Elektronenfluss entsteht, der in der Atmungskette
benötigt wird um Adenosintriphosphat zu bilden, welches der Energielieferant
des gesamten Organismus ist.
Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex besteht aus drei Enzymen, wobei
Thiaminpyrophosphat als Coenzym an das erste gebunden ist. Bei der
Umwandlung von Pyruvat zu Acetyl-CoA handelt es sich um eine oxidative
Decarboxylierung. Im ersten Schritt wird Pyruvat an Thiaminpyrophosphat
gebunden, wobei eine CO2 Gruppe abgespalten wird. Die so gebildete
Hydroxyethyl-Gruppe wird dann zu einer Carbonsäure oxidiert und mit
Coenzym
A
zu
Acetyl-CoA
verestert.
Bei
der
Regeneration
des
Enzymkomplexes findet eine Elektronenübertragung statt, die wiederum für die
Atmungskette von Bedeutung ist (Lehninger et al., 1998).
Die a-Ketoglutarat-Dehydrogenase ist Teil des Citronensäurezyklus, welcher
über die Bildung reduzierter Cofaktoren Energie konserviert und wichtige
Vorstufen anderer Reaktionen im Organismus liefert. Die Reaktionen des
Citronesäurezyklus laufen in den Mitochondrien ab.
Im vierten Schritt des Citronensäurezyklus katalysiert
der a-Ketoglutarat-
Dehydrogenase Komplex die oxidative Decarboxylierung von a-Ketoglutarat zu
Succinyl-CoA. Die Reaktion gleicht der Reaktion des Pyruvat-Dehydrogenase43
Schrifttum
Komplexes und auch die Enzymkomplexe sind einander sehr ähnlich. Der erste
Enzymkomplex allerdings, an dem auch das Thiaminpyrophosphat gebunden ist,
ist strukturell so verschieden, dass nur das für den Komplex typische Substrat
gebunden wird. Die zweite und dritte Untereinheit dagegen sind in beiden
Enzymkomplexen fast identisch. Das gebildete Succinyl-CoA ist eine Vorstufe
von Porphyrinen und des Häms, welches ein essentieller Bestandteil roter
Blutkörperchen ist.
Valin wird durch die Acetolactat-Synthetase aus Pyruvat, Energie in Form von
NADH und Glutamat gebildet. Aus einer Zwischenstufe dieser Reaktion wird
ebenfalls Leucin synthetisiert (Lehninger et al., 1998).
Thiamintriphosphat ist zu etwa einem Prozent des Gesamtthiamins im
Nervengewebe vertreten. Obwohl nur in geringer Menge vorhanden, scheint es
doch eine außerordentlich wichtige Funktion im Nervengewebe zu besitzen. Ein
Thiaminmangel des Organismus führt zu einer Abnahme des Gesamtthiamins,
während aber, selbst über eine Mangelsituation von vier Wochen, der
Thiamintriphosphatgehalt im Gehirn stets konstant bleibt. Es konnte vor allem
in Membranen der peripheren Nervenzellen nachgewiesen werden (Ball, 2004).
Die Bedeutung von Thiamin für die Nervenerregbarkeit wurde bereits 1971
belegt (Eichenbaum und Cooper, 1971). Sie zerstörten mittels ultravioletter
Strahlung das endogene Thiamin und konnten zeigen, dass die nun nicht mehr
stimulierbaren Nerven wieder erregbar wurden, wenn sie in eine Thiaminlösung
überführt
wurden.
Diese
Tatsache
konnte
durch
Experimente
an
Flusskrebsaxonen von Sasa et al. 1976 bestätigt werden (Sasa et al., 1976). Fox
und Duppel fanden 1975 erste Hinweise, die von Bettendorf 1990 bestätigt
wurden, dass Thiamintriphosphat einen stabilisierenden Effekt auf das
Membranpotential hat (Fox und Duppel, 1975; Bettendorff et al., 1990). Sie
konnten außerdem belegen, dass die Aufnahme von Chloridionen in
44
Schrifttum
Membranvesikel durch Thiamintriphosphat um 10 % erhöht wird (Bettendorff et
al., 1990).
Ein weiterer Wirkmechanismus von Thiamin scheint die Synthese von
Neurotransmittern zu sein, da daran Pyruvat-, a-Ketoglutarat-Dehydrogenase
und Transketolase beteiligt sind (Ball, 2004).
2.5.3
Thiaminmangel
Ein Thiaminmangel kann seine Ursache in einer unzureichenden Aufnahme mit
der Nahrung, der Aufnahme von Thiaminantagonisten, Thiaminasen, oder auch
einen zu hohen Alkoholkonsum haben.
Aufgrund der allgemeinen Notwendigkeit des Thiamins in der Atmunsgskette,
äußert sich ein Mangel an Thiamin klinisch besonders in Geweben mit hohem
Energieumsatz wie: Zentralnervensystem, Magen, Darm und Muskelsystem. Die
Läsionen im Nervensystem stellen sich histopathologisch als allgemeiner
Gewebsuntergang, Proliferation von Gliazellen und Zerstörung markhaltiger
Nervenfasern dar (Ball, 2004). Die Nekrosen können, da das Gehirn auf eine
Energiegewinnung durch aerobe Glykolyse angewiesen ist, durch eine
hypoxische
Schädigung
erklärt
werden
(Bickhardt,
1992).
Die
Nervenschädigungen äußern sich in Symptomen wie Appetitlosigkeit,
Stimmungsschwankungen, Parästhesie (Sensibilitätsstörung) der Hände und
Füße, Abnehmen von Kniescheiben- und Achillessehnenreflexen und einer
allgemeinen Abnahme aller Sinnesempfindungen. Eine Magenverstimmung und
Darmatonie können ebenfall auftreten. Durch die Muskelbeeinträchtigung kann
es zu allgemeiner Muskelschwäche und am Herzen zu Rhythmusstörungen
kommen (Ball, 2004).
45
Schrifttum
2.5.4 Thiamingehalt in Lebensmitteln
2.5.4.1 Allgemein
In pflanzlichen Geweben kommt Thiamin vorwiegend in seiner freien Form vor.
In tierischen Geweben dagegen ist Thiamin hauptsächlich in der biologisch
aktiven Form, Thiamindiphosphat, vorhanden, nämlich zu 80 bis 85 %. Der Rest
ist freies Thiamin, Thiaminmonophosphat und Thiamintriphosphat. Eine
Ausnahme bildet die Skelettmuskulatur vom Schwein und die weiße
Skelettmuskulatur vom Huhn, in der Thiamin zu 70 bis 80 % als
Thiamintriphosphat vorliegt (Ball, 2004).
Als reich an Thiamin gelten laut DGE (Deutsche Gesellschaft für Ernährung)
Lebensmittel mit denen in einer Portion mindestens 15 % des Tagesbedarfs
gedeckt werden. Anhand dieser Definition zählt Hühnerfleisch zu den
thiaminreichen Lebensmitteln und wird nur von Schweinefleisch übertroffen
(Elmadfa, 1985).
Miyoshi
et
al.
bestimmten
den
Gehalt
von
Thiamin
und
der
Thiaminphosphateester, einschließlich Thiamintriphosphat, in der weißen und
roten Muskulatur von ausgewachsenen 5 bis 9 Monate alten Hühnern. Sie
fanden heraus, dass der Gesamtthiamingehalt in beiden Muskeltypen zwar
gleich, aber das Verhältnis von Thiamin und den Thiaminphosphaten
unterschiedlich ist. In der weißen Muskulatur betrug der Anteil des
Thiamintriphosphats am Gesamtthiamingehalt 80 %, während in der roten
Muskulatur nur 30 % Thiamintriphosphat vorhanden sind (Miyoshi et al., 1990).
2.5.4.2 Thiamin im Ei
Der Thiamingehalt im Eiklar wird von Ternes et al. mit 0,29 µg/g und für Eigelb
mit 2,9 µg/g angeben (Ternes et al., 1994). Zu ähnlichen Ergebnissen kamen
auch Hisil und Ötles (1997), die 0,27 µg/g für Eiklar und zwischen 2,71 und
46
Schrifttum
2,84 µg/g für Eigelb angeben. Unterschiede im Gehalt zu Angaben, die in
älteren Veröffentlichungen gemacht wurden, so vermuteten sie, können
einerseits durch die Fütterung und andererseits dadurch erklärt werden, dass
heutige Legehybriden mehr Thiamin in Eiern anreichern, als die Rassen in den
50er und 60er Jahren. Fütterungsstudien zeigten allerdings, dass der
Thiamingehalt im Ei nur solange proportional zum Gehalt im Futter ansteigt, bis
der Bedarf der Henne gedeckt ist (Hisil und Ötles, 1997). Ein Thiamingehalt im
Futter, der über den Bedarf der Henne hinausgeht führt nicht zu einer Erhöhung
des Thiamingehaltes im Ei. Der Gehalt ist außer von der Rasse und der
Fütterung noch von der Jahreszeit abhängig.
Eigelb gehört prinzipiell zu den Lebensmitteln, die einen relativ hohen
Thiamingehalt haben, der dem Gehalt in µg/g der meisten Fischsorten entspricht
(Elmadfa, 1985). Dennoch werden Eier und auch Eigelb laut DGE nicht zu den
thiaminreichen Lebensmitteln gezählt, da ein Ei nur etwa 18 g Eigelb enthält
und daher gegenüber einer Portion Fisch von 100 g einen wesentlich geringeren
Thiamingehalt aufweist. Anders ausgedrückt ist ein durchschnittlicher Verzehr
von 100 g Fleisch oder Fisch pro Tag realistisch, ein Verzehr von 100 g Eigelb
aber eher unwahrscheinlich, da dies 5 Eigelben entspräche.
Von Muniyappa und Adiga (1981) wurden aus dem Eiklar und dem Eigelb zwei
einander sehr ähnliche Proteine isoliert, die unter experimentellen Bedingungen
Thiamin im Verhältnis 1:1 binden (Burley und Vadehra, 1989). Es wird
angenommen, dass auch im nativen Eigelb das Thiamin an diese Proteine
gebunden ist (White et al., 1976).
47
Schrifttum
2.6 ANALYTISCHE METHODEN
2.6.1 Nachweis von Thiamin
Eine verbreitete Methode Thiamin in biologischen Proben nachzuweisen ist die
Extraktion
aus
der
Matrix
und
eine
anschließende
spektroskopische
Bestimmung.
In biologischen Proben liegen Thiamin und seine Phosphatester entweder frei,
oder an Proteine gebunden vor. Je nach Beschaffenheit der Probe müssen sie
also gegebenenfalls aus den Zellen heraus- und von den Proteinen abgelöst
werden. Da sich Thiamin und seine Phosphatester in Wasser und in Methanol
lösen, werden entsprechende Lösungen zur Extraktion gewählt. Bei festerem
Probenmaterial erfolgt zusätzlich eine mechanische Bearbeitung. Um die
Feststoffe von dem wässrigen Probenextrakt zu trennen erfolgt anschließend
eine Zentrifugation.
Die Extraktion erfolgt mit Lösungen wässriger Säuren, wobei Trichloressigsäure
(Bettendorff et al., 1986; Bettendorff et al., 1991; Bontemps et al., 1984b;
Botticher und Botticher, 1986; Burch et al., 1952; Herve et al., 1994; Iwata et
al., 1988; Kimura und Itokawa, 1983; Kimura und Itokawa, 1985; Matsuda und
Cooper, 1981; Rindi und Giuseppe, 1961; Sander et al., 1991; Tallaksen et al.,
1991; Viñas et al., 2003b), Perchlorsäure (Batifoulier et al., 2005; Brunnekreeft
et al., 1989; Chase et al., 1993; Laschi-Loquerie et al., 1992; Losa et al., 2005)
und Salzsäure (Alyabis und Simpson, 1993; Laschi-Loquerie et al., 1992; Ndwa
et al., 2000; Sanchez-Machado et al., 2004; Viñas et al., 2003a) am häufigsten
genutzt werden. Nur in Einzelfällen werden andere Säuren (Sulfosalicylsäure,
Phosphorsäure) (Kim et al., 2002; Vanderslice und Huang, 1986), oder auch
Methanol (Baines, 1985) verwendet. Die Wahl der Säure und deren
Konzentration hängt vor allem von der Komplexität der Probenmatrix und von
der Art der Analyten ab, die neben Thiamin bestimmt werden sollen. Durch
48
Schrifttum
Säurelösungen mit einer Konzentration zwischen 5 und 10 % werden Proteine
bei einer Temperatur von 0 °C durch Denaturierung gefällt und können
anschließend abzentrifugiert werden (Geckeler, 1998). Die Fällung mit
Trichloressigsäure wird beispielsweise in der Bioanalytik mit einer 10 % igen
Lösung durchgeführt, wobei eine Endkonzentration in der Probe von 3 bis 4 %
angestrebt wird (Lottspeich und Engels, 1998). Eine Bestimmung von Thiamin
ohne vorherigen Extraktionsschritt ist nur bei sehr einfachen Probenmatrices,
wie Urin, Blutplasma oder Standards möglich (Bontemps et al., 1984a; Ichinose
und Mitsui, 1988; Ishii et al., 1979; Viñas et al., 2001). Der Extraktionsschritt ist
in der Regel gekoppelt mit einer mechanischen Zerkleinerung der Probe, wenn
es sich um Feststoffe handelt.
Das Thiamin liegt in biologischen Proben häufig in verschiedenen Formen vor,
nämlich als Thiaminhydrochlorid und als Thiaminphosphatester. Soll nun der
Gesamtthiamingehalt bestimmt werden, werden die Thiaminphosphate nach der
Säureextraktion
enzymatisch
dephosphoryliert,
so
dass
nur
noch
Thiaminhydrochlorid in der Probe vorliegt und gemessen wird (Abdel-Kader,
1992; Alyabis und Simpson, 1993; Botticher und Botticher, 1986; Burch et al.,
1952; Laschi-Loquerie et al., 1992; Ndwa et al., 2000; Rettenmaier et al., 1979;
Sanchez-Machado et al., 2004; Schrijver et al., 1982; Viñas et al., 2003a).
In Abhängigkeit von der biologischen Probenmatrix aus der extrahiert wurde
und dem Verfahren das gewählt wurde, ist der Probenextrakt mehr oder minder
stark mit unerwünschten Bestandteilen verunreinigt. Daher folgt in einigen
Fällen eine Probenaufreinigung (Alyabis und Simpson, 1993; Bettendorff et al.,
1991; Kim et al., 2002; Rettenmaier et al., 1979; Sanchez-Machado et al., 2004).
Je
nach
Art
und
Stärke
der
Verunreinigung
können
Papierfilter,
Spritzenvorsatzfilter oder Festphasenextraktion genutzt werden.
Die Trennung der Analyten, mittels Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)
und eine nachfolgende spektroskopische Bestimmung sind stark verbreitet. In
der Literatur sind HPLC Methoden für die Bestimmung von Thiamin oder
49
Schrifttum
Gesamtthiamin (Abdel-Kader, 1992; Botticher und Botticher, 1986; Fayol,
1997; Laschi-Loquerie et al., 1992; Mascher und Kikuta, 1997; Schrijver et al.,
1982) für die simultane Bestimmung von Thiamin und anderen Analyten (Chase
et al., 1993; Gennaro, 1991; Kim et al., 2002; Ndwa et al., 2000; SanchezMachado et al., 2004; Viñas et al., 2003a) und die gleichzeitige Bestimmung
von Thiamin und seinen Phosphatestern (Batifoulier et al., 2005; Bettendorff et
al., 1986; Bettendorff et al., 1991; Bontemps et al., 1984b; Bontemps et al.,
1984a; Brunnekreeft et al., 1989; Herve et al., 1994; Ishii et al., 1979; Iwata et
al., 1988; Kimura und Itokawa, 1983; Kimura und Itokawa, 1985; Losa et al.,
2005; Sander et al., 1991; Sanemori et al., 1980; Tallaksen et al., 1991;
Vanderslice und Huang, 1986; Viñas et al., 2001; Viñas et al., 2003b)
beschrieben.
Eine erfolgreiche Trennung hängt vor allem von der Wahl der passenden
Chromatographiesäule ab.
Für die chromatographische Trennung wurden bislang am häufigsten C-18
Säulen verwendet (Bontemps et al., 1984b; Brunnekreeft et al., 1989; Chase et
al., 1993; Gennaro, 1991; Herve et al., 1994; Ichinose und Mitsui, 1988; Iwata et
al., 1988; Kim et al., 2002; Kimura und Itokawa, 1983; Kimura und Itokawa,
1985; Li und Brown, 2003; Losa et al., 2005; Sanchez-Machado et al., 2004;
Sander et al., 1991; Sanemori et al., 1980; Vanderslice und Huang, 1986; Viñas
et al., 2001). Da es sich hierbei um lange, lipophile Kohlenstoffketten handelt,
werden lipophile Substanzen am besten retardiert. Um die Retention von
Thiamin und seiner Phosphatester zu verbessern, die aufgrund ihrer Seitenketten
negativ geladen vorliegen, wird häufig die Ionenpaarchromatographie
angewendet. Bei dieser werden der Probenlösung Substanzen zugesetzt, die als
Gegenion fungieren, so dass sich ein Ionenpaar bildet, das nach außen neutral
ist. Im Falle von Thiamin und seiner Phosphatester werden Alkyl- und
Arylsulfonate wie Methan- und Heptansulfonat, sowie Camphersulfonsäure
verwendet
(Meyer,
1992).
Eine
50
Lösung
mit
Thiamintriphosphat,
Schrifttum
Thiamindiphosphat, Thiaminmonophosphat und Thiamin würde auch in dieser
Reihenfolge, d.h. die Thiaminphosphate mit den meisten Phosphatgruppen
zuerst, eluiert. In nicht ausreichend aufgereinigten Probenlösungen werden
daher die Thiaminphosphate häufig von Störpeaks überdeckt. Eine Alternative
zu den C-18 Phasen stellen die Amid-C-16 Phasen dar, bei denen in die
Kohlenstoffkette eine Amidgruppe eingebunden ist. Ein Vergleich der Trennung
von Thiamin und Thiaminderivaten auf der C-18 Phase mit Ionenpaarbildung
und der Amid-C-16 Phase ergab, dass bei letzterer auf Ionenpaarreagenzien
verzichtet werden kann und die Trennung insgesamt besser ist (Viñas et al.,
2001). In der Thiaminanalytik wird daher diese Phase in jüngerer Zeit ebenfalls
genutzt (Batifoulier et al., 2005; Viñas et al., 2003b; Viñas et al., 2003a). Die
Elutionsreihenfolge entspricht der der C-18 Phasen, so dass der Nachweis von
Thiaminphosphaten durch Störpeaks ebenfalls erschwert ist. In der Literatur
konnten zudem keine Hinweise auf einen erfolgreichen Nachweis von
Thiamintriphosphat gefunden werden.
Ein Problem der auf Silicagel basierenden Phase ist deren geringe Stabilität bei
Werten unter pH 3 oder über pH 7. Bei geringem pH-Wert erfolgt eine saure
Hydrolyse der gebundenen funktionellen Gruppen und bei hohen pH-Werten
eine Auflösung der Silicapartikel. Gerade höhere pH-Werte des Eluenten
verbessern nicht nur die Retentionszeiten (Viñas et al., 2001), sondern erhöhen
auch die Fluoreszenz der Thiochrome, deren Maximum über pH 8 liegt (Ishii et
al., 1979). Um Eluenten mit höheren pH-Werten nutzen zu können werden daher
auch Poly- (Styrol-Divinylbenzol), kurz PRP-Phasen eingesetzt (Bettendorff et
al., 1986; Bettendorff et al., 1991; Bontemps et al., 1984a). Diese Phasen sind
stabil zwischen pH 1 bis 13 und können als Umkehr- oder Normalphasen
verwendet werden (Meyer, 1992). Daher erfolgt eine Trennung entweder wie bei
den C-18 Phasen (TTP, TDP, TMP, T) oder umgekehrt wie bei den NH2-Phasen
(T, TMP, TDP, TTP).
51
Schrifttum
Aufgrund des ionischen Charakters der Thiamine und seiner Phosphatester
können ebenfalls hydrophile Phasen wie Silicaphasen mit funktionellen NH2Gruppen (Baines, 1985; Botticher und Botticher, 1986; Ishii et al., 1979; LaschiLoquerie et al., 1992; Tallaksen et al., 1991) für eine Trennung genutzt werden,
wobei eine Umkehr der Elutionsreihenfolge erreicht wird. Soll das
Vorhandensein von Thiaminphosphaten in Proben bestimmt werden ist diese
Elutionseihenfolge (T, TMP, TDP, TTP) von Vorteil, da Thiaminphosphate
nicht von Störsubstanzen überdeckt werden und auch nicht die Gefahr besteht,
dass Thiaminphosphate überhaupt nicht auf der Säule retardiert werden.
Obwohl viele Ansätze für eine Trennung des Thiamins und seiner
Thiaminphosphate existieren, konnte bislang durch keine Methode eine gute
Trennung aus komplizierten Probenmatrices erreicht werden.
An die Trennung der Analyten schließt sich eine geeignete Detektionsmethode
an.
Dabei
werden
vor
allem
UV-spektroskopische
Verfahren
und
Fluoreszenzspektroskopie genutzt. Der Vollständigkeit halber sei erwähnt, dass
sich auch andere Verfahren wie zum Beispiel die elektrochemische Detektion
(Li et al., 2005) oder die Fourier-transformierte Infrarot-Detektion (Li und
Brown, 2003) für Thiamin anwenden lassen.
Die
Vorteile
des
UV-Detektors
sind
ein
großer
linearer
Bereich,
Unempfindlichkeit gegenüber Temperaturschwankungen und die Möglichkeit
zum Einsatz bei Gradientenelution. Er registriert Substanzen die ultraviolettes
Licht absorbieren (Meyer, 1992). Die Absorptionsmaxima liegen für Thiamin
bei einer Wellenlänge von 247 nm bei pH 3 und von 235 nm und 267 nm bei
pH 5 (Egi und Kawasaki, 2003), die mit UV-Spektroskopie (Degiuseppe und
Rindi, 1958; Gennaro, 1991; Kim et al., 2002) oder Photodioden-Array (Viñas
et al., 2001) messbar sind. Mit letzterem können ganze Spektren aufgenommen
werden, die anschließend elektronisch weiter verarbeitet werden. Mit diesem
Detektor können hohe Empfindlichkeiten für Thiamindiphosphat von 5 ng/mL
erreicht werden (Viñas et al., 2001). Sehr verbreitet ist die Erfassung der
52
Schrifttum
Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzdetektor (Abdel-Kader, 1992; Alyabis und
Simpson, 1993; Baines, 1985; Batifoulier et al., 2005; Bettendorff et al., 1986;
Bettendorff et al., 1991; Bontemps et al., 1984b; Bontemps et al., 1984a;
Botticher und Botticher, 1986; Brunnekreeft et al., 1989; Burch et al., 1952;
Chase et al., 1993; Herve et al., 1994; Ichinose und Mitsui, 1988; Ishii et al.,
1979; Iwata et al., 1988; Kimura und Itokawa, 1983; Kimura und Itokawa, 1985;
Laschi-Loquerie et al., 1992; Losa et al., 2005; Ndwa et al., 2000; Rettenmaier
et al., 1979; Sanchez-Machado et al., 2004; Sander et al., 1991; Sanemori et al.,
1980; Schrijver et al., 1982; Tallaksen et al., 1991; Vanderslice und Huang,
1986; Viñas et al., 2003b) da dessen Empfindlichkeit 103 mal höher sein kann,
als bei einem UV-Detektor. Hierbei wird die fluoreszierende Substanz in der
Probe mit einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt und das emittierte Licht bei
einer spezifischen Wellenlänge gemessen (Meyer, 1992).
Thiamin und dessen Phosphatester besitzen keine natürliche Fluoreszenz, daher
müssen sie in fluoreszierende Verbindungen umgewandelt werden. Dies
geschieht durch eine alkalische Oxidation, die durch Oxidationsmittel wie
Bromcyan (BrCN) oder Kaliumhexacyanoferrat K3Fe(CN)6 katalysiert wird.
Durch die Bildung eines substituierten Ringsystems hat das gebildete
Thiochrom fluoreszierende Eigenschaften im alkalischen Milieu (Abbildung 5).
Das Exitationsmaximum liegt bei allen Derivaten bei 375 nm und das
Fluoreszenzmaximum zwischen 432 nm und 435 nm. Im Gegensatz zum nicht
derivatisierten Thiamin und seiner Phosphatester sind die Thiochrome im
alkalischen Milieu stabil. Die Stabilität wird durch Lichtausschluss und niedrige
Temperaturen verbessert (Kawasaki und Egi, 2000b).
53
Schrifttum
Abbildung 5: Thiochrom-Reaktion
H
H
C
N
N
H3C
N
CH3
+
NH2
alkalische
Oxidation
S
C C OH
H3C
CH3
N
N
H H
N
N
H H
H H
S
C C OH
H H
Thiamin
Thiochrom
Für die Thiochrom-Reaktion wurden am häufigsten Quecksilberchlorid (HgCl2)
(Laschi-Loquerie et al., 1992; Ratanaubolchai et al., 1981; Ratanaubolchai et al.,
1980; Ratanaubolchai und Panijpan, 1979), Kaliumhexacyanoferrat, K3Fe(CN)6,
(Abdel-Kader, 1992; Alyabis und Simpson, 1993; Baines, 1985; Batifoulier et
al., 2005; Bettendorff et al., 1986; Bettendorff et al., 1991; Bontemps et al.,
1984b; Bontemps et al., 1984a; Botticher und Botticher, 1986; Brunnekreeft et
al., 1989; Burch et al., 1952; Chase et al., 1993; Herve et al., 1994; Kimura und
Itokawa, 1983; Kimura und Itokawa, 1985; Losa et al., 2005; Ratanaubolchai et
al., 1981; Ratanaubolchai et al., 1980; Ratanaubolchai und Panijpan, 1979;
Rettenmaier et al., 1979; Sanchez-Machado et al., 2004; Sander et al., 1991;
Schrijver et al., 1982; Vanderslice und Huang, 1986; Viñas et al., 2003b) und
Bromcyan (BrCN) (Ishii et al., 1979; Iwata et al., 1988; Ratanaubolchai et al.,
1981; Ratanaubolchai et al., 1980; Ratanaubolchai und Panijpan, 1979;
Rettenmaier et al., 1979; Sanemori et al., 1980; Tallaksen et al., 1991)
verwendet. Kaliumhexacyanoferrat wurde demnach am häufigsten genutzt, ist
aber Studien zufolge nicht das beste oxidierende Reagenz. Ratanaubolchai
untersuchte
die
oxidierende
Wirkung
von
Quecksilberchlorid,
Kaliumhexacyanoferrat und Bromcyan in Pflanzenproben (Ratanaubolchai et
al., 1980), in biologischen Proben (Ratanaubolchai et al., 1981) und in
Urinproben (Ratanaubolchai und Panijpan, 1979) und fand heraus, dass
Bromcyan sich am besten für die alkalische Oxidation von Thiamin zu
Thiochrom eignete. Offenbar werden von diesem mehr Thiamine zu
Thiochromen oxidiert und außerdem scheint es, aufgrund des abweichenden
Reaktionsmechanismus, eine höhere Selektivität als die beiden anderen
54
Schrifttum
Reagenzien zu besitzen. Daher werden unerwünschte Substrate in Proben, wie
zum Beispiel N-Methylnicotinamid, von Bromcyan nicht zu fluoreszierenden
Verbindungen
umgesetzt.
Dies
könnte
auch
erklären
wieso
die
Wiederfindungsrate bei Verwendung von Kaliumhexacyanoferrat oft höher ist
als 100 %. Außerdem wies Morita darauf hin, dass K3Fe(CN)6 ebenfalls das im
Muskel vorkommende 2-(1-Hydroxyethyl)-Thiamin zu einer fluoreszierenden
Verbindung umsetzen könnte (Morita et al., 1969). Eine Analyse unerwünschter
Derivate und deren Beeinflussung der Thiochromoxidation wurde von
Ratanaubolchai et al. präsentiert (Ratanaubolchai et al., 1981).
2.6.2 Elementanalyse mit Atomabsorptionsspektrometrie (AAS)
Bei der Elementanalytik müssen Kontaminationen und Absorptionsverluste
berücksichtigt werden. Daher werden Kalibrier- und Probenlösungen in
geeigneten Behältern und bei geeignetem pH-Wert gelagert. Alle Geräte sollten
mit mindestens 0,1 molarer Salpetersäurelösung ausgekocht oder ausgespült
werden und zum Reinigen und Ansetzen von Lösungen sollte mindestens
zweifach destilliertes Wasser verwendet werden, damit Kontaminationen durch
andere
Elemente
kontrolliert
werden
können.
Aufgrund
der
Kontaminationsgefahr, sollte die Verwendung von Metall- und Glasgeräten
vermieden werden. Alle Chemikalien sollten zumindest analytische Reinheit
haben, wobei eine höhere Reinheit aber vor allem für die Spurenanalyse oft
notwendig ist.
Da sowohl für die Messung mit der Flammen-AAS als auch der GraphitrohrAAS möglichst reine Analysenlösungen mit gelösten Ionen benötigt werden,
werden die Proben vorher einer Veraschung unterzogen. Dabei unterscheidet
man zwischen Trocken- und Nassveraschung.
Bei ersterer werden die Proben in einem Muffelofen bei Temperaturen um die
500 °C verascht, so dass die organischen Komponenten zerstört und die
55
Schrifttum
Analyten mineralisiert werden und danach in Säure gelöst werden können.
Große Probenmengen können auf diese Art aufbereitet werden, allerdings dauert
die Aufbereitung lange und Analytverluste oder Kontaminationen können nicht
kontrolliert werden, so dass diese Art der Probenaufbereitung nicht mehr häufig
verwendet wird.
Beim oxidativen Nassaufschluss werden die Proben mit konzentrierten Säuren
versetzt und stark erhitzt. Zu den gebräuchlichsten Säuren mit hohem
oxidativem Potential gehören: Perchlorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure,
Wasserstoffperoxid und Fluorwasserstoffsäure, die auch in verschiedenen
Mischungen eingesetzt werden. In offenen Aufschlussgefäßen kann so ebenfalls
die Probenmenge reduziert und die Analyten aufkonzentriert werden. Stark
oxidierende Säuren mit einem hohen Siedepunkt wie Perchlorsäure haben
allerdings den Nachteil, dass sie auch die Lebensdauer der Analysengeräte
reduzieren.
Für einige Proben und Analyten ist ein kompletter Aufschluss nicht notwendig,
da die Analyten bei geringeren Temperaturen aus der Matrix herausgelöst
werden können.
Weitere Varianten des „klassischen“ oxidativen Nassaufschlusses sind mit
Druck oder Hochdruck kombinierte Verfahren, sowie der Mikrowellen
unterstützte Säureaufschluss. Neben diesen häufig angewendeten Verfahren gibt
es
einige
Versuche
zum
Aufschluss
mit
Veraschung
in
reiner
Sauerstoffatmosphäre, Infrarotbestrahlung, Ultraschallbehandlung und CO2Laser.
In Abhängigkeit von der Probenmatrix und den zu untersuchenden Analyten
kann sogar auf einen Aufschluss verzichtet werden und die Probe direkt oder
nach Verdünnen in einem Graphitrohr-AAS analysiert werden (Welz und
Sperling, 1999).
Bei der AAS werden Elemente analysiert, indem die licht-physikalischen
Eigenschaften der Atome ausgenutzt werden, deren Kenntnis das Verständnis
56
Schrifttum
der Funktionsweise der AAS erleichtert und daher im Folgenden in Grundzügen
erläutert wird.
Die Wellenlängen, das Linienspektrum, welche von einem angeregten Atom
eines bestimmten Elements emittiert werden, hängen von dessen atomaren
Aufbau ab. Die Elektronen eines Atoms haben, je nach ihrer Lage, eine
bestimmte Energie und können auch nur eine bestimmte Menge an zugeführter
Energie aufnehmen. Die Valenzelektronen eines Atoms sind verantwortlich für
die Spektrallinien eines Atoms, daher werden sie auch als Photoelektronen
bezeichnet. Im nicht angeregten Zustand haben sie das niedrigste mögliche
Energieniveau. Durch Zufuhr von Energie können sie in verschiedene angeregte
Zustände versetzt werden. Dieser angeregte Zustand ist instabil und die
aufgenommene Energie wird von den Elektronen in Form von Strahlungsenergie
wieder
abgegeben.
