Titelblatt, Referat, Abstract, Inhaltsverzeichnis
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Aus dem Institut für Medizinische Immunologie (Direktor: Prof. Dr. med. habil. J. Langner) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Immunphänotypisierung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg von Katrin Eisert geboren am 21.01.1971 in Dresden Betreuer Dr. med. habil. D. Riemann Gutachter: 1. Frau PD Dr. D. Riemann 2. Prof. Dr. G. Metzner 3. PD Dr. D. Reinhold (Magdeburg) eingereicht am: 08.10.2002 verteidigt am: 04.04.2003 urn:nbn:de:gbv:3-000005546 [http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv%3A3-000005546] Referat In dieser Arbeit wurden die phänotypischen Eigenschaften von tum orinfiltrierenden Lym phozyten (TIL) aus frischen Gew ebeproben von Patienten mit Tumoren unterschiedlicher Herkunft unters ucht. Dabei galt die Suche prognostischen Zusamm enhängen zwischen bestimm ten Express ionsm ustern von O berflächena ntigenen und der Üb erlebenszeit von Patienten mit nichtkleinzelligen Lungenkarzinom en (NSCLC) gesucht. D er zweite Teil der Arbeit besch äftigte sich mit dem Vergleich phänotypischer Eigenschaften von TIL verschiede ner m aligner Primärtumoren und Metastasen. Die gesamte Untersuchungsgruppe umfasste 303 Patienten mit Tumordiagnose (125 Lungen-, 116 Nierenzell-, 21 Magen-, 4 Mam ma-, 10 Harnblasen-, 7 Ösophagus- und 5 Kolon-/Rektumkarzinome, 20 Lungen m etastasen, 5 Hirntumore), welche sich an der Martin-Luther-Universität Halle-W ittenberg einer chirurgischen Therapie unterzogen. Nach Gewinnung und Aufbereitung der frischen Tumorresektate erfolgten die Immunfluoreszenzfärbung mit einer Kombination aus Fluorescein (FIT C)- und Phycoerythrin (PE)-m arkierten monoklonalen Antikörpern (mAK) und Analyse m ittels Durchflus szytom eter. Die resultierenden Daten wurden m it Hilfe univariater u nd multivariater Analysemodelle (Kaplan-Meier-Modell, Cox-R egres sionsm odell, Allgem eines lineares M odell) statistisc h ausgewertet. Ein Zusamm enhang zwischen der Überlebenswahrscheinlichkeit und der Höhe des Anteils der B-Zellen, T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) an den TIL konnte statistisch nicht nachgewiesen werden. Dies gilt ebenfalls für CD4 +, CD8+, HLA-DR+, CD56 + und/oder CD16 +, CD13 +, CD25 +, CD57 +, CD45RO +, CD69 +, CD49a + tumorinfiltrierende T-Z ellen (T ITL ) sowie das Verhältnis CD4+/CD8+ TITL. Für Lungentumorpatienten war eine modera te Expression von CD11b, CD26 bzw. CD54 gegenüber einer geringen CD11b-, CD26- bzw. CD54-Expression m it einem signifikant geringeren Sterbe risiko (p < 0,05) asso ziiert. Im Ergebnis dieser Untersuchung ist es bisher nicht möglich, aus den hier in der Flowzytometrie gewonnenen Daten zum T-Zellphänotyp und zur lymphozytären Zusamm ensetzung eindeutige Aussagen zur Prognose der NSCLC-Patienten abzuleiten. Es war nachzuweisen, dass die Expression der untersuchten Oberflächenantigene in den 125 Lungen- und 116 Nierenzellkarzinomen wesentlich von der Tumorentität abhängt. Die Faktoren Alter und Geschlecht der Patienten und der Tumorsubtyp zeigten hier eine geringe Relevanz. Metastasen und ihre Primärtum oren s cheine n sich in ihre m TIL-P rofil zu ähneln. Dies kon nte am Beispiel der Lungenmetastasen von Nierenzellkarzinomen und prim ären Nierenzellkarzinomen, sowie Lungenmetastasen von Mammatum oren und primären Mamm atumoren belegt werden. Bei der vergleichenden Gegenüberstellung der Magen-, Harnblasen-, Ösophagus -, Kolon-/Rektumkarzinome und Hirntumore ließen sich aus den phänotypischen Eigenschaften der TIL charakteristische Muster ableiten. Eisert, Katrin: Imm unphänotypisierung tumorinfiltrierender Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie. 80 Seiten, 2002 Halle/S., Martin-Luther-Universität Halle-W ittenberg, Medizinische Fakultät, Dissertation Abstract Tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) of different kinds of tum or were chara cterized with respect to their expression of cell surface molecules (imm unophenotype). The aim of this study was to look for significant correlations between the patterns of surface molecules and the survival of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Furthermore, we compared the imm unphenotype of different primary tumors and/or metastases. 303 tumor probes resected at the Martin Luther University Halle-W ittenberg were investigated (125 lung cancers, 116 renal cell carcinomas, 21 tumors of the stomach, 4 of mam ma, 10 of bladder, 7 of oesophagus, 5 of colon, 5 of brain, and 20 of lung metastases). After preparation of lymphocytes by density centrifugation, cells were stained with a com bination of a fluorescein (FITC)- and a phycoerythrin (PE)-labeled monoclonal antibody specific for different surface molecules and analysed in a flow cytometer. The statistical analyses included uni- and m ultivariate models (Kaplan-M eyer Method, Cox regression M odel, Gene ral Linear Model). W e found no significant correlation between survival of lung cancer patients and the percentages of tu m or-infiltrating B lymphocytes , T cells and natural killer (NK) cells. Similarly, no significant correlation could be found between survival and CD4+, CD8+, HLA-DR+, CD56+ and/or CD16+, CD13+, CD25+, CD57+, CD45RO+, CD69+ , CD4 9a+ TIL or the ratio CD4+/CD8+ TIL. We found only an association with patients survival of the percentage of CD1 1b+-, CD26+- and C D54+ tum or infiltrating T ce lls (significant only in case of m odera te expression ). Sum m arizing our res ults, we cannot give a clear prediction for the patient’s prognosis with the surface m olecules investigated in this study. Com paring TIL of renal cancer und lung cancer, we found several peculiarities of immunophenotype. Age and gender of patients as well as the histological subtype of a tumor had a smaller influence on the surface molecules of TIL. W e found similarities between phenotype of metastases and the appropriate primary tum or. Last not least, specific patterns were described for the TIL’s imm unophenotype of tumors of stomach, bladder, oesophagus, colon and brain. Keywords: tumor-infiltrating lymphocytes, imm unphennotype, non-sm all ce ll lung cancer, flow cytometer Inhaltsverz eichnis Seite 1. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 1 2. Einleitung und Problembehandlung 2 2.1. Tumorerkrankung und Imm unkompetenz 3 2.1.1. Lymphozytenvermittelte Tumorabwehr 3 2.1.2. Funktionsassoziation der Oberflächenmoleküle auf Lymphozyten 5 2.2. Therapie und Prognose des Lungenkarzinoms 8 3. Material und Methoden 10 3.1. Patientenrekrutierung 10 3.2. Gewinn ung und Präpara tion der TIL 10 3.3. Durchflus szytom etrie 12 3.4. Statistische Analysen 15 3.4.1. Überlebensstatistik 15 3.4.2. W eitere vergleichende Analysemodelle 16 3.4.3. Grafische Darstellung der Ergebnisse als Boxplots 17 4. Ergebnisse 19 4.1. Überlebensanalyse bei Lungenkarzinomen 19 4.2. Vergleichende Aufbereitung von Tumorproben mit und ohne Kollagenase 29 4.3. Vergleiche des T-Zellphäno typs verschiedener T um ore 30 4.3.1. Primäre Lungen- und Nierenzellkarzinome 30 4.3.2. Sonstige Primärtumore und Lungenmetastasen 37 5. Diskussion 40 5.1. Epidemiologie der häufigsten Tumorerkrankungen 40 5.2. Genese und Imm unologie der Tumoren 42 5.3. Prognostische Relevanz von Lymphozyteninfiltraten in Tumoren 44 5.3.1. Lymphozyteninfiltrate und Prognose von Lungentumorpatienten 44 5.3.2. T-Zellphänotyp und Prognose von Lungentumorpatienten 46 5.4. Gegenüberstellung von TIL-Phänotypen unterschiedlicher Tumore und Lungenmetastasen 52 5.5. Zusamm enfassende Bewertung 56 6. Tabellen und grafische Darstellungen 58 7. Literatu rverzeichnis 71 8. Thesen 80
