Charakterisierung des Fusionsproteins des respiratorischen
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Aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Charakterisierung des Fusionsproteins des respiratorischen Synzytialvirus mit Hilfe rekombinanter Sendai-Viren INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Matthias Hinz aus Heide/Holstein Hannover 2003 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Georg Herrler 1. Gutachter: Prof. Dr. Georg Herrler 2. Gutachterin: Prof. Dr. Edda Töpfer-Petersen Tag der mündlichen Prüfung: 20. November 2003 Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Seite 1 EINLEITUNG .................................................................................................................. 1 1.1 DAS RESPIRATORISCHE SYNZYTIALVIRUS ................................................................... 1 1.1.1 Taxonomie .......................................................................................................... 1 1.1.2 Verbreitung, Pathogenität und Epidemiologie................................................... 3 1.1.3 Klinik und Pathologie......................................................................................... 4 1.1.4 Immunologie....................................................................................................... 5 1.1.5 Morphologie ....................................................................................................... 6 1.1.6 Strukturproteine ................................................................................................. 9 1.1.6.1 Nukleokapsid-assoziierte Proteine ................................................................. 9 1.1.6.2 M-Protein ..................................................................................................... 10 1.1.6.3 SH-Protein.................................................................................................... 11 1.1.6.4 G-Protein ...................................................................................................... 11 1.1.6.5 F-Protein....................................................................................................... 13 1.1.7 Nichtstrukturproteine ....................................................................................... 16 1.1.8 Genomstruktur und Virusvermehrung.............................................................. 16 1.2 DAS SENDAI-VIRUS ................................................................................................... 18 1.2.1 Taxonomie ........................................................................................................ 18 1.2.2 Medizinische Bedeutung des Sendai-Virus ...................................................... 19 1.2.3 Morphologie ..................................................................................................... 20 1.2.4 Oberflächenproteine......................................................................................... 22 1.2.4.1 HN-Protein ................................................................................................... 22 1.2.4.2 F-Protein....................................................................................................... 23 1.2.5 Spaltung des F-Proteins ................................................................................... 25 1.2.6 Genomstruktur und Virusvermehrung.............................................................. 27 2 ZIELSETZUNG ............................................................................................................. 30 3 MATERIAL.................................................................................................................... 32 Inhaltsverzeichnis 4 3.1 ZELLLINIEN ............................................................................................................... 32 3.2 ZELLKULTURMEDIEN ................................................................................................ 33 3.3 ERYTHROZYTEN ........................................................................................................ 34 3.4 VIREN........................................................................................................................ 34 3.5 ERSTANTIKÖRPER...................................................................................................... 36 3.6 ZWEITANTIKÖRPER ................................................................................................... 37 3.7 KITS .......................................................................................................................... 37 3.8 ENZYME .................................................................................................................... 37 3.9 SUBSTRATE/MARKER ................................................................................................ 37 3.10 CHEMIKALIEN ........................................................................................................... 38 3.11 PUFFER UND LÖSUNGEN ............................................................................................ 39 3.12 GERÄTE UND SONSTIGE MATERIALIEN ...................................................................... 43 METHODEN .................................................................................................................. 47 4.1 ZELLKULTUREN......................................................................................................... 47 4.1.1 Passagieren von MDCK II Zellen .................................................................... 47 4.1.2 Passagieren von Vero-Zellen ........................................................................... 47 4.1.3 Passagieren von BHK21-Zellen ....................................................................... 47 4.1.4 Anlegen von Gefrierkulturen und Auftauen von Zellen.................................... 48 4.2 VERMEHRUNG VON VIRUS IN ZELLKULTUR .............................................................. 48 4.3 HÄMAGGLUTINATIONSTEST (HA-TEST).................................................................... 49 4.4 FIXIEREN VON ZELLEN .............................................................................................. 50 4.5 IMMUNOPLAQUETEST ................................................................................................ 50 4.6 INFEKTION VON ZELLKULTUR ................................................................................... 52 4.7 IMMUNFLUORESZENZ ................................................................................................ 53 4.8 VIRUSREINIGUNG ...................................................................................................... 54 4.9 PROTEINBESTIMMUNG IM BCA-TEST ........................................................................ 55 4.10 SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE ......................................................... 56 4.11 WESTERN BLOT, SEMI-DRY-BLOT VON PROTEINEN ................................................. 57 4.12 IMMUNCHEMISCHE DETEKTION VON PROTEINEN ...................................................... 57 4.13 DETEKTION VON PROTEINEN IN POLYACRYLAMIDGELEN.......................................... 59 4.13.1 Coomassie-Färbung ......................................................................................... 59 4.13.2 5 4.14 WACHSTUMSKINETIK ................................................................................................ 59 4.15 VIRUSNEUTRALISATIONSTEST ................................................................................... 60 4.16 INKUBATION VON VIRUS MIT NEUTRALISIERENDEN ANTIKÖRPERN ........................... 62 4.16.1 Inkubation mit Antikörpern gegen RSV-F ........................................................ 62 4.16.2 Inkubation mit polyklonalem Serum gegen Sendai-Virus ................................ 63 4.17 DESIALYLIERUNG VON ZELLKULTUR ........................................................................ 63 4.18 WIEDERHERSTELLUNG DER SEV-REZEPTOREN IN ZELLKULTUR ............................... 64 ERGEBNISSE ................................................................................................................ 66 5.1 EXPRESSION DER TRANSGENE DER REKOMBINANTEN SENDAI-VIREN ....................... 66 5.2 EINBAU DER FREMDPROTEINE IN SEV-PARTIKEL ...................................................... 68 5.2.1 Nachweis des Einbaus mit Hilfe des Western Blots ......................................... 68 5.2.2 Nachweis in Polyacrylamidgelen ..................................................................... 70 5.3 WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN DER REKOMBINANTEN VIREN .................................... 71 5.4 REPLIKATIONSVERHALTEN DER REKOMBINANTEN VIREN ......................................... 74 5.5 HEMMUNG DER INFEKTION DURCH NEUTRALISIERENDE ANTIKÖRPER ...................... 76 5.5.1 Neutralisationsvermögen diverser Antikörper gegen RSV-F........................... 76 5.5.2 Infektionshemmung mit einem Antikörper gegen RSV-F ................................. 78 5.5.3 Infektionshemmung mit Antikörpern gegen SeV .............................................. 79 5.6 6 7 Silberfärbung.................................................................................................... 59 INFEKTIONSVERMÖGEN IN ABHÄNGIGKEIT VON SIALINSÄUREN ............................... 81 5.6.1 Entfernen der Sialinsäuren von Zellkultur ....................................................... 81 5.6.2 Wiederherstellung der SeV-Rezeptoren ........................................................... 82 DISKUSSION ................................................................................................................. 85 6.1 EINBAU DES CHIMÄREN FUSIONSPROTEINS IN SENDAI-VIRIONEN ............................. 85 6.2 INFEKTIONSVERMITTLUNG DURCH RSV-F ................................................................ 86 6.3 NEUTRALISATION DER INFEKTIONSWEGE .................................................................. 89 6.4 ABHÄNGIGKEIT DES RSV-F VON SENDAI-HN........................................................... 90 6.5 AUSBLICK ................................................................................................................. 91 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................... 94 Inhaltsverzeichnis 8 SUMMARY..................................................................................................................... 96 9 LITERATURVERZEICHNIS ...................................................................................... 98 TABELLENVERZEICHNIS .............................................................................................. 117 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS........................................................................................ 118 TAGUNGSBEITRÄGE ....................................................................................................... 121 DANKSAGUNG ................................................................................................................... 122 ANHANG .............................................................................................................................. 123 1 Einleitung 1.1 1.1.1 Das respiratorische Synzytialvirus Taxonomie Das respiratorische Synzytialvirus wurde erstmals 1956 als viraler Erreger aus den oberen Atemwegen beschrieben (MORRIS et al., 1956). Man isolierte es aus einem Schimpansen und bezeichnete es als chimpanzee coryza agent (CCA). Ein Jahr später gelang einer anderen Arbeitsgruppe der Nachweis eines solchen Virus beim Menschen. Es wurde als humanes respiratorisches Synzytialvirus (HRSV) bezeichnet (CHANOCK et al., 1957). Auch bei anderen Spezies wurden verwandte Viren nachgewiesen. In der Schweiz gelang Paccaud und Jaquier 1967 die Isolierung des bovinen respiratorischen Synzytialvirus bei Rindern (PACCAUD & JACQUIER, 1970). Dieses Virus zeigt neben serologischer Verwandtschaft zu HRSV (ORVELL et al., 1987; WALRAVENS et al., 1990) auch sehr ähnliche klinische Symptome und eine ähnliche Pathologie (COLLINS et al., 2001). Es wird bei Kälbern und Kindern ein vergleichbares Krankheitsbild durch diese Viren hervorgerufen. Experimentell lassen sich Kälber mit aus Menschen isoliertem Virus infizieren (JACOBS & EDINGTON, 1975). Bei Ziegen und Schafen konnte ein zwar serologisch verwandtes, aber nicht identisches respiratorisches Synzytialvirus nachgewiesen werden. Es gibt also auch eine caprine (CRSV) und eine ovine (ORSV) Virusspezies des RSV (SMITH et al., 1975; TRUDEL et al., 1989; MALLIPEDDI & SAMAL, 1993). Bei Infektionen von Zellkulturen lässt sich die für RSV typische Synzytienbildung beobachten (COLLINS, 1991). Die Fusionseigenschaften des Virus bewirken die Bildung von mehrkernigen Riesenzellen. Im Grunde verschmelzen hier die Zellen zu größeren Konglomeraten, den Synzytien. Dieses Wort stammt vom griechischen „syn“ (=zusammen) und „kytos“ (=Höhlung, Wölbung) und beschreibt gut diesen Charakter. 2 Einleitung Tabelle 1: Vertreter der Familie Paramyxoviridae Subfamilie Genus Paramyxovirinae Respirovirus Tier Mensch bovines Parainfluenzavirus Parainfluenzavirus Typ3 Typ1 und 3 Sendai-Virus Rubulavirus Simian-Virus 5 Mumpsvirus Parainfluenzavirus Typ 2 und 4a,b Avulavirus Newcastle-Disease-Virus Paramyxovirus 1 der Taube Paramyxovirus 3 der Pute Morbillivirus Hundestaupevirus Masernvirus Robbenstaupevirus Rinderpestvirus Pest-des-PetitsRuminants-Virus (PPRV) Henipavirus Hendravirus (Pferd) Hendravirus Menanglevirus (Schwein) Nipahvirus Nipahvirus (Schw., Hund) Pneumovirinae Pneumovirus BRSV (Rind) humanes respiratorisches ORSV (Schaf) Synzytialvirus (HRSV) CRSV (Ziege) Pneumovirus der Maus (PVM) Metapneumovirus Rhinotracheitisvirus Pute (TRTV) der Humanes Metapneumovirus Einleitung 3 Die vier Spezies der respiratorischen Synzytialviren gehören zusammen mit dem Pneumovirus der Maus (PVM) zum Genus Pneumovirus. Gemeinsam werden sie zur Familie Paramyxoviridae (vgl. Tab.1) (COLLINS et al., 2001) und zur Ordnung Mononegavirales (PRINGLE, 1999) gerechnet. 1.1.2 Verbreitung, Pathogenität und Epidemiologie Nach der Isolierung von RSV aus respiratorisch erkrankten Rindern, basierend auf den Erkenntnissen von Paccaud und Jacquier (1970), erschienen Berichte über Ausbrüche RSVbedingter Erkrankungen in England, den USA, Japan, Kanada, Belgien, Ungarn, den Niederlanden, Norwegen, Schweden, Dänemark u. a. (INABA et al., 1970; JACOBS & EDINGTON, 1971; SMITH et al., 1975; BITSCH et al., 1976; HOLZHAUER et al., 1976; ODEGAARD & KROGSRUD, 1977; BRYSON et al., 1979; THOMAS et al., 1980; ELAZHARY et al., 1980; PIRIE et al., 1981; PRITCHARD & EDWARDS, 1981; FLORENT et al., 1985; HARRISON & PURSELL, 1985; LINGGI & WYLER, 1985; WELLEMANS & VAN OPDENBOSCH, 1985). Infektionsversuche führten zu klinischen Erkrankungen und erfüllten so für RSV die Henle-Kochschen Postulate (VERHOEFF et al., 1984), d. h. dass sich mit dem regelmäßig in betroffenen Tieren nachgewiesenen und in Reinkultur anzüchtbaren Erreger das entsprechende Krankheitsbild auch reproduzieren lässt. In der Bundesrepublik wurden zunächst in Bayern serologische Erhebungen vorgenommen. Es konnte auf eine starke Verbreitung von BRSV im Freistaat geschlossen werden (NIEMEYER, 1976). Nach gehäuftem Auftreten von respiratorischen Erkrankungen bei Rindern in Schleswig-Holstein ab 1984 wurde auch hier BRSV als infektiöse Ursache ermittelt (STEINHAGEN, 1987). Epidemiologische Untersuchungen zeigten, dass über 70% der Rinder in Deutschland Antikörper gegen das Virus besitzen (LOTTHAMMER & EHLERS, 1990). Die Infektion mit BRSV verläuft häufig in Gesellschaft mit anderen bakteriellen (Pasteurellen, Chlamydien und Mykoplasmen) und viralen Erregern (bovine Adenoviren, 4 Einleitung bovines Herpesvirus 1, Virus der bovinen Virusdiarrhoe, Parainfluenzavirus 3, bovine Rhinoviren 1 und 2, Coronaviren, Reoviren). Man spricht von einer Faktorenkrankheit. Es konnte beobachtet werden, dass das Virus nicht nur in Mast- und Zukaufsbetrieben auftaucht, sondern auch in Milchbetrieben, in denen seit Jahren kein Zukauf erfolgte (STEINHAGEN, 1990). Hauptreservoir von BRSV ist das Rind, allerdings lassen sich experimentell auch Schafe infizieren (SHARMA & WOLDEHIWET, 1992). Es erkranken hauptsächlich Jungrinder im Alter von vier Wochen bis sechs Monaten (BRYSON et al., 1983; KIMMAN et al., 1988). Beim Aufstallen im Herbst und Winter führen nasskaltes Klima und enger Tierkontakt zu gehäuften Infektionen (BAKER et al. 1986 b). Die Übertragung von RSV erfolgt aerogen durch Tröpfcheninfektion. Das Virus gelangt hierbei in den oberen Respirationstrakt, vermehrt sich in den Zellen des Schleimhautepithels und breitet sich von hier aus schnell in die unteren Atemwege aus. BRSV wird noch etwa drei Wochen nach Infektion vom betroffenen Tier ausgeschieden (LIEBERMANN, 1992). Die humane Spezies des respiratorischen Synzytialvirus, HRSV, hat große Bedeutung in der Pädiatrie. Sie gilt als wichtigster viraler Erreger des unteren Respirationstraktes bei Kleinkindern und tritt weltweit auf (HEILMANN, 1990). Säuglinge in einem Alter von sechs Wochen bis zu einem halben Jahr, aber auch ältere Menschen und Personen, die unter einer Immunsuppression leiden, sind besonders gefährdet (THORSEN et al., 2000; COLLINS & POLLARD, 2002). HRSV-Infektionen sind hochansteckend. Man findet 106 infektiöse Einheiten pro Milliliter Nasenflüssigkeit (COLLINS, 1995). Die Infektion erfolgt aerogen oder durch direkten Kontakt mit den erkrankten Personen. Die Inkubationszeit beträgt drei bis fünf Tage. Über 80% der Kinder unter vier Jahren haben bereits Antikörper gegen HRSV. 1.1.3 Klinik und Pathologie Bei der BRSV-Infektion unterscheidet man zwei Verlaufsformen. Der gutartige Verlauf ist durch ein geringgradig gestörtes Allgemeinbefinden, leichtes Fieber und Nasenausfluss gekennzeichnet. Es kommt zum Ausheilen nach etwa drei Tagen. Es kann aber circa eine Einleitung 5 Woche später die Ausprägung des zweiten Stadiums folgen. Es kommt zu hohem Fieber bis 42°C, schaumigem Speicheln, Tachypnoe bei fehlendem Nasenausfluss bis hin zu starker Dyspnoe mit typischer Maulatmung und gestrecktem Hals. Die Tiere werden anorektisch, leiden unter Obstipation, und der Kliniker findet Emphyseme in der Schulter- und Halsgegend des betroffenen Tieres. Es ist meist der gesamte Bestand betroffen, wobei die Letalität bei 20 bis 30% liegt. Zwei bis drei Monate nach der Erstinfektion trifft man bei erneut infizierten Tieren auch eine subklinische Verlaufsform an (INABA et al., 1970; LIEBERMANN, 1992; BELKNAP, 1993). Der Pathologe findet bei betroffenen Tieren Lungenemphyseme und Lungenödeme vor. Das histologische Bild zeigt eine Tracheobronchitis, Bronchiolitis und eine interstitielle Pneumonie mit Synzytien und eosinophilen Einschlusskörperchen (LIEBERMANN, 1992). In der Kinderheilkunde spricht man bei HRSV vom infektiologischen Hauptproblem des ersten Lebensjahres. Die Erkrankung kann stark in ihrer Ausprägung variieren. Sie kann sich lediglich als leichter grippaler Infekt äußern oder nach zwei Tagen auch zu einer Pharyngitis, Tracheitis oder Bronchitis führen (CHANOCK & PAROTT, 1965; ANDERSON et al., 1990) Etwa 40% der erkrankten Kinder entwickeln eine Bronchiolitis oder auch eine Pneumonie. Bei 5% der Betroffenen entwickelt sich der Pseudokrupp. Klinisch zeigt sich Heiserkeit, bellender Husten, Zyanose und Fieber. Als Komplikation kann sich eine Mittelohrentzündung entwickeln. Das pathologische Bild ähnelt dem der BRSV-Infektion. Bei Kindern, die einer Risikogruppe angehören, wie etwa Patienten mit Herzfehlern oder bronchopulmonaler Dysplasie, kann die Infektion lebensbedrohlich sein (COLLINS, 1995). 