Die
Art
und
Höhe
der
Emission
folgt
den
quantenphysikalischen Gesetzmäßigkeiten und ist daher für die Elektronen nicht
willkürlich, so dass die spezifischen Spektrallinien eines Atoms entstehen.
Da die Valenzelektronen in bestimmten Grundzuständen existieren und die
Frequenz der möglichen aufgenommenen Energie exakt definiert ist, aber bei
der Anregung und Abgabe viele Möglichkeiten der Energieübertragung
bestehen, besteht das Absorptionsspektrum, das bei der Aufnahme der Energie
entsteht, aus weniger Spektrallinien als das Emissionsspektrum, das bei der
Abgabe der Energie und der Rückkehr der Elektronen in den Grundzustand
entsteht.
Im Atomisator des AAS-Gerätes wird den Molekülen in der Probe Energie
zugeführt damit sie dissoziieren, das heißt ihre Bindungsenergie überschritten
wird und sie in freier Form vorliegen. Erst in diesem Zustand können
Absorption oder Emission gemessen werden. Ist allerdings die zugeführte
Energie zu hoch, dann werden die Atome ionisiert, das heißt die
Valenzelektronen werden abgespalten. Ein unerwünschter Vorgang, weil sich
dadurch auch die Spektrallinien verändern.
57
Schrifttum
Das
Grundprinzip
der
AAS
ist
also,
dass
Licht
in
bestimmten
Frequenzbereichen von Elementen absorbiert wird und diese Abschwächung der
Lichtintensität gemessen werden kann. Als Strahlungsquelle werden bevorzugt
Hohlkathodenlampen (HCL) oder elektrodenlose Lampen (EDL), die nur
bestimmte Spekrallinien emittieren, genutzt. In Hohlkathodenlampen besteht die
Kathode aus dem zu bestimmenden Element, so dass nur Licht emittiert wird,
das für dieses Element spezifisch ist. Mit einem Monochromator kann dann eine
Wellenlänge isoliert werden.
Im Atomisator werden die Atome der Moleküle einer Probe durch Zufuhr von
Energie dissoziiert, so dass sie als freie Atome im Gaszustand vorliegen. Bei der
älteren Technik, der Flammen-AAS, geschieht dies indem ein Gemisch aus
Brenngas, Trägergas und zerstäubter Probenflüssigkeit zusammen verbrannt
werden. Das Licht der Hohlkathodenlampe strahlt durch die Flamme und wird
dabei von den dissoziierten Atomen geschwächt. Der Detektor misst die
Lichtintensität bei der für das Element spezifischen Wellenlänge.
Bei der Graphitrohr-AAS wird ein definiertes Probenvolumen, üblicherweise 10
µL bis 50 µL, in ein Rohr aus Graphit verbracht und elektrisch schnell stark
erhitzt, so dass die Probe verdampft. So können geringere Probenmengen
analysiert und höhere Temperaturen erreicht werden. In Verbindung mit einem
Magnetfeld kann durch Ausnutzung des Zeeman-Effektes sogar eine noch
höhere Empfindlichkeit erreicht werden, da durch diesen eine Korrektur der
Hintergrundabsorption möglich ist. Daher wird das Graphitrohr-AAS für die
Spurenanalyse verwendet.
Die
Konzentration
der
Probe
wird
indirekt
durch
Erstellung
einer
Kalibriergeraden im linearen Bereich ermittelt.
In bestimmten Konzentrationsbereichen gilt das Lambert-Beer’sche Gesetz. Das
bedeutet, dass sich mit steigender Konzentration in der Probe die Schwächung
(Extinktion) erhöht. Bei stark konzentrierten Lösungen wird daher ein
Extinktionsmaximum erreicht.
58
Schrifttum
Abgesehen von der Erstellung einer Kalibriergeraden durch Kalibrierlösungen,
gibt es noch die Möglichkeit der Standardaddition. Bei dieser wird den
Kalibrierlösungen bekannter Konzentration ebenfalls eine definierte Menge der
Probenlösung zugegeben. Die Konzentration der Kalibirerlösungen sollte
idealerweise ein Vielfaches der Konzentration der Probenlösung betragen, d.h.
die Intervalle sollten gleich sein. Sie wird benutzt, wenn die Zusammensetzung
der Probenlösung unbekannt ist und Störungen durch die Probenmatrix
vorhanden sind oder vermutet werden. Diese Technik ist wesentlich
zeitintensiver, da nicht nur eine Kalibriergerade für alle Probenlösungen erstellt
wird, sondern für jede Probe eine eigene (Welz und Sperling, 1999).
2.6.2.1 Calcium
Calcium war eines der ersten Elemente, welches mit Flammen-AAS gemessen
wurde. Es kann mit einem Brenngasgemisch aus Distickstoffoxid (N2O) und
Acetylen (C2H2) nahezu frei von Interferenzen bei einer Wellenlänge von 422,9
nm gemessen werden. Die Messung kann durch sehr hohe Silikon- oder
Aluminiumkonzentrationen gestört werden, wohingegen eine Ionisation durch
Zusatz von Alkalimetallen kontrolliert werden kann.
Eine Messung ist ebenso in der Flamme aus einem Gemisch aus Luft und
Acetylen möglich, wird dann aber durch Anwesenheit von Phosphaten, Sulfaten,
Aluminium und Silikon gestört. Diese können durch Zugabe von 10 g/L Lanthan
oder 10 g/L EDTA kontrolliert werden (Welz und Sperling, 1999). Die
Nachweisgrenze für die Messung von Calcium mit dem Flammen-AAS liegt bei
0,1 mg/mL.
In wässriger Lösung befindliche Calciumionen adsorbieren an Glasflächen bei
pH 1,5 über einen Zeitraum von 30 Tagen bis zu 15 %. Bei pH 11 sogar zu
85 %, so dass ein Verlust aus der Lösung bei pH 5 schon nach 24 Stunden
feststellbar ist (Welz und Sperling, 1999).
59
Schrifttum
2.6.2.2 Magnesium
Magnesium kann mit hoher Sensitivität mit dem Flammen-AAS bestimmt
werden. Die Sensitivität mit einer Flamme aus einem Gemisch aus Luft und
Acetylen ist höher, als mit einem Gemisch aus Stickstoffoxid und Acetylen,
außerdem treten aufgrund der höheren Temperatur Ionisationsstörungen von
etwa 6 % auf.
In der Flamme aus Luft und Acetylen können niedrige
Magnesiumkonzentrationen bei einer Wellenlänge von 285,2 nm und höhere
Konzentration bei 202,5 nm gemessen werden. Hohe Silikon- oder
Aluminiumkonzentrationen stören die Bestimmung, können aber durch Zusatz
von Lanthanchlorid (LaCl3) kontrolliert werden (Welz und Sperling, 1999). Die
Nachweisgrenze für die Messung von Magnesium mit dem Flammen-AAS liegt
bei 0,1 mg/mL.
An
Glasflächen
adsorbieren
Magnesiumionen
aufgrund
eines
Austauschprozesses irreversibel aus wässrigen Lösungen. Diese Verluste
betragen nach zwei Wochen etwa 43 % und sind bei pH 6 bereits nach 24
Stunden signifikant (Welz und Sperling, 1999).
2.6.2.3 Eisen
Eisen kann mit der Flammen-AAS mit einer Flamme aus einem Gemisch aus
Luft und Acetylen gemessen werden. Wird eine brennstoffarme Flamme
verwendet, dann treten kaum Interferenzen auf. Eine Signalerniedrigung kann
durch Silikon, Strontium, Aluminium, Mangan, Citronensäure und Weinsäure
hervorgerufen werden. Hohe Konzentrationen an Kobalt, Kupfer und Nickel
erniedrigen
ebenfalls
die
Empfindlichkeit.
Durch
Zugabe
von
8-
Hydroxyquinolone oder Ammoniumchlorid zur Analysenlösung können diese
Interferenzen vermindert werden. Am häufigsten wird bei einer Wellenlänge
60
Schrifttum
von 248,3 nm gemessen. Die Nachweisgrenze für die Messung von Eisen mit
dem Flammen-AAS liegt bei 5 mg/mL.
Für die Bestimmung mit dem G-AAS wird die Verwendung von
Magnesiumnitrat als Modifier und eine Verbrennungstemperatur von 1400 °C
empfohlen.
Da Eisen in größerer Konzentration im Staub vorhanden ist, muss eine
Kontamination durch entsprechende Maßnahmen verhindert werden (Welz und
Sperling, 1999).
Die Adsorptionsverluste wässriger Eisenlösungen an Glasgefäßen treten bei über
pH 1,5 auf und betragen bei pH 3,5 bereits nach 24 Stunden 34 %. Selbst bei pH
2,5 und einer Lagerung in Polyethylen- (PE-) Gefäßen können Verluste von 10
% nach 10 Tagen festgestellt werden. Die Verluste betragen dagegen in PE
Gefäßen in 0,06 mol/L HCl nur 2 % (Welz und Sperling, 1999).
2.6.2.4 Kupfer
Bei der Messung mit dem Flammen-AAS von Kupfer mit einem
Brenngasgemisch aus Luft und Acetylen treten praktisch keine Interferenzen
auf. Für niedrige Konzentrationen wird bei einer Wellenlänge von 324,8 nm
gemessen. Die Nachweisgrenze für die Messung von Kupferionen mit dem
Flammen-AAS liegt bei 1 mg/mL.
Mit Graphitrohr-AAS kann Kupfer ohne Modifier bei einer Temperatur von
1100 °C und mit Modifier bei einer Temperatur von 1300 °C gemessen werden.
Bei Temperaturen von 1100 bis 1200 °C treten am wenigsten Interferenzen auf
(Welz und Sperling, 1999).
Adsorptionseffekte und Desorptionseffekte treten bei der Lagerung von
wässrigen Kupferlösungen auf. Eine Desorption konnte für Glas-, PE-, PTFEund PFA- Gefäße festgestellt werden. Eine Lagerung sollte daher bei unter pH
61
Schrifttum
1,5 in sorgfältig gereinigten PE-, PFA- oder FEP-Gefäßen erfolgen (Welz und
Sperling, 1999).
2.6.2.5 Zink
Zink ist das Element für das mit dem Flammen-AAS die höchste
Empfindlichkeit mit einem Brenngas aus Luft und Acetylen bei einer
Wellenlänge von 213,9 nm erreicht werden kann. Sehr hohe Konzentrationen
können ebenfalls bei einer Wellenlänge von 307,6 nm bestimmt werden.
Außerdem konnten bislang in Untersuchungen keine durch Sulfate, Phosphate,
Nitrite, Nitrate, Bicarbonate, Silicate oder andere Kationen hervorgerufenen
Interferenzen festgestellt werden. Die Nachweisgrenze für die Messung von
Zinkionen mit dem Flammen-AAS liegt bei 1 mg/mL.
Die Sensitivität des Graphitrohr-AAS für Zink ist ebenfalls sehr hoch. Die
optimale Verdampfungstemperatur liegt ohne Modifier bei 1600 bis 1800 °C
und kann mit einem Palladium-Magnesium-Modifier auf 1000 °C reduziert
werden. Bei einer Wellenlänge von 213,9 nm können spektrale Interferenzen,
unter anderem von Kupfer, Tellur und Eisen hervorgerufen werden.
Ein großes Problem in der Analyse von Zink ist die Kontaminationsgefahr aus
der Umgebung oder durch nicht sorgfältig gereinigte Laborgeräte (Welz und
Sperling, 1999).
Adsorptionen aus wässrigen Lösungen treten an Glasgefäßen bei über pH 5 auf,
während dies für die Lagerung in PE-Behältnissen nicht festgestellt werden
konnte. Eine Desorption kann ebenfalls für viele Materialen und Geräte, vor
allem
Glas-
und
Polypropylengefäße,
Pipettenspitzen,
Verschlussfolie
(Parafilm®), Papiertücher und Filtermaterial festgestellt werden (Welz und
Sperling, 1999).
62
63
64
Material und Methoden
3. MATERIAL UND METHODEN
Alle untersuchten Eier waren von Hühnern der Art Gallus gallus.
Das Probenmaterial umfasste unbefruchtete, unbebrütete Eier aus dem
Supermarkt, im Folgenden als Nativei bezeichnet. Es handelte sich hierbei um
frische Eier von Hühnern aus Käfighaltung. Sie wurden nach Erwerb umgehend
bis zur weiteren Analyse bei +5 °C gelagert.
Des Weiteren wurden befruchtete, bis zu fünf und bis zu sieben Tage bebrütete,
spezifisch pathogenfreie (SPF) Eier (Valo-SPF-Ei, Lohmann Tierzucht GmbH,
Cuxhaven, Germany) untersucht. Diese wurden in der Klinik für Geflügel der
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover bei einer Temperatur von 37,8 °C
und einer Luftfeuchtigkeit von 50 % bis 60 % bebrütet. Die Bruteier wurden
nach Erhalt bei +5 °C gekühlt und noch am selben Tag untersucht.
3.1 BEHANDLUNG UND FRAKTIONSTRENNUNG DER EIER
Vor der Bestimmung des Thiamingehaltes und des Mineralstoffgehaltes, wird
das Eigelb in Plasma und Granula getrennt und einige Eigelb werden vorher
technologisch behandelt.
3.1.1 Native Eiproben
Das Ei wird seitlich aufgeschlagen und die obere Eischale vorsichtig
abgenommen. Das Eiklar wird in ein Becherglas abgegossen. Das Eigelb wird in
der Hand mit tridestilliertem Wasser vorsichtig abgespült und auf einem
Papiertuch trocken gerollt. Es wird an den Rand des Tuchs gerollt, mit einem
Spatel angestochen und der Inhalt in einem Becherglas aufgefangen, damit die
65
Material und Methoden
Eigelbmembran nicht analysiert wird. Das Eigelb wird gewogen und mit der
gleichen Gewichtsmenge tridestilliertem Wasser vermischt. Das Gemisch wird
in Reaktionsgefäße (Eppendorfcups) überführt und für 10 Minuten mit einer
Zentrifuge (3200 Eppendorf, Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH,
Wesseling-Berzdorf,
Deutschland)
bei
einer
relativen
Zentrifugationsbeschleunigung (RZB) von 8000 zentrifugiert. Der Überstand
wird als Eigelbplasma (Plasma) und das Sediment als Eigelbgranula (Granula)
weiter verwendet. Das Plasma wird vorsichtig in ein Becherglas pipettiert. Zum
Waschen werden einige Tropfen tridestilliertes Wasser auf die in den
Reaktionsgefäßen verbliebenen Granula getropft und erneut bei einer RZB von
8000 für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und
verbleibende Flüssigkeitsreste mit einem Zellstofftuch aufgesaugt.
Um Kontaminationen zu verhindern werden für die Elementanalyse alle Metallund Glasgeräte durch Plastikgeräte aus Polymethylpenten (PMP) oder
Polyethylen (PE) ersetzt.
3.1.2 Eigelbproben mit Zusatz
Da in den Eigelbproben mit Zusatz nur Mineralstoffgehalte bestimmt werden,
werden nur Bechergläser aus PMP und Geräte aus PE verwendet.
Ein Nativei wird seitlich aufgeschlagen und geöffnet, indem die obere
Schalenhälfte abgenommen wird. Das Eiklar wird vorsichtig abgegossen. Das
fast vollständig von Eiklar befreite Eigelb wird in die Hand genommen und
sorgfältig mit tridestilliertem Wasser abgespült. Das Eigelb wird auf ein
Zellstofftuch gelegt, trocken gerollt und anschließend die Eigelbmembran mit
einem Plastikspatel eingestochen, so dass der Inhalt ohne Kontakt zum Zellstoff
in ein Becherglas abgegossen werden kann. Dieser Vorgang wird mit elf
weiteren Eiern wiederholt, die alle in einem Becherglas vermischt werden. Diese
66
Material und Methoden
Sammelprobe wird für die Proben mit Ascorbinsäure und Citronensäure
verwendet.
In sechs Bechergläser werden jeweils 0,2 g Ascorbinsäure und in weitere sechs
Bechergläser 0,2 g Citronensäure eingewogen und mit jeweils 9,8 g Eigelb
vermischt. Dann werden 10 mL tridestilliertes Wasser zugegeben und erneut gut
gemischt.
Mit den sechs Proben werden jeweils sechs Reaktionsgefäße befüllt und bei
einer RZB von 8000 für 10 Minuten zentrifugiert. Die Überstände (Plasma) aus
den je sechs Reaktionsgefäßen werden in je einem Becherglas vereint und das
Sediment wird verworfen.
Für eine Blindprobe wird kein Zusatz zugemischt, sondern stattdessen 0,2 g
tridestilliertes Wasser.
Für die Proben mit Essigsäure und Weinsäure wird der gesamte Vorgang mit
zwölf neuen Eiern wiederholt.
Zu sechs Eigelbproben wird 0,75 % Phospholipase A2 zugesetzt und diese für 3
Stunden bei 60 °C inkubiert.1 Anschliessend werden diesen dieselbe
Gewichtsmenge Wasser zugesetzt und gemischt. Wie die anderen Proben
werden diese dann in Reaktionsgefäßen zentrifugiert und das Plasma in
Bechergläsern gesammelt. Das Sediment wird verworfen.
Bei den Blindproben wird das Eigelb durch Wasser ersetzt.
Bei den mit Säure versetzten Proben wird der pH-Wert gemessen.
1
Proben wurden zur Verfügung gestellt aus dem Technikum des Instituts für Chemische Analytik unter der
Leitung von Prof. Dr. W. Ternes
67
Material und Methoden
Tabelle 20: Zusammensetzung der Proben zur Mineralstoffbestimmung
Probenbezeichnung
A1, A2, A3,
A4, A5, A6
Zusatz jeweils 0,2 Eigelb
Gramm
Ascorbinsäure
9,8 Gramm
C1, C2, C3,
C4, C5, C6
Citronensäure
AC
E1, E2, E3,
E4, E5, E6
H2O, tridestilliert
Essigsäure
W1, W2, W3,
W4, W5, W6
Weinsäure
EW
AO
CO
EO
WO
H2O, tridestilliert
Ascorbinsäure
Citronensäure
Essigsäure
Weinsäure
Wasser
10 Gramm
9,8 Gramm
kein
19,8
A = mit Ascorbinsäure
C = mit Citronensäure
E = mit Essigsäure
W = mit Weinsäure
AC = Vergleichsprobe zu Proben A1-A3 und C1-C3
EW = Vergleichsprobe zu Proben E1-E3 und W1-W3
3.1.3 Gefriergetrocknete Eigelbproben mit Zusatz
Es werden 60 g Eigelb zunächst pasteurisiert und anschließend bei
-6 °C
vorgefroren. Danach wird die Probe schockgefroren und anschließend für fünf
Stunden bei -25 °C gefriergetrocknet. Durch das Vorfrieren oberhalb der
Gelbildungstemperatur wird dem pasteurisierten Eigelb die Kristallationsenergie
des
enthaltenen
Wassers
entzogen
und
anschließend
durch
ein
Doppelplattenkontaktgefrierverfahren der Temperaturbereich der Gelbildung in
wenigen Sekunden durchlaufen und damit die Gelbildung verhindert (Ternes
und Dautel, 2007).
Die Zusätze werden vor der Pasteurisation zum Eigelb hinzu gegeben. Jeweils
drei Proben enthalten als Zusatz entweder 1 % Salz, 3 % Zucker, 2 %
68
Material und Methoden
Essigsäure, 0,5 % Phospholipase A2, oder sind ohne Zusatz. Mit 0,75 %
Phospholipase A2 standen sechs Proben zur Verfügung.2
Da in den gefriergetrockneten Proben der Mineralstoffgehalt bestimmt wird,
erfolgte die Probenaufarbeitung ausschließlich in Bechergläsern aus PMP und es
werden nur Geräte aus PE verwendet.
Das gefriergetrocknete Eigelbpulver wird zunächst resuspendiert. Dazu werden
zwischen 2 g und 4 g Probe in ein Becherglas eingewogen und mit der gleichen
Gewichtsmenge tridestilliertem Wasser versetzt, da durch die Gefriertrocknung
etwa 50 % Wasser verloren gegangen sind. Nun wird die gleiche
Gewichtsmenge Wasser hinzugefügt und gut verrührt. Die Suspension wird in
Reaktionsgefäße gefüllt und bei einer RZB von 8000 für 10 Minuten
zentrifugiert. Der Überstand (Plasma) wird in einem Becherglas vereint und das
Sediment verworfen.
3.1.4 Bruteier
Das Brutei wird in einem Becherglas mit dem stumpfen Pol nach oben
aufgestellt und mit einem Spatel die Eischale angebrochen. Mit einer Pinzette
werden die Schalenfragmente entfernt, bis die Eischalenhaut sichtbar ist. Diese
wird mit tridestilliertem Wasser abgespült und danach mit einer Pinzette
entfernt. Nun wird der Embryo mit einer Pinzette entnommen und in ein
Becherglas überführt. Da die Eigelbmembran durch den Brutprozess brüchig
geworden ist, ist eine Entnahme des Eigelbs im Ganzen, wie beim Nativei, nicht
möglich. Daher wird das Eigelb vorsichtig in ein Becherglas abgeseiht und das
Eiklar in einem separaten Becherglas aufgefangen.
Durch den Flüssigkeitstransfer, der aus dem Eiklar ins Eigelb während der
Bebrütung stattfindet ist eine Wasserzugabe, um die Fraktionen bei der
2
Proben wurden zur Verfügung gestellt aus dem Technikum des Instituts für Chemische Analytik unter der
Leitung von Prof. Dr. W. Ternes
69
Material und Methoden
Zentrifugation voneinander zu trennen, nicht notwendig. Das abgeseihte
Bruteigelb wird durchmischt und in Reaktionsgefäßen für 10 Minuten bei einer
RZB von 8000 zentrifugiert. Das Sediment in den Reaktionsgefäßen wird als
Granula und der Überstand als Plasma weiter behandelt. Letzteres wird in ein
Becherglas abpipettiert. Zum Waschen werden einige Tropfen tridestilliertes
Wasser auf die in den Reaktionsgefäßen verbliebenen Granula getropft und
erneut zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und verbleibende
Flüssigkeitsreste mit einem Zellstofftuch aufgesaugt.
Für die Mineralstoffanalyse wird das Brutei mit Verschlussfolie (Parafilm®)
umwickelt, um eine Kontamination durch die Eischale beim Abseihen des
Eigelbs zu vermeiden. Alle Glas- und Metallgeräte werden durch Plastikgeräte
aus PMP oder PE ersetzt.
70
Material und Methoden
3.2 THIAMINANALYSE
3.2.1 Probenmaterial
Für die Bestimmung des Thiamins und der Thiaminphosphate wurden vor allem
Eigelbgranula und Eigelbplasma untersucht. Die Analyse des Eiklars erfolgte
ausschließlich zu Vergleichszwecken. Aufgrund des geringen Gewichtes der
Embryos wurden Sammelproben analysiert.
Tabelle 21: Proben für die Thiaminanalytik
Nativei
Brutei 5. Tag
Brutei 7. Tag
Dotierte
Proben
Fraktion
Eiklar
Eigelbplasma
Eigelbgranula
Eiklar
Eigelbplasma
Eigelbgranula
Embryo
Embryo
Eigelbplasma
Eigelbgranula
Probenanzahl
3
6
7
2
6
6
41
42
16
9
1
= vier gepoolte Proben aus jeweils vier Embryos
= zwei Sammelproben aus je zwei Embryos und zwei
Sammelproben aus je vier Embryos
2
3.2.2 Probenaufarbeitung
3.2.2.1 Ansetzen der Lösungen
• Trichloressigsäure wird als 0,4 g/L wässrige Lösung angesetzt.
• Die Bromcyanlösung hat eine Konzentration von 0,3 g/L.
• Eine Natriumhydroxid- und eine Salzsäurelösung werden mit einer
Konzentration von 1 mol/L hergestellt.
71
Material und Methoden
• Eine weitere Salzsäurelösung wird mit einer Konzentration von 5 mmol/L
angesetzt.
• Die Elutionslösung für die Festphasenextraktion wird hergestellt als 20:80
(v/v) Acetonitril: Phosphatpuffer, letzterer mit einer Konzentration von
250 mM und pH 6,4.
• Für
die
Kalibrierlösungen
wird
eine
40:60
(v/v)
Acetonitril:
Phosphatpuffer-Lösung, 110 mM, pH 6 angesetzt.
3.2.2.2 Thiaminextraktion
Die
Methode
für
die
Thiaminextraktion
wurde
im
Verlauf
des
Untersuchungszeitraumes geringfügig geändert, so dass beide verwendeten
Methoden beschrieben werden.
Einige der zu Anfang untersuchten Proben wurden, ungeachtet des
Thiamingehaltes und der Matrixbeschaffenheit, einheitlich extrahiert. Es wurden
Granula, Eiklar und Plasma untersucht.
Es wird jeweils 1 g Probe in ein Zentrifugenglas eingewogen. Die Probe wird
mit 4 mL eiskalter Trichloressigsäurelösung versetzt und mit einem Stabrührer
(Ultra-Turrax, TP 18-10, Janke-Kunkel GmbH & Co. KG-IKA Labortechnik,
Staufen, Breisgau) für 30 Sekunden homogenisiert. Am Gerät haftende
Probenreste werden mit eiskalter Trichloressigsäurelösung abgespült. Das
Zentrifugenglas wird in einer Tischzentrifuge (Hettich Universal 1200) bei einer
RZB von 1500 für 15 Minuten zentrifugiert. Währenddessen wird ein
Messkolben mit einem Trichter und Filterpapier versehen und zum Schutz vor
Licht in ein braunes Pulverglas gestellt. Der Überstand der zentrifugierten Probe
wird in den Messkolben abfiltriert. Dem, im Zentrifugenglas verbliebenen,
Sediment werden 4 mL eiskalte Trichloressigsäurelösung zugefügt und der
Extraktionsvorgang wiederholt.
Die gesamte Probenlösung wird anschließend derivatisiert.
72
Material und Methoden
Die später verwendete Extraktionsmethode berücksichtigt den erwarteten
Thiamingehalt und die Matrixbeschaffenheit, so dass sie für Granula, Plasma,
Eiklar und Embryo individuell verändert wurde.
3.2.2.3 Thiaminextraktion aus Plasmaproben
Es wird 4 g Eigelbplasma in ein Zentrifugenglas eingewogen.
Die Probe wird mit 7 mL eiskalter Trichloressigsäurelösung versetzt und 2
Minuten lang kräftig geschüttelt. Anschließend wird die Probe in einer
Tischzentrifuge bei einer RZB von 1500 für 15 Minuten zentrifugiert.
Ein 20 mL Messkolben wird mit einem Trichter und Filterpapier versehen und
zum Schutz vor Licht in ein braunes Pulverglas gestellt. Nach der Zentrifugation
wird der Überstand über den Filter in den 20 mL Kolben abgegossen. Das im
Zentrifugenglas
verbleibende
Sediment
wird
mit
6
mL
eisgekühlter
Trichloressigsäurelösung versetzt und mit einem Stabrührer 30 Sekunden
homogenisiert. Am Stabrührer verbleibende Probenreste werden mit 1 mL
eisgekühlter
Trichloressigsäurelösung
abgespült.
Danach
erfolgt
eine
Zentrifugation in der Tischzentrifuge bei einer RZB von 1500 für 15 Minuten.
Dann wird der Überstand in den 20 mL Messkolben abgegossen und das
Sediment mit 3 mL eiskalter Trichloressigsäurelösung versetzt und mit dem
Stabrührer
für
30
Sekunden
homogenisiert.
Mit
1
mL
eiskalter
Trichloressigsäurelösung werden verbleibende Reste abgewaschen. Die Probe
wird zentrifugiert und der Überstand in den 20 mL Messkolben abgegossen.
Der im Messkolben gesammelte Überstand wird mit tridestilliertem Wasser auf
20 mL aufgefüllt. Für die Derivatisierung werden 2 mL entnommen und in ein
braunes Probenglas überführt.
73
Material und Methoden
3.2.2.4 Thiaminextraktion aus Eiklarproben
In ein Zentrifugenglas werden 2 g Eiklar eingewogen. Die Probe wird mit 4 mL
eiskalter Trichloressigsäurelösung versetzt und 2 Minuten lang kräftig
geschüttelt. Danach wird die Probe in einer Tischzentrifuge bei einer RZB von
1500 für 15 Minuten zentrifugiert. Ein 10 mL Messkolben wird mit einem
Trichter und einem Filterpapier versehen und zum Schutz vor Licht in ein
braunes Pulverglas gestellt. Der Überstand der zentrifugierten Probe wird in den
Messkolben
abgegossen,
das
Sediment
mit
3
mL
eiskalter
Trichloressigsäurelösung versetzt und mit einem Stabrührer für 30 Sekunden
homogenisiert. Am Stabrührer verbleibendes Probenmaterial wird mit 1 mL
eiskalter Trichloressigsäurelösung abgewaschen. Die Probe wird bei einer RZB
von 1500 für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand in den 10 mL
Messkolben abgegossen. Das Sediment wird verworfen und der 10 mL
Messkolben mit tridestilliertem Wasser aufgefüllt. Die gesamten 10 mL werden
für die Derivatisierung in ein braunes Probenglas überführt.
3.2.2.5 Thiaminextraktion aus Granulaproben
Aus den Reaktionsgefäßen (siehe 3.1) wird das Sediment entnommen und in ein
Zentrifugenglas etwa 1 g eingewogen. Dazu werden 4 mL eiskalte
Trichloressigsäurelösung pipettiert und solange kräftig geschüttelt bis die
Granula und die Säure vermischt sind. Das Zentrifugenglas wird in einer
Tischzentrifuge bei einer RZB von 1500 für 15 Minuten zentrifugiert. Der
Überstand wird über einen Trichter mit Papierfilter in einen 10 mL Messkolben
abgegossen und dieser zum Schutz vor Licht in ein braunes Pulverglas gestellt.
Das Sediment wird mit 3 mL eiskalter Trichloressigsäurelösung versetzt und mit
einem Stabrührer für 30 Sekunden homogenisiert. Reste am Stabrührer werden
mit 1 mL eiskalter Trichloressigsäurelösung abgewaschen. Es folgt eine
74
Material und Methoden
Zentrifugation bei einer RZB von 1500 für 15 Minuten. Der Überstand wird in
den 10 mL Messkolben abgegossen und das Sediment verworfen.
Der 10 mL Messkolben wird mit tridestilliertem Wasser aufgefüllt und für die
Derivatisierung 5 mL Probenlösung in ein braunes Probenglas überführt.
3.2.2.6 Thiaminextraktion aus Embryoproben
Jeweils zwei bis vier Embryos werden mit tridestilliertem Wasser abgespült, mit
einer Pinzette in ein Zentrifugenglas eingewogen, mit 3 mL eiskalter
Trichloressigsäurelösung versetzt und mit einem Stabrührer 30 Sekunden lang
homogenisiert. Am Gerät verbleibende Probenreste werden mit 1 mL eiskalter
Trichloressigsäurelösung abgewaschen. Das Zentrifugenglas wird in einer
Tischzentrifuge bei einer RZB von 1500 für 15 Minuten zentrifugiert.
Anschließend wird der Überstand über einen Trichter mit Filterpapier in einen
10 mL Messkolben abfiltriert und der Kolben zum Schutz vor Lichteinfall in ein
braunes Pulverglas gestellt. Das Sediment wird mit 3 mL eiskalter
Trichloressigsäurelösung versetzt und mit einem Stabrührer für 30 Sekunden
homogenisiert.
Reste
am
Stabrührer
werden
mit
1
mL
eiskalter
Trichloressigsäurelösung abgewaschen. Es folgt eine Zentrifugation bei einer
RZB von 1500 für 15 Minuten. Der Überstand wird in den 10 mL Messkolben
abgegossen und das Sediment verworfen.
Der 10 mL Messkolben wird mit tridestilliertem Wasser aufgefüllt und für die
Derivatisierung die gesamten 10 mL in ein braunes Probenglas überführt.
75
Material und Methoden
3.2.2.7 Derivatisierung
Für die Derivatisierung wird die Probe mit 0,5 mL Bromcyanlösung versetzt und
anschließend mit einer 1 molaren NaOH-Lösung auf pH 10 eingestellt. Die
Probe wird für eine Reaktionszeit von 20 Minuten im Dunkeln gelagert.
