Protein-NMR

Protein-NMR
Vertiefungsfach Analytische Chemie(WS2015/16)
Dr.PeterBellstedt – NMRPlattformIAAC&IOMC
[email protected]
Themenübersicht
Termin1am30.11.15:BiochemievonProteinen
(Aufbau,Struktur,gentechn.Herstellung)
Termin2am07.12.15:NMR-ExperimenteI
(Labeling,1D/2D/3D-Exp.fürZuordnungundräuml.Erfassung)
Termin3am14.12.15:NMR-ExperimenteII
(CSundNOE-basierteStrukturberechnung,prakt.Übung)
Termin4am04.01.16:SpezielleNMR-Strategien
(>4DExperimente,spez.Labeling-Strategien,RDCs)
Wdh:Visualisierungvon3D-Spektren
Wdh:Visualisierungvon3D-Spektren
„Strips“
Wdh:DiesequentielleZuordnungalsersterSchrittaufdemWegzurStruktur
OftsindmehrereExp.notwendigumeineeindeutigeZuordnungtreffenzukönnen
DiewichtigstenZuordnungsexperimente(undihreNomenklatur!)
EinfacheInformationenauseinerNMR-Pulssequenz(hier3D-HNCO)
NMRPulseq.Sehenunheimlich kompliziert aus,liefernaberauchdem„Anfänger“wichtige
Informationen (->Magnetisierungsstart,-ende,AnzahlunterschiedlicherKanäle,Entkopplungen)
Vom3Dzum4D-Experiment
->liefertfür jedesNH zweiCO-Shifts
->liefertfür jedesNH zweiCa-Shifts
Warumdann nichtgleichfür jedesNHzweiCOund zweiCa-Shifts?
->Erweiterungdes3D-ExperimentesumeineweitereDimension
Vom3Dzum4D-Experiment
->fürjedesNHzweiCOund zweiCa-Shifts
Vor- undNachteilenD-Experimenten
• Vorteil:
• Eindeutigkeit:BeigroßenMolekülenmithoherWahrscheinlichkeitan
ÜberschneidungenindenchemischenVerschiebungenerlaubtdurchdas
HinzufügeneinerweiterenDimensioneine(hoffentlich)eineeindeutige
Zuordnung.(„höhereAuflösung“,Auflösung=Möglichkeitder
UnterscheidungvonengbenachbartenPunkten!)
• Nachteil:
• EnormlängereMesszeit (Faktor>6)!(DaherkommthiermeistNUSzum
Einsatz)
• Insensitiver als3DExperimentdurch„längeren“Magnetisierungswegvorder
Detektion
• Visualisierungund„räuml.Vorstellung“etwasschwieriger(auseinem4DDatensatzkannmanunterschiedliche3D-Würfelextrahieren,Tafelbild)
• Fazit:4DExp.nimmtmannurwennesdasSystemwirklicherfordert.Sehrhäufig
benötigtmansolcheExp.beisog.Intrinsingly disordered proteins (IDPs)
Bsp:SukzessiveErhöhungderAuflösungdurchHinzufügeneinerDimension
ZumNachlesenfürspäter:
Aus: Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy, S.271
IDPs:SpektraleÜberlappungdurchengen1HN-Bereich
Konrat R. NMR contributions to structural dynamics studies of intrinsically disordered
proteins. Journal of Magnetic Resonance. 2014;241(100):74-85.
IDPs:NCOanstelleNHhathierofteinehöhereDispersion
OftmalswirddaherbeiIDPsauchdirekt13Cdetektiert,obwohlinsensitiver
„Fingerprint“
-Spektrum
„Fingerprint“
-Spektrum
beiIDPs
BeiIDPsliefertdasCONExperimentofteinebessereAuflösungund„Ausbeute“
Quelle:NMRof Biomolecules, Wiley-Blackwell, 2012
IDPs:...undeskommen4Dund5DExperimentezumEinsatz
Konrat R. NMR contributions to structural dynamics studies of intrinsically disordered
proteins. Journal of Magnetic Resonance. 2014;241(100):74-85.
ProblemebeiderStrukturaufklärunggroßerProteine
• SchnelleRelaxationbeigroßenMolekülen(breitereLinien,niedrigereSensitivität)
• SpektraleÜberlappungderSignaledurchhoheAnzahlan1H/13C
• Löslichkeitsprobleme(unddadurchniedrigereKonzentration)
T1+T2 alsParameterderRelaxation
T2 bestimmtdieLängedesFIDs,T1dieZeitbiszumEquilibrium
DurchDeuterierung kanneingroßesSystemdeutlichvereinfachtwerden
Vollständige Protonierung
Vollständige Perdeuterierung
(NuraustauschbareProtonen ausBackboneund Seitenkette)
Gardner, Kevin H., and Lewis E. Kay. "THE USE OF 2H, 13C, 15N MULTIDIMENSIONAL NMR GTO STUDY THE STRUCTURE AND DYNAMICS OF PROTEINS." Annual review of biophysics and biomolecular
structure 27.1 (1998): 357-406.
Dipol-Dipol-InteraktionalsHauptgrundderT2-Relaxation
Für600MHz,inkl.CSA
Quelle:EMBONMRCourse2005;Nietlispach :Theuse of deuteration for the structural study of largerproteins
DurchAustauschvonProtonen durch 2Hkanndie
T2-Zeitsignifikant vergrößertwerdenund
ermöglicht beigroßen Molekülen überhaupt erst
einmaldieerfolgreiche Aufnahme vonDaten!
Einfluß derPerdeuterierung aufdieLinienbreite(hier1H-15NHSQC)
Gardner, Kevin H., and Lewis E. Kay. "THE USE OF 2H, 13C, 15N MULTIDIMENSIONAL NMR GTO STUDY THE STRUCTURE AND DYNAMICS OF PROTEINS." Annual review of biophysics and biomolecular
structure 27.1 (1998): 357-406.
Einfluß derPerdeuterierung aufdieLinienbreite(hierimHNCAExp.)
Gardner, Kevin H., and Lewis E. Kay. "THE USE OF 2H, 13C, 15N MULTIDIMENSIONAL NMR GTO STUDY THE STRUCTURE AND DYNAMICS OF PROTEINS." Annual review of biophysics and biomolecular
structure 27.1 (1998): 357-406.
Die3JKopplungverräteinigesüberdielokaleStruktur(vgl.Kaplus Gleichung)
Die3JKopplung zwischenHN und Halpha reagiertsehrempfindlich aufWinkeländerungen undwirddaherbevorzugt
gemessen und fürdieStrukturberechnung alszusätzlicherRestraintbenutzt.
KopplunginpartiellausgerichtetenProteinen:ResidualDipolar Coupling (RDC)
Alignment Medien:
• PEGBicelle
• Pf1Phage
• PolyacrylamidGel(„stretched“)
• (Isotrope) Kopplung ->J
• Kopplung vonpartiellausgerichtetenMolekülen ->J+D
• Dipolare Kopplung ->D=(J)– (J+D)
(2DatensätzeAufnehmen: „normales“Medium (Puffer, LSM)
undinAlign.Medium)
KopplunginpartiellausgerichtetenProteinen:ResidualDipolar Coupling (RDC)
SpezielleLabeling Strategien(hier: CH3-(IVL)labeling)
SpezielleLabeling Strategien(hier:CH3-labeling)
V.Tugarinov andL.E.Kay (2003) J.Am.Chem.Soc. 125 13868-1387
Spez.Labeling Strategien+spezielleExperimente(hier:Methyl-NHKorrelation)
Ile,Leu-(HM)CM(CGCBCA)NH
V.Tugarinov andL.E.Kay (2003) J.Am.Chem.Soc. 125 13868-1387
Val-(HM)CM(CBCA)NH
Spez.Labeling Strategien+spezielleExperimente(hier:Methyl-NHKorrelation)
V.Tugarinov andL.E.Kay (2003) J.Am.Chem.Soc. 125 13868-1387
Umdenpositiven EffektderPerdeuterierung aufdieRelaxationseigenschaftenvollständigzunutzenund die
Kopplung zumDeuterium zuunterdrücken, gibtesnun ofteine 2HEntkopplung indenExperimenten.
Spez.Labeling Strategien+spezielleExperimente(hier:Methyl-COKorrelation)
Ile,Leu-HMCM- (CGCBCA)CO
Protonendetektion istbeigroßen Proteinen imGegensatzzu(kleineren) IDPsunumgänglich. Daherverwendet
man„out-and-back“Expiemente ZurDetektionvonquartärenKohlenstoffen (hierCO).
Spez.Labeling Strategien+spezielleExperimente(hier:Methyl-CO/NHKorrelation)
SpezielleLabeling Strategien(hier:Spez.Labeling vonAla)
Das Hauptproblem bei der Markierung
(1H/13C/15N oder auch 2H/CH3/15N) von
bestimmten
Aminosäuren,
ist
das
„Scrambling“, also die Umwandlung von
einer Aminosäure in eine andere. Hier ist
oft
biochemisches
Wissen
über
Stoffwechselwege notwendig um die
verschiedenen
Scramblingmuster
zu
verstehen.
Ayala, Isabel, et al. "An efficient protocol for the complete incorporation of methylprotonated alanine in perdeuterated protein." Journal of biomolecular NMR 43.2
(2009): 111-119.
SpezielleLabeling Strategien(hier:Spez.Unlabeling vonAminosäuren)
Bellstedt, Peter, et al. "Resonance assignment for a particularly challenging protein based on systematic unlabeling of amino acids to complement
incomplete NMR data sets." Journal of biomolecular NMR 57.1 (2013): 65-72.
AnalysedesNH-Scramblings inE.coli BL21(DE3)
Bellstedt, Peter, et al. "Resonance assignment for a particularly challenging protein based on systematic unlabeling of amino acids to complement
incomplete NMR data sets." Journal of biomolecular NMR 57.1 (2013): 65-72.
AnalysedesNH/CO-Scramblings inE.coli BL21(DE3)
Bellstedt, Peter, et al. "Resonance assignment for a particularly challenging protein based on systematic unlabeling of amino acids to complement
incomplete NMR data sets." Journal of biomolecular NMR 57.1 (2013): 65-72.
BeispielfürmetabolischenStoffwechselwegeinE.coli BL21(DE3)
Figure S9 (A) Metabolic pathways involving the (inter)conversion of Thr, Gly,
Ser, Cys and Trp respectively. Glycine (1) can be interconverted into serine by
the bacterial enzyme SHMT (Serine hydroxymethyltransferase; EC 2.1.2.1).
Serine (2) in turn can be utilized to produce both cysteine (3) and trypthophan
(4). Whereas the first reaction is catalyzed by the cysteine synthase complex
consisting of CSA and CSB (Cysteine synthase A and B, respectively; EC
2.5.1.47), the latter one is catalyzed by TRPA/B (Tryptophan synthase alpha
and beta chain, respectively; EC 4.2.1.20). Threonine (0) can be cleaved to
Glycine by the bacterial enzyme lsL-TA (Low specificity L-threonine aldolase;
EC 4.1.2.48). Please note that all enzymes, except lsL-TA, catalyze the
respective conversion in both directions.
Bellstedt, Peter, et al. "Resonance assignment for a particularly challenging protein
based on systematic unlabeling of amino acids to complement incomplete NMR data
sets." Journal of biomolecular NMR 57.1 (2013): 65-72.
Zusammenfassung
• IDPs:NCObessereAuflösung,oftdirekte13CDetektion,4D&5DSpektren,NUS
• großeMoleküle:SchnelleRelaxation->Perdeuterierung oderpartielle
Deuterierung,Experimentemit2HEntkopplung,ILV-Labeling,SpezielleMethylExperimente,Methyl-Methyl-NOEs,zusätzlicheInformationenausRDCs
• Spezifische13C/15N-MarkierungvonAminosäuren:ProblemdesScramblings,
teuer,evtl.zellfreieSynthesenotwendig
• „Unlabeling“vonAminosäuren:ebenfallsScrambling,kostengünstiger,kannzur
Zuordnungbenutztwerden,funktioniertnichtmitallen