1.1.4 Immunologie Die RSV-Infektion hinterlässt keine belastbare Immunität. Bei Kälbern verlaufen Reinfektionen symptomlos, bei Kindern hingegen ist die Wiedererkrankung klinisch erkennbar (HALL et al., 1978; BAKER et al., 1986 a). Zugelassene Vakzine gegen HRSV sind momentan nicht auf dem Markt. Formalin-inaktivierte Impfstoffe erwiesen sich als 6 Einleitung ungeeignet. Sie waren nicht in der Lage, die Bildung neutralisierender Antikörper zu induzieren und haben eine Wildtypinfektion eher negativ beeinflusst, da es zu verstärkten Krankheitssymptomen kam (KIM et al., 1969; MURPHY & WALSH, 1988). Im Tierversuch mit Ratten konnte gezeigt werden, dass es nach einer Verabreichung Formalin-inaktivierter RSV-Vakzine und anschließender RSV-Infektion zu einer allergischen Reaktion des Typs III, zum Arthus-Phänomen bzw. zur Hypersensitivität, kommt (PRINCE et al., 1986). Lebendimpfstoffe mit attenuierten Viren sind in der Entwicklung, allerdings ist eine ausgewogene Balance zwischen Attenuierung und Induktion einer protektiven Immunantwort noch nicht erreicht (WRIGHT et al., 2000). Eine Behandlung der RSV-Infektion bei Kindern erfolgt durch Sauerstoff-Therapie. Prophylaktisch wird bei prädisponierten Patienten eine passive Immunisierung durchgeführt. Eine Protektion durch passive Immunisierung mit monoklonalen Antikörpern gegen das Fusionsprotein von BRSV konnte auch bei Kälbern gezeigt werden (THOMAS et al., 1998). Gegen BRSV sind Lebend- und Totvakzine im Handel erhältlich. Deren Wirkung und Nutzen hingegen wird kontrovers diskutiert (KIMMAN et al., 1989; ELLIS et al., 1995; WOOLUMS et al., 1999). 1.1.5 Morphologie RSV ist ein RNA-Virus. Sein Genom ist nicht segmentiert, linear, einzelsträngig und liegt in Negativstrangorientierung vor. Die Nukleinsäure besteht aus 15222 Basenpaaren (COLLINS et al., 2001). Das Virion ist vielgestaltig, filamentös oder sphärisch. Sphärische Partikel variieren im Durchmesser von 150 bis 300 nm. Filamentöse Virionen erreichen Durchmesser von 60 bis 100 nm und eine Länge bis zu 10 µm (JONCAS et al., 1969; ITO et al., 1973). Abbildung 1 zeigt den schematischen Aufbau eines RSV-Partikels. 7 Einleitung L-Protein N-Protein P-Protein M-Protein F-Protein SH-Protein G-Protein Abbildung 1: schematische Darstellung des respiratorischen Synzytialvirus Es besitzt eine Lipiddoppelmembran, die es durch einen Knospungsprozess an der Plasmamembran der Wirtszelle erhält. Das Genom codiert für 11 verschiedene Virusproteine. Die Oberflächenproteine von RSV sind das G-, das F- und das SH-Protein, mit der genomischen RNA sind die Proteine L, N und P assoziiert. Ferner gibt es die Proteine M, M21, M2-2 und die Nichtstrukturproteine NS1 und NS2. Tabelle 2 gibt einen kurzen Überblick über die Virusproteine von RSV (COLLINS, 1995; COLLINS et al., 2001). 8 Einleitung Tabelle 2: Funktion und Eigenschaft der RSV-Proteine Protein Molekulargewicht in charakteristische Eigenschaften und Funktion kDa / Modifkationen F0 F1 70 Vorläufer-Membranprotein, wird gespalten in F1- und F2- N-glykosyliert Untereinheit 48 Typ-I-Membranprotein, carboxyterminale Region von F0, N-glykosyliert, acyliert Fusionspeptid am NH2-Ende, Induzierung neutralisierender Antikörper, Bindungseigenschaft, Fusionseigenschaft, über Disulfidbrücken mit F2 zu einem Heterodimer verbunden F2 20 aminoterminale Region von F0, Signalpeptid am NH2-Ende N-glykosyliert G 90 Bindung an Proteoglykane, Transmembranregion am NH2- O-/N-glykosyliert Ende (Typ-II-Membranprotein), hoher Kohlenhydratanteil SH 13 Membranprotein, Funktion unklar M 25 Matrixprotein, zwischen Nukleokapsid und Membraninnenseite lokalisiert, initiiert self-assembly N 45 Nukleokapsidprotein, Teil des Polymerasekomplexes P 33, phosphoryliert Teil des Polymerasekomplexes L 250 Teil des Nukleokapsids, RNA-abhängige RNA-Polymerase M2-1 22, phosphoryliert Elongationsfaktor M2-2 11 vermittelt Umschaltung von Transkription auf Replikation NS1 14 Interferon-Antagonist NS2 15 Interferon-Antagonist 9 Einleitung 1.1.6 Strukturproteine 1.1.6.1 Nukleokapsid-assoziierte Proteine Die Proteine N, P, L und M2 sind eng mit dem RSV-Genom assoziiert und bilden gemeinsam mit der RNA das Nukleokapsid. Sie sind als Komplex an der Transkription und Replikation von RSV beteiligt. Das konnte in Transfektionsversuchen gezeigt werden (YUNUS et al., 1998). Hier wurde verdeutlicht, dass ein BRSV-Minigenom mit N, P und L ausreicht, um Transkription und Replikation zu gewährleisten. Unter dem Einfluss von geringen Mengen an M2 wurde die Effektivität dieses Systems noch gesteigert. Das 42 kDa große Nukleokapsidprotein (N-Protein) als Teil des Polymerasekomplexes ist verantwortlich für die Umschaltung von Transkription zu Replikation. Es interagiert eng mit dem Phosphoprotein (P-Protein) (MALLIPEDDI et al., 1996; KRISHNAMURTHY & SAMAL, 1998). Das Phosphoprotein hat ein Molekulargewicht von 27 kDa, ist hydrophil und überwiegend am N-Terminus phosphoryliert. An zwei Regionen des Proteins finden sich gehäuft saure Aminosäuren (SATAKE et al., 1984). Die Phosphoproteine von BRSV und HRSV ähneln sich in der Nukleotidsequenz zu etwa 70%, in der Aminosäuresequenz zu über 80% (MALLIPEDDI & SAMAL, 1992). Da das Genom von RSV in Negativstrangorientierung vorliegt, muss das Virus seine eigene RNA-abhängige RNA-Polymerase in die Wirtszelle mitbringen, um einen Positivstrang zu synthetisieren. Diese wird durch das large Protein (L-Protein) repräsentiert (STEC et al., 1991). Es ist 250 kDa groß, besitzt Proteinkinaseaktivität und bindet an das Nukleokapsidund an das Phosphoprotein (COLLINS et al., 2001). Zwischen BRSV und HRSV stimmt die Nukleotidsequenz des L-Proteins zu 77% überein, die Aminosäuresequenz zu 84% (YUNUS et al., 1998). Der Polymerasekomplex aus den drei vorgenannten Proteinen wird unterstützt durch das M21-Protein. Der Leserahmen für das M2-Protein überlappt ein kurzes Stück mit dem für das L- 10 Einleitung Protein (STEC et al., 1991). Die mRNA für M2 enthält zwei offene Leserahmen (HARDY & WERTZ, 1998). Der offene Leserahmen für die M2-mRNA kodiert am 5’-Ende (Nukleotide 10-594) für das M2-1-Protein (COLLINS et al., 1990). M2-1 kann an das N-Protein binden und ist intrazellulär kolokalisiert mit N und P (GARCIA et al., 1993; GARCIA-BARRENO et al., 1996). Als Antiterminationsfaktor ist M2-1 wichtig für die Synthese von mRNA in voller Länge (FEARNS & COLLINS, 1999). Stromabwärts der M2-mRNA (Nukleotide 563-835) befindet sich der offene Leserahmen für das M2-2-Protein (COLLINS et al., 1990). M2-2 hat eine Bedeutung bei der Umschaltung vom Transkriptions- zum Replikationsmodus. Es ist nicht essentiell für das Virus (BERMINGHAM & COLLINS, 1999; JIN et al., 2000). 1.1.6.2 M-Protein Das Matrixprotein spielt bei den Paramyxoviren eine zentrale Rolle bei der Bildung der Virionen. Es ist sehr basisch, hydrophob und stark konserviert in dieser Virusfamilie (BELLINI et al., 1986; GALINSKI et al., 1987; SPRIGGS et al., 1987). Das Matrixprotein von RSV ist 29 kDa groß und bildet die Proteinschicht an der Innenseite der Virushülle. Ein Signalpeptid oder eine Transmembrandomäne ist in der Sequenz nicht vorhanden. Es spielt eine zentrale Rolle beim Entstehungsprozess des neuen Viruspartikels (self assembly). Schon kurz nach seiner Synthese tritt das Matrixprotein mit der Plasmamembran der Wirtszelle in Interaktion (BOWEN & LYLES, 1982) und zieht im weiteren die übrigen Virusbestandteile für den Knospungsprozess (budding) an der Zellmembran zusammen. Es findet offenbar eine Wechselwirkung mit den viralen Glykoproteinen und dem Nukleokapsid, insbesondere mit dem N-Protein, statt. Einleitung 11 1.1.6.3 SH-Protein Das kleinste der drei Oberflächenproteine des respiratorischen Synzytialvirus ist das small hydrophobic Protein (SH-Protein) mit einem theoretischen Molekulargewicht von 13 kDa. Bei HSRV wurden unterschiedlich glykosylierte Isoformen nachgewiesen (OLMSTED & COLLINS, 1989). Die SH-Proteine von HRSV und BRSV sind sehr unterschiedlich. Am CTerminus zeigen sie nur eine Übereinstimmung von 16 bis 22% in ihren Sequenzen (SAMAL & ZAMORA, 1991). In Koexpressionsversuchen mit dem F- und dem G-Protein wurde dem SH-Protein zunächst eine unterstützende Wirkung bei der viralen Fusionsaktivität zugeschrieben (SAMAL & PASTEY, 1997). Die durch das Fusionprotein bewirkte Synzytienbildung scheint durch SH gesteigert zu sein (HEMINWAY et al., 1994). SH wird allerdings aufgrund von Erkenntnissen mit einem Minigenom-System (TENG & COLLINS, 1998) anders beurteilt. Hier konnte gezeigt werden, dass das SH-Protein im Grunde keinen Einfluss auf die Vermehrung in der Zellpassage hat, im Gegenteil eher hinderlich zu sein scheint. Es wurde aber gezeigt, dass SH die Bindungsaffinität an Heparinstrukturen erhöhen kann und in dieser Hinsicht die beiden anderen Oberflächenproteine G und F unterstützt (FELDMAN et al., 2001). Die genaue Funktion des SH-Proteins ist noch nicht bekannt. Rekombinantes RSV, in denen das SH-Gen deletiert wurde, ist in Zellkultur überlebensfähig (BUKREYEV et al., 1997). SH ist also nicht essentiell für das Virus. In vivo ist die SH-Deletionsmutante attenuiert in Bezug auf Schimpansen (WHITEHEAD et al., 1999) und bietet möglicherweise Ansätze zur Entwicklung von Vakzinen. 1.1.6.4 G-Protein Das Glykoprotein G besitzt eine Transmembranregion am N-Terminus und fällt somit in die Kategorie der Typ-II-Membranproteine. Das relativ hohe Molekulargewicht von 84 bis 90 12 Einleitung kDa rührt von der starken Glykosylierung her (MCINTOSH & CHANNOCK, 1985). Es handelt sich zu etwa 80% um O-Glykane, mit denen das G-Protein ausgestattet ist. In einer Nukleotidsequenzanalyse wurde gezeigt, dass zwischen HRSV und BRSV nur eine Homologie von etwa 30% besteht. Obwohl einige Epitope zwischen HRSV und BRSV sehr ähnlich sind, ist die serologische Verwandtschaft sehr verschieden (ORVELL et al., 1987; BAKER et al., 1992). Antiseren gegen das jeweilige G-Protein der beiden Spezies HRSV und BRSV zeigen keine Kreuzreaktivität (LERCH et al., 1990). Die Divergenz der G-Proteine innerhalb der Spezies HRSV führt zur Einteilung in die Serotypen A und B (JOHNSON et al., 1987). Die Funktion des G-Proteins liegt in der Bindung an die Wirtszelle (LEVINE et al., 1987). Es stellt den Kontakt zur Zielzelle her und ermöglicht so die weiteren Schritte zur Einschleusung des Virions in den Wirt. Zu den Bindungsproteinen der anderen Paramyxoviren zeigt das Glykoprotein deutliche strukturelle Unterschiede (LANGEDIJK et al., 1996). Hämagglutinierende Eigenschaften sind nicht vorhanden. Interessant ist die morphologische Ähnlichkeit mit einem Tumornekrose-Faktor-Rezeptor und die damit mögliche immunologische Bedeutung (LANGEDIJK et al., 1998). Es konnte gezeigt werden, dass die Effektivität der Bindung an die Zielzelle durch Entfernung von zellulären Glukosaminoglykanen stark herabgesetzt werden kann. Außerdem wurde ein Bindungsvermögen des G-Proteins an Heparin festgestellt (KRUSAT & STRECKERT, 1997; BOURGEOIS et al., 1998). Im RSV-Glykoprotein wurde die Bindungsdomäne für schwefelhaltige heparin-ähnliche Glukosaminoglykane ermittelt (FELDMAN et al., 1999). Die Affinität von HRSV zu verschiedenen Proteoglykanen kann in folgende Reihenfolge gebracht werden: Heparin – Heparansulfat – Chondroitinsulfat-B (HALLAK et al., 2000). Zu Chondrotitinsulfat-A und –C sowie zu Hyaluronan besteht keine Affinität. Das Glykoprotein wird in polarisierten Epithelzellen an die apikale Seite transportiert und dort in die Membran integriert (ROBERTS et al., 1995). Neben der membrangebundenen Form gibt es eine weitere Variante. In infizierten Zellen konnte G-Protein nachgewiesen werden, welches keinen zytoplasmatischen Abschnitt und keine Transmembrandomäne Einleitung 13 besitzt. Dieses verkürzte G-Protein wird in löslicher Form von den Zellen sezerniert (HENDRICKS et al., 1988; ROBERTS et al., 1994). Eine Immunantwort mit neutralisierenden Antikörpern richtet sich weniger gegen das GProtein als vielmehr gegen das Fusionsprotein (SCHRIJVER et al., 1997). Das G-Protein ist nicht essentiell für die Virusvermehrung, wie Versuche mit der attenuierten Deletionsmutante cp-52 erwiesen haben, der sowohl das Gen für SH als auch für G fehlt (KARRON et al., 1997). 1.1.6.5 F-Protein Nachdem der Kontakt zur Wirtszelle hergestellt ist, wird bei Paramyxoviren eine Fusion der Virusmembran mit der Plasmamembran der betroffenen Zelle eingeleitet. Verantwortlich dafür ist das Fusionsprotein (F-Protein) (BRATT & GALLAGHER, 1969; CHOPPIN & COMPANS, 1975; WALSH & HRUSKA, 1983). Am N-Terminus befindet sich ein Signalpeptid für den Transport des Translationskomplexes zur Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER). Weiterhin besitzt das F-Protein neben der Ektodomäne einen Transmembrananker und einen kurzen zytoplasmatischen Abschnitt (COLLINS et al., 1984). Die Aminosäurekette des Fusionsproteins wird in die Membran des ER eingeschleust und mit dem hydrophoben Bereich der Transmembrandomäne in diese verankert. Das Fusionsprotein hat in seiner monomeren ungespaltenen Form F0 eine Größe von etwa 70 kDa. Modifikationen sind die Acylierung (ARUMUGHAM et al., 1989) und die NGlykosylierung (CASH et al., 1979; MORRISON, 1988, MALLIPEDDI et al., 1990). Potentielle N-Glykosylierungsstellen sind N27, N70, N116, N120, N126 und N500 (ZIMMER et al., 2001 a). Des weiteren findet eine Oligomerisierung statt (COLLINS, 1991). Es kommt zur Ausbildung von Trimeren des F-Proteins (CALDER et al., 2000; MATTHEWS 14 Einleitung et al., 2000). Dabei werden haarnadelähnliche Strukturen beobachtet, die möglicherweise die Interaktion mit der Wirtszellmembran verbessern (ZHAO et al., 2000). Das zunächst gebildete Vorläuferprotein ist noch biologisch inaktiv. Entscheidend zur Erlangung der Fusionsaktivität ist die proteolytische Spaltung in die Untereinheiten F1 und F2 (GRUBER & LEVINE, 1983), die allerdings über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden bleiben (ELANGO et al., 1985). Die Molekulargewichte betragen für F1 48 kDa und für F2 20 kDa. Als Spaltstelle wurde das multibasische Aminosäuremotiv Lysin-Lysin-Arginin-LysinArginin-Arginin (K-K-R-K-R-R) identifiziert, das hinter der Aminosäure 136 von der ubiquitären, d.h. im Grunde in jeder Säugetier-Zelle vorhandenen, Protease Furin gespalten wird (ELANGO et al., 1985). Zusätzlich konnte noch ein weiteres Furinspaltmotiv stromaufwärts entdeckt werden. Es befindet sich an Position 109 und besitzt die Sequenz Arginin-Alanin-Arginin-Arginin (R-A-R-R) (GONZALES-REYES et al., 2001; ZIMMER et al., 2001 b). Die zweite Spaltstelle ist allerdings nicht essentiell für das Virus. Sie ist entbehrlich für die Replikation und Virusvermehrung in Zellkultur (ZIMMER et al., 2002). In der Elektronenmikroskopie können je nach Spaltung der beiden Motive unterschiedliche strukturelle Ausprägungen des Fusionsproteins beobachtet werden (BEGONA RUIZARGUELLO et al., 2002). Bei der Spaltung an beiden Motiven kommt es zur Heraustrennung eines 27 Aminosäuren großen Peptides, dessen Bedeutung noch nicht hinlänglich geklärt ist. Außerdem wird durch die Spaltung in die zwei Untereinheiten am N-terminalen Ende der F1Einheit ein stark hydrophober Bereich, das Fusionspeptid, in eine exponierte Lage gebracht (siehe Abbildung 2). Dieses kann mit der Zielzellmembran wechselwirken und eine Verschmelzung der Lipidschichten der Virusmembran und der Plasmamembran des Wirtes einleiten (COLLINS et al., 2001). So wurde es auch bei anderen Paramyxoviren beobachtet (HSU et al., 1981, KOHAMA et al., 1981). 