HNPCC - Deutsche Digitale Bibliothek

Aus dem Institut für Pathologie
Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. Moll
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
in Zusammenarbeit mit dem Klinikum Kassel
Mikrosatelliteninstabilität und MismatchRepairgenexpression in Adenomen bei
erblichen Dickdarmkarzinom (HNPCC)
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der gesamten Humanmedizin in dem Fachbereich
Medizin der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Carmen Beckmann
aus
Hamburg
Marburg, 2008
Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am:
08.04.2008
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.
Dekan: Prof. Dr. Rothmund
Referent: Prof. Dr. Rüschoff
1. Korreferent: Frau Prof. Dr. Bauer
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis............................................................................................................ 3
Inhaltsverzeichnis............................................................................................................ 3
Abkürzungsverzeichnis...................................................................................................5
Abkürzungsverzeichnis...................................................................................................5
Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung.........................................................................6
Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung.........................................................................6
1.1 Epidemiologie Tumorerkrankungen...................................................................... 6
1.2 Epidemiologie gastrointestinaler Tumore.............................................................. 6
1.3 Erblichkeit gastrointestinaler Tumore....................................................................7
1.3.1 sporadische vs. genetisch determinierte gastrointestinale Tumore................ 7
1.3.2 Klassifikation genetisch determinierter gastrointestinaler Tumore................ 7
1.3.3 Arten der vererbten gastrointestinalen Tumore............................................. 7
1.4 Hereditäres non-polypöses Kolonkarzinoms (HNPCC)........................................ 8
1.4.1 Definition........................................................................................................ 8
1.4.2 Diagnosekriterien des HNPCC....................................................................... 8
1.4.3 Pathogenese des HNPCC-Syndroms............................................................ 10
1.4.4 Pathohistologie des HNPCC......................................................................... 13
1.4.5 Adenome beim HNPCC................................................................................14
1.5 Fragestellung....................................................................................................... 16
Kapitel 2 Material und Methoden................................................................................18
Kapitel 2 Material und Methoden................................................................................18
2.1 Material................................................................................................................ 18
2.2 Methoden..............................................................................................................18
2.2.1 Mikrosatellitenanalyse.................................................................................. 18
2.2.2 (Laser-) Mikrodissektion ..............................................................................21
2.2.3 Immunhistochemische Darstellung der Proteine MLH1-, MSH2-, MSH6und PMS2................................................................................................... 22
2.2.3.1 Methode................................................................................................... 22
2.2.3.2 Reagenzien...............................................................................................22
2.2.3.3 Lösungen..................................................................................................22
2.2.3.4 Vorbehandlung....................................................................................... 23
2.2.3.5 Färbevorgang.......................................................................................... 23
2.2.3.6 Auswertungskriterien...............................................................................24
Kapitel 3 Ergebnisse......................................................................................................26
Kapitel 3 Ergebnisse......................................................................................................26
3.1 Allgemeine Daten.................................................................................................26
3.2 Adenomhäufigkeit................................................................................................26
3.3 Histologie der Adenome...................................................................................... 29
3.4 Mikrosatellitenstatus der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen............... 29
3.5 MMR Proteinexpression der Adenome................................................................32
3.6 Immunhistochemie der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen.................. 33
3.7 Lokalisation der Adenome................................................................................... 35
3.8 Zeitliche Zusammenhänge................................................................................... 37
3.9 Lokalisation Adenome zu ihren Karzinomen...................................................... 38
Kapitel 4 Diskussion...................................................................................................... 39
Kapitel 4 Diskussion...................................................................................................... 39
4.1 Allgemeine Daten.................................................................................................39
4.2 Mutationsanalysen................................................................................................39
4.3 Tumorentstehung unter dem Einfluss der MMR - Gene......................................39
4.4 Adenome und HNPCC.........................................................................................40
4.5 Immunhistochemische Untersuchungen des Mikrosatellitenstatus..................... 40
4.5.1 Aufbau von Mikrosatelliten.......................................................................... 40
4.5.2 Mikrosatelliten(in)stabilität bei HNPCC-Patienten...................................... 40
4.6 Grundlage jeder HNPCC – Diagnostik: Die Anamnese...................................... 41
4.7 Ziele der Arbeit.................................................................................................... 41
4.8 Zeitliche Zusammenhänge zwischen Adenomen und Karzinomen..................... 42
4.9 Mikrosatellitenstabilität in Adenomen und Karzinomen..................................... 42
4.10 Immunhistochemische Zusammenhänge zwischen Adenomen und Karzinomen
......................................................................................................................... 42
4.11 Lokalisationen von Adenomen und Karzinomen...............................................43
4.12 Zusammenfassung und Schlußfolgerungen....................................................... 44
Kapitel 5 Zusammenfassung ....................................................................................... 45
Kapitel 5 Zusammenfassung ....................................................................................... 45
Chapter 6 Summary ..................................................................................................... 47
Chapter 6 Summary ..................................................................................................... 47
Kapitel 7 Literatur und Abbildungsnachweis............................................................ 49
Kapitel 7 Literatur und Abbildungsnachweis............................................................ 49
Kapitel 8 Anhang I (Gensequenzen)............................................................................ 53
Kapitel 8 Anhang I (Gensequenzen)............................................................................ 53
8.1 MSH2............................................................................................................... 53
8.2 MSH6............................................................................................................... 54
8.3 MLH1...............................................................................................................55
8.4 PMS2................................................................................................................56
Kapitel 9 Anhang II.......................................................................................................58
9.1 Tabellarischer Lebenslauf.................................................................................... 58
9.2 Verzeichnis der akademischen Lehrer................................................................. 59
9.3 Danksagung..........................................................................................................61
9.5 Ehrenwörtliche Erklärung.................................................................................... 62
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
Bedeutung
APC-Gen
Adenomatosis Polyposis Coli -Gen
CA
Kalifornien
CE
Kolektomie
CRC
Kolorektales Karzinom
DNA
Desoxyribonukleinsäure
E. coli
Escherichia coli (Darmbakterium)
EDTA
Ethylendiamin tetraacetic acid
FAP
familiäre adenomatöse Polyposis
GI-Trakt
Gastrointestinal-Trakt
HE - Färbung
Hämatoxilin – Eosin - Färbung
HNPCC
hereditäres non-polypöses Kolonkarzinom
ICG
International Cancer Group
IGFRIIR
Insulin-like growth factor receptor II
hMLH
humanes MutL Homolog
MMR
Mismatch Reparaturgene
hMSH
humanes MutS Homolog
MSI
Mikrosatelliteninstabilität
MSI-H
hochgradige (high) Mikrosatelliteninstabilität
MSI-L
geringgradige (low) Mikrosatelliteninstabilität
MSS
Mikrosatellitenstabilität
NIH
national institute of health
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerasekettenreaktion
hPMS
humanes postmeiotic segragation increased
PSA
Prostataspezifisches Antigen
RT-PCR
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion
TGF
Transforming growth factor
Z.n.
Zustand nach
Kapitel 1 Einleitung und Fragestellung
1.1 Epidemiologie Tumorerkrankungen
Seit Jahren gibt das statistische Bundesamt die Altersstruktur der deutschen
Bevölkerung heraus, und daraus ist ersichtlich, daß die Bevölkerung eine
steigende Lebenserwartung hat (Statistisches Bundesamt, 2005). Konform zu
dieser Entwicklung steigen die Neuerkrankungen an Neoplasien stetig an. Die
Todesursachenstatistik für das Jahr 2004 zeigt die Mortalität an Malignomen an
zweiter Stelle (Statistisches Bundesamt, 2005). Dieser Trend ist zum einen
zurückzuführen auf die gestiegene Lebenserwartung, zum anderen aber auch
auf den Lebensstandard, wie Ernährungs- und Bewegungsweise und nicht
zuletzt spielt auch der medizinische Fortschritt eine bedeutende Rolle in dieser
Entwicklung, da das Auftreten vieler Neoplasien mit zunehmendem Alter
ansteigt.
1.2 Epidemiologie gastrointestinaler Tumore
Bezogen auf die Häufigkeit stehen Malignome des Gastrointestinaltrakts an
zweiter Stelle, gleich hinter den Malignomen des Bronchialsystems (Statistisches
Bundesamt 2005).
Im Gastrointestinalsystem ist das Kolon am häufigsten von Tumoren befallen
(34%), gefolgt vom Magen mit 22% und dem Rektum mit 18% (Abb. 1). Dies
macht in der Summe mit 64% weit mehr als die Hälfte aller gastrointestinalen
Tumore aus.
Abb.1.1 Inzidenz gastrointestinaler Tumorerkrankungen (Prozent Neuerkrankungen/Jahr)
Pankreas
11%
Gallenblase
6%
Kolon
34%
Rektum
18%
Leber
5%
Magen
22%
Ösophagus
4%
1.3 Erblichkeit gastrointestinaler Tumore
1.3.1 sporadische vs. genetisch determinierte gastrointestinale Tumore
Die Tumore des Gastrointestinaltraktes lassen sich in sporadische und genetisch
determinierte einteilen. Unter den sporadischen Tumoren des
Gastrointestinaltraktes versteht man Tumore, die ohne genetische Vorbelastung,
entstehen. Mit rund 65% sind diese Tumoren zwar in der Mehrzahl, dies
bedeutet aber auch, dass bei 35% der Patienten, die an einem
gastrointestinalen Tumor erkranken, eine genetische Belastung vorliegt, die
unterschiedlich ausgeprägt ist (Rüschoff et al.. 2004).
1.3.2 Klassifikation genetisch determinierter gastrointestinaler Tumore
Betrachtet man nur die Patienten, die durch eine genetische Prädisposition an
einem gastrointestinalen Tumor erkrankt sind, so fällt auf, dass der
überwiegende Teil, rund 90%, eine polygene Vererbung aufweist. Polygene
Vererbung bedeutet, dass sich diese Tumore nicht auf eine Genveränderung
zurückführen lassen und dass in der Regel auch Faktoren wie Lebensweise die
Manifestation eines Karzinoms mit beeinflussen.
Etwa 10% werden monogen vererbt, d.h. sie lassen sich auf eine Mutation in
einem bestimmten Gen zurückführen. Dabei zeichnen sich Betroffene durch eine
hohe z.T. bis 100%ige Penetranz (Manifestation weitgehend unabhängig von
Umweltfaktoren) aus (Rüschoff et al.. 2004). Während die genetischen
Grundlagen bei letzteren Formen relativ gut aufgeklärt sind, ist dies bei den
polygenetischen Formen noch weitgehend ungeklärt.
Unabhängig davon kommt der Familienanamnese eine zentrale Rolle bei der
Aufdeckung von Tumorhäufungen und möglicherweise einer erblichen Belastung
zu.
1.3.3 Arten der vererbten gastrointestinalen Tumore
So auch bei dem hereditären nicht – polypösen Kolonkarzinom (HNPCC). Auch
wenn in den letzten Jahren die ursprünglich angenommene Inzidenz von 5% auf
zwischen 2 und 4% korrigiert wurde, stellt dieses den größten Anteil des
erblichen Dickdarmkrebses dar, gefolgt von der familiären adenomatösen
Polyposis (FAP), die mit bis 2% die zweithäufigste vererbte Karzinomerkrankung
des Gastrointestinaltraktes ist ( Rüschoff et al.. 2004) (Abb. 2).
Im Unterschied zum HNPCC ist die FAP gekennzeichnet durch das Auftreten
hunderter von Adenomen im Kolon. Der Erkrankungsbeginn liegt schon im
Kindesalter, so daß bei Koloskopien bis zu hundert Adenome gleichzeitig
gefunden werden können. Diese Blickdiagnose ermöglicht ein frühes
Einschließen von Patienten und deren Angehörige in effektive
Vorsorgeprogramme. Die Krankheit ist begründet in einem Defekt des APCGens und führt letztendlich zur Entartung der multiplen Adenome (Friedl W
2002).
Abb. 1.2: Häufigkeit der vererbaren Kolonkarzinome in Prozent
HNPCC
4%
FAP
2%
Hamartomatöse
Polypöse
Tumorsyndr.
1%
Polygen
93%
1.4 Hereditäres non-polypöses Kolonkarzinoms (HNPCC)
1.4.1 Definition
Erstmalig wurde das HNPCC - Syndrom im Jahr 1913 von Warthin beschrieben.
Aldred Warthin war Pathologe an der Universität von Michigan in Ann Arbor
(USA). Angeregt durch die Aussage seiner Schneiderin, sie werde an Unterleibsoder Darmkrebs sterben, untersuchte er schon seit 1895 diese Familie. Seine
Schneiderin sollte Recht behalten, sie verstarb in jungen Jahren an einem
Endometriumkarzinom. Warthin veröffentlichte erstmals seine Untersuchungsergebnisse in seiner Publikation als Familie G (Warthin, 1913). Auffällig
an dieser Familie waren das gehäufte Auftreten von Tumoren im Bereich des
Magen-Darm- und Urogenitaltraktes, sowie das junge Erkrankungsalter der
Familienmitglieder. Warthin versuchte, in seinen Untersuchungen eine Verbindung zwischen Krebserkrankung und familiärer Prädisposition zu finden. Seit
Warthins Veröffentlichung 1913 haben verschiedene Autoren sich mit dieser
Familie G beschäftigt und deren Stammbaum ergänzt. So auch Lynch, der in
einem follow – up 1966 nochmals diese Familie untersuchte (Lynch et al.., 1966)
und das Lynch – Warthin – Syndrom definierte, heute auch als HNPCC benannt.
1991 wurde von der "International Collaborative Group on Hereditary Non–
Polyposis Colorectal Cancer" die Amsterdam-Kriterien I festgelegt (Vasen et al..,
1991). Diese ermöglichen eine Diagnosestellung des HNPCC nach
anamnestischen und klinischen Angaben (Tab. 1). Später zeigte sich, daß die
Amsterdam-Kriterien I nicht ausreichend sind, da häufig bei Patienten mit
HNPCC extraintestinale Tumore auftreten. In einer erweiterten Definition, den
Amsterdam-Kriterien II (Vasen et al.., 1999), werden diese Tumore mit
eingeschlossen.
1.4.2 Diagnosekriterien des HNPCC
Die Diagnose eines HNPCC Syndroms basiert auf den sog. Amsterdam I und II
Kriterien (Tab. 1).
Amsterdam I Kriterien
Mindestens drei Personen in einer Familie mit kolorektalem Karzinom und
Erfüllung aller folgenden Kriterien:
• Einer der drei Patienten ist ein Verwandter 1. Grades der beiden anderen
Erkrankten.
• Mindestens zwei aufeinanderfolgende Generationen sind betroffen.
• Mindestens ein Betroffener ist jünger als 50 Jahre bei
Karzinommanifestation.
• Ausschluß einer familiären adenomatösen Polyposis und
• Tumoren sind histopathologisch verifiziert.
Amsterdam II Kriterien
Mindestens drei Personen in einer Familie mit einem HNPCC-assoziierten
Tumor und Erfüllung aller folgenden Kriterien, wobei neben kolorektalen
Karzinomen auch extrakolische Malignome wie Karzinome des Endometriums,
des Dünndarms und der ableitenden Harnwege oder des Nierenbeckens
gleichwertig berücksichtigt werden:
• Einer der 3 Patienten ist ein Verwandter 1. Grades der beiden anderen
Erkrankten.
• Mindestens 2 aufeinander folgende Generationen sind betroffen.
• Mindestens ein Betroffener ist jünger als 50 Jahre bei
Karzinommanifestation.
• Ausschluß einer familiären adenomatösen Polyposis und
• Tumoren sind histopathologisch verifiziert.