3.2.2.8 Festphasenextraktion
Mit einer 1 molaren HCl-Lösung und einer 1 molaren NaOH-Lösung wird die
Probenlösung auf pH 7 eingestellt. Für die Festphasenextraktion werden die
Ventile der Unterdruckkammer erst mit tridestilliertem Wasser gereinigt und
anschließend mit Luft getrocknet. Die C-18 und die SAX-Festphasensäulen
werden erst mit 5 mL Methanol und dann mit 5 mL tridestilliertem Wasser
konditioniert. Die beiden Säulen werden durch ein Verbindungsstück verbunden
und auf ein Ventil der Festphasenkammer gesteckt. Die Probe wird in die obere
C-18 Säule pipettiert und der Durchfluss in einem Becherglas aufgefangen. Die
Säulen werden auf das nächste Ventil gesteckt, mit 5 mL tridestilliertem Wasser
gewaschen und die Waschlösung in einem Reagenzglas aufgefangen. Für die
Elution werden die Säulen auf das nächste Ventil gesteckt und 4 mL
Elutionslösung langsam durch die Säulen in einen 5 mL Glaskolben getropft.
Für ein weiteres Eluat wird die Säulenkombination auf das nächste Ventil
gesteckt und der Vorgang wiederholt.
Die Glaskolben mit dem 1. und 2. Eluat werden mit tridestilliertem Wasser auf 5
mL aufgefüllt und analysiert.
76
Material und Methoden
3.2.2.9 Dotierung
Für die Bestimmung der Wiederfindungsrate werden 16 Plasmaproben und 9
Granulaproben mit jeweils 840 ng TMP und 1374 ng TDP vor der Extraktion
dotiert.
3.2.3 Trennung und Analyse
3.2.3.1 Ansetzen der Kalibrierlösungen
Es werden zunächst Stammlösungen mit 1,1 mg/mL Thiamin, 1,4 mg/mL
Thiaminmonophosphat und 2,29 mg/mL Thiamindiphosphat hergestellt, die in
etwa 0,5 mL Portionen geteilt und in braunen Probenflaschen bei -20 °C
gelagert werden. Durch Auftauen der Stammlösung bei Raumtemperatur werden
jeden Tag frische Kalibrierlösungen erstellt. Die Stammlösungen werden auf
1100 ng/mL für Thiamin, 2800 ng/mL für Thiaminmonophosphat und 4580
ng/mL für Thiamindiphosphat verdünnt. Es werden jeweils 400 µL, zusammen
mit 200 µL BrCN-Lösung und 200 µL 1 molarer NaOH-Lösung in einen 5 mL
Kolben pipettiert und nach 30 Minuten Reaktionszeit mit Elutionslösung
aufgefüllt. Durch Verdünnen wird eine Kalibrationsreihe erstellt.
Zum Überprüfen der Retentionszeit von Thiamintriphosphat wurde aus einer
1000 mg/L Stammlösung eine Lösung mit einer Konzentration von 600 ng/mL
hergestellt.
3.2.3.2 Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Die
Trennung
erfolgte
anfänglich
mit
einer
isokratischen
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), wurde aber, um eine bessere
77
Material und Methoden
Trennung zu erzielen, später auf ein Gradientensystem umgestellt. Die Analyse
erfolgte mit einem Fluoreszenzdetektor.
Isokratisches System:
-
Eluent: 40:60 (v/v) Acetonitril: Phosphatpuffer, 75mM pH (6,5) 7
-
Probenschleife: Knauer 20 µL
-
Pumpe: Knauer HPLC Pump 64
-
Vorsäule:
Knauer Eurospher-100 C-8, 30 mm x 4,6 mm
-
Säulen:
1. Knauer: Europher-100 C-8, 250 mm x 4 mm, 5 µm Ø
2. LiChrospher-100 NH2, 250 mm x 4 mm, 5 µm Ø
-
Fluoreszenzdetektor: Perkin-Elmer LC 240
-
Computersystem: Intel Pentium III mit 751 MHz, 256 MB RAM, Betriebssystem:
Windows XP Professionell Version 2002, Programm: Knauer Eurochrom 2000,
Drucker: HP Laserjet 1010
Die Analyse wurde mit einer Flussrate von 0,7 mL/min über 30 Minuten
durchgeführt.
Gradientensystem:
-
Eluent A: 37:63 (v/v) Acetonitril:Phosphat-Puffer; 65mM, pH (6,5) 7,15
-
Eluent B: 40:60 (v/v) Acetonitril:Phosphat-Puffer; 110mM, pH (6,5) 7,25
-
Probenschleife: Knauer 20 µL
-
Pumpe: Knauer HPLC Pump 64
-
Vorsäule:
Knauer Eurospher-100 C-8, 30 mm x 4,6 mm,
-
Säulen:
1. Knauer: Europher-100 C-8, 250 mm x 4 mm, 5 µm Ø
2. Alltech-Grom Saphir 110 NH2, 150 mm x 4 mm, 5 µm Ø
-
Fluoreszenzdetektor: Perkin-Elmer LC 240
-
Computersystem: Intel Pentium III mit 751 MHz, 256 MB RAM, Betriebssystem:
Windows XP Professionell Version 2002, Programm: Knauer Eurochrom 2000,
Drucker: HP Laserjet 1010
Die Zusammensetzung der Eluenten, während eines Analysenlaufes, ist in
Tabelle 22 dargestellt.
78
Material und Methoden
Tabelle 22: Gradientensystem
Zeit
hh:mm:ss
00:00:00
00:08:00
00:31:00
00:45:00
Fluss
mL/min
0,7
0,7
0,7
0,0
Eluent A
%
97
3
97
97
Eluent B
%
3
97
3
3
Die Excitation erfolgt bei beiden Systemen bei einer Wellenlänge von 375 nm
und die Emmision bei einer Wellenlänge von 450 nm.
Die Probenlösung wird mit einer 200 µL Probenspritze aufgezogen und zweimal
verworfen. Beim dritten Mal wird die 20 µL Probenschleife befüllt und die
Analyse über die Steuerungssoftware gestartet und nach dem Probenlauf mit
dieser ausgewertet.
3.3 MINERALSTOFFANALYSE
3.3.1 Chemikalien und Gerätschaften
Alle verwendeten Glas-, PMP- und PE-Gefäße und Geräte wurden entweder mit
0,2 g/L Salpetersäurelösung (HNO3-Lösung) ausgekocht, oder über Nacht in 1
g/L HNO3-Lösung stehen gelassen und anschließend mit tridestilliertem Wasser
ausgespült. Alle gespülten Gefäße und Geräte wurden trocken und staubfrei
gelagert.
3.3.2 Probenmaterial
Für die Mineralstoffanalyse wurden die in Tabelle 24 dargestellten Proben
untersucht. Alle Proben, die aufgrund ihres niedrigen Gehaltes des
79
Material und Methoden
entsprechenden Elements nicht mit Flammen-AAS untersucht werden konnten,
wurden mit Graphitrohr-AAS untersucht.
Tabelle 23: Analysenplan für die Mineralstoffbestimmung mit F-AAS und G-AAS
______
Nativei
Granula
Plasma
Eiklar
Granula
Plasma
Eiklar
Plasma
Brutei 5.Tag
Gefrierproben
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
-
F-AAS
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
Mg2+
-
______
Zn2+
Zn2+
Zn2+
Zn2+
Zn2+
Zn2+
Zn2+
_____
Cu2+
Cu2+
Cu2+
Cu2+
Cu2+
Cu2+
Cu2+
_____
G-AAS
Fe2+/ Fe3+
Fe2+/ Fe3+
Fe2+/ Fe3+
Fe2+/ Fe3+
Fe2+/ Fe3+
Fe2+/ Fe3+
Fe2+/ Fe3+
Probenumfang
6
6
6
6
6
6
211
1
= Drei gefriergetrocknete Proben enthalten als Zusatz entweder 1 % Salz, 3 % Zucker, 2 % Essigsäure, 0,5
% Phospholipase A2, oder keinen Zusatz. Sechs Proben mit 0,75 % Phospholipase A2 wurden untersucht,
drei davon mit ICP-OES.
Tabelle 24: Analysenplan für die Mineralstoffbestimmung mit G-AAS und ICP-OES
______
Proben mit
Zusatz,
Plasma
Ascorbinsäure
Citronensäure
Essigsäure
Weinsäure
PLA A2
G-AAS______
Cu2+
Fe2+/ Fe3+
n=3
n=3
n=3
n=3
-
______
ICP-OES______
Cu2+
Fe2+/ Fe3+
n=3
n=3
n=3
n=3
n=6
Probenumfang
6
6
6
6
6
3.3.3 Säureaufschluss
Die Granula-, Plasma- und Eiklarproben werden wie unter 3.1.1, 3.1.2 und 3.1.3
dargestellt gewonnen.
Die Granula in den Reaktionsgefäßen werden über Nacht im Trockenschrank bei
103 ± 2 °C
getrocknet. Mit einem Plastikspatel wird die trockene
Granulafraktion in den Reaktionsgefäßen zerkleinert und etwa 1 g in ein
Teflongefäß eingewogen.
Von Plasma und Eiklar werden jeweils 2 g Probe in ein Teflongefäß
eingewogen. Zur Probe wird 500 µL suprapure, konzentrierte Salpetersäure
pipettiert und das Teflongefäß in einem Heizblock für 6 Stunden bei 60 °C
80
Material und Methoden
erhitzt. Danach werden 600 µL suprapure, konzentrierte Salpetersäure und 400
µL suprapure, konzentrierte Perchlorsäure zupipettiert und die Temperatur jede
halbe Stunde um 10 °C erhöht bis eine Temperatur von 130 °C erreicht ist.
Diese Temperatur wird 8 Stunden gehalten. Nach vier Stunden werden
nochmals 400 µL suprapure, konzentrierte Perchlorsäure und 600 µL suprapure,
konzentrierte Salpetersäure zupipettiert.
Die klaren fast vollständig verdampften Proben werden in 10 mL oder 5 mL
Messkolben überführt und mit tridestilliertem Wasser bis zur Marke aufgefüllt.
Die Lösung wird in PE-Gefäße überführt und bis zur weiteren Untersuchung bei
+ 5 °C gelagert.
3.3.4 Analyse mit Flammen-Atomabsorptionsspektrometrie
Der Gehalt der Mineralstoffe in den Proben wurde mit externer und interner
Kalibrierung bestimmt, um einen Matrixeffekt abschätzen zu können. Das
Verfahren ist für jedes Element gleich, variiert werden lediglich die
Konzentration
der
Matrixmodifiers.
Standardlösungen
Durch
ein
und
Screening
die
wurde
Art
der
und
zu
Menge
des
erwartende
Konzentrationsbereich ermittelt und der Ansatz der Kalibrierlösungen angepasst,
so dass bei möglichst hoher Konzentration im linearen Bereich gearbeitet wurde.
81
Material und Methoden
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Kalibrierverfahren
3.3.4.1 Apparatur
Die
Analyse
der
Lösungen
wird
mit
einem
Flammen-
Atomabsorptionsspektrometer (PU 9100x, Philips) an dem ein Schreiber
(Kompensograph III, Siemens) angeschlossen ist durchgeführt. Für die Analyse
werden Hohlkathodenlampen (LOT-Oriel GmbH & Co. KG, Darmstadt,
Deutschland)
verwendet.
Die
aufgezeichneten
Peaks
wurden
manuell
ausgemessen und mit einer am Computer erstellten Kalibriergeraden
ausgewertet.
82
Material und Methoden
3.3.4.2 Ansetzen der Lösungen
Mit tridestilliertem Wasser und suprapurer, konzentrierter Salpetersäure wird
eine 0,2 % ige HNO3-Lösung angesetzt.
Als Modifier werden durch Lösen in tridestilliertem Wasser eine 10 % ige
Lanthanchloridlösung und eine 5 % ige Kaliumchloridlösung hergestellt.
Die 1000 mg Calcium-, Eisen-, Zink-, Magnesium- und Kupferstandards werden
gemäß den Herstellerangaben zu 1000 mg/L Stammlösungen verdünnt.
3.3.4.3 Bestimmung von Calcium in Granula, Plasma und Eiklar
Für die Bestimmung des Calciumgehaltes in den Granula wird die 1000 mg/L
Calciumstammlösung mit 0,2 % iger HNO3-Lösung zu einer 100 mg/L Lösung
verdünnt. Für die externe Kalibrierung wird diese Lösung zu einer 10; 20; 30
und 40 mg/L Lösung verdünnt. Von der Probenlösung werden 0,25 mL
zusammen mit 1 mL 10 % iger Lanthanchloridlösung in einem 5 mL
Messkolben angesetzt. Für die Standardaddition werden zu 0,25 mL
aufgeschlossener Probenlösung und 1 mL der 10 % igen Lanthanchloridlösung
jeweils 1; 2; 3 und 4 mL der 100 mg/L Standardlösung in einen 10 mL
Messkolben pipettiert. Alle Kolben werden mit 0,2 % iger HNO3-Lösung
aufgefüllt.
83
Material und Methoden
Tabelle 25: Kalibrierlösungen für die Calciumbestimmung in Granulaproben
Kalibrierpunkt 1
Kalibrierpunkt 2
Kalibrierpunkt 3
Kalibrierpunkt 4
Probe
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Für
die
Messkolben
mL
10
10
10
10
10
10
10
10
10
Bestimmung
100 mg/L
Calciumlösung
mL
1
2
3
4
0
1
2
3
4
des
Konzentration
mg/L
10
20
30
40
10
20
30
40
Granula
Probenlösung
mL
0
0
0
0
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
Calciumgehaltes
10 % ige
LaCl3Lösung
mL
0
0
0
0
1
1
1
1
1
in
den
aufgeschlossenen
Plasmaproben, wird aus der Calciumstammlösung, durch Verdünnen mit 0,2 %
iger HNO3-Lösung, eine 10 mg/L Calciumlösung hergestellt. Für die externe
Kalibrierung werden Calciumlösungen mit einer Konzentration von 0,5; 1; 1,5
und 2 mg/L angesetzt. Von der Plasmaprobenlösung werden 100 µL zusammen
mit 0,5 mL einer 10 % igen Lanthanchloridlösung in einem 5 mL Messkolben
mit 0,2 % iger HNO3-Lösung verdünnt. Für die Standardaddition werden 100
µL Probenlösung mit 0,5 mL 10 % iger Lanthanchloridlösung in einem 5 mL
Kolben mit 10 mg/L Calciumlösung angesetzt, so dass eine Endkonzentration
von 0,5; 1; 1,5 und 2 mg/L erreicht wird. Das Auffüllen der Kolben erfolgt mit
0,2 % iger HNO3-Lösung.
84
Material und Methoden
Tabelle 26: Kalibrierlösungen für die Calciumbestimmung in Plasmaproben
Kalibrierpunkt 1
Kalibrierpunkt 2
Kalibrierpunkt 3
Kalibrierpunkt 4
Probe
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
10
10
10
10
5
5
5
5
5
10 mg/L
Calciumlösung
mL
0,5
1
1,5
2
0
0,25
0,5
0,75
2
Konzentration
mg/L
0,5
1
1,5
2
0,5
1
1,5
2
Plasma
Probenlösung
µL
0
0
0
0
100
100
100
100
100
10 % ige
LaCl3Lösung
mL
0
0
0
0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Für die Eiklarproben wird die aufgeschlossene Probenlösung 1:10 verdünnt und
zum Herstellen der Kalibrierlösungen eine 10 mg/L Calciumlösung verwendet.
Für die externe Kalibrierung werden Lösungen mit einer Konzentration von 1;
1,5; 2 und 2,5 mg/L hergestellt. Von der 1:10 verdünnten Eiklarprobenlösung
werden 0,1 mL und 0,5 mL 10 % ige Lanthanchloridlösung in einem 5 mL
Kolben mit 0,2 % iger HNO3-Lösung aufgefüllt. Für die Standardaddition
werden Calciumlösungen in einer Konzentration von 1; 1,5; 2 und 2,5 mg/L
zusammen mit 0,1 mL 1:10 verdünnter Eiklarprobenlösung und 0,5 mL 10 %
iger Lanthanchloridlösung in einem 5 mL Kolben hergestellt.
Alle Kolben werden mit 0,2 % iger HNO3-Lösung aufgefüllt.
Tabelle 27: Kalibrierlösungen für die Calciumbestimmung in Eiklarproben
Kalibrierpunkt 1
Kalibrierpunkt 2
Kalibrierpunkt 3
Kalibrierpunkt 4
Probe
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
10
10
10
10
5
5
5
5
5
10 mg/L
Calciumlösung
mL
1
1,5
2
2,5
0
0,5
0,75
1
1,25
Konzentration
mg/L
1
1,5
2
2,5
1
1,5
2
2,5
85
10 % ige
Eiklar
LaCl3Probenlösung 1:10 Lösung
mL
mL
0
0
0
0
0
0
0
0
0,5
0,1
0,5
0,1
0,5
0,1
0,5
0,1
0,5
0,1
Material und Methoden
Die Messung der Proben erfolgte bei einer Spaltbreite von 0,2 nm, einer
Stromstärke von 4 mA, bei einer Wellenlänge von 422,7 nm in einem
Luft:Acetylen-Gemisch 80:20.
3.3.4.4 Bestimmung von Magnesium in Granula, Plasma und Eiklar
Für die Bestimmung in den Granula wird die Magnesiumstammlösung mit 0,2
% iger HNO3-Lösung zu einer 10 mg/L Lösung verdünnt.
Die Lösungen für die externe Kalibrierung werden als 0,2; 0,6; 1 und 1,2 mg/L
Magnesiumlösungen angesetzt. Für die mit externer Kalibrierung zu messenden
Proben wird 0,1 mL der Probenlösung mit 0,5 mL 10 % iger
Lanthanchloridlösung in einem 10 mL Messkolben angesetzt. Zu den Proben für
die Standardaddition wird zusätzlich soviel 10 mg/L Magnesiumlösung
pipettiert, dass eine Endkonzentration von 0,2; 0,6; 1 und 1,2 mg/L erreicht
wird. Alle Kolben werden mit 0,2 % iger HNO3-Lösung aufgefüllt.
Tabelle 28: Kalibrierlösungen für die Magnesiumbestimmung in Granulaproben
Kalibrierpunkt 1
Kalibrierpunkt 2
Kalibrierpunkt 3
Kalibrierpunkt 4
Probe
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10 mg/L
Magnesiumlösung
mL
0,2
0,6
1
1,6
0
0,2
0,6
1
1,2
Konzentration
mg/L
0,2
0,6
1
1,6
0,2
0,6
1
1,2
Granula
Probenlösung
mL
0
0
0
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
10 % ige
LaCl3Lösung
mL
0
0
0
0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Für die externe Kalibrierung der Plasmaproben werden Magnesiumlösungen mit
einer Konzentration von 40; 80; 120; 160 µg/L angesetzt.
Für die mit externer Kalibrierung zu bestimmenden Proben werden 0,25 mL
1:10
verdünnte
Plasmaprobenlösung
86
und
0,25
mL
10
%
ige
Material und Methoden
Lanthanchloridlösung in einem 5 mL Messkolben angesetzt. Für die
Standardadditionsproben wird zusätzlich von der 10 mg/L Magnesiumlösung
soviel zugesetzt, dass eine Endkonzentration von 40; 80; 120 und 240 µg/L
erreicht wird. Alle Messkolben werden mit 0,2 % iger HNO3-Lösung aufgefüllt.
Tabelle 29: Kalibrierlösungen für die Magnesiumbestimmung in Plasmaproben
Kalibrierpunkt 1
Kalibrierpunkt 2
Kalibrierpunkt 3
Kalibrierpunkt 4
Probe
Standard-Addition 1
Standard-Addition 2
Standard-Addition 3
Standard-Addition 4
Messkolben
mL
10
10
10
10
5
5
5
5
5
10 mg/L
Magnesiumlösung
µL
40
80
120
160
0
20
40
60
80
Konzentration
µg/L
40
80
120
160
40
80
120
160
Plasma
10 % ige
ProbenLaCl3lösung 1:10 Lösung
mL
mL
0
0
0
0
0
0
0
0
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
Für die Eiklarproben werden Kalibrierlösungen mit einer Konzentration von 0,4;
0,8; 1,2 und 1,6 mg/L aus der 10 mg/L Magnesiumlösung hergestellt. Von der
aufgeschlossenen Eiklarprobenlösung wird 0,25 mL mit derselben Menge 10 %
iger Lanthanchloridlösung in einem 10 mL Messkolben angesetzt. Die Proben
für die Standardaddition werden zusätzlich mit Magnesiumlösung versetzt, so
dass eine Endkonzentration von 0,4; 0,8; 1,2 und 1,6 mg/L erreicht wird. Alle
Kolben werden mit 0,2 % iger HNO3-Lösung aufgefüllt.
87
Material und Methoden
Tabelle 30: Kalibrierlösungen für die Magnesiumbestimmung in Eiklarproben
Kalibrierpunkt 1
Kalibrierpunkt 2
Kalibrierpunkt 3
Kalibrierpunkt 4
Probe
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
10
10
10
10
5
5
5
5
5
10 mg/L
Magnesiumlösung
mL
0,4
0,8
1,2
1,6
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Konzentration
mg/L
0,4
0,8
1,2
1,6
0,4
0,8
1,2
1,6
Eiklar
Probenlösung
mL
0
0
0
0
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
10 % ige
LaCl3Lösung
mL
0
0
0
0
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
Die Messung der Proben erfolgt bei einer Spaltbreite von 0,2 nm, einer
Stromstärke von 2,8 mA, bei einer Wellenlänge von 285,2 nm in einem
Luft:Acetylen-Gemisch 80:20.
3.3.4.5 Bestimmung des Eisengehaltes in der Granulafraktion
Mit dem Flammen-AAS wurden die mit Graphitrohr-AAS ermittelten
Eisengehalte stichprobenartig überprüft.
Die Eisenstammlösung wird mit 0,2 % iger HNO3 Lösung zu einer 10 mg/L
Lösung verdünnt.
Für die externe Kalibrierung werden 0,4; 1,2; 2 und 2,8 mg/L konzentrierte
Eisenlösungen hergestellt. Die mit externer Kalibrierung zu messenden Proben
werden mit 0,5 mL aufgeschlossener Granulaprobenlösung und 1 mL 5 % iger
Kaliumchloridlösung in einem 10 mL Messkolben angesetzt. Für die
Standardadditon wird zusätzlich Eisenstandardlösung zugesetzt, so dass eine
Endkonzentration entsprechend der externen Kalibrierlösungen erreicht wird.
Alle Kolben werden mit 0,2 % iger HNO3-Lösung aufgefüllt.
88
Material und Methoden
Tabelle 31: Kalibrierlösungen für die Eisenbestimmung in Granulaproben
Kalibrierpunkt 1
Kalibrierpunkt 2
Kalibrierpunkt 3
Kalibrierpunkt 4
Probe
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
10
10
10
10
10
10
10
10
10
Konzen10 mg/L
Eisenlösung tration
mL
mg/L
0,4
0,4
1,2
1,2
2
2
2,8
2,8
0
0,4
0,4
1,2
1,2
2
2
2,8
2,8
Granula
Probenlösung
mL
0
0
0
0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
5 % ige
KClLösung
mL
0
0
0
0
1
1
1
1
1
Für die Messung wird die Spaltbreite auf 0,2 nm, die Wellenlänge auf 248,3 nm,
die Stromstärke auf 10 mA und das Luft:Acetylen-Gemisch auf 80:20
eingestellt.
3.3.4.6 Bestimmung von Zink in Granula, Plasma und Eiklar
Für die Zinkbestimmung in den Granula wird die 1000 mg/L Zinkstammlösung
auf 10 mg/L verdünnt und für die externe Kalibrierung vier weitere Lösungen
mit einer Konzentration von 1; 2; 3 und 4 mg/L hergestellt. Die
aufgeschlossenen Granulaprobenlösungen werden für die Messung mit externer
Kalibrierung 1:10 verdünnt. Für die interne Kalibrierung werden in einen 10 mL
Messkolben 1 mL Probenlösung und 1; 2; 3 und 4 mL 10 mg/L Zinklösung
angesetzt. Alle Kolben werden mit 0,2 % iger HNO3-Lösung aufgefüllt.
Tabelle 32: Standardaddition der Granulaproben für die Zinkbestimmung
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
10
10
10
10
10 mg/L
Zinklösung
mL
1
2
3
4
Konzentration
mg/L
1
2
3
4
89
Granula
Probenlösung
mL
1
1
1
1
Material und Methoden
Für die Bestimmung von Zink in den Plasmaproben werden für die externe
Kalibrierung Lösungen mit einer Konzentration von 0,1; 0,2; 0,3 und 0,4 mg/L
hergestellt und die Proben unverdünnt und in einer 1+1 Verdünnung mit 0,02 %
iger
Magnesiumnitrat-Hexahydrat-Lösung
gemessen.
Für
die
interne
Kalibrierung werden Lösungen mit einem Zinkgehalt von 0,1; 0,2; 0,3 und 0,4
mg/L und einer Probenverdünnung von 1+1 hergestellt.
Tabelle 33: Standardaddition der Plasmaproben für die Zinkbestimmung
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
2
2
2
2
2 mg/L
Zinklösung
mL
0,1
0,2
0,3
0,4
Konzentration
mg/L
0,1
0,2
0,3
0,4
Plasma
Proben- lösung
mL
1
1
1
1
Für die externe Kalibrierung für die Bestimmung der Eiklarproben wurden
Lösungen mit einer Konzentration von 0,1; 0,2; 0,3 und 0,4 mg/L aus der
Zinkstammlösung hergestellt. Die Eiklarproben werden einmal nicht verdünnt
und einmal 1+1 mit 0,02 % iger Magnesiumnitrat-Hexahydrat-Lösung verdünnt
gemessen. Die Brutei-Eiklarproben wurden nochmals 1+1 verdünnt und
gemessen.
Für die interne Kalibrierung werden in einem 2 mL Messkolben 0,25 mL Probe
und soviel einer 2 mg/L Zink-Lösung zugesetzt, so dass eine Endkonzentration
von 0,1; 0,2; 0,3 und 0,4 mg/L erreicht wird.
90
Material und Methoden
Tabelle 34: Standardaddition der Eiklarproben für die Zinkbestimmung
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
2
2
2
2
2 mg/L
ZinkLösung
mL
0,1
0,2
0,3
0,4
Konzentration
mg/L
0,1
0,2
0,3
0,4
Eiklar Probenlösung
mL
0,25
0,25
0,25
0,25
3.3.4.7 Bestimmung von Zink in gefriergetrockneten Proben
Für die externe Kalibrierung werden Lösungen mit einer Konzentration von 0,1;
0,2; 0,3 und 0,4 mg/L hergestellt und die Proben unverdünnt und in einer 1+1
Verdünnung mit 0,02 % iger Magnesiumnitrat-Hexahydrat-Lösung gemessen.
Für die Standardaddition der gefriergetrockneten Proben werden in 2 mL
Kolben 1 mL Probenlösung mit 0,1; 0,2, 0,3 und 0,4 ml einer 2 mg/L
Zinkstandardlösung angesetzt.
Tabelle 35: Standardaddition der gefriergetrockneten Plasmaproben
für die Zinkbestimmung
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
2
2
2
2
2 mg/L
ZinkLösung
mL
0,1
0,2
0,3
0,4
Konzentration
mg/L
0,1
0,2
0,3
0,4
Plasma
Probenlösung
mL
1
1
1
1
3.3.4.8 Bestimmung von Zink in nativen Eigelbproben mit Zusatz
Für die externen Kalibrierpunkte werden Zinklösungen mit einer Konzentration
von 0,1; 0,2; 0,3 und 0,4 mg/L vorbereitet. Die Proben A1, A2, A3, C1, C2, C3,
E1, E2, E3, W1, W2 und W3 werden in 1:20 Verdünnung und die Proben AC
und EW unverdünnt gemessen.
91
Material und Methoden
Für die Standardaddition werden 0,25 mL der Probenlösung der Probe A1 in
vier 5 mL Kolben mit 10 mg/L Zinkstandardlösung angesetzt, so dass eine
Endkonzentration von 0,1; 0,2; 0,3 und 0,4 mg/L erreicht wird. Für die Proben
A2, A3, E1, E2, E3 wird der Vorgang mit jeweils vier neuen Kolben wiederholt.
Für die Proben C1, C2, C3, W1, W2, W3 wird statt 0,25 mL Probenlösung 0,1
mL Probenlösung verwendet. Die Proben AC und EW werden in 2 mL Kolben
angesetzt.
Tabelle 36: Standardaddition der Proben A1-A3, C1-C3, E1-E3, W1-W3
Proben
A1, A2, A3,
E1, E2, E3
C1, C2, C3,
W1, W2, W3
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
5
5
5
5
5
5
5
5
10 mg/L
Zinklösung
mL
0,05
0,1
0,15
0,2
0,05
0,1
0,15
0,2
Konzentration
mg/L
0,1
0,2
0,3
0,4
0,1
0,2
0,3
0,4
Probenlösung
mL
0,25
0,25
0,25
0,25
0,1
0,1
0,1
0,1
Konzentration
mg/L
0,1
0,2
0,3
0,4
0,1
0,2
0,3
0,4
Probenlösung
mL
0,5
0,5
0,5
0,5
0,75
0,75
0,75
0,75
Tabelle 37: Standardaddition der Proben AC und EW
Proben
AC
EW
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Standardaddition 1
Standardaddition 2
Standardaddition 3
Standardaddition 4
Messkolben
mL
2
2
2
2
2
2
2
2
2 mg/mL
Zinklösung
mL
0,1
0,2
0,3
0,4
0,1
0,2
0,3
0,4
Die Zinklösungen werden bei einer Wellenlänge von 213,9 nm, einer Spaltbreite
von 0,2 nm, in der Luf:Acetylen Flamme 80:20, bei einer Stromstärke von 7
mA, gemessen.
92
Material und Methoden
3.3.5 Analyse mit Graphitrohr-Atomabsorptionsspektrometrie
3.3.5.1 Apparatur
Die Analyseneinheit umfasst einen Computer mit darauf installierter
Steuerungssoftware (AAWinLab 3.51, Perkin-Elmer LAS GmbH RodgauJügesheim, Deutschland), einen Autosampler (AS70 Perkin-Elmer LAS GmbH
Rodgau-Jügesheim,
Deutschland)
und
einen
Zeeman-Graphitrohr-
Atomabsorptionsspektrometer (4100ZL, Perkin-Elmer LAS GmbH RodgauJügesheim, Deutschland).
Als Strahlungsquelle wurden Hohlkathodenlampen (LOT-Oriel GmbH & Co.
KG, Darmstadt, Deutschland) verwendet.
3.3.5.2 Ansetzen der Lösungen
Konzentrierte suprapure Salpetersäure wird mit tridestilliertem Wasser zu einer
0,2 % igen Lösung verdünnt.
Der Matrixmodifier für die Kupferbestimmung wird mit 2,5 mL Palladiumnitratund 0,025 g Magnesiumnitratlösung in einem 100 mL Kolben mit 0,2 % iger
HNO3-Lösung angesetzt. Dies entspricht einer Konzentration von 0,25 mg/mL
Palladium und 0,15 mg/mL Magnesiumnitrat.
Der Modifier für die Eisenbestimmung wurde in einer Konzentration von 0,75
mg/mL Magnesiumnitrat in 0,2 % iger HNO3-Lösung angesetzt.
3.3.5.3 Kupfer
Die 1000 mg/L Kupferstammlösung wird mit 0,2 % iger HNO3-Lösung zu einer
100 µg/L Kupferlösung verdünnt und zum Erstellen der Kalibriergeraden im
93
Material und Methoden
Autosampler
platziert.
Das
Behältnis
des
Autosamplers
für
die
Verdünnungslösung wird mit 0,2 % iger HNO3-Lösung befüllt. Der KupferMatrixmodifier, sowie die zu messenden Proben werden ebenfalls in
Probengefäßen im Autosampler platziert. Die Steuerungssoftware des
Graphitrohr-AAS erstellt aus dem Kalibrierstandard, Matrixmodifier und
Verdünnungslösung Kalibrierlösungen für eine Konzentration von 25, 50, 75
und 100 µg/L.