15 Einleitung S-S Furin NH2- -COOH F2 pep27 Signalpeptid F1 zytoplasmatischer Abschnitt Fusionspeptid Membrananker S-S NH2F2 -COOH Signalpeptid F1 zytoplasmatischer Abschnitt Fusionspeptid Membrananker Abbildung 2: Proteolytische Prozessierung des RSV-Fusionsproteins Eine Fusion mit der Wirtszelle kann auch allein durch das Fusionsprotein erreicht werden. Das zeigen Versuche, in denen F in Abwesenheit anderer Oberflächenproteinen exprimiert wurde (PASTEY & SAMAL, 1997). Versuche mit der HRSV-Deletionsmutante cp-52, denen die Genabschnitte für das G- und für das SH-Protein fehlen, zeigen, dass das Fusionsprotein allein, unabhängig von G und SH, eine Replikation in vivo gewährleisten kann (KARRON et al., 1997). Das F-Protein von RSV hat im Gegensatz zu den Fusionsproteinen anderer Paramyxoviren selbst Bindungseigenschaften. Es konnte gezeigt werden, dass RSV mit Heparin-ähnlichen Strukturen interagiert (MARTÌNEZ & MELERO, 2000). Entfernt man Heparin als Bindungspartner enzymatisch, sinkt die Infektiosität der Deletionsmutante cp-52 16 Einleitung sehr stark (FELDMAN et al., 2000). Die F2-Untereinheit kann für die Speziesspezifität verantwortlich gemacht werden (SCHLENDER et al., 2003), d.h. sie bestimmt den Wirt. Neben der Fusions- und der Bindungseigenschaft hat das F-Protein noch eine weitere Funktion. Es ist das Hauptantigen von RSV und induziert im Wirtsorganismus die Bildung neutralisierender Antikörper (OLMSTEDT et al, 1986; PEMBERTON et al., 1987; WERTZ et al, 1987; KIMMAN & WESTENBRINK, 1990). 1.1.7 Nichtstrukturproteine Die RNA des respiratorischen Synzytialvirus kodiert für zwei Nichtstrukturproteine. Dies sind das leicht saure, 14 kDa große NS1 und das basische, 15 kDa große NS2. Man kann sie in RSV-infizierten Zellen, nicht aber in Virionen nachweisen (COLLINS et al., 2001). NS2 ist instabil und hat in infizierten Zellen eine Halbwertszeit von etwa 30 Minuten (EVANS et al., 1996). Einzeln oder gemeinsam scheinen sie keinen Effekt auf das self assembly oder auf die Passagierung von Virus-ähnlichen Partikeln zu haben (TENG & COLLINS, 1998). Sie haben offenbar immunologische Bedeutung, denn gemeinsam wirken sie antagonistisch zu Interleukin vermittelten antiviralen Zellantworten (SCHLENDER et al., 2000). 1.1.8 Genomstruktur und Virusvermehrung Der Kontakt mit der Zielzelle wird durch das G-Protein hergestellt. Dieser Prozess wird als attachment bezeichnet. Das Glykoprotein stellt über eine Bindung an Proteoglykane eine erste Anheftung an die Wirtszelle her. Hierzu beitragen kann wahrscheinlich auch noch das Fusionsprotein mit Hilfe seines Bindungsvermögens an Heparinstrukturen. Nach der Anheftung an den Wirt kann das F-Protein die Fusion einleiten, also die Verschmelzung der Membranen der Zelle und des Viruspartikels. Das Nukleokapsid kann so in das Zytoplasma gelangen, wo im weiteren Transkription und Replikation ablaufen. Diese Vorgänge finden in 17 Einleitung vivo insbesondere in den Epithelzellen des Respirationstraktes und in den Alveolarzellen statt. Eine virämische Ausbreitung erfolgt nicht (SCHRIJVER et al., 1995). Das Genom liegt in einer Länge von 15.222 Basenpaaren vor. Am N-Terminus der RNA befindet sich eine als leader bezeichnete Sequenz, die zwar transkribiert wird, aber nicht für Aminosäuren kodiert. Als trailer wird ein nichttranskribierter Bereich am 5’-Ende bezeichnet. Zwischen den einzelnen Genabschnitten finden sich ausserdem noch intergenische Nukleotide, kurze, nichttranskribierte Sequenzfolgen (COLLINS et al., 2001). 5’ 3’ NS1 NS2 N P M SH G F M2 leader F trailer Abbildung 3: Genomorganisation des respiratorischen Synzytialvirus Die Genomorganisation von RSV zeigt Abbildung 3. Die RNA dient zum einen der Synthese von mRNA für die 11 verschiedenen Virusproteine mit Hilfe der RNA-abhängigen RNAPolymerase (L-Protein) (LERCH et al., 1989; WESTENBRINK et al., 1989). Jede mRNA kodiert für jeweils ein Virusprotein. Die einzelnen Gene werden entsprechend ihrer Reihenfolge auf der RNA mit Hilfe des Transkriptionskomplexes aus L, N und P transkribiert, wobei die Menge an produzierter mRNA zum 3’-Ende zunimmt. Zum anderen dient die RNA der Replikation. Es wird eine durchgehende antigenomische RNA in Positivstrangorientierung synthetisiert, die als Matrize für neue genomische RNA dient. Die Nukleokapsid-Proteine, die sich bereits während der Synthese an das naszierende Genom binden, regulieren die Bildung des Antigenoms. Sie sorgen für die Umschaltung von Transkription auf Replikation. 18 Einleitung Unter dem Einfluss des M-Proteins kommt es zum self assembly der Virusbestandteile an der Plasmamembran der Wirtszelle und zum Knospungsprozess (budding), wobei sich das Nukleokapsid als neues Virion an der Lipidhülle der Zelle ausstülpt und abspaltet. Ein Großteil der neuen Viruspartikel bleibt allerdings zellassoziiert, was relativ niedrige Virustiter in Zellkultur zur Folge hat (WECHSLER et al., 1985). 1.2 1.2.1 Das Sendai-Virus Taxonomie Das Sendai-Virus (SeV) gehört ebenso wie das respiratorische Synzytialvirus zur Familie Paramyxoviridae. Gemeinsam mit den Virusfamilien Rhabdoviridae, Bornaviridae und Filoviridae bilden sie die Ordnung Mononegavirales, also der Viren mit einem einzelsträngigen Genom in Negativstrangorientierung. Anders als RSV, welches zur Subfamilie der Pneumovirinae gehört, wird das SeV zur Unterfamilie der Paramyxovirinae gerechnet (vgl. Tabelle 1). Hier gruppiert man es gemeinsam mit den humanen Parainfluenzaviren Typ 1 und 3 und dem bovinen Parainfluenzavirus 3 in das Genus Respirovirus ein (CHANOCK et al., 2001). SeV wird auch als murines, also mausspezifisches, Parainfluenzavirus bezeichnet. Seinen Namen verdankt es seiner Entdeckung in der Stadt Sendai auf der japanischen Hauptinsel Honshu. Der Erreger wurde dort erstmals aus einem an Lungenentzündung verstorbenen Mädchen isoliert (KUROYA & ISHIDA, 1953). Es wurde zunächst für humanpathogen gehalten. Später hat sich allerdings herausgestellt, dass es sich hierbei um einen Zufallsbefund handelte. Es spielt vielmehr in der Heimtier- und Labortierhaltung eine Rolle, insbesondere bei Mäusen und Ratten. Das Sendai-Virus kann als murines Gegenstück zum humanen Parainfluenzavirus 1 angesehen werden. So wird auch das bovine Parainfluenzavirus 3 als Gegenstück zum humanen Parainfluenzavirus 3 betrachtet (ABINANTI et al., 1961; COOK & CHANOCK, 1963). Einleitung 1.2.2 19 Medizinische Bedeutung des Sendai-Virus Das Sendai-Virus ist weltweit verbreitet und infiziert vorwiegend Kleinnager. Betroffen sind insbesondere Mäuse, Ratten, Hamster und Meerschweinchen (PARKER et al., 1978). Auch Kaninchen sind empfänglich für das Sendai-Virus (MACHII et al., 1989). In der Heimtiermedizin spricht man im Zusammenhang mit der Sendai-Virus-Infektion vom chronischen respiratorischen Syndrom. Chronische Erkrankungen der Atmungsorgane sind bei zahmen Mäusen die am häufigsten vorgestellten Probleme (VISSIER, 1998). Es handelt sich bei der Infektion mit dem Sendai-Virus teilweise um eine Mischinfektion mit dem Pneumovirus der Maus (PVM), Mycoplasma pulmonis und gelegentlich Mycoplasma neurolyticum. Als bakterielle Sekundärerreger können sich noch Pasteurella pneumotropica, Bordetella bronchiseptica, Corynebacterium kutscheri und andere hinzugesellen. Tiere, die unter dieser respiratorischen Erkrankung leiden, zeigen eine erschwerte Atmung, die sich durch Schnarchen, Schnauben und Niesen äußert (SPARROW, 1980). Betroffene Tiere sind lustlos, sitzen mit gekrümmtem Rücken und haben ein struppiges Fell. Die Atemnot wird noch durch die deutlich hervortretenden Augen betont (MULLINK, 1979). Der Pathologe kann eine Rhinitis, Bronchitis und Bronchoalveolitis erkennen. Antikörper werden ab dem 7. Tag nachgewiesen und bleiben auf einem hohen Niveau bis zum 21. Tag post infectionem (PERCY & PALMER, 1997). Das Sendai-Virus verursacht bei der Ratte, ähnlich wie bei der Maus, eher in Jungtieren eine klinisch erkennbare Erkrankung. Die betroffenen Tiere haben Nasenausfluss und eine erschwerte Atmung. Das Wachstum ist vermindert, und das Haarkleid ist stumpf und gesträubt (WIJNBERGEN, 1998). Das Virus kann auch an einer Mischinfektion mit Mycoplasma pulmonis mitwirken und trägt dann zum Krankheitsbild der murinen respiratorischen Mykoplasmose (MRM) bei (HARKNESS & WAGNER, 1989). Diese chronische Form tritt allerdings eher bei älteren Ratten auf (JUDD, 1981). Es wird dabei das klinische Bild einer chronischen progressiven Lungenentzündung hervorgerufen. 20 Einleitung In Versuchstierhaltungen ist das Virus problematisch, da die Infektion bei älteren Tieren subklinisch verläuft, aber eventuell Ergebnisse in den Tierversuchen mit infizierten Individuen beeinflussen kann. Das Virus kann sich gewissermaßen in einer Kolonie verstecken. Daher ist es notwendig, in Versuchstierhaltungen regelmäßig auf dieses Virus zu untersuchen (FELASA, 2002). Prophylaktisch isoliert man alle neuabgesetzten Tiere für zwei Monate aus der Kolonie. Ein Totimpfstoff gegen das Sendai-Virus ist im Handel erhältlich (HARKNESS & WAGNER, 1989). 1.2.3 Das Morphologie Sendai-Virus ist ein behülltes Virus mit helikalem Nukleokapsid. Die Lipiddoppelmembran erhält das Virus durch einen Knospungsprozess an der Plasmamembran der Wirtszelle (KLENK & CHOPPIN, 1969, 1970). Als Oberflächenproteine finden sich in der Virushülle, anders als bei RSV, nur zwei Glykoproteine (vgl. Abbildung 4). L-Protein P-Protein N-Protein M-Protein F-Protein HN-Protein Abbildung 4: schematische Darstellung des Sendai-Virus 21 Einleitung Das attachment-Protein des Sendai-Virus ist das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein (HNProtein). Das zweite Oberflächenprotein ist das Fusionsprotein (F-Protein). Das Bindeglied zwischen Lipidhülle und Nukleokapsid stellt das Matrixprotein (M-Protein) dar. Die einzelsträngige RNA liegt als Komplex mit 2564 Nukleokapsidproteinen (N-Proteinen) als linksorientierte Helix vor (CALAIN & ROUX, 1993). Tabelle 3: Funktion und Eigenschaften der SeV-Proteine Protein Molekulargewicht in kDa charakteristische Eigenschaften und Funktion / Modifikationen F0 F1 63 Vorläuferprodukt, Membranprotein, wird prozessiert zu glykosyliert F1 und F2, ist erst nach dieser Spaltung fusionsaktiv 50-55 carboxyterminale Region von F0, Fusionspeptid am N- glykosyliert, acyliert Terminus, Typ-I-Membranprotein, Induktion neutralisierender Antikörper, über Disulfidbrücke mit F2 verbunden F2 HN 10-12 aminoterminale Region von F0, Signalpeptid am N- glykosyliert Terminus 69-72 Adsorption, Hämagglutination, Bindung an glykosyliert, acyliert Sialinsäuren, Induktion neutralisierender Antikörper, Typ-II-Membranprotein, Neuraminidase M 39,5 Matrixprotein, bildet Proteinschicht an Membraninnenseite, initiiert self assembly N 58 Nukleokapsidprotein, interagiert mit Genom P 67 ergänzt Polymeraseaktivität des L-Proteins, bindet an phosphoryliert L- und N-Proteine L 256 RNA-abhängige RNA-Polymerase C 23,3 Interferon-Antagonist D 20 aminoterminal verkürztes C-Protein V 22-28 Insertion von G-Resten durch RNA-Editing bei der phosphoryliert Transkription führt zur mRNA für V 22 Einleitung Je sechs Nukleotide werden von einem N-Protein gebunden. Bei der Herstellung von rekombinanten Viren stellte man fest, dass es nur zu einer effizienten Replikation von Genomen kommt, wenn die Anzahl an Nukleotiden einem Vielfachen von sechs entspricht („rule of six“). Es werden immer genau sechs Nukleotide vom 5’-Ende der naszierenden RNA-Kette mit einem N-Protein assoziiert. Der RNA-Nukleokapsidprotein-Komplex bildet gemeinsam mit etwa 300 Phosphoproteinen (P) und 20 – 30 large Proteinen (L) das eigentliche Nukleokapsid. Diese Interaktion ermöglicht virale Transkription und Replikation (BUCHHOLZ et al., 1994). Tabelle 3 gibt einen kurzen Überblick über die Strukturproteine und drei der Nichtstrukturpoteine des Sendai-Virus (CHANOCK et al., 2001). Zu den Nukleokapsid-assoziierten Proteinen N, P und L und zu dem Matrixprotein gelten im Grunde genommen die entsprechenden Angaben zum respiratorischen Synzytialvirus. 1.2.4 Oberflächenproteine 1.2.4.1 HN-Protein Das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein (HN-Protein) des Sendai-Virus besteht aus 575 Aminosäuren und hat damit ein theoretisches Molekulargewicht von 67 kDa (CHANOCK et al., 2001). Es besitzt vier potentielle N-Glykosylierungsstellen: N77, N448, N 499, N511 (SEGAWA et al., 2003). Die Faltung und Oligomerisierung zu Tetrameren findet im rauhen Endoplasmatischen Retikulum statt (MOTTET et al., 1986). Nahe dem N-Terminus besitzt das HN-Protein eine hydrophobe Region, mit der es in die ER-Membran verankert wird. Ein kurzer Abschnitt verbleibt im Zytoplasma (CHANOCK et al., 2001). Der größte Teil des HNProteins bildet die Ektodomäne (Typ-II-Membranprotein). HN liegt als Homotetramer vor und hat in seiner dreidimensionalen Struktur starke Ähnlichkeit zum Neuraminidase-Tetramer des Influenza-A-Virus (THOMPSON et al., 1988). Ebenso wie das Fusionsprotein des Sendai-Virus induziert HN die Bildung von neutralisierenden Antikörpern im Wirtsorganismus (TAKAO et al., 1997). Zu seinen Funktionen gehören die Bindung (attachment) des Virus an Sialinsäure-haltige Rezeptoren Einleitung 23 auf den potentiellen Wirtszellen (WU et al., 1980; MARKWELL et al., 1981, 1984), Neuraminidaseaktivität (GORMAN et al., 1991) und eine fusionsunterstützende Wirkung (LAMB, 1993). Die Bindungsaffinität zu sialinsäurehaltigen Glykoproteinen oder Glykolipiden ist so hoch, dass HN in der Lage ist, Erythrozyten zu binden und zu agglutinieren. Diese Eigenschaft macht man sich für den Nachweis einer Sendai-Virus-Infektion mit Hilfe des Hämadsorptionstestes oder des Hämagglutinationstestes zunutze (SUZUKI et al., 1983). Die Hämagglutinin-Neuraminidase ist andererseits auch in der Lage, durch ihre Neuraminidaseaktivität Sialinsäuren von den Rezeptormolekülen abzuspalten (SCHEID & CHOPPIN, 1974). Damit ist gewährleistet, dass sich neugebildete Virionen von der Wirtszelle abspalten können und nicht die bereits infizierte Zelle reinfizieren. Eine Superinfektion wird also vermieden. Das HN-Protein ist essentiell für ein funktionierendes Fusionsvermögen des F-Proteins (BOUSSE et al., 1994). In Expressionsversuchen konnte die Gruppe um Bousse zeigen, dass es nur bei Koexpression der beiden SeV-Gene HN und F zu einer Zell-ZellFusion kommt. Interessanterweise kann auch eine Fusion beobachtet werden bei Koexpression von HN des humanen Parainfluenzavirus 1 und von F des Sendai-Virus. Umgekehrt (HN von SeV und F von hPIV-1) zeigt sich indes keine Fusion. Es ist hier offenbar eine spezifische Interaktion der beiden Oberflächenproteine vonnöten (BOUSSE et al., 1994). 1.2.4.2 F-Protein Das Fusionsprotein (F-Protein) besteht in seiner inaktiven Vorläuferform F0, dem primären Translationsprodukt, aus 565 Aminosäuren, besitzt ein theoretisches Molekulargewicht von 63 kDa und enthält drei potentielle Glykosylierungsstellen (BLUMBERG et al., 1985). Die Glykosylierung der zweiten Stelle ist essentiell für den intrazellulären Transport und die Fusionsaktivität des Fusionsproteins (SEGAWA et al., 2000). Zuckerreste werden Nglykosidisch an Asparagin gebunden (YOSHIMA et al., 1981). Am N-Terminus ist ein 24 Einleitung hydrophober Bereich zur Einschleusung in das ER zu finden. Dieses Signalpeptid wird nach der Translokation des F-Proteins durch die ER-Membran abgespalten (BLUMBERG et al., 1985). Das zunächst inaktive Vorläuferprotein F0 (Abbildung 5) wird durch eine wirtsspezifische proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren 116 und 117 in die Untereinheiten F1 (5055 kDa) und F2 (10-12 kDa) geteilt. Beide Peptide bleiben weiterhin über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden (HOMMA & OHUCHI, 1973; SCHEID & CHOPPIN, 1974). Durch die Spaltung und eine Konformationsänderung wird das Fusionspeptid, eine zweite hydrophobe Domäne am N-Terminus des F1-Proteins in eine exponierte Lage gebracht (HSU et al., 1981). In diesem Bereich wird die Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran der Zielzelle initiiert (GETHING et al., 1978). Ein dritter hydrophober Bereich am C-Terminus des Fusionsproteins stellt den Membrananker dar, wobei sich das Carboxylende im Zytoplasma befindet. Das Fusionsprotein kann also als Typ-I-Membranprotein eingeordnet werden. S-S Trypsin -COOH NH2F2 F1 zytoplasmatischer Abschnitt Signalpeptid Fusionspeptid Abbildung 5: Das Fusionsprotein des Sendai-Virus Membrananker Einleitung 1.2.5 25 Spaltung des F-Proteins Die proteolytische Spaltung der Vorläufer-Einheit F0 in die beiden Untereinheiten F1 und F2 ist für die Aktivierung des Virus absolut essentiell. Erst mit der Spaltung des Fusionsproteins ist das Virus in der Lage, mit der Wirtszellmembran zu fusionieren und so in die betroffene Zelle einzudringen. Die verantwortliche Protease, die diese Spaltung bewirkt, ist im Lungengewebe von Mäusen und Ratten, den natürlichen Wirten des Sendai-Virus, lokalisiert (TASHIRO et al., 1990, 1992). Namentlich ist dies die Tryptase Clara, die von bronchialen Epithelzellen in das Lungengewebe abgegeben wird und so die externe Spaltung des SeVFusionsproteins gewährleistet. Diese Protease ist vornehmlich im Lungengewebe vorhanden, wodurch sich der strenge Pneumotropismus des Sendai-Virus erklären lässt (TASHIRO & HOMMA, 1983). Der Infektionsort ist also abhängig von der Anwesenheit aktiver, gewebsspezifischer Proteasen (MOCHIZUKI et al., 1988). Es konnte allerdings noch eine andere Trypsin-ähnliche Protease identifiziert werden, die zur spezifischen Spaltung des SeV-F befähigt ist. Sie ähnelt dem Blutgerinnungsfaktor X und ist in der Allantoisflüssigkeit von embryonierten Hühnereiern zu finden (MURAMATSU & HOMMA, 1980). In Zellkultur kann damit eine Aktivierung des Sendai-Virus herbeigeführt werden. Das SeV-Fusionsprotein hat eine monobasische Spaltstelle mit der Folge –Q-S-R-F-F-. Die Spaltung erfolgt nach dem singulären Arginin (BLUMBERG et al., 1985). Man kann diese Spaltung in Zellkultur durch Zugabe einer exogenen Serin-Protease, wie z.B. Trypsin erreichen (SCHEID & CHOPPIN, 1974). Diese monobasische Spaltstelle ist unter den Paramyxoviren wie auch bei anderen Virusfamilien eher die Ausnahme, wie die Tabelle 4 zeigt (GARTEN et al., 1994). Eine Vielzahl viraler Oberflächenproteine weisen eine multibasische Spaltstelle der Abfolge –(R)-R-X-K/R-R- auf. Wie schon bei RSV ausgeführt, ist dies das Erkennungsmotiv für die ubiquitäre Subtilisin-ähnliche Protease Furin, welche im Golgi-Apparat der meisten Zelltypen zu finden ist (GARTEN et al., 1994; KLENK & GARTEN, 1994; BOLT & PEDERSEN, 1998). 