Abstract - ETH E
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Diss.ETH No 10050 The Role of Perforin Protein in Lymphocyte Cytotoxicity Mediated A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by David Kagi Dipl.sc.nat. born June 2,1963 citizen of Zurich, Wallisellen accepted on (ZH) and Baretswil (ZH) the recommendation of Prof. T.Koller, examiner Prof. H.Hengartner, coexaminer 1993 Reprint from: European Journal of Immunology (1989), 19:1253 -1259 4 Summary 1. Cytotoxic T cells and natural killer cells tumorigenic able to and are allogeneic cells. The effector mechanism by which these cells provided for granula exocytosis the cytolytic lymphocytes, upon recognition this concept for was cytotoxicity investigated during the elimination of this hybridisation into the intercellular space, which of the target cell. Since the relevance of in vivo has been questioned, the infection of mice with virus. It is well established that CD8 situ lysis leads to colloid osmotic model. It proposes that and interaction with the target cell, release cytolytic pore-forming protein perforin subsequently the expression of perforin lymphocytic choriomeningitis positive cytotoxic T cells play a pivotal non-cytopathic virus. Perforin expression was analyzed by staining with T cell marker and virus specific antibodies. close histological association of infiltrating lymphocytes expressing perforin with virally cells on infected cells serial sections was observed. The distribution of compared frequency of positive T cells express perforin expressing cells days maximal LCMV specific cytotoxicity on positive perforin. liver sections of the in by A mRNA perforin expressing the distribution of CD8 to consistent with the notion, that CD8 about 2 role in of serial liver and brain sections from infected mice and immunohistochemical the maximal are cells is still controversial. From all candidate models, most lyse target evidence has been the able to eliminate virus infected In cells was addition, preceded by lymphoid liver infiltrating cells. Complementary investigation by perforin expression These spleen by a confirmed factor of at least 10 findings, though somewhat circumstantial, involvement of To in the RNA-PCR provide perforin perforin in cell more mediated planned. Embryonic by homologous stem cells with a during most upregulation of LCMV infection. consistent with an cytotoxicity in vivo. direct evidence for the role of deficient mice are the perforin recombination in in vivo, the embryonic generation stem cells targeted mutation of the perforin gene of was were 5 isolated. A all three neomycine resistance gene with reading frames was introduced in multiple translational stop codons in exon 3 resulting in the formation of non-functional mRNA from the disrupted perforin gene. By blastocyst injection of the targeted pluripotent embryonic embryo into the uterus of chimeras transmitted the the a stem cells and surgical foster mother chimeric mice disrupted locus to 50% of their introduction of the were obtained. Eight offsprings. By breeding heterozygot offsprings with each other homozygous perforin deficient mice will be obtained. These animals will allow for the cytotoxicity the role of of cytotoxic biological agents lymphocytes and a direct assessment of the role of eventually provide a perforin model system to test T cells and natural killer cells in infections with various and in murine models for autoimmune diseases. 6 2. Zytotoxische T-Zellen virusinfizierte und Mechanismus dieser Zusammenfassung und neoplastische Zellyse ist experimentell breitesten am cytolytische Lymphozyten, zu nach wie den ist das Fahigkeit, molekulare kontrovers. vor Unter den Granula-Exocytose-Modell Zielzelle nachdem sie ihre die Der Es beruht auf der abgestiitzte. das Protein Perforin gebunden haben, eliminieren. Zellen vorgeschlagenen Modellvorstellungen haben NK-Zellen sogenannte das Vorstellung, dass spezifisch erkannt und sekretieren, das dann durch Porenbildung cytolytischen Effekt bewirkt. Da dieses Modell wurde die speziell Expression fur die in vivo Situation in von Frage gestellt Perforin wahrend Infektion von nicht-cytopathische Lymphocytare Choriomeningitis Virus Virus ist bekannt, dass bekampft es wird. Perforin und Hirnschnitten hauptsachlich Expression nachgewiesen wurde durch In Situ Vinisantigene Es wurde Verteilung der CD8 exprimierenden zehn erhohte positiven Zellen Zellen Leberlymphozyten Verteilung um ging zwei Expression dem Tage von Das war. von Leber- Farbungen exprimierende fur Zellen im Virus infizierten Zellen von Haufigkeitsmaximum der Maximum voran. Die Perforin um zu Perforin einen Faktor an der von Infektion durch eine bestatigt. der Perforin zytolytischen Aktivitat wahrend wurde Milzen infizierter Tiere mit RNA-PCR Beteiligung Hybridisation auf dieser Zellen im Gewebe identisch mit der Lymphozytaren Choriomeningitis Virus demnach auf eine T-Zellen auf seriellen Schnitten derselben dass Perforin gezeigt, infizierten Gewebe in der unmittelbaren Nahe finden sind und dass die untersucht. Von diesem und durch immunhistochemische T-Zell Oberflachenmolekule und Gewebeproben erganzt Mausen durch das positive cytotoxische durch CD8 ist, worden von mindestens mit Untersuchung dem von Alle diese Befunde weisen der Zell vermittelten Zytolyse auch in vivo hin. Um einen direkten Beweis fur die Relevanz die Herstellung von von Perforin in vivo Perforin defizienten Mausen durch zu homologe fuhren, wurde Rekombination 7 in embryonalen Stammzellen gezielten Mutation in Exon 3, die geplant. Embryonale Stammzellen mit einer zum Abbnich der Proteintranslation in alien drei Leserastera fuhrt, wurden isoliert. Durch das Blastocoel Embryonen von Mauseembryonen in den Uterus erhalten. Acht Chimaren die dann zu von und durch gaben die Mutation interessantes an durch chirurgisches Einfuhren dieser 50% ihrer Nachkommen weiter, homozygoten Perforin defizienten Zytolyse der mutierten Stammzellen in Ammenmuttermausen wurden chimare Mause konnen. Diese Tiere werden eine direkte Prozess der Injektion Untersuchung Lymphozyten Testsystem ergeben, Mause weitergeziichtet der Rolle von werden Perforin im erlauben. Zusatzlich konnten sie ein mit dem der Beitrag der Cytotoxizitat von cytolytischen T-Zellen und NK-Zellen sowohl wahrend einer Infektion mit verschiedenen mikrobiologischen Organismen als auch in Maus-Modellen fur Autoimmunkrankheiten untersucht werden kann.