Tabelle 38: Zusammensetzung der Lösungen für die Kupferbestimmung
100 µg/L Kalibrierpunkt
75 µg/L Kalibrierpunkt
50 µg/L Kalibrierpunkt
25 µg/L Kalibrierpunkt
Blindwert
Probe
100 µg/L
Kupferstandard
µL
20
15
10
5
-
0,2 % ige
HNO3Lösung
µL
5
10
15
20
-
Kupfermodifier
µL
20
20
20
20
20
20
Probe
µL
20
Für die Messbedingungen wurden die in der Datenbank der Steuerungssoftware
vorhandenen Standardbedingungen gewählt.
Die Kalibriergerade wird auf Linearität überprüft und dann die Proben
gemessen. Sind die Proben zu hoch konzentriert, werden sie entsprechend mit
0,2 % iger HNO3-Lösung verdünnt.
3.3.5.4 Eisen
Die 1000 mg/L Eisenstammlösung wird mit 0,2 % iger HNO3-Lösung zu einer
200 µg/L Eisenlösung verdünnt und zum Erstellen der Kalibriergeraden im
Autosampler
platziert.
Der
Autosampler
wird
mit
Probenlösungen,
Verdünnungslösung und dem Matrixmodifier für Eisen bestückt. Die
94
Material und Methoden
Steuerungssoftware
erstellt
mit
Standardlösungen,
Modifier
und
Verdünnungslösung die Kalibrierlösungen.
Tabelle 39: Zusammensetzung der Lösungen für die Eisenbestimmung
200 µg/L Kalibrierpunkt
150 µg/L Kalibrierpunkt
100 µg/L Kalibrierpunkt
50 µg/L Kalibrierpunkt
Blindprobe
Proben
200 µg/L
Eisenstandard
µL
20
15
10
5
-
0,2 % ige
HNO3Lösung
µL
5
10
15
20
-
Eisenmodifier
µL
20
20
20
20
20
20
Probe
µL
20
Für die Messbedingungen wurden die in der Datenbank der Steuerungssoftware
vorhandenen
Standardbedingungen
gewählt.
Nach
Überprüfung
der
Kalibriergerade auf Linearität wird die Analyse der Proben gestartet. Müssen
Proben verdünnt werden, so erfolgt dies durch Zugabe von 0,2 % iger HNO3Lösung.
3.3.6 Analyse mit ICP-Spektrometrie
Zum Überprüfen der mit Graphitrohr-AAS ermittelten Kupfer- und Eisenwerte,
werden weitere Proben mit einem ICP- (engl.: inductively coupled plasma)
Spektrometer gemessen. Die Proben umfassen drei Plasmaproben aus mit 0,75
% Phospholipase A2 versetzten und anschließend gefriergetrockneten
Eigelbproben, sowie 6 Plasmaproben aus mit 0,75 % Phospholipase A2
versetzten und jeweils 3 Plasmaproben aus mit 2% Ascorbinsäure,
Citronensäure,
Essigsäure
und
Weinsäure
versetzten
Eigelbs.
Die
aufgeschlossenen Probenlösungen werden der Klinik für Rinder an der
Tierärztlichen Hochschule Hannover übergeben und dort mit einem ICPSpektrometer (ICP-OES vista pro, Varian Deutschland GmbH, Darmstadt,
95
Material und Methoden
Deutschland)
gemessen.
Dort
wurden
die
Proben
mit
einer
sechs
Kalibrierpunkte umfassenden Standardaddition gemessen. Eine Verdünnung der
Proben erfolgte mit einer wässrigen Lösung aus 0,05 % Triton-X-100 und 0,5 %
Salpetersäure. Der Messbereich lag bei Kupfer zwischen 0 und 24 µmol/L und
für Eisen zwischen 0 und 54 µmol/L.
Tabelle 40: Analysenplan der mit ICP-OES gemessenen Proben
Zusatz
ohne Zusatz
0,75 % Phospholipase A2, gefriergetrocknet
0,75 % Phospholipase
2 % Ascorbinsäure
2 % Citronensäure
2 % Essigsäure
2 % Weinsäure
Probenanzahl
2
3
6
3
3
3
3
3.4 TROCKENMASSEBESTIMMUNG
Die Trockenmasse wird von allen Proben, bei denen Thiamin- oder
Mineralstoffgehalt gemessen wurde, gravimetrisch bestimmt.
3.4.1 Analyse
Eine Keramikschale wird mit Blaugel befüllt und in einem Trockenschrank bei
103 °C ± 2 °C über Nacht getrocknet und danach in den Exsikkator gestellt.
Die
Aluminiumschalen
werden
mit
Seesand
befüllt.
Zum
späteren
Durchmischen wird ein Probenfläschchen aus Glas zugefügt. Die Menge
Seesand richtet sich nach der eingesetzten Probenmenge. Pro Gramm Probe
werden etwa 15 g Seesand eingewogen. Die Schalen werden in den
Trockenschrank gestellt und über Nacht bei 103 °C ± 2 °C getrocknet.
96
Material und Methoden
Nach dem Trocknen werden die Schalen in einen mit Blaugel gefüllten
Exsikkator gestellt und eine Stunde lang auf Raumtemperatur abgekühlt. Die
Schalen werden auf einer Feinwaage gewogen. Dann wird die Probe
eingewogen und der Sand mit der Probe durchmischt und in den
Trockenschrank gestellt. Die Proben werden bei 103 °C ± 2 °C für eine Stunde
vorgetrocknet und mit dem Probenfläschchen fein vermahlen. Die endgültige
Trocknung erfolgt über Nacht bei 103 °C ± 2 °C.
Die getrockneten Proben werden in den Exsikkator gestellt und eine Stunde auf
Raumtemperatur abgekühlt und gewogen.
Die Berechnung erfolgt nach folgender Gleichung:
w = ((m – a) x 100)/m
w
= Trockenmassegehalt in g/100g
m
= Probeneinwaage
a
= durch Trocknung erfolgte Massenabnahme
Die Trockenmasse der Granula wird zusätzlich in Reaktionsgefäßen bestimmt,
da
die
in
den
Reaktionsgefäßen
getrockneten
Granula
für
die
Mineralstoffanalyse weiter verwendet wird.
Die Reaktionsgefäße werden im Trockenschrank bei 103 °C ± 2 °C über Nacht
getrocknet. Dann werden sie in einem Exsikkator für eine Stunde auf
Raumtemperatur abgekühlt und das Gewicht jedes Reaktionsgefäßes mit einer
Feinwaage bestimmt.
In die Reaktionsgefäße wird das Eigelb-Wassergemisch (siehe 3.1.1) gefüllt und
in Plasma und Granula durch Zentrifugieren für 10 min bei einer RZB von 8000
getrennt. Nach der Zentrifugation wird das Plasma in einem Becherglas
gesammelt. Die im Rektionsgefäß verbleibende Flüssigkeit wird mit einem
Zellstofftuch aufgesaugt. Die Reaktionsgefäße werden nun gewogen und das
97
Material und Methoden
Gewicht notiert. Anschließend werden sie über Nacht im Trockenschrank bei
103 °C ± 2 °C getrocknet. Im Exsikkator werden sie für eine Stunde auf
Raumtemperatur abgekühlt und dann gewogen. Die Berechnung erfolgt wie
zuvor beschrieben.
3.5 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE
3.5.1 Probenvorbereitung
Für die Rasterelektronenmikroskopie werden die Eigelbgranula wie unter 3.1.1
und 3.1.4 beschrieben aus dem Eigelb von Nativeiern und fünf Tage alten
Bruteiern präpariert und dem Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover zur weiteren Bearbeitung übergeben.
Dort erfolgt zunächst eine Vorfixation in 5 % iger Glutaraldehydlösung für 24
Stunden. Danach werden die Proben fünfmal mit 0,1 M Cacodylatpuffer gespült,
der Vorgang dauert insgesamt fünf Stunden.
Die Nachfixation erfolgt in 1 % iger Osmiumsäure für zwei Stunden. Die
Proben werden danach wieder fünfmal über einen Zeitraum von 3 Stunden mit
0,1 M Cacodylatpuffer gespült.
Zum Entwässern werden die Proben jeweils 30 min mit 30 % igem, 50 % igem,
70 % igem, zweimal 90 % igem und zweimal 100 % igem Alkohol behandelt.
Ein Tropfen der Probe wird auf einen mit einem leitfähigen Tap beklebten
Stiftprobenteller getropft und über Nacht im Exsikkator getrocknet. Die Proben
werden entnommen und sind nach dem besputtern mit Gold fertig für die
Messung.
98
Material und Methoden
3.5.2 Analyse
Die Proben werden mit einem digitalen Rasterelektronenmikroskop (Zeiss DSM
940 Digital Scanning Electron Microscope, Carl Zeiss AG, Oberkochen)
betrachtet am Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover betrachtet.
3.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte computerunterstützt mit dem
Tabellenkalkulationsprogramm Excel®.
99
100
Ergebnisse
4. ERGEBNISSE
4.1 THIAMIN
4.1.1 Thiamingehalt in Plasma und Granula nativer Eier
In Abbildung 7 ist ein Chromatogramm der Kalibrierlösung mit Thiamin (T),
Thiaminmonophosphat (TMP) und Thiamindiphosphat (TDP) dargestellt. Die
Retentionszeit von T beträgt 6 Minuten, von TMP 9 Minuten und von TDP 15
Minuten.
Wie in Abbildung 8 und Abbildung 9 dargestellt, wird in der Granula- und
Plasmafraktion des Eigelbs der Nativeier eine fluoreszierende Substanz
registriert, bei der es sich anhand der Retentionszeit um Thiamin handelt. Die
beiden Thiaminphosphate TMP und TDP konnten weder in den Plasmaproben,
noch in den Granulaproben nachgewiesen werden. Da jeweils gleiche
Probenmengen extrahiert und aufbereitet wurden, können die Chromatogramme
direkt verglichen werden. In den Plasmaproben war mehr Thiamin als in den
Granulaproben vorhanden. Durch den Extraktionsprozess und den selektiven
Nachweis der derivatisierten Analyten werden wenig unerwünschte Substanzen
in der Probenlösung registriert, die zudem gut von den Analyten getrennt sind,
obwohl es sich bei der Granulafraktion und dem Plasma um komplexe Matrices
handelt.
101
Ergebnisse
Abbildung 7: Auftrennung der Reinsubstanzen
Spannung
mV
Kalibrierlösung
180
TMP
T
8,88
6,43
130
TDP
15,50
80
30
-20
0
5
10
15
20
25
Zeit min
Von den untersuchten Proben wurde anhand einer am Computer erstellten
Kalibriergeraden der Thiamingehalt bestimmt. Mit den parallel bestimmten
Trockenmassegehalten wurde dieser auf die Trockensubstanz bezogen, da nur so
ein Vergleich der Proben untereinander oder mit Literaturdaten möglich ist. Für
die Nativeiproben lag die durchschnittliche Trockenmasse bei 22,4 % für
Plasmaproben und bei 44,1 % für Granulaproben, wobei zu berücksichtigen ist,
dass das Eigelb bei der Trennung der Fraktionen 1+1 mit Wasser verdünnt
wurde. Die Mittelwerte des Thiamingehaltes der gemessenen Proben und die
Standardabweichungen wurden in Tabelle 41 zusammengefasst. Im Plasma des
Nativeies beträgt der Thiamingehalt 3431 ± 698 ng/g und in den Granula 1522 ±
135 ng/g.
Somit konnte erstmalig gezeigt werden, dass Thiaminphosphate nicht im Eigelb
nativer Eier vorhanden sind und das Thiaminverhältnis in Plasma und Granula
nativen Eigelbs bestimmt werden. Die Thiaminkonzentration im Plasma ist mit
einem Verhältnis von 2,25:1 etwa doppelt so hoch als in der Granulafraktion.
102
Ergebnisse
Durch einen Signifikanztest (t-Test) wurde die Abweichung als hochsignifikant
(P = 0,01) bestätigt.
Tabelle 41: Thiamingehalt der Eigelbfraktionen im Nativei
Nativei
Thiamin
ng/g Tr. M.
3431 ± 698
1522 ± 135
Plasma
Granula
n= 6
n= 6
n= untersuchte Probenanzahl
Abbildung 8: Auftrennung des Nativeiplasmas
Spannung
mV
800
Plasma nativer Eier
T
6,45
700
600
500
400
300
200
100
0
-100
0
5
10
103
15
20
25
Zeit min
Ergebnisse
Abbildung 9: Autftrennung der Nativeigranula
Spannung
mV
Granula nativer Eier
800
700
600
500
400
T
300
6,43
200
100
0
-100
0
5
10
15
20
25
Zeit min
4.1.2 Thiamingehalt in Plasma und Granula 5 Tage embryonierter Eier
In dem Eigelbplasma und der Eigelbgranula fünf Tage embryonierter Eier
konnte, wie in den Proben der nativen Eier (Vergleiche 4.1.1), nur eine
fluoreszierende Substanz registriert werden, bei der es sich ebenfalls um
Thiamin handelt. Weder Thiaminmonophosphat, noch Thiamindiphosphat
waren in den Proben vorhanden. Die Chromatogramme sind in Abbildung 10
und Abbildung 11 dargestellt. Erstmalig konnte damit gezeigt werden, dass
Thiaminphosphate nicht im Eigelb embryonierter Eier vorhanden sind.
Von
allen
gemessenen
Proben
wurden
der
Mittelwert
und
die
Standardabweichung berechnet und als Gehalt in der Trockenmasse in Tabelle
42 zusammengefasst. Die Trockenmasse des Eigelbplasmas betrug 21,7 % und
die Trockenmasse in der Eigelbgranula 44,1 %, wobei zu berücksichtigen ist,
dass das Eigelb bei der Trennung der Fraktionen 1+1 mit Wasser verdünnt
wurde. Der Thiamingehalt in der Trockenmasse im Plasma beträgt 4377 ± 1074
104
Ergebnisse
ng/g und in den Granula 2132 ± 450 ng/g. Die Streuung um den Mittelwert ist in
den Proben der embryonierten Eier in beiden Fraktionen höher als in den
Fraktionen der Nativeier (Vergleiche Tabelle 41). Im Durchschnitt konnte
sowohl für die Eigelbgranula als auch das Eigelbplasma der embryonierten Eier
ein höherer Thiamingehalt festgestellt werden, als in den normalen Eiern. Das
Verhältnis des Thiamingehaltes ist mit 2,05: 1 ebenfalls zugunsten des Plasmas
verschoben. Die Abweichung im Gehalt ist mit P = 0,01 hochsignifikant.
Tabelle 42: Thiamingehalt in den Fraktionen embryonierter Eier
5 Tage embryonierte Plasma
Eier
Granula
n= untersuchte Probenanzahl
Thiamin
ng/g Tr. M.
4377 ± 1074
2132 ± 450
n= 6
n= 6
Um die Unterschiede im Thiamingehalt im Plasma und Granula von nativen,
unembryonierten, zu fünf Tage embryonierten Eiern zu verdeutlichen sind die
mittleren Gehalte und die Standardabweichung in Abbildung 12 vergleichend
dargestellt.
105
Ergebnisse
Abbildung 10: Auftrennung des Bruteiplasmas
Spannung
mV
Plasma der 5. Tage Bruteier
1100
T
6,43
900
700
500
300
100
-100
0
5
10
15
20
25
Zeit min
Abbildung 11: Auftrennung der Bruteigranula
Spannun
g mV
Granula der 5. Tage Bruteier
1100
900
700
T
6,43
500
300
100
-100
0
5
10
106
15
20
25
Zeit min
Ergebnisse
Abbildung 12: Thiamingehalt in Nativeiern und Bruteiern
Thiamingehalt
ng/g
Tr.M.
Nativei
Brutei
6000
4377 n=6
5000
3431 n=6
4000
3000
2132 n=6
1522 n=7
2000
1000
0
Plasma
Granula
Fraktionen
Ein Signifikanztest verdeutlicht die Unterschiede im Thiamingehalt von Plasma
und Granula der Nativeiproben und der Proben embryonierter Eier.
Der signifikante Unterschied in den Granulaproben kann durch Fütterung, Alter
der Hennen oder auch jahreszeitliche Schwankungen bedingt sein.
Tabelle 43: Signifikanztest zum Thiamingehalt in Plasma und Granula
F- Test
Varianzen
Plasma 0,3670667
gleich
Granula 0,0192981
ungleich
A = nicht signifikant (p > 0,05)
B = signifikant (p = 0,05)
t- test
0,0504769
0,0097824
Interpretation
A
B
4.1.3 Thiamingehalt in 5 und 7 Tage alten Embryos
Um die Trennung des Thiamins und der Thiaminphosphate zu verbessern wurde
die für die vorherigen Messungen verwendete NH2-Säule gegen eine NH2-Säule
eines anderen Herstellers ausgetauscht. Die veränderten Retentionszeiten sind in
107
Ergebnisse
Abbildung 13 dargestellt. Das Chromatogramm der Kalibrierlösung zeigt eine
bessere Trennung, wobei sich die Retentionszeiten von T auf 9 Minuten, von
TMP auf 14 Minuten und von TDP auf 24 Minuten verlängert haben. Der letzte
Peak des Chromatogramms bei einer Retentionszeit von 41 Minuten ist als
Thiamintriphosphat identifiziert worden.
Wie bereits in 4.1.1 und 4.1.2 dargestellt konnten in den Eigelbgranula und dem
Eigelbplasma der Nativeier und der embryonierten Eier keine Thiaminphosphate
nachgewiesen werden. In den 5 Tage und 7 Tage alten Embryos wurden
dagegen
Peaks
registriert,
die
in
den
Retentionszeiten
dem
Thiaminmonophosphat und dem Thiamindiphosphat der Kalibrierlösung
entsprechen.
In Abbildung 14 ist ein Chromatogramm der Probe eines 5 Tage alten Embryos
dargestellt. Bei dem schwachen Peak nach 9 Minuten handelt es sich um
Thiamin und bei dem stärkeren Peak nach 21 Minuten um Thiamindiphosphat.
Thiaminmonophosphat wurde nicht nachgewiesen. Dieses taucht erst als
schwacher Peak in den 7 Tage alten Embryoproben (Abbildung 15) nach einer
Retentionszeit von 11 Minuten auf. Außerdem konnten, wie in den 5 Tage alten
Embryos auch, Thiamin und Thiamindiphosphat nachgewiesen werden. In
keiner der Proben war Thiamintriphosphat enthalten. Erstmalig wurden damit
direkt das Vorhandensein und das Verhältnis der Thiaminphosphate in 5 und 7
Tage alten Embryos nachgewiesen. Zudem wurden die Reinsubstanzen,
inklusive Thiamintriphosphat, erstmalig vollständig getrennt und auch in den
Proben ohne Störung durch unerwünschte Peaks bestimmt.
108
Ergebnisse
Abbildung 13: Auftrennung der Reinsubstanzen
Spannung
mV
750
TDP
650
25,5
550
450
TMP
T
12,6
8,9
350
TTP
41,1
250
150
50
-50
0
10
20
30
40
Zeit min
Abbildung 14: Chromatogramm der Probe 5 Tage alter Embryos
Spannung
mV
Embryo 5. Tag
100
80
60
40
TDP
20
T
21,5
9,3
0
-20
0
10
20
109
30
40
Zeit min
Ergebnisse
Abbildung 15: Chromatogramm der Probe 7 Tage alter Embryos
Spannung
mV
Embryo 7. Tag
100
80
TDP
19,5
60
T
40
8,9
TMP
20
11,3
0
-20
0
10
20
30
40
Zeit min
Da es sich bei den gemessenen Proben um Sammelproben handelt, können die
Chromatogramme nicht direkt miteinander verglichen werden. Der Gehalt an
Thiamin, Thiaminmonophosphat und Thiamindiphosphat wurde auf die
Trockenmasse bezogen und in Tabelle 44 vergleichend dargestellt. Die
Trockenmasse betrug für 5 Tage alte Embryos durchschnittlich 6,0 % (n=12)
und für 7 Tage alte Embryos durchschnittlich 6,1 % (n=6).
In den Proben der 5 Tage alten Embryos wurde nicht in allen Proben Thiamin
gefunden. Der Thiamindiphosphatgehalt ist außerdem höher als in den Proben
der 7 Tage alten Embryos. In den Proben der 7 Tage alten Embryos wurde
neben Thiamindiphosphat auch Thiamin und in geringer Konzentration
Thiaminmonophosphat gefunden.
110
Ergebnisse
Tabelle 44: Thiamingehalte in Proben der 5 und 7 Tage alten Embryos
_______
Embryo Probe
1
2
3
4
Ø
5. Tag
Embryos
n= 4
n= 4
n= 4
n= 4
n= 16
ng/g Feuchtgewicht ________
T
TMP
TDP
1
1
517,9
1
1
528,9
1
92,9
446,9
1
55,5
408,1
1
74 ± 26
475 ± 58
7. Tag
1
n= 2
36,1
36,3
2
n= 2
48,2
12,7
3
n= 4
65,7
19,8
4
n= 4
63,5
20,6
Ø
n= 12
53 ± 14
22 ± 10
n= Anzahl Embryos pro Sammelprobe
Ø = Durchschnittlicher Gehalt und Standardabweichung
1= unter der Nachweisgrenze (siehe 4.1.4)
_____________
1547,8
924,3
1236 ± 441
ng/g Tr. M _____________
TMP
TDP
1
8632
1
8815,2
1
7448,5
1
6800,8
1
7924 ± 963
591
790,7
1077,2
1041,6
875 ± 228
594,9
208,2
325,1
337,7
367±163
T
1
1
321,6
246,3
430,7
348,0
337 ± 76
5272,5
4037,2
7060,5
5704,4
5519±1247
Um den Gehalt der Proben besser vergleichen zu können, wurden die
Thiamingehalte von ng/g in nmol/g umgerechnet und in Tabelle 45
gegenübergestellt.
Tabelle 45: Thiamingehalte in 5 und 7 Tage alten Embryos
5 Tage alte Embryos _____
T
TMP
TDP
Gesamt
Probe
nmol/g Tr. M.
1
1
1
18,74
18,74
1
1
2
19,13
19,13
1
3
4,59
16,17
20,76
1
4
2,74
14,76
17,5
Ø
19 ± 1,3
1= unter der Nachweisgrenze
_____
_____
T
Probe
1
2
3
4
Ø
1,75
2,34
3,19
3,09
7 Tage alte Embryos _____
TMP
TDP
Gesamt
nmol/g Tr. M
1,56
0,55
0,85
0,89
11,44
8,76
15,33
12,38
14,76
11,65
19,37
16,36
15,5 ± 3,2
Ein Signifikanztest der Gesamththiamingehalte in nmol ergab, dass diese nicht
signifikant voneinander abweichen. Somit ist das Verhältnis von Thiamin und
den
Thiaminphosphaten
in
7
Tage
alten
Embryos,
in
denen
Thiaminmonophosphat vorhanden ist, ein anderes als in 5 Tage alten Embryos,
in denen kein Thiaminmonophosphat nachgewiesen wurde.
111
Ergebnisse
4.1.4 Wiederfindungsrate, Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze
Die Wiederfindungsrate der dotierten Proben ist in Tabelle 46 als Mittelwert für
Plasma- und Granulaproben mit Standardabweichung angegeben.
Tabelle 46: Wiederfindungsrate
Plasma
Granula
n= Probenanzahl
TMP
%
71 ± 13
58 ± 15
TDP
%
64 ± 16
47 ± 13
n= 16
n= 9
Die Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze wurde mit der
Blindwertmethode ermittelt (Gottwald, 2004). Durch die hohe Selektivität des
Fluoreszenzdetektors
waren
Blindwerte
nicht
vom
Grundrauschen
zu
unterscheiden, so dass die Erfassungsgrenze von der mittleren Peakhöhe des
Rauschens
und
einer
Regressionsgeraden
abgeleitet
wurde.
Die
Erfassungsgrenze wird als doppelte und die Bestimmungsgrenze als dreifache
Nachweisgrenze angegeben.
Tabelle 47: Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze
Thiamin
TMP
TDP
Nachweisgrenze
ng/mL
0,3
0,5
0,9
Erfassungsgrenze
ng/mL
0,6
1,1
1,9
Bestimmungsgrenze
ng/mL
0,9
1,6
2,8
112
Ergebnisse
4.2 MINERALSTOFFE
4.2.1 Trockenmassegehalt der Proben
Die Ergebnisse der Trockenmassebestimmung für die Granulaproben sind in
Tabelle 48 dargestellt.
Tabelle 48: Trockenmassebestimmung
Granula
Nativeier
Bruteier
n = Probenanzahl
Aluminiumschalen
%
45,5 ± 2,1
n = 15
44,2 ± 2,2
n = 15
Reaktionsgefäße
%
44,1 ± 1,3
n=5
44,1 ± 1,5
n = 10
Die Trockenmasse weicht nicht voneinander ab, so dass die in den
Reaktionsgefäßen getrockneten Granula für die Mineralstoffbestimmung
verwendet werden konnte.
4.2.2 Mineralstoffgehalt in Granula nativer Eier und von Bruteiern
Soweit nicht anders angegeben, werden die mit interner Kalibrierung ermittelten
Werte dargestellt. Die Bestimmung der Gehalte mit externer Kalibrierung diente
zum Abschätzen von Matrixinterferenzen.
Die Mineralstoffgehalte für die Granula der Nativeier und 5 Tage embryonierten
Eier sind in Tabelle 49 zusammengefasst. Der Calciumgehalt und auch der
Magnesiumgehalt sind in der Granulafraktion der embryonierten Eier erhöht.
Der Eisen- und Zinkgehalt dagegen sind in den Granula embryonierter Eier
leicht erniedrigt. Der Kupfergehalt ist in den Granula der nativen und der 5 Tage
embryonierten Eier annähernd gleich. Die prozentuale Streuung der Werte liegt
zwischen 10 und 20 %.
113
Ergebnisse
Somit kann erstmalig der Mineralstoffgehalt in den Granula nativen Eigelbs mit
dem Mineralstoffgehalt in den Granula embryonierter Eier verglichen werden.
Tabelle 49: Mineralstoffgehalt in Granula nativer Eier und von Bruteiern
Calcium
Magnesium
Eisen
Zink
Kupfer
Nativeigranula*
µg/g Tr. M.
s in %
12900 ± 1400
10,6
1000 ± 120
12,3
520 ± 60
11,8
500 ± 100
19,4
9,3 ± 1,3
13,9
Granula 5 Tage embryonierter Eier*
µg/g Tr. M
s in %
14400 ± 1800
12,8
1500 ± 280
18,9
410 ± 60
14,9
450 ± 75
16,9
9,0 ± 1,0
10,6
s = Standardabweichung
* = 6 Proben
Zur Abschätzung, ob die ermittelten Werte signifikant voneinander abweichen,
wird ein t-Test durchgeführt. Zuvor werden die Werte mit dem KolmogorovSmirnov-Test auf Normalverteilung überprüft und mit einem F-Test auf
Varianzengleichheit geprüft, da dies die Vorraussetzungen für einen t-Test sind.
Tabelle 50: Signifikanztest der Mineralstoffgehalte in den Granula
F- Test
Calcium
Magnesium
Eisen
Zink
Kupfer
Varianzen
gleich
ungleich
gleich
gleich
gleich
zweiseitiger
t- Test
Interpretation
A
B
B
A
A
0,46067
0,10704
0,04254
0,00103
0,99855
0,00565
0,97413
0,08723
0,49718
0,38849
Gleich = Wert > 0,05 bedeutet Gleichheit der Varianzen
Ungleich = Wert = 0,05 bedeutet signifikante Heterogenität der Varianzen
A = nicht signifikant (p > 0,05)
B = hochsignifikant (p = 0,01)
Der t-Test ergab für Calcium, Zink und Kupfer einen Wert für p > 0,05. Das
bedeutet, dass die gemessenen Werte nicht signifikant voneinander abweichen,
sondern eine Streuung um den Mittelwert aufweisen. Für Magnesium und Eisen
ergab der t-Test einen Wert für p = 0,01. Für die gemessenen Gehalte in den
Granula der nativen Eier und der embryonierten Eier zeigt dies eine
hochsignifikante Abweichung der Werte vom Mittelwert und kann nicht als
Streuung
angesehen
werden.
Es
konnte
114
daher
eine
Erhöhung
des
Ergebnisse
Magnesiumgehaltes von 500 µg/g Tr. M. und eine Erniedrigung des
Eisengehaltes von 110 µg/g Tr. M. in den Bruteiern festgestellt werden.
Der Gehalt dieser Mineralstoffe in den Granula embryonierter Eier hat sich
möglicherweise durch Mineralstofftransfer aus anderen Kompartimenten des
Eies oder durch extraembryonalen Abbau der Granula während der Bebrütung
verändert.
4.2.3 Mineralstoffgehalt im Plasma nativer Eier und von Bruteiern
Der mittlere Mineralstoffgehalt im Eigelbplasma der Nativeier und der 5 Tage
embryonierten Eier ist in Tabelle 51 zusammenfassend dargestellt. Der Gehalt
aller gemessenen Mineralstoffe in der Trockenmasse des Plasmas embryonierter
Eier ist höher als im Plasma der Nativeier. Die prozentuale Streuung beträgt
zwischen 10 % und 90 % und ist für Calcium, Eisen und Kupfer in den
Plasmaproben embryonierter Eier höher, als im Nativei. Die Streuung ist in den
Proben, in denen nur geringe Gehalte gemessen wurden, wie Eisen, Zink und
Kupfer, besonders ausgeprägt.
Der Mineralstoffgehalt im Plasma embryonierter Eier war bislang nicht bekannt.
Durch die gleichzeitige Bestimmung des Mineralstoffgehaltes im Plasma nativer
Eier ist auch ein direkter Vergleich möglich.
115
Ergebnisse
Tabelle 51: Mineralstoffgehalt im Plasma nativer Eier und von Bruteiern
Calcium
Magnesium
Eisen
Zink
Kupfer
Nativeiplasma1
µg/g Tr. M.
s in %
a
180 ± 20
11
32,2 ± 3,8 a
12
b
4,1 ± 0,6
15
1,08 ± 0,45 a, c
41
b
0,42 ± 0,36
84
Plasma 5 Tage embryonierter Eier1
µg/g Tr. M
s in %
a
290 ± 90
30
48,8 ± 4,7 a
10
b
20,3 ± 8,4
41
2,24 ± 0,66 a, c
30
b
2,18 ± 2,03
93
c= mit externer Kalibrierung
a= mit Flammen-AAS gemessen
b= mit Graphitrohr-AAS gemessen
s = Standardabweichung
1
= 6 Proben
Nur durch einen statistischen Signifikanztest kann abgeschätzt werden,
inwieweit
die
Erhöhung
der
Mineralstoffkonzentration,
die
in
den
embryonierten Eiern vorhanden ist, durch die allgemeine Streuung der Werte
um den Mittelwert bedingt ist. Wie auch bei den Granulaproben (siehe 4.2.2)
wird zunächst mit dem Kolmogorov-Smirnoff-Test auf Normalverteilung und
mit dem F-Test auf Varianzengleichheit getestet. Es konnte für jede Messreihe
eine Normalverteilung bestätigt werden. In Tabelle 52 sind die Ergebnisse des
F-Tests und des t-Tests aufgeführt.
Tabelle 52: Signifikanztest der Mineralstoffgehalte im Plasma
F-Test
Calcium
Magnesium
Eisen
Zink
Kupfer
0,0052
0,6425
0,0001
0,4137
0,00128
A= nicht signifikant (p > 0,05)
B= signifikant (p = 0,05)
C= hochsignifikant (p = 0,01)
Varianzen
ungleich
gleich
ungleich
gleich
ungleich
einseitiger
t-Test
0,0244
0,0001
0,0060
0,0072
0,0596
Interpretation
B
C
C
C
A
Die Ergebnisse des t-Tests zeigen, dass die Erhöhung des Kupfergehaltes im
Plasma embryonierter Eier, aufgrund der hohen Schwankung der Werte um den
Mittelwert, nicht signifikant ist. Für Calcium konnte eine signifikante Erhöhung
und für Magnesium, Eisen und Zink eine hochsignifikante Erhöhung festgestellt
werden, die nicht durch die Schwankung der Werte um den Mittelwert bedingt
116
Ergebnisse
ist. Die Ursache könnte ein Mineralstofftransfer, oder der in der Literatur
angegebene extraembryonale Granulaabbau sein.
