Entgiftung und Ausscheidung

Grundpraktikum Humanbiologie I - Entgiftung und Ausscheidung,
Entgiftung und Ausscheidung
Einführung
Entgiftung und Ausscheidung sind neben der Aufnahme, Verteilung und Verstoffwechslung von Nährstoffen unabdingbare Voraussetzungen zur Erhaltung der Funktionsfähigkeit (Homöostase) des Organismus. Die zentralen Organe der Entgiftung
und Ausscheidung sind die Leber und die Nieren.
Wichtige Leistungen der Leber sind in diesem Zusammenhang:
1. die Harnstoffsynthese in den periportalen Arealen und die perivenös lokalisierte
Glutaminsynthetase, die das beim Proteinabbau entstehende Ammoniak in eine
ungiftige (Harnstoff bzw. Glutamin) und besser ausscheidbare Form überführen
und
2. die Biotransformation, die durch Oxidation und Kopplungsreaktionen apolare Substanzen in besser ausscheidbare polare Substanzen umsetzen.
Die durch diese Mechanismen in ihrer Löslichkeit gesteigerten Substanzen werden
dann über die Galle oder nach Exkretion in das Blutplasma über die Nieren ausgeschieden.
Die Menge und die Zusammensetzung des Harns weisen starke Schwankungen auf,
die durch die tägliche Flüssigkeitsaufnahme und die Ernährungsweise bedingt sind.
Die Osmolarität des Harns schwankt in weiten Grenzen (50 - 1400 mosm / L), sie
kann bis zum Fünffachen der Osmolarität des Plasmas betragen. Die Konzentration
der gelösten Bestandteile des Harns lässt sich am einfachsten aus der Dichte bestimmen, die meist zwischen 1,015 und 1,025 liegt. Sie kann bei großer Flüssigkeitszufuhr oder unter krankhaften Bedingungen auf 1,001 absinken, oder auf Werte über
1,04 ansteigen. Über den pH-Wert des Harns entscheiden das Säure-Base-Verhältnis des Organismus sowie die Nierenfunktion. Als Extremwerte werden pH-Werte
von 4,0 und 8,0 angegeben. Die in 24 h mit dem Harn ausgeschiedene Trockensubstanz beträgt ungefähr 40 - 70 g, davon ist in etwa die Hälfte Harnstoff.
Übersicht der normalen Harnbestandteile im 24 h – Urin:
Anorganische Bestandteile
Ion
g
mVal
Na+
4–6
175 – 260
+
K
2–3
50 – 75
Ca²+
0.2
5 – 10
+
Mg²
0.1
8
Cl6–9
170 – 255
SO4²
0.8-1.2 (als
S)
HPO4²- 0.8-1.2 (als
P)
NH4+
0 – 1 (als N)
Organische Bestandteile
Stoff
g
mmol
Gesamt – N
10 - 18
Harnstoff
20 – 35
9 - 16
Harnsäure
0.2 – 1
0.2
Kreatinin
1
0.4
Aminosäuren 1
0.2
In geringen Mengen werden außerdem ausgeschieden: Zucker, organische Säuren,
Pyrrolderivate, Steroide und Steroidkonjugate, Mucine und Enzyme
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Ziel dieses Versuches ist es, durch Analyse verschiedener Harnbestandteile Einblikke in die Regulation des Protein- und Kohlenhydrat-Stoffwechsels durch Glucocorticoide und den Abbau von Purinbasen sowie der Nierenfunktion zu gewinnen.
Stichworte zur Vorbereitung
Leber und Stoffwechsel stickstoffhaltiger Substanzen: Bildung und Entgiftung von
Ammoniak; Kreatin, Glutaminsynthese, Ornithin und Polyamine, Arginin und Stickstoffmonoxid, Desaminierung, Transaminierung, Stickstoffbilanz.
Galle und Biotransformation: Bilirubin, Gallensäuren, Reaktionen der Phase 1 und 2,
Biotransformation von Paracetamol und Aflatoxin.
Niere: Harnbestandteile, pH-Wert (Säure-Base-Haushalt), Pufferung, Nitrit, Gluconeogenese.
Hormone: Cortisol, Aldosteron, Adiuretin, ANF: Wirkungsweise, Rezeptoren.
Ascorbinsäure: Funktionen, Ausscheidung.
Pathobiochemie: Morbus Cushing, Morbus Addison, Diabetes mellitus (Ketonkörper), Diabetes insipidus, Purinabbau und Gicht, Harnkonkremente, Oxalat, Defekte
der Harnstoffsynthese, metabolische Azidosen, Abbau von Ethanol und Methanol.
Praktikumsablauf
Urinproben:
Für jeden Versuchstag werden vier Freiwillige gesucht, die Urin sammeln. Gebraucht
werden dreimal 24 h–Sammelurin:
1. Der erste Freiwillige (Versuch 2 – Ascorbinsäurebestimmung) nimmt eine Gratisprobe Ascorbinsäure (1 g) vor dem Urinsammeln (Harn A).
