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Stiftung zur Förderung
der Erforschung von
Ersatz- und
Ergänzungsmethoden
zur Einschränkung von
Tierversuchen
Projekt
Zellkultur-basiertes In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der
Aktivität von Botulinumtoxin
Prof. Dr. Gerhard Püschel, Universität Potsdam
03/2012 – 02/2015
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Zellkultur-basiertes In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der
Aktivität von Botulinumtoxin
Botulinumtoxin ist ein bakterielles Exotoxin. Es wird vom anaerob wachsenden Sporen-bildenden
Bakterium Clostridium botulinum produziert und gehört zu den potentesten bakteriellen Giften
überhaupt. Die tödliche Dosis beim Menschen liegt bei etwa 1 ng/kg Körpergewicht. Botulinumtoxin
ist ein Neurotoxin, das die Freisetzung von Überträgersubstanzen aus den Endigungen der Nerven
hemmt, die die Muskelkontraktion stimulieren. Dadurch führt es zur schlaffen Lähmung der
betroffenen Muskeln. Der Tod tritt durch Lähmung der Atemmuskulatur ein.
Botulinumtoxin ist ein Protein, das aus zwei Untereinheiten besteht. Die große Untereinheit sorgt
dafür, dass die kleine Untereinheit in Nervenzellen eindringen kann. In den Nervenzellen zerstört
die kleine Untereinheit Proteine, die für die Freisetzung der Überträgersubstanzen aus den
Nervenzellen notwendig sind.
Die Bakterien gedeihen in unzureichend sterilisierten, unter Luftabschluss gelagerten
Lebensmitteln, z. B. Konserven, deren Verzehr zum oft tödlich verlaufenden Krankheitsbild des
Botulismus führt. In niedriger Dosierung lokal verabreicht kann Botulinumtoxin aber als Medikament
eingesetzt werden, um Krankheitsbilder zu behandeln, die durch eine Dauerkontraktion (Spasmus)
eines Muskels oder einer Muskelgruppe zustande kommen wie z. B. den Lidkrampf oder den
spastischen Schiefhals. Die breiteste therapeutische Anwendung findet Botulinumtoxin aber in der
kosmetischen Medizin, in der es eingesetzt wird, um die Bildung von Hautfältchen durch gezielte
Lähmung der die Fältchen verursachenden Hautmuskulatur zu unterdrücken. Dazu wird es in
geringer Konzentration in die entsprechenden Hautregionen injiziert (Botox).
Botulinumtoxin für die therapeutische Anwendung wird aus Kulturen von Clostridien gewonnen.
Bei den dafür notwendigen Reinigungsschritten wird ein Teil des Proteins inaktiviert. Daher besteht
das fertige Präparat aus schwankenden Anteilen funktionstüchtigen und inaktiven Proteins. Wegen
der hohen Toxizität muss die Aktivität jeder Präparation genau bestimmt werden. Dabei muss die
Aktivität sowohl der großen als auch der kleinen Untereinheit erfasst werden. Dies gelingt derzeit
am zuverlässigsten durch die Messung der biologischen Wirkung im lebenden Tier. Es wird die
Konzentration des Präparates bestimmt, bei der die Hälfte der behandelten Mäuse an
Atemlähmung verstirbt. Für diesen Test sterben jährlich weltweit ca. als 300.000 Mäuse einen
qualvollen Erstickungstod (http://altweb.jhsph.edu/sebin/c/g/altex_2_10_bitz.pdf; accessed 14. 6.
2012).
In diesem Projekt soll ein zellbasiertes Verfahren zur Messung der Aktivität von Botulinumtoxin
etabliert werden, das den Tierversuch weitgehend ersetzen kann. Es unterscheidet sich von allen
bisher etablierten Ersatzverfahren dadurch, dass über einen Reporter, der gleichzeitig mit dem
Neurotransmitter aus Nervenzellen freigesetzt wird, der Endpunkt der Botulinumtoxinwirkung, die
Hemmung der Neurotransmitterfreisetzung aus der Nervenzelle, direkt erfasst wird. Dadurch wird
sowohl die Aktivität der großen als auch die der kleinen Untereinheit in einem Schritt bestimmt.
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Das Prinzip beruht darauf, dass in der Zelle Proteine durch bestimmte Aminosäuresequenzen
(Adresssequenzen) an eine bestimmte Adresse in der Zelle dirigiert werden können. So kann man
mit geeigneten Adresssequenzen auch Proteine in die Speichervesikel lenken, aus denen die
Überträgersubstanzen der Nervenzelle freigesetzt werden. Diese Proteine werden dann
gemeinsam mit den Überträgersubstanzen freigesetzt bzw. ihre Freisetzung dann gehemmt, wenn
die Freisetzung der Überträgersubstanzen gehemmt wird. Wählt man als Protein ein Enzym, das
normalerweise nicht von den Zellen produziert wird, kann man die Freisetzung anhand der Aktivität
des Enzyms im Zellkulturüberstand bestimmen, die Stimulus-abhängige Aktivität im Überstand
nimmt ab, wenn durch Botulinumtoxin die Freisetzung der Überträgersubstanz gehemmt wird.
Im Sinne der 3R stellt das Verfahren eine Möglichkeit zum weitgehenden Ersatz des Tierversuchs
bei der Messung der Aktivität von Botulinumtoxin dar. Wo es notwendig erscheint, zur letzten
Sicherung der Aktivität den Tierversuch weiter durchzuführen, kann die Anzahl der dafür
notwendigen Tiere reduziert werden, da der Bereich der zu testenden Dosierungen durch den
zellbasierten Assay stark eingeengt werden kann.
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Projektleiter
Prof. Dr. Gerhard Püschel
Jahrgang 1958. Studium der Humanmedizin an der Christian-Albrechts-Universität Kiel und Biochemie an
der Indiana University, Bloomington IN, USA. 1994 Habilitation im Fach Biochemie an der Georg-AugustUniversität Göttingen. Seit 2000 Leiter des Lehrstuhls Biochemie der Ernährung im Institut für
Ernährungswissenschaft der Universität Potsdam.
Mitarbeiter
Dr. Andrea Pathe-Neuschäfer-Rube
Jahrgang 1959. Studium der Biochemie und Promotion an der FU Berlin. Wissenschaftliche Mitarbeiterin mit
dem Spezialgebiet Etablierung von transgenen Modellzellinien.
Dr. habil. Frank Neuschäfer-Rube
Jahrgang 1963. Studium der Biologie an der Georg-August-Universität Göttingen. Im Jahr 2004 Habilitation
im Fach Biochemie an der Universität Potsdam. Wissenschaftlicher Mitarbeiter mit dem Schwerpunkt
Signaltransduktionsmechanismen.
Ausführende Institution
Universität Potsdam
Institut für Ernährungswissenschaft
Arthur-Scheunert-Allee 114-116
14558 Nuthetal
Förderungslaufzeit
01.03.2012 - 28.02.2015
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