4.2.4 Kupfergehalt im Plasma von Eigelbproben mit Zusätzen
4.2.4.1 Gefriergetrocknete Proben mit Zusätzen
Die
Mineralstoffgehalte
im
Plasma
von
Eigelbproben,
die
vor
der
Gefriertrocknung mit verschiedenen Substanzen versetzt wurden, sind in
nachfolgender Tabelle zusammenfassend dargestellt. In den Proben, denen vor
der Gefriertrocknung Essigsäure und 0,75 % Phospholipase A2 zugesetzt wurde,
konnte ein höherer Kupfergehalt verzeichnet werden als in den anderen Proben.
Tabelle 53: Kupfergehalt in gefriergetrockneten Plasmaproben
Ohne
1 % Salz1
3 % Zucker1
2 % Essigsäure1
0,5 % PLA21
0,75 % PLA22
Kupfergehalt
µg/g Tr. M.
0,41 ± 0,15
0,5 ± 0,07
0,22 ± 0,15
1,42 ± 0,32
0,44 ± 0,05
1,04 ± 0,95
s in %
37
15
65
23
11
92
Probenumfang
n=3
n=3
n=3
n=3
n=3
n=6
PLA2 = Phospholipase A2
s = Standardabweichung
1
= mit G-AAS gemessen
2
= drei Proben mit G-AAS und drei Proben mit ICP-OES gemessen
In Abbildung 16 sind die Ergebnisse einander gegenübergestellt. Es ist eine
Erhöhung des Kupfergehaltes bei denen mit Essigsäure und 0,75 %
Phospholipase A2 versetzten Proben zu erkennen.
117
Ergebnisse
Abbildung 16: Kupfergehalt in gefriergetrockneten Proben mit und ohne Zusatz
Kupfergehalt
Kupfer
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
1,60
1,42
1,40
1,20
1,04
1,00
0,80
0,60
0,41
0,50
0,41
0,41
0,41 0,44
0,41
0,40
0,22
0,20
0,00
1 % Salz
3 % Zucker
2 % Essig
0,5 % PLA2
0,75 % PLA2
Der Kupfergehalt der Proben mit Zusätzen wurde mit den Proben ohne Zusatz
mit einem einseitigen t-Test verglichen, um signifikante Erhöhungen feststellen
zu können. Es wurde von einer Normalverteilung der Daten ausgegangen, aber
kein Test auf Normalverteilung durchgeführt, da nur jeweils drei Proben
vorlagen.
Die Ergebnisse (Tabelle 54) zeigen, dass bei den Proben mit Essigsäurezusatz
von einer hochsignifikanten Erhöhung des Kupfergehaltes ausgegangen werden
kann. Bei allen anderen Proben liegt eine Veränderung des Gehaltes im Bereich
der Schwankungsbreite vor.
118
Ergebnisse
Tabelle 54: Signifikanztest der Erhöhung des Kupfergehaltes
F-Test
1 % Salz
3 % Zucker
2 % Essigsäure
0,5 % PLA2
0,75 % PLA2
Varianzen
gleich
gleich
gleich
gleich
ungleich
t-Test
0,3821948
0,9589226
0,3621941
0,1738349
0,0496824
A = keine signifikante Abweichung (p > 0,05)
B = hochsignifikante Abweichung (p = 0,01)
PLA2 = Phospholipase A2
0,21636
0,09849
0,00402
0,37444
0,08541
Interpretation
A
A
B
A
A
4.2.4.2 Native Eigelbproben mit Zusätzen
Eine zusammenfassende Übersicht des Kupfergehaltes im Plasma der nicht
gefriergetrockneten Proben mit Zusätzen ist im Folgenden dargestellt.
Der Kupfergehalt in den Zusätzen war niedrig und wurde von den gemessenen
Werten abgezogen. Der Kupfergehalt in den zum Aufschluss eingesetzten
Säuren wurde ebenfalls bei der Berechnung berücksichtigt.
Die
mit
G-AAS
und
ICP-OES
ermittelten
Gehalte
sind
einander
gegenübergestellt und wurden dann zu einem Wert zusammengefasst. In den mit
Essigsäure versetzten Proben, die mit ICP-OES gemessen wurden, war der
Kupfergehalt höher, als in den Proben, die mit G-AAS gemessen wurden.
Tabelle 55: Kupfergehalt im Plasma der Nativeiproben mit und ohne Zusätzen
Kupfergehalt
Proben
ohne
Ascorbinsäure
Citronensäure
Essigsäure
Weinsäure
PLA A2
G-AAS
µg/g Tr. M.
0,15 ± 0,05
0,15 ± 0,07
0,70 ± 0,21
0,21 ± 0,02
0,84 ± 0,12
-
n=6
n=3
n=3
n=3
n=3
-
ICP
µg/g Tr. M.
0,19
0,24 ± 0,03
1,22 ± 0,08
0,94 ± 0,30
1,49 ± 0,06
0,28 ± 0,04
n=2
n=3
n=3
n=3
n=3
n=6
G-AAS + ICP
µg/g Tr. M.
0,16 ± 0,06
0,20 ± 0,07
0,96 ± 0,32
0,57 ± 0,45
1,17 ± 0,37
-
s in
%
38
36
34
78
32
14
n=8
n=6
n=6
n=6
n=6
-
s = Standardabweichung
In den nachfolgenden Abbildungen werden die Proben mit den Zusätzen und
ohne Zusätze verglichen, um einen Effekt abschätzen zu können (Abbildung 17;
119
Ergebnisse
Abbildung 18; Abbildung 19; Abbildung 20). In den ersten sechs Spalten sind
die Einzelproben und in der siebten Spalte deren Mittelwert gegen den Wert der
Vergleichsproben dargestellt.
Abbildung 17: Kupfergehalte der Ascorbinsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Ascorbinsäure
Kupfer
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus A1-A6
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,26
0,16 0,21
0,16 0,16
0,16 0,21
0,16
0,16
0,26
0,16 0,20
0,16
0,08
0,00
A1
A2
A3
A1-A3 = Messung mit G-AAS
A4
A5
A6
A4-A6 = Messung mit ICP-OES
120
AM
Ergebnisse
Abbildung 18: Kupfergehalte der Citronensäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Citronensäure
Kupfer
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus C1-C6
1,80
1,60
1,31
1,40
1,13
1,20
1,00
0,89
0,80
0,60
0,96
1,24
0,71
0,48
0,40
0,16
0,16
0,16
0,20
0,16
0,16
0,16
0,16
0,00
C1
C2
C3
C4
C1-C3 = Messung mit G-AAS
C5
C6
AM
C4-C6 = Messung mit ICP-OES
Abbildung 19: Kupfergehalte der Essigsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Essigsäure
Kupfer
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus E1-E6
1,80
1,60
1,40
1,14
1,20
1,09
1,00
0,57
0,80
0,60
0,60
0,40
0,16 0,21
0,20
0,160,18
0,16 0,22
0,16
0,16
0,16
0,16
0,00
E1
E2
E3
E4
E1-E3 = Messung mit G-AAS
E5
E6
E4-E6 = Messung mit ICP-OES
121
AM
Ergebnisse
Abbildung 20: Kupfergehalte der Weinsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Weinsäure
Kupfer
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus W1-W6
1,80
1,53
1,60
1,53
1,17
1,42
1,40
1,20
1,00
0,98
0,78
0,80
0,76
0,60
0,40
0,16
0,16
0,16
0,20
0,16
0,16
0,16
0,16
0,00
W1
W2
W3
W1-W3 = Messung mit G-AAS
W4
W5
W6
AM
W4-W6 = Messung mit ICP-OES
Abbildung 21: Kupfergehalt der Phospholipaseproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Phospholipase
Kupfer
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus P1-P6
1,80
1,60
1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,31
0,16 0,27
0,20
0,28
0,16 0,21
0,16
0,16
0,32
0,16
0,31
0,28
0,16
0,16
0,00
P1
P2
P3
P4
P5
P1-P6 = Messung mit ICP-OES
122
P6
AM
Ergebnisse
Wie den Diagrammen zu entnehmen ist, ist kein deutlicher Effekt auf den
Kupfergehalt bei den mit Ascorbinsäure versetzten Proben zu erkennen. Eine
unzweifelhafte Erhöhung um das sechsfache des ursprünglichen Wertes, ist bei
den mit Citronensäure versetzten Proben und eine Erhöhung um das siebenfache
bei denen mit Weinsäure versetzten Proben zu erkennen. Die mit G-AAS
gemessenen Werte konnten durch die Messung mit ICP-OES bestätigt werden.
Die mit G-AAS gemessenen Werte, der mit Essigsäure versetzten und der mit
Essigsäure versetzten und dann gefriergetrockneten Proben wichen mit 0,21 ±
0,02 µg/g Tr. M. und 1,42 ± 0,3 µg/g Tr. M. stark voneinander ab. Daher
wurden mit Essigsäure versetzte Proben ebenfalls mittels ICP-OES gemessen.
Der ermittelte Wert entspricht mit 0,94 ± 0,3 µg/g Tr. M. eher dem in den
gefriergetrockneten Proben von 1,42 ± 0,3 µg/g Tr. M., so dass mit der ICP-OES
die in den gefriergetrockneten Proben ermittelten Werte bestätigt wurden. Für
die Berechnung einer signifikanten Abweichung wurden sowohl die mit G-AAS
als auch die mit ICP-OES ermittelten Werte berücksichtigt.
Zur Abschätzung einer signifikanten Abweichung wird ein t-Test durchgeführt.
Zuvor
werden
die
Werte
mit
dem
Kolmogorov-Smirnov-Test
auf
Normalverteilung und mit dem F-Test auf Gleichheit der Varianzen getestet. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 56 dargestellt.
Tabelle 56: Signifikanztest der Erhöhung des Kupfergehaltes
F-Test
Varianzen
Ascorbinsäure
Citronensäure
Essigsäure
Weinsäure
PLA2
0,81941
gleich
0,00052
ungleich
0,00005
ungleich
0,00021
ungleich
0,33208
gleich
A = keine signifikante Abweichung (p > 0,05)
B = signifikante Abweichung (p = 0,05)
C = hochsignifikante Abweichung (p = 0,01)
PLA2 = Phospholipase A2
t-Test
0,18536
0,00076
0,03709
0,00050
0,00091
Interpretation
A
C
B
C
C
Bei den mit Ascorbinsäure versetzten Proben wurde keine signifikante
Abweichung festgestellt. Bei denen mit Citronensäure, Weinsäure und
123
Ergebnisse
Phospholipase A2 konnte eine hochsignifikante Erhöhung festgestellt werden.
Trotz der Abweichung im Gehalt der mit G-AAS und ICP-OES gemessenen
Essigsäureproben, konnte auch bei diesen eine signifikante Abweichung zu nicht
mit Zusätzen versehenen Proben festgestellt werden.
Der pH-Wert der Proben ist in nachfolgender Tabelle dargestellt.
Tabelle 57: pH-Werte der Proben mit Zusätzen
ohne
Ascorbinsäure
Citronensäure
Essigsäure
Weinsäure
Phospholipase A2
pH-Wert
6,0
4,4
3,5
4,1
2,7
5,9
Die veränderten pH-Werte in den mit Säuren versetzten Proben und damit
einhergehende strukturelle Veränderungen im Eigelb, könnte die Ursache für die
erhöhten Kupferwerte sein.
4.2.5 Eisengehalt im Plasma von Eigelbproben mit verschiedenen Zusätzen
4.2.5.1 Gefriergetrocknete Proben mit Zusatz
In
der
folgenden
Tabelle
sind
die
Eisengehalte
im
gefriergetrockneten Eigelbproben mit Zusätzen zusammengefasst.
124
Plasma
der
Ergebnisse
Tabelle 58: Eisengehalt in gefriergetrockneten Plasmaproben
Eisengehalt
µg/g Tr. M.
7,07 ± 1,09
7,47 ± 1,99
4,49 ± 3,82
10,19 ± 1,42
7,75 ± 0,83
9,66 ± 2,19
Ohne1
1 % Salz1
3 % Zucker1
2 % Essig1
PLA2 0,5 %1
PLA2 0,75 %2
Probenumfang
n=3
n=3
n=3
n=3
n=3
n=6
s in %
15
27
85
14
11
23
PLA2 = Phospholipase A2
s = Standardabweichung
1
= mit G-AAS gemessen
2
= drei Proben mit G-AAS und drei Proben mit ICP-OES gemessen
In der Abbildung 22 sind die Ergebnisse der Tabelle 58 grafisch einander
gegenübergestellt. Eine Abweichung des Eisengehaltes der gefriergetrockneten
Proben mit Zusatz zu denen ohne Zusatz ist bei den mit Essigsäure und 0,75 %
Phospholipase A2 behandelten Proben erkennbar.
Abbildung 22: Eisengehalt in gefriergetrockneten Proben mit und ohne Zusatz
Gefriergetrocknete Proben mit Zusätzen
Eisen µg/g
ohne
+ Zusatz
12,0
10,19
9,66
10,0
8,0
7,75
7,47
7,07
7,07
7,07
7,07
2% Essig
0,5% PLA2
7,07
6,0
4,49
4,0
2,0
0,0
1% Salz
3% Zucker
0,75% PLA2
Es wurde ein t-Test durchgeführt, anhand dessen signifikante Abweichungen im
Eisengehalt der Proben festgestellt werden können. Des Weiteren wurde ein FTest durchgeführt in dem von normalverteilten Probenwerten ausgegangen
125
Ergebnisse
wurde.
Aufgrund
der
geringen
Probenzahl
wurde
auf
einen
Normalverteilungstest verzichtet.
Tabelle 59: Signifikanztest der Erhöhung des Eisengehaltes
F-Test
Salz
Zucker
Essig
PLA2 0,5 %
PLA2 0,75 %
0,46032
0,15012
0,74419
0,73156
0,42175
A= keine signifikante Abweichung
B= Abweichung signifikant (p = 0,05)
PLA2= Phospholipase A2
Varianzen
gleich
gleich
gleich
gleich
gleich
t-Test
0,38610
0,16231
0,01946
0,21846
0,0500
Interpretation
A
A
B
A
B
Durch den t-Test konnte die Einschätzung, dass sich der Eisengehalt in den mit
Essigsäure und Phospholipase A2 behandelten Proben signifikant erhöht hat,
bestätigt werden.
4.2.5.2 Native Eigelbproben mit Zusatz
Der Eisengehalt im Plasma der Eigelbproben mit und ohne Zusatz, die nicht
gefriergetrocknet wurden, unterscheidet sich deutlich und ist im Vergleich zu
den Proben ohne Zusatz erhöht. Der Eisengehalt in den Zusätzen war niedrig
und wurde von den gemessenen Werten abgezogen. Der Eisengehalt in den zum
Aufschluss eingesetzten Säuren wurde ebenfalls bei der Berechnung
berücksichtigt.
126
Ergebnisse
Tabelle 60: Eisengehalt im Plasma der Nativeiproben mit und ohne Zusatz
Eisengehalt
Proben
ohne
Ascorbinsäure
Citronensäure
Essigsäure
Weinsäure
PLA A2
G-AAS
µg/g Tr. M.
3,7 ± 0,9
29,2 ± 1,8
15,6 ± 0,3
7,8 ± 0,9
12,2 ± 1,4
-
n=7
n=3
n=3
n=3
n=3
-
ICP
µg/g Tr. M.
3,5
46,3 ± 2,7
21,0 ± 0,5
8,8 ± 0,8
16,6 ± 1,8
2,7 ± 0,2
n=2
n=3
n=3
n=3
n=3
n=6
G-AAS + ICP
µg/g Tr. M.
3,5 ± 0,9
37,7 ± 9,6
18,3 ± 2,9
8,3 ± 0,9
14,4 ± 2,8
-
s in
%
27
26
16
11
20
9
n=9
n=6
n=6
n=6
n=6
-
s = Standardabweichung
Der Unterschied im Eisengehalt wird auch in Abbildung 23; Abbildung 24;
Abbildung 25; und Abbildung 26, in denen die unbehandelten mit den
behandelten Proben verglichen werden, deutlich. In Abbildung 23 sind die mit
Ascorbinsäure versetzten Proben der Vergleichsprobe gegenübergestellt. In den
ersten sechs Spalten sind die Einzelproben und in der siebten Spalte deren
Mittelwert gegen den Wert der Proben ohne Zusätze dargestellt. Die Grafik
verdeutlicht, dass durch Ascorbinsäurezusatz zum Eigelb, im darauf folgend
abgetrennten Plasma mehr Eisen gefunden wird, als in Proben, denen nichts
zugesetzt wurde. Auch in den Proben, denen Citronensäure, Essigsäure und
Weinsäure zugesetzt wurde, ist der Gehalt erhöht. Die gefundenen Werte sind
bei Ascorbinsäure etwa 10 mal höher, bei Citronensäure etwa 5 mal höher, bei
Essigsäure etwa 2 mal höher und bei Weinsäure etwa 4 mal höher, als bei den
unbehandelten Proben. Bei den mit Phospholipase A2 versetzten Proben ist
keine Erhöhung zu erkennen.
127
Ergebnisse
Abbildung 23: Eisengehalte der Ascorbinsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Ascorbinsäure
Eisen
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus A1-A6
60,0
47,3
50,0
48,4
43,3
37,7
40,0
29,5
27,1
30,0
30,8
20,0
10,0
3,5
3,5
3,5
3,5
3,5
3,5
3,5
0,0
A1
A2
A3
A4
A1-A3 = Messung mit G-AAS
A5
A6
AM
A4-A6 = Messung mit ICP-OES
Abbildung 24: Eisengehalte der Citronensäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Citronensäure
Eisen
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus C1-C6
60,0
50,0
40,0
30,0
20,9
20,0
10,0
15,9
3,5
15,6
3,5
21,4
18,3
20,5
15,3
3,5
3,5
3,5
3,5
3,5
0,0
C1
C2
C3
C1-C3 = Messung mit G-AAS
C4
C5
C6
C4-C6 = Messung mit ICP-OES
128
AM
Ergebnisse
Abbildung 25: Eisengehalte der Essigsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Essigsäure
Eisen
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus E1-E6
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
8,0
6,8
3,5
3,5
8,5
3,5
3,5
8,1
8,6
9,7
3,5
3,5
8,3
3,5
0,0
E1
E2
E3
E4
E1-E3 = Messung mit G-AAS
E5
E6
AM
E4-E6 = Messung mit ICP-OES
Abbildung 26: Eisengehalte der Weinsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Weinsäure
Eisen
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus W1-W6
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
18,4
13,6
10,9
10,0
3,5
3,5
16,7
14,8
12,1
3,5
3,5
3,5
14,4
3,5
3,5
0,0
W1
W2
W3
W1-W3 = Messung mit G-AAS
W4
W5
W6
W4-W6 = Messung mit ICP-OES
129
AM
Ergebnisse
Abbildung 27: Eisengehalt der Phospholipaseproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Phospholipase
Eisen
µg/g Tr. M.
ohne
+ Zusatz
AM aus P1-P6
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
3,5
2,7
3,5
3,0
3,5
2,4
3,52,4
P3
P4
3,5
2,9
3,5
2,7
P5
P6
3,5
2,7
0,0
P1
P2
AM
P1-P6 = Messung mit ICP-OES
Mit einem t-Test soll geprüft werden, ob eine signifikante Erhöhung der
Eisengehalte vorliegt. Zuvor wird mit einem Kolmogorov-Smirnov-Test auf
Normalverteilung und mit einem F-Test auf Gleichheit der Varianzen getestet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 61 zusammengefasst.
Tabelle 61: Signifikanztest der Erhöhung des Eisengehaltes
F-Test
Varianzen
Ascorbinsäure
Citronensäure
Essigsäure
Weinsäure
PLA2
0,0000008
ungleich
0,00538
ungleich
0,94032
gleich
0,00702
ungleich
0,00749
ungleich
A = keine signifikante Abweichung (p > 0,05)
B = signifikante Abweichung (p = 0,05)
C = hochsignifikante Abweichung (p = 0,01)
PLA2 = Phospholipase A2
t-Test
0,00015
0,00002
0,0000001
0,00006
0,01614
Interpretation
C
C
C
C
B
Eine hochsignifikante Erhöhung des Eisengehaltes konnte für die mit
Ascorbinsäure, Citronensäure, Essigsäure und Weinsäure versetzten Proben
130
Ergebnisse
festgestellt werden. Der Gehalt in den mit Phospholipase A2 versetzten Proben
war nicht erhöht, sondern signifikant erniedrigt.
Eine durch pH-Wert Erniedrigung hervorgerufene strukturelle Veränderung
könnte für die Erhöhung des Eisengehaltes die Ursache sein.
Die pH-Werte sind auf Seite 124 in Tabelle 57 dargestellt.
4.2.6 Rasterelektronenmikroskopie
Die elektronenmikroskopischen Bilder der Granula unembryonierter Eier und
der embryonierten Eier sind nachfolgend dargestellt. Auflösungserscheinungen
der Granula sind nicht zu erkennen, allerdings scheinen weniger große Granula
in den Proben der embryonierten Eier vorhanden zu sein. Ein extraembryonaler
Granulaabbau während der Embryogenese könnte auch zu einer Verkleinerung
der Granula führen.
131
Ergebnisse
Abbildung 28: Granula aus dem Eigelb nativer Eier
Abbildung 29: Granula aus dem Eigelb 5 Tage embryonierter Eier
132
133
134
Diskussion
5.
DISKUSSION
5.1 THIAMIN
5.1.1 Methodenentwicklung und Thiaminanalytik
In der Literatur werden für die Thiaminextraktion aus der Matrix
unterschiedliche Konzentrationen für Trichloressigsäure zwischen 5 und 60 %
verwendet. Um abschätzen zu können, welchen Einfluss die Säurekonzentration
auf die Stabilität von Thiamin und Thiaminphosphaten hat, wurden vorab
verschiedene Säurekonzentrationen bei der Methodenentwicklung getestet. Bei
der Extraktion mit 20 % iger Trichloressigsäure war die Wiederfindung, im
Vergleich zur Extraktion mit 8 % iger Trichloressigsäure bei TMP um 13 % und
bei TDP um 20 % reduziert. Daher wurde eine möglichst niedrige
Säurekonzentration von 4 % gewählt, die dennoch ausreichte um die Proteine zu
fällen.
Für die Festphasenextraktion wurde anfänglich eine C-18 Säule und eine Oasis
MAX Säule benutzt. Diese wurden mit Methanol und anschließend mit
tridestilliertem Wasser gewaschen. Dann wurden die Säulen mit einem sauren
Phosphatpuffer konditioniert. Die Säulen wurden mit einem geeigneten
Verbindungsstück verbunden und auf einer Vakuumkammer platziert. Durch
einen Spritzenvorsatzfilter wurde der Probenextrakt, welcher nach der basischen
Derivatisierung auf pH 3 eingestellt wurde, auf die oberste Säule gegeben und
mit tridestilliertem Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte dann mit einem
Acetonitril: Phosphatpuffer-Gemisch 60:40 (v/v), 120 mM, pH 8,8.
Bei dieser Methode wurden die Thiochromphosphate nicht vollständig auf den
Säulen retardiert. Die Zugabe des sauren Phosphatpuffers führte vermutlich
135
Diskussion
dazu, dass die positiven Bindungsstellen der Oasis MAX Säule auch mit
Phosphaten, anstatt mit den Thiochromphosphaten belegt wurden. Zudem sind
Thiochrome im sauren Milieu nicht stabil (Fayol, 1997).
Aufgrund der aufgeführten Nachteile wurde die Festphasenextraktion verändert.
Sowohl der Ansäuerungsschritt der Probe mit Phosphatpuffer, sowie der
Säuerungsschritt der Säule wurden verworfen. Damit die Säulen beim Beladen
durch den nun basischen pH-Wert der Probenlösung keinen Schaden nehmen,
wurde diese mit 1 molarer Salzsäurelösung auf pH 7 eingestellt. Andernfalls
wurden die Säulen schon während der Extraktion durch Auflösung der
Silicapartikel unbrauchbar. Bei pH 7 allerdings wurden die Thiochromphosphate
nicht mehr auf der Oasis MAX Säule retardiert, so dass stattdessen eine Supelco
SAX Säule verwendet wurde. Auf dieser Säule wurden die Thichromphosphate
sehr stark retardiert, so dass die Phosphatpufferkonzentration stark erhöht
werden musste, um die Thiaminphosphate von den Bindungsstellen zu
verdrängen. Die Elution der Analyten erfolgte daher mit einem Acetonitril:
Phosphatpuffer-Gemisch 20:80 (v/v), 250 mM, pH 7,5.
Durch Einzeluntersuchungen konnte bestätigt werden, dass Thiamin auf der C18 Säule und die Thiaminphosphate auf der SAX Säule zurückgehalten wurden.
Es wurde keine Beschreibung einer Festphasenextraktion für eine gemeinsame
Aufreinigung von Thiamin und seinen Phosphatestern gefunden, die aus der
Literatur hätte entnommen werden können.
Somit gelang es erstmalig eine Methode zu präsentieren, bei der Thiamin und
seine Phosphatester durch eine Festphasenextraktion gemeinsam aufgereinigt
und eluiert werden können, die für die Analytik von Proben mit komplizierten
Matrices viele Vorteile enthält:
Die Eiprobenmatrix beinhaltet Lipide, Proteine und fluoreszierende Stoffe in
großer Menge (Ternes et al., 1994). Selbst nach der Zentrifugation war schon
mit dem bloßen Auge durch eine Gelbfärbung der Probenlösung zu erkennen,
dass noch gelöste Stoffe vorhanden waren, die durch die Festphasenextraktion
136
Diskussion
entfernt werden konnten. Durch die Festphasenextraktion konnten außerdem
HPLC-Säulen schädigende Substanzen, wie die für die Extraktion verwendete
Trichloressigsäure, oder das Bromcyan für die Derivatisierung entfernt werden.
Außerdem konnte die Probe, wie in den Chromatogrammen zu sehen ist (siehe
4.1), von fast allen unerwünschten Substanzen befreit werden. Die Proben
konnten darüber hinaus durch Anpassung des bei der Festphasenextraktion
verwendeten Eluenten in ein Medium verbracht werden, dass der des HPLC
Eluenten ähnelte, so dass die Auftrennung und Peakform verbessert wurden.
Die Trennung der Analyten mittels HPLC wurde zunächst isokratisch mit einem
Acetonitril: Phosphatpuffer Gemisch (v/v) 40:60 mit einer Molarität von 75 mM
und pH 8 durchgeführt. Da Methanol die Fluoreszenz der Thiochrome
verbessert, wurde auch dieses zu Anfang getestet, aber abgesehen von den
schlechteren Trennergebnissen, war der Pumpendruck sehr viel höher, da
Mischungen aus Methanol und Wasser eine sehr viel höhere Viskosität als
andere Gemische haben (Meyer, 1992). Obwohl das Thiamin und die
Thiaminphosphate mit dem ioskratischen System gut getrennt werden konnten,
war der pH-Wert zu hoch, um eine lange Haltbarkeit der mit Silicapartikeln
gefüllten HPLC-Säulen zu garantieren. Bei einer Erniedrigung des pH-Wertes
verschlechterte sich, durch Verringerung der Retentionszeiten, die Trennung der
Analyten. Daher wurde ein Gradientensystem eingeführt, so dass die Puffer auf
pH 7,15 und pH 7,25 abgesenkt werden konnten. Die Trennung konnte
außerdem durch den Austausch der NH2-Säule gegen eine NH2-Säule eines
anderen Herstellers verbessert werden, da diese kürzer war. Durch das System
konnte
eine
vollständige
Trennung
des
Thiamins
und
aller
drei
Thiaminphosphate in akzeptabler Zeit von 40 Minuten erreicht werden, die
außerdem eine längere Lebensdauer der Trennsäulen ermöglicht.
Durch die neu entwickelte Methodik ist es gelungen Thiamin und seine
Phosphatester zusammen zu extrahieren, aufzutrennen und quantitativ zu
bestimmen, obwohl sie unterschiedliche chemisch-physikalische Eigenschaften
137
Diskussion
haben. Das zu Thiochrom derivatisierte Thiamin verhält sich apolar,
wohingegen die Phosphatester durch die negativ geladenen Phosphatgruppen
polar sind. Sie können daher bei Verwendung nur einer HPLC Säule nicht
optimal getrennt werden. Diese Problematik konnte durch den Einsatz von zwei
Säulen gelöst werden. Zwar war eine Trennung mit isokratischem System
möglich, aber eine bessere Trennleistung und Haltbarkeit der HPLC-Säulen
konnte durch ein Gradientensystem erreicht werden. Obwohl in der Literatur
viele Methoden gefunden wurden, die eine Analyse der Thiamine und
Thiaminphosphate präsentieren, wurde bei keiner eine zufrieden stellende
Aufreinigung und Auftrennung aus komplizierteren Matrices gefunden. Bei der
Analyse nicht ausreichend aufgereinigter Proben können Störpeaks, die den
eigentlichen Analyten überlagern, zu falschen Ergebnissen führen, ohne das dies
bemerkt wird. Auch die quantitative Analyse nicht vollständig getrennter Peaks
kann zu falschen Werten führen. Daher stellt die hier präsentierte Methode eine
Verbesserung dar: Thiamin und seine Thiaminphosphate können, inklusive dem
selten
analysierten
Thiamintriphosphat,
komplett
getrennt
und
ohne
Beeinträchtigung von Störpeaks analysiert werden.
Obwohl der pH-Wert der Eluenten niedriger als der für die Fluoreszenz der
Thiochrome als optimal angegebene ist (Ishii et al., 1979), liegt die Nachweis-,
Erfassungs- und Bestimmungsgrenze im üblichen Bereich und ist teilweise
sogar besser, als die von anderen Autoren angegebene.
138
Diskussion
Tabelle 62: Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze verschiedener Autoren
eigene
(Losa et al., 2005)
(Viñas et al., 2003b)
Thiamin
NG
BG
ng/mL
ng/mL
0,3
0,9
0,2
0,7
0,06
0,2
NG
BG
pg/20µL1
pg/20µL1
eigene
6
18
(Losa et al., 2005)
4
14
(Viñas et al., 2003b)
1,2
4
TMP: Thiaminmonophosphat
TDP: Thiamindiphosphat
NG: Nachweisgrenze
BG: Bestimmungsgrenze
1
= absoluter Gehalt in der Probenschleife
TMP
TDP
NG
ng/mL
0,5
0,4
1
BG
ng/mL
1,6
1,2
3,4
NG
ng/mL
0,9
0,3
0,75
BG
ng/mL
2,8
1
2,5
NG
pg/20µL1
10
8
20
BG
pg/20µL1
32
24
68
NG
pg/20µL1
18
6
15
BG
pg/20µL1
56
20
50
Die Nachweisgrenze für Thiamin wird außerdem von einigen anderen Autoren
angegeben und beträgt 0,2 (Brunnekreeft et al., 1989); 0,6 (Schrijver et al.,
1982); und 1 (Botticher und Botticher, 1986; Laschi-Loquerie et al., 1992)
ng/mL. Die von Viñas et al. (2003b) angegebene Nachweisgrenze von 0,06
ng/mL für Thiamin liegt mit der von Bettendorff et al. (1986) angegebenen
Nachweisgrenze von 0,08 ng/mL für Thiamin und 0,16 ng/mL für
Thiamindiphosphat in einem sehr niedrigen Bereich und es konnten keine
Literaturdaten gefunden werden, in denen niedrigere Nachweisgrenzen angeben
werden. Der Vergleich von in der Literatur angegebenen Nachweisgrenzen ist
schwierig, da wie auch in den beiden letztgenannten Fällen nicht immer bekannt
ist, wie diese bestimmt wurden.
Obwohl alle möglichen Ursachen für einen Thiaminabbau (Licht, Wärme, pHWert) in Betracht gezogen und vermieden wurden, war die Wiederfindungsrate
von 71 % für TMP und 64 % TDP im Plasma und 58 % für TMP und 47 % für
TDP in der Granulafraktion, verglichen mit Literaturdaten, niedrig. Dort werden
Wiederfindungsraten für Thiaminmonophosphat und Thiamindiphosphat von
über 85 % für Urin (Losa et al., 2005), Blut (Bettendorff et al., 1986;
Brunnekreeft et al., 1989; Gerrits et al., 1997; Kimura und Itokawa, 1985; Losa
et al., 2005; Tallaksen et al., 1991), Organproben (Batifoulier et al., 2005), Bier
139
Diskussion
und Bierzutaten (Zapala, 2003), Erythrozyten (Baines, 1985; Herve et al., 1994;
Losa et al., 2005), Nervengewebe (Bettendorff et al., 1991) und Rattengewebe
(Sander et al., 1991) angegeben.
Die Festphasenextraktion konnte als Ursache, nachdem dieselbe dotierte Probe
vor und nach der Festphasenextraktion gemessen wurde, ausgeschlossen
werden, da die Wiederfindungsrate bei über 85 % lag.
Als mögliche andere Ursache kam außerdem die Eimatrix in Betracht, da mit
derselben Methode analysierte Fleischproben eine Wiederfindungsrate von über
90 % aufwiesen. Auch Vanderslice und Huang, die Thiamin und
Thiaminphosphate
Wiederfindungsrate
in
in
Lebensmitteln
Fleisch-
und
untersuchten,
hatten
Getreideproben,
eine
gute
nur
eine
aber
Wiederfindungsrate von 60 % für Geflügelprodukte (Vanderslice und Huang,
1986). Allerdings verwendeten sie eine andere Art der Probenaufbereitung, so
dass ein direkter Vergleich nicht gezogen werden kann.
Die für die Fleisch- und Eiproben verwendeten Methoden erscheinen auf den
ersten Blick identisch. Erst bei eingehender Betrachtung fiel ein Unterschied in
der Filtration nach der Zentrifugation auf. Für Eiproben wurde, da es sich um
feinere
Filterrückstände
handelt,
ein
Papierfilter
verwendet,
für
die
Fleischproben, da die Rückstände gröber waren Glaswolle. Ob durch
unterschiedliche Filtermaterialien tatsächlich ein so großer Verlust der
Thiaminphosphate verursacht werden kann erscheint unwahrscheinlich und
könnte nur durch weiterführende Untersuchungen eindeutig geklärt werden.
140
Diskussion
5.1.2 Thiamin- und Thiaminphosphatgehalte in Proben
5.1.2.1 Thiamingehalt in Plasma und Granula
In Plasma und Granula der nativen Eier und der 5 Tage embryonierten Eier
wurde nur Thiamin gefunden und keine Thiaminphosphate. Aufgrund der sehr
niedrigen Nachweisgrenze von 10 pg TMP und 18 pg TDP in 20 µL
eingespritzter Probe konnte, bei Berücksichtigung der Wiederfindungsrate,
davon ausgegangen werden, dass tatsächlich keine Thiaminphosphate vorhanden
sind. Wird die Wiederfindungsrate zu der Nachweisgrenze addiert, hätten pro
analysiertem Volumen von 20 µL 14 pg TMP und 28 pg TDP enthalten sein
können. Verglichen mit den für Thiamin gefundenen Werten von etwa 900 pg in
der 20 µL Probenschleife also sehr geringe Mengen. Ein Abbau von TDP oder
TMP zu Thiamin hätte sich kaum in einer Erhöhung des Thiamingehaltes
bemerkbar gemacht.
In der Literatur konnten keine Angaben zu Thiaminphosphatgehalten im Eigelb
oder Eigelbfraktionen gefunden werden und die vorliegenden Ergebnisse
belegen, dass keine Thiaminphosphate in den Eigelbfraktionen und somit auch
nicht im Gesamteigelb vorhanden sind.
Da nun der Thiamingehalt pro Gramm Feuchtsubstanz bekannt ist und das
Verhältnis von Plasma zu Granula im Eigelb etwa 75:25 beträgt, kann berechnet
werden wie viel Prozent des Gesamtthiamins in den einzelnen Fraktionen
enthalten ist. Demnach sind 87 % des Gesamtthiamins des Eigelbs im Plasma
und 13 % in den Granula enthalten. In den Bruteiern ist dies Verhältnis mit
86:14
annähernd
gleich.
Daher
kann
das
Plasma
des
Eigelbs
als
Thiaminspeicher weiter differenziert werden. Bei der Isolierung des
thiaminbindenden Proteins aus dem Eigelb verdünnten Muniyappa und Agida
(1981) dieses mit einer Mischung aus Phosphatpuffer und 0,2 molarer NaClLösung und zentrifugierten dieses anschließend. Laut Ternes et al. (1991) und
141
Diskussion
Causeret (1991) reicht diese Ionenstärke nicht aus, um die Granula
aufzubrechen. Daher ist es wahrscheinlich, dass Muniyappa und Agida (1981)
nur die Plasmaproteine aus dem Eigelb isolierten und keine Granulaproteine und
folglich auch das thiaminbindende Protein vor allem aus dem Plasma isolierten.
Außerdem wird vermutet, dass die thiaminbindenden Proteine auch fast
vollständig mit Thiamin gesättigt sind und Vitamine durch die Bindung an
Transportproteine ins Ei eingelagert werden (White et al., 1976). Damit passen
die aus der Literatur gewonnenen Erkenntnisse, dass Thiamin komplett an das
thiaminbindende Protein gebunden ist und dass dieses im Plasma des Eigelbs
lokalisiert ist, mit den hier vorliegenden Ergebnissen, dass Thiamin vor allem im
Plasma gefunden wurde, überein.
Somit
konnte,
die
soweit
bekannt
bislang
ungeklärte
Frage,
ob
Thiaminphosphate im Eigelb und in den Eigelbfraktionen vorhanden sind,
beantwortet werden und darüber hinaus Angaben zur Thiaminverteilung in den
Eigelbfraktionen gemacht werden.
Der Thiamingehalt im Plasma embryonierter Eier war nicht, der Gehalt in den
Granula dagegen hochsignifikant (P = 0,01) erhöht.
Da Thiamin zur Aufrechterhaltung des Energiestoffwechsels für die
Embryogenese benötigt wird, ist eine Erhöhung, statt einer Erniedrigung des
Gehaltes, ungewöhnlich da durch den Transfer von Thiamin zum Embryo ein
niedrigerer Gehalt erwartet würde.
Es gibt mehrere Möglichkeiten wie der erhöhte Thiamingehalt erklärt werden
kann:
Da die befruchteten und die unbefruchteten Eier von verschiedenen
Bezugsquellen stammten, ist es möglich, dass der Thiamingehalt im Futter der
Hennen unterschiedlich war. Dies würde zu einem unterschiedlichen
Thiamingehalt in den Eiern führen (Leeson und Caston, 2003). Außerdem haben
auch die Jahreszeit, das Alter der Hennen und vor allem die Rasse einen Einfluss
auf den Thiamingehalt der Eier. Eine weitere Möglichkeit für den höheren
142
Diskussion
Gehalt
wäre
ein
Thiamintransport
aus
anderen
Eikompartimenten,
beispielsweise dem Eiklar. Der Transfer aus dem Eiklar kann zwar grundsätzlich
nicht ausgeschlossen werden, würde aber den hohen Anstieg nicht erklären, da
nur ein geringer Thiamingehalt von 0,29 µg/g F.S. im Eiklar vorhanden ist.
Obwohl also externe Ursachen (Fütterung, Rasse, Jahreszeit) für den höheren
Thiamingehalt in den Granula wahrscheinlich sind, kann dies ohne weitere
Untersuchungen nicht vollständig geklärt werden.
Da nur Thiamin in Plasma und Granula von Nativeiern gefunden wurde, kann
das
Vorhandensein
von
Thiaminphosphaten
ausgeschlossen
werden.
Thiaminphosphate konnten auch nicht im Plasma und Granula von
embryonierten Eiern nachgewiesen werden. Damit konnte geklärt werden, dass
Thiaminphosphate nicht in Granula oder Plasma während der Embryogenese
gebildet oder eingelagert werden.
5.1.2.2 Thiamingehalt in Embryos
Im Gegensatz zu den Eigelbfraktionen der Nativeier und der embryonierten Eier
konnten
Thiaminphosphate
im
Embryo
nachgewiesen
werden.
Da
Thiaminphosphate in Plasma und Granula nicht vorhanden sind, deutet dies an,
dass die Thiaminphosphate erst in der Eigelbmembran, oder im Embryo gebildet
werden.
Vor allem die biologisch aktive Form, das Thiamindiphosphat, lag sowohl in 5
Tage alten, als auch 7 Tage alten Embryos vor. Da auch Thiamin in
nennenswerter Menge vorlag, spricht dies eher für eine Verstoffwechselung in
den Zellen des Embryos, als in den extraembyonalen Membranen. Das
Thiaminmonophosphat, für das bislang keine biologisch aktive Rolle festgestellt
werden konnte, ist nur eine Zwischenstufe in der Metabolisierung zum
Thiamindiphosphat und konnte in Übereinstimmung dazu auch nur in geringer
Konzentration nachgewiesen werden. Es wurde zwar nur in 7 Tage alten
143
Diskussion
Embryos nachgewiesen, aber da es eine Vorstufe in der Metabolisierung zum
Thiamindiphosphat ist, ist es wahrscheinlich, dass der Gehalt in 5 Tage alten
Embryos unter der Nachweisgrenze lag. Dem Thiamintriphosphat dagegen wird
eine spezielle Funktion in Nerven zugesprochen und es ist mit 80 % die
Hauptfraktion in der weißen Skelettmuskulatur des Huhnes. In der roten
Skelettmuskulatur ist es noch zu 30 % vertreten (Miyoshi et al., 1990). Da es
sich also um sehr differenzierte Gewebe handelt, könnte dies der Grund sein,
dass in 5 und 7 Tage alten Embryos kein Thiamintriphosphat nachgewiesen
werden konnte, da zu diesen Zeitpunkten noch keine Differenzierung zu
Nerven- oder Muskelgewebe in den Embryos vorhanden ist.
Der Gehalt an Gesamtthiamin im Vergleich 5 Tage alter Embryos zu 7 Tage
alten Embryos scheint abgenommen zu haben. Ein t-Test zeigt allerdings keine
ausgeprägte Signifikanz (p = 0,046). Es wäre also möglich, dass zu diesem
Zeitpunkt das Wachstum des Embryos die Thiaminaufnahme übersteigt. Eine
andere Erklärung wäre, dass die Dottersackmembran nicht nur für Mineralstoffe,
sondern auch für Thiamin, eine regulatorische Funktion erfüllt. Da sie zuvor
noch nicht voll entwickelt ist, könnte die Thiaminaufnahme erst am 7. Tag
begrenzt sein. Der Thiamindiphosphatgehalt dagegen ist in den 7 Tage alten
Embryos hochsignifikant erniedrigt (P = 0,01). Da weniger Thiamin zur
Verfügung steht, könnte auch weniger Thiamindiphosphat metabolisiert werden.
Zumindest führt ein bei Schafen induzierter Thiaminmangel im Gehirn ebenfalls
zu einem Abfall von Thiamin und aller Thiaminphosphate in etwa gleichem
Maßstab (Thornber et al., 1980).
Olkowski und Classen (1999) führten Untersuchungen zum Einfluss der
Fütterung auf den Thiamingehalt durch und bestimmten im Rahmen dieser
Untersuchungen auch den Thiamindiphopshatgehalt im Herz von 20 Tage alten
Embryos (Olkowski und Classen, 1999). Es konnte somit eine Brücke zu den in
der Literatur vorhandenen Stützpfeilern gebaut werden, da gezeigt werden
konnte, dass schon in 5 und 7 Tage alten Embryos Thiaminphosphate gebildet
144
Diskussion
werden. Dass Thiamintriphosphat im undifferenzierten Embryogewebe nicht
nachgewiesen wurde, bestätigt die Vermutung, dass es eine sehr spezielle Rolle
im Stoffwechsel einnimmt und erst in späteren Entwicklungsphasen in
differenzierten Geweben gebildet wird.
5.2 MINERALSTOFFE
5.2.1 Trockenmassebestimmung in Granulaproben
Es konnte kein signifikanter Unterschied im Trockenmassegehalt der in den
Aluschalen gemessenen und den in den Reaktionsgefäßen gemessenen Granula
festgestellt werden. Daher konnte der in den getrockneten Granula bestimmte
Mineralstoffgehalt als Gehalt in der Trockenmasse angenommen werden.
5.2.2 Mineralstoffgehalt in nativen Eiern in Plasma und Granula
In dieser Versuchsanordnung sollte geklärt werden, wie die Mineralstoffe in
Plasma und Granula embryonierter Eier verteilt sind, da diese nur für Nativeier
bekannt ist. Darüber hinaus sollten Unterschiede im Vergleich zwischen
Mineralstoffgehalt und Verteilung in Plasma und Granula von Nativeiern und
embryonierten Eiern festgestellt werden.
Für den Calciumgehalt in den Granula von Nativeiern fanden Wakamatu et al.
(1982a) 9880 µg/g Tr. M. und Causeret et al. (1991) 11900 µg/g Tr. M. Die
gefundenen Werte stimmen mit den Literaturdaten überein. Für den
Calciumgehalt im Plasma lagen nur die Werte von Wakamatu et al. (1982a) vor,
welche mit 580 µg/g Tr. M. einen über doppelt so hohen Gehalt fanden. Bei
einer Schwankungsbreite von nur 10 % in den vorliegenden Proben und einer
Mittelung
von
jeweils
drei
Messungen
145
derselben
Probe
können
Diskussion
Messungenauigkeiten als Ursache ausgeschlossen werden. Die Trennung von
Plasma und Granula erfolgte ebenfalls annähernd zu der von Wakamatu et al.
(1982a) beschriebenen Methode, wobei diese die Proben wesentlich länger
zentrifugierten, so dass hier eine mögliche Ursache liegen könnte, wenn sich
dadurch
Plasma-
und
Granulabestandteile,
vor
allem
die
löslichen
Plasmaproteine unterschiedlich getrennt haben. Dies würde auch den geringeren
Calciumgehalt in den Granula von Wakamatu et al. (1982a) erklären.
Der gefundene Magnesiumgehalt in den Granula entspricht mit 996 µg/g Tr. M.
in etwa den Gehalten, die von Grau (1979) 749 µg/g Tr. M., Wakamatu (1982a)
790 µg/g und Causeret (1991) 715 µg/g angegeben werden. Der
Mineralstoffgehalt im Plasma von 32,3 µg/g Tr. M. ist in den vorliegenden
Proben geringer als der in der Literatur angegebene mit 74 µg/g Tr. M. (Grau
und Roudybush, 1979a) und 110 µg/g (Wakamatu et al., 1982a). Die
Unterschiede in der Technik der Trennung von Plasma und Granula könnte, wie
bei Calcium, die Ursache für den unterschiedlichen Gehalt sein.
Der Eisengehalt der Granula weicht mit 518 µg/g Tr. M. nicht von den in der
Literatur angegebenen Werten von 400 und 480 µg/g Tr. M. (Grau und
Roudybush, 1979a; Wakamatu et al., 1982a) ab. Der Eisengehalt von 4 µg/g Tr.
M. liegt unter dem von Grau (Grau und Roudybush, 1979a) angegebenen Wert
von 7,6 µg/g.
Der Zinkgehalt in den Granula wird von Grau und Roudybush (1979a) mit 288
µg/g angegeben und liegt somit weit unter dem Gehalt von 515 µg/g in den
vorliegenden Proben. Der Zinkgehalt im Plasma dagegen entspricht mit 1 µg/g
Tr. M. dem von Grau angegebenen Wert von 2 µg/g Tr. M.
Der Kupfergehalt in den Eigelbfraktionen wurde, soweit bekannt, nur von Grau
und Roudybush (1979a) für Gesamteigelb mit 20,3 µg, für Granula mit 20,6 µg
und für Plasma mit 20,5 µg angegeben. Diese Werte weichen erheblich von den
hier vorliegenden Werten von 9,28 µg/g Tr. M. in der Granulafraktion und 0,42
µg/g Tr. M. Plasma ab. Von anderen Autoren wird ein wesentlich niedrigerer
146
Diskussion
Kupfergehalt für Gesamteigelb zwischen 2,6 bis 4,8 µg/g Tr. M. angegeben
(Cotterill et al., 1977; Romanoff und Romanoff, 1967). Man kann ein Verhältnis
von Plasma zu Granula von 75:25, eine Trockenmasse für Eigelb von 50 %, für
Eigelbplasma von 40 % und für die Granula von 45 % als Grundlage für eine
grobe Einschätzung der Werte verwenden. Der aus den in dieser Arbeit
gefundenen Werten berechnete Kupfergehalt von 3 µg/g Eigelbtrockenmasse
liegt damit näher an den von anderen Autoren angegebenem Kupfergehalt, so
dass die von Grau angegebenen Werte vermutlich nicht den tatsächlichen
Gehalten entsprechen.
5.2.3 Mineralstoffgehalt in Plasma und Granula 5 Tage embryonierter Eier
Da die Mineralstoffgehalte in den Nativeiern denen in der Literatur angegebenen
Werten entsprechen, oder wie im Fall von Kupfer, als korrekt angesehen werden
können, gilt dies ebenso für die in embryonierten Eiern gefundenen Gehalte. Für
den Mineralstoffgehalt in Plasma und Granula embryonierter Eier ließen sich in
der Literatur keine Angaben finden, so dass die hier präsentierten Daten
erstmalig erhoben wurden.
Außerdem sollte beurteilt werden, inwieweit die zwischen Nativeiern und
embryonierten Eiern gefundenen Werte voneinander abweichen und worin die
Ursache bestehen könnte.
Der Calciumgehalt in den Granula unterscheidet sich in Nativeiern und
embryonierten Eiern nicht signifikant. Im Plasma dagegen, konnte eine
signifikante Erhöhung festgestellt werden. Daher gibt es drei Möglichkeiten, die
Erhöhung zu erklären. Da Calcium während der Embryogenese aus der Eischale
mobilisiert wird, könnte ein Transfer in das Eigelb vor der Aufnahme durch den
Embryo eine Erhöhung im Plasma bewirken. Andererseits gilt als gesichert, dass
eine Calciummobilisation aus der Eischale erst ab dem 10 bis 12 Inkubationstag
in größerem Umfang über die extraembryonalen Häute stattfindet, so dass ein
147
Diskussion
aktiver Transport vermutlich ausgeschlossen werden kann. Im Eiklar ist Calcium
ebenfalls in größerer Menge vorhanden, so dass ein Transfer oder eine passive
Diffusion auch aus diesem Kompartiment möglich wäre. Auch aus der Eischale
gelöste Calciumionen könnten über das Eiklar in das Eigelb diffundieren. Da
während der Embryogenese Wasser vom Eiklar ins Eigelb diffundiert, könnten
gleichzeitig auch Calciumionen in das Eigelb gelangen. Als letzte Möglichkeit
könnten auch in den Granula gebundene oder freie Calciumionen während der
Embryogenese in das Plasma gelangen, da ein extrazellulärer Granulaabbau
durch das Vorhandensein von Enzymen vermutet wird und Calciumionen zu 99
% in den Granula gebunden sind.
Es ist bekannt, dass der Calciumgehalt im Gesamteigelb leicht vom 5. bis zum 7.
Inkubationstag zunimmt, nicht aber ob diese Erhöhung in Plasma oder Granula
stattfindet. Eine Erhöhung des Calciumgehaltes im Eigelb konnte somit durch
die vorliegenden Ergebnisse bestätigt werden und außerdem weiter differenziert
werden, dass diese Erhöhung in der Plasmafraktion stattfindet.
Für Magnesium konnte in den Granula und im Plasma ein signifikant höherer
Gehalt in embryonierten Eiern als in Nativeiern festgestellt werden. Daher ist es
unwahrscheinlich, dass ein Transfer von Magnesiumionen zwischen diesen
beiden Fraktionen stattgefunden hat. Magnesium ist mit 900 µg/g Tr. M. (Souci
et al., 2000) auch im Eiklar in größerer Menge vorhanden. Daher wäre es
möglich, dass eine Diffusion von Magnesiumionen aus dem Eiklar in das Eigelb
stattgefunden hat. Da, wie schon erwähnt, während der Embryogenese Wasser
vom Eiklar ins Eigelb gelangt, könnten gleichzeitig auch Magnesiumionen in
das Eigelb gelangen. Eine weitere Möglichkeit wäre die Mobilisation aus der
Eischale, da Experimente an schalenlosen Embryos vermuten lassen, dass auch
ein Teil des Magnesiums aus der Eischale mobilisiert wird (Dunn und Boone,
1977). In beiden Fällen würden die Magnesiumionen vermutlich nicht von einer
extraembryonalen Membran aufgenommen und dann zum Embryo transportiert,
sondern über das Eiklar zunächst in die Granula gelangen, da erst ab dem 10.
148
Diskussion
Tag ein Kontakt der Chorioallantoismembran mit der Eischalenmembran zu
verzeichnen ist.
Der Eisengehalt in den Granula ist gegenüber den Nativeiern in den
embryonierten
Eiern
signifikant
erniedrigt
und
im
Plasma
dagegen
hochsignifikant erhöht. Da Eisenionen im Eiklar nur in Spuren vorhanden sind,
kann
diese
Eifraktion
als
Eisenquelle
mit
hoher
Wahrscheinlichkeit
ausgeschlossen werden. Da keine Beeinträchtigung des Eisengehaltes in
schalenlosen Embryos festgestellt werden konnte (Dunn und Boone, 1977) und
Eisenionen nur in geringer Konzentration in der Eischale zu finden sind, ist die
Eischale als Eisenquelle ebenfalls unwahrscheinlich. In den Granula sind
Eisenionen zu 95 % im Phosvitin-Lipovitellin-Komplex gebunden (Richards,
1997; Ternes et al., 1994), wohingegen sich 33 % der Eisenionen in den
Experimenten von Wakamatu et al. (1982a) dialysieren ließen. Ob eine
Diffusion von Eisenionen möglich ist, kann daher nicht zufrieden stellend
geklärt werden. Es besteht noch die Möglichkeit, dass im Komplex gebundene
Eisenionen während des Brutvorganges durch extrazellulären Granulaabbau
freigesetzt werden und daher im Plasma embryonierter Eier ein höherer
Eisengehalt gefunden werden kann. Da auch im Darm Eisenionen nicht an
Phosvitin
gebunden
aufgenommen
werden,
könnte
dies
für
die
Dottersackmembran ebenfalls gelten, so dass Eisenionen nicht nur mit den
Granula
per
Endozytose,
sondern
auch
über
einen
speziellen
Eisentransportmechanismus aufgenommen werden könnten.
Der Zinkgehalt in Granula embryonierter Eier ist, gegenüber Nativeiern, nicht
verändert, im Plasma dagegen signifikant erhöht. Zink ist in der Granulafraktion
zu 90 % an Lipovitellin gebunden. Ansonsten gelten ähnliche Bedingungen wie
für Eisen. Es ist ebenfalls nur in geringen Konzentrationen in Eiklar und
Eischale zu finden und es könnte somit ein Transfer aus den Granula in das
Plasma stattgefunden haben.
149
Diskussion
Der Kupfergehalt hat sich weder in den Granula, noch im Plasma signifikant im
Vergleich von Nativei zu embryonierten Eiern verändert. Eine Freisetzung oder
ein Transfer von Kupferionen aus anderen Kompartimenten des Eies ist daher
unwahrscheinlich.
Die Ergebnisse, dass einige Mineralstoffe in embryonierten Eiern im Plasma
angereichert werden, legt nahe, dass durch den extraembryonalen Proteinabbau,
auch die in den Proteinkomplexen gebundenen Mineralstoffe freigesetzt und von
der Dottersackmembran aufgenommen werden. Dass zumindest Kupfer, Zink
und Eisen von der Dottersackmembran aufgenommen werden, legten die
Ergebnisse von Ridgway und Karnofsky (1952) nahe. Sie injizierten Metallsalze
in den Dottersack und bestimmten anschließend den Mineralstoffgehalt in
Hühnerembryos.
Dies
stellt
einen
indirekten
Beweis
für
einen
Mineralstofftransfer von freien Ionen aus dem Dotter in den Embryo dar.
5.2.4 Kupfer- und Eisengehalt in technologisch behandelten Proben
5.2.4.1 Veränderung des Kupfergehaltes in Plasmaproben
In den Eigelbproben, denen vor der Gefriertrocknung Zusätze zugegeben
wurden und die danach auf ihren Kupfergehalt im Plasma untersucht wurden,
zeigten die mit 2 % Essigsäure eine Veränderung im Kupfergehalt im Plasma.
Der Gehalt betrug das 3 fache im Vergleich zu den Proben ohne Zusatz und war
hochsignifikant. Zur Abschätzung, ob die Gefriertrocknung einen Einfluss auf
die Freisetzung hat, wurden die gefriergetrockneten Proben ohne Zusatz mit
nativen Proben ohne Zusatz verglichen. Der Kupfergehalt im Plasma des
Eigelbs von Nativeiern (siehe 4.2.3) beträgt, wie bei den gefriergetrockneten
Proben, 0,42 µg/g (siehe 4.2.4.1). Somit kann angenommen werden, dass die
Erhöhung des Kupfergehaltes im Plasma nur auf die Zugabe der Zusätze
150
Diskussion
zurückzuführen ist und nicht auf die Gefriertrocknung. Da der Nomalgehalt an
Kupfer im Eigelbplasma niedriger ist, als der Gehalt in den mit Zusätzen
versetzten Proben, muss das zusätzliche Kupfer aus den Granula stammen.
Ebenso wie Zink und Eisen sind auch Kupferionen im Phosvitin-LipovitellinKomplex der Granula gebunden. Zink und Eisen sind zu über 90 % gebunden,
aber genaue Angaben zur Kupferbindung konnten in der Literatur nicht
gefunden werden. Da durch die Bindung von Eisen und Kupfer eine
Lipidoxidation verhindert werden soll, ist eine Bindung von Kupferionen zu
einem hohen Prozentsatz wahrscheinlich (Richards, 1997). Daher kann
angenommen werden, dass die Kupferionen aus den Granula und dort aus dem
PvLv-Komplex stammen. Nach der Resuspension des gefriergetrockneten
Eigelbs wich die Konsistenz von der bei Eigelb üblichen Konsistenz bei den
Essigsäureproben ab. Bei unter pH 4,2 werden die Ionenbrücken der Granula
aufgebrochen und die Granula destabilisiert. Dadurch nimmt die Löslichkeit der
Granulaproteine zu. Da der pH-Wert durch Essigsäurezusatz auf pH 4,1
abgesenkt wurde wäre dies ein Grund für die Freisetzung der Kupferionen. Die
Bildung von löslichen Kuferacetaten wäre eine andere Erklärung für den
erhöhten Gehalt im Plasma.
Bei denen mit 0,75 % Phospholipase A2 versetzten Proben konnte keine
signifikante Erhöhung des Kupfergehaltes im Plasma festgestellt werden,
obwohl der Gehalt gegenüber den Proben mit 0,5 % Phospholipase A2
tendenziell erhöht erschien. Da es sich bei der Phospholipase A2 um ein Enzym
handelt, ist die Aktivität von Temperatur und Inkubationszeit abhängig. Ein
geringerer Gehalt des Enzyms könnte daher, wie im vorliegenden Fall, keinen
messbaren Effekt auf eine Kupferfreisetzung haben.
Da das Phosvitin mit Lipovitellin, welches selbst Lipoproteine enthält und in
welches Lipide eingelagert sind, einen Komplex bildet, könnte die
Phospholipase A2 diesen Komplex durch ihre Aktivität destabilisieren. Dadurch
könnten die Kupferionen ebenfalls frei werden, oder an Proteinfragmente
151
Diskussion
gebunden mit diesen in Lösung gehen, was zu einem erhöhten Kupfergehalt im
Plasma führen würde.
Um den Effekt andere Zusätze auf eine Freisetzung von gebundenen
Kupferionen feststellen zu können, wurden Eigelbproben mit Zusätzen versetzt
und nicht gefriergetrocknet. Für die mit Ascorbinsäure behandelten Proben kann
eine Wirkung anhand der Ergebnisse nahezu ausgeschlossen werden. Eine
hochsignifikante Erhöhung um das sechsfache und siebenfache war bei den mit
Citronensäure bzw. Weinsäure versetzten Proben zu erkennen. Die Überprüfung
des pH-Wertes der mit Zusätzen versetzten Proben ergab eine Erniedrigung auf
pH 3,5 bei den mit Citronensäure versetzten Proben und auf pH 2,7 bei den mit
Weinsäure versetzten Proben. Es ist anzunehmen, dass die pH-Wert Absenkung
die Granula denaturiert hat und dadurch die Kupferionen aus den Granula
freigesetzt wurden, so dass sich der Gehalt im Plasma erhöht hat. Darüber, ob
die Kupferionen als freie Ionen oder an Proteinfragmente im Plasma gelöst
vorliegen, kann keine Aussage getroffen werden. Sowohl Citronensäure, als
auch Weinsäure sind in der Lage lösliche Komplexe mit Metallionen zu bilden,
so dass auch eine Umkomplexierung als Ursache des veränderten Gehaltes im
Plasma ebenfalls in Betracht kommt.
In den mit Essigsäure versetzen nativen Eigelbproben, konnte keine Erhöhung
im Gegensatz zu den mit Essigsäure versetzten und danach gefriergetrockneten
Proben festgestellt werden. Daher wurden nochmals Proben mit ICP-OES
gemessen und in diesen, wie in den gefriergetrockneten Proben eine deutliche
Erhöhung des Kupfergehaltes festgestellt. Obwohl die niedrigen mit G-AAS
gemessenen Werte berücksichtigt wurden, war die Erhöhung des Kupfergehaltes
in den nativen mit Essigsäure versetzten Proben signifikant. In Zusammenhang
mit den für die gefriergetrockneten Proben gemessenen Werten, kann davon
ausgegangen werden, dass auch Essigsäure, durch pH-Wert Absenkung zu einer
Freisetzung von Kupferionen führt. Eine Umkomplexierung als Ursache kommt
152
Diskussion
dagegen nicht in Betracht. Eine Bildung von löslichen Kupferacetaten könnte
die erhöhten Kupferwerte im Plasma dagegen ebenfalls erklären.
Eine Freisetzung von Kupfer in den nicht gefriergetrockneten Proben durch
Phospholipase A2 konnte festgestellt werden und bestätigt die in den
gefriergetrockneten Proben stattgefundene tendenzielle, aber nicht signifikante
Erhöhung.
Eine umfassende Kenntnis darüber, wie bestimmte Nahrungszusätze den
Kupfergehalt oder die Verfügbarkeit der Kupferionen im Eigelb beeinflussen, ist
bei der technologischen Verarbeitung wichtig, um zu garantieren, dass gesunde
und ausgewogene Lebensmittel hergestellt werden. Die Wirkung von
verschiedenen Säuren auf die Freisetzung von Kupferionen aus den Granula
wurde, soweit bekannt, noch nicht untersucht, so dass die hier vorliegenden
Erkenntnisse neue Möglichkeiten eröffnen, die technologisch bedingten
Veränderungen nutzbar zu machen und weiter zu erforschen.
5.2.4.2 Veränderung des Eisengehaltes in Plasmaproben
In den zuvor mit Zusätzen behandelten und anschließend gefriergetrockneten
Eigelbproben, konnte im Plasma bei zwei Proben eine Veränderung des
Eisengehaltes verzeichnet werden. In den mit Essigsäure und mit 0,75 % iger
Phospholipase A2 behandelten Proben wurde eine signifikante Erhöhung des
Eisengehaltes festgestellt. Das zuvor untersuchte Plasma von Nativeiern (siehe
4.2.3) wies nur einen Eisengehalt von 4,07 µg/g Tr. M. auf. Da der Eisengehalt
der unbehandelten Proben allerdings bei 7,07 µg lag, ist es möglich, dass auch
die Gefriertrocknung eine Freisetzung der Eisenionen hervorgerufen hat. Die
durch Zugabe von Essigsäure erzeugte Absenkung auf pH 4,1 und damit
verbundene Destabilisierung der Granula, oder die Bildung von löslichem
Eisenacetat können zu einer Erhöhung der Eisenionen im Plasma der Proben
geführt haben.
153
Diskussion
Das Lipovitellin des PvLv-Komplexes der Granula besteht aus einer globulär
gefalteten Proteinkette, in die Lipide eingelagert sind. Das Lipovitellin selbst ist
ein Lipoprotein und die zu 23 % enthaltenen Lipide sind zu 85 bis 90 %
Phospholipide. Wenn diese von der Phospholipase A2 angegriffen werden, dann
könnte dies zur Zerstörung des Lipovitellinkomplexes und in der Folge des
gesamten PvLv-Komplexes führen, in welchem die Eisenionen an Phosvitin
gebunden sind. Die Eisenionen könnten dadurch vollständig vom Phosvitin
gelöst werden, oder auch an Phosvitin gebunden mit diesem im Plasma in
Lösung gehen.