2. Für die Harnstoffmessung sollte sich der zweite Freiwillige 24 h vor und während
der Sammelperiode möglichst proteinarm (vegetarisch mit möglichst wenig Milchprodukten) ernähren (Harn V), wohingegen der
3. dritte Freiwillige proteinreiche Kost (Fleisch, Fisch, Milchprodukte..., Harn F) zu
sich nehmen sollte.
Gewinnung von Sammelurin: Zu Beginn der Sammelperiode (Zeitpunkt notieren)
wird die Blase komplett entleert und der Urin verworfen. Ab jetzt wird der Urin gesammelt. Abschließend wird am Folgetag zum Zeitpunkt des Sammelbeginns die
Blase wiederum vollständig entleert und das Gesamtvolumen notiert.
Weiterhin wird eine kleine Probe Morgenmittelstrahlurin benötigt.
Die Proben sollen vom Tag vor dem Praktikum stammen. Für die Bilanz ist es unabdingbar, dass das Gesamtvolumen notiert wird, während für die Analysen nur wenige Milliliter benötigt werden. Urinflaschen werden eine Woche vor dem Praktikumstag verteilt.
Harnvolumina (24-h-Sammelurin):
Harn A (Ascorbinsäure)
Harn V (Vegetarier)
Harn F (proteinreiche Kost)
mL
mL
mL
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Aufteilung einer Gruppe aus7-8 Studierenden am Praktikumstag
bc
Versuch 1:
Probenvorbereitung
Inkubationszeit: 60
min
währenddessen::
Versuch 2:
AscorbinsäureBestimmung
bc
bc
bc
Versuch 2:
AscorbinsäureBestimmung
Versuch 3a:
HarnstoffBestimmung
Versuch 1:
Probenvorbereitung
Inkubationszeit: 60
min
Versuch 3a:
HarnstoffBestimmung
Versuch 3b:
KreatininBestimmung
währenddessen::
Versuch 3c:
Harnsäurebestimmung
Versuch 3b:
Versuch 3c:
Fluorimetrische BeKreatininHarnsäureFluorimetrische Bestimmung
Bestimmung
bestimmung
stimmung
Versuch 3d: Bestimmung des Urin-pH-Wertes
Versuch 4: Urin-Teststreifen
Auswertung und Diskussion der Ergebnisse aller Versuche
Versuch 1:
Fluorimetrische Cortisol-Bestimmung
Das im Harn frei (unkonjugiert) vorkommende Cortisol besitzt erhebliche diagnostische Bedeutung, da die durch die Niere ausgeschiedenen, unkonjugierten HarnGlucocorticoide als direktes Maß des nicht eiweißgebundenen, biologisch aktiven
Plasma-Glucocorticoids angesehen werden können. Bei Normalpersonen sind nur 5 10 % des gesamten im Blut zirkulierenden Cortisols nicht eiweißgebunden. Die restlichen 90 - 95 % sind reversibel an Transcortin oder Albumin gebunden und somit vor
der Ausscheidung geschützt.
Prinzip der fluorimetrischen Cortisol-Bestimmung:
In ethanol-schwefelsaurer Lösung bildet Cortisol bei Raumtemperatur einen gelben,
grün fluoreszierenden Farbstoff. Dessen Fluoreszenz kann zur quantitativen Bestimmung des Hormons ausgenutzt werden. Um das Cortisol von anderen im Harn
vorkommenden fluoreszierenden Substanzen abzutrennen, wird es mit Dichlormethan extrahiert. Anschließend wird die Dichlormethan-Phase mit Natronlauge ausgeschüttelt um weitere störende Substanzen zu entfernen. Nach Zugabe von Ethanol /
Schwefelsäure und Ausschütteln wird Cortisol in der schwefelsauren Lösung (untere
Phase) fluorimetrisch bestimmt.
Probenvorbereitung:
Es werden jeweils eine Harnprobe (Doppelbestimmung) und eine Standardreihe mit
4 verschiedenen Standardkonzentrationen parallel angesetzt (die Herstellung der
Standardreihe wird vom zuständigen Assistenten durchgeführt). Die Standardreihe
entspricht 100 µg, 50 µg, 25 µg, und 12,5 µg Cortisol pro 100 ml.
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2 ml Harn (Doppelbestimmung) wird durch kräftiges Schütteln mit 8 ml Dichlormethan
in Schliff-Reagenzgläsern extrahiert (hoher Dampfdruck des Dichlormethans öfter vorsichtig entlüften!!!). Nach Phasen-Trennung wird die obere wässrige
Phase per Pasteurpipette vorsichtig am Rand des Reagenzglases abgesaugt
(eventuell beim Assistenten nachfragen...). Die organische Phase wird mit 2 ml 0,1 N
NaOH durchgeschüttelt. Erneut wird die obere wässrige Phase mit einer Pasteurpipette entfernt (Pipettenspitze wiederholt am Reagenzglasrand ansetzen und absaugen).