Tab. 1 Amsterdam-Kriterien zur Diagnose des HNPCC Syndroms
Mit Aufklärung der molekulargenetischen Grundlagen des HNPCC Syndroms
kann die Diagnose nicht nur klinisch - anamnestisch sondern auch mittels
Nachweis einer Mutation in den heute bekannten Genen (Keimbahnanalyse)
nachgewiesen werden (Die genauen Gene und Mutationsloci werden in Kapitel
1.3 beschrieben). Da sich die Mutatationsanalyse allein kostenbedingt nicht zum
Screening eignet, ist es notwendig die Risikopatienten, bei denen eine
Keimbahnanalyse sinnvoll ist, vorab zu selektieren. Dazu wurden 1994 die so
genannten Bethesda – Kriterien eingeführt (Rodriguez – Bigas et al., 1997).
Diese wurden inzwischen anläßlich eines weiteren Expertentreffens in Bethesda
überarbeitet (Tab.2). Hiermit wird festgelegt, von welchen Patienten
Tumorproben auf Mikrosatelliteninstabilität geprüft werden sollten, womit dann
die Indikation zur Keimbahnanalyse auf einen HNPCC typischen Gendefekt
gestellt werden kann.
Bethesda Kriterien
• Patienten, die die Amsterdam – Kriterien I/II erfüllen
• Patienten mit synchronen / metachronen Tumoren aus dem HNPCC –
Spektrum
• Patienten mit kolorektalem Karzinom und Verwandte 1. Grades mit
Karzinom aus dem HNPCC – Spektrum vor dem 45. Lebensjahr oder mit
kolorektalem Adenom vor dem 45. Lebensjahr
•
•
•
•
Patienten mit kolorektalem Karzinom oder Endometriumkarzinom vor dem
45. Lebensjahr
Patienten mit rechtsseitigem, wenig differenziertem kolorektalem Karzinom
vor dem 45. Lebensjahr
Patienten mit kolorektalem Karzinom vom Siegelringzelltyp vor dem 45.
Lebensjahr
Patienten mit kolorektalem Adenom vor dem 45. Lebensjahr
a Karzinome des Endometriums, der Ovarien, des Magens, hepatobiliären Systems, Dünndarms
Tab. 2 Aktualisierte Bethesda Kriterien:
1.4.3 Pathogenese des HNPCC-Syndroms
Bei dem HNPCC - Syndrom handelt es sich um eine autosomal - dominant vererbte Erkrankung. Aufgrund einer Keimbahnmutation kommt es zu einem Funktionsverlust in einem der Mismatch Repairgene (MMR). Bis heute sind 6 MMRGene (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, PMS1, MLH3) bekannt, von denen die vier
Erstgenannten ursächlich dem HNPCC Syndrom zugrunde liegen. Dabei sind in
nahezu 90% der Fälle die Gene MLH1 oder MSH2 betroffen. Fehler, die in der
Replikation der DNA in Form von Basenfehlpaarungen und Leserasterwechsel
auftreten, werden vom MMR-System erkannt, ausgeschnitten und repariert.
In E. coli sind im MMR-System drei Gene beteiligt: MutS, MutL und MutH (Lahue
et al.., 1989). Das MutS Protein erkennt als Homodimer Basenfehlpaarungen
und bindet an diesen, so daß sie als "loop" aus dem neu synthetisierten Strang
herausragen.
In Verbindung mit MutL aktiviert MutS MutH, welche zusammen den Strang markieren, so daß Exonukleasen das fehlerhafte DNA-Segment herausschneiden
und die DNA Polymerase zusammen mit der DNA Ligase die so entstandene
Lücke ergänzen (Mara und Schär, 1999).
In Eukaryonten gibt es im Wesentlichen zwei Unterschiede zum E. coli Modell:
Zum einen wird das MMR-System lediglich durch Strang-Diskontinuitäten an die
zu reparierende Stelle gelenkt und nicht wie bei E. coli über hemimethylierte
Basenpaare. Daraus folgend wurden auch keine MutH-Analoga in Eukaryonten
gefunden. Zum anderen sind die MutS und MutL Homologe nicht Homodimere
wie in E. coli, sondern als Heterodimere tätig. Es finden sich mindestens sechs
MutS Homologe und fünf MutL Homologe, die als MSH und MLH bezeichnet
werden. MSH2-MSH6 Heterodimere erkennen und reparieren Basenpaarfehlbildungen und "loops" bis zu zwei Basenpaaren, wo hingegen MSH2-MSH3
Heterodimere Basenfehlbildungen verschiedener Größe reparieren (Luiz et al..,
2003). In Abb. 3 ist ein Schema dieses Reparationsvorganges dargestellt.
M
utH
mismatc
h
MutS
MutH
neu synthetisierter Strang
Neusynthes
e
ist speziell für Reparaturen in so genannten Basenrepeats
zuständig. Zu einem endgültigen Ausfall des MMR - Systems und damit zu einer
Tumor-Entstehung, muss zum ererbten Ausfall des einen Allels eine zufällige
somatische Mutation zum Ausfall des anderen Allels führen, entsprechend der
"two hit"- Hypothese von Knudson (Knudson, 1971).
Die durch Mutation des MMR - Systems entstandene Mikrosatelliten - Instabilität
(MSI) ist ein wichtiges Diagnosekriterium für ein HNPCC. Mikrosatelliten sind
repetetive DNA-Sequenzen mit einer Sequenzlänge bis zu 6 Basen.
Mikrosatelliten - DNA ist am häufigsten in Introns lokalisiert, allerdings gibt es
auch codierende Abschnitte der menschlichen DNA, die Mikrosatelliten
enthalten. Die vom National Cancer Institute Workshop und den International
Cancer Group (ICG) – HNPCC (Boland et al.., 1998; Umar et al.., 2004)
international veröffentlichten Mikrosatelliten - Loci, BAT25, BAT26, D5S346,
D2S123, D17S250, sind bei Instabilität ein molekularbiologischer Anhalt für ein
HNPCC - Syndrom. Für den molekularbiologischen Verdacht eines HNPCC
sollten nach den Empfehlungen des National Institute of Health (NIH) zwei dieser
fünf Mikrosatelliten instabil sein, also eine hochgradige MSI bestehen (MSI – H).
Im Gegensatz dazu treten Mikrosatelliten-Instabilitäten (MSI) bei den
sporadischen Formen erst in späteren Tumorstadien auf. Eine MSI kann auch
bei Tumoren ohne Störung des MMR - Systems auftreten, die Ausprägung ist
dann allerdings deutlich geringer, so daß man zur Unterscheidung dort von
einem Tumor mit leichter MSI (MSI – L) spricht. Zusätzlich gibt es noch die
Möglichkeit Tumoren mit einem stabilen Mikrosatellitensystem zu haben, diese
Tumore werden als MSS bezeichnet.
Wie sporadische CRC entstehen HNPCC - assoziierte Tumore in der so
genannten Dysplasie - Adenom - Karzinom - Sequenz. Dabei spielt ein
schrittweiser Verlust von wachstumsbegrenzenden Faktoren eine wichtige Rolle
(Vogelstein, 1988).
Abb.
Mismatchrepair
Das 3MMR
- System
Bei HNPCC assoziierten CRC sind vor allem BAX, TGFβRII (transforming groth
factor – β receptor II), IGFRIIR (insulin – like growth factor receptor II) , sowie
MSH3 betroffen. In geringerer Häufigkeit treten Mutationen in den Genen c – K –
ras und p53 auf. Bei sporadischen CRC sind im wesentlichen APC, K – ras und
p53 mutiert. Bei sporadischen CRC kommt es mit zunehmender Akkumulation
von genetischen Schäden zum Verlust eines Allels und Mutation des anderen
Allels, also zur Akkumulation grober genetischer Schäden, die nicht selten mit
Verlusten und/oder Zugewinnen ganzer Chromosomen und
Chromosomenteilstücke mit Ausbildung einer Aneuploidie führen können. Im
Gegensatz dazu betreffen die Mutationen bei MSI-H Tumoren nur kleine DNA
Sequenzabschnitte, so dass diese Tumoren häufiger einen diploiden
Chromosomensatz aufweisen (Perucho M, 1996).
Sind beide Genallele eines Reparaturgens ausgeschaltet, lässt sich dies in den
meisten Fällen immunhistochemisch als fehlende Expression im Tumorgewebe
erfassen. In etwa 70-80% der HNPCC - Fälle ist ein solcher
Genexpressionsausfall vor allem in den Genen MSH2 oder MLH1 nachweisbar.
Dabei konnte gezeigt werden, dass ein Ausfall von MSH2 in der Regel von einer
verminderten Expression von MSH6 begleitet ist. Analog ist eine verminderte
Expression von PMS2 bei einem Ausfall von MLH1 zu erwarten (Rüschoff et al.
2006).
Als Beispiel für HNPCC-assoziierte Gene sei hier MSH2 beschrieben. Bisher
entdeckte Mutationen liegen größtenteils im codierenden Bereich des Gens. Das
Gen ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 2 lokalisiert und besteht aus
insgesamt 16 Exons mit 2804 Basenpaaren. Das Genprodukt besteht aus 935
Aminosäuren, das ungefähr in der Mitte des Proteins eine DNA Bindungsdomäne
und am C-Peptid lokalisierte ATP-ase Aktivität besitzt. Die genauen
Basensequenzen der Gene MSH2 und MSH6, sowie MLH1 und PMS2 sind in
Abb. I bis IV (s. Anhang) beschrieben.
Da die im Anschluß beschriebenen pathohistologischen und makroskopischen
Aspekte der Tumore nicht ausreichen, um mit Sicherheit die Diagnose eines
HNPCC zu stellen, wird bei einem entsprechendem Verdacht (Amsterdam- und
Bethesda- Kriterien) eine molekulargenetische Untersuchung angestrebt.
Zunächst wird eine Untersuchung zur Analyse des Expressionsverlustes von
MSH2, MLH1, MSH6 und PMS2 empfohlen (Rüschoff et al. 2004). Diese wird
routinemäßig mit entsprechenden Antikörpern und den entsprechenden
Färbungen durchgeführt. Der definitive Nachweis einer Keimbahnmutation erfolgt
somit nach immunhistochemischer Charakterisierung der entsprechenden Gene.
Hierbei empfiehlt es sich, das Gen auf eine Mutation hin zu untersuchen, das in
der immunhistochemischen Färbung einen Verlust der Expression des Proteins
gezeigt hat. Da bis zum heutigen Tage keine bevorzugten Mutationsorte ("hotspots") der betroffenen Gene bekannt sind, muß jeweils das gesamte Gen
analysiert und sequenziert werden (Peltomäki et al., 1997). Daraus resultiert ein
aufwendiges "Screening"-Verfahren für die alltägliche Praxis. Ein weiteres
Problem des Nachweises einer Keimbahnmutation besteht in der geringen
eindeutigen Mutationsnachweisrate von 50-60% bei den durch die AmsterdamKriterien anamnestisch definierten HNPCC-Erkrankten (Park et al.., 2002).
1.4.4 Pathohistologie des HNPCC
HNPCC-Tumore zeigen histologisch ein zu den sporadisch auftretenden
Tumorformen differentes Bild. Sporadische Tumoren sind in der Regel eher nicht
muzinös und aneuploid, wohingegen HNPCC assoziierte Tumoren muzinös /
solid erscheinen und euploid sind. (Rüschoff et al.., 1998).
Als häufiges Merkmal ist eine sogenannte Siegelringzellform zu verzeichnen, die
durch eine verstärkte Schleimproduktion der Zelle und konsekutiver Verdrängung
des Zellkernes entsteht. Weiterhin konnten Jass et al.. (Jass et al., 1998) zeigen,
daß ein signifikant höherer Anteil an HNPCC-Tumoren eine sogenannte
"CROHN´s like lesion", also eine lymphozytäre Infiltration in den Randzonen des
Tumors beinhaltet (Abb. 9). Als letztes histologisch auffälliges Merkmal ist eine
zunehmende Dedifferenzierung des Tumors zu vermerken (Abb. 10).
Abb. 9 Rektum HE frühes muzinöses Adeno Karzinom mit Crohn's like lesion.
Abb.10 Beispiel für eine zunehmende Dedifferenzierung (solid medulläres Karzinom, PAS)
1.4.5 Adenome beim HNPCC
War man zu Beginn der Erforschung des HNPCC-Syndroms noch der Meinung,
daß das Auftreten von Adenomen ein sehr seltenes Ereignis ist, so ist man heute
eher der Ansicht, daß die Häufigkeit von Adenomen bei dieser Erkrankung
zumindest denen der Allgemeinbevölkerung gleichzusetzen ist (Iino et al.., 2000).
Im Gegensatz zum sporadischen CRC ist die Adenom-Karzinom-Sequenz
deutlich beschleunigt. Beträgt die Zeitspanne vom Auftreten des Adenoms bis
zur Entstehung des Karzinoms bei sporadischen CRC in der Regel 8-10 Jahre,
so haben im Vergleich hierzu Untersuchungen gezeigt, daß sich die Entartung
der Adenome bei HNPCC-Patienten innerhalb von drei Jahren vollzieht (Lynch
und Chapelle, 2003). Festzustellen ist, daß die Adenome bei HNPCC-Erkrankten
deutlich im früheren Lebensalter auftreten, im Median bei 43,3 Jahren (De Jong
et al.., 2004), als dies der Fall bei sporadischen CRC ist (Altersgipfel bei 65
Jahren). Auffällig ist dabei die fehlende Expression der MMR-Proteine in den
meisten Adenomen (De Jong et al.., 2004). Dies ist ein guter Ansatzpunkt, um
ein frühzeitiges Erkennen von HNPCC-Tumoren in der Vorsorge zu ermöglichen.
Histopathologisch kann man bei Adenomen von HNPCC-Erkrankten zumeist
eine höhergradige Dysplasie der Adenome finden, als es der Fall bei Adenomen
von Patienten mit sporadischen Karzinomen ist (Lynch et al.., 1989; Mecklin und
Jarvinen, 1986; Mecklin et al..,1986a; Muto et al..,1985). Zusätzlich sind diese
Adenome größer und haben häufig eine tubulo-villöse Architektur (De Jong et
al.., 2004, Iino et al.., 2000). In Abbildung 11 ist ein Adenom eines Patienten mit
sporadischen CRC, in Abbildung 12 ein Adenom eines HNPCC-Patienten
dargestellt.
Abb. 11 niedriggradig dysplastisches Adenom
Abb. 12 hochgradig dysplastisches Adenom
1.5 Fragestellung
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich Adenome als
Untersuchungsmaterial für ein HNPCC - Screening eignen.
Adenome stellen die erste Stufe der Karzinomentstehung dar. Dabei ist die
Adenom-Karzinom-Sequenz bei HNPCC - erkrankten Patienten zeitlich deutlich
verkürzt. Aus diesem Grund war die Fragestellung dieser Arbeit, ob durch
molekulargenetische Analyse in Form von Mikrosatelliteninstabilität und die
immunhistochemische Färbung an Adenomen ein Hinweis auf HNPCC geben
kann.
Im Umkehrschluss muss geklärt werden, ob ein MSS - Status automatisch ein
Ausschluss eines HNPCC - Syndroms bedeuten kann, oder ob hier zusätzlich
auch ein sporadisches Adenom aufgetreten sein kann.
Durch Untersuchung von syn- oder metachronen Adenomen bei gesicherten
HNPCC - Patienten wurde, unter Zuhilfenahme von Lasermikrodissektion und
immunhistochemischer Färbung, dieser Fragestellung Rechnung getragen.