Ein geringer Zusatz an Phospholipase A2 führt zu keiner deutlichen Erhöhung
des Eisengehaltes. Da es sich bei der Phospholipase A2 um ein Enzym handelt,
welches seine Wirkung temperatur- und zeitäbhängig erfüllt, könnte eine
Freisetzung mit der Menge der eingesetzten Phospholipase A2 und der
Temperatur und Dauer der Inkubation korreliert sein.
Wie auch schon von Morris und Greene 1972 postuliert, bewirkt Zugabe von
Ascorbinsäure eine Freisetzung des an Phosvitin gebundenen Eisens (Morris
und Greene, 1972). In der vorliegenden Arbeit wurde eine Erhöhung des
Eisengehaltes im Plasma der mit Ascorbinsäure versetzten Eigelbproben um den
Faktor 10 festgestellt. Für andere Zusätze, wie Citronensäure, Essigsäure und
Weinsäure, ließen sich dagegen keine Quellen finden, die eine Freisetzung von
Eisen diskutieren. Für diese Zusätze konnte durch die vorliegenden Ergebnisse
ebenfalls eine Freisetzung des gebundenen Eisens festgestellt werden, da der
Eisengehalt im Plasma anstieg. Die pH-Wert Absenkung, die bei allen mit Säure
versetzten Proben stattfand, kann nicht allein die Ursache für die Freisetzung
sein, da Castellani et al. (2004) herausfanden, dass einmal gebundene
Eisenionen so leicht durch pH-Wert Absenkung nicht wieder von Phosvitin
abzulösen sind. Die Ascorbinsäure reduziert Fe-(III)-Ionen zu Fe-(II)-Ionen und
bildet mit ihnen einen Komplex (Ternes et al., 1994). Die Eisenfreisetzung
konnte auch von anderen Autoren bestätigt werden (Jacobsen et al., 1999;
154
Diskussion
Jacobsen et al., 2001; Nielsen et al., 2000). Jacobsen et al. (1999) diskutierten,
dass die pH-Wert Absenkung bei Zugabe von Ascorbinsäure nicht der
Hauptgrund für die Freisetzung ist, sondern die Reduzierung von Fe-(III)-Ionen
zu Fe-(II)-Ionen und deren Komplexierung. Für Kupfer dagegen fanden sie
keine Freisetzung durch Ascorbinsäure. Neben Ascorbinsäure sind auch
Citronensäure und Weinsäure in der Lage Metallionen zu komplexieren. Es
könnte also eine Umkomplexierung stattgefunden haben, die dann eine
Erhöhung des Eisengehaltes im Plasma zur Folge hätte, da die gebildeten
Komplexe löslich sind.
In den mit Essigsäure versetzten Proben war ebenfalls ein hochsignifikanter
Anstieg des Eisengehaltes zu verzeichnen. Der Gehalt war aber nur doppelt so
hoch, wie in den nativen Proben. Essigsäure kann durch eine Absenkung des
pH-Wertes zu einer Freisetzung des Eisens geführt haben. Da Eisen durch pHWert Änderung so leicht nicht vom Phosvitin zu lösen ist, wurden entweder
lösliche Eisenacetate gebildet, oder die Granula wurden destabilisiert und die
Eisenionen gingen an Proteinfragmente gebunden in Lösung.
Durch Phospholipase A2 konnte, im Gegensatz zu den Kupferionen, keine
Freisetzung von Eisen in nicht gefriergetrockneten Proben hervorgerufen
werden. Da eine Erhöhung des Eisengehaltes in den gefriergetrockneten
Phospholipaseproben festgestellt wurde, wäre eine Erklärung, dass erst die
Kombination von Phospholipase und Gefriertrocknung zu einer Veränderung
des Eisengehaltes führt.
Erstmalig konnte gezeigt werden, dass Eisenionen auch durch andere Zusätze,
wie Essigsäure, Citronensäure und Weinsäure aus den Granula freigesetzt
werden. Eine weiterführende Untersuchung der Mechanismen der Freisetzung
könnte neue Möglichkeiten in der technologischen Verarbeitung von Eigelb
eröffnen. Inwieweit das neu entwickelte Gefriertrocknungsverfahren eine
Freisetzung gebundener Ionen beeinflusst konnte ebenfalls geklärt werden.
155
Diskussion
5.2.5 Rasterelektronenmikroskopie
Durch die elektronenmikroskopischen Aufnahmen der Granula, sollte geklärt
werden, ob Auflösungserscheinungen, die einen extraembryonalen Abbau
bestätigen würden, zu erkennen sind. Obwohl dies nicht der Fall ist, erscheinen
die Granula der bebrüteten Eier etwas kleiner, so dass eine Auflösung der
Granula zwar nicht stattfindet, aber dem extrazelluläreren Abbau der Granula
möglicherweise
andere
Mechanismen
zugrunde
liegen,
die
zu
einer
Verkleinerung führen. Die Ursachen für die Verkleinerung der Granula kann nur
durch weiterführende Untersuchungen geklärt werden.
156
Zusammenfassung
6. ZUSAMMENFASSUNG
Sarina Bäckermann
Untersuchungen zur Verteilung ausgewählter Kationen in Plasma und
Granula von nativen, embryonierten und lebensmitteltechnologisch
verarbeiteten Hühnereigelb
In der vorliegenden Arbeit wurden die Kationen Magnesium, Calcium, Eisen,
Kupfer und Zink, sowie Thiamin und Thiaminphosphate untersucht.
Für die gleichzeitige Bestimmung des Thiamins und der Thiaminphosphate
wurden eine neue Festphasenextraktion und eine neue HPLC-Methode
entwickelt. Bei der Festphasenextraktion wurde eine C-18 Säule für die
Retardierung des Thiamins und eine SAX Säule für die Retardierung der
Thiaminphosphate gekoppelt. Mit dieser Methode gelang erstmalig eine
gemeinsame Aufreinigung des Thiamins und der Thiaminphosphate aus der
komplizierten Eimatrix, so dass die Selektivität der HPLC Analyse optimiert
wurde.
Bei der neuen HPLC Methode wurde ein C-8 Säule mit einer NH2-Säule
kombiniert, so dass das zu Thiochrom derivatisierte Thiamin auf ersterer und die
Thiochromphosphate auf letzterer retardiert wurden. Bei Verwendung einer
Gradientenelution
konnten
Thiaminphosphate,
inklusive
dargestellt
werden.
Durch
erstmals
dadurch
Thiamintriphosphat,
die
vorherige
Thiamin
und
vollständig
Aufreinigung
alle
separiert
mittels
Festphasenextraktion waren zudem keine die Messung störenden Peaks
vorhanden. Die Nachweisgrenze lag für Thiamin bei 0,3 ng/mL, für
157
Zusammenfassung
Thiaminmonophosphat bei 0,5 ng/mL und für Thiamindiphosphat bei 0,9
ng/mL.
In
Plasma
und
Granula
des
Eigelbs
wurde
der
Thiamin
und
Thiaminphosphatgehalt untersucht. Sowohl in Plasma und Granula nativer, als
auch 5 Tage embryonierter Eier konnten keine Thiaminphosphate nachgewiesen
werden. Es wurde nur Thiamin in Plasma und Granula nachgewiesen und ein
Verhältnis des Thiamingehaltes von 2:1 bestimmt. Im Plasma des Nativeies
wurde ein Thiamingehalt von 3431 ± 698 ng/g Tr. M. und in den Granula von
1522 ± 135 ng/g Tr. M. bestimmt. Im Plasma der 5 Tage embryonierten Eier
beträgt der Thiamingehalt 4377 ± 1074 ng/g Tr. M. und in den Granula 2132 ±
450 ng/g Trockenmasse.
Der Thiamin und Thiaminphosphatgehalt in 5 und 7 Tage alten Embryos wurde
ebenfalls untersucht. Im Gegensatz zu Granula und Plasma des Eigelbs nativer
und embryonierter Eier konnten in den Embryos Thiaminmonophosphat und
Thiamindiphosphat nachgewiesen werden. Der Gehalt betrug in 5 Tage alten
Embryos für Thiamin 1236 ± 441 ng/g Tr. M und für Thiamindiphosphat 7924 ±
963 ng/g Trockenmasse. Thiaminmonophosphat wurde nicht nachgewiesen. In 7
Tage alten Embryos betrug der Gehalt an Thiamin 875 ± 228 ng/g Tr. M und an
Thiamindiphosphat 5519 ± 1247 ng/g Trockenmasse. Thiaminmonophosphat
wurde ebenfalls mit einem Gehalt von 367 ± 163 ng/g Tr. M. gefunden.
Es wurde somit belegt, dass Thiaminphosphate nicht im Eigelb nativer oder
embryonierter Eier vorhanden sind und erst während der Embryogenese im
Embryo gebildet werden.
In einer weiteren Versuchsreihe wurde der Mineralstoffgehalt in nativen,
embryonierten und technologisch bearbeiteten Eiern bestimmt. Für den
Mineralstoffgehalt
in
Fraktionen
nativen
Eigelbs
lagen
nur
wenige
Literaturdaten vor, die Bestimmung in embryonierten Eiern dagegen erfolgte
erstmalig.
158
Zusammenfassung
Da ein Gefriertrocknungsverfahren am Institut neu entwickelt wurde, lagen auch
hierüber keine Literaturdaten vor und die Bestimmung der Mineralstoffgehalte
lieferte Erkenntnisse zur Beeinflussung der Verteilung von Eisen und Kupfer in
derart behandelten Proben. Native Eigelbproben wurden ebenfalls mit
Ascorbinsäure, Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure und Phospholipase A2
versetzt und der Kupfer- und Eisengehalt im Plasma bestimmt.
Für die Verteilung von Kupfer und Zink in Plasma und Granula nativer
unbehandelter Eier konnte nur eine Quelle gefunden werden, so dass die in
dieser Arbeit ermittelten Werte zum Vergleich älterer Daten herangezogen
können. Der in der Literatur angegebene Kupfergehalt für Plasma und Granula
nativen Eigelbs scheint, aufgrund der neu gewonnenen Erkenntnisse, nicht dem
tatsächlichen Gehalt zu entsprechen.
Es konnte für einige Mineralstoffe in Plasma und Granula embryonierter Eier
eine höhere Konzentration als in nativen Eiern festgestellt werden. In den
Granula embryonierter Eier waren der Magnesiumgehalt mit 1500 ± 280 µg/g
Tr. M. hochsignifikant erhöht und der Eisengehalt mit 410 ± 60 µg/g Tr. M.
hochsignifikant erniedrigt. Im Plasma embryonierter Eier war der Calciumgehalt
mit 290 ± 90 µg/g Tr. M. signifikant und der Magnesiumgehalt mit 48,8 ± 4,7
µg/g Tr. M., der Eisengehalt mit 20,3 ± 8,4 µg/g Tr. M und der Zinkgehalt mit
2,24 ± 0,7 µg/g Tr. M hochsignifikant erhöht.
Ein extraembryonaler Granulaabbau, der zu einem erhöhten Mineralstoffgehalt
im Plasma führen könnte, konnte in elektronenmikroskopischen Aufnahmen
nicht bestätigt werden. Die Granula aus Eigelb nativer und embryonierter Eier
unterschied sich kaum und Auflösungserscheinungen waren nicht zu erkennen.
In einer weiteren Versuchsanordnung wurde der Mineralstoffgehalt im Plasma
mit Zusätzen versehener und anschließend gefriergetrockneter Eigelbproben
bestimmt. In den Proben mit 2 % Essigsäure war der Kupfer- und Eisengehalt
und in denen mit 0,75 % Phospholipase A2 der Eisengehalt signifikant erhöht.
159
Zusammenfassung
Der Kupfergehalt im Plasma von mit Citronensäure, Weinsäure und
Phospholipase A2 versetzten Proben wich hochsignifikant von den Proben ohne
Zusatz ab. Der Kupfergehalt in den Citronensäureproben war 6-mal höher und in
den Weinsäureproben 7-mal höher, als im Plasma nativen Eigelbs. Der Gehalt in
den Essigsäureproben war signifikant erhöht, der in den Ascorbinsäureproben
dagegen nicht.
Der Eisengehalt im Plasma der mit Ascorbinsäure, Citronensäure, Essigsäure
und Weinsäure versetzten Proben war hochsignifikant erhöht. Der Gehalt der
Ascorbinsäureproben war 10-mal höher, der in den Citronensäureproben 5-mal
höher, der in den Essigsäureproben 2 mal höher und der in den
Weinsäureproben 4 mal höher als im Plasma nativer Eigelbproben. Es konnte
gezeigt werden, dass einige Zusätze den Kupfer- und Eisengehalt im Plasma
vom Eigelb verändern.
160
Summary
7. SUMMARY
Sarina Bäckermann
Analyses of the distribution selected cations in plasma and granules of
native, embryonated and technologically processed egg yolk
In this dissertation the cations magnesium, calcium, iron, copper and zinc, as
well as thiamin and thiaminphosphates were analysed.
For the simultaneous determination of thiamin and the thiaminphosphates a new
solid phase extraction and HPLC method was developed. For solid phase
extraction retention of thiamin was achieved on a C-18 cartridge and of
thiaminphosphates on a SAX (strong-anion-exchange) cartridge, which were
closely connected. With this method a separation of thiamin and
thiaminphosphates from the other egg components was achieved and therefore
selectivity of the following HPLC analysis optimized.
For the new HPLC method a C-8 column was connected to a NH2 column, so
the derivated thiamin was held on the first column and the derivated
thiaminphosphates on the latter. With gradient elution thiamin and
thiaminphosphates, including thiamintriphosphat, were separated completely
from each other. Due to the prior solid phase extraction no interfering peaks
were present. The limit of detection was 0,3 ng/mL for thiamin, 0,5 ng/mL for
thiaminmonophosphate and 0,9 ng/mL for thiamindiphosphate.
In plasma and granules of egg yolk the content of thiamin and thiaminphosphat
was determined. In plasma and granules of native eggs as well as in 5 days
embryonated eggs no thiaminphosphates could be detected. Only thiamin was
161
Summary
present in plasma and granules. The relation in plasma and granules was 2:1.
The thiamin content in plasma of native eggs was 3431 ± 698 ng/g dry mass and
in granules 1522 ± 135 ng/g dry mass. In plasma of 5 days embryonated eggs
thiamin content was 4377 ± 1074 ng/g dry mass and in granules 2132 ± 450 ng/g
dry mass.
The thiamin content of 5 and 7 day old embryos was also analysed. In contrary
to the findings in plasma and granules of native and embryonated eggs
thiaminphosphates as well as thiamin were found in embryos. Thiamin content
in 5 day old embryos was 1236 ± 441 ng/g dry mass and thiamindiphosphat
content was 7924 ± 963 ng/g dry mass. Thiaminmonophosphate was not
detected. In 7 day old embryos thiamin content was 875 ± 228 ng/g dry matter
and thiamindiphosphat content was 5519 ± 1247 ng/g dry matter.
Thiaminphosphat was also present with 367 ± 163 ng/g dry matter. No
thiamintriphosphat was detected.
It could be demonstrated that thiaminphosphates are not present in plasma and
granules of native and embryonated eggs and that they are synthesized by the
embryo during embryogenesis.
In another experimental series the mineral content in native, embryonated and
technologically treated egg yolk was studied.
For the distribution of iron, copper and zinc in plasma and granules in egg yolk
only few references could be found. Only one for copper and zinc was found, so
the presented data in this work could be used for comparison with older
references. For copper we found different concentrations in plasma and granules
and there are reasons to believe that older references may not be accurate.
Apparently determination of minerals in plasma and granules of embryonated
eggs has not performed in the past.
For minerals in plasma and granules of embryonated eggs higher concentrations
were found than in native eggs. Magnesium content in granules of embryonated
eggs was 1500 ± 280 µg/g dry matter and the iron content 410 ± 60 µg/g dry
162
Summary
matter and therefore highly significantly higher for magnesium and lower for
iron. In plasma of embryonated eggs calcium content was 290 ± 90 µg/g dry
matter and magnesium contend was 48,8 ± 4,7 µg/g dry matter both significantly
higher. The iron content was 20,3 ± 8,4 µg/g dry matter and the zinc content was
2,24 ± 0,7 µg/g dry matter, both highly significantly higher.
A degradation of granules could be an explanation for the raised mineral content
but could not be confirmed in electron micrographs of granules of native and
embryonated eggs.
In another experimental series the variation in mineral content in plasma of eggs
which were treated with additives and freeze dried was determined. As the
freeze drying method was newly invented, the analysis of mineral distribution
provided new information to which extent this method affected mineral contents
in plasma and granules. The mineral content in plasma and granules of native
egg yolk which was treated with ascorbic acid, citric acid, acetic acid, tartaric
acid and phospholipase A2, was also determined.
In samples with addives which were freeze dried iron and copper content in
plasma of samples with acetic acid and iron content in samples with
phospholipase A2 was significantly higher.
The release of minerals due to food additives in native egg yolk could be
demonstrated: It was found that copper contend increased highly significantly in
samples which were treated with citric acid, tartaric acid and phospholipase A2.
The content for citric acid was 6 times higher and for tartaric acid 7 times higher
than in plasma of native egg yolk. The copper contend in samples with acetic
acid was significantly higher. The samples with ascorbic acid showed no
different copper contend.
The iron content in plasma of samples with ascorbic acid, citric acid, acetic acid
and tartaric acid was highly significantly higher. For ascorbic acid the content
was 10 times higher, for citric acid 5 times higher, for acetic acid 2 times higher
and for tartaric acid 4 times higher than in plasma of native egg yolk.
163
Summary
It could be shown that several food additives alter the copper and iron content in
plasma of egg yolk.
164
Anhang
8. ANHANG
8.1 CHEMIKALIENVERZEICHNIS
Bezeichnung
Summenformel
Reinheit
Bezugsquelle
Acetonitril
CH3CN
für UV
Analyse
Ascorbinsäure
C6H8O6
p.a. puriss.
>99%
Bromcyan
BrCN
Fisher Scientific GmbH,
Schwerte, Deutschland
Fluka (Sigma- Aldrich
Laborchemikalien GmbH),
Seelze, Deutschland
Sigma- Aldrich
Laborchemikalien GmbH,
Seelze, Deutschland
CitronensäureMonohydrat
Dikaliumhydrogenphosphat
C6H8O7 x H2O
p.a. >99,5%
ACS ISO
K2HPO4
p.a.; >99%
Essigsäure 100%ig
C2H4O2
p.a. >99,8%
Kaliumchlorid
KCl
p.a. >99,5%
Kaliumdihydrogenphosphat
KH2PO4
p.a.; >99%
ACS
Carl Roth GmbH & Co KG,
Karlsruhe, Deutschland
Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland
Carl Roth GmbH & Co KG,
Karlsruhe, Deutschland
Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland
Palladium MatrixModifier
Pd(NO3)2 x 2H2O
Carl Roth GmbH & Co KG,
Karlsruhe, Deutschland
Fluka (Sigma- Aldrich
p.a. puriss.
Laborchemikalien GmbH),
>99%
Seelze, Deutschland
AppliChem GmbH, Darmstadt,
p.a. >99%
Deutschland
für HPLC
ACROS organics (Thermo
Gradientenan Fisher Scientific Inc.) Geel,
alyse
Belgium
Merck KGaA, Darmstadt,
p.a. 99% ISO Deutschland
Fluka (Sigma- Aldrich
Laborchemikalien GmbH),
p.a. puriss.
Seelze, Deutschland
Perchlorsäure 70%ig
HClO4
suprapur
Salpetersäure 65%ig
HNO3
suprapur
Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland
Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland
Salpetersäure 65%ig
HNO3
p.a. ISO
Carl Roth GmbH & Co KG,
Karlsruhe, Deutschland
Lanthanchlorid
MagnesiumnitratHexahydrat
LaCl3
Methanol
NatriumhydroxidPlättchen
CH3OH
Mg(NO3)2 x 6H2O
NaOH
165
Anhang
Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland
Salzsäure 25%ig
HCl
Seesand
SiO2
p.a.
p.a.
gereinigt,
geglüht
Thiamindiphosphat
Thiaminchloridhydrochlorid
C12H18ClN4O7P2 S
> 95 %
BioChemika (AppliChem GmbH),
Darmstadt, Deutschland
C12H18Cl2N4OS
> 99 %
Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland
C12H18ClN4O4P S
> 99 %
Sigma- Aldrich Laborchemikalien
GmbH, Seelze, Deutschland
C12H18ClN4O10P3 S
CaCl2 in 6,5%iger
HCl
FeCl3 in 15%iger
HCl
> 99 %
Wako Chemicals GmbH, Neuss,
Germany; www.wako-chemicals.de
für G-AAS
VWR International GmbH,
Darmstadt, Deutschland
für G-AAS
VWR International GmbH,
Darmstadt, Deutschland
Thiaminmonophosphat
Thiamintriphosphat
Titrisol Calcium
Standard
Titrisol Eisen
Standard
Titrisol Kupfer
Standard
CuCl2 in H2O
ZnCl2 in 0,06% iger
Titrisol Zink Standard HCl
Trichloressigsäure
CCl3COOH
tridestilliertes Wasser
(Umkehrosmose MilliQ Wasser)
Triton X-100
t- Octylphenoxypolyethoxyethanol
Weinsäure
C4H6O6
Carl Roth GmbH & Co KG,
Karlsruhe, Deutschland
für G-AAS
VWR International GmbH,
Darmstadt, Deutschland
für G-AAS
Merck KGaA, Darmstadt,
Deutschland
p.a. > 99%
Carl Roth GmbH & Co KG,
Karlsruhe, Deutschland
> 18MOhm
Millipore, Massachusetts, USA
für G-AAS
p. a.
166
Sigma- Aldrich Laborchemikalien
GmbH, Seelze, Deutschland
Riedel de Haen (Sigma-Aldrich
Laborchemikalien GmbH), Seelze,
Germany
Anhang
8.2 GERÄTELISTE
Tischzentrifuge, Hettich Universal, 1200
Zeeman-Graphitrohr-Atomabsorptionsspektrometer
4100ZL
Perkin-Elmer LAS GmbH RodgauJügesheim, Deutschland
LOT-Oriel GmbH & Co. KG,
Darmstadt, Deutschland
G. Kern & Sohn GmbH, Albstadt,
Deutschland
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Macherey-Nagel GmbH & Co. KG,
Düren, Deutschland
Supelco, Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, München, Deutschland
Philips GmbH, Hamburg, Deutschland
Perkin-Elmer LAS GmbH RodgauJügesheim, Deutschland
Dr. Ing. H. Knauer GmbH, Berlin,
Deutschland
Dr. Ing. H. Knauer GmbH, Berlin,
Deutschland
Dr. Ing. H. Knauer GmbH, Berlin,
Deutschland
Alltech-Grom GmbH, RottenburgHailfingen, Deutschland
Dr. Ing. H. Knauer GmbH, Berlin,
Deutschland
Dr. Ing. H. Knauer GmbH, Berlin,
Deutschland
Dr. Ing. H. Knauer GmbH, Berlin,
Deutschland
Varian Deutschland GmbH,
Darmstadt, Deutschland
Siemens Aktiengesellschaft, München,
Deutschland
Janke-Kunkel GmbH & Co. KG-IKA,
Labortechnik, Staufen, Breisgau
Andreas Hettich GmbH & Co
KG, Tuttlingen, Deutschland
Perkin-Elmer LAS GmbH RodgauJügesheim, Deutschland
Zentrifuge, 3200 Eppendorf
Eppendorf Vertrieb Deutschland
GmbH, Wesseling-Berzdorf,
Deutschland
Autosampler AS70
Einelementlampen
Feinwaage Kern 770
Festphase, LiChrolut
Festphasensäulen, Chromabond C-18 ec
Festphasensäulen, Discovery DSC SAX
Flammen-Atomabsorptionsspektrometer PU9100x
Fluoreszenzdetektor LC 240
HPLC-Vorsäule Eurospher-100, C-8 30 mm x 4,6 mm
HPLC-Säule Eurospher-100, C-8, 250 x 4 mm, 5 µm Ø
HPLC-Säule LiChrospher-100, NH2, 250 x 4 mm, 5 µm Ø
HPLC-Säule Grom Saphir 110 NH2, 150 x 4 mm, 5 µm Ø
HPLC-Mischkammer
HPLC-Probenschleife
HPLC-Pumpen Modell 64
ICP-OES, vista pro
Schreiber, Kompensograph III
Stabrührer, Ultra Turrax, TP 18-10,
167
Abkürzungsverzeichnis
9. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AAS
ATP
BG
bzw.
DGE
DNA
EDTA
EG
engl.
F.S.
FEP
HDL
HPLC
ICP-OES
L
LDL
n/a
NADH
NG
PE
PFA
PLA
PMP
PP
PTFE
PvLv
RNA
RZB
SAX
SPF
T
TDP
TMP
Tr. M.
TTP
VLDL
Atomabsorptionsspektrometrie
Adenosintriphosphat
Bestimmungsgrenze
beziehungsweise
Deutsche Gesellschaft für Ernährung
Desoxyribonukleinsäure
Ethylendiamintetraessigsäure
Erfassungsgrenze
englisch
Feuchtsubstanz
Copolymer aus Hexaflourpropylen und Tetraflourethylen
engl. = high density lipoprotein = Lipoprotein hoher Dichte
engl. = High pressure liquid chromatography =
Hochdruckflüssigchromatographie
engl. = inductively coupled plasma optical emission spectrometry = induktiv
gekoppelte plasma optische Emissionsspetrometrie
Lipovitellin
engl. Low density lipoprotein = Lipoprotein geringer Dichte
nicht angegeben
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Wasserstoff
Nachweisgrenze
Polyethylen
Perflouralkoxy-Polymere
Phospholipase
Polymethylpenten
Polypropylen
Polytetrafluorethylene
Phosvitin-Lipovitellin-Komplex
Ribonukleinsäure
Relative Zentrifugationsbeschleunigung
engl.: strong anion exchanger = starker anionen Austauscher
spezifisch pathogenfrei
Thiamin
Thiamindiphosphat
Thiaminmonophosphat
Trockenmasse
Thiamintriphosphat
engl. Very low density lipoprotein = Lipoprotein sehr geringer Dichte
168
Tabellenverzeichnis
10. TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1: Zusammensetzung des Eigelbs
Tabelle 2: Gehalt und Schwankung einiger Mineralstoffe im Ei
Tabelle 3: Gehalt, Verteilung und Dialysierbarkeit der Mineralstoffe in Eigelbfraktionen
Tabelle 4: Mineralstoffgehalt im gesamten Ei
Tabelle 5: Mineralstoffgehalt im Eigelb
Tabelle 6: Mineralstoffgehalt im Eiklar
Tabelle 7: Calciumgehalt im Ei
Tabelle 8: Verteilung und Dialysierbarkeit der Calciumionen im Ei
Tabelle 9: Magnesiumgehalt im Ei
Tabelle 10: Magnesiumgehalt in Eigelbfraktionen
Tabelle 11: Verteilung und Dialysierbarkeit der Magnesiumionen im Ei
Tabelle 12: Absoluter Spurenelementgehalt im Ei
Tabelle 13: Eisengehalt im Ei
Tabelle 14: Eisengehalt in Eigelbfraktionen
Tabelle 15: Verteilung und Dialysierbarkeit der Eisenionen im Ei
Tabelle 16: Kupfergehalt in Eigelbfraktionen
Tabelle 17: Zinkgehalt im Ei
Tabelle 18: Zinkgehalt in Eigelbfraktionen
Tabelle 19: Enzyme mit Thiaminpyrophosphat
Tabelle 20: Zusammensetzung der Proben zur Mineralstoffbestimmung
Tabelle 21: Proben für die Thiaminanalytik
Tabelle 22: Gradientensystem
Tabelle 23: Analysenplan für die Mineralstoffbestimmung mit F-AAS und G-AAS
169
Tabellenverzeichnis
Tabelle 24: Analysenplan für die Mineralstoffbestimmung mit G-AAS und ICP-OES
Tabelle 25: Kalibrierlösungen für die Calciumbestimmung in Granulaproben
Tabelle 26: Kalibrierlösungen für die Calciumbestimmung in Plasmaproben
Tabelle 27: Kalibrierlösungen für die Calciumbestimmung in Eiklarproben
Tabelle 28: Kalibrierlösungen für die Magnesiumbestimmung in Granulaproben
Tabelle 29: Kalibrierlösungen für die Magnesiumbestimmung in Plasmaproben
Tabelle 30: Kalibrierlösungen für die Magnesiumbestimmung in Eiklarproben
Tabelle 31: Kalibrierlösungen für die Eisenbestimmung in Granulaproben
Tabelle 32: Standardaddition der Granulaproben für die Zinkbestimmung
Tabelle 33: Standardaddition der Plasmaproben für die Zinkbestimmung
Tabelle 34: Standardaddition der Eiklarproben für die Zinkbestimmung
Tabelle 35: Standardaddition der gefriergetrockneten Plasmaproben
Tabelle 36: Standardaddition der Proben A1-A3, C1-C3, E1-E3, W1-W3
Tabelle 37: Standardaddition der Proben AC und EW
Tabelle 38: Zusammensetzung der Lösungen für die Kupferbestimmung
Tabelle 39: Zusammensetzung der Lösungen für die Eisenbestimmung
Tabelle 40: Analysenplan der mit ICP-OES gemessenen Proben
Tabelle 41: Thiamingehalt der Eigelbfraktionen im Nativei
Tabelle 42: Thiamingehalt in den Fraktionen embryonierter Eier
Tabelle 43: Signifikanztest zum Thiamingehalt in Plasma und Granula
Tabelle 44: Thiamingehalte in Proben der 5 und 7 Tage alten Embryos
Tabelle 45: Thiamingehalte in 5 und 7 Tage alten Embryos
Tabelle 46: Wiederfindungsrate
Tabelle 47: Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze
Tabelle 48: Trockenmassebestimmung
170
Tabellenverzeichnis
Tabelle 49: Mineralstoffgehalt in Granula nativer Eier und von Bruteiern
Tabelle 50: Signifikanztest der Mineralstoffgehalte in den Granula
Tabelle 51: Mineralstoffgehalt im Plasma nativer Eier und von Bruteiern
Tabelle 52: Signifikanztest der Mineralstoffgehalte im Plasma
Tabelle 53: Kupfergehalt in gefriergetrockneten Plasmaproben
Tabelle 54: Signifikanztest der Erhöhung des Kupfergehaltes
Tabelle 55: Kupfergehalt im Plasma der Nativeiproben mit und ohne Zusätzen
Tabelle 56: Signifikanztest der Erhöhung des Kupfergehaltes
Tabelle 57: pH-Werte der Proben mit Zusätzen
Tabelle 58: Eisengehalt in gefriergetrockneten Plasmaproben
Tabelle 59: Signifikanztest der Erhöhung des Eisengehaltes
Tabelle 60: Eisengehalt im Plasma der Nativeiproben mit und ohne Zusatz
Tabelle 61: Signifikanztest der Erhöhung des Eisengehaltes
Tabelle 62: Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze verschiedener Autoren
171
Abb. Verzeichnis
11. ABB. VERZEICHNIS
Abbildung 1: Schematischer Aufbau des Eies nach Schnorr (Schnorr, 1996) mit Änderungen
nach Ternes (Ternes et al., 1994)
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Eigelbpartikel
Abbildung 3: Schematische Aufbau eines Embryo am 10 bis 11 Bebrütungstag (Schnorr,
1996)
Abbildung 4: Thiamin und Thiaminphosphate
Abbildung 5: Thiochrom-Reaktion
Abbildung 7: Auftrennung der Reinsubstanzen
Abbildung 8: Auftrennung des Nativeiplasmas
Abbildung 9: Autftrennung der Nativeigranula
Abbildung 10: Auftrennung des Bruteiplasma
Abbildung 11: Auftrennung der Bruteigranula
Abbildung 12: Thiamingehalt in Nativeiern und Bruteiern
Abbildung 13: Auftrennung der Reinsubstanzen
Abbildung 14: Chromatogramm der Probe 5 Tage alter Embryos
Abbildung 15: Chromatogramm der Probe 7 Tage alter Embryos
Abbildung 16: Kupfergehalt in gefriergetrockneten Proben mit und ohne Zusatz
Abbildung 17: Kupfergehalte der Ascorbinsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Abbildung 18: Kupfergehalte der Citronensäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Abbildung 19: Kupfergehalte der Essigsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Abbildung 20: Kupfergehalte der Weinsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Abbildung 21: Kupfergehalt der Phospholipaseproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
172
Abb. Verzeichnis
Abbildung 22: Eisengehalt in gefriergetrockneten Proben mit und ohne Zusatz
Abbildung 23: Eisengehalte der Ascorbinsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Abbildung 24: Eisengehalte der Citronensäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Abbildung 25: Eisengehalte der Essigsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Abbildung 26: Eisengehalte der Weinsäureproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Abbildung 27: Eisengehalt der Phospholipaseproben im Vergleich zu Proben ohne Zusatz
Abbildung 28: Granula aus dem Eigelb nativer Eier
Abbildung 29: Granula aus dem Eigelb 5 Tage embryonierter Eier
173
Lit. Verzeichnis
12. LIT. VERZEICHNIS
ABDEL-KADER, Z. M. (1992).