26 Einleitung Tabelle 4: Spaltstellenmotive viraler Glykoproteine Virus Glykoprotein Spaltstellenmotiv Sendai-Virus (Stamm Fushimi) F GVPQSR1 Newcastle-Disease-Virus (Stamm AV) F GRRQKR FI Masern-Virus F SRRHKR FA Parainfluenza-Virus Typ 3 F DPRTKR FF Influenzavirus A/Memphis/102/72 (H3) HA PEKQTR GL Influenzavirus A/Tern/SA/61 (H5) HA TRRQKR GL M SGRSRR SV E2 SGRSKR SV env VQREKR AV Epstein-Barr-Virus gB LRRRRR DA Varicella-Zoster-Virus gB NTRSRR Paramyxoviridae FF Orthomyxoviridae Flaviviridae Gelbfieber-Virus Togaviridae Sindbis-Virus Retroviridae Humanes Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) Herpesviridae 1 SV :Wichtige basische Aminosäuren des Spaltstellenmotivs sind durch Fettdruck hervorgehoben. 27 Einleitung 1.2.6 Genomstruktur und Virusvermehrung Die einzelsträngige, negativorientierte genomische RNA des Sendai-Virus beseht aus 15.384 Nukleotiden. Die Gene für die 6 Strukturproteine sind wie folgt in 5’-Richtung angeordnet: 3’-N-P/C-M-F-HN-L-5’. Am aminoterminalen Ende des Genoms befindet sich eine leader-Sequenz, die zwar transkribiert wird, jedoch nicht für Aminosäuren kodiert. Am carboxyterminalen Ende liegt eine nicht transkribierte trailer-Sequenz. Das P/C-Gen kodiert für das Phosphoprotein und sieben Nichtstrukturproteine (C, C’, Y1, Y2, X, V, W). Die Ursache für die Synthese unterschiedlicher Proteine liegt in der Verwendung verschiedener Startkodons und der dadurch entstehenden diversen Leserahmen innerhalb des P/C-Gens (CURRAN & KOLAKOFSKY, 1989, 1990). Das C-Protein wirkt als InterferonAntagonist und beeinflusst so immunologische Vorgänge innerhalb der Wirtszelle (GARCIN et al., 1999). Außerdem hat das C-Protein die Fähigkeit, Apoptose auszulösen, also den programmierten Zelltod herbeizuführen (ITOH et al., 1998). Die Funktionen der Nichtstrukturproteine sind bisher weitgehend unbekannt, es handelt sich aber vermutlich um regulatorische Funktionen im Bereich der Expression (siehe Tabelle 3) (CHANOCK et al., 2001). Über das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein wird der Kontakt mit der Zielzelle hergestellt. Die Adsorption erfolgt an sialinsäurehaltige Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Daraufhin kann das Fusionsprotein, das zuvor durch eine extrazelluläre trypsinähnliche Protease gespalten sein muss, die Verschmelzung der Viruslipidhülle mit der Plasmamembran der zukünftigen Wirtszelle einleiten. Dies geschieht über den hydrophoben Abschnitt am Nterminalen Ende der F1-Untereinheit, der nach der Aktivierung des Fusionsproteins in einer exponierten Stellung ist (OHUCHI & HOMMA, 1976). Somit kann das Nukleokapsid in die Zelle eingeschleust werden (Penetration). 28 Einleitung Die Synthese der viralen Komponenten erfolgt im Zytoplasma der infizierten Zelle. Zunächst wird ein primäres Transkript durch die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase synthetisiert. Von einem Promotor am 5’-Ende werden alle 6 viralen Gene durch einen Polymerasekomplex aus L, N und P transkribiert, und es entstehen 8 polyadenylierte, mit einer 5’-Cap-Struktur versehenen mRNAs. Die intergenischen Sequenzen werden nicht transkribiert. Letztlich liegen die mRNAs der am 3’-Ende transkribierten Gene in größeren Mengen, vor als die mRNAs der Gene, die näher am 5’-Ende kodiert sind. Es entsteht ein Expressionsgradient, ein Regulationsmechanismus für die quantitative Bildung der viralen Proteine (GLAZIER et al., 1977; HOMANN et al., 1990). Mit zunehmender Zahl der Virusproteine N und P kommt es zur Umschaltung von der Transkription zur Replikation der negativ orientierten RNA. Da bei der Genomreplikation alle Terminations-Signale überlesen werden (VIDAL & KOLAKOFSKY, 1989), wird eine nicht modifizierte, antigenomische RNA mit positiver Polarität gebildet, die von NukleokapsidProteinen verpackt wird. Die Bindung von Nukleokapsiden an virale Oberflächenproteine erfolgt vermutlich bereits an der intrazellulären Membran des Golgi-Apparates (SANDERSON et al., 1994). Dort interagieren die viralen Transmembranproteine HN und F0 über die zytoplasmatische Domäne mit dem Matrixprotein. Das M-Protein wiederum bindet die Nukleokapside über das NProtein und wirkt so als Mediator zwischen den Glykoproteinen und dem Nukleokapsid, wodurch möglicherweise auch der Zusammenhalt der reifen Viruspartikel sichergestellt ist (STRICKER et al., 1994). Der Mechanismus der Ausstülpung der Zellmembran und der Knospung (budding) der Viren ist noch weitgehend ungeklärt. Die Hämagglutinin-Neuraminidase sorgt mit ihrer Neuraminidase-Aktivität für ein Abspalten der Sialinsäuren von der Wirtszelloberfläche und verhindert so eine Reinfektion. Damit wird das Ablösen reifer Viren von der Zelle ermöglicht. Ein erhöhter Umsatz an M- und HN-Proteinen in der Wirtszelle konnte mit einer starken Reduktion in der Virusausschleusung in Korrelation gebracht werden (ROUX & WALDVOGEL, 1982; ROUX et al., 1985; TUFFEREAU & ROUX, 1988). Man kann also Einleitung 29 vermuten, dass diese Proteine eine entscheidende Rolle bei der Virusausschleusung spielen. Interessanterweise können temperatursensitive SeV-Mutanten, welche bei nichtpermissiven Temperaturen einen reduzierten HN-Einbau in der Virushülle aufweisen, effizient ausgeschleust werden (STRICKER & ROUX, 1991). Die Übergänge zwischen den Genen bestehen aus jeweils 50 bis 80 Nukleotiden. In jedem dieser Bereiche findet man eine stark konservierte Region von 22 Nukleotiden, die sich jeweils in drei Abschnitte unterteilen lassen. Die ersten 9 Nukleotide stellen das Terminationssignal des vorangegangenen Gens dar. Die nächsten der Nukleotide werden als intergene Sequenz bezeichnet und nicht transkribiert. Die letzten 10 Nukleotide fungieren als Startsignal für das nachfolgende Gen (GUPTA & KINGSBURY, 1984). Somit ist jeder Genabschnitt von Konsensussequenzen flankiert, welche die Genexpression regulieren. 2 Zielsetzung Das Fusionsprotein von RSV hat im Rahmen der Infektion wichtige Funktionen. Es induziert im Wirtsorganismus die Bildung neutralisierender Antikörper. Weiterhin besitzt es Bindungsvermögen an Heparinstrukturen auf dem Wirt und ist so in der Lage, unabhängig von anderen Oberflächenproteinen, die Infektion zu vermitteln. Schließlich leitet es die Fusion von Virushülle und Plasmamembran der Zielzelle ein. Essentiell für die Funktionstüchtigkeit des Fusionsproteins ist die proteolytische Spaltung durch Furin-ähnliche Proteasen an einem multibasischen Spaltmotiv. Furin ist ubiquitär vorhanden, so dass die Aktivierung von RSV-F in nahezu jeder Zelle, also auch in Zellkultur, erfolgt. Um einzelne Virusproteine des respiratorischen Synzytialvirus zu untersuchen, greift man meist auf ein Plasmid-Vektor-System zurück, mit dem Einzel- oder Koexpressionen von Virusproteinen durchgeführt werden können (HEMINWAY et al., 1994; PASTEY & SAMAL, 1997; TENG & COLLINS, 1998). Als Alternative zu diesem Verfahren wurde ein rekombinantes Sendai-Virus hergestellt, in dessen Genom das Gen für das Fusionsprotein von RSV zusätzlich eingebaut ist. Das entsprechende System wurde vor einigen Jahren im Bereich der SeV-Forschung etabliert, mit dessen Hilfe rekombinante, infektiöse Sendai-Viren aus Plasmid-kodierter cDNA hergestellt werden konnten (GARCIN et al., 1995). Sendai-Viren infizieren Mäuse und andere Kleinnager. Sie besitzen ebenso wie RSV ein Fusionsprotein, welches Antigen- und Fusionseigenschaften besitzt. Es wird allerdings nicht in jeder Zelle gespalten und damit aktiviert. Natürlicherweise wird es außerhalb der Wirtszelle von trypsinähnlichen Proteasen wie der Tryptase Clara in den Lungen von Mäusen aktiviert. In Zellkultur ist es notwendig, exogenes Trypsin bei Infektionsversuchen mit dem Sendai-Virus in das Medium zu geben. Es ist so möglich, bei dem rekombinanten Konstrukt das Sendai-Fusionsprotein nach Belieben durch Trypsin zu aktivieren. Die Infektionswege über das RSV-Fusionsprotein bzw. über das Sendai-Fusionsprotein lassen sich auf diese Weise voneinander unterscheiden. Als Kontrolle wurde anstelle des Gens für RSV-F das Gen für den Farbstoff DsRed eingebaut, welcher in Zielsetzung 31 der Natur von der Scheibenanemone Discosoma ssp. gebildet wird. Dieser Farbstoff wird zytosolisch exprimiert und soll das Sendai-Virus in seiner Funktion nicht beeinträchtigen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, dieses rekombinante Sendai-Virus zu analysieren und die Wirkungsweise des RSV-F im Zusammenhang mit einer SeV-Infektion zu untersuchen, speziell im Hinblick auf die Expression des Fremdgenes und auf dessen Funktionalität (Fusionseigenschaft, Rezeptorbindung). Das zusätzliche Fusionsprotein war ein chimäres Konstrukt, bei dem nur die Ektodomäne dem RSV-Fusionsprotein entstammte, der Transmembrananker und der zytoplasmatische Abschnitt aber dem SeV-Fusionsprotein. Es war zu untersuchen, ob die chimären Anteile des Fusionproteins wichtig waren für den Einbau in Sendai-Virionen. Der Einbau von Glykoproteinen mit multibasischer Spaltstelle in Sendai-Viren würde außerdem eine Vereinfachung zur Herstellung schwer amplifizierbarer Viren darstellen, da während der Virusvermehrung auf die Zugabe von Trypsin zur Aktivierung des SeVFusionsproteins verzichtet werden könnte. Dieser Aspekt wäre eine Hilfe bei der Entwicklung von Sendai-Virus-Vektoren für die Gentherapie. Auch im Hinblick auf einen Tierversuch ist dieses Konstrukt interessant. Es ist denkbar, mit diesem attenuierten Virus Mäuse zu infizieren und damit das RSV-F als Hauptantigen des respiratorischen Synzytialvirus im Mausmodell zu untersuchen. Da das Sendai-Virus kein humanpathogenes Potential besitzt, ist es denkbar, mit ihm RSV-Antigene in einen Wirtsorganismus zur Induktion einer AntikörperBildung einzuschleusen. Somit ließen sich weiterhin grundlegende Ergebnisse zur Entwicklung von Impfstoffen ermitteln. 3 3.1 Material Zelllinien In der vorliegenden Arbeit wurde mit den folgenden permanenten Monolayer-Zelllinien gearbeitet: Vero-Zellen Diese Zellen stammen aus dem Nierengewebe der Grünen Meerkatze (African green monkey kidney). Die etablierte Zelllinie wurde vom Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. BHK21-Zellen Hierbei handelt es sich um eine etablierte Zelllinie aus Nierengewebe von jungen syrischen Goldhamstern (baby hamster kidney). Sie stammt aus der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig. Katalognummer: DSM ACC 61 und wurde durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. MDCK-II-Zellen Ursprünglich stammt diese etablierte Zelllinie aus Nierengewebe von Hunden (Madin Darby Canine Kidney). Auch sie wurde durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. Material 3.2 33 Zellkulturmedien Medium für VERO-Zellen Edulb mit Antibiotikazusatz, hergestellt durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Hinzugefügt wurde vor Gebrauch 4% Fetales Kälberserum (1 h bei 56°C inaktivert), Fa. Biochrom KG, Berlin Medium für BHK21-Zellen bzw. für MDCK-II-Zellen EMEM (Earl’s Minimum Essential Medium), hergestellt durch das Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Hinzugefügt wurde vor Gebrauch 4% Fetales Kälberserum (1 h bei 56°C inaktivert) der Firma Biochrom KG, Berlin. Methylcellulose-haltiges Medium In einer 500 ml-Flasche mit einem Magnetrührstab wurden zunächst 4 g Methylcellulose autoklaviert. Dann wurden unter sterilen Bedingungen 500 ml EMEM bzw. Edulb hinzugegeben. Die Zutaten wurden etwa zwei Tage bei 4°C auf einem Magnetrührer miteinander vermengt. 34 3.3 Material Erythrozyten Hühnererythrozyten wurden aus der Klinik für Geflügel, Abteilung Wirtschaftsgeflügel, der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. 3.4 Viren Humanes respiratorisches Synzytialvirus (HRSV) Der Stamm Long wurde ursprünglich von Herrn Streckert, Universität Bochum, zur Verfügung gestellt. Rekombinante Sendai-Viren Der Stamm Fushimi (SeV D 52) wurde von Herrn Prof. Neubert, Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried, zur Verfügung gestellt. Die Konstrukte der drei rekombinanten Sendai-Viren rSeV-DsRed, rSeV-RSV-Fch und rSeVRSV-Fnat (vgl. Abbildung 6) wurden durch Herrn Dr. Zimmer, Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und durch Herrn Dr. Sascha Bossow, Max-PlanckInstitut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried, entwickelt und zur Verfügung gestellt. Die drei Transgene wurden jeweils über die Schnittstellen MlUI und BssHII in das Genom des Sendai-Virus zwischen die Genabschnitte für das P-Protein und für das M-Protein eingebaut. Die Abbildung 6 zeigt ein Schema der Genome für die drei verschiedenen Konstrukte. Die Nukleotidsequenz des chimären Fusionsproteins RSV-Fch des Virus rSeV-RSV-Fch ist im Anhang einzusehen. 35 Material 1.) 3‘ N P X M 1 2 RSV-Fch 2.) 3‘ N P X F HN L 5‘ 3 M F HN M F HN L 5‘ RSV-F 3.) 3‘ N P X L 5‘ DsRed Abbildung 6: Schema der Genome der drei rekombinanten Viren 1.) RSeV-RSV-Fch, rekombinantes Sendai-Virus mit Genabschnitt für die Ektodomäne von RSV-F (1), den Transmembrananker (2) und den zytoplasmastischen Abschnitt (3) des Sendai-F 2.) RSeV-RSV-Fnat, rekombinantes Sendai-Virus mit Genabschnitt für das gesamte, native RSV-F 3.) RSeV-DsRed, rekombinantes Sendai.Virus mit Genabschnitt für DsRed, einen Fluoreszenz-Farbstoff der Scheibenanemone Discosoma ssp. 36 3.5 Material Erstantikörper Anti-RSV-F (Mab Biosoft) Fa. Biosoft, Varilhes, Frankreich Anti-RSV-F (Mab Melero) zur Verfügung gestellt von Herrn José Antonio Melero, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien Anti-RSV-F (Mab Örvell) zur Verfügung gestellt von Herrn Claes Örvell, Karolinska Institutet, Department of Microbiology, Pathology + Immunology, Huddinge, Schweden Anti-RSV-F (Mab 4, 13, 19) zur Verfügung gestellt von Frau Geraldine Taylor, Institute for Animal Health, Compton, Vereinigtes Königreich Anti-MBP-F2 zur Verfügung gestellt von Herrn Dr. Zimmer, Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Sendai-Antiserum zur Verfügung gestellt von Herrn Dr. Zimmer, Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Anti-Sendai-HN zur Verfügung gestellt von Herrn Prof. Neubert, Max-PlanckInstitut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried Anti-Sendai-F zur Verfügung gestellt von Herrn Prof. Neubert, Max-PlanckInstitut für Biochemie, Abteilung Molekulare Virologie, Martinsried Anti-Parainfluenzavirus 1 Fa. DPC Biermann, Bad Nauheim 37 Material 3.6 Zweitantikörper Anti-Maus-POD Fa. DAKO, Hamburg Anti-Maus-FITC Fa. Amersham, Freiburg Anti-Kaninchen-POD Fa. Sigma, Steinheim Anti-Kaninchen-FITC Fa. Amersham, Freiburg 3.7 Kits Silver Stain Kit Fa. BIO-RAD, München BCA-Protein-Assay Fa. Pierce, Bonn 3.8 Enzyme Neuraminidase aus V. cholerae Fa. DADE BEHRING, Marburg Trypsin, acyteliert, aus bovinem Pankreas Fa. Sigma, Steinheim 3.9 Substrate/Marker Rainbow Marker Fa. Amersham, Freiburg AEC (5-Amino-9-ethylcarbazol) Fa. Sigma, Steinheim BM Chemoluminescence Blotting Substrate (POD) Fa. Roche, Mannheim 38 Material Super Signal® West Dura Extended Duration Substrate Fa. Pierce, Bonn 3.10 Chemikalien Acrylamidlösung 30% „rotiphorese® Gel 30“ Fa. Merck, Darmstadt Aminocapronsäure Fa. Sigma, Steinheim Amoniumpersulfat (APS) Fa. BIO-RAD, München Blocking-Reagenz Fa. Roche, Mannheim Bromphenolblau Fa. Merck, Darmstadt Calciumchlorid (CaCl2 x 2 H2O) Fa. Roth, Karsruhe Coomassie-Brilliantblau Fa. Merck, Darmstadt 1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-oktan (DABCO) Fa. Sigma, Steinheim 1,4-Dithiotreiol (DTT) Fa. Roth, Karlsruhe Dimethylsulfoxid (DMSO) Fa. Roth, Karlsruhe Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 x 12 H2O) Fa. Merck, Darmstadt Dimethylformamid (DMF) Fa. Merck, Darmstadt Essigsäure Fa. Roth, Karlsruhe Ethanol Fa. Merck, Darmstadt Fetales Kälberserum (FKS) Fa. Biochrom, Berlin Ganglioside, gereinigt, aus Rinderhirn Fa. Sigma, Steinheim Glycerin Fa. Roth, Karlsruhe Glycin Fa. Roth, Karlsruhe Isopropanol Fa. Roth, Karlsruhe Kaliumchlorid (KCl) Fa. Roth, Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Fa. Merck, Darmstadt Magnesiumchlorid (MgCl2 x 6 H2O) Fa. Roth, Karlsruhe Methylcellulose (2.000 centipodes) Fa. Sigma, Steinheim Mowiol 4-88 Fa. Calbiochem, Darmstadt Natriumacetat Fa. Merck, Darmstadt Natriumchlorid (NaCl) Fa. Roth, Karlsruhe 39 Material Natriumdodecylsulfat (SDS) Fa. Roth, Karlsruhe N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Fa. Roth, Karlsruhe Paraformaldehyd Fa. Fluka, Neu-Ulm Saccharose Fa. Roth, Karlsruhe Salzsäure Fa. Roth, Karlsruhe Stickstoff, flüssig Fa. Messer-Griesheim, Krefeld Tris-Hydroxymethylaminmethan (TRIS) Fa. Roth, Karlsruhe Tween-20 Fa. Roth, Karlsruhe Wasserstoffperoxid (H2O2), 30% Fa. Merck, Darmstadt 3.11 Puffer und Lösungen AEC (5-Amino-9-ethylcarbazol)-Lösung (1,85 ml) AEC-Puffer (0,05 M Natriumacetat, pH 5,0) 1,7 ml AEC-Subtrat (0,66% AEC in Dimethylformamid (DMF) 0,1 ml H2O2 3% 1 Tropfen (0,05 ml) 10 x SDS-Laufpuffer für Polyacrylamidgele SDS 10 g TRIS 30 g Glycin 144 g Mit H2O auf 1 l aufgefüllt 3% Paraformaldehyd (pH 7,4) 3 g Paraformaldehyd werden in 100 ml PBSM bei 80°C gelöst, steril filtriert und bei –20°C gelagert 40 Material 2 x SDS-Probenpuffer für Proteingele TRIS/HCl 100 mM SDS 4% Glycerin 20% Bromphenolblau 0,02% eingestellt auf pH 6,8 Anodenpuffer I für Semi-Dry-Western-Blot TRIS/HCl 300 mM Ethanol 20% eingestellt auf pH 9,0 Anodenpuffer II für Semi-Dry-Western-Blot TRIS/HCl 25 mM Ethanol 20% eingestellt auf pH 7,4 Kathodenpuffer für Semi-Dry-Western-Blot TRIS/HCl 25 mM Ethanol 20% Aminocapronsäure 40 mM eingestellt auf pH 9,0 1 M DTT-Lösung 3,09 g DTT wurden in 20 ml einem 0,01 M Natriumacetat-Puffer gelöst. 