Die Beurteilung der Ergebnisse der Mikrosatellitenanalyse und immunhistochemischen Färbung soll zeigen, inwieweit es sich hierbei um verläßliche Untersuchungsmethoden in der Praxis handelt, die zum Beispiel in Form eines
Screening-Verfahrens für Risiko-Patienten routinemäßig angewendet werden
sollten.
Kapitel 2 Material und Methoden
2.1 Material
Das in dieser Arbeit verwendete Untersuchungsgut stellt Normalgewebe, Tumorgewebe und Adenomgewebe aus dem Gastrointestinaltrakt dar. Die
Gewebeblöcke stammen aus der Pathologie des Klinikums Kassel, die im
Rahmen der Verbundstudie zum erblichen Dickdarmkarzinom der Deutschen
Krebshilfe gesammelt worden sind (Patienten- und Follow-up Details, s.
Ergebnisteil).
An diesen Geweben wurden Mikrosatellitenanalysen, Lasermikrodissektion und
immunhistochemische Analysen durchgeführt.
2.2 Methoden
2.2.1 Mikrosatellitenanalyse
Für die Mikrosatellitenanalyse wurde DNA aus Normal- und Tumor- bzw.
Adenomgewebe mit den vom National Cancer Institute Workshop und den ICGHNPCC (Boland et al., 1998; Umar et al., 2004) empfohlenen und zuvor von
Dietmaier et al. (1997) validierten 5 Primerpaaren untersucht. Hierbei handelte
es sich um die folgenden Mikrosatellitenloci: zwei Mononukleotidrepeats (BAT
25, BAT 26) und drei Dinukleotidrepeats (D2S123, D5S346, D17S250).
Zusätzlich wurde bei der Lasermikrodissektion der Locus BAT40 untersucht. Die
Normal - DNA stammte entweder aus unauffälliger Darmmucosa, die an den
Tumor grenzte, oder aus isolierter DNA aus dem Blut des jeweiligen Patienten.
Aus den Paraffingewebeblöcken wurden mehrere 5 µm dicke Gewebeschnitte
angefertigt. Hiervon wurde ein Schnitt mittels Hämatoxylin - Eosin (HE) gefärbt
und vier Schnitte für die immunhistochemische Analyse verwandt.
Weitere 5 µm dicke Schnitte von in Paraffin eingebetteten Karzinom-, Adenom
und angrenzendes Normalgewebe wurden auf Objektträger gezogen.
Zur Entparaffinisierung werden die Objektträger ca. 20 Minuten bei 80° C im
Wärmeschrank inkubiert. Durch eine absteigende Xylol/Ethanolreihe wird das
verflüssigte Paraffin aus dem Gewebe entfernt. Dies geschieht, indem die
Schnitte nach 10- und 5-minütiger Inkubation in 100% Xylol für jeweils eine
Minute in 100%, 96%, 80%, 70% und 70% Ethanollösung überführt werden. Im
Anschluß werden sie kurz mit destilliertem Wasser gespült.
Mit Hilfe des korrespondierenden HE-Präparates wurden die Tumorareale mit
einer sterilen Skalpellklinge vom Objektträger gekratzt und in ein 1,5 ml
Reaktionsgefäß gegeben, das zuvor mit 100 µl Lysepuffer beschickt wurde.
Danach wurde zur Gewinnung der Gesamt-DNA das High Pure PCR Template
Preparation Kit der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim) verwendet. Die
einzelnen Komponenten des Kits mit ihrer Zusammensetzung und Funktion ist in
Tabelle 1 aufgeführt. Nach Zugabe von 200 µl tissue lysis buffer und 40 µl
Proteinase K und kurzem Durchmischen wurden die Ansätze bei 50° C und
kontinuierlichem Schütteln auf einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg) über
Nacht inkubiert.
Am nächsten Tag wurden pro Ansatz 200 µl Binding buffer pipettiert und diese
für 10 Minuten bei 72° C inkubiert. Es folgte durch die Zugabe von 100 µl
Isopropanol die Aufreinigung der DNA. Die Lysate wurden nachfolgend in ein mit
einem Filtervlies versehenes filter tube gegeben und bei 6800 g eine Minute
zentrifugiert (Eppendorf Tischzentrifuge 5810 R, Hamburg). Anschließend
wurden die Gefäße mit 500 µl Waschpuffer versetzt und nochmals bei 6800 g
zentrifugiert. Dieser Schritt wurde zweimal durchgeführt.
Nach Leerung des Auffanggefäßes erfolgte ein erneutes Zentrifugieren für 10
Sekunden bei 18000 g. Nun wurde das filter tube in ein frisches Reagiergefäß
eingesetzt und mit 100 µl elution buffer versetzt. Der elution buffer wurde zuvor
auf 72° C erwärmt. Es schloß sich eine erneute Zentrifugation bei 6800 g für eine
Minute an. Das gewonne Eluat entspricht der gereinigten DNA. Die gereinigte
DNA konnte nun weiterverarbeitet werden oder bei 4° C bzw. –20° C gelagert
werden.
Für die weitere Verarbeitung der gereinigten DNA wurde das HNPCC Microsatellite Instability Test-Kit der Firma Roche Diagnostics GmbH (Mannheim)
verwendet. Hierfür wurde zu einem auf Eis stehenden 0,5 ml Reaktiongefäß 10
µl steriles H2O (PCR grade) hinzugegeben. Anschließend wurden 4 µl MultiPrimer Mix (5fach konzentriert), dann 4 µl Enzyme Master Mix (5fach
konzentriert) und zum Abschluß 2 µl Tumor-, Adenom- bzw. Normal-DNA
hinzupipettiert. Es folgte das Vermischen (Vortex) und das anschließende kurze
Zentrifugieren der Reaktionsansätze. Nun wurden die Gefäße im Thermocycler
plaziert und die Polymerasenkettenreaktion (PCR) gestartet.
Bei der PCR handelt es sich um ein automatisiertes, enzymatisches Verfahren
zur exponentiellen Vermehrung spezifischer DNA-Sequenzen. Diese wurde nach
einem modifizierten Originalprotokoll (Saiki et al., 1988) durchgeführt.
Charakeristisch ist das zyklische Durchlaufen dreier Reaktionsschritte, die i. d. R.
bei definierten Temperaturen stattfinden (PCR-Programm). Initial werden die
DNA-Stränge von einander getrennt (Denaturierung bei 94° C). Im folgenden
Schritt lagern sich distal und proximal der zu amplifizierenden Sequenz
Oligonukleotide (Primer) an (Annealing, bei 52° C), an die beim jeweiligen
Temperaturoptimum (72° C) der verwendeten DNA-Polymerase Nukleotide
entsprechend der zu kopierenden Sequenz synthetisiert werden (Elongation).
Bei den durchlaufenden PCR-Zyklen stehen jeweils zunehmend jene Stränge für
die Kopie zu Verfügung, die die betreffende DNA-Sequenz umfassen. Das
Ergebnis ist eine exponentielle Anreicherung der Ziel-DNA im Reaktiongemisch.
In Tabelle 2 ist das verwendete PCR-Programm aufgeführt. Anschließend
erfolgte die Analyse mit dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer, hierfür wurden zu
jeweils 2 µl PCR-Produkt, 15 µl entionisiertes Formamid und 0,5 µl Längenstandard (GS500TAMRA) gegeben und gemischt. Das Gefäß wurde mit einem
Septum verschlossen und der Reaktionsansatz bei 94° C für zwei Minuten
denaturiert. Bis zum Auftragen wurden die PCR-Produkte bei 4° C auf Eis
gelagert.
Bezeichnung
Funktion
Zusammensetzung
Tissue Lysis Buffer
Gewebelyse
4 M Harnstoff, 200 mM Tris, 20
mM NaCl, 200 mM EDTA, pH
Binding Buffer
optimales
Bindeverhalten der
DNA an das Glasvlies
Proteinase K
Wash Buffer
Elution Buffer
High Pure Filter
Tubes
Collection tubes
Proteinabbau
Entfernung von
überschüssigen
Zellbestandteilen
Elution der DNA vom
Glasvlies
Auffanggefäße
7,4
6M
Gunanidiniumhydrochlorid, 10
mM Harnstoff, 10 mM TrisHCl, 20% Triton X-100 (v/v),
pH 4,4
Lyophilisat
80% Ethanol, 20 mM NaCl, 2
mM Tris, HCl, pH 7,5
10 mM Tris, pH 8,5
Polypropylen Gefäße mit
Glasfieber-Fleece
Polypropylen
Tab.1: Komponenten des High Pure PCR Template Preparation Kit
Schritt
Denaturierung
Amplifikation
Final Elongation
Abkühlung
Dauer/Temperatur
2 min 94° C
10 s 94° C Denaturierung
30 s 52° C Annealing
30 s 72° C Elongation
7 min 72° C
4°C
Tab. 2: PCR-Programm
Abb. 1 Mikrosatelliteninstabiles Adenom
Wiederholung
1x
35x
1x
Abb. 2 Mikrosatellitenstabiles Adenom
2.2.2 (Laser-) Mikrodissektion
Für die Lasermikrodissektion kommen in Paraffin eingebettete Gewebestücke
zum Einsatz, die Karzinom-, Adenomgewebe und korrespondierendes Normalgewebe enthalten. Mit einem Mikrotom werden von diesen Paraffingewebeblöcken 5 µm dicke Schnitte angefertigt. Jeweils ein Schnitt wird auf
einen membranmontierten Objektträger (Polyethylenmembran fixiert mit Rubbercement (Fixogum, Marabuwerke, Tamm, Deutschland)) gezogen und einer
Hämatoxilin – Eosin - Färbung (HE - Färbung) mit dem Färbeautomat (Tissue
Stainer cot, Fa. Medite, Burgdorf) unterzogen. Zu jedem Tumor wurde zusätzlich
ein Querschnitt angefertigt und mit PAS (periodic acid Schiff) gefärbt.
Zunächst wurde mit Hilfe des HE - Schnittes das betreffende Tumor- bzw.
Adenomareal markiert, welches mikrodisseziert werden soll. Das Areal besteht
aus mindestens 1 cm2 Größe. Für die manuelle Dissektion wird der zu untersuchende Zellverband vom Objektträger gekratzt, für die Laserdissektion mit
dem Laser gelöst und mit Proteinase K in einer Konzentration von 2 µg/ml (Fa.
Qiagen, Valencia, CA), der Verdauung unterzogen. Die DNA wird mit dem
QIAamp DNA Mini Kit (Fa. Qiagen, Valencia, CA) gemäß der Herstellerangaben
extrahiert und mit dem PCR Template Preparation Kit (Fa. Roche, Mannheim)
gereinigt.
Die Schnitte werden mit Xylene entparaffinisiert und durch eine absteigende
Alkoholreihe rehydriert, analog zu der Mikrosatellitenanalyse.
Für die Lasermikrodissektion kam das Leica AS LMD System (Leica
Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) zum Einsatz. Hierbei wurden ca.
100 bis 200 Epithelzellen entnommen. Bei der Entnahme der Zellen wurde
darauf geachtet, daß jeweils Adenomanteile mit verschiedenen Dysplasiegraden
(D1-D3) des Adenoms zur Analyse kamen. Für jeden Dysplasiegrad wurden
jeweils zwei unabhängige Zellgruppen entnommen. Diese Epithelzellen wurden
in ein Reagenzglas getan und mit 20 µl Lysis buffer versetzt. Der Lysis buffer
setzt sich aus 10% Proteinase K 2 mg/ml (Fa.Roche, Mannheim, Deutschland),
0,5% Tween 20 (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) und einmal Taq PCR
Buffer (Fa. Roche, Mannheim, Deutschland) zusammen. Anschließend fand der
Verdau für 18 Stunden bei 50°C statt. Nach dieser Zeit wurde die Proteinase K
durch die Inkubation für 10 Minuten bei 94°C gestoppt.
Zur DNA Isolierung siehe oben.
2.2.3 Immunhistochemische Darstellung der Proteine MLH1-, MSH2-, MSH6und PMS2
2.2.3.1 Methode
Nach dem heutigen Wissensstand führt eine Mutation in der Keimbahn eines der
Mismatch-Repair(MMR)-Gene zu einem Stopcodon. Daraus resultiert eine fehlerhafte Transkription bzw. es kommt zu einem Basenabbruch und somit zur
Unfähigkeit, das entsprechende Protein zu synthetisieren und als Antigen zu
präsentieren. Dieses Phänomen macht sich die immunhistochemische Analyse
zu eigen, da bei einer Mutation der entsprechende Antikörper nicht mehr an das
Antigen binden kann. In der vorliegenden Arbeit wurden Schnitte von Tumor-,
Adenom- und korrespondierendem Normalgewebe des Darms verwendet und
Primärantikörper gegen das hMLH1-, hMSH2- und hMSH6- und hPMS2-Protein
für die immunhistochemische Darstellung eingesetzt (Tab. 3).
2.2.3.2 Reagenzien
• Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), Fa. Merck, Darmstadt,
Deutschland
• Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), Fa. Merck, Darmstadt,
Deutschland
• Citronensäure-Monohydrat (C6H8O7), Fa. Merck, Darmstadt,
Deutschland
• Trinatriumcitratdihydrat (C6H5O7Na3), Fa. Merck, Darmstadt,
Deutschland
• Tween 20, Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland
• EDTA, Fa. Sigma
2.2.3.3 Lösungen
• Phosphate Buffered Saline (PBS)-Puffer pH 7,4
• 12,4g KH2PO4 + 43,1g Na2HPO4 x 2H2O + 42,5g NaCl in 5l Aqua dest.
lösen, mit 1M NaOH auf pH 7,4 einstellen.
• Phosphate Buffered Saline (PBS)-Puffer pH 7,4 mit Tween (PBS/Tween)
• 12,4g KH2PO4 + 43,1g Na2HPO4 x 2H2O + 42,5g NaCl in 5l Aqua dest.
lösen, mit 1M NaOH auf pH 7,4 einstellen. 2,5ml Tween 20 zufügen.
• 10mM Citratpuffer pH 6,0
• 21,01g C6H8O7 x 2H2O in 1000ml Aqua dest. lösen = 0,1M
Zitronensäure = Stammlösung A
• 29,41g C6H5O7Na3 x 2H2O in 1000ml Aqua dest. lösen = 0,1M
Natriumcitrat = Stammlösung B
• 9ml Stammlösung A + 41ml Stammlösung B mit 450ml Aqua dest. auf
500ml auffüllen.
•
•
1mM EDTA pH 8,0
0,37g EDTA in 1000ml Aqua dest. lösen und mit NaOH auf pH 8,0
einstellen.
2.2.3.4 Vorbehandlung
Für die Untersuchung werden 4 µm dicke Schnitte von Tumor-, Adenom- und
korrespondierendes Normalgewebe des Darms auf silanisierte Objektträger
gezogen. Konnte kein Normalgewebe in der Nähe des Tumors bzw. Adenoms
verwendet werden, wurde ein zusätzlicher Gewebeschnitt von einem anderen
Block angefertigt. Das Normalgewebe diente zur Positivkontolle und wurde für 30
Minuten bei 60° C sowie über Nacht bei 38° C getrocknet.
Es folgt die Entparaffinierung der Schnitte, indem die Objektträger zweimal 5
Minuten in Xylol überführt, anschließend zweimal 5 Minuten in Aceton und
abschließend zweimal 5 Minuten in Aqua dest. getaucht werden. Zur Antigendemaskierung werden die Gewebeschnitte für die hMLH1- und hMSH2-Analyse
in eine mit EDTA Lösung gefüllte Küvette überführt und in der Mikrowelle bei 250
W für 30 Minuten gekocht. Schnitte, die einer hMSH6- und hPMS2-Analyse
unterzogen werden, werden in eine Küvette mit Citratpuffer überführt und im
Autoklaven bei 120° C für 20 Minuten hitzebehandelt. Danach werden die
Küvetten der Mikrowelle bzw. dem Autoklaven entnommen und für 30 Minuten
bei Raumtemperatur abgekühlt.
Es folgte das Abspülen der Objektträger mit Aqua dest. Für die Blockierung
endogener Peroxidasen werden die Objektträger für 20 Minuten bei Raumtemperatur einem 0,3%igen H2O2-Methanol-Bad unterzogen, danach mit Aqua
dest. gespült und anschließend für 5 Minuten in PBS/Tween überführt.
2.2.3.5 Färbevorgang
Die Färbetechnik erfolgte mit Hilfe des Tecan-Immunostainers Genesis RSP 200
unter Verwendung der EnVision+-Methode (Fa. DAKO) nach Herstellerangaben.
Die Schnitte wurden zweimal mit PBS/Tween für 7 Minuten gespült und mit dem
Primärantikörper (hMLH1-, hMSH2-, hMSH6- oder hPMS2-Antikörper;
Verdünnung siehe Tab.3) für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Inkubation wurde mit 100 µl/Objektträger PBS/Tween gestoppt. Danach wurden
die Schnitte mit 1400 µl PBS/Tween für 7 Minuten gewaschen und anschließend
für 30 Minuten mit 120 µl anti-mouse EnVision HRP (Fa. DAKO) inkubiert. Nach
Ablauf der Inkubationszeit wurde der Vorgang mit 100 µl PBS/Tween gestoppt.
Es folgte ein 7 minütiges Spülen der Objektträger mit 1400 µl PBS/Tween.
Hiernach wurden die Schnitte für 10 Minuten mit 120 µl DAB-Chromogen (1:50
Verdünnung in Substratpuffer (Fa. DAKO)) inkubiert.
Die DAB-Inkubation wurde mit 100 µl PBS/Tween gestoppt und die Objektträger
wurden mit 1400 µl PBS/Tween für 7 Minuten gespült. Anschließend wurden die
Objektträger dreimal in einem Abstand von zwei Stunden mit PBS/Tween
gespült. Am Ende schloss sich das Spülen der Objektträger mit Aqua dest. an.
Die Objektträger wurden zur Gegenfärbung für 10 Sekunden in Harris
Hämatoxylin (Fa. Merck) überführt, 5 Minuten in warmem Wasser gebläut und
abschließend mit Pertex (Fa. Medite) eingedeckt.
Antikörper
Verdünnung Klon
Firma
hMLH1
hMSH2
hMSH6/GTBP
hPMS2
1 : 100
1 : 50
1 : 50
1 : 25
BD PharMingen
Calbiochem
Becton-Dickinson
BD PharMingen
Clon G 168-15
AB-2
44
A16-4
KatalogNummer
551091
NA 27
610919
556415
Tab. 3: Für die immunhistochemische Darstellung verwendete Antikörper, deren Verdünnung und
Herstellernachweis.
2.2.3.6 Auswertungskriterien
Die mikroskopische Kontrolle soll bei positiver Färbung eine Kernfärbung zeigen,
da sich die DNA-Mismatch-Repair-Proteine im Kern nachweisen lassen. Dies ist
gleichbedeutend mit einer regelrechten Antiköperbindung an das entsprechende
Protein und einer ungestörten Proteinexpression im Zellkern. Bewertet wurden
die Kerne der Basalzellen in den Krypten der Normalmucosa bzw. des Stromas
und der Entzündungszellen. Zeigte sich im Bereich des Tumors bzw. Adenoms
eine Kernfärbung von weniger als 10%, dann wurde dies als eine fehlende
Proteinexpression gewertet. Eine inkomplette Kernfärbung von 10-50% oder nur
eine partielle Färbung wurde als positiv gewertet. Zur Positivkontolle wurde das
angrenzende Normalgewebe oder der zusätzlich angefertigte Gewebeschnitt des
Normalgewebes herangezogen.
Abb. 1 Beispiel für eine negative Anfärbung (MLH1 negatives Karzinom)
Abb. 2 Beispiel für eine positive Anfärbung (MLH1 positives Adenom desselben Patienten)
Darstellung einer immunhistochemischen Färbung von Tumorgewebe und
Normalgewebe eines HNPCC Patienten. Im Tumorgewebe ist keine Anfärbung
der Kernregion durch den verwendeten Antikörper gegen MLH1 darzustellen, im
Normalgewebe färben sich die Kernregionen braun an.
Kapitel 3 Ergebnisse
3.1 Allgemeine Daten
Die vorliegenden Daten entstammen dem Patientenkollektiv der Verbundstudie
der Deutschen Krebshilfe der Pathologie Kassel in den Jahren 01/1998 bis
08/2003. Insgesamt wurden für die hier vorliegende Arbeit bei 122 Patienten
Karzinome auf MSI und Expression der MMR Gene untersucht, die auf Grund
der Lokalisation und Voranamnese für ein HNPCC-Syndrom verdächtig waren.
Bei 40 dieser Patienten waren neben dem Karzinomgewebe ein oder mehrere
Adenome verfügbar. Diese Patienten und die entsprechenden Adenome wurden
in die weiteren Untersuchungen aufgenommen (40/122 = 32,78%).
Bei genauer Anamnese-Erhebung erfüllten von diesen 40 Patienten 36 (36/40 =
90%) die Bethesda Kriterien, so daß diese 15 Frauen und 21 Männer in die
Studie aufgenommen wurden (w:m = 1:1,4). Das mittlere Alter dieser Patienten
bei der Erstuntersuchung betrug 46 (24-78) Jahre.
Abb. 1 Untersuchungsgut. a.) Pat., die die Kriterien erfüllten b.) Geschlechterverteilung
Pat.
Amst/Beth.
42%
Pat.Amst
58%
Pat insg.
-20
30
80
130
3.2 Adenomhäufigkeit
Von 22 Patienten lag im Untersuchungszeitraum von 5,5 Jahren ein Adenom vor,
bei 14 Patienten waren in diesem Zeitabschnitt mehrere Adenome aufgetreten
(1:1,57).
Insgesamt gab es 38 multiple Adenome, von denen 22 synchron und 16
metachron auftraten (1,375 : 1).
Bei 28 Patienten wurden die Adenome zeitgleich mit dem Karzinom entfernt, bei
fünf (17,8%) wurde erst das Karzinom diagnostiziert und dann im weiteren
Krankheitsverlauf neu auftretende Adenome entfernt. Lediglich drei Patienten
(10,7%) fielen zuerst durch ein Adenom auf und hatten im späteren Verlauf ein
Karzinom.
Männer
Frauen
Abb. 3 zeitlicher Zusammenhang Adenom/Karzinom
14%
8%
synchron
78%
erst Adenom
erst Carzinom
3.3 Histologie der Adenome
Von den 71 untersuchten Adenomen waren die überwiegende Mehrzahl tubulär
(45/71 = 63,38%). Gefolgt wurde diese Gruppe von den tubulo-villösen
Adenomen (15/71 = 21,12%) und einer Gruppe von Adenomen (10/71 =
14,08%), deren Wachstumsform nicht sicher näher bestimmt werden konnte, da
nicht genügend Material zur Verfügung stand.
Zusätzlich fanden wir ein Adenoma serratum. (1/71 = 1,4%)
1,40%
14,08%
21,12%
63,36%
t AD
t-v AD
AD
AD serratum
Abb. 4 Histologischer Adenomtyp
3.4 Mikrosatellitenstatus der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen
Von den 44 untersuchten tubulären Adenomen wurde bei 18 Proben der
Mikrosatellitenstatus bestimmt. Es fand sich kein MSI - L Adenom.
Die Mehrzahl der tubulären Adenome waren MSI – H (12/18 = 66,6%), gefolgt
von MSS (6/18 = 33,3%), wobei alle tubulären Adenome am Rande eines
Karzinoms jeweils wie das Karzinom MSI – H waren.
Dagegen traten MSS Adenome jeweils getrennt vom Karzinom auf, dies 1x
synchron und 5x metachron zum jeweils instabilen Karzinom.
12
10
8
MSI - H
6
MSS
4
2
0
Abb. 5 Mikrosatellitenstatus der Adenome
Bei den tubulo-villösen Adenomen fanden sich in der überwiegenden Mehrzahl
MSI - H Adenome, somit dem MSI Status der Karzinome entsprechend (13/15 =
86,6%), ein Adenom war MSI - L und ein Adenom MSS. Interessant ist hier, daß
der Mikrosatellitenstatus der übereinstimmenden Adenome immer mit dem der
Karzinome übereinstimmte, obwohl sogar ein Karzinom nicht im Darm sondern
im Uterus (Endometriumarzinom) gefunden wurde.
Bei der drittgrößten Gruppe, den nicht näher klassifizierten Adenomen, waren 6
MSI – H (75%) und 2 MSI – L.
Das Adenoma serratum war MSI – L bei MSI – H Karzinom.
Somit waren nur in 73,8% (31/42) der bei gesichertem HNPCC aufgetretenen
Adenome MSI-H, während die ebenfalls aufgetretenen Karzinome jeweils den
MSI-H Phänotyp aufwiesen.
13%
13%
74%
MSI - H
MSI - L
MSS
Abb. 6 Verteilung der Mikrosatellitenstabilität bei den Adenomen
25%
75%
s ynchron
m e tachron
Abb. 7 Zeitlicher Zusammenhang Adenome und Karzinom
40
35
30
25
20
15
10
5
0
M SI- H
M SI- L
M SS
s ynchron
m e tachron
Abb. 8 Zusammenhang zwischen MS – Status und zeitlichem Auftreten
3.5 MMR Proteinexpression der Adenome
Insgesamt wurden 51 Adenome immunhistochemisch auf Expression der MMR
Gene MSH2, MSH6, MLH1 und PMS2 hin untersucht. Darunter waren 40
hochinstabile Adenome, 1 leicht instabiles Adenom und 10 mikrosatellitenstabile
Adenome.
Bei den MSI-H Adenomen hatten 20 einen Ausfall im MSH2/6 System (50%), 11
einen Ausfall im MLH1/PMS2 System (27,5%) und 9 (22,5%) waren in keiner
Expression negativ.
Das MSI-L Adenom war im MLH1/PMS2 System negativ.
Den Bezug der immunhistiochemischen Befunde zum MSI Status verdeutlicht
Abb. 9.
25
20
20
15
MSH2/6 neg.
10
11
5
9
1
2
1
7
kein Ausfall
0
MSI-H
MSI-L
MLH1/PMS2
neg.
MSS
Abb. 9 MMR Proteinexpression und MSI Status
3.6 Immunhistochemie der Adenome im Vergleich zu den Karzinomen
Bei der größten Gruppe den tubulären Adenomen zeigten 12/23 Adenome einen
Expressionsausfall mindestens eines Repairgens (12/23= 52,2%). Die Hälfte der
Fälle zeigten einen Ausfall von MSH2 und MSH6 (6/12 = 50%). In 4 Fällen waren
auch die Karzinome derselben Patienten MSH2 und MSH6 negativ (Kongruenz
67%), bei den zwei übrigen Karzinomen war nur MSH2 komplett negativ (33%).
Insgesamt ergibt sich für die Gruppe der MSH2 und MSH6 negativen Adenome,
ein entsprechender Befund bei den Karzinomen, die entweder nur einen MSH2
oder auch einen MSH6 Ausfall aufwiesen.
14
12
12
10
MSH 2/6
negativ
9
8
MLH 1neg
6
4
3
positiv
2
0
Abb. 10 IHC Status der Adenome
In der Gruppe der MLH1 negativen tubulären Adenome (4/13 = 30%) waren auch
alle Karzinome MLH1 negativ (100% Kongruenz).
Elf tubuläre Adenome (47,8%) waren in allen untersuchten Expressionen positiv.
Bei den tubulo-villösen Adenomen war die Mehrzahl der Adenome MSH2 negativ
(3/5 = 60%), die Karzinome waren hier MSH6 (2/3 = 67%) und MSH2 negativ
(33%), also eine direkte Kongruenz von 33%.
Ein tubulo-villöses Adenom war MSH6 negativ das entsprechende Karzinom war
ebenfalls MSH6 negativ.
Insgesamt bestätigte sich auch hier wieder die Beobachtung, daß bei MSH2 und
MSH6 negativen Adenomen die Karzinome auch entweder MSH2 oder MSH6
negativ sind, bei einer direkten Kongruenz von 50%.
Zwei tubulo-villöse Adenom waren MLH1 negativ, hier war auch das
entsprechende Karzinom jeweils MLH1 negativ.
Bei den Adenomen, die aufgrund von ungenügendem Material nicht näher
bestimmt werden konnten, waren 4 MLH1 negativ, 2 MSH2 negativ und 2 MSH2
und MSH6 negativ. Alle Karzinome entsprachen direkt den Adenomen (100%
Kongruenz).
Das Adenoma serratum war durchweg positiv, bei einem MLH1 negativen
Karzinom.
In der Gruppe der Adenome ergibt sich also eine direkte immunhistochemische
Kongruenz von insgesamt 14/19 (73,7%), zählt man die Gruppe MSH2 und
MSH6 zusammen sowie MLH1 ergibt sich ein Kongruenz von 100% (19/19). Bei
einem MSH 2+6 /MLH1 Verhältnis von 13/6 = 2,16/1).
Abb. 11 Immunhistochemische Kongruenz Adenom/Karzinom
14
12
10
8
26%
74%
MSH
6
MLH
4
2
0
Anzahlkongruent
nicht kongruent
Abb. 12 Anzahl der MSH2/6 neg. bzw. MLH1 neg. Adenome
MSH
Entspr.
Kongruen
2/6
Karzinom z in %
negativ negativ
Tubuläre 6
Adenome
Tubulo
4
villöse
Adenome
Adenoma
serratum
MLH1 Entspr.
Kongruen
negativ Karzinom z in %
negativ
6
100
4
4
100
4
100
2
2
100
Pos.
Adenome
bei neg.
Karzinomen
11
1
Tabelle 1 Zusammenhang MSH /MLH Status der Adenome und der entsprechenden Karzinome
(MSH 2 und MSH6 wurden zu einer Gruppe zusammengefasst).
Wie man aus Tabelle 1 deutlich erkennen kann, ist der Zusammenhang
zwischen Adenomen und Karzinomen deutlich zu sehen. Jedoch sind immer
wieder einzelne Adenome vorhanden, die immunhistochemisch keinen Bezug
zum Karzinom zu haben scheinen.
3.7 Lokalisation der Adenome
Von den tubulären Adenomen waren 11 vor der rechten Kolonflexur (11/31 =
35,5%), 8 im Kolon transversum (8/31 = 25,8%) und 12 nach der linken
Kolonflexur (12/31 = 38,7%) lokalisiert. Bei 13 tubulären Adenomen war die
genaue Lokalisation nachträglich nicht mehr eruierbar.
Bei den tubulo-villösen Adenomen waren 3 Adenome vor der rechten Kolonflexur
(3/10 = 30%) und 7 Adenome nach der linken Kolonflexur. Zwei tubulo-villöse
Adenome konnten keiner genauen Lokalisation zugeordnet werden.
In der Gruppe der durch Materialmangel nicht als tubulär oder villös näher
bestimmbaren Adenome war die Mehrzahl nach der linken Kolonflexur (4/6 =
66,7%)lokalisiert. Vor und nach der rechten Kolonflexur befand sich jeweils ein
Adenom und bei einem weiteren Adenom konnte die Lokalisation nicht mehr
nachvollzogen werden.