In ein zweites Schliff-Reagenzglas, in dem sich bereits 1 ml Ethanol p.a. / konz.
Schwefelsäure (30 / 70) befindet, wird der gereinigte Dichlormethan-Cortisol-Extrakt
umdekantiert und kräftig durchgeschüttelt.
CAVE: Umdekantieren bitte nur unter Aufsicht des Assistenten!!!
Nach 60-minütiger Inkubationszeit wird wiederum die obere Phase abgesaugt (das
ist nun die Dichlormethanphase, die untere Schwefelsäure-Phase wird unter Aufsicht des Assistenten vermessen!!!), und die Fluoreszenz der SchwefelsäurePhase bei einer Anregungswellenlänge von 465 nm (blau) gemessen. Das Maximum
der Fluoreszenz-Emission liegt bei 525 nm (grün).
µg / 100 µL Cortisol
relative Fluoreszenzeinheiten
100
50
25
12,5
Harnprobe (1. Wert)
Harnprobe (2. Wert)
24-Stunden-Urin oder
Morgenurin
Aus den Standardverdünnungen soll eine Eichkurve erstellt werden, die im Idealfall
linear verläuft. Ermitteln Sie aus der Standard-Eichgeraden, den Messdaten der Urinproben und dem 24 h-Urinvolumen die Menge an ausgeschiedenem Cortisol. Welche
endogenen und exogenen Faktoren beeinflussen die Cortisol-Ausscheidung?
Versuch 2:
Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C)
Die in großen Mengen chemisch synthetisierte Ascorbinsäure wird heute zahlreichen
Nahrungsmitteln (z. B. Fruchtsäften) zur ernährungsphysiologischen Aufwertung und
als Antioxidans zugesetzt. Die ausreichende Versorgung mit Vitamin C ist deshalb in
unseren Breiten gesichert. Der nachfolgende Versuch soll demonstrieren, dass nach
Einnahme übergroßer Dosen an Vitamin C ein Großteil dessen rasch wieder im Urin
ausgeschieden wird. Das in hohen Dosen ausgeschiedene Vitamin kann Urintests
stören (Glucose, Bilirubin; s. Versuch 4).
Prinzip der titrimetrischen Ascorbinsäure-Bestimmung:
Jod-Lösung (5,7 mM, Titrisol®, Merck Darmstadt) oxidiert Ascorbinsäure quantitativ
zu Dehydroascorbinsäure. Frisch zubereitete Stärkelösung wird als Indikator eingesetzt und verursacht einen schleppenden aber erkennbar blauen Umschlagspunkt.
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Die blaue Farbe am Äquivalenzpunkt resultiert aus der Reaktion von überschüssiger
Jod-Lösung mit Stärke. Hierbei baut das spiralige Amylose-Molekül der Stärke in seinen kanalartigen freien Raum passende Moleküle, wie beispielsweise das Iod, ein.
Iod wird in linearen Ketten mit einem I-I-Abstand von 0,31 nm eingeschlossen und
ergibt durch Lockerung des Elektronensystems eine intensive Blaufärbung.
CH2OH
CH2OH
CHOH
O
CHOH
O
O
OH OH
O
O O
I2 + Ascorbinsäure → 2 I - + Dehydroascorbinsäure + 2 H +
Gehaltsbestimmung:
Zu je 20.0 mL Urin (24-Stunden-Urin, Harn A und zum Vergleich Harn V oder F)
werden 2 ml 10 %-ige Schwefelsäure zugegeben. Nach Zusatz von wenigen Tropfen
einer frisch angesetzten 20 %-igen Stärkelösung wird mit Jod-Lösung bis zur bleibenden Blauviolett-Färbung titriert.
Berechnung:
1 mL Jod-Lösung (5,7 µmol) entspricht 1 mg Ascorbinsäure (MG: 176,1 g / mol) in
der Probe. Geben Sie den Verbrauch der Titrationslösung an und berechnen Sie
daraus die Menge an ausgeschiedener Ascorbinsäure. Diskutieren Sie diesen Befund im Hinblick auf Störungsmöglichkeiten bei der Bestimmung.
20 mL 24 h - Urin
Harn A
Harn V
Harn F
Verbrauch an
5,7 mM Iodlösung:
mL
mL
mL
Ausgeschiedene Menge
Ascorbinsäure in 24 h
mg
mg
mg
Versuch 3:
Bestimmung der Gesamt-Stickkstoffausscheidung
Im Vordergrund der Ausscheidung organischer Substanzen mit dem Harn stehen
folgende stickstoffhaltige Verbindungen:
• Harnstoff
• Kreatinin
• Harnsäure:
Neben endogenen Faktoren (Stoffwechsellage, Stoffwechselerkrankungen) ist die Art
und Zusammensetzung der Ernährung von entscheidender Bedeutung für die ausgeschiedene Menge dieser Substanzen.