41 Material Mowiol Mowiol 4-88 12% Glycerin 30% 1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-oktan (DABCO) 2,5% TRIS/HCl 0,12 M eingestellt auf pH 8,5 Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) NaCl 8,00 g KCl 0,20 g Na2HPO4 x 12 H2O 1,15 g KH2PO4 0,20 g MgCl2 x 6 H2O 0,10 g CaCl2 x 2 H2O 0,132 g Reinstwasser ad 1 l pH 7,5 PBSM wie PBS, allerdings ohne CaCl2 und MgCl2, pH 7,5 PBSM 0,1% Tween-20 zu 1 l PBSM wurde 1 ml Tween-20 gegeben PBSM 0,05% Tween-20 zu 1 l PBSM wurden 0,5 ml Tween-20 gegeben 42 Material Glycin-Lösung (0,1 mol/l) Glycin 0,75 g PBSM 100 ml Sammelgellösung für Polyacrylamidgele (5 ml Ansatz) H2O 3,4 ml TRIS-HCl 1 M pH 6,8 0,63 ml Acrylamidlösung 30% 0,83 ml SDS 10% (in H2O) 50 µl APS 10% (in H2O) 50 µl TEMED 10 µl Trenngellösung (10%) für Polyacrylamidgele (10 ml Ansatz) H2O 4,0 ml TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8 2,5 ml Acrylanidlösung 30% 3,3 ml SDS 10% (in H2O) 100 µl APS 10% (in H2O) 100 µl TEMED 16 µl Coomassie-Färbelösung Coomassie-Brilliantblau 0,5 g Ethanol 200 ml konz. Essigsäure 50 ml H2O 250 ml 43 Material Entfärbelösung/Fixierlösung für Proteingele Ethanol 400 ml konz. Essigsäure 100 ml H2O 500 ml Saccharose-Gradient 60%ige Saccharose-Lösung: 6 g Saccharose zu 4 ml PBSM 50%ige Saccharose-Lösung: 5 g Saccharose zu 5 ml PBSM 20%ige Saccharose-Lösung: 2 g Saccharose zu 2 ml PBSM 3.12 Geräte und sonstige Materialien Immunfluoreszenz Deckgläschen Fa. Superior Marienfeld, Lauda-Königshofen Objektträger Fa. Roth, Karlsruhe Parafilm® Fa. Roth, Karlsruhe Mikroskope Leitz Lichtmikroskop Fa. Leitz, Wetzlar Fluoreszenzmikroskop Axiophot 2 Fa. Zeiss, Jena Pipetten und Pipettierhilfen Pipetten (Volumen 10 µl, 100 µl, 1000 µl) Fa. Eppendorf, Hamburg Accu-Jet® Pipettenhelfer Fa. Brand, Wertheim/Main VacuSafe Absaugsystem Fa. Integra Biosciences, Fernwald Pasteurpipetten aus Glas Fa. H. Jürgens, Hannover 44 Material Glaspipetten (Volumen 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml) Fa. H. Jürgens, Hannover Einmal-Pipettenspitzen (10 µl) Fa. Biozym, Hessisch Oldendorf Einmal-Pipettenspitzen (100 µl, 1000 µl) Fa. Ratiolab, Dreieich Einmal-Pipettenspitzen, gestopft (10 µl, 100 µl, 1000 µl) Fa. Biozym, Hessisch Oldendorf Aspirette® Fa. Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt SDS-Gelelektrophorese Gelgießvorrichtung Fa. von Keutz, Reiskirchen Gelträger und Kammer Fa. von Keutz, Reiskirchen Elektrophoresekammer Fa. von Keutz, Reiskirchen Kämme, Spacer Fa. von Keutz, Reiskirchen Spannungsquelle BIO-RAD Power Pac 200/300 Fa. BIO-RAD, München Waagen Elektron. Analysenwaage, Typ 1712 MP 8 Fa. Sartorius, Göttingen Sartorius Portable Waage Fa. Sartorius, Göttingen Wasserbäder Lauda A100 Fa. Lauda, Königshofen GFL Wasserbad Fa. GFL, Burgwedel Western Blot Filterpapier Fa. Schleicher & Schuell, Dassel Nitrocellulose-Transfer-Membran Fa. Schleicher & Schuell, Dassel 45 Material Transferkammer Fa. von Keutz, Reiskirchen Zellkultur große Kulturflaschen, 175 cm2, 650 ml Fa. Greiner, Frickenhausen mittlere Kulturflaschen, 75 cm2 Fa. Nunc, Wiesbaden 2 kleine Kulturflaschen, 25 cm Fa. Nunc, Wiesbaden 24-well-Platten Fa. Greiner, Frickenhausen Mikrotiterplatten (96-well) Fa. Greiner, Frickenhausen Kryoröhrchen Fa. Greiner, Frickenhausen Neubauer-Zählkammer Fa. La fontaine, Forst Petrischalen 145/20 Fa. Greiner, Frickenhausen Mikrotiterplatten (96 well) U-Form Fa. Nunc, Wiesbaden CO2-Brutschrank Fa. Heraeus, Osterode Strata Cooler® Cryo Preservation Module Fa. Stratagene, Niederlande Zentrifugation Ultra-Zentrifuge L8-70M und Rotoren Fa. Beckman, München Zentrifugenröhrchen Ultra Clear, 13 x 51 mm Fa. Beckman, München Polyallomer, 25 x 89 mm Fa. Beckman, München Spritze Omnifix®-F 1 ml Fa. Braun, Melsungen Kanülen Fa. Braun, Melsungen Zentrifugenröhrchen 15 ml, 50 ml Fa. Greiner, Frickenhausen Tischzentrifugen (5417R, 5417C) Fa. Eppendorf, Hamburg Megafuge 1,0R Fa. Heraeus, Hamburg 46 Material sonstige Geräte ChemiDocTM System Fa. BIO-RAD, München ELISA Reader, Spectra SLT Fa. TECAN, Crailsheim Kühl- und Gefriergeräte Fa. Liebherr, Lientz Autoklav Webeco Fa. H. Jürgens, Hannover pH-Meter Fa. H. Jürgens, Hannover RCT basic Magnetrührer Fa. IKA Labortechnik, Staufen Schwenktisch 3012 Fa. GFL, Burgwedel Thermoblock Fa. Liebisch, Bielefeld Thermomixer Kompakt Fa. Eppendorf, Hamburg 4 Methoden 4.1 4.1.1 Zellkulturen Passagieren von MDCK II Zellen MDCK-II-Zellen wurden in EMEM, versetzt mit Antibiotikalösung und 4% FKS, kultiviert. Die Passagierung erfolgte im Drei- bzw. Viertagesrhythmus in 75 cm2-Kulturflaschen. Der adhärente Zellrasen wurde zweimal zwei Minuten lang mit PBSM gewaschen. Nach Entfernen der Waschflüssigkeit wurden die Zellen zwei Minuten lang mit 10 ml Trypsin inkubiert. Anschließend wurden 9 ml Trypsin abgenommen und die Kulturflasche für etwa 15 Minuten mit dem verbleibenden 1 ml in den Brutschrank (37°C, 5% CO2-Begasung) gestellt. Die abgelösten Zellen konnten dann mit 10 ml Nährmedium resuspendiert werden. Von dieser Zellsuspension wurden 0,5 ml zusammen mit 20 ml neuem Kulturmedium in die Kulturflasche gegeben (1:20 Umsetzung). Diese wurde bei 37°C und 5% CO2-Begasung inkubiert. Die restlichen abgelösten Zellen konnten für Versuche genutzt werden. 4.1.2 Passagieren von Vero-Zellen Die Vero-Zellen wurden in Edulb, versetzt mit Antibiotikalösung und 4% FKS, kultiviert. Die Passage erfolgte analog zu den MDCK-II-Zellen, allerdings genügte eine Trypsinierungszeit von 10 Minuten zum Ablösen der Zellen. Die Umsetzung erfolgte ebenfalls 1:20. 4.1.3 Passagieren von BHK21-Zellen BHK21-Zellen wurden in EMEM, versetzt mit Antibiotikalösung und 4% FKS, kultiviert. Die Passagierung erfolgte im Drei- bzw. Viertagesrhythmus in 75 cm2-Kulturflaschen. Zum Umsetzen wurden dem Zellrasen nach Verwerfen des gebrauchten Mediums 10 ml Trypsin zugefügt, die Kulturflasche wurde kurz geschwenkt und sogleich das Trypsin wieder 48 Methoden abgegossen. Dann wurde etwa 1 ml Trypsin zu den Zellen gegeben und 7 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur auf diesen belassen. Die abgelösten Zellen wurden mit 10 ml Nährmedium resuspendiert und wie die beiden anderen Zelllinien umgesetzt. 4.1.4 Anlegen von Gefrierkulturen und Auftauen von Zellen Es wurden Gefrierkulturen zur Konservierung der Zelllinien angelegt. Die trypsinierten Zellen wurden in kaltem EMEM mit 10% FKS und 10% DMSO resuspendiert und zügig in einem Isopropanol-Kühlbehälter in eine Umgebungstemperatur von –80°C verbracht. Durch diesen Spezialbehälter war ein schonendes Gefrieren gewährleistet. Zum Auftauen wurden die Gefrierkulturen in der Hand erwärmt und 5 Minuten bei 200 rpm sedimentiert. Anschließend wurden sie in 20 ml entsprechendem Medium resuspendiert und, wie oben ausgeführt, kultiviert. Nach 24 Stunden war ein Mediumwechsel notwendig. Soweit nicht anders angegeben, wurden die Zellen zur Kultivierung oder zur Inkubation mit Antikörpern etc. bei 37°C und einer 5%igen CO2-Begasung gehalten. 4.2 Vermehrung von Virus in Zellkultur Zur Vermehrung von Viren in Zellkultur wurden MDKC-II-Zellen einen Tag vor der Infektion mit Virusmaterial in mittlere Kulturflaschen (75 cm2) und in einem Volumen von jeweils 20 ml EMEM mit 4% FKS ausgesät. Am Folgetag sollte die Grundfläche der Flasche zu fast 100% bewachsen sein. Das Medium wurde dann verworfen, und die Zellen wurden dreimal mit etwa 10 ml PBS gewaschen. Das Waschen sollte hier sicherstellen, dass kein restliches Kälberserum mit den Viren um Rezeptoren auf der Zelloberfläche konkurriert. Es wurden 2,5 ml EMEM ohne FKS zusammen mit 100 µl (ca. 104 PFU/ml) Virusmaterial (rSeV-DsRed, rSeV-RSV-Fch oder rSeV-RSV-Fnat) in die Kulturflasche gegeben. Diese Methoden 49 wurde auf einem Schüttler für eine Stunde im Brutschrank bei 37°C gelagert. Anschließend wurde das virushaltige Medium abgegossen und 20 ml EMEM mit 1 µg/ml acyteliertem Trypsin in die Flasche gefüllt. Das Trypsin diente zur Aktivierung des Sendai-Fusionproteins. Es wurden außerdem Virusstocks gezüchtet, denen kein Trypsin beigefügt wurde, die also nicht aktiviert wurden. In allen Fällen wurde als Kontrolle eine kleine Kulturflasche mit MDCK-II-Zellen mitgeführt, denen kein Virus zugesetzt wurde. Nach zwei bzw. drei Tagen wurde der Virusgehalt mit Hilfe des Hämagglutinationstestes überprüft und das Erscheinungsbild der Zellen unter dem Lichtmikroskop betrachtet. Die Titer lagen bei 24 bis 27 HAU/ml. Gegenüber den Kontrollzellen waren jeweils geringgradige zytopathische Effekte durch Ablösung einiger Zellen vom Boden der Kulturflasche zu erkennen. Die Virusernte erfolgte am zweiten oder dritten Tag aus dem Überstand der MDCK-II-Zellen. Dazu wurde der Überstand, also etwa 20 ml, in 50 ml-Zentrifugenröhrchen gefüllt und mit 2 ml FKS versetzt. Es folgte ein 10 Minuten langer Zentrifugationschritt bei 4°C und 2.000 rpm zur Abtrennung von zellulären Bestandteilen. Darauf wurde der Überstand zu Aliquots à 1 ml in Kryoröhrchen pipettiert. Abschließend folgte das Schockgefrieren mit flüssigem Stickstoff bei –196°C und die Lagerung des Virus bei –80°C. Später wurde der Virustiter mit dem Immunoplaquetest ermittelt. Er schwankte unter den Viren und innerhalb einer Spezies von 104 bis 107 PFU/ml. 4.3 Hämagglutinationstest (HA-Test) Der HA-Test wurde in einer Mikrotiterplatte mit U-förmigen Vertiefungen durchgeführt. Die Spalten 2 bis 12 wurden mit 50 µl PBSM beschickt, in die erste Spalte wurden 100 µl der Viruslösung gegeben, also Überstand von virusinfizierten Zellen. Von der Virussuspension in Spalte 1 wurden 50 µl in Spalte 2 überführt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt. Durch Weitergabe von 50 µl Suspension von Spalte 2 in die nächste und entsprechend in die weiteren entstand eine geometrische Reihe der Virusverdünnung. 50 Methoden In jede Vertiefung wurden 50 µl einer 0,5%igen Hühnererythrozyten-Suspension pipettiert und die Mikrotiterplatte darauf in den Kühlschrank gestellt. Nach 60 Minuten konnte die Hämagglutination abgelesen werden. Eine Agglutination war durch eine gleichmäßige Verteilung der Erythrozyten zu erkennen, während nicht agglutinierte Zellen sedimentierten und einen scharf umrissenen Punkt am Boden der Vertiefung bildeten. Der in Hämagglutinationseinheiten (HAU/ml) angegebene Titer stellte den reziproken Wert der höchsten Verdünnung dar, bei der eine vollständige Agglutination zu beobachten war. 4.4 Fixieren von Zellen Die Fixierung wurde an adhärenten Zellen direkt auf Kulturplatten oder auf Deckgläschen in Kulturplatten vorgenommen. Die Zellen wurden zweimal mit PBSM gewaschen. Dann wurde für zwanzig Minuten 3%iges Paraformaldehyd auf die Zellen gegeben. In einer Mikrotiterplatte wurden 50 µl je Vertiefung, in einer 24-well-Platte wurden 250 µl je Vertiefung verwendet. Nach der Fixierung wurde das Paraformaldehyd abgenommen, und die Zellen wurden mit einer Glycin-Lösung gewaschen. Schließlich folgte eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur mit der Glycin-Lösung, die darauf abgenommen wurde. Es folgten Inkubationsschritte mit Antikörpern. 4.5 Immunoplaquetest Am ersten Tage wurden zunächst 100 µl BHK 21-Zellen mit einer Konzentration von 185.000 Zellen pro Milliliter, suspendiert in EMEM und 4% FKS, in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben. Methoden 51 Der Zellrasen war am zweiten Tag zu nahezu 100% dicht gewachsen. Die zu titrierenden Virusproben wurden zügig aufgetaut. Von den Proben wurden dann zwei Verdünnungsreihen mit zehnfachen Verdünnungsschritten in Reihen von 6 Kahn-Röhrchen angelegt. In jedes Röhrchen wurden 450 µl EMEM vorgelegt. In das erste Röhrchen wurden 50 µl Virussuspension pipettiert und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt. Mit einer neuen Pipettenspitze wurden 50 µl Inhalt aus Röhrchen 1 in Röhrchen 2 weitergegeben und erneut gemischt. So wurde bis Röhrchen 6 verfahren. Es entstand somit eine geometrische Reihe der Virusverdünnung. Die Mikrotiterplatten wurden aus dem Brutschrank genommen und das Medium wurde abgenommen. Je Stufe einer Verdünnungsreihe wurden zwei Vertiefungen mit je 50 µl der Virussuspension beschickt. Es wurde von der höchsten Verdünnungsstufe zur niedrigsten vorgegangen. Pro Mikrotiterreihe wurde eine Vertiefung als Zellkontrolle mit 50 µl EMEM versehen. Somit hatte man für eine Virusprobe einen vierfachen Ansatz einer Verdünnungsreihe von 101 bis 106. Für etwa zwei Stunden wurden die Mikrotiterplatten dann bei 37°C und CO2-Begasung auf einem Kippschwenker in einen Brutschrank gestellt. Anschließend wurden in jede Vertiefung 200 µl Methylcellulose-haltiges Medium gegeben, ohne vorher das Medium abzunehmen. Die Methylcellulose verhinderte eine Ausbreitung neu entstandener Viruspartikel über das Medium. Dann wurden die Zellen weitere zwei Tage im Brutschrank inkubiert. Am vierten Tag wurde der Überstand von der Mikrotiterplatte verworfen und die Zellen wurden sodann zweimal mit PBSM gewaschen. Es schloss sich ein Fixieren der Zellen mit 3%igem Paraformaldehyd an (siehe dort). Es folgte die Anfärbung der fixierten Zellen. Als Erstantikörper wurde polyklonales gegen Sendai-Virus gerichtetes Antiserum aus dem Kaninchen verwendet. Aufgrund der Kreuzreaktivität ließ sich der Test ebenso mit polyklonalem Serum gegen Parainfluenzavirus 1 aus der Ziege durchführen. Das gegen Sendai-Virus gerichtete Antiserum wurde 1:2000 mit PBSM verdünnt und zu 50 µl in jede Vertiefung pipettiert. Die Inkubation erfolgte 90 Minuten auf einem Schwenker bei Raumtemperatur. 52 Methoden Danach wurde der Überstand entfernt und die Zellen dreimal mit PBSM gewaschen. Als Zweitantikörper wurde Anti-Kaninchen, Peroxidase-gekoppelt, bzw. Anti-Ziege, Peroxidasegekoppelt, verwendet. Dieser wurde 1:2000 in PBSM verdünnt und zu 50 µl auf die Zellen gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde damit eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schwenker inkubiert. Es wurde dann erneut dreimalig mit PBSM gewaschen. Nun wurden 25 µl des AEC-Substrates in die Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 12 Minuten bei Raumtemperatur geschwenkt. Dann wurde das Substrat abgenommen und die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die infizierten Zellen waren karminrot angefärbt. Mit dem Ergebnis konnte der Virustiter mit Hilfe der Schätzmethode nach Kärber (KÄRBER, 1931) kalkuliert werden. 4.6 Infektion von Zellkultur Um die Expression der Transgene zu überprüfen und Hinweise auf ihren Einbau in die Virionen zu erhalten, wurden Infektionsversuche durchgeführt. BHK21-Zellen wurden mit einer Konzentration von 185.000 Zellen/ml in einem Volumen von 1 ml in Vertiefungen einer 24-well-Platte auf Deckgläschen pipettiert. Am nächsten Tage waren die Zellen nahezu konfluent. Die Platten wurden dreimal mit Medium gewaschen und mit 1000 PFU Virusmaterial in 200 µl Medium je Vertiefung beschickt. Für eine Stunde wurden sie auf einem Kippschwenker in den Inkubator gestellt. Anschließend wurde das Inokulum abgenommen, und sie wurden erneut dreimal mit Medium gewaschen. Dann wurden die Vertiefungen mit 1 ml Medium und ggf. 1 µg/ml acetyliertem Trypsin befüllt. So wurden die Kulturplatten für zwei Tage im Brutschrank inkubiert. Methoden 4.7 53 Immunfluoreszenz Nach Infektion mit Virus und einer zweitägigen Inkubation erfolgte eine Fixierung mit 3%igem Paraformaldehyd. Um Virus oder bestimmte Virusproteine nachzuweisen, wurden diese mit spezifischen Erstantikörpern, mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)- gekoppelten Zweitantikörpern und mit Hilfe der Fluoreszenz-Mikroskopie sichtbar gemacht. Als Erstantikörper wurde polyklonales gegen Sendai-Virus gerichtetes Antiserum aus dem Kaninchen (1:500) bzw. ein Antikörper-Pool gegen das Fusionsprotein von RSV (1:100) verwendet. Für den Pool wurden der kommerzielle RSV-F-Antikörper Mab Biosoft und die monoklonalen RSV-F-Antikörper Mab Melero und Mab Örvell benutzt. Alle drei Antikörper stammten aus der Maus und wurden jeweils 1:100 gemeinsam in PBSM verdünnt. Als Zweitantikörper wurden FITC-gekoppelte Immunglobuline, gegen Kaninchen-Antikörper gerichtet bzw. gegen Maus-Antikörper gerichtet, eingesetzt. Beide wurden jeweils 1:100 verdünnt. Es wurde zunächst eine feuchte Kammer hergerichtet. Dazu wurde eine Glas-Petrischale mit Filterpapier ausgelegt und mit etwas destilliertem Wasser getränkt. Darauf wurde ein nach Bedarf großer Streifen Parafilm® positioniert. Der Erstantikörper wurde in PBSM verdünnt und je vorhandenem Deckgläschen zu einem 25 µl fassenden Tropfen auf den Parafilm® pipettiert. Die Deckgläschen mit den fixierten und gewaschenen Zellen wurden mit der bewachsenen Seite aus der Kulturplatte auf den Tropfen gelegt. Die Inkubation mit dem ersten Antikörper erfolgte 90 Minuten bei Raumtemperatur. Danach wurden die Deckgläschen wieder in die Kulturplatte überführt und dreimal mit PBSM gewaschen. Der Zweitantikörper wurde in PBSM verdünnt, darauf folgte eine kurze Zentrifugation in der Tischzentrifuge. Aus dem gewonnenen Überstand wurden je Deckgläschen 25 µl auf einen neu bereitgelegten Parafilm® in eine feuchte Kammer pipettiert. Auf diese Tropfen mit dem Zweitantikörper wurden die Deckgläschen mit der bewachsenen Seite nach unten gelegt. Die Inkubation erfolgte eine Stunde bei Raumtemperatur in Dunkelheit. Danach wurden die Deckgläschen ein letztesmal in die Kulturplatte gelegt und dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. 54 Methoden Zum Ende wurde ein Tropfen circa 37°C warmes Mowiol mit einer 1000 µl-Pipette auf einen Objektträger gegeben. Auf diese Mowiol-Tropfen wurden abschließend die Deckgläschen mit der bewachsenen Seite nach unten gelegt. Die fixierten und gefärbten Zellen konnten nun bei 4°C gelagert und am Fluoreszenzmikroskop untersucht werden. 4.8 Virusreinigung Für die Virusreinigung wurden je Virus 8 große Petrischalen aus Plastik verwendet und auf diesen MDCK-II-Zellen ausgesät, so dass die Schalen am Folgetag nahezu konfluent mit Zellen besiedelt waren. Die Schalen wurden dann dreimal mit jeweils etwa 10 ml PBS gewaschen. Es wurde Virusmaterial mit einer m.o.i. (multiplicity of infection) von 1, d.h. eine plaquebildende Einheit (plaque forming unit, PFU) pro vorhandener Zelle, in die Petrischalen gegeben. Diese Virusmenge wurde in einem Volumen von 2,5 ml EMEM appliziert. Die Schalen wurden damit auf einem Kippschwenker zwei Stunden lang in den Brutschrank (37°C) gestellt. Im Anschluss wurde das virushaltige Medium abgenommen und die Schale zweimal mit PBS gewaschen. Nun wurden 25 ml EMEM mit 0,5% FKS und 1 µg/ml acyteliertem Trypsin in die Schalen gegeben. Dann wurden die Zellen zwei Tage bei 37°C inkubiert. Zur weiteren Bearbeitung wurde der Infektionsüberstand nach diesen zwei Tagen abgenommen und in 50 ml-Zentrifugenröhrchen gefüllt. Zum Abzentrifugieren der Zelltrümmer wurde ein 15 Minuten langer Zentrifugationsschritt bei 4°C und 4.000 rpm gewählt. Anschließend wurde der Überstand in Zentrifugenröhrchen für die Ultrazentrifuge überführt und nun in der Ultrazentrifuge für eine Stunde bei 4°C und 27.000 rpm sedimentiert. Danach wurde der Überstand abgekippt, und das pelletierte Virusmaterial konnte im Zentrifugenröhrchen kurz antrocknen. Schließlich wurde das Pellet in 450 µl PBSM aufgenommen und auf einen Saccharosegradienten in ein kleines Probenröhrchen (ultra clear) für die Ultrazentrifuge gegeben. Am Boden des Röhrchens befand sich ein Kissen von 0,5 ml einer 60%igen Saccharose-Lösung. Darüber war mit einem Gradientenmischer aus einer 20%igen und einer 50%igen Saccharose-Lösung ein Methoden 55 kontinuierlicher, insgesamt 3,5 ml umfassender Saccharosegradient geschaffen worden. Es folgte eine zweistündige Zentrifugation in der Ultrazentrifuge bei 4°C und 36.000 rpm. Das Probenröhrchen wurde danach in ein Stativ gehängt und mit einer gerichteten Lichtquelle angeleuchtet. Das Virusmaterial zeigte sich jeweils als grau-milchige Bande in der Mitte des Röhrchens. Dies wurde mit Hilfe einer Kanüle und einer 1 ml-Spritze abgesaugt und in ein neues kleines Probenröhrchen für die Ultrazentrifuge überführt. Dazu wurden 3,5 ml PBSM gegeben. Es schloss sich ein einstündiger Waschschritt bei 4°C und 36.000 rpm in der Ultrazentrifuge an. Der Überstand wurde danach verworfen. Das Pellet des gereinigten Virusmaterials wurde kurz getrocknet und in 100 µl PBSM aufgenommen. Es wurde dann bei –20°C gelagert und später die Proteinkonzentration mittels BCA-Test gemessen. 4.9 Proteinbestimmung im BCA-Test Der Test zur Bestimmung des Proteingehaltes von gereinigtem Virus wurde mit dem BCATest-Kit der Firma Pierce durchgeführt. Der beiliegende Albuminstandard wurde mit Reinstwasser auf die Endkonzentrationen von 200, 400, 600, 800, 1000 und 1200 µg/ml gebracht. Dann wurden jeweils 10 µl dieser Verdünnungen in einem Doppelansatz in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit flachem Boden gegeben. Als Leerwert wurden zwei Vertiefungen mit 10 µl Reinstwasser befüllt. Die Proteinprobe wurde beispielsweise in Verdünnungen von 1:10, 1:100 und 1:1000 zu 10 µl in einem Doppelansatz in andere Vertiefungen pipettiert. Nun wurden die beiden Komponenten der beiliegenden Substratlösung angesetzt. Die fertige Substratlösung wurde dann zu 200 µl je Vertiefung auf die Mikrotiterplatte gegeben. Es wurde durch Auf- und Abpipettieren sofort gemischt. Dann wurde die Platte mit einem Deckel 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die enthaltenen Proteine bildeten in der alkalischen Lösung mit Cu2+-Ionen einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die violette Farbe entstand dadurch, dass die Cu2+-Ionen zu Cu+-Ionen reduziert wurden und mit Bicinchonininsäure (BCA) einen Komplex bildeten. 56 Methoden Die Messung der Extinktionen erfolgte im ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 570 nm. Für die Probenextinktion war es dann ausschlaggebend, dass diese im Bereich der Standardwerte lag. Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe der Standards berechnet. 4.10 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese In der diskontinuierlichen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDSPAGE) wurden Proteine aufgetrennt (LAEMMLI, 1970). Dazu wurde mit Mini-Gelen (60 mm x 80 mm x 0,75 mm) gearbeitet. Nach Zusammenbau der Gelträger wurden diese zunächst mit Trenngelansatz bis etwa 2 cm unter den oberen Rand der Glasplatten befüllt. Bis zum Erstarren wurde das Gel mit Wasser oder Isopropanol beschwert, um einen geraden oberen Rand zu gewährleisten. Nach Erstarren des Trenngeles wurde die überstehende Flüssigkeit abgegossen und etwa 2 ml des Sammelgelansatzes daraufgegeben. Unverzüglich wurde dann der Plastikkamm zum Ausformen der Taschen (slots) oben in die Vorrichtung gesteckt. Das fertige Gel wurde in die Trägerkammer gesetzt. Die Pufferreservoire wurden mit SDSLaufpuffer befüllt. Mit einer feinen Spritze konnten die Proben in die Geltaschen gefüllt werden. Die zu untersuchenden Proteingemenge wurden in 20 µl 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen. Sollten reduzierende Bedingungen geschaffen werden, wurden 2 µl DTT hinzugegeben. Diese Proben wurden drei Minuten lang bei 95°C erhitzt und vor dem Auftragen gut gemischt. Leerstehende Taschen wurden mit reinem 2x SDS-Probenpuffer befüllt. Die Apparatur wurde an eine Spannungsquelle angeschlossen. Zunächst wurde eine Spannung von 80 V eingestellt. Nachdem die Lauffront in das Trenngel übergegangen war, wurde die Spannung auf 140 V erhöht. Die Spannung wurde noch vor Austritt der Lauffront aus den Gelen abgenommen. Anschließend wurden die aufgetrennten Proteine im Western Blot auf eine Membran übertragen. Methoden 57 4.11 Western Blot, Semi-Dry-Blot von Proteinen Der Semi-Dry Western Blot (KHYSE-ANDERSON, 1984) wurde durchgeführt, um Proteinbanden aus dem Polyacrylamidgel (Mini-Gel, 8 cm x 6 cm) auf eine NitrocelluloseMembran zu übertragen. 5 bis 10 Minuten vor der Durchführung wurden 18 Lagen Filterpapier in der Größe des Mini-Gels zugeschnitten und mit Puffer getränkt. 6 Lagen wurden in Anodenpuffer I gelegt, 3 Lagen wurden mit Anodenpuffer II getränkt und 9 Lagen mit dem Kathodenpuffer. Direkt vor Versuchsbeginn wurde ein Stück Nitrocellulose mit den gleichen Ausmaßen mit destilliertem Wasser benetzt. Die Transferkammer wurde in nachstehender Reihenfolge bestückt: Auf den Boden der Kammer wurden die 6 Filter mit Anodenpuffer I gelegt, darauf die 3 Filter mit Anodenpuffer II, dann folgte die wasserbenetzte Nitrocellulose, das aus der Elektrophoresekammer entnommene Mini-Gel und schließlich die 9 Filter mit Kathodenpuffer. Luftblasenbildung wurde vermieden. So konnte die Kammer geschlossen werden. Je Quadratzentimeter Oberfläche der Nitrocellulose wurde an der Spannungsquelle nun eine Stromstärke von 0,8 mA eingestellt. Für eine Nitrocellulose waren also 38 mA notwendig. Der Transfer wurde eine Stunde lang durchgeführt. Nach dem Durchlauf wurde der Marker auf der Nitrocellulose gekennzeichnet und die Membran sodann in eine Schale mit 15 ml Blocking Reagenz überführt. Hierin wurde sie über Nacht bei 4°C auf einen Schüttler gestellt. Die freien Bindungsstellen auf der Membran wurden damit abgesättigt. 4.12 Immunchemische Detektion von Proteinen Die Proteinbanden auf der Nitrocellulose wurden immunchemisch mit spezifischen Erstantikörpern und Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörpern detektiert. Die Peroxidase konnte ein später zugefügtes Substrat umsetzen und so die Proteine für das ChemiDocTM System sichtbar machen. Als erster Antikörper wurde zum einen polyklonales gegen Sendai- 58 Methoden Virus gerichtetes Antiserum aus dem Kaninchen (1:5000) verwendet. Zum anderen kam ein gegen die F2-Untereinheit von RSV gerichteter Antikörper (Anti-MBP-F2), ebenfalls aus dem Kaninchen, in einer Konzentration von 1:2000 zum Einsatz. Zweitantikörper waren in beiden Fällen gegen Kaninchen reagierende und mit Peroxidase gekoppelte Immunglobuline (1:2000). Zur Anfärbung der Proteinbanden wurde die Nitrocellulose aus dem Blocking Reagenz genommen. Darauf wurde die Membran zunächst dreimal für 10 Minuten mit PBSM-Tween 0,1% gewaschen. Der Erstantikörper wurde in PBSM verdünnt und in einer Petrischale auf die gut abgetropfte Nitrocellulose pipettiert. Darauf wurde ein entsprechend großes Stück Parafilm® gelegt. Die Inkubation dauerte eine Stunde lang. Dann wurde die Membran erneut dreimal mit PBSM-Tween 0,1% gewaschen. Es schloss sich eine Inkubation mit einem Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörper an. Das Einwirken des Zweitantikörpers erfolgte analog zum ersten für eine Stunde. Es folgte eine erneute dreimalige Waschung. Zum Abschluss wurde die Membran gut abgetropft und in eine Petrischale gelegt. Es wurde nach den Angaben des Herstellers angesetztes „BM Chemoluminescence Blotting Substrate (POD)“ der Firma Roche auf die Membran geträufelt, welches etwa eine Minute auf der Membran verblieb. Das Substrat wurde anschließend abgeschüttelt und die Membran in eine doppelseitige Folie gelegt. So konnte die Nitrocellulose im ChemiDocTM System ausgewertet werden. Waren keine Banden zu erkennen, wurde auf das sensitivere Substrat Super Signal® der Firma Pierce zurückgegriffen. Nachdem die Membran kurz mit PBSM gewaschen wurde, konnte die abgetropfte Nitrocellulose in einer Petrischale mit etwa 1 ml Super Signal® benetzt werden, welches dann 5 Minuten auf der Membran verblieb. Anschließend erfolgte eine erneute Auswertung im ChemiDocTM System. Methoden 59 4.13 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen 4.13.1 Coomassie-Färbung Das Mini-Gel wurde aus der Elektrophorese-Kammer genommen und auf einem Schwenktisch für 30 Minuten in ein Coomassie-Färbebad gelegt. Anschließend wurde das Gel etwa eine Stunde in einem Entfärbebad geschwenkt, bis der Hintergrund entfärbt und die Proteinbanden durch das gebundene Coomassie-Brilliantblau deutlich sichtbar waren. Danach wurde das Gel gewässert, zwischen zwei Zellophanfolien (z.B. Einmach-Haut) gelegt und über Nacht in einer Spannvorrichtung getrocknet. 4.13.2 Silberfärbung Eine sensitivere Methode als die Coomassie-Färbung zur Sichtbarmachung von Proteinen ist die Silberfärbung (DZANDU et al., 1984; MERRIL et al., 1979, 1981). Sie ist auch in der Lage, Proteinmengen unter 1 µg pro Bande zu detektieren. Es wurde in diesem Fall das Silver Stain Kit der Firma BIO-RAD benutzt, das speziell zur Färbung von Glykoproteinen entwickelt worden war. Im weiteren wurden die Anweisungen auf der Packungsbeilage befolgt. 4.14 Wachstumskinetik Zur Analyse des Wachstumsverhaltens der drei Konstrukte wurde eine Kinetik über einen Zeitraum von 48 Stunden erstellt. BHK21-Zellen wurden einen Tag vor der Infektion BHK21-Zellen in 12-well-Platten im Doppelansatz ausgesät, so dass sie am nächsten Tag konfluent waren. Die Platten wurden zunächst dreimal mit Medium gewaschen. Das Virusmaterial wurde dann mit einer m.o.i. von 3 in einem Volumen von 300 µl EMEM auf die Zellen gegeben. Da in diesem Versuch der Überstand untersucht werden sollte, wurden Virusstocks verwendet, die unter Trypsingabe gezüchtet worden waren. Eine Infektion der 60 Methoden Zellen war also in allen Fällen sichergestellt. Die Aktivierung des Sendai-Fusionsproteins und damit das Infektionsvermögen neu gebildeter Virionen hing dann im weiteren von einer Trypsingabe in diesem Versuch ab. Die Platte wurde eine Stunde bei 37°C auf einen Kippschüttler gestellt. Anschließend wurde das Inokulum abgenommen und 1,5 ml Medium in die Vertiefungen gegeben. Die Probenansätze, die unter Trypsinwirkung beobachtet werden sollten, wurden mit 1 µg/ml Trypsin versetzt. Es wurden dann 1, 8,5, 16,5, 24, 32, 40,5 und 47,5 Stunden nach Inokulationsbeginn jeweils 250 µl Überstand aus den Vertiefungen entnommen, mit 20 µl FKS versetzt, in flüssigem Stickstoff bei –196°C schockgefroren und in eine Umgebungstemperatur von –80°C verbracht. Der entnommene Überstand wurde in allen Fällen durch neues Medium mit bzw. ohne Trypsin substituiert und die Platten nach der Entnahme zurück in den Brutschrank gestellt. Die Virusproben wurden später im Immunoplaquetest analysiert. 4.15 Virusneutralisationstest Zur Bestimmung eines geeigneten neutralisierenden Antikörpers gegen das Fusionsprotein von RSV wurde der Virusneutralisationstest durchgeführt. Es kamen fünf verschiedene Antikörper zum Einsatz: Mab 4, Mab 13, Mab 19 von Geraldine Taylor aus Compton (Vereinigtes Königreich), der kommerzielle Antikörper Mab Biosoft und der Antikörper Mab Örvell. In die Vertiefungen der Spalten 2 bis 12 einer Mikrotiterplatte wurden 50 µl EMEM mit 4% FKS vorgelegt. In die Spalte 1 wurden 100 µl der 1:100 in EMEM verdünnten Antikörper gegeben. Dann wurden 50 µl der Antikörper-Suspension von Spalte 1 in Spalte 2 verbracht und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Durch Überführen von 50 µl aus der 2. Spalte in die nächste und entsprechend in die weiteren entstand eine geometrische Verdünnungsreihe der zu testenden Antikörpergemische. Die Vertiefungen der Spalten 12 erhielten als 61 Methoden Infektionskontrollen keine Antikörper. Es wurden vier Parallelreihen pro Antikörper angesetzt. Jede Vertiefung erhielt nun 50 µl einer HRSV-Virussuspension mit einem Titer von 100 PFU (plaque forming units). Die Inokulation mit dem Virus dauerte eine Stunde bei 37°C. Anschließend wurden 50 µl einer Suspension von BHK21-Zellen in EMEM mit 4% FKS und einer Konzentration von 200.000 Zellen/ml in jede Vertiefung gegeben. Die Infektion wurde für zwei Tage bei 37°C durchgeführt. Nach zwei Tagen wurde der Überstand der Mikrotiterplatte abgenommen und die Platte einmal mit PBSM gewaschen. Die von der Waschlösung befreite Platte wurde für 7 Stunden in eine Umgebungstemperatur von 80°C in einen Ofen gestellt. Damit wurden die Zellen in der Kulturplatte hitzefixiert. Anschließend wurde die Platte mit PBSM Tween 0,05% gewaschen. Es erfolgte eine Detektion mit einem Pool aus Antikörpern, gegen das Fusionsprotein von RSV gerichtet. Für den Pool wurden die monoklonalen Antikörper Mab Biosoft, Mab Melero und Mab Örvell benutzt. Alle drei Antikörper stammten aus der Maus und wurden jeweils 1:1000 gemeinsam in PBSM verdünnt. Die Inkubation dauerte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Jede Vertiefung erhielt dafür 50 µl der Antikörper-Suspension. Danach wurde die Platte dreimal mit PBSM-Tween 0,05% gewaschen. Es folgte die Inkubation mit einem Peroxidasegekoppelten Zweitantikörper, ebenfalls eine Stunde bei Raumtemperatur und in einem Volumen von 50 µl pro Vertiefung. Die Platte wurde wieder dreimal gewaschen. Abschließend wurde das Peroxidase-Substrat AEC für 12 Minuten in einem Volumen von 50 µl in die Vertiefungen gegeben. So konnten die infizierten Zellen mit einer karminroten Anfärbung sichtbar gemacht werden. Die Auswertung orientierte sich an der Infektionskontrolle, deren durchschnittliche Anzahl an sichtbaren Plaques als Maßstab für die restlichen Antikörper-behandelten Proben genutzt wurde. 62 Methoden In einem weiteren Virusneutralisationstest wurden Immunglobuline gegen das Fusionsprotein bzw. gegen das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein auf ihre neutralisierenden Eigenschaften gegen Sendai-Virus (rSeV-DsRed) getestet. 4.16 Inkubation von Virus mit neutralisierenden Antikörpern 4.16.1 Inkubation mit Antikörpern gegen RSV-F In diesem Versuch sollte der Effekt eines neutralisierenden Antikörpers gegen RSV-F auf das Konstrukt rSeV-RSV-Fch analysiert werden. Es wurde Virus untersucht, welches mit Trypsinzugabe gezüchtet worden war und Virus, welches ohne Trypsin herangezogen wurde. Das Ergebnis für HRSV Wildtyp lag durch den Virusneutralisationstest bereits vor. Am Vortag des Infektionsversuches wurden BHK21-Zellen in eine Mikrotiterplatte ausgesät, so dass sie am Versuchstag etwa konfluent waren. In einer zweiten Mikrotiterplatte wurde eine Verdünnungsreihe des monoklonalen, gegen das Fusionsprotein von RSV gerichteten Antikörpers Nr.4 (Mab 4) hergestellt. Dabei wurden in die Spalten 2 bis 12 50 µl EMEM ohne FKS vorgelegt, in Spalte 1 wurden 100 µl des vorverdünnten Antikörpers pipettiert. Durch Weitergabe von jeweils 50 µl und anschließender Durchmischung entstand Antikörperkonzentration von eine 1:200 Verdünnungsreihe. bis 1:102.400. Sie Spalte reichte 11 wurde von nicht einer mit Antikörpersuspension versehen. Sie diente als Infektionskontrolle. Spalte 12 wurde weder mit Antikörpermaterial, noch Virusmaterial beschickt. Sie diente als Zellkontrolle. Dann wurden in die Spalten 1 bis 11 50 µl Virussuspension mit einem Gehalt von 100 PFU gegeben. Die Platte wurde für eine Stunde in den Brutschrank auf einen Kippschwenker gestellt. In dieser Zeit konnte eine Interaktion der neutralisierenden Antikörper mit dem Virusmaterial stattfinden. Dann wurde die Mikrotiterplatte mit den BHK21-Zellen einmal mit EMEM gewaschen und der Inhalt der zweiten Mikrotiterplatte mit den Antigen-Antikörper-Gemischen auf diese Methoden 63 übertragen. Die Zellen wurden so mit dem Inokulum für eine Stunde auf einem Kippschwenker in den Brutschrank gestellt. Anschließend wurden in jede Vertiefung 200 µl des Methylcellulose-haltigen Mediums gefüllt, welches 2% FKS, allerdings kein acetyliertes Trypsin enthielt. Die Kulturplatte wurde damit für zwei Tage bei 37°C inkubiert und später nach Entfernen des Überstandes und Waschung mit PBSM durch 3%iges Paraformaldehyd fixiert. Die Anfärbung mit gegen Sendai-Virus gerichtetes Antiserum erfolgte wie in dem Kapitel „Immunoplaquetest“ beschrieben. In der Auswertung diente die durchschnittliche Zahl der PFU in den Infektionskontrollen als Richtwert für die Antikörper-behandelten Infektionsansätze. 4.16.2 Inkubation mit polyklonalem Serum gegen Sendai-Virus Es wurde auch der Effekt von polyklonalem Serum gegen Sendai-Virus auf aktiviertes rSeVDsRed und aktiviertes bzw. nicht aktiviertes rSeV-RSV-Fch getestet. Als Antigene seitens des Sendai-Virus wirkten zum einen das Fusionsprotein und zum anderen das HämagglutininNeuraminidase-Protein. Die neutralisierenden Eigenschaften wurden zunächst durch einen Versuch mit rSeV-DsRed, stellvertretend für das Wildtyp-Virus, getestet und belegt. Weiterhin wurden Trypsin-behandelte und nicht Trypsin-behandelte Virusstocks von rSeVRSV-Fch untersucht. Die Durchführung und Auswertung folgte analog dem Versuchsaufbau mit Antikörpern gegen RSV-F. 4.17 Desialylierung von Zellkultur Der Bindungsparter für das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein des Sendai-Virus, die Sialinsäure, sollte in diesem Versuchsansatz von den Zielzellen abgetrennt werden. Dazu wurde Neuraminidase aus dem Bakterium Vibrio cholerae, bekannt als Cholera-Erreger, verwendet (MARKWELL & PAULSON, 1980). 64 Methoden Am Vortag des Infektionsansatzes wurden Vero-Zellen in eine 24-well-Platte mit Deckgläschen ausgesät, dass sie am nächsten Tag etwa konfluent waren. Das Medium wurde am Folgetag abgenommen, die Zellen wurden einmal mit Edulb gewaschen und mit jeweils 50 mU der Neuraminidase in 200 µl Medium pro Vertiefung beschickt. Zellen, die als Zellund Infektionskontrolle dienen sollten, wurden von der Sialidase-Behandlung ausgenommen. Die Platte wurde sodann für eine Stunde und 45 Minuten in den Brutschrank gestellt. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit Edulb gewaschen und mit 1000 PFU Virusmaterial (aktiviertes rSeV-DsRed und rSeV-RSV-Fch) in einem Volumen von 200 µl Medium infiziert. Damit wurden die Zellen 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Diese Zeit wurde relativ kurz gewählt, da die Zellen auch rasch wieder selbst endogene Sialinsäuren bilden können (MARKWELL & PAULSON, 1980). Dann wurde das Inokulum abgenommen und dreimal mit Medium gewaschen. Zum Abschluss wurde in jede Vertiefung 1 ml Medium mit 2% FKS gefüllt und die Platte in den Brutschrank gestellt. Nach zwei Tagen wurden die Zellen fixiert und mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Technik angefärbt. Als Erstantikörper diente polyklonales gegen Sendai-Virus gerichtetes Antiserum aus dem Kaninchen, 1:150 verdünnt (90 Minuten bei Raumtemperatur), als Zweitantikörper ein FITC-gekoppelter Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobuline, 1:100 verdünnt (60 Minuten bei Raumtemperatur). 4.18 Wiederherstellung der SeV-Rezeptoren in Zellkultur Um den Einbau von Sendai-Virus-Rezeptoren auf der Oberfläche der Wirtszellmembran nach einer Neuraminidase-Behandlung zu erreichen, wurden die Zellen mit Gangliosiden aus bovinem Gehirnmaterial behandelt (HOLMGREN et al., 1980). Zunächst wurde der Versuch analog der Desialylierung durchgeführt. Nach der Inkubation mit der Neuraminidase allerdings wurde eine Behandlung der Zellen mit Gangliosiden vorgenommen. Am Ende sollten für jedes Virus (rSeV-DsRed und rSeV-RSV-Fch) Zellansätze entstehen, die als Infektionkontrolle nur mit Virusmaterial behandelt wurden, solche, die vor der Virusinfektion mit Neuraminidase inkubiert wurden und solche, die vor der Inokulation mit Virusmaterial Methoden 65 zunächst mit Neuraminidase und sofort anschließend mit Gangliosiden behandelt wurden. Zusätzlich wurden noch Zellkontrollen benötigt. Nach der Inkubation mit Neuraminidase wurden die Vertiefungen der Kulturplatten zweimal mit Medium gewaschen und mit 0,1 mg Gangliosiden in 200 µl Edulb beschickt. Vertiefungen mit Zellen, die nicht einer GangliosidBehandlung unterzogen werden sollten, wurden nur mit Medium befüllt. Die Kulturplatten wurden für 30 Minuten in den Brutschrank gestellt. Dann wurden die Zellen dreimal mit Edulb gewaschen und mit 1000 PFU in einem Volumen von 200 µl Medium je Vertiefung inokuliert. Die Inkubation dauerte 30 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde erneut dreimal gewaschen und jeweils 1 ml Edulb mit 2% FKS in die Vertiefungen pipettiert. Nach zwei Tagen bei 37°C erfolgte die Fixierung und Färbung wie in dem Kapitel „Desialylierung“ besprochen. Zusätzlich wurden jeweils 100 µl der Überstände zur Untersuchung im Hämagglutinationstest entnommen. 5 5.1 Ergebnisse Expression der Transgene der rekombinanten Sendai-Viren Die beiden zu untersuchenden rekombinanten Sendai-Viren enthielten als Fremdgene das FGen des respiratorischen Synzytialvirus (RSV). In einem Fall sollte ein unverändertes FProtein (RSV-Fnat), im anderen Fall ein chimäres F-Protein (RSV-Fch) exprimiert werden. Das Protein Fch umfasste die Ektodomäne des F-Protein von RSV, während der Membrananker und der zytoplasmatische Abschnitt vom F-Protein des Sendai-Virus stammte (siehe Abbildung 6). Die Fragestellung war zunächst, ob bei einer Infektion mit rekombinantem Sendai-Virus diese beiden Proteine exprimiert werden. BHK21-Zellen wurden mit den Viren rSeV-RSV-Fch und rSeV-RSV-Fnat infiziert (siehe Kapitel „4.6 Infektion von Zellkultur“). Als Kontrolle wurden BHK21-Zellen mit rSeV-DsRed infiziert, das anstelle der RSV-F-Gene das Gen für das autofluoreszierende DsRed enthielt. Um optimale Infektionsbedingungen in der Zellkultur sicherzustellen, wurde dem Medium nach der einstündigen Inokulation mit dem Virusmaterial acetyliertes Trypsin zugefügt. Damit war in allen Fällen die Aktivierung der fusionierenden Eigenschaften des SeV-Fusionsproteins gewährleistet. Nach zwei Tagen Inkubationszeit bei 37°C wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und in der Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Dazu wurde das Zellmaterial zunächst mit einem RSV-F-spezifischen Erstantikörper und einem FITC-gekoppelten Zweitantikörper inkubiert (siehe Kapitel „4.7 Immunfluoreszenz“). Wie Abbildung 7 verdeutlicht, wird sowohl das chimäre Fusionsprotein als auch das native Fusionsprotein des respiratorischen Synzytialvirus in den BHK21-Zellen exprimiert. Im Falle der Infektion mit rSeV-DsRed, also der Kontroll-Virus-Infektion (Abbildung 7C), wurde keine FITC-vermittelte Fluoreszenz entdeckt. Die gegen das RSV-Fusionsprotein gerichteten Antikörper weisen also keine Kreuzreaktivität mit SeV-Proteinen oder zellulären Proteinen auf. 67 Ergebnisse A B C Abbildung 7: Expression der Transgene RSV-Fnat und RSV-Fch in mit rSeV infizierten BHK21-Zellen Bild A zeigt die Expression von Fch bei einer Infektion mit rSeV-RSV-Fch, Bild B zeigt die Expression von Fnat bei einer Infektion mit rSeV-RSV-Fnat, Bild C zeigt die Infektion mit rSeV-DsRed. Der Nachweis der Proteine erfolgte im Fluoreszenzmikroskop über spezifische gegen RSV-F gerichtete Erstantikörper und FITC-gekoppelte Zweitantikörper. Bei dem gewählten Filter ist nur die FITC-, nicht aber die DsRed-vermittelte Fluoreszenz sichtbar. 68 5.2 5.2.1 Ergebnisse Einbau der Fremdproteine in SeV-Partikel Nachweis des Einbaus mit Hilfe des Western Blots Es sollte im Weiteren festgestellt werden, ob die von den Fremdgenen exprimierten Proteine in Sendai-Virionen eingebaut werden. Dazu wurden die drei Viren rSeV-DsRed, rSeV-RSVFch und rSeV-RSV-Fnat jeweils auf 8 großen Plastik-Petrischalen bei Aktivierung des Sendai-Fusionsproteins durch die Zugabe von exogenem Trypsin angezüchtet. Die Überstände wurden nach Sedimentation von Zelldetritus über einen kontinuierlichen Saccharose-Gradienten gereinigt (siehe Kapitel „4.8 Virusreinigung“). Das gereinigte Virusmaterial wurde in PBSM aufgenommen und sein Proteingehalt im BCA-Test bestimmt (siehe Kapitel „4.9 Proteinbestimmung im BCA-Test“). Die Virusproteine wurden einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen unterzogen (siehe Kapitel „4.10 SDS-PolyacrylamidgelElektrophorese“). Nach der Auftrennung in den Mini-Gelen wurden die Proteine mit Hilfe der Semi-Dry-Western-Blot-Technik auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen (siehe Kapitel „4.11 Western Blot, Semi-Dry Blot von Proteinen“). Um die Proteinbanden sichtbar zu machen, wurde eine Nitrocellulose mit einem gegen die F2Untereinheit des RSV-Fusionsproteins gerichteten Antikörper aus dem Kaninchen inkubiert. Anschließend folgte die Detektion der Bindungsstellen des Erstantikörpers mit einem gegen Kaninchen-Immunglobuline gerichteten, Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörper (siehe Kapitel „4.12. Immunchemische Detektion von Proteinen“). Zur Kontrolle der aufgetragenen Virusmengen wurde eine zweite, analog beschickte Nitrocellulose mit polyklonalen, gegen das Sendai-Virus gerichteten Antikörpern aus dem Kaninchen inkubiert. Anschließend wurden die Proteine dann mit Hilfe eines Peroxidase-gekoppelten, gegen KaninchenImmunglobuline gerichteten Zweitantikörpers detektiert und durch Chemolumineszenz sichtbar gemacht. Die Abbildung 8 zeigt bei einer Detektion mit Antikörpern gegen RSV-F eine Reaktion für die Viren rSeV-RSV-Fch und rSeV-RSV-Fnat in einer Höhe von etwa 70 kDa. Diese Größe 69 Ergebnisse entspricht der F0-Einheit von RSV-F bzw. F1-F2, dem über Disulfidbrücken zusammengehaltenen Komplex aus den Untereinheiten F1 und F2 des RSV-Fusionsproteins. Die Bande für das native RSV-F ist etwas niedriger angesiedelt als die für das chimäre Fusionsprotein. Dieser Unterschied spiegelt die unterschiedliche Länge des Membranankers bzw. des zytoplasmatischen Abschnittes der F-Proteine von RSV und SeV wider. In beiden Fällen hat also ein Einbau der Fusionsproteine in die SeV-Virionen stattgefunden, unabhängig von einem Transmembrananker bzw. zytoplasmatischen Abschnitt des Sendai- Fusionsproteins. Im Falle von rSeV-DsRed war keine Reaktion mit den Antikörpern zu erkennen. Diese Virionen enthalten erwartungsgemäß kein RSV-F. Die parallel durchgeführte Anfärbung mit polyklonalen SeV-Antikörpern zeigte ein nahezu gleiches Proteinmuster für die drei Viren mit ähnlicher Intensität der Proteinbanden (nicht gezeigt). Die aufgetragenen Proteinmengen waren also vergleichbar. kDa RSV-Fch DsRed RSV-Fnat 220 97 66 46 30 Abbildung 8: Western Blot mit rSeV DsRed, rSeV RSV-Fch und rSeV RSV-Fnat Der Western Blot zeigt die Färbung mit Antikörpern gegen RSV-F. 70 5.2.2 Ergebnisse Nachweis in Polyacrylamidgelen Nach dem immunologischen Nachweis des eingebauten transgenen Proteins wurde nun versucht, das zusätzlich eingebaute RSV-F durch Anfärben von Proteinen in Polyacrylamidgelen darzustellen. Dazu wurden je etwa 20 µg gereinigtes Virusmaterial der Konstrukte rSeV-DsRed und rSeV-RSV-Fch in der SDS-PAGE aufgetrennt. Die Elektrophorese erfolgte sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Anschließend wurden die Proteinbanden durch den Farbstoff CoomassieBrilliantblau angefärbt (siehe Kapitel „4.13.1 Coomassie-Färbung“). kDa DsRed RSV-Fch 220 97 66 HN P 46 F1 N M 30 Abbildung 9: Elektrophoretische Auftrennung der Proteine gereinigter rekombinanter Sendai-Virionen (rSeV-DsRed und rSeV-FSV-Fch) mit nachfolgender Coomassie-Färbung Das Gel zeigt eine Auftrennung der Proteine unter reduzierenden Bedingungen. Markiert sind mutmaßliche Banden einiger Proteine des Sendai-Virus. Ergebnisse 71 Die Abbildung 9 macht deutlich, dass kein Unterschied zwischen den Bandenmustern von rSeV-DsRed und rSeV-RSV-Fch zu erkennen war. Eine etwaige zusätzliche Bande für das RSV-Fusionsprotein im Bereich von 48 kDa (F1-Untereinheit) war nicht zu sehen. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass nur geringe Mengen der Fremdproteine in Sendai-Virionen verpackt werden. Auch eine Silberfärbung ergab keine anderen Ergebnisse (nicht gezeigt). Da nach dem Western-Blot-Ergebnis von Abbildung 8 für rSeV-RSV-Fnat kein höherer Einbau von RSV-Fnat zu erwarten war, wurde für dieses Virus keine Proteinfärbung durchgeführt. 5.3 Wachstumseigenschaften der rekombinanten Viren Das rekombinante Virus rSeV-RSV-Fch bzw. rSeV-RSV-Fnat hat im Gegensatz zum Vergleichs-Virus rSeV-DsRed theoretisch zwei mögliche Wege, um eine Fusion zwischen der Lipidhülle des Virions und der Plasmamembran der Wirtszelle einzuleiten. Die Genome der beiden Viren kodieren für zwei verschiedene Fusionsproteine, die in neue Viruspartikel eingebaut werden. Sowohl bei SeV als auch bei RSV muss das F-Protein durch zelluläre Proteasen in die Untereinheiten F1 und F2 gespalten werden, damit es fusionsaktiv ist. Die proteolytische Aktivierung der beiden Fusionsproteine läuft allerdings unterschiedlich ab (Abbildung 10). Die Spaltstelle des Sendai-Virus-Fusionsproteins besteht aus einem singulären Arginin. Zur Spaltung bedarf es einer extrazellulären Trypsin-ähnlichen Protease. Für Infektionsversuche in Zellkultur bedeutet dies, dass zur Aktivierung des SeVFusionsproteins die Zugabe von exogenem Trypsin in das Medium notwendig ist. Das RSVFusionsprotein wird durch die ubiquitäre Protease Furin gespalten und kann damit im Grunde in jeder Zelle aktiviert werden. Es gibt im Falle des respiratorischen Synzytialvirus zwei multibasische Spaltmotive für das Furin, so dass nach der Spaltung ein 27 Aminosäuren großes Peptid aus dem Fusionsprotein herausgetrennt wird. Die Gabe exogener Proteasen ist bei RSV nicht notwendig. Es wurden Infektionsversuche mit den drei Viren rSeV-DsRed, rSeV-RSV-Fch und rSeVRSV-Fnat auf BHK21-Zellen vorgenommen, und zwar wurde je Konstrukt einerseits Virus eingesetzt, das in Gegenwart von Trypsin vermehrt worden war und andererseits Virus, das 72 Ergebnisse ohne Trypsingabe erhalten wurde (siehe Kapitel „4.6 Infektion von Zellkultur“). Im erstgenannten Fall trugen die Viruspartikel aktivierte Sendai-Fusionsproteine auf ihrer Oberfläche, im anderen Falle besaßen sie nur ungespaltene und damit inaktive SeVFusionsproteine auf ihrer Oberfläche. Die Fusionseigenschaft über das Sendai-VirusFusionsprotein war also in einem Fall aktiviert, im anderen Fall nicht aktiviert. 1 S-S Furin F2 F1 ...KKRKRR... ...RARR... S-S Trypsin 2 F2 F1 ...R... Abbildung 10: Aktivierung der Fusionsproteine von SeV und RSV (1) Fusionsprotein des respiratorischen Synzytialvirus, Spaltung durch Furin an zwei multibasischen Motiven, (2) Fusionsprotein des Sendai-Virus, Spaltung durch trypsinähnliche Proteasen an einem singulären Arginin. Jeweils 1000 PFU der Viren wurden zum jeweiligen Zellrasen einer Vertiefung einer Kulturplatte (24 well) gegeben. Nach einstündiger Inokulation bei 37°C wurde neues Medium auf die Zellen pipettiert. Die Medien der aktivierten Ausgangsviren wurden zusätzlich mit Trypsin versetzt. Die SeV-Fusionsproteine waren also in diesen Fällen gespalten und damit aktiviert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen fixiert und mit polyklonalem, gegen Sendai- 73 Ergebnisse Virus gerichtetem Antiserum aus dem Kaninchen und FITC-gekoppelten Zweitantikörpern gegen Kaninchen-Immunglobuline im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. A B C D E F Abbildung 11: Infektion von BHK21-Zellen durch rSeV-DsRed, rSeV-RSV-Fch bzw. rSeVRSV- Fnat in Gegenwart oder Abwesenheit von exogenem Trypsin (A) rSeV DsRed ohne Trypsingabe, (B) rSeV DsRed mit Trypsingabe, (C) rSeV RSVFch ohne Trypsingabe, (D) rSeV RSV-Fch mit Trypsingabe, (E) rSeV RSV-Fnat ohne Trypsingabe, (F) rSeV RSV-Fnat mit Trypsingabe 74 Ergebnisse Eine Infektion mit dem Vergleichsvirus rSeV-DsRed fand nur statt, wenn exogenes Trypsin im Versuchsansatz verwendet wurde (vgl. Abbildung 11 A, B). Die Infektion der Zellen war nur über das SeV-Fusionsprotein möglich. Mit dem Konstrukt rSeV-RSV-Fch war eine erfolgreiche Infektion nicht von der Gabe einer zusätzlichen Protease abhängig (Abbildung 11 C, D). Die Infektion in Abwesenheit von Trypsin (Abbildung 11 C) verlief offensichtlich über das RSV-Fusionsprotein. Eine Infektion durch das Konstrukt mit dem nativen RSVFusionsprotein, rSeV-RSV-Fnat, wiederum war nur möglich, wenn Trypsin zugesetzt wurde (Abbildung 11 E, F). In diesem Fall verlief die Infektion offensichtlich nur über das SeVFusionsprotein. Das RSV-Fusionsprotein konnte dabei keine Infektion vermitteln. 5.4 Replikationsverhalten der rekombinanten Viren Das Wachstumsverhalten der drei Viren rSeV-DsRed, rSeV-RSV-Fch und rSeV-RSV-Fnat wurde über einen Zeitraum von zwei Tagen beobachtet (siehe Kapitel „4.14 Wachstumskinetik“). Dazu wurden BHK21-Zellen in Kulturplatten (12 well) mit jeweils 1000 PFU Virusmaterial je Vertiefung beimpft. Als Inokulum wurde sowohl Virus verwendet, das unter Trypsingabe vermehrt worden war (SeV-F aktiviert) als auch Virus, dem diese Protease nicht zugesetzt worden war (SeV-F nicht aktiviert). Abbildung 12 veranschaulicht das Wachtumsverhalten der Viren über einen Zeitraum von 46 Stunden. Grafik A zeigt, dass das Vergleichsvirus rSeV-DsRed unter Zugabe von Trypsin 30 Stunden nach Inokulation Titer von bis zu 106 PFU/ml erreichte (schwarze Linie). Ohne diese exogene Protease konnte keine Infektion nachgewiesen werden (graue Linie). In der Abbildung 12 B ist zu sehen, dass rSeV-RSV-Fch unabhängig von einer Trypsingabe Infektionen vermitteln konnte. Unter der Wirkung von zugefügtem Trypsin (schwarze Linie) wurde allerdings ein etwas höherer Titer (5 x 106 PFU/ml) erreicht, als es ohne die Protease (graue Linie) möglich war (2 x 105 PFU/ml). Das Konstrukt rSeV-RSV-Fnat (Abbildung 12 C) war abhängig von Trypsin, es verhielt sich im Grunde wie das Kontrollvirus rSeV-DsRed und erreichte nach 30 Stunden ebenfalls Titer von bis zu 106 PFU/ml. 75 Ergebnisse Infektiosität (log PFU/ml) 6 5 4 3 2 1 A 0 1 8 16 22,5 30 40,5 46 Zeit nach Inokulation (Stunden) Infektiosität (log PFU/ml) 7 6 5 4 3 2 1 B 0 1 8 16 22,5 30 40,5 46 Zeit nach Inokulation (Stunden) 76 Ergebnisse Infektiosität (log PFU/ml) 6 5 4 3 2 1 C 0 1 8,5 15,5 23 31 39,5 46,5 Zeit nach Inokulation (Stunden) Abbildung 12: Vermehrungskurve von rSeV-DsRed (A), rSeV-RSV-Fch (B) und rSeV-RSVFnat (C) in BHK21-Zellen (A) rSeV-DsRed mit Trypsinzugabe [schwarze Linie], rSeV-DsRed ohne Trypsinzugabe [graue Linie], (B) rSeV-RSV-Fch mit Trypsinzugabe [schwarze Linie], rSeV-RSV-Fch ohne Trypsinzugabe [graue Linie], (C) rSeV-RSV-Fnat mit Trypsinzugabe [schwarze Linie], rSeV-RSV-Fnat ohne Trypsinzugabe [graue Linie] 5.5 5.5.1 Hemmung der Infektion durch neutralisierende Antikörper Neutralisationsvermögen diverser Antikörper gegen RSV-F Um zu überprüfen, ob die Infektion durch rSeV-RSV-Fch in Abwesenheit von Trypsin durch das RSV-Fch-Protein vermittelt wird, wurde versucht, diesen Infektionsweg mit neutralisierenden Antikörpern zu unterbinden. Zur spezifischen Erkennung von RSV-F standen mehrere Antikörper zur Verfügung. Um ihre neutralisierenden Eigenschaften zu überprüfen, wurden sie im Virusneutralisationstest verglichen (siehe Kapitel „4.15 77 Ergebnisse Virusneutralisationstest“). Es kamen fünf verschiedene Antikörper gegen das RSVFusionsprotein zum Einsatz: Mab 4, Mab 13, Mab 19, Mab Biosoft und Mab Örvell (siehe „3.5 Erstantikörper“) Es wurden Verdünnungsreihen der Antikörper von 1:100 bis 1:51.200 angelegt und mit humanem respiratorischen Synzytialvirus inkubiert (siehe Kapitel „4.15 Virusneutralisationstest“). Dieses Antigen-Antikörper-Gemisch wurde für eine Stunde auf BHK21-Zellen gegeben. Als Infektionskontrollen dienten BHK21-Zellen, die nur mit HRSV, ohne Antikörper-Einwirkung, inokuliert wurden. Nach einer zweitägigen Inkubation bei 37°C wurden die Zellen hitzefixiert und schließlich mit einem Gemisch dreier Antikörper gegen RSV-F inkubiert. Mit Hilfe eines Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörpers wurden die 100 50 1 2 3 4 5 0 51 20 0 26 50 0 12 80 0 64 00 32 00 16 00 80 0 40 0 20 0 10 0 Anteil infizierter Zellen (%) infizierten Zellen sichtbar gemacht. Antikörperverdünnung Abbildung 13: Neutralisationsvermögen diverser Antikörper gegen RSV-F (1) Mab 4, (2) Mab 13, (3) Mab Örvell, (4) Mab 19, (5) Mab Biosoft 78 Ergebnisse Durch Mab 4 wurde bereits bei einer Konzentration von 1:12.500 eine Reduzierung der Infektiosität um 50% erreicht (siehe Abbildung 13). Bei einer Verdünnung bis zu 1:800 war eine nahezu komplette Infektionshemmung möglich. Der Antikörper Mab 13 erreicht eine 50%ige Neutralisation erst bei Konzentrationen um 1:1.800, der Antikörper Mab Örvell bei Konzentrationen um 1:1.400 und die beiden übrigen Antikörper bei noch geringeren Verdünnungen. Antikörper Mab 4 hatte gegenüber den übrigen getesteten Antikörpern die besten neutralisierenden Eigenschaften und bot sich somit für den Einsatz in einem Plaquereduktionstest an. 5.5.2 Infektionshemmung mit einem Antikörper gegen RSV-F Mit dem neutralisierenden Antikörper Mab 4 wurde ein Plaquereduktionstest mit dem rekombinanten Sendai-Virus rSeV-RSV-Fch durchgeführt. Die Fragestellung war, welchen Effekt der gegen RSV-F gerichtete Antikörper auf die Infektiosität des rekombinanten SendaiVirus hat. Es wurde zum einen ein mit Trypsin behandeltes Virus getestet, in dem das SeVFusionsprotein aktiviert war, und zum anderen ein ohne Trypsinzugabe gewonnenes Virus, in dem das SeV-Fusionsprotein also nicht aktiviert war. Verschiedene Verdünnungen des Antikörpers wurden eine Stunde lang mit 100 PFU des entsprechenden Virus inkubiert und dann auf BHK21-Zellen überführt (siehe Kapitel „4.16.1 Inkubation mit Antikörpern gegen RSV-F“). Die BHK21-Zellen verblieben zwei Tage im Brutschrank und wurden danach fixiert (siehe Kapitel „4.4 Fixieren von Zellen“). Die Anfärbung erfolgte mit polyklonalem gegen SendaiVirus gerichteten Antiserum, einem entsprechenden Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörper und durch Umsetzung des Substrates AEC. Die Abbildung 14 demonstriert, dass das HRSV mit zunehmender Antikörper-Konzentration an Infektiosität verlor (Linie 3). Je mehr neutralisierende Antikörper vorhanden waren, desto stärker war offensichtlich das Fusionsprotein von RSV in seiner Wirkung eingeschränkt. rSeV-RSV-Fch ohne aktiviertes Sendai-Fusionsprotein (Linie 1) verhielt sich ebenso wie das HRSV-Wildtyp-Virus. Die Infektiosität sank mit steigender Konzentration neutralisierender 79 Ergebnisse Antikörper. Die Infektionsvermittlung über das RSV-Fusionsprotein wurde durch die neutralisierenden Antikörper unterbunden. Anders verhielt es sich mit rSeV-RSV-Fch, dessen SeV-Fusionsprotein durch die Zugabe exogenen Trypsins aktiviert war (Linie 2). Eine Neutralisation durch Antikörper gegen RSV-F fand erwartungsgemäß nicht statt. Die 100 2 3 1 50 10 0 20 0 40 0 80 0 64 00 32 00 16 00 0 51 20 0 25 60 0 12 80 0 0 10 24 0 Anteil infizierter Zellen (%) Infektiosität blieb bei steigender Antikörper-Konzentration unvermindert erhalten. Antikörperverdünnung Abbildung 14: Plaquereduktionstest mit einem neutralisierenden Antikörper gegen RSV-F (1) rSeV-RSV-Fch ohne Trypsinzugabe, (2) rSeV-RSV-Fch mit Trypsinzugabe, (3) HRSV Wildtyp 5.5.3 Infektionshemmung mit Antikörpern gegen SeV Nachdem der Infektionsweg über das RSV-Fusionsprotein durch einen monoklonalen Antikörper neutralisiert werden konnte, wurde der neutralisierende Effekt eines gegen SendaiVirus gerichteten polyklonalen Antiserums auf die rekombinanten Viren untersucht. Die Antikörper richteten sich sowohl gegen das Fusionsprotein als auch gegen das 80 Ergebnisse Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein des Sendai-Virus. Es wurde nun untersucht, inwieweit der Infektionsweg über das Sendai-Fusionsprotein eingeschränkt werden konnte. Die Versuchsdurchführung erfolgte analog zur Infektionshemmung mit Antikörpern gegen das RSV-Fusionsprotein (siehe Kapitel „4.16.2 Inkubation mit polyklonalem gegen Sendai-Virus gerichtetes Antiserum“). Getestet wurden das Vergleichsvirus rSeV-DsRed mit aktiviertem Sendai-Fusionsprotein, rSeV-RSV-Fch mit aktiviertem Sendai-Fusionsprotein und rSeVRSV-Fch ohne Trypsinzugabe (nicht aktives SeV-F-Protein). Im Ergebnis war das Kontrollvirus rSeV-DsRed erwartungsgemäß mit zunehmender Antikörperkonzentration in seiner Infektiosität eingeschränkt (Abbildung 15, Linie 1). Das gegen Sendai-Virus gerichtete Antiserum war also in der Lage, das Vergleichsvirus zu neutralisieren. Das Konstrukt rSeVRSV-Fch wurde unabhängig von einer Aktivierung des SeV-Fusionsproteins durch Trypsin in seiner Infektiosität neutralisiert (Abbildung 15, Linie 2 und 3). In beiden Fällen sank die Zahl der infizierten Zellen bei einer Antikörper-Verdünnung von 1:600 gegen Null. 2 50 3 1 10 0 20 0 40 0 80 0 64 00 32 00 16 00 0 51 20 0 25 60 0 12 80 0 Anteil infizierter Zellen (%) 100 Antikörperverdünnung Abbildung 15: Infektionshemmung mit polyklonalem Sendai-Antiserum (1) rSeV-DsRed mit Trypsingabe, (2) rSeV-RSV-Fch ohne Trypsingabe, (3) rSeVRSV-Fch mit Trypsingabe Ergebnisse 5.6 5.6.1 81 Infektionsvermögen in Abhängigkeit von Sialinsäuren Entfernen der Sialinsäuren von Zellkultur Die vollständige Neutralisation von rSeV-RSV-Fch durch Sendai-Virus-Antiserum war überraschend. Man hätte erwarten können, dass eine durch RSV-Fch vermittelte Restinfektiosität erhalten bliebe, die nicht durch Antikörper gegen Sendai-Virus gehemmt werden kann. Eine Erklärung könnte die Funktion des HN-Proteins bieten, das für die Bindung der SeV-Partikel an Zielzellen verantwortlich ist. Zwar verfügt das RSV-F-Protein auch über gewisse Bindungseigenschaften (siehe Kapitel „1.1.6.5 F-Protein“), aber möglicherweise reichen diese nicht aus, um rSeV-RSV-Fch an Zellen zu binden. Falls also rSeV-RSV-Fch auf die Bindungseigenschaft der SeV-HN-Proteine angewiesen ist, ist damit die vollständige Neutralisation von diesem Virus durch das gegen SeV gerichtete Antiserum zu erklären. Die Bindungspartner für die Hämagglutinin-Neuraminidase sind Sialinsäuren, die in einer terminalen Position von Glykoproteinen und Glykolipiden auf der Zelloberfläche zu finden sind. Mit Hilfe von Sialidasen lassen sich die Sialinsäuren von der Oberfläche abtrennen, z.B. durch die Neuraminidase aus dem Cholera-Erreger Vibrio cholerae. Um die Bedeutung des HN-Proteins für die rSeV-RSV-Fch-Infektion zu klären, wurde die Infektion Neuraminidasebehandelter Zellen untersucht (siehe Kapitel „4.17 Desialylierung von Zellkultur“). Vero-Zellen wurden eine Stunde und 45 Minuten mit Neuraminidase bei 37°C inkubiert und für eine halbe Stunde mit Virus (rSeV-DsRed, rSeV-RSV-Fch, jeweils mit Trypsingabe) infiziert. Die Inokulation mit den Viren wurde kurz gehalten, um den Zellen keine Gelegenheit zu geben, neue Sialinsäuren zu bilden. Dies hätte das Versuchsergebnis verfälscht. Nach zweitägiger Inkubation wurden die Zellen fixiert (siehe Kapitel „4.4 Fixieren von Zellen“) und mit einem gegen Sendai-Virus gerichteten Erstantikörper und einem FITCgekoppelten Zweitantikörper im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht (siehe Kapitel „4.7 Immunfluorenszenz“). Es zeigte sich, dass durch die Neuraminidase-Behandlung die Zellen resistent werden, sowohl gegen eine rSeV-DsRed-Infektion als auch gegen eine rSeV-RSVFch-Infektion (Abbildung 16 B, E). Bei rSeV-DsRed war das zu erwarten. In gleicher Weise verhielt sich aber auch das mit Trypsin aktivierte Virus rSeV-RSV-Fch. Eine 82 Ergebnisse Infektionsvermittlung ausschließlich durch das RSV-Fusionsprotein war unter diesen Bedingungen nicht zu beobachten. Das Virus rSeV-RSV-Fch benötigte also genau wie das Kontrollvirus rSeV-DsRed die Sialinsäure-abhängige Adsorption über das HN-Protein. 5.6.2 Wiederherstellung der SeV-Rezeptoren Nach Entfernen des Bindungspartners für das Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein von SeV, reichte beim Konstrukt rSeV-RSV-Fch das Fusionsprotein von RSV nicht für eine Infektionsvermittlung aus. Eine teilweise Wiederherstellung des Sialinsäure-Besatzes auf der Wirtszell-Oberfläche ist durch eine Behandlung der Zellen mit Gangliosiden möglich. Falls die Gangliosid-behandelten Zellen wieder empfänglich für eine SeV-Infektion werden, ist dies ein weiterer Beleg für die Beteiligung des HN-Proteins an der Einleitung einer Infektion. Direkt nach der Inkubation der Vero-Zellen mit Neuraminidase wurde ein Teil der Zellen eine halbe Stunde mit Gangliosiden aus bovinem Gehirn-Material behandelt (siehe Kapitel „4.18 Resialylierung von Zellkultur“). Es ist bekannt, dass Ganglioside an die Zelloberfläche binden und zum Teil auch in die Membran integrieren. Die anschließende Inokulation mit Virus (rSeV-DsRed, rSeV-RSV-Fch, jeweils mit Aktivierung durch Trypsingabe) dauerte eine halbe Stunde bei Raumtemperatur. Schließlich wurde das Medium erneuert und die Vero-Zellen für zwei Tage in den Brutschrank gestellt. Die Zellen wurden dann mit Paraformaldehyd fixiert (siehe Kapitel „4.4 Fixieren von Zellen“) und mit gegen Sendai-Virus gerichtetem Antiserum und FITC-gekoppelten Zweitantikörpern angefärbt (siehe Kapitel „4.7 Immunfluoreszenz“). In der Immunfluoreszenz wurde deutlich, dass nach der Inaktivierung der Rezeptoren durch Neuraminidase-Behandlung die Zellen durch die Inkubation mit Gangliosiden wieder empfänglich wurden für eine Infektion, und zwar sowohl durch rSeV-DsRed (Abbildung 16, C), als auch durch rSeV-RSV-Fch (Abbildung 16, F). 83 Ergebnisse A D B E C F Abbildung 16: Desialylierung und Gangliosid-Behandlung von Vero-Zellen (A) rSeV-DsRed, Infektionskontrolle, (B) rSeV-DsRed, nach NeuraminidaseBehandlung, (C) rSeV-DsRed, nach Neuraminidase- und anschließender GangliosidBehandlung, (D) rSeV-RSV-Fch, Infektionskontrolle, (E) rSeV-RSV-Fch, nach Neuraminidase-Behandlung, (F) rSeV-RSV-Fch, nach Neuraminidase- und anschließender Gangliosid-Behandlung. Beide Viren wurden mit Trypsin behandelt (SeV-F aktiviert). 84 Ergebnisse Um diesen Sachverhalt zu quantifizieren, wurde derselbe Versuchsansatz wiederholt. Nach dreitägiger Inkubation wurden den Überständen dieser Ansätze Proben von 100 µl entnommen und im Hämagglutinationtest untersucht (siehe Kapitel „4.3 Hämagglutinationtest“). Der HA-Test bestätigte das Ergebnis der Immunfluoreszenz. Der Ausgangstiter von rSeV-DsRed betrug am dritten Tage nach der Inokulation 24 HAU/ml und sank nach der Neuraminidase-Behandlung um zwei Titerstufen auf 22 HAU/ml. Eine Gangliosid-Einwirkung steigerte den Virustiter um eine Titerstufe auf 23 HAU/ml. Das Virus rSeV-RSV-Fch verhielt sich ebenso, allerdings waren die Titer jeweils um eine Stufe höher. 6 6.1 Diskussion Einbau des chimären Fusionsproteins in Sendai-Virionen Viren mit einer Lipidhülle reifen durch einen Knospungsvorgang, der beim Sendai-Virus wie auch bei vielen anderen Viren an der Plasmamembran der Wirtszelle abläuft. Die treibende Kraft dieses Knospungsvorganges scheint das Matrixprotein zu sein, wie für eine Reihe von Viren gezeigt worden ist (PEEPLES, 1991; STRICKER et al., 1994). Während des Knospungsvorganges befindet es sich auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran. Es interagiert nicht nur mit dem genomhaltigen Ribonukleoproteinkomplex, sondern auch mit den Oberflächenprotein HN und F (SANDERSON et al., 1994; TAKIMOTO et al., 2001), die als Transmembranproteine in der Plasmamembran bzw. in der späteren Virushülle verankert sind. Das Matrixprotein kann deshalb mit dem zytoplasmatischen Abschnitt und möglicherweise auch mit dem Membrananker von HN und F interagieren (ALI & NAYAK, 2000). Deshalb wurde bei dem Konzept, das RSV-F-Protein mit rekombinanten Sendai-Viren zu untersuchen, sofort an ein chimäres Protein gedacht. Die Verknüpfung der RSV-FEktodomäne mit dem Membrananker und dem zytoplasmatischen Abschnitt des SeV-FProteins sollte sicherstellen, dass das Fremdprotein in Viruspartikel eingebaut wird. Die Analyse gereinigter Viren bestätigte auch das Vorhandensein des chimären Proteins (siehe Kapitel „5.2 Einbau der Fremdproteine in SeV-Partikel“).. Mit Antikörpern gegen RSV-F gelang der Nachweis einer Bande bei 70 kDa. Diese Größe entspricht der F0-Einheit des Fusionsproteins. Über die Menge des eingebauten RSVFusionsproteins im Vergleich zu dem SeV-Fusionsprotein kann keine Aussage gemacht werden. Polyacrylamidgele, in denen sowohl gereinigtes rSeV-RSV-Fch als auch gereinigtes Vergleichsvirus rSeV-DsRed elektrophoretisch aufgetrennt war, zeigten nach einer Coomassie- oder Silberfärbung keinerlei Unterschiede im Proteinbandenmuster. Bei dieser Analyse kommt erschwerend hinzu, dass in der erwarteten Position des RSV-F-Proteins auch SeV-Proteine auftreten. Deshalb kann man lediglich aussagen, dass das RSV-F-Protein in den rekombinanten SeV-Partikeln kein Hauptprotein ist, sondern vermutlich nur in geringer Menge eingebaut wird. Eine quantitative Aussage könnte man mit einem immunologischen 86 Diskussion Nachweis erhalten, bei Verwendung eines Antikörpers, der gegen den zytoplasmatischen Abschnitt des SeV-Fusionsprotein gerichtet ist. Da der zytoplasmatische Abschnitt beim SeVF-Protein und beim RSV-Fch-Protein identisch ist, könnte die Western-Blot-Analyse eine relative Einschätzung der Mengen beider Glykoproteine ermöglichen. Um zu überprüfen, inwieweit die Anteile des SeV-Fusionsproteins im chimären Fusionsprotein von rSeV-RSV-Fch für den Einbau in die Sendai-Virionen notwendig waren, wurde ein rekombinantes Sendai-Virus untersucht, in dessen Genom statt des Gens für ein chimäres Fusionsprotein das gesamte native Gen für das RSV-Fusionsprotein eingebaut war (siehe Kapitel „5.2 Einbau der Fremdproteine in SeV-Partikel“). Dieses als RSV-Fnat bezeichnete Protein wurde ebenfalls in Viruspartikel eingebaut. Der Transmembrananker oder der zytoplasmatische Abschnitt des SeV-Fusionsproteins sind offenbar nicht essentiell für den Einbau des RSV-Fusionsproteins. Die Untersuchung zeigt, dass Fremdproteine in SeVPartikel verpackt werden können, wenn auch in geringer Menge. Im Gegensatz zu unserer ursprünglichen Erwartung reicht der Austausch von Membrananker und zytoplasmatischem Abschnitt offensichtlich nicht aus, um die Effizienz des Einbaus deutlich zu steigern. 6.2 Infektionsvermittlung durch RSV-F Die Viren rSeV-RSV-Fch und rSeV-RSV-Fnat verfügen mit den beiden Fusionsproteinen SeV-F und RSV-F über zwei mögliche Wege der Fusion mit der Wirtszelle. Die Fusionsproteine werden allerdings in unterschiedlicher Weise aktiviert, wodurch sich die beiden Infektionswege Wachstumseigenschaften“, gut voneinander Abbildung 11). unterscheiden Das lassen (vgl. Kapitel Vorläufer-Fusionsprotein F0 „5.3 des respiratorischen Synzytialvirus besitzt das Spaltmotiv Lysin-Lysin-Arginin-Lysin-ArgininArginin [131K-K-R-K-R-R136] (ELANGO et al., 1985) und ein weiteres Spaltmotiv ArgininAlanin-Arginin-Arginin [106R-A-R-R109] (GONZALES-REYES et al., 2001; ZIMMER et al., 2001 a). Die Spaltung erfolgt intrazellulär über die ubiquitäre Protease Furin. In den gängigen Zelllinien wird das Fusionprotein F0 dadurch in seine Untereinheiten F1 (48 kDa) und F2 (20 kDa) gespalten und damit aktiviert (GRUBER & LEVINE, 1983). 87 Diskussion Das Vorläufer-Fusionsprotein F0 des Sendai-Virus wird ebenfalls proteolytisch in die Untereinheiten F1 (50-55 kDa) und F2 (10-12 kDa) gespalten (HOMMA & OHUCHI, 1973). SeV-F0 besitzt nur ein monobasisches Spaltmotiv mit der Sequenzfolge –Q-S-R-F-F-. Die Spaltung erfolgt nach dem singulären Arginin (BLUMBERG et al., 1985), allerdings nicht intrazellulär durch Furin, wie im Fall des RSV-Fusionsproteins. Unter natