Umgang mit Zellen und Zellkulturen
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Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Umgang mit Zellen und Zellkulturen • • • Eigenschaften von Zellkulturen Einstufung in Gruppen und Klassen Arbeitspraktiken Ursula Jenal Jenal & Partners Biosafety Consulting [email protected] HELA Zellen http://www.microscopyu.com/staticgallery/dicphasecontrast/helapc.html Jenal & Partners Biosafety Consulting 1 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Definitionen • Primäre Zellen – direkt aus Gewebe entnommen • Etablierte Zelllinie – über mehrere Passagen gezüchtet und untersucht Jenal & Partners Biosafety Consulting 2 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Definitionen • Kontinuierliche Zelllinie: immortalisierte Zellen vermehren sich kontinuierlich Seneszenz Virusinfektion Chemikalien aus Tumor proliferativer Stimulus Proliferation Apopotose Jenal & Partners Biosafety Consulting 3 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Eigenschaften von tierischen und menschlichen primären Zellen und etablierten Zelllinien • getrennt von der Ursprungsumgebung • gehalten unter künstlichen Bedingungen • empfindlich auf Störungen • ideale Nahrungsgrundlage für Mikroorganismen Jenal & Partners Biosafety Consulting 4 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Eigenschaft von Zellkulturen: ‘Beherbergung’ pathogener Mikroorganismen Zellen von Vögeln und Invertebraten gut charakterisierte und stabile Zelllinien Säugerzellen kontinuierliche Zelllinien Affenzellen primäre Zellen Menschenzellen Risiko Jenal & Partners Biosafety Consulting Risiko 5 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Eigenschaft von Zellkulturen: ‘Beherbergung’ pathogener Mikroorganismen Peripheres Blut Risiko lymphoide Zellen neuronale Zellen Endothelzellen Darmepithelzellen Epithelzellen Fibroblasten Jenal & Partners Biosafety Consulting 6 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Herkunft der pathogener Mikroorganismen • Herkunft: aus getestetem oder ungetestetem Gewebe - grosse Differenzen - 15% falsch identifiziert oder falsch beschrieben - Kontamination mit unbekannten Viren (Squirrel Monkey Retrovirus 1-3%) • Kontamination während der Arbeit: - Kreuzkontamination mit anderen Zellen - von Laborpersonal - aus kontaminierten Medien - Kontamination mit Mycoplasma: - primäre Zellen 1-5%, - kontinuierliche Zelllinien – 35% • Kulturbedingungen (Nährstoffe, Wachstumsfaktoren) und Zellalterung Jenal & Partners Biosafety Consulting 7 Erythrozyten mit Mycoplasma Abdrücken 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Eigenschaft von Zellkulturen: Risiko-reiche Inserts • Sequenzen für Proteine mit transformierenden Eigenschaften (aktiviert oder nicht aktiviert) Cytokine, Hormone, Fachstumsfaktoren, Antigene - 1 Fall von Tumorformation nach Nadelstich mit Onkogen-exprimierender Zelllinie) • Endogene retrovirale Sequenzes, ERV Jenal & Partners Biosafety Consulting 8 ERV Promoteraktivität in Zelllinien 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Grundlage zur Einstufung von Zellkulturen WHO biosafety guidelines Verwende Praktiken der Sicherheitsstufe 2 wenn über die Zellen nur limitierte Information vorhanden ist. Empfehlung der EFBS zum sicheren Umgang mit menschlichen und tierischen Zellen und Zellkulturen http://www.efbs.admin.ch/fileadmin/efbsdateien/dokumentation/empfehlungen/10_Zellkulturen_EFBS_E.pdf http://www.biosicherheit.zh.ch/internet/bd/awel/awb/bs/de/sbs_dokumente.html Jenal & Partners Biosafety Consulting 9 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Risikobewertung von Zellkulturen 1. Risikogruppe Quelle, Zertifikate, Eigenschaften, Wissensstand + ? Risiko 2. Art der Tätigkeit, Gentechnische Veränderung, Kombination mit Vektoren, Umfang, Kulturbedingungen G1 = vernachlässigbar Jenal & Partners Biosafety Consulting G2 klein 10 + 3. Qualitätssicherung Qualitätskontrolle Gute Laborpraxis G3 G4 mittel hoch 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Grundlage zur Einstufung von Zellkulturen Information Klasse 1 BSL1 Risiko Qualitätskontrolle Klasse 2 BSL2 Sichere Anwendungspraxis Reinraum No way !!! BSL1/BSL2 Jenal & Partners Biosafety Consulting 11 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Einstufung von Zellen gemäss Art der Zellen Primäre Zellen und Zelllinien, mit Verdacht auf eine Infektion mit einem spezifischen pathogenen Mikroorganismus. Gruppe gemäss pathogen Primäre Zellen und Zelllinien, bei denen eine Infektion nicht ausgeschlossen werden kann. 2 Primäre Zellen und Zelllinien, Infektion mit einem pathogenen Mikroorganismus mit grösster Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen. 1 Identifizierte und gut charakterisierte Zelllinien. 