h i e r
Werbung
Charakterisierung von Weizen aus unterschiedlichen Anbauformen mit Profiling-Methoden Georg Langenkämper, Christian Zörb, Karsten Niehaus1, und Thomas Betsche Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel Institut für Biochemie von Getreide und Kartoffeln, Detmold 1Abteilung für Proteom- und Metabolomforschung, Lehrstuhl für Genetik, Universität Bielefeld 58. Tagung für Getreidechemie in Detmold vom 20. – 21. Juni 2007 Förderung des Projektes durch das Bundesprogramm Ökologischer Landbau Projektlaufzeit: November 2005 – Oktober 2007 Gliederung Einleitung Fragestellung Untersuchungsmaterial: DOK-Weizen Ergebnisse 1. Profiling von Metaboliten 2. Profiling von Proteinen Schlussfolgerungen 4,7 % Anteil an der landwirtschaftlichen Nutzfläche (Bundesdurchschnitt) Fragestellungen 1. Hat die Anbauform einen Einfluss auf Inhaltsstoffe des Weizens? 2. Gibt es anbauspezifische Inhaltsstoffprofile? Untersuchungsmaterial: Weizen Getreide aus einem Feldversuch mit kontrolliertem ökologischem und konventionellem Anbau DOK - Feldversuch Variablen ausgeschaltet: Standort, Klima, Sorten D O K Feldversuch • Seit 1978 • 7-gliedrige Fruchtfolge • Löss-Parabraunerde Forschungsinstitut für biologischen Landbau (FiBL) und Forschungsanstalt Agroscope Reckenholz-Tänikon, Schweiz Anbauformen Organisch org Dynamisch dyn Konventionell conv Mineralisch min Keine Düngung null Ergebnisse zum DOK Versuch Eigenschaften Boden: N, K, P, Boden: pH, organische Substanz, Biodiversität, Biomasse Kornertrag Hektolitergewicht, Tausendkorngewicht Proteinkonzentration Ballaststoffe, Fructan, Phytinsäure, Oxalsäure, Antioxidantien Mineralstoffe, Spurenelemente Aminosäuren Metabolit-Profiling a Mäder et al., 2002, b Langenkämper et al., 2006a, c Zörb et al. 2006, d Langenkämper et al., 2006b, e Mäder et al. 2007, f Fließbach et al 2007 ÖKO Referenz + a, e = = +/= +/- a, e a, f e b, e b b, d e c Profiling Drei prinzipielle Anwendungsebenen Transkripte Proteine Metabolite Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Citrat Malat Ribitol (IS) Gesamt Ionenstrom (x106) Fumarat org 10 Glukose Saccharose Raffinose Valin 5 0 conv 10 5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Zeit (min) Gesamtionen-Chromatogram methanolischer Extrakte 55 Threonin Lysin A 0,25 A relative Einheiten 1,5 0,20 AB BC B 1,0 B B A A C 0,15 0,10 0,5 0,05 0 null dyn org conv min ökologisch konventionell 0 null dyn org conv min ökologisch konventionell β-Alanin Pantothensäure 0,15 0,4 A AB AB relative Einheiten A 0,3 AB AB B 0,10 BC 0,2 B C 0,05 0,1 0 null dyn org conv min ökologisch konventionell 0 null dyn org conv min ökologisch konventionell Metabolite Aminosäuren Zucker und Zuckeralkohole organische Säuren andere α-Alanin Prolin Fructose Citrat Adenosin β-Alanin Serin Glucose 2-Aminoadipate Arginin Threonin Maltose Fumarat Glycerat Asparagin Tyrosin myo-Inositol Gluconat α-Glycerophosphat Glutamat Tryptophan Raffinose 2-Hydroxyglutarat Harnstoff Glycin Valin Ribitol (IS) α-Ketoglutarat 2-Isopropylmalat Histidin Ribose Malat Pantothensäure Homoserin Saccharose Pyruvat Shikimat Succinat Uracil Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin 2006 Runal 2005 Titlis Jahre 2005 und 2006 4-Aminobutyrate Panthothensäure - Vitamin B5 β-Alanin Pantoinsäure Pantothensäure Coenzym A Metabolite Zusammenfassung 45 Metabolite wurden identifiziert Die Konzentrationen von 15 Metaboliten waren verschieden Die Schwankungsbreiten der Konzentrationen betrugen maximal 50 % In den Sorten Runal (Anbau 2006) und Titlis (Anbau 2005) traten die meisten Konzentrationsunterschiede bei unterschiedlichen Metaboliten auf Konzentrationen von β–Alanin war in den organischen Anbauformen in beiden