12
10
8
6
4
2
0
t AD
vor re Kolonflexur
AD
vor li Kolonflexur
tv AD
nach li Kolonflexur
nicht bestimmt
Abb. 13 Lokalisation der Adenome bezogen auf die Histologie
Bei den synchronen Adenomen (unabhängig von der Histologie) waren 15
Adenome (15/44 = 34,1%) vor der rechten Kolonflexur, 7 (7/44 = 15,9%) im
Kolon transversum und 22 (22/44 = 50%) hinter der linken Kolonflexur lokalisiert.
Sieben Adenome konnten nachträglich nicht mehr einer genauen Lokalisation
zugeordnet werden.
Bei den metachronen Adenomen war kein Adenom vor der rechten Kolonflexur,
zwei nach der rechten Kolonflexur (2/7 = 28,6%) und fünf nach der linken
Kolonflexur (5/7 = 71,4%). Acht der metachronen Adenome konnten auch hier
wieder nicht zugeordnet werden.
25
20
15
10
5
0
s ynchron
vor re Kolonflexur
m etachron
vor li Kolonflexur
nach li Kolonflexur
nicht zugeodnet
Abb. 14 Lokalisation der Adenome bezogen auf den zeitlichen Zusammenhang
Bei den MSI-H Adenomen waren 11(11/26 = 42,3%) vor der rechten Kolonflexur,
3 (3/26 = 8,7%) nach der rechten Kolonflexur und 12 (12/26 = 46,2%) nach der
linken Kolonflexur. 12 MSI – H Adenome konnten nicht mehr zugeordnet werden.
42%
46%
vor re Kolonflexur
12%
vor li Kolonflexur
nach li Kolonflexur
Abb. 15 Lokalisation der Adenome bezogen auf die Immunhistochemie
Bei den MSS Adenomen waren 2 vor der rechten Kolonflexur (2/8 = 25%), 1 vor
der linken Kolonflexur ( 1/8 = 12,5%) und 5 nach der linken Kolonflexur (5/8 =
62,5%). Zwei der MSS Adenome konnten nicht mehr zugeordnet werden.
Abb. 16 Lokalisation der Mikrosatellitenstabilen Adenome
25%
62%
13%
vor re Kolonflexur
vor li Kolonflexur
nach li Kolonflexur
Von den im Mikrosatellitenstatus nicht bekannten Adenome waren vor der
rechten Kolonflexur 4 (4/19 = 21%), vor der linken Kolonflexur 4 (4/19 = 21%)
Abb. 17 Lokalisation der histologisch nicht bestimmten Adenome
21%
58%
21%
vor re Kolonflexur
vor li Kolonflexur
nach li Kolonflexur
Adenome und nach der linken Kolonflexur waren 11 (11/19 = 28,9%) Adenome.
3 Adenome konnten auch hier nicht weiter zugeordnet werden.
3.8 Zeitliche Zusammenhänge
In der Gruppe der tubulären Adenome waren die meisten synchron zum
Karzinom (33 /43 = 76,7%), 23,2% (10/43) waren metachron.
Bei den tubulo - villösen Adenomen waren 12 synchron (12/15 = 80%) und 3
metachron (3/15 = 20%).
Bei den aufgrund von Materialmangel nicht näher bestimmten Adenomen (10/10
= 100%) entwickelten sich alle synchron mit dem Karzinom.
Das Adenoma serratum war metachron.
Die hoch mikrosatelliteninstabilen Adenome erwiesen sich als überwiegend
synchron (30/36 = 83,3%), 6 dieser Adenome entstanden metachron (6/36 =
16,6%). Das leicht mikrosatelliteninstabile Adenom stellte sich als synchron dar.
Von den mikrosatellitenstabilen Adenomen entwickelten sich 8 synchron (8/10 =
80%), zwei metachron (2/10 = 20%).
Von den MSH 2 negativen Adenomen traten 7 synchron (7/12 = 58,3%) und 5
metachron (5/12 = 41,7%) auf. Von den MSH6 negativen Adenomen kamen alle
3 synchron vor.
Von den MSH2 und 6 negativen Adenomen stellten sich 5 synchron (5/6 =
83,3%) und 1 metachron (1/6 = 16,7%) dar. Insgesamt enthielt diese Gruppe 15
(15/21 = 71,4%) synchron und 6 (6/21 = 28,6%) metachron entstandene
Adenome.
Von den MLH1 negativen Adenomen traten alle 13 synchron auf.
Von den in allen untersuchten Expressionen positiven Adenomen entwickelten
sich 13 synchron (13/17 = 76,5%) und 4 metachron (4/17 = 23,5%).
3.9 Lokalisation Adenome zu ihren Karzinomen
12 Adenome wurden im Karzinom lokalisiert. In einem Abstand bis zu 5 cm vom
Karzinom entfernt waren 28 Adenome. Mehr als 5 cm vom Karzinom entfernt,
fanden wir 31 Adenome.
Metachron aufgetretene Adenome fanden sich nur in der Gruppe der mehr als 5
cm entfernt vom Karzinom aufgetretenen Adenome (12/31 = 38,7%).
Alle Adenom in Karzinom aufgetretenen Adenome waren zu 100% kongruent in
ihrem Mikrosatellitenstatus zum Karzinom.
In der Gruppe der bis zu 5 cm entfernten Adenome boten die meisten denselben
Mikrosatellitenstatus wie die Karzinome (25/28 = 89,3%), jedoch gab es hier
auch drei mikrosatellitenstabile Adenome (3/28 = 10,7%).
In der Gruppe der mehr als 5 cm entfernten Adenome waren 24/31 = 77,4%
kongruent zum Karzinom, allerdings gab es auch hier insgesamt sieben
mikrosatellitenstabile Adenome (7/31 = 22,5%).
In der MMR-Expression waren sowohl in der Adenom in Karzinom Gruppe, als
auch in der Gruppe der Adenome weniger als 5 cm entfernt vom Karzinom alle
Adenome dem Karzinom analog. In der Gruppe der mehr als 5 cm entfernten
Adenome war die Mehrzahl der Adenome ebenfalls kongruent zu ihrem
jeweiligen Karzinom (18/31 = 58,1%), jedoch gab es hier auch deutliche
Unterschiede zum Karzinom (13/31 = 41,9%). Diese Adenome entsprachen in
ihrer Expression dem „gesunden“ Normalgewebe.
Kapitel 4 Diskussion
4.1 Allgemeine Daten
Die im Kolon und Rektum lokalisierten Karzinome bilden die größte Gruppe der
gastrointestinalen Tumore. Davon sind etwa 10% genetisch fixiert, wobei die vom
Typ des hereditären nicht mit Polyposis assoziierten Kolonkarzinoms (HNPCC)
die derzeit größte Gruppe genetisch verankerter vererbbarer Kolonkarzinome
darstellen.
4.2 Mutationsanalysen
Das HNPCC Syndrom wird durch Mutationen im Mismatchrepair (MMR-) System
verursacht, so daß die betroffenen Patienten früher und häufiger an Karzinomen
erkranken als Patienten ohne diese Mutation. Dies zeigte auch die
Altersverteilung in unserer Studie: das mittlere Alter bei Erstmanifestation der
Erkrankung betrug 46 Jahre, der jüngste Patient war 24 Jahre, der älteste 78
Jahre. In den meisten Fällen ist eine Mutation in den Genen MLH1 oder MSH2
beschrieben. Diese Mutation ist bereits durch das Genom der Patienten fixiert,
durch ein molekulargenetisches Screening müsste man also bis zu 90% der
Patienten identifizieren können. 10% der Patienten haben eine Mutation in
anderen Genen, z.B. PMS2 oder MSH6. Wie Zilinski et al (2002) jedoch zeigen
konnten, ist ein Mutationsscreening zur Detektion insbsondere von noch nicht
erkrankten Mutationsträgern aufgrund unterschiedlicher Schwierigkeiten (noch)
nicht zu empfehlen:
Derzeitig liegt die Nachweisrate von Keimbahnmutationen bei klinisch oder auch
durch Nachweis von MSI und MMR Proteinausfall definierten HNPCC Patienten
nur bei etwa 60%. Eine Ursache dafür scheint zu sein, daß verschiedene Genloci
von der Mutation betroffen sein können. Bisher wurden allein 120 verschiedene
Keimbahnmutationen beschrieben, den größten Teil stellen dabei die Mutation in
den MSH2- und MLH1-Genen (Hahn und Schmiegel 1995). In den bislang
durchgeführten Untersuchungen zu diesen beiden Genen, konnten keine
bevorzugten Loci, sog. hot spots, für eine Mutation ausgemacht werden. Daher
müssen jeweils die gesamten Gene mit einer Länge von entweder 2,5Kb für das
MSH2 Gen oder 2,7Kb für das MLH1 Gen sequenziert werden.
Durch ein molekulargentisches Mutationsscreening ist es somit bisher weder
möglich HNPCC Patienten eindeutig zu identifizieren noch sie definitiv
auszuschließen.
4.3 Tumorentstehung unter dem Einfluss der MMR - Gene
Die Tumorentstehung wird durch verschiedene Gene begünstigt. Am besten
untersucht sind die zuerst entdeckten Onkogene. Sie liegen als Protoonkogene
in der Zelle vor und sind bei Aktivierung für das unkontrollierte Wachstum der
Zelle verantwortlich.
Die als nächste für die Tumorentstehung verantwortlich entdeckte Gruppe von
Genen sind die Tumorsupressorgene, die bei normaler Funktion die
Zellproliferattion unterdrücken. Bei einem Ausfall dieser Gene teilt sich die Zelle
unkontrolliert.
Anhand von Untersuchungen von HNPCC-Patienten fand sich eine dritte Gruppe
von Genen, die für eine Tumorentstehung verantwortlich sein können, die MMRGene. Parson et al (1993) konnten zeigen, daß Patienten einen Ausfall in diesen
Genen auf einem Allel haben. Auch hier reicht jedoch der vererbte Ausfall eines
Genes nicht aus, um ein Karzinom entstehen zu lassen. Es muß zu einer
erworbenen Veränderung des anderen Allels kommen, analog zu der Hypothese
von Knudson ("two hit Hypothese") (Knudson AG (1971)).
Die MMR Gene haben einen Einfluß auf verschiedene Enzyme, z.B. den TGFbeta-II-Rezeptor.
Wie bei Lynch et al. (1999) und Vasen et al.(1999) beschrieben, ist HNPCC die
häufigste autosomal dominant vererbte Störung. Auch die in unserer Studie
gefundene nahezu gleiche Verteilung Männer zu Frauen (1:1,4) spricht für eine
autosomal vererbte Störung.
4.4 Adenome und HNPCC
Bisherige Untersuchungen zu HNPCC richten sich vor allem auf die
Karzinogenese und somit auf die Untersuchung der Karzinome. Erst in letzter
Zeit finden zunehmend auch die Adenome Beachtung. Wie beim sporadischen
Karzinom sind auch beim HNPCC auftretende Adenome Vorläufer der sich
daraus entwickelnden Karzinome. Daher wird HNPCC Patienten auch ein enger
Vorsorgeplan mit regelmäßig stattfindenden Koloskopien zur frühzeitigen
Entdeckung und Entfernung der Adenome angeraten. Hiermit erhofft man sich
ein Ausbrechen der Tumorart frühzeitig verhindern zu können.
Ein weiterer Vorteil der frühzeitigen Diagnose einer HNPCC – Erkrankung vor
Auftreten des Tumors ist die Möglichkeit einer primären Prävention. Wie Arbeiten
von Jarvinen et al gezeigt haben kann so die Entstehung von Karzinomen beim
HNPCC – Syndrom bis zu 62% gesenkt werden (Jarvinen et al, 2000). Zusätzlich
konnten Bliss et al. zeigen, daß diese Untersuchungsmethode im frühzeitigen
Krankheitsverlauf nicht nur positiv für den Krankheitsverlauf, sondern auch
kosteneffektiv ist (Bliss et al., 2004)
4.5 Immunhistochemische Untersuchungen des Mikrosatellitenstatus
4.5.1 Aufbau von Mikrosatelliten
Mikrosatelliten sind kurze sich wiederholende Sequenzen, vorwiegend der Basen
Adenosin und Tyrosin. Diese Basen sind in kurzen Gruppen von drei bis fünf
Basen angeordnet. Ihre Funktion ist bisher noch nicht geklärt, beim HNPCC
Syndrom scheinen sie eine wichtige Rolle bei der Genomstabilisierung zu
spielen.
Akiyama et al konnten in 57% der untersuchten Adenome bei HNPCC-Patienten
eine Veränderung des Poly-A-Repeats zeigen (Akiyama et al 1996).
4.5.2 Mikrosatelliten(in)stabilität bei HNPCC-Patienten
HNPCC Karzinome können sowohl immunhistochemisch auf Expression der
MMR Proteine MSH2, MSH6, MLH1 und PMS2 als auch auf
Mikrosatellitenstabilität hin untersucht werden. Die alleinige Bestimmung der
Immunhistochemie schließt die Tumore aus der Erfassung aus, die einen
Aktivitätsverlust, jedoch kein Expressionsverlust haben. Dies führte zu den
allgemeinen Empfehlungen, bei hochgradig HNPCC verdächtigen Patienten bei
Erkrankungsverdacht und/oder immunhistochemisch festgestelltem Ausfall einer
Komponente des MMR Systems den Mikrosatellitenstatus zu bestimmen.
Folgerichtig wurde bei den uns zugänglichen Patienten zusätzlich im Rahmen
des molekulargenetischen Screenings der Mikrosatelliten-Status bestimmt. Eine
hohe Mikrosatelliteninstabilität wurde dabei durch einen Ausfall von mindestens
zwei der untersuchten Sequenzabschnitte definiert. Untersucht wurden
insgesamt fünf Sequenzabschnitte, welche als Referenzpanel vom National
Cancer Institute empfohlen wurden (Dietmaier Cancer Res; Umar JNCI 2004).
HNPCC-Erkrankte haben in bis zu 90% einen Störung im Mikrosatelliten-System,
im Umkehrschluß heißt das jedoch auch, das 10% der HNPCC-Erkrankten einen
unauffälligen Mikrosatelliten-Status an den untersuchten Loci haben (Aaltonen et
al 1994). Im Gegensatz dazu haben Patienten mit sporadischen Karzinomen nur
in 15% eine Mikrosatelliteninstabilität (Peltomäki et al 1993).
In der anfänglichen Bestimmung von Mikrosatelliteninstabilitäten gab es große
Unterschiede in der Inzidenz, was sich durch einen Uneingikeit in der Anzahl der
analysierten Mikrosatellitenmarker, der unterschiedlichen Repeattypen und der
Uneinigkeit, ab welcher Anzahl von positiven Markern ein Tumor als instabil
zuwerten war, erklärte. Diese Uneinigkeiten führten 1998 zu den allgemein
gültigen Kriterien, die auch in unserer Studie berücksichtigt wurden (Boland et al
1998).
4.6 Grundlage jeder HNPCC – Diagnostik: Die Anamnese
Der Beginn jeder Diagnosestellung eines HNPCC-Syndroms ist jedoch neben
dem molekulargenetischen Screening die genaue Anamneseerhebung, die
spätestens bei der Verdachtsdiagnose nachgeholt werden muß, da die typische
klinische Symptomatik, wie z.B. die Polyposis oder
Augenhintergrundveränderung bei der FAP, fehlt, noch das es typische
Laborbefunde wie z.B. das erhöhte PSA (prostataspezifisches Antigen) beim
Prostatakarzinom gibt. Der entscheidende Nachteil der bisherigen
Diagnosestellung ist, daß zur Diagnose bereits ein Tumor vorliegen muß. Daher
wurde, auch in der Klinik, in letzter Zeit immer mehr Augenmerk auf die
präkanzerösen Adenome gelegt. Das, soweit es in das allgemeine Screening
Einzug halten sollte, hat eine wichtige Folge: Die Diagnose HNPCC kann bei
durch die Familienanamnese vorbelasteten Patienten früher gestellt werden und
mögliche Karzinomentstehung gegebenenfalls verhindert werden. Die
Voraussetzung für alle Screening – Überlegungen ist aber, dass immer alle
Adenome bei HNPCC – Patienten den genetischen Defekt aufweisen.
4.7 Ziele der Arbeit
Die hier vorliegende Arbeit widmet sich insbesondere der genauen Beschreibung
der Adenome im zeitlichen, histologischen und genetischen Zusammenhang
unter verstärktem Augenmerk auf die klinische Relevanz und die möglichen
praktischen Konsequenzen.
Um eine wirkungsvolle Prävention zu erreichen muß der Patient einen
Arztkontakt vor Auftreten der Krankheit (in diesem Fall vor Karzinomentstehung)
haben.
4.8 Zeitliche Zusammenhänge zwischen Adenomen und Karzinomen
In unseren Daten sind zumeist die Adenome zeitgleich mit dem Karzinom
entfernt worden (78%). In 14% der Fälle wurde zuerst das Karzinom entfernt
und erst im weiteren Krankheitsverlauf die Adenome diagnostiziert. Insgesamt
ergibt dies eine Patientengruppe von immerhin 92%. Diese Patienten hatten
keine Möglichkeit einer früheren Diagnosestellung über die Untersuchung ihrer
bereits bestehenden Adenome.
Lediglich bei 8% der Patienten wurde zuerst eine Adenomentfernung vor
Diagnose der Karzinomerkrankung durchgeführt. Diese Patienten haben eine
effektive Vorsorge erfahren. Für die zukünftige Versorgung der HNPCCPatienten wäre es wünschenswert, wenn noch mehr HNPCC vorbelastete
Patienten in die engmaschige Vorsorge einbezogen werden könnten.
4.9 Mikrosatellitenstabilität in Adenomen und Karzinomen
Bei der Bestimmung der Mikrosatellitenstabilität ergaben sich teilweise große
Ähnlichkeiten zwischen Adenomen und Karzinomen der jeweiligen Patienten. Die
Mehrzahl der Adenome entsprach in der Mikrosatellitenstabilität den
Karzinomen. Jedoch waren auch hier komplett mikrosatellitenstabile Adenome
zu finden.
Dies ist umso mehr von Bedeutung, als dass bisher eine
Mikrosatelliteninstabilität als Kriterium für eine HNPCC-Diagnose unumgänglich
war, wie auch Untersuchungen von Rüschoff et al. (1995), Boland et al. (1998),
Lamberti et al und Loukola et al zeigen konnten (Rüschoff et al, 1995, Boland et
al,1998, Lamberti et al, 1994, Loukola et al, 2001). Dem schließt sich auch die
Untersuchung Iino et al und Peroni et al an, die die Hypothese vertreten, daß
MSI eine frühe Stufe der Karzinogenese in HNPCC ist (IIno et al, 2000, Pedroni
et al, 2001).
Wie bisher dargestellt wurde, sind die Adenome bei HNPCC zuerst mikrosatelliteninstabil und dann genetisch verändert. Daher ist es wahrscheinlich, daß
wir "echte" sporadische Adenome erfaßt haben und nicht, wie es ebenfalls
möglich wäre, Adenome vor dem second hit.
Nicht unerwähnt soll in diesem Zusammenhang bleiben, daß in beiden Gruppen
die Adenome sowohl zeitgleich mit dem Karzinom (synchron), als auch
unabhängig von der Karzinomentfernung (metachron) aufgetreten waren.
4.10 Immunhistochemische Zusammenhänge zwischen Adenomen und
Karzinomen
Die meisten der entfernten Adenome, gleich welcher genauen histologischen
Kategorisierung, entsprachen in ihrer immunhistochemischen Färbung den
Karzinomen entweder genau oder wiesen Ausfälle im entsprechenden
Gegenpartner der Reparaturgene (MSH2/MSH6, PMS2/MLH1) auf. Die
Karzinome sind in unserer Studie durchweg MSI-H gewesen, was den Daten von
Peltomäki et al. (Peltomäki, 2001) entspricht, in deren Untersuchung 90% der
HNPCC-Karzinome MSI-H waren, wohingegen dies nur bei 15 % der
sporadischen Karzinome der Fall war.
In den immunhistochemischen Färbungen ergaben sich zwei Konstellationen von
Enzymausfällen. In dem einen Fall war der Komplex MSH2 / MSH6 ganz oder
teilweise betroffen, der andere Teil wurde von dem Paar MLH1 und PMS2
gestellt. So war in der immunhistochemischen Färbung immer festzustellen, daß
bei Adenomen mit einem Ausfall in der MSH2 und/oder MSH6 Expression auch
die Karzinome entsprechende Defizite vorwiesen. Analog dazu hatten die MLH1
defizitären Adenome auch MLH1 negative Karzinome. Interessanterweise hatten
wir in der uns zugänglichen Patientengruppe kein Adenom, welches alleinig
einen Ausfall in der Expression von PMS2 gezeigt hat.
Besondere Aufmerksamkeit soll hier auf den Punkt gelenkt werden, daß es in
allen Subklassen der Adenome Adenome mit positiver MMR Genexpression gab.
Dies hat große Konsequenzen für den möglichen Ausschluß für Patienten aus
Vorsorgeprogrammen, bei nachgewiesenen positiven Adenomen und somit
falsch negativer HNPCC - Ausschlußdiagnose.
4.11 Lokalisationen von Adenomen und Karzinomen
Die klassische Lokalisation für das HNPCC – Karzinom ist das Kolon und das
Rektum. In der Mehrzahl der Fälle waren sie nach der linken Flexur lokalisiert,
also im Kolon descendes, Sigma oder Rektum. An dieser anatomischen
Lokalisation ist auch eine sporadische Adenomentstehung am
wahrscheinlichsten.
Nicht unerwähnt bleiben darf die zweithäufigste Lokalisation, das Endometrium.
Im Gegensatz zum Kolon ist die Möglichkeit der Früherkennung durch Adenome
hier jedoch deutlich schlechter. Eine Nichtbeachtung dieser Lokalisation hätte
aber eine deutliche Unterdiagnostik der Erkrankung zur Folge.
Ebenso diskutiert werden müssen die anderen möglichen Lokalisationen, wie
z.B. Karzinome des Urogenitaltraktes, des Dünndarms oder des Ovars, die in
deutlich kleinerer Fallzahl vorliegen, jedoch unzweifelhaft mit zum HNPCC
Syndrom gezählt werden müssen (Jarvinen et al 1995, Menko et al 1993,
Toribara und Schleisinger 1995). So fanden sich bei Untersuchungen von Vasen
et al 1990 an HNPCC Familien 104 Kolonkarzinome und 65 extrakolische
Karzinome (62,5%).
Eine früher häufig aufgetretene Lokalisation des HNPCC, das Magenkarzinom,
spielt heute nur noch eine untergeordnete Rolle. Dies scheint die Hypothese von
Knudson et al. zu bestätigen, daß zur Karzinogenese ein Mutation im zweiten
DNA – Strang eintreffen muß. Dieser "zweite Schlag" (two hit Hypothese) ist
durch Umweltfaktoren beeinflußbar und tritt demzufolge auch an den
Lokalisationen auf, die auch von sporadischen Karzinomen, oft ebenfalls mit
Umweg über ein entsprechend sporadisches Adenom, am häufigsten betroffen
sind.
Besonderes Augenmerk sollte in diesem Zusammenhang auf die Adenome, die
mehr als 5 cm entfernt vom Karzinom lokalisiert sind, gerichtet werden. Sie sind
meist jenseits der linken Flexur, alle jedoch jenseits der rechten Flexur gelegen.
Dies spricht, abgesehen von den häufigeren Unterschieden in der
Genexpression und dem MSI-Status, für eine sporadische Entstehung dieser
Adenome. Interessanterweise sind alle Patienten mit diesen Adenomen eindeutig
HNPCC-Patienten, die auch „HNPCC-typische“ Adenome haben.
Abb. 1 Vergleich zweier räumlich entfernter, synchroner Adenome desselben Patienten
4.12 Zusammenfassung und Schlußfolgerungen
All diese Fakten sprechen für eine zusätzliche eigenständige Adenomentstehung
bei HNPCC- Patienten, also eine sporadische Adenomentstehung zusätzlich zur
HNPCC- assoziierten Adenomentstehung.
Da bei Patienten mit einer entsprechenden Vorgeschichte ein engeres Screening
dringend empfohlen wird, liegt in der Entfernung von sporadischen Adenomen
eine mögliche Fehlerquelle für eine falsch negative Diagnose, sollte diese als
beweisend für einen Ausschluss einer HNPCC-Erkrankung gelten.
Kapitel 5 Zusammenfassung
Das hereditäre non – polypöse Kolonkarzinom stellt unter den bösartigen
Erkrankungen des Magen – Darm – Traktes mit 2 – 5%, in einigen Studien sogar
bis zu 30%, die größte Gruppe der ererbten Tumorerkrankungen. Es scheint
sich dabei um eine polymorph vererbte Erkrankung zu handeln, deren Diagnose
trotz zahlreicher Fortschritte immer noch schwierig ist. Die große
Schwankungsbreite in der Epidemiologie ergibt sich aus der schwierigen
Diagnosestellung, die sich vor allem auf die Anamneseerhebung stützt, deren
Grundlagen von A. Warthin 1913 gelegt wurden und die heute mittels der
Amsterdam – und Bethesda – Kriterien verfeinert fortgeführt wird. Hier sind, vor
allem bei unvollständiger Anamneseerhebung, die Möglichkeiten einer falsch
negativen Diagnose recht groß, insbesondere durch die uneinheitliche
Einbeziehung der verschiedenen Tumorlokalisationen.
Die Diagnose einer HNPCC – Erkrankung wird wesentlich durch laborchemische
Methoden unterstützt. Hierbei wird besonderes Augenmerk auf Mutationen in
Mismatch – repair Genen und auf Mikrosatelliteninstabilitäten gelegt.
In bis zu 90% der Fälle ist bei einer HNPCC – Erkrankung eine Mutation in den
Mismatch repair Genen MSH2 und MLH1 zu finden, was jedoch auch bei
sporadischen Karzinomen der Fall sein kann. Daher folgt im Anschluß an die
immunhistochemische Diagnostik eine Bestimmung der Mikrosatellitenstabilität,
die als hoch instabil bei einem Ausfall von mindestens zwei der untersuchten fünf
Loci gilt.
Eine, im positiven Fall beweisende Methode der Diagnosesicherung, ist die
Durchführung eines genetischen Screenings. Da noch nicht alle Genloci sicher
bekannt sind (polymorph vererbte Erkrankung), ist diese Methode mit einem
Risiko einer falsch negativen Diagnose behaftet. Lediglich in 60% der Fälle mit
einer HNPCC Diagnose mittels Anamnese und entsprechendem MSI Status
kann eine Mutation nachgewiesen werden.
Eine sichere Diagnose einer HNPCC Erkrankung kann also nur durch eine gute
Zusammenarbeit der Kliniker mit dem Pathologen und dem entsprechend
ausgerüsteten Labor gestellt werden. Besonders wichtige Diagnosekriterien sind
dabei die Anamnese, die histologische Begutachtung und die genaue
Untersuchung der Gewebeschnitte auf Veränderungen im MMR System und im
MSI Status.
Bislang wird die Diagnose HNPCC allerdings meist nur bei bereits vorliegendem
Karzinom durch die oben erläuterte Stufendiagnostik gestellt. Ein wesentlicher
Schritt wäre die Diagnosestellung vor Manifestation des Karzinoms.
Eine Karzinomerkrankung im GI-Trakt hat den großen Vorteil über
Zwischenstufen stattzufinden, nämlich vom Normalgewebe über das Adenom zur
Endstufe dem Karzinom. So könnte mithilfe eines entsprechenden Adenoms auf
eine folgende Karzinomerkrankung geschlossen werden.
Diese Vorstufen, die Adenome, werden im Moment leider noch unzulänglich
untersucht, obwohl in ihnen der Schlüssel für die oben definierten
Problemstellungen liegen könnte und sie mittels Koloskopie relativ leicht
zugänglich sind.
In dieser Arbeit wurden Adenome und deren Mikrosatellitenstatus bei
diagnostizierten HNPCC-Patienten im zeitlichen, immunhistochemischen und
histologischen Zusammenhang betrachtet.
Es wurden nur Patienten in die Studie eingeschlossen, bei denen sicher von
einer HNPCC Erkrankung ausgegangen werden konnte.
Erwartungsgemäß entsprachen die meisten Adenome in ihrer Immunhistochemie
und dem MSI-Status, den durch die HNPCC Erkrankung erwarteten oder
gefundenen Karzinomen, unabhängig vom Ort der Entstehung und vom
zeitlichen Zusammenhang.
Jedoch wurden auch in allen Mikrosatellitenstabilitäten, immunhistochemischen,
zeitlichen und histologischen Zusammenhängen Adenome gefunden, deren
Pathologie am ehesten sporadischen Adenomen entspricht. Diese Adenome
wurden mehr als 5 cm vom Primärtumor entfernt gefunden.
Es wäre also eine mögliche Schlußfolgerung, daß sporadische Adenome
unabhängig von der genetischen Disposition, dem zeitlichen Zusammenhang
und der Histologie bei allen Patientengruppen auftreten können. Das MSI – und
IHC – Screening auf HNPCC an Adenomen ist also mit einer, den Karzinomen
um mindestens 20 Prozent höheren, falsch-negativ Rate behaftet.
Dies ist umso mehr von Bedeutung, als daß das Auftreten von sporadischen
Adenomen oft als Ausschlußkriterium für eine HNPCC Erkrankung galt. Nach
unseren Untersuchungen kann dies ein falscher Rückschluß sein, da es
durchaus möglich ist, daß auch bei HNPCC – Patienten unabhängig von der
Grunderkrankung sporadische Adenome vorliegen können.
Chapter 6 Summary
Among the malignant diseases of the gastro-intestinal (GI) tract, the hereditary
non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) builds the largest group of hereditary
tumor diseases, with percentages ranging from with 2-5% up to 30%, depending
on the study. The (HNPCC) seems to be a polymorphic inherited disease;
despite progress, diagnosis is still difficult. The large variability of prevalences in
epidemiological studies results from these diagnostic difficulties. Diagnosis is
based on the anamnesis, initially developed 1913 by A. Warthin and later refined
by the Amsterdam– and Bethesda-Criteria. Consideration of tumor localization is
not standardized, such that the probability for a false diagnosis is relatively high,
especially if anamnesis is incomplete.
Diagnosis of HNPCC is mainly supported by laboratory chemical methods, with a
special emphasis on mutations in mismatch-repair genes and instabilities of
microsatellites.
A mutation in mismatch- repair genes MSH2 and MLH1 can be found in up to
90% of all cases. Such a mutation, however, can also be observed in sporadic
carcinoma. Therefore, the immuno- histochemical diagnosis is followed by an
examination of the microsatellite stability, which is judged as highly instable if
there is a drop-out of at least two of the five examined locations.
Genetic screening is a method that proofs a diagnosis if the outcome is positive.