1 Identifizierte und gut charakterisierte Zelllinien oder primäre Zellen, mit einem spezifischen pathogenen Mikroorganismus infiziert. Humane Zellen mit Gensequenzen, die einen schädlichen Effekt haben könnten, wenn sie exprimiert werden (auch unter nicht gewöhnlichen Kulturbedingungen). Zellen, die potentiell schädliche Gensequenzen enthalten, diese aber nicht exprimieren können. Jenal & Partners Biosafety Consulting 12 gemäss Pathogen 2 1, wenn pathogenfrei 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Einstufung von Tätigkeiten mit Zellen und Zellkulturen Klasse Kulturen von charakterisierten Zellen der Gruppen 1 – 3 Klasse gemäss Gruppe der Zellen, bzw. des pathogenen Mikroorganismus Produktion von Viren oder viralen Vektoren auf Zellkulturen Klasse gemäss Gruppe des Vektors oder Virus Kultur von Zellen mit unzureichender Charakterisierung oder mit Verdacht auf Infektion mit pathogenen Mikroorganismen - Klasse 2 - Klasse 3 (bei Verdacht auf Mikroorganismen der Gruppe 3) Kultivierung von Zellen mit gentechnischen Veränderungen Klasse gemäss Bewertung des Risikos der Zellen, Vektoren und Inserts Analyse von Zellen ohne Kultivierung Anforderungen der SAMV zum Schutz vor Exposition gegenüber potentiell infektiösem Material befolgen Jenal & Partners Biosafety Consulting 13 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Arbeitspraxis zur Verhinderung von Kontaminationen mit Mikroorganismen Einhalten bzw. Überprüfen bester Laborpraxis (zertifizierter Materialien, persönlicher Hygiene, Dekontamination, biologische Sicherheitswerkbank Klasse II); Master- und Arbeitszellbanken mit tiefen seriellen Überimpfungszahlen; so wenig wie möglich Antibiotika verwenden; routinemässiges Testen der verwendeten Zelllinien zur Authentifikation; routinemässiges Testen der verwendeten Zelllinien zum Nachweis von Kontaminationen, bzw. zur Bestätigung des Fehlens von Kontaminationen; für gewisse Institutionen GMP-Methoden (good manufacturing practice). Biosicherheit Personal, Mensch, Umwelt ! Qualitätssicherheit Jenal & Partners Biosafety Consulting Produkte-, bzw. Forschungsqualität 14 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Test zum Nachweis von kontaminierenden Mikroorganismen Beim Einkauf/Bezug von Zellen ein Zertifikat bzw. Nachweis für Überprüfung auf Mikroorgnismen verlangen Zelllkulturen regelmässig unter dem Mikroskop auf ihre Morphologie überprüfen Wachstumskurve beobachten Prallelkultur (aus Masterzellbank) ohne Antibiotika ‘mitlaufen’ lassen; Kulturen regelmässig auf Mykoplasmen überprüfen (z.B. Fluoreszenzfarbstoff); Isoenzym-Authentifizierungskit DNA-Fingerprinting so wenig wie möglich Antibiotika verwenden; Jenal & Partners Biosafety Consulting 15 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen Test zum Nachweis von kontaminierenden Mikroorganismen DSMZ Testangebote DSMZ Service Broth-agar microbiological culture method Mycoplasma testing and elimination Polymerase chain reaction Cell culturing for mycoplasma testing (if applicable) Mycoplasma elimination and verification 150,00 € 150,00 € 150,00 € 1.500,00 € Authentication of human cell lines Multiplex PCR single locus analysis (per sample) 150 € Polymerase chain reaction (per virus out of 8 150 € viruses: EBV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, HTLV-I/-II, Detection of viruses: SMRV, XMRV) Cell culturing for virus testing 150 € PCR detection of human and animal species of the panel of DSMZ cell bank 150 € Detection or verification of species One to three samples (per PCR-assay) Four to six samples (per PCR-assay) 200 € PCR detection of monkey cell lines Inquire Jenal & Partners Biosafety Consulting 16 10-11-15 Universität und Universitätsspital Zürich Umgang mit Zellen und Zellkulturen FRAGEN ? Jenal & Partners Biosafety Consulting 17 10-11-15