Sorten und Anbaujahren signifikant geringer Protein-Profiling Extraktion von Gesamtprotein aus Weizenschrot - Fällung mit Aceton/TCA - Extraktion mit Lysepuffer mit nicht-ionischem Detergenz Auftrennung des Proteinextrakts in 2D-Gelelektrophorese: 1. Isoelektrische Fokussierung 2. SDS-PAGE Auswertung der Gele Massenspektrometrische Identifizierung von Proteinen Protein-Profiling von Weizen Zweidimensionale Gelelektrophorese pH 3 Mw [kDa] 78,0 66,3 42,7 30,0 Organisch pH 10 pH 3 Mineralisch pH 10 Gelauswertung Probe A Probe B 1) Einzelgele 2) Mittelwertgele + 3) Overlay (Ausschnitt) Gelauswertung Overlay (Ausschnitt) relative Proteinexpression 3D Ansicht 100 75 50 25 0 1 A 2 B Anzahl der Proben im Protein-Profiling • vier Feldwiederholungen je Anbauform • pro Feldwiederholung drei Extrakte und 2D-Gele • fünf Anbauformen und zwei Anbaujahre 120 2D-Gele erstellen und auswerten (bis 1000 Proteine pro Gel) Fokussierung des Protein-Profiling auf Weizen dyn und min von zwei Anbaujahren Protein-Profiling in Weizen anderer Anbauformen mit gleichen Trends Protein Profiling von Weizen aus den Anbauformen dyn und min 1049 verschiedene Proteine in 24 2D-Gelen detektiert 37 Proteine in „ökologsich-dynamischen“ Weizen geringer exprimiert 2 Proteine in „ökologsich-dynamischen“ Weizen verstärkt exprimiert Expressionsunterschiede bei diesen 39 Proteinen in zwei Anbaujahren gefunden Identifizierung von Weizenproteinen mit unterschiedlicher Expression pH 3 pH 10 Mw 120 [kDa] 80 60 39 77 162 295 55 271 LMW Glutenin 229 114 247 107 231 108 194 197 GAP-DH 94 171 40 275 Sample Gel Image: D2 48d Kopie 250 268 Serpin 20 327 152 137 214 30 76 74 50 40 HMW Glutenin UE 173 312 Peroxidase 1 Proteine mit unterschiedlicher Expression Speicherproteine Globulin 1 Enzyme Andere Aldose-Reduktase ähnliches Eukariotischer Protein Initiationsfaktor 5 HMW Glutenine β-Amylase 6 LMW Glutenine Glycerinaldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase 2 Triticin-Vorläufer ‘granule bound’ Stärkesynthase-Vorläufer Peroxidase 1 Peroxiredoxin Stärkesynthase Saccharosesynthase Typ 2 2 Xylanasen, A-Ketten Familie Serpin 13 Proteine nicht identifiziert HMW Glutenin Untereinheit 1By9 LMW Glutenin relative Proteinexpression 1,2 A A 0,4 0,8 0,2 0,4 B B 0 0 dyn min dyn min ökologisch konventionell ökologisch konventionell relative Proteinexpression Serpin 0,9 A 0,6 0,3 B 0 dyn min ökologisch konventionell Glycerinaldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase 0,4 0,12 relative Proteinexpression Peroxidase 1 a b 0,3 0,08 b 0,2 a 0,04 0,1 0 dyn ökologisch min konventionell 0 dyn min ökologisch konventionell Protein Profiling Zusammenfassung 1049 Proteine detektiert, davon 132 per MALDI-TOF identifiziert 37 Proteine in „ökologisch-dynamischem“ Weizen mit geringerer Expression • überwiegend Speicherproteine wie Globuline, HMW und LMW Glutenine sowie Enzyme 2 Proteine in „ökologisch-dynamisch“ Weizen mit erhöhter Expression • eine Peroxidase und ein nicht identifiziertes Protein Expressionsunterschiede bei 39 Proteinen in zwei Anbaujahren gefunden Ergebnisse für organische und konventionelle Anbauform in Tendenz gleich Schlussfolgerungen Weizen der verschiedenen Anbauformen im DOK Versuch sind nicht gleich: Signifikante Konzentrationsunterschiede von β-Alanin und von 39 Proteinen wurden in zwei Anbaujahren festgestellt. Die signifikanten, aber kleinen, Unterschiede bedeuten keine ernährungsphysiologisch andere Qualität. Ökologisch und konventioneller Weizen ist gleichwertig. Dank an Dr. Aiko Barsch (Universität Bielefeld) Dr. Paul Mäder (FiBL, Frick) Monika Null-Greulich (BfEL Detmold) Ursula Leckeband (BfEL Detmold) Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