However, since not all gene localizations are known (polymorphic inherited
disease), this method suffers from the risk of a false negative diagnosis. Using
anamnesis and MSI status, a mutation can only be detected in 60% of all cases
with a HNPCC diagnosis. Thus, a safe diagnosis of HNPCC is only possible in
cooperation between a clinician and a pathologist with a laboratory equipped for
the required examinations. Important criteria for diagnosis are anamnesis,
histological report and a careful examination of changes in the MMR system and
the MSI status in tissue sections.
So far, diagnosis of HNPCC is typically based on the diagnostic steps described
above. An important step is the diagnosis before the manifestation of a
carcinoma.
The advantage of a carcinoma in the GI-tract is that it proceeds in several steps
from normal tissue over adenoma up to the final stage of a carcinoma.
Accordingly, an adenoma could help to predict a future carcinoma.
Adenoma might bear the key to the problems described above, and they are
relatively easy to examine using coloscopy, but at the moment they are not
adequately examined.
This study aims at examining temporal, immuno-histochemical and histological
perspectives of adenoma and their microsatellite status in patients with a HNPCC
diagnosis.
Only patients with a safe diagnosis of HNPCC were included in the study.
As expected, immuno-histochemical results and MSI status of most adenoma
corresponded well with the carcinoma detected or expected due to HNPCC. This
result was independent of source location and temporal aspects of the disease.
However, adenoma with a pathology close to sporadic adenoma were also
observed in all micro-satellite stabilities, immuno-chemical, temporal and
histological relationships. These adenoma were detected more than 5 cm away
from the primary tumor.
A possible conclusion is that sporadic adenoma can appear irrespective of
genetic disposition, temporal relationships and the histology of patient groups.
Accordingly, the false-negative rate of MSI- and ICH-screenings for HNPCC
using adenoma is at least 20% than the false-negative rate using carcinoma.
This is an important finding since so far sporadic adenoma were often used as an
exclusion criterion for HNPCC. Our study suggests that this might be a wrong
conclusion since HNPCC patients can have sporadic adenoma irrespective of the
primary disease.
Kapitel 7 Literatur und Abbildungsnachweis
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Kapitel 8 Anhang I (Gensequenzen)
8.1 MSH2
1 ggcgggaaac agcttagtgg gtgtggggtc gcgcattttc ttcaaccagg aggtgaggag
61 gtttcgacat ggcggtgcag ccgaaggaga cgctgcagtt ggagagcgcg gccgaggtcg
121 gcttcgtgcg cttctttcag ggcatgccgg agaagccgac caccacagtg cgccttttcg
181 accggggcga cttctatacg gcgcacggcg aggacgcgct gctggccgcc cgggaggtgt
241 tcaagaccca gggggtgatc aagtacatgg ggccggcagg agcaaagaat ctgcagagtg
301 ttgtgcttag taaaatgaat tttgaatctt ttgtaaaaga tcttcttctg gttcgtcagt
361 atagagttga agtttataag aatagagctg gaaataaggc atccaaggag aatgattggt
421 atttggcata taaggcttct cctggcaatc tctctcagtt tgaagacatt ctctttggta
481 acaatgatat gtcagcttcc attggtgttg tgggtgttaa aatgtccgca gttgatggcc
541 agagacaggt tggagttggg tatgtggatt ccatacagag gaaactagga ctgtgtgaat
601 tccctgataa tgatcagttc tccaatcttg aggctctcct catccagatt ggaccaaagg
661 aatgtgtttt acccggagga gagactgctg gagacatggg gaaactgaga cagataattc
721 aaagaggagg aattctgatc acagaaagaa aaaaagctga cttttccaca aaagacattt
781 atcaggacct caaccggttg ttgaaaggca aaaagggaga gcagatgaat agtgctgtat
841 tgccagaaat ggagaatcag gttgcagttt catcactgtc tgcggtaatc aagtttttag
901 aactcttatc agatgattcc aactttggac agtttgaact gactactttt gacttcagcc
961 agtatatgaa attggatatt gcagcagtca gagcccttaa cctttttcag ggttctgttg
1021 aagataccac tggctctcag tctctggctg ccttgctgaa taagtgtaaa acccctcaag
1081 gacaaagact tgttaaccag tggattaagc agcctctcat ggataagaac agaatagagg
1141 agagattgaa tttagtggaa gcttttgtag aagatgcaga attgaggcag actttacaag
1201 aagatttact tcgtcgattc ccagatctta accgacttgc caagaagttt caaagacaag
1261 cagcaaactt acaagattgt taccgactct atcagggtat aaatcaacta cctaatgtta
1321 tacaggctct ggaaaaacat gaaggaaaac accagaaatt attgttggca gtttttgtga
1381 ctcctcttac tgatcttcgt tctgacttct ccaagtttca ggaaatgata gaaacaactt
1441 tagatatgga tcaggtggaa aaccatgaat tccttgtaaa accttcattt gatcctaatc
1501 tcagtgaatt aagagaaata atgaatgact tggaaaagaa gatgcagtca acattaataa
1561 gtgcagccag agatcttggc ttggaccctg gcaaacagat taaactggat tccagtgcac
1621 agtttggata ttactttcgt gtaacctgta aggaagaaaa agtccttcgt aacaataaaa
1681 actttagtac tgtagatatc cagaagaatg gtgttaaatt taccaacagc aaattgactt
1741 ctttaaatga agagtatacc aaaaataaaa cagaatatga agaagcccag gatgccattg
1801 ttaaagaaat tgtcaatatt tcttcaggct atgtagaacc aatgcagaca ctcaatgatg
1861 tgttagctca gctagatgct gttgtcagct ttgctcacgt gtcaaatgga gcacctgttc
1921 catatgtacg accagccatt ttggagaaag gacaaggaag aattatatta aaagcatcca
1981 ggcatgcttg tgttgaagtt caagatgaaa ttgcatttat tcctaatgac gtatactttg
2041 aaaaagataa acagatgttc cacatcatta ctggccccaa tatgggaggt aaatcaacat
2101 atattcgaca aactggggtg atagtactca tggcccaaat tgggtgtttt gtgccatgtg
2161 agtcagcaga agtgtccatt gtggactgca tcttagcccg agtaggggct ggtgacagtc
2221 aattgaaagg agtctccacg ttcatggctg aaatgttgga aactgcttct atcctcaggt
2281 ctgcaaccaa agattcatta ataatcatag atgaattggg aagaggaact tctacctacg
2341 atggatttgg gttagcatgg gctatatcag aatacattgc aacaaagatt ggtgcttttt
2401 gcatgtttgc aacccatttt catgaactta ctgccttggc caatcagata ccaactgtta
2461 ataatctaca tgtcacagca ctcaccactg aagagacctt aactatgctt tatcaggtga
2521 agaaaggtgt ctgtgatcaa agttttggga ttcatgttgc agagcttgct aatttcccta
2581 agcatgtaat agagtgtgct aaacagaaag ccctggaact tgaggagttt cagtatattg
2641 gagaatcgca aggatatgat atcatggaac cagcagcaaa gaagtgctat ctggaaagag
2701 agcaaggtga aaaaattatt caggagttcc tgtccaaggt gaaacaaatg ccctttactg
2761 aaatgtcaga agaaaacatc acaataaagt taaaacagct aaaagctgaa gtaatagcaa
2821 agaataatag ctttgtaaat gaaatcattt cacgaataaa agttactacg tgaaaaatcc
2881 cagtaatgga atgaaggtaa tattgataag ctattgtctg taatagtttt atattgtttt
2941 atattaaccc tttttccata gtgttaactg tcagtgccca tgggctatca acttaataag
3001 atatttagta atattttact ttgaggacat tttcaaagat ttttattttg aaaaatgaga
3061 gctgtaactg aggactgttt gcaattgaca taggcaataa taagtgatgt gctgaatttt
3121 ataaataaaa tcatgtagtt tgtgg
Abb.I Basensequenz hMSH2
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide& val=4557760 NM_000251
8.2 MSH6
1 atttcccgcc agcaggagcc gcgcggtaga tgcggtgctt ttaggagctc cgtccgacag
61 aacggttggg ccttgccggc tgtcggtatg tcgcgacaga gcaccctgta cagcttcttc
121 cccaagtctc cggcgctgag tgatgccaac aaggcctcgg ccagggcctc acgcgaaggc
181 ggccgtgccg ccgctgcccc cggggcctct ccttccccag gcggggatgc ggcctggagc
241 gaggctgggc ctgggcccag gcccttggcg cgatccgcgt caccgcccaa ggcgaagaac
301 ctcaacggag ggctgcggag atcggtagcg cctgctgccc ccaccagttg tgacttctca
361 ccaggagatt tggtttgggc caagatggag ggttacccct ggtggccttg tctggtttac
421 aaccacccct ttgatggaac attcatccgc gagaaaggga aatcagtccg tgttcatgta
481 cagttttttg atgacagccc aacaaggggc tgggttagca aaaggctttt aaagccatat
541 acaggttcaa aatcaaagga agcccagaag ggaggtcatt tttacagtgc aaagcctgaa
601 atactgagag caatgcaacg tgcagatgaa gccttaaata aagacaagat taagaggctt
661 gaattggcag tttgtgatga gccctcagag ccagaagagg aagaagagat ggaggtaggc
721 acaacttacg taacagataa gagtgaagaa gataatgaaa ttgagagtga agaggaagta
781 cagcctaaga cacaaggatc taggcgaagt agccgccaaa taaaaaaacg aagggtcata
841 tcagattctg agagtgacat tggtggctct gatgtggaat ttaagccaga cactaaggag
901 gaaggaagca gtgatgaaat aagcagtgga gtgggggata gtgagagtga aggcctgaac
961 agccctgtca aagttgctcg aaagcggaag agaatggtga ctggaaatgg ctctcttaaa
1021 aggaaaagct ctaggaagga aacgccctca gccaccaaac aagcaactag catttcatca
1081 gaaaccaaga atactttgag agctttctct gcccctcaaa attctgaatc ccaagcccac
1141 gttagtggag gtggtgatga cagtagtcgc cctactgttt ggtatcatga aactttagaa
1201 tggcttaagg aggaaaagag aagagatgag cacaggagga ggcctgatca ccccgatttt
1261 gatgcatcta cactctatgt gcctgaggat ttcctcaatt cttgtactcc tgggatgagg
1321 aagtggtggc agattaagtc tcagaacttt gatcttgtca tctgttacaa ggtggggaaa
1381 ttttatgagc tgtaccacat ggatgctctt attggagtca gtgaactggg gctggtattc
1441 atgaaaggca actgggccca ttctggcttt cctgaaattg catttggccg ttattcagat
1501 tccctggtgc agaagggcta taaagtagca cgagtggaac agactgagac tccagaaatg
1561 atggaggcac gatgtagaaa gatggcacat atatccaagt atgatagagt ggtgaggagg
1621 gagatctgta ggatcattac caagggtaca cagacttaca gtgtgctgga aggtgatccc
1681 tctgagaact acagtaagta tcttcttagc ctcaaagaaa aagaggaaga ttcttctggc
1741 catactcgtg catatggtgt gtgctttgtt gatacttcac tgggaaagtt tttcataggt
1801 cagttttcag atgatcgcca ttgttcgaga tttaggactc tagtggcaca ctatccccca
1861 gtacaagttt tatttgaaaa aggaaatctc tcaaaggaaa ctaaaacaat tctaaagagt
1921 tcattgtcct gttctcttca ggaaggtctg atacccggct cccagttttg ggatgcatcc
1981 aaaactttga gaactctcct tgaggaagaa tattttaggg aaaagctaag tgatggcatt
2041 ggggtgatgt taccccaggt gcttaaaggt atgacttcag agtctgattc cattgggttg
2101 acaccaggag agaaaagtga attggccctc tctgctctag gtggttgtgt cttctacctc
2161 aaaaaatgcc ttattgatca ggagctttta tcaatggcta attttgaaga atatattccc
2221 ttggattctg acacagtcag cactacaaga tctggtgcta tcttcaccaa agcctatcaa
2281 cgaatggtgc tagatgcagt gacattaaac aacttggaga tttttctgaa tggaacaaat
2341 ggttctactg aaggaaccct actagagagg gttgatactt gccatactcc ttttggtaag
2401 cggctcctaa agcaatggct ttgtgcccca ctctgtaacc attatgctat taatgatcgt
2461 ctagatgcca tagaagacct catggttgtg cctgacaaaa tctccgaagt tgtagagctt
2521 ctaaagaagc ttccagatct tgagaggcta ctcagtaaaa ttcataatgt tgggtctccc
2581 ctgaagagtc agaaccaccc agacagcagg gctataatgt atgaagaaac tacatacagc
2641 aagaagaaga ttattgattt tctttctgct ctggaaggat tcaaagtaat gtgtaaaatt
2701 atagggatca tggaagaagt tgctgatggt tttaagtcta aaatccttaa gcaggtcatc
2761 tctctgcaga caaaaaatcc tgaaggtcgt tttcctgatt tgactgtaga attgaaccga
2821 tgggatacag cctttgacca tgaaaaggct cgaaagactg gacttattac tcccaaagca
2881 ggctttgact ctgattatga ccaagctctt gctgacataa gagaaaatga acagagcctc
2941 ctggaatacc tagagaaaca gcgcaacaga attggctgta ggaccatagt ctattggggg
3001 attggtagga accgttacca gctggaaatt cctgagaatt tcaccactcg caatttgcca
3061 gaagaatacg agttgaaatc taccaagaag ggctgtaaac gatactggac caaaactatt
3121 gaaaagaagt tggctaatct cataaatgct gaagaacgga gggatgtatc attgaaggac
3181 tgcatgcggc gactgttcta taactttgat aaaaattaca aggactggca gtctgctgta
3241 gagtgtatcg cagtgttgga tgttttactg tgcctggcta actatagtcg agggggtgat
3301 ggtcctatgt gtcgcccagt aattctgttg ccggaagata cccccccctt cttagagctt
3361 aaaggatcac gccatccttg cattacgaag actttttttg gagatgattt tattcctaat
3421 gacattctaa taggctgtga ggaagaggag caggaaaatg gcaaagccta ttgtgtgctt
3481 gttactggac caaatatggg gggcaagtct acgcttatga gacaggctgg cttattagct
3541 gtaatggccc agatgggttg ttacgtccct gctgaagtgt gcaggctcac accaattgat
3601 agagtgttta ctagacttgg tgcctcagac agaataatgt caggtgaaag tacatttttt
3661 gttgaattaa gtgaaactgc cagcatactc atgcatgcaa cagcacattc tctggtgctt
3721 gtggatgaat taggaagagg tactgcaaca tttgatggga cggcaatagc aaatgcagtt
3781 gttaaagaac ttgctgagac tataaaatgt cgtacattat tttcaactca ctaccattca
3841 ttagtagaag attattctca aaatgttgct gtgcgcctag gacatatggc atgcatggta
3901 gaaaatgaat gtgaagaccc cagccaggag actattacgt tcctctataa attcattaag
3961 ggagcttgtc ctaaaagcta tggctttaat gcagcaaggc ttgctaatct cccagaggaa
4021 gttattcaaa agggacatag aaaagcaaga gaatttgaga agatgaatca gtcactacga
4081 ttatttcggg aagtttgcct ggctagtgaa aggtcaactg tagatgctga agctgtccat
4141 aaattgctga ctttgattaa ggaattatag actgactaca ttggaagctt tgagttgact
4201 tctgaccaaa ggtggtaaat tcagacaaca ttatgatcta ataaacttta ttttttaaaa
4261 atga
Abb. II Basensequenz hMSH6
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=4504190 NM_000179
8.3 MLH1
1 attggctgaa ggcacttccg ttgagcatct agacgtttcc ttggctcttc tggcgccaaa
61 atgtcgttcg tggcaggggt tattcggcgg ctggacgaga cagtggtgaa ccgcatcgcg
121 gcgggggaag ttatccagcg gccagctaat gctatcaaag agatgattga gaactgttta
181 gatgcaaaat ccacaagtat tcaagtgatt gttaaagagg gaggcctgaa gttgattcag
241 atccaagaca atggcaccgg gatcaggaaa gaagatctgg atattgtatg tgaaaggttc
301 actactagta aactgcagtc ctttgaggat ttagccagta tttctaccta tggctttcga
361 ggtgaggctt tggccagcat aagccatgtg gctcatgtta ctattacaac gaaaacagct
421 gatggaaagt gtgcatacag agcaagttac tcagatggaa aactgaaagc ccctcctaaa
481 ccatgtgctg gcaatcaagg gacccagatc acggtggagg acctttttta caacatagcc
541 acgaggagaa aagctttaaa aaatccaagt gaagaatatg ggaaaatttt ggaagttgtt
601 ggcaggtatt cagtacacaa tgcaggcatt agtttctcag ttaaaaaaca aggagagaca
661 gtagctgatg ttaggacact acccaatgcc tcaaccgtgg acaatattcg ctccatcttt
721 ggaaatgctg ttagtcgaga actgatagaa attggatgtg aggataaaac cctagccttc
781 aaaatgaatg gttacatatc caatgcaaac tactcagtga agaagtgcat cttcttactc
841 ttcatcaacc atcgtctggt agaatcaact tccttgagaa aagccataga aacagtgtat
901 gcagcctatt tgcccaaaaa cacacaccca ttcctgtacc tcagtttaga aatcagtccc
961 cagaatgtgg atgttaatgt gcaccccaca aagcatgaag ttcacttcct gcacgaggag
1021 agcatcctgg agcgggtgca gcagcacatc gagagcaagc tcctgggctc caattcctcc
1081 aggatgtact tcacccagac tttgctacca ggacttgctg gcccctctgg ggagatggtt
1141 aaatccacaa caagtctgac ctcgtcttct acttctggaa gtagtgataa ggtctatgcc
1201 caccagatgg ttcgtacaga ttcccgggaa cagaagcttg atgcatttct gcagcctctg
1261 agcaaacccc tgtccagtca gccccaggcc attgtcacag aggataagac agatatttct
1321 agtggcaggg ctaggcagca agatgaggag atgcttgaac tcccagcccc tgctgaagtg
1381 gctgccaaaa atcagagctt ggagggggat acaacaaagg ggacttcaga aatgtcagag
1441 aagagaggac ctacttccag caaccccaga aagagacatc gggaagattc tgatgtggaa
1501 atggtggaag atgattcccg aaaggaaatg actgcagctt gtaccccccg gagaaggatc
1561 attaacctca ctagtgtttt gagtctccag gaagaaatta atgagcaggg acatgaggtt
1621 ctccgggaga tgttgcataa ccactccttc gtgggctgtg tgaatcctca gtgggccttg
1681 gcacagcatc aaaccaagtt ataccttctc aacaccacca agcttagtga agaactgttc
1741 taccagatac tcatttatga ttttgccaat tttggtgttc tcaggttatc ggagccagca
1801 ccgctctttg accttgccat gcttgcctta gatagtccag agagtggctg gacagaggaa
1861 gatggtccca aagaaggact tgctgaatac attgttgagt ttctgaagaa gaaggctgag
1921 atgcttgcag actatttctc tttggaaatt gatgaggaag ggaacctgat tggattaccc
1981 cttctgattg acaactatgt gccccctttg gagggactgc ctatcttcat tcttcgacta
2041 gccactgagg tgaattggga cgaagaaaag gaatgttttg aaagcctcag taaagaatgc
2101 gctatgttct attccatccg gaagcagtac atatctgagg agtcgaccct ctcaggccag
2161 cagagtgaag tgcctggctc cattccaaac tcctggaagt ggactgtgga acacattgtc
2221 tataaagcct tgcgctcaca cattctgcct cctaaacatt tcacagaaga tggaaatatc
2281 ctgcagcttg ctaacctgcc tgatctatac aaagtctttg agaggtgtta aatatggtta
2341 tttatgcact gtgggatgtg ttcttctttc tctgtattcc gatacaaagt gttgtatcaa
2401 agtgtgatat acaaagtgta ccaacataag tgttggtagc acttaagact tatacttgcc
2461 ttctgatagt attcctttat acacagtgga ttgattataa ataaatagat gtgtcttaac
2521 ataa
Abb.III Basensequenz hMLH1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=28559089 NM_000249
8.4 PMS2
1 cgaggcggat cgggtgttgc atccatggag cgagctgaga gctcgagtac agaacctgct
61 aaggccatca aacctattga tcggaagtca gtccatcaga tttgctctgg gcaggtggta
121 ctgagtctaa gcactgcggt aaaggagtta gtagaaaaca gtctggatgc tggtgccact
181 aatattgatc taaagcttaa ggactatgga gtggatctta ttgaagtttc agacaatgga
241 tgtggggtag aagaagaaaa cttcgaaggc ttaactctga aacatcacac atctaagatt
301 caagagtttg ccgacctaac tcaggttgaa acttttggct ttcgggggga agctctgagc
361 tcactttgtg cactgagcga tgtcaccatt tctacctgcc acgcatcggc gaaggttgga
421 actcgactga tgtttgatca caatgggaaa attatccaga aaacccccta cccccgcccc
481 agagggacca cagtcagcgt gcagcagtta ttttccacac tacctgtgcg ccataaggaa
541 tttcaaagga atattaagaa ggagtatgcc aaaatggtcc aggtcttaca tgcatactgt
601 atcatttcag caggcatccg tgtaagttgc accaatcagc ttggacaagg aaaacgacag
661 cctgtggtat gcacaggtgg aagccccagc ataaaggaaa atatcggctc tgtgtttggg
721 cagaagcagt tgcaaagcct cattcctttt gttcagctgc cccctagtga ctccgtgtgt
781 gaagagtacg gtttgagctg ttcggatgct ctgcataatc ttttttacat ctcaggtttc
841 atttcacaat gcacgcatgg agttggaagg agttcaacag acagacagtt tttctttatc
901 aaccggcggc cttgtgaccc agcaaaggtc tgcagactcg tgaatgaggt ctaccacatg
961 tataatcgac accagtatcc atttgttgtt cttaacattt ctgttgattc agaatgcgtt
1021 gatatcaatg ttactccaga taaaaggcaa attttgctac aagaggaaaa gcttttgttg
1081 gcagttttaa agacctcttt gataggaatg tttgatagtg atgtcaacaa gctaaatgtc
1141 agtcagcagc cactgctgga tgttgaaggt aacttaataa aaatgcatgc agcggatttg
1201 gaaaagccca tggtagaaaa gcaggatcaa tccccttcat taaggactgg agaagaaaaa
1261 aaagacgtgt ccatttccag actgcgagag gccttttctc ttcgtcacac aacagagaac
1321 aagcctcaca gcccaaagac tccagaacca agaaggagcc ctctaggaca gaaaaggggt
1381 atgctgtctt ctagcacttc aggtgccatc tctgacaaag gcgtcctgag acctcagaaa
1441 gaggcagtga gttccagtca cggacccagt gaccctacgg acagagcgga ggtggagaag
1501 gactcggggc acggcagcac ttccgtggat tctgaggggt tcagcatccc agacacgggc
1561 agtcactgca gcagcgagta tgcggccagc tccccagggg acaggggctc gcaggaacat
1621 gtggactctc aggagaaagc gcctgaaact gacgactctt tttcagatgt ggactgccat
1681 tcaaaccagg aagataccgg atgtaaattt cgagttttgc ctcagccaac taatctcgca
1741 accccaaaca caaagcgttt taaaaaagaa gaaattcttt ccagttctga catttgtcaa
1801 aagttagtaa atactcagga catgtcagcc tctcaggttg atgtagctgt gaaaattaat
1861 aagaaagttg tgcccctgga cttttctatg agttctttag ctaaacgaat aaagcagtta
1921 catcatgaag cacagcaaag tgaaggggaa cagaattaca ggaagtttag ggcaaagatt
1981 tgtcctggag aaaatcaagc agccgaagat gaactaagaa aagagataag taaaacgatg
2041 tttgcagaaa tggaaatcat tggtcagttt aacctgggat ttataataac caaactgaat
2101 gaggatatct tcatagtgga ccagcatgcc acggacgaga agtataactt cgagatgctg
2161 cagcagcaca ccgtgctcca ggggcagagg ctcatagcac ctcagactct caacttaact
2221 gctgttaatg aagctgttct gatagaaaat ctggaaatat ttagaaagaa tggctttgat
2281 tttgttatcg atgaaaatgc tccagtcact gaaagggcta aactgatttc cttgccaact
2341 agtaaaaact ggaccttcgg accccaggac gtcgatgaac tgatcttcat gctgagcgac
2401 agccctgggg tcatgtgccg gccttcccga gtcaagcaga tgtttgcctc cagagcctgc
2461 cggaagtcgg tgatgattgg gactgctctt aacacaagcg agatgaagaa actgatcacc
2521 cacatggggg agatggacca cccctggaac tgtccccatg gaaggccaac catgagacac
2581 atcgccaacc tgggtgtcat ttctcagaac tgaccgtagt cactgtatgg aataattggt
2641 tttatcgcag atttttatgt tttgaaagac agagtcttca ctaacctttt ttgttttaaa
2701 atgaaacctg ctacttaaaa aaaatacaca tcacacccat ttaaaagtga tcttgagaac
2761 cttttcaaac c
Abb. IV Basensequenz hPMS1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=11125773 NM_000535
Kapitel 9 Anhang II
9.1 Tabellarischer Lebenslauf
Name:
Vorname:
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Anschrift:
BECKMANN
Carmen, Birga, Andrea
28.08.1968
Hamburg
37079 Göttingen
Kopernikusstraße 21
Schulbesuch:
1975 - 1979
1979 - 1985
1985 - 1988
Grundschule in Rellingen;
Realschule in Burg/Dithmarschen;
Fachgymnasium sozialwirtschaftlicher Zweig in Heide;
Studium /
Ausbildung:
1988 - 1990
1990 - 1992
1995 - 1997
Sportstudium Deutsche Sporthochschule Köln;
Krankengymnastikschule Damp;
schulische Ausbildung zur Heilpraktikerin und
Sportheilpraktikerin (Deutsche Paracelsus Schule
Hamburg / Kassel)
Studium der Humanmedizin an der Georg-AugustUniversität Göttingen
Anerkennungsjahr Ostseeklinik Damp
Krankengymnastin in der Ostseeklinik Damp
Krankengymnastin in einer Praxis in Heide, SchleswigHolstein
Krankengymnastin in einer Praxis in Göttingen
Krankengymnastin in einer Praxis in Felsberg
Honorardozentin an der Dr. Rohrbach-Schule in Kassel
Krankengymnastin in einer Praxis in Kassel
studentische Aushilfe in der Stroke Unit im
Universitätsklinikum Göttingen
studentische Aushilfe im Schlaflabor des
Universitätsklinikums Göttingen, Abt. Prof. Dr.
Hasenfuß
Honorardozentin an der Profess und Hippokratesschule
Kassel
freie Mitarbeiterin in einer krankengymnastischen
Praxis in Göttingen
Assistenzärztin in der Chirurgie am Albert-SchweitzerKrankenhaus Northeim
1998-2006
Tätigkeiten:
1992 - 1993
1993 - 1994
1994 - 1995
1995 - 1997
1997
1997 - 2000
2000
2000 - 2001
2003 - 2005
med.
seit 2005
1997-2006
seit 2006
Göttingen, 04. November 2007
Carmen Beckmann
9.2 Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer waren an der Georg-August-Universität in
Göttingen:
Prof. Dr. med.
Baer (Neurologie)
Prof. Dr. med.
Brockmöller (Pharmakologie)
Prof. Dr. med.
Brunner (Biomathematik)
Prof. Dr. med.
Buchfelder (Neurochirurgie)
Prof. Dr. med.
Burckhardt (Physiologie)
Prof. Dr. rer. nat.
Dönecke (Biochemie)
Prof. Dr. rer. nat.
Drabent (Biochemie)
Prof. Dr. med.
Emons (Gynäkologie)
Prof. Dr. med.
Friedrich (Psychologie)
Prof. Dr. med.
Füzesi (Pathologie)
PD Dr. med.
Gottschalk (Klinische Chemie)
Prof. Dr. med.
Groß (Mikrobiologie)
Prof. Dr. med.
Grunewald (Innere Medizin)
Prof. Dr. med.
Hasenfuß (Kardiologie)
Prof. Dr. med.
Hellige (Notfallmedizin)
Prof. Dr. med.
Herken (Anatomie)
Prof. Dr. med.
Knepel (Pharmakologie)
Prof. Dr. med.
Kochen (Allgemeinmedizin)
Prof. Dr. med.
Kuhn (Anatomie)
Prof. Dr. med.
Kunze (Pathologie)
Prof. Dr. med.
Lakomek (Pädiatrie)
Prof. Dr. med.
Markus (Chirurgie)
Prof. Dr. rer. nat.
Nägerl (Physik)
Prof. Dr. med.
Neumann (Dermatologie)
Prof. Dr. med.
Oellerich (Klinische Chemie)
Prof. Dr. med.
Paul (Pädiatrie)
Prof. Dr. med.
Peters (Mikrobiologie)
Prof. Dr. med.
Poser (Psychiatrie)
Prof. Dr. med.
Radzun (Pathologie)
Prof. Dr. med.
Richter (Anatomie)
Prof. Dr. med.
Ringert (Urologie)
Prof. Dr. med.
Schmidberger (Radiologie)
Prof. Dr. med.
Schmidt (klinische Medizin)
Prof. Dr. med.
Schulz (Orthopädie)
Prof. Dr. med.
Seidl (Anatomie)
Prof. Dr. med.
Steiner (HNO)
Prof. Dr. rer. nat.
Tischner (Biologie)
Prof. Dr. med.
Wiesemann (Terminologie)
Prof. Dr. rer. nat.
Zeeck (Chemie)
9.3 Danksagung
Allen, die durch ihre Hilfe und Unterstützung zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen haben, möchte ich ganz herzlich meinen Dank aussprechen:
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Joseph Rüschoff für die
Überlassung des Themas und seiner steten Unterstützung.
Den medizinisch technischen Assistentinnen aus den Laboren.
Frau Dr. rer. nat. Westphal für ihre freundschaftliche und verlässliche Hilfe.
Frau Dr. med. Müller, die mich besonders in den schwierigen Anfängen
unterstützt hat.
Ein besonderer Dank gilt meiner Familie, die mir auch in schwierigen Zeiten im
Studium sowie in der Doktorarbeit stets beiseite standen und mich immer wieder
motiviert haben, durchzuhalten und beides erfolgreich abzuschließen.
9.5 Ehrenwörtliche Erklärung
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur
Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „Mikrosatelliteninstabilität
und Mismatch-Repairgenexpression in Adenomen bei erblichen
Dickdarmkarzinom (HNPCC)“ im Institut für Pathologie der Klinik Kassel unter
Leitung von Herrn Prof. Rüschoff ohne sonstige Hilfe selbst durchgeführt und bei
der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der Dissertation aufgeführten
Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe bisher an keinem in- oder ausländischen
Medizinischen Fachbereich ein Gesuch um Zulassung zur Promotion eingereicht,
noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als Dissertation vorgelegt.
Vorliegende Arbeit wurde in folgendem Publikationsorgan: Int J Colorectal Dis
(2006) 21: 632–641 veröffentlicht.
Carmen Beckmann, Göttingen, den 04.11.2007