Comparison of AOAC and high- performance liquid chromatographic methods for thiamin
determination in foods.
Food Chem. 43:393-397.
ALBRIGHT, K. J., D. T. GORDON, und O. J. COTTERILL. (1984).
Release of Iron from Phosvitin by Heat and Food-Additives.
J. Food Sci. 49:78-81.
ALYABIS, A. M. und K. L. SIMPSON. (1993).
Comparison of reverse- phase c-18 open column with the bio- rex 70 column in the
determination of thiamin.
J. Food Compos. Anal. 6:166-171.
ARIAEY-NEJAD, M. R., M. BALAGHI, E. M. BAKER, und H. E. SAUBERLICH. (1970).
Thiamin Metabolism in Man.
Am. J. Clin. Nutr. 23:764-778.
BAINES, M. (1985).
Improved high performance liquid chromatographic determination of thiamin diphosphate in
erythrocytes.
Clin. Chim. Acta 153:43-48.
BALL, G. F. M. (2004).
Thiamin (Vitamin B1).
in Vitamins- Their Role in the Human Body.
Blackwell, Science. 274-288
BATIFOULIER, F., M. A. VERNY, C. BESSON, C. DEMIGNE, und C. REMESY. (2005).
Determination of thiamine and its phosphate esters in rat tissues analyzed as thiochromes on a
RP-amide C16 column.
J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 816:67-72.
BELLAIRS, R. (1958).
The conversion of yolk into cytoplasm in the chick blastoderm as shown by electron
microscopy.
J. Embryol. Exp. Morphol. 6:129-161.
BELLAIRS, R. (1961).
The structure of the yolk of the hen's egg as studied by electron microscopy. I. The yolk of the
unincubated egg.
J. Biophys. Biochem. Cytol. 11:207-225.
BERG, G. G. und J. SZEKERCZES. (1962).
Trimetaphosphatase in Developing Chick.
J. Exp. Zool. 149:147-152.
174
Lit. Verzeichnis
BETTENDORFF, L., C. GRUNDFILS, R. C. DE, und E. SCHOFFENIELS. (1986).
Determination of thiamine and its phosphate esters in human blood serum at femtomole
levels.
J. Chromatogr. 382:297-302.
BETTENDORFF, L., M. PEETERS, C. JOUAN, P. WINS, und E. SCHOFFENIELS. (1991).
Determination of Thiamin and Its Phosphate-Esters in Cultured Neurons and Astrocytes
Using An Ion-Pair Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatographic Method.
Anal. Biochem. 198:52-59.
BETTENDORFF, L., P. WINS, und E. SCHOFFENIELS. (1990).
Regulation of ion uptake in membrane vesicles from rat brain by thiamine compounds.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 171:1137-1144.
BIAGI, - (1964). Proteins of the high density fraction of the fluid and granules of yolk during
embryogenesis.
Biochim. Biophys. Acta 93:421-422.
BICKARDT, K. (1992).
Kompendium der allgemeinen inneren Medizin und Pathophysiologie für Tierärzte.
Parey, Berlin.
BITSCH, R. (1997).
Vitamin B1.
in H. K. BIESALSKI, J. SCHREZENMEIR, P. WEBER, und H. WEISS, (Hrsg.). Vitamine Physiologie, Pathophysiologie, Therapie. 67-73
Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York.
BJOERN-RASMUSSEN, E. und L. HALLBERG. (1979).
Effect of Animal Proteins on Iron Absorption of Food in Man.
Nutr.Metabol. 23; 192-202
BONTEMPS, J., L. BETTENDORFF, J. LOMBET, C. GRUNDFILS, G. DANDRIFOSSE,
E. SCHOFFENIELS, F. NEVEJANS, und J. CROMMEN. (1984a).
Poly(Styrene Divinylbenzene) As Reversed-Phase Adsorbent for the High-Performance
Liquid-Chromatographic Analysis of Thiochrome Derivatives of Thiamine and
Phosphorylated Esters.
J. Chromatogr. 295:486-491.
BONTEMPS, J., P. PHILIPPE, L. BETTENDORFF, J. LOMBET, G. DANDRIFOSSE, E.
SCHOFFENIELS, und J. CROMMEN. (1984b).
Determination of thiamine and thiamine phosphates in excitable tissues as thiochrome
derivatives by reversed-phase high-performance liquid chromatography on octadecyl silica.
J. Chromatogr. 307:283-294.
BOTTICHER, B. und D. BOTTICHER. (1986).
Simple rapid determination of thiamin by a HPLC method in foods, body fluids, urine and
faeces.
Int. J. Vitam. Nutr. Res. 56:155-159.
175
Lit. Verzeichnis
BRUNNEKREEFT, J. W., H. EIDHOF, und J. GERRITS. (1989).
Optimized determination of thiochrome derivatives of thiamine and thiamine phosphates in
whole blood by reversed-phase liquid chromatography with precolumn derivatization.
J. Chromatogr. 491:89-96.
BURCH, H. B., O. A. BESSEY, R. H. LOVE, und O. H. LOWRY. (1952).
The Determination of Thiamine and Thiamine Phosphates in Small Quantities of Blood and
Blood Cells.
J.Biol. Chem. 198:477-490.
BURLEY, R. W. und D. V. VADEHRA.(Hrsg.) (1989).
The Avian Egg - Chemistry and Biology.
John Wiley, New York.
CALLENDER, S. T., S. R. MARNEY, und G. T. WARNER. (1970).
Eggs and iron absoprtion.
Br. J. Haematol. 19;6:657-665
CASTELLANI, O., C. GUERIN-DUBIARD, E. VID-BRIAND, und M. ANTON. (2004).
Influence of physicochemical conditions and technological treatments on the iron binding
capacity of egg yolk phosvitin.
Food Chem. 85:569-577.
CAUSERET, D., E. MATRINGE, und D. LORIENT. (1991).
Ionic-Strength and Ph Effects on Composition and Microstructure of Yolk Granules.
J. Food Sci. 56:1532-1536.
CAUSERET, D., E. MATRINGE, und D. LORIENT. (1992).
Mineral Cations Affect Microstructure of Egg Yolk Granules.
J. Food Sci. 57:1323-1326.
CHANG, C. M., W. D. POWRIE, und O. FENNEMA. (1977b).
Studies on the Gelation of Egg Yolk and Plasma upon Freezing and Thawing.
J. Food Sci 42:1658-1165 .
CHANG, C. M., W. D. POWRIE, und O. FENNEMA. (1977a).
Microstructure of Egg-Yolk.
J. Food Sci. 42:1193-1200.
CHASE, G. W., W. O. LUNDEN, Jr., A. G. SOLIMAN, und R. R. EITENMILLER. (1993).
Method modification for liquid chromatographic determination of thiamine, riboflavin, and
pyridoxine in medical foods.
J. AOAC Int. 76:1276-1280.
COTTERILL, O. J., W. W. MARION, und E. C. NABER. (1977).
A nutrient re-evaluation of shell eggs.
Poult. Sci. 56:1927-1934.
176
Lit. Verzeichnis
DEGUISEPPE, L. und G. RINDI. (1958).
Chromatographic Separation and Determination of Thiamine and Thiamine Phosphoric Esters
on Ion-ExCHANGe Resins.
J. Chromatogr. 1:545-551.
DEWAR, W. A., P. W. TEAGUE, und J. N. DOWNIE. (1974). The transfer of minerals from
the egg to the chick embryo from the 5th to 18th days of incubation.
Br. Poult. Sci. 15:119-129.
DUNN, B. E. und M. A. BOONE. (1977).
Growth and mineral content of cultured chick embryos.
Poult. Sci. 56:662-672.
EGI, Y. und T. KAWASAKI. (2003).
Thiamin - Properties and Determination.
in B. CABALLERO, (Hrsg..) Encyclopedia of food sciences and nutrition 5767-5780.
Academic Press, Amsterdam.
EICHENBAUM, J. W. und J. R. Cooper. (1971).
Restoration by thiamine of the action potential in ultraviolet irradiated nerves.
Brain Res. 32:258-260.
EISENBRAND, G.(Hrsg.) (2006).
Römpp Online. www.roempp.com Online.
ELMADFA, I; D. FRITZSCHE (Hrsg.) (1985).
Die große Vitamin- und Mineralstoff- Tabelle. Die Vitamine und Mineralstoffe unserer
Lebensmittel.
Gräfe, Unzer, München.
ENGELHARDT, W. v. und G. BREVES. (Hrsg.) (2000).
Physiologie der Haustiere.
Enke im Hippokrates Verlag, Stuttgart.
FAYOL, V. (1997).
High-performance liquid chromatography determination of total thiamin in biological and
food products.
Methods Enzymol. 279:57-66.
FOX, J. M. und W. DUPPEL. (1975).
The action of thiamine and its di- and triphosphates on the slow exponential decline of the
ionic currents in the node of Ranvier.
Brain Res. 89:287-302.
FREEMAN, B. M. und M. A. Vince. (1974).
Development of the avian embryo.
John Wiley, New York.
GARLAND, T. D. und W. D. POWRIE. (1978).
Isolation of Myelin Figures and Low- Density Lipoproteins from Egg Yolk Granules.
J. Food Sci. 43:592-597.
177
Lit. Verzeichnis
GECKELER, K. E.; (Hrsg.) (1998).
Bioanalytische und biochemische Labormethoden.
Vieweg Verlagsgesellschaft, Braunschweig/Wiesbaden.
GENNARO, M. C. (1991).
Separation of water soluble vitamins by reversed- phase ion- interaction- reagent highperformance liquid chromatography: Application to multivitamin pharmaceuticals.
J. Chromatogr. Sci. 29:410-415.
GERRITS, J., H. EIDHOF, J. W. BRUNNEKREEFT, und J. HESSELS. (1997).
Determination of thiamin and thiamin phosphates in whole blood by reversed-phase liquid
chromatography with precolumn derivatization.
Methods Enzymol. 279:74-82.
GLASER, O. und E. PIEHLER. (1934).
The mobilization of calcium during development.
Biol. Bull. Wood`s Hole 66:351-356.
GOTTWALD, W. (Hrsg.) (2004).
Statistik für Anwender.
Wiley-VCH, Weinheim.
GRAU, C. R. (1976).
Ring Structure of Avian Egg-Yolk.
Poult. Sci. 55:1418-1422.
GRAU, C. R. und T. E. ROUDYBUSH. (1979b).
Mineral composition of yolk fractions and whole yolk from eggs of restricted ovulator hens.
Poult. Sci. 58:1143-1148.
GRAU, C. R. und T. E. ROUDYBUSH. (1979a).
Mineral Composition of Yolk Fractions and Whole Yolk from Eggs of Restricted Ovulator
Hens.
Poult. Sci. 58:1143-1148.
GREENGARD., O., A. SENTENAC., und N. MENDELSOHN. (1964)
Phosvitin the iron carrier of egg yolk.
Biochim. Biophys. Acta 90:406-407.
GROGAN, J. und G. TABORSKY. (1986).
Iron binding by phosvitin: variation of rate of iron release as a function of the degree of
saturation of iron binding sites.
J. Inorg. Biochem. 26:237-246.
GUERRERO, A., J. A. CARMONA, I. MARTINEZ, F. CORDOBES, und P. PARTAL.
(2004).
Effect of pH and added electrolytes on the thermal- induced transitions of egg yolk.
Rheol Acta 43:539-549.
178
Lit. Verzeichnis
HASIAK, R. J., D. V. VADEHRA, R. C. BAKER und L. HOOD. (1972).
Effect of certain physical and chemical treatments on the microstructure of egg yolk.
J. Food Sci.913-917.
HERVE, C., P. BEYNE, und E. DELACOUX. (1994).
Determination of Thiamine and Its Phosphate-Esters in Human Erythrocytes by HighPerformance Liquid-Chromatography with Isocratic Elution.
J. Chromatogr. B-Biomed. Appli. 653:217-220.
HISIL, Y. und S. ÖTLES. (1997).
Changes of Vitamin B1 Concentrations during Storage of Hen Eggs.
Lebensm.-Wiss.u.Technol.30:320-323
ICHINOSE, N. und M. MITSUI. (1988).
Fluorescence High-Performance Liquid-Chromatography of Trace Microamounts of
Phosphate by Oxidation of Thiamine to Thiochrome.
Fresenius’ J. Anal. Chem. 330:634-636.
ISHII, K., K. SARAI, H. SANEMORI, und T. KAWASAKI. (1979).
Analysis of thiamine and its phosphate esters by high-performance liquid chromatography.
Anal. Biochem. 97:191-195.
IWATA, H., T. MATSUDA, und H. TONOMURA. (1988).
Improved high-performance liquid chromatographic determination of thiamine and its
phosphate esters in animal tissues.
J. Chromatogr. 450:317-323.
JACOBSEN, C., J. DLER-NISSEN, und A. S. MEYER. (1999).
Effect of ascorbic acid on iron release from the emulsifier interface and on the oxidative
flavor deterioration in fish oil enriched mayonnaise.
J. Agric. Food Chem. 47:4917-4926.
JACOBSEN, C., M. TIMM, und A. S. MEYER. (2001).
Oxidation in fish oil enriched mayonnaise: ascorbic acid and low pH increase oxidative
deterioration.
J. Agric. Food Chem. 49:3947-3956.
JOHNSTON, P. M. und C. L. COMAR (1955).
Distribution and contribution of calcium from the albumen, yolk and shell to the developing
chick embryo.
Am. J. Physiol 183:365-370.
JUURLINK, B. H. und M. A. GIBSON. (1973).
Histogenesis of the yolk sac in the chick.
Can. J. Zool. 51:509-519.
KAWASAKI, T. und Y. EGI. (2000a).
Thiamine.
in LEENHEER, A. P (Hrsg.) Modern chromatographic analysis of the vitamins. 365-389
179
Lit. Verzeichnis
KIM, H.-S., D.-K. JANG, D.-K. WOO, und K.-L. WOO. (2002).
Simultaneous determination of water soluble vitamins in multi nutrient tablets by RP-HPLC.
J. Food Sci. Nutr. 7:12-17.
KIMURA, M. und Y. ITOKAWA. (1985).
Determination of Thiamine and Its Phosphate-Esters in Human and Rat-Blood by HighPerformance Liquid-Chromatography with Post-Column Derivatization.
J. Chromatogr. 332:181-188.
KIMURA, M. und Y. ITOKAWA. (1983).
Determination of Thiamin and Thiamin Phosphate-Esters in Blood by LiquidChromatography with Post-Column Derivatization.
Clin. Chem. 29:2073-2075.
LAMBSON, R. O. (1970).
An electron microscopic study of the entodermal cells of the yolk sac of the chick during
incubation and after hatching.
Am. J. Anat. 129:1-19.
LASCHI-LOQUERI, A., S. VALLAS, J. VIOLLET, M. LECLERCQ, und V. FAYOL.
(1992).
High performance liquid chromatographic determination of total thiamine in biological and
food products.
Int. J. Vitam. Nutr. Res. 62:248-251.
LEESON, S. und L. J. CASTON. (2003).
Vitamin enrichment of eggs.
J. Appl. Poult. Res. 12:24-26.
LEHNINGER, A. L., D. L. NELSON, und M. M. COX. (Hrsg.) (1998).
Prinzipien der Biochemie. 2. Aufl., Studienausg.
Spektrum Akad. Verl.
LI, L. J., H. CHENG, C. ZHAO, und X. G. HU. (2005).
Determination of vitamin B-1 in pharmaceutical preparations by flow-injection analysis with
biamperometric detection.
Chem. Res.Chin. Univ. 21:650-653.
LI, Y. und P. R. BROWN (2003).
The optimization of HPLC-UV conditions for use with FTIR detection in the analysis of B
vitamins.
J. Chromatogr. Sci. 41:96-99.
LONSDALE, D. (2006).
A Review of the Biochemistry, Metabolism and Clinical Benefits of Thiamin(e) and Its
Derivates.
Evidence-Based Complement. Altern. Med. 3:49-59
180
Lit. Verzeichnis
LOSA, R., M. I. SIERRA, A. FERNANDEZ, D. BLANCO, und J. M. BUESA. (2005).
Determination of thiamine and its phosphorylated forms in human plasma, erythrocytes and
urine by HPLC and fluorescence detection: a preliminary study on cancer patients.
J: Pharm. Biomed. Anal. 37:1025-1029.
LOTTSPEICH, L. und J. W. ENGELS (Hrsg.) (1998).
Bioanalytik.
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin.
MANSON, J. M., K. J. PICKEN, M. H. DRAPER, und R. THOMPSON. (1993).
Variation among individual White-Leghorn hens in the concentration of minerals in the
albumen and yolk content of their eggs.
Br. Poult. Sci. 34:899-909.
MASCHER, H. J. und C. KIKUTA. (1997).
High-performance liquid chromatography determination of total thiamin in human plasma.
Methods Enzymol. 279:83-90.
MATSUDA, T. und J. R. COOPER. (1981).
The separation and determination of thiamine and its phosphate esters in brain.
Anal. Biochem. 117:203-207.
MATSUO, T. und Z. SUZUOKI. (1969).
The Occurrence of 4- Methylthiazole-5-Acetic Acid as a Thiamine Metabolite in Rabbit, Dog,
Man and Rat.
J. Biochem. 65:953-960.
MEYER, V. R. (Hrsg.) (1992).
Praxis der Hochleistungs- Flüssigchromatographie. 7. ed.
Otto Salle Verlag; Frankfurt.
MINEKI, M. und M. KOBAYASHI. (1997).
Microstructure of yolk from fresh eggs by improved method.
J. Food Sci. 62:757-761.
MIYOSHI, K., Y. EGI, T. SHIODA, und T. KAWASAKI. (1990).
Evidence for in vivo synthesis of thiamin triphosphate by cytosolic adenylate kinase in
chicken skeletal muscle.
J. Biochem. (Tokyo) 108:267-270.
MOBBS, I. G. und D. B. McMILLAN. (1979).
Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of
development.
Am. J. Anat. 155:287-309.
MOORE, C. V. (1965).
Iron nutritients and requirements
Ser. Haematol 6:1-14
181
Lit. Verzeichnis
MORIARTY, C. M. (1973).
Serum-dependent transcellular active calcium transport.
Exp. Cell Res. 79:79-86.
MORITA, M., T. KANAYA, und T. MINESITA. (1969).
Simultaneous determination of thiamine and 2-(1-hydroxyethyl) thiamine in biological
materials.
J. Vitaminol. (Kyoto) 15:116-125.
MORRIS, E. R. und F. E. GREENE. (1972).
Utilization of the iron of egg yolk for hemoglobin formation by the growing rat.
J. Nutr. 102:901-908.
MUNIYAPPA, K. und P. R. ADIGA. (1981).
Nature of the Thiamin-Binding Protein from Chicken Egg-Yolk.
Biochem J. 193:679-685.
NDWA, S., M. BERGAENTZLÉ, D. AOUDÉ-WERNER, und C. HASSELMANN. (2000).
Extraction procedures for the liquid chromatographic determination of thiamin riboflavin and
vitamin B6 in foodstuffs.
Food Chem. 71:129-138.
NIELSEN, J. H., G. H. KRISTIANSEN, und H. J. UNDERSEN. (2000).
Ascorbic acid and ascorbic acid 6-palmitate induced oxidation in egg yolk dispersions.
J. Agric. Food Chem. 48:1564-1568.
OBERLEAS, D., B. F. HARLUND, und D. J. BOBILYA. (Hrsg.) (1999).
Minerals: Nutrition and Metabolism.
Vantage Press, New York.
OLKOWSKI, A. A. und H. L. CLASSEN. (1999).
The effects of maternal thiamine nutrition on thiamine status of the offspring in broiler
chickens.
Int. J. Vitam. Nutr. Res. 69:32-40.
RATANAUBOLCHAI, K., J. JAREONSANTI, und B. PANIJPAN. (1981).
Cyanogen-Bromide, A Good Reagent for Assay of Thiamine in Biological Extracts.
Clin. Chem. 27:1777-1778.
RATANAUBOLCHAI, K. und B. PANIJPAN. (1979).
Cyanogen-Bromide, A Good Reagent for Assay of Thiamine in Urine.
Clin. Chem. 25:1670-1671.
RATANAUBOLCHAI, K., S. PIKULKARNTALERT, und B. PANIJPAN. (1980). A
comparison of 3 reagents in converting thiamine to thiochrome in the presence of plant
extracts and polyphenols.
Experientia 36:825.
RETTENMAIER, R., J. P. VUILLEUMIER, und W. MULLER-MULOT. (1979).
Zur quantitativen B1 Bestimmung in Nahrungsmitteln und biologischem Material.
Z. Lebensm. Unters. Forsch. 168:120-124.
182
Lit. Verzeichnis
RICHARDS; M. P. (1997).
Trace mineral metabolism in the avian embryo.
Poult. Sci. 76:152-164.
RICHARDS, M. P. und N. C. STEELE. (1987).
Trace element metabolism in the developing avian embryo: a review.
J. Exp. Zool. Suppl 1:39-51.
RIDGWAY, L. P. und D. A. KARNOFSKY. (1952).
The Effects of Metals on the Chick Embryo - Toxicity and Production of Abnormalities in
Development.
Ann. N Y Acad. Sci. 55:203-215.
RINDI, G. und L. D. GIUSEPPE. (1961).
A New Chromatographic Method for Determination of Thiamine and Its Mono-, Di- and TriPhosphates in Animal Tissues.
Biochem. J. 78:602-606&.
ROMANOFF, A. L. (Hrsg.) (1967).
Biochemistry of the avian embryo : a quantitative analysis of prenatal development.
Wiley, New York.
ROSSANDER, L., L. HALLBERG, und E. BJOERN-RASMUSSEN. (1979).
Absorption of iron from breakfast meals.
Am. J. Clin. Nutr. 32:2484-2489
SAITO, K., Y. HAGIWARA, T. HASEGAWA, und E. OZAWA. (1982).
Indispensability of Iron for the Growth of Cultured Chick Cells. Develop.
Growth and Differ. 24:571-580.
SANCHEZ-MACHADO, D. I., J. LOPEZ-CERVANTES, J. LOPEZ-HERNANDEZ, und P.
PASEIRO-LOSADA. (2004).
Simultaneous determination of thiamine and riboflavin in edible marine seaweeds by highperformance liquid chromatography.
J. Chromatogr. Sci. 42:117-120.
SANDER, S., A. HAHN, J. STEIN, und G. REHNER. (1991).
Comparative-Studies on the High-Performance Liquid-Chromatographic Determination of
Thiamine and Its Phosphate-Esters with Chloroethylthiamine As An Internal Stundard Using
Precolumn and Postcolumn Derivatization Procedures.
J. Chromatogr. 558:115-124.
SANDERS, E. J. (1980).
The Golgi body and thiamine pyrophosphatase localization in embryonic cells in culture.
Exp. Cell Res. 126:458-461.
SANEMORI, H., H. UEKI, und T. KAWASAKI. (1980).
Reversed-phase high-performance liquid chromatographic analysis of thiamine phosphate
esters at subpicomole levels.
Anal. Biochem. 107:451-455.
183
Lit. Verzeichnis
SASA, M., I. TAKEMOTO, und Y. ITOKAWA. (1976).
The role of thiamine on exitable membrane of crayfish giant axon.
J. Nutr. Sci. Vitaminol. 22 (Suppl.):21-46.
SAVAGE, J. E. (1968).
Trace minerals and avian reproduction.
Fed. Proc. 27:927-931.
SAWANO, F. und H. FUJITA. (1981).
Cytochemical studies on the internal polarity of the Golgi apparatus and the relationship
between this organelle and GERL.
Histochem. 71:335-348.
SCHLESINGER, A. B. (1958).
The Structural Significance of the Avian Yolk in Embryogenesis.
J. Exp. Zool. 138:223-258.
SCHNORR, B. (1996).
Embryologie der Haustiere. 3. ed.
Enke, Stuttgart.
SCHRIJVER, J., A. J. SPEEK, J. A. KLOSSE, H. J. VAN RIJN, und W. H. SCHREURS.
(1982).
A reliable semiautomated method for the determination of total thiamine in whole blood by
the thiochrome method with high-performance liquid chromatography.
Ann. Clin. Biochem. 19:52-56.
SCHULZ, J. und N. J. SMITH. (1958).
Quantitative Study of the Absorption of Iron Salts in Infants and Children.
Ama Journal of Diseases of Children 95:120-125.
SCHÜMANN, K. (2002).
Kupfer.
in H. K. BIESALSKI, J. KÖHRLE, und K. SCHÜMANN (Hrsg.), Vitamine, Spurenelemente
und Mineralstoffe 147-151
Thieme, Stuttgart, New York.
SCHÜMANN, K. und G. WEISS. (2002).
Eisen.
in H. K. BIESALSKI, J. KÖHRLE, und K. SCHÜMANN (Hrsg.), Vitamine, Spurenelemente
und Mineralstoffe 137-147
Thieme, Stuttgart, New York.
SHENSTONE, F. S. (1968).
The gross composition, chemistry and physiochemical basis of organization of the yolk and
white.
in T. C. CARTER (Hrsg.), Egg Quality. A study of the hen's egg.
Oliver & Boyd, Edinburgh.
184
Lit. Verzeichnis
SIMKISS, K. (1991).
Fluxes during embryogenesis.
in D. C. DEEMING und M. W. J. FERGUSON (Hrsg.), Egg incubation : its effects on
embryonic development in birds and reptiles 47-51
Univ. Press, Cambridge.
SOUCI, S. W., W. FACHMANN, und H. KRAUT. (2000).
Food composition and nutrition tables. 6. Aufl.
medpharm Scientific Publ., Stuttgart.
TABORSKY, G. (1980).
Iron binding by phosvitin and its conformational consequences.
J. Biol. Chem. 255:2976-2984.
TALLAKSEN, C. M., T. BOHMER, H. BELL, und J. KARLSEN. (1991).
Concomitant determination of thiamin and its phosphate esters in human blood and serum by
high-performance liquid chromatography.
J. Chromatogr. 564:127-136.
TERNES, W., L. ACKER, und S. SCHOLTYSSEK. (1994).
Ei und Eiprodukte.
Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg.
TERNES, W. (1991).
Model of the functional propeties of egg yolk proteins in the preaparaion of foams for sauces
and sweet desserts.
in A. OOSTERWOUD und A. W. DE VRIES (Hrsg.), Quality of Poultry Products: II Eggs
and Egg Products 191-200
Spelderholt Centre for Poultry Res. and Inform. Services, Beekbergen
TERNES, W. und K. DAUTEL. (2007).
Der "Punkt der Rose" - Wahrung der technofunktionellen Eigenschaften von Eigelbproteinen.
Forschung fürs Leben: Forschung, Dienstleistung, Lehre Tiho 52-56
THORNBER, E. J., R. H. DUNLOP, und J. M. GAWTHORNE. (1980).
Thiamin Deficiency in the Lamb - Changes in Thiamin Phosphate-Esters in the Brain.
J. Neurochem. 35:713-717.
TOLONEN, M. (1990).
Vitamins and minerals in health and nutrition.
Ellis Horwood, New York.
VANDERSLICE, J. T. und M.-H. A. HUANG. (1986).
Liquid Chromatographic Analysis of Thiamin and its Phosphates in Food Products Using
Amprolium as an Internal Stundard.
J. Micronutrient Anal. 2:189-199.
185
Lit. Verzeichnis
VIÑAS, P., C. LOPEZ-ERROZ, N. BALSALOBRE, und M. HERNANDEZ-CORDOBA.
(2001).
Comparison of ion-pair and amide-based column reversed-phase liquid chromatography for
the separation of thiamine-related compounds.
J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 757:301-308.
VIÑAS, P., C. LOPEZ-ERROZ, N. BALSALOBRE, und M. HERNANDEZ-CORDOBA.
(2003a).
Reversed-phase liquid chromatography on an amide stationary phase for the determination of
the B group vitamins in baby foods.
J. Chromatogr. A 1007:77-84.
VIÑAS, P., C. LOPEZ-ERROZ, N. BALSALOBRE, und M. HERNANDEZ-CORDOBA.
(2003b).
Determination of thiamine and its esters in beers and raw materials used for their manufacture
by liquid chromatography with postcolumn derivatization.
J. Agric. Food Chem. 51:3222-3227.
WAHEED; S., I. FATIMA, A. MANNAN, M. S. CHAUDHARY, und I. H. QURESHI.
(1985).
Trace element concentration in egg yolk and egg white of farm and domestic eggs.
J. Environ. Anal. Chem. 21:333-344.
WAKAMATU, T., Y. SATO, und Y. SAITO. (1982a).
Determination of Main Mineral Contents in Hen's Egg Yolk Fractions.
Agric. Biol. Chem. 46:577-578.
WELZ, B. und M. SPERLING. (1999).
Atomic Absorption Spectrometry. 3. ed.
Wiley-VCH Verlag, Weinheim.
WHITE, H. B., B. A. DENNISON, M. A. DELLAFERA, C. J. WHITNEY, J. C. McGUIRE,
H. W. MESLAR, und P. H. SAMMELWITZ. (1976).
Biotin-Binding Protein from Chicken Egg-Yolk - Assay and Relationship to Egg-White
Avidin.
Biochem. J. 157:395-400.
WINDISCH, P. und C. LEITZMANN. (1984).
Beeinflussung der Eisen- Bioverfügbarkeit durch Inhaltsstoffe in Nahrungsmitteln.
Verbraucherdienst 29:201-207.
WOODWARD, S. A. und O. J. COTTERILL. (1987).
Texture and Microstructure of cooked whole egg yolk and heat formed gels of stirred egg
yolk.
J. Sci. 52:63-67.
ZAPALA, W. (2003).
Influence of mobile phase composition on retention factors in different HPLC systems with
chemically bonded stationary phases.
J. Chromatogr. Sci. 41:289-294.
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Danksagung
Danksagung
Den lieben Menschen die hinter mir und dieser Arbeit standen möchte ich an
dieser Stelle ganz herzlich danken.
Herrn Prof. Ternes für die Vergabe des interessanten Themas und außerdem für
die stets freundliche und fachliche Betreuung.
Aus dem Institut für Geflügelkunde, Frau Prof. Dr. Rautenschlein Ph.D und
Frau Haase, für die freundliche Bereitstellung der embryonierten Eier und als
Zweitgutachter PD Dr. G. Glünder.
Aus dem Institut für Pathologie, Herrn Prof. Dr. med. vet. Baumgärtner, Ph.D.
und Frau Rohn, für die Anfertigung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen.
Dem Arbeitskreis, insbesondere Nicole, Susi, Kirsten, Thomas und Frau
Matthias, da sie mich von Anfang an begleitet haben, danke ich für die
anregenden wissenschaftlichen Disskusionen und die Schaffung eines
außergewöhnlich guten Arbeitsklimas.
Der Fritz Ahrberg Stiftung, die diese Arbeit teilweise finanziell unterstützt hat.
Lieber Thorsten, für alles was du mir bist danke ich dir.
Meinen Eltern danke ich für die gute Pflege und Aufzucht und insbesondere für
die großartige Unterstützung während dieser Arbeit. Ihr habt mir die
Möglichkeit gegeben mich zu dem zu enwickeln was ich bin und dafür danke
ich euch von ganzem Herzen.
Meinem Bruder danke ich dafür, dass er mein Bruder ist. Ich könnte mir keinen
besseren vorstellen.
All den anderen lieben Menschen die mir während dieser Zeit zur Seite standen
danke ich ebenfalls von ganzem Herzen.
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