Weiterhin werden kleine Mengen an freien Aminosäuren (1 - 3 g / d), Aminosäurederivate (z.B. Hippursäure) und Proteine (weniger als 150 mg / d) ausgeschieden, die
bei der Bestimmung der Gesamt-Stickstoffausscheidung im Rahmen des Praktikums
unberücksichtigt bleiben.
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Fassen Sie nach den Einzelauswertungen die Ergebnisse der Versuche 3 a-d zusammen und diskutieren Sie den Einfluss der Ernährung (vegetarisch - proteinreich)
hinsichtlich der ausgeschiedenen Menge der bestimmten Substanzen und der Gesamtstickstoffausscheidung. Hat die Ernährung einen Einfluss auf den Urin-pH-Wert?
Versuch 3a:
Bestimmung der Harnstoffausscheidung
Harnstoff (MG: 60,01 g / mol) wird als ein Produkt des Abbaus von Aminosäuren und
der Entgiftung von Ammoniak in den periportalen Abschnitten der Leber synthetisiert.
In Abhängigkeit von der Proteinzufuhr bzw. der Aminosäurekonzentration im Blutplasma sowie der Stoffwechsellage werden täglich wenige Gramm (Fasten), 20 – 40
g (Kost mit 60 – 120 g Protein / Tag) und eventuell mehr Harnstoff (proteinreiche
Kost) im Urin ausgeschieden. Im klinischen Labor wird Harnstoff quantitativ im optischen Test durch Oxidation von NADH bei der mit der Harnstoffhydrolyse gekoppelten reduktiven Aminierung von α-Ketoglutarat bestimmt:
NH2 CO NH2 + 2H2O + H+
Urease
NH4+ + -OOC - CO - (CH2)2 - COO+ NADH + H+
2 NH4+ + HCO-3
GluDH
OOC - HCNH3+ - (CH2)2 - COO-
-
+ NAD+ + H2O
Für Orientierungszwecke ist es jedoch möglich, die Ureasereaktion mit einer Titration
der gebildeten Base (NH3) zu koppeln.
Testprinzip:
Harnstoff wird durch Urease in oben genannter Weise in Bicarbonat und 2 NH3 gespalten. Freigesetztes NH3 bindet Protonen mit einem pK-Wert von 9,2. Der Protonenverbrauch im Ansatz führt zu einer Verschiebung des pH-Wertes ins Alkalische,
die mittels des zugesetzten Farbindikators o-Cresolphthalein-Komplexon (Phthalein
Purple) nachgewiesen wird. Die Menge des umgesetzten Harnstoffs im Ansatz ist
unter den gewählten Bedingungen proportional zum Anstieg des pH-Wertes, der kolorimetrisch durch eine Zunahme der Violetttönung bestimmt wird (Orsonneau J.L. et
al., Clin Chem 38 (1992) 619-623).
Benötigte Reagenzien:
1) Farbreagenz:
2,5 mM o-Cresolphthalein-Komplexon (Phthalein Purple, Sigma,
Taufkirchen)
30 mM Tris / HCl, pH 7,0
5 mM EDTA
0,1 % NaN3
2) Ureaselösung: Urease (540 kU / L; Sigma, Taufkirchen) in 150 mM NaCl
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Versuchsdurchführung:
Die Reaktion wird nach dem folgenden Pipettierschema durchgeführt:
In 6 Halbmikroküvetten pipettieren:
Harn V
Harn F
H2O
0,25 M Harnstoff
Farbreagenz
Reaktionsstart:
Urease
Gesamtansatz
Leerwert Standard
----10 µL
--10 µL
580 µL
580 µL
10 µL
600 µL
10 µL
600 µL
V1:
5 µL
-5 µL
-580 µL
V2:
10 µL
---580 µL
F1:
-5 µL
5 µL
-580 µL
F2:
-10 µL
--580 µL
10 µL
600 µL
10 µL
600 µL
10 µL
600 µL
10 µL
600 µL
Die Küvetten mit Parafilm-Streifen fest verschließen. Nach kurzem Schütteln (Küvette
2x über Kopf stellen) erfolgt die Inkubation bei Raumtemperatur über 25 Minuten.
Danach wird innerhalb weniger Minuten die Absorption der Proben gegen den Leerwert bei 578 nm gemessen.
V1
V2
F1
F2
Std. 1
Eingesetztes Harnvolumen
5 µL
10 µL
5 µL
10 µL
10 µL
A 578 nm
Absorptionskoeffizient ε (578 nm) = 68 [mol/L]-1 cm-1
(1 M Lösung entspräche einer Extinktion von 68)
freigesetztes NH3
im Ansatz (M)
Harnstoff
im Ansatz (M)
Verdünnungsfaktor
120
60
120
60
60
Harnstoff
im Urin / Standard (M)
Urinvolumen (L / 24 h)
Harnstoff (mol / 24 h)
Harnstoff : MG 60 g / mol
Harnstoff (g / 24h)
Stickstoff (g / 24 h)
Proteinäquivalent (g / 24h)
Std. 2
10 µL
60
Anhand des berechneten Harnstoff-N-Wertes kann unter Berücksichtigung des Urinvolumens und des Faktors 6,25 (g Protein / g Stickstoff) auf den Proteinumsatz der
Sammelperiode rückgeschlossen werden. Der angegebene Faktor ergibt sich aus
dem empirisch ermittelten Wert von 16 Gewichts-% Stickstoff in einem durchschnittlichen Proteingemisch.
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Versuch 3b:
Bestimmung von Kreatinin
In der Skelettmuskulatur dient Kreatinphosphat als Energiespeicher, der der raschen
Wiederauffüllung des ATP-Pools dient. Ein Teil des Kreatinphosphats zyklisiert unter
Abspaltung anorganischen Phosphats in einer nichtenzymatischen Reaktion zu Kreatinin (MG: 113,1 g / mol), das nicht mehr durch die Kreatinkinase rephosphoryliert
werden kann und ausgeschieden wird.
H2
C
H3C
N
H2
C
-
COO
H
N
O
C
P
+
- ONH2 O
P
Kreatinphosphat
H3C
O
NH
N
C
NH
Kreatinin
Diese Menge ist bei fleischarmer Diät zur Muskelmasse proportional. Das Kreatinin
gelangt mit dem Blut zur Niere, wo es glomerulär filtriert wird. Eine tubuläre Rückresorption findet nicht statt; eine tubuläre Sekretion setzt erst bei einem (deutlich erhöhten) Serumspiegel von ca. 170 µmol / L ein.
Testprinzip:
Kreatinin bildet im alkalischen Milieu mit dem Salz der Pikrinsäure einen rot-orangen
Farbkomplex (Jaffe-Reaktion). Die Reaktion wird durch im Harn enthaltene sog.
„Pseudokreatinine“ (Harnsäure, Ketonkörper, Proteine, Medikamente (Cephalosporine)) gestört, die langsam ähnlich absorbierende Farbkomplexe bilden. Dieser systematische Fehler wird vermieden, wenn man bei Pikrinsäureüberschuss und konstanter Reaktionstemperatur die Anfangsgeschwindigkeit der Farbkomplexbildung
misst (kinetischer Test). Dazu werden die Extinktionen des Farbkomplexes genau 30
und 150 Sekunden nach Beginn der Reaktion gemessen. Die Differenz der Extinktionen ist ein ausreichend gutes Maß für die Reaktionsgeschwindigkeit. Durch Bezug
auf die Reaktionsgeschwindigkeit eines Standards lässt sich die Kreatininkonzentration in der Probe berechnen.
Benötigte Reagenzien:
1. Kreatinin-Standardlösung:
CStandard = 176,8 µmol / L (2 mg / dL)
2. Farbreagenz:
18 mM Pikrinsäure
160 mM NaOH
Das Farbreagenz wird an jedem Versuchstag frisch angesetzt und muss vor Licht
geschützt in einer dunklen Flasche aufbewahrt werden. Das Farbreagenz ist maximal. 5 Stunden stabil.
Versuchsdurchführung:
Je 20 µL der Urinproben V und F werden 1 : 49 mit dest. Wasser verdünnt.
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Die Reaktionen werden bei gleicher Temperatur nacheinander durchgeführt: Mit
dem Zusatz des Farbreagenz die Stopuhr starten, die Küvette ins Photometer setzen und die Extinktionen bei 492 nm nach exakt 30 und 150 Sekunden ablesen
In 1 cm-Küvetten pipettieren:
Standard
Harn V-Verdünnung (1:49)
Harn F-Verdünnung (1:49)
Farbreagenz
Gesamtansatz
E 492 nm 30 sec.
E 492 nm 150 sec.
∆E 492 (E 150 sec. – E 30 sec.)
Kreatinin in der verdünnten Probe (mg / 100 mL)
Kreatinin im Urin (mg / 100 mL)
Urinvolumen (L)
Kreatinin (g / 24h)
Stickstoff (g / 24 h)
Standard
200 µL
--2000 µL
2200 µL
V:
-200 µL
-2000 µL
2200 µL
F:
--200 µL
2000 µL
2200 µL
Berechnung mit Dreisatz, Verdünnung berücksichtigen!
Normalwerte des 24h-Urin: 7 - 20 mmol / d bzw. 0,8 - 2,3 g / d
Versuch 3c:
Bestimmung von Harnsäure
Testprinzip:
Zur Bestimmung von Harnsäure (MG: 168,1 g / mol) dient ein gekoppelter enzymatischer Test. Harnsäure wird durch das Enzym Uricase in Allantoin umgewandelt. Dabei entsteht eine zur Harnsäure äquimolare Menge an Wasserstoffperoxid (H2O2).
Dieses oxidiert in einer zweiten Reaktion (Indikator-Reaktion − katalysiert durch Peroxidase, POD) chromogene Substrate zu einem Chinonimin-Farbstoff, dessen Absorption zur Harnsäurekonzentration proportional ist.
Harnsäure + 2 H2O + O2
Uricase
H2O2 + NENMA + 4-Aminoantipyrin
POD
Allantoin + CO2 + H2O2
Chinonimin-Farbstoff + 2 H2O
(NENMA = N-Ethyl-N-3-methoxyanilin))
Im folgenden wird ein fertiges Reaktionsgemisch (Ecoline 25® Harnsäure Uicase-PAP, Merck, Darmstadt) verwendet, das alle notwendigen Komponenten
(Uricase, POD, chromogene Substrate) enthält.
Harnsäurestandard: 6 mg / dL.
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Probenvorbereitung:
Harn V und F 1 + 9 mit dest. Wasser verdünnen
Bestimmungsansatz:
Spektralphotometer:
Küvette:
Inkubationstemperatur:
540 nm
1 cm Schichtdicke
20 - 25 °C
In 5 Halbmikroküvetten pipettieren:
H2Oo
Harn (1 + 9 verdünnt
!)
Standard (6 mg / dL)
Pufferlösung
Startreagenz
Harn V
-20 µL
Harn F
-20 µL
1. Standard
-−
−
780 µL
200 µL
−
780 µL
200 µL
20 µL
780 µL
200 µL
2. Standard
-−
Leerwert
20 µL
−
−
780 µL
200 µL
20 µL
780 µL
200 µL
Mischen und 10 min bei 20 - 25 °C inkubieren. Innerhalb von 30 min die Absorption
von Test und Standard gegen Leerwert messen.
Harn V
Harn F
Standard 1
Standard 2
A 540 nm
MW (Standards)
Harnsäure in der verdünnten Probe (mg /
100 mL)
Harnsäure im Urin
(mg / 100 mL)
Urinvolumen (L)
Harnsäure (g / 24h)
Stickstoff (g / 24 h)
Berechnung mit Dreisatz, Verdünnung berücksichtigen!
Normalwerte des 24h-Urin:
1,49 - 4,46 mmol / d bzw. 0,25 - 0,75 g / d
Versuch 3d:
Bestimmung des Urin-pH-Wertes
Messung der pH-Werte der drei Sammelurine am pH-Meter.
Harn A (Ascorbinsäure)
Harn V (Vegetarier)
Harn F (proteinreiche Kost)
pH
pH
pH
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Versuch 4:
Qualitative und halbquantitative Bestimmung
von Harnbestandteilen
Die Diagnostics-Teststreifen (Multistix 10 SG®, Bayer Diagnostics GmbH, München)
ermöglichen den Nachweis von Glucose, Ketonkörper, Spez. Gewicht, Blut, pH, Eiweiß, Bilirubin, Urobilinogen, Nitrit und Leukozyten im Harn. Die Testergebnisse geben Aufschluss über evtl. Stoffwechsel-Störungen, Nieren- und Leberfunktion sowie
Harnwegsinfektionen.
Testdurchführung:
Teststreifen kurz in den Harn eintauchen
Teststreifen mit der Kante am Gefäßrand abstreifen, um überschüssigen Harn zu
entfernen.
Durch Farbvergleich mit dem Flaschenetikett erfolgt die visuelle Testauswertung.
Einheitliche Ablesung aller Parameter mit Ausnahme der Leukozyten-Zone nach
1 Minute. Die Leukozyten-Zone wird stets nach 2 Minuten ausgewertet.
Eventuelle Farbveränderungen, die nach mehr als 2 Minuten auftreten, sind diagnostisch nicht relevant.
Testprinzipien:
Glucose:
Der spezifische Nachweis basiert auf der Glucose-Oxidase-Peroxidase-Reaktion
(siehe Versuch Organstoffwechsel). Auf dem Teststreifen dient jedoch Kaliumjodid
als Chromogen. Die Farbentwicklung erfolgt von grün nach braun. Physiologische
Glucosekonzentrationen werden dabei nicht erfasst. Höhere AscorbatKonzentrationen (500 mg / L) und /oder hohe Ketonkörper-Konzentrationen
(> 0,4 g / L) können zu falsch negativen Ergebnissen führen.
Störungen: Durch Wasserstoffperoxid und andere Oxidationsmittel, die in Reinigungsmitteln vorkommen, kann eine falsch positive Reaktion angezeigt werden.
Reduktionsmittel (z. B. Ascorbinsäure) können Wasserstoffperoxid reduzieren, so
dass es nicht mehr für die Oxidation des Chromogens zur Verfügung steht. Enzyminhibitoren wie Fluorid oder Azid (Fluorid kann dem Blut zur Gerinnungshemmung zugesetzt werden) hemmen die Peroxidase, so dass trotz H2O2-Bildung die Indikatorreaktion unterbleibt.
Bilirubin:
Zusammensetzung: Dichloranilin-Diazonium-Salz.
Das Testprinzip beruht auf der Kopplungsreaktion von diazotiertem Dichloranilin mit
Bilirubin in stark saurem Milieu. Der Test erfasst Bilirubin-Konzentrationen ab
0,4 - 0,8 mg / dL. Schon geringste Verfärbungen müssen als positiv und damit als
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pathologisch gewertet werden (Lebererkrankungen). Größere Mengen Ascorbinsäure
(> 250 mg / L) können zu falsch positivem Ergebnis führen.
Ketonkörper:
Zusammensetzung: Nitroprussid-Natrium.
Die Reaktionszone ist mit Nitroprussid-Natrium imprägniert und reagiert mit Acetessigsäure, nicht hingegen mit Aceton bzw. β-Hydroxybuttersäure. Die Empfindlichkeit
für Acetessigsäure liegt bei 5 - 10 mg / dL. Normalerweise enthalten Harnproben keine Ketone. Erkennbare Ketonkonzentrationen können nach physischen Belastungen
wie Fasten, Schwangerschaft, nach starker körperlicher Anstrengung (Leistungssport) oder bei Stoffwechselentgleisungen festgestellt werden. Falsch positive Resultate können bei dunklen Harnen und bei Vorliegen von L-Dopa-Stoffwechselprodukten auftreten.
Spezifisches Gewicht:
Zusammensetzung: Bromthymolblau; Poly-(Methylvinylether / Maleinsäureanhydrid);
Natriumhydroxid.
Der Test basiert auf einer pKs-Änderung verschiedener Elektrolyte in Abhängigkeit
von der Ionen-Konzentration.
Erythrozyten / Hämoglobin:
Zusammensetzung: Diisopropylbenzol Dihydroperoxid; Tetramethylbenzidin.
Hämoglobin katalysiert die Oxidation des Farbindikators (3,3`, 5,5`Tetramethylbenzidin) durch ein organisches Hydroperoxid (Diisopropylbenzol Dihydroperoxid) und bewirkt so den Farbumschlag. Peroxidasen mikrobiellen Ursprungs
(z. B. bei Harnwegsinfektionen) können zu falsch positiven Ergebnissen führen genauso wie stark oxidierende Reinigungsmittel.
pH:
Zusammensetzung: Methylrot; Bromthymolblau.
Eine Kontamination durch die benachbarte Eiweiß-Testzone kann erfolgen, wenn der
Teststreifen nicht ausreichend am Gefäßrand abgestreift wurde.
Eiweiß:
Zusammensetzung: Tetrabromphenolblau; Puffer.
Dem Nachweis von Eiweiß mit Teststreifen liegt die Bindung großer Anionen an
Proteinmoleküle zugrunde. Als Anionen werden dabei pH-Indikatoren verwendet.
Im Sauren zeigt der pH-Indikator die Farbe der undissoziierten Indikatorsäure; bei
Verschiebung des pH-Wertes ins Alkalische bildet sich das blaugefärbte Anion. Diese
Farbänderung tritt auf, wenn der Indikator in einer schwach sauren Lösung mit dem
Eiweiß in Berührung kommt (Eiweißfehler des Indikators). Dieser „Fehler“ beruht
darauf, dass der Indikator von den protonierten Aminogruppen des Proteins als Anion gebunden wird. Daher enthält der Teststreifen noch eine Puffersubstanz, die beim
Anfeuchten einen pH-Wert von 3 liefert. Bei stark gepufferten bzw. alkalischen Harnen oder bei Verunreinigungen durch Antiseptica und Desinfektionsmittel mit quartären Ammonium-Gruppen bzw. Chlorhexidin können falsch positive Ergebnisse auftreten.
Urobilinogen:
Zusammensetzung: Diethylaminobenzaldehyd.
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Grundpraktikum Humanbiologie I - Entgiftung und Ausscheidung,
Das Testprinzip beruht auf der modifizierten Ehrlich-Reaktion von p-Diethylaminobenzaldehyd mit Urobilinogen in Gegenwart eines Farbverstärkers in stark saurem
Milieu. Die Empfindlichkeit liegt bei ca. 0,2 mg / dL (0,2 Ehrlich-Einheiten / dL). Bei
Gesunden werden Urobilinogen-Konzentrationen von 0,2 - 1,8 mg / dL gefunden, ab
ca. 2,0 mg / dL beginnt der Übergang zum pathologischen Bereich. Falsch positive
Resultate können durch eine Reaktion mit p-Aminosalicylsäure und Sulfonylharnstoffen, atypische Verfärbungen bei Anwesenheit von p-Aminobenzoesäure zustande
kommen. Falsch negative Ergebnisse können durch Formalin verursacht werden.
Nitrit:
Zusammensetzung: p-Arsanilsäure; 1,2,3,4-Tetrahydrobenzol[h]chinolin-3-ol.
Im Harn vorhandenes Nitrat wird durch die meisten harnwegspathologischen Bakterien (gramnegative Keime) zu Nitrit reduziert. Das Testprinzip beruht auf der Diazotierung von p-Arsanilsäure durch Nitrit und anschließender Kupplungsreaktion mit
1,2,3,4-Tetrahydrobenzol[h]chinolin-3-ol. Die Empfindlichkeit für Nitrit liegt bei
0,06 - 0,10 mg / dL. Falsch negative Ergebnisse können erhalten werden, wenn die
Verweildauer des Harns in der Blase weniger als 4 Stunden betrug, wenn die Erreger
der Harnwegsinfektion nicht reduzierend wirken oder der Urin durch die Ernährung
keine ausreichenden Mengen an reduzierbarem Nitrat enthält.
Leukozyten:
Zusammensetzung: derivatisierter Pyrrolaminosäureester; Diazonium Salz.
Der Test enthält ein Derivat des Pyrrolaminosäureesters und weist die EsteraseAktivität von Granulozyten nach. Bei der Reaktion entsteht 3-Hydroxy-5-phenylpyrrol,
das mit einem Diazoniumsalz zu einem violetten Farbstoff reagiert.
Testfeld
Ergebnis
Testfeld
Ergebnis
Ketonkörper
Protein
Nitrit
Erythrozyten
Leukozyten
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.....................
.....................
.....................
.....................
Bilirubin
Urobilinogen
spez. Gewicht
Glucose
pH
....................
....................
....................
....................
....................
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Grundpraktikum Humanbiologie I - Entgiftung und Ausscheidung,
Fragen
1. Welche Stoffwechsel-Endprodukte, die mit dem Urin ausgeschieden werden, entstehen aus Kohlenhydraten, Lipiden, Proteinen und Nucleinsäuren?
2. Wovon hängt die Harnsäure-Ausscheidung ab? Wann spricht man von Hyperuricämie, welche Symptome treten auf und wie kann man sie therapeutisch beeinflussen?
3. Welche Aminosäuren sind die Stickstoff-Donatoren im Harnstoffcyclus? Wie werden
die Aminogruppen der anderen Aminosäuren auf diese Donatoren übertragen? Wie
ist die Energiebilanz des Harnstoffcyclus?
4. Wie wird die Menge an abgebauten Aminosäuren aus der Menge an ausgeschiedenem Harnstoff berechnet? Welchen Einfluss hat die Wertigkeit der mit der Nahrung
zugeführten Proteine auf die Harnstoffsynthese?
5. Unter welchen Stoffwechsel-Bedingungen treten vermehrt Ketonkörper im Harn auf?
6. Welches sind die physiologischen Funktionen von Cortisol? Welches sind die
Ursachen und Krankheitssymptome bei Morbus Addison und Morbus Cushing? Was
versteht man unter der glucocorticoiden und mineralcorticoider Wirkung von Nebennierenrinden-Steroiden?
7. Wie entsteht Oxalsäure und wie wird sie ausgeschieden?
8. An welchen Reaktionen ist Ascorbinsäure im Organismus beteiligt?
9. Wie wird der pH-Wert des Urins reguliert? Wie entsteht alkalischer Harn?
10. Wann werden vermehrt Hydroxyprolin und Hydroxylysin ausgeschieden? Woher
stammen diese Aminosäuren? Warum werden die im Blutplasma gut vertretenen
Aminosäuren kaum im Urin ausgeschieden?
11. Wie wird Kreatinin gebildet und ausgeschieden?
12. Welche Reaktionen finden bei der 1. und 2. Phase der Biotransformation statt?
13. Nennen Sie die typischen Bestandteile von Harnkonkrementen und die Ursachen
ihrer Bildung.
14. Wie wird Bilirubin gebildet und ausgeschieden? Was versteht man unter dem Begriff
„Kernikterus“?
15. Welche Säuren können bei normalem und pathologischem Stoffwechsel gebildet
werden und zur Ausscheidung von Protonen mit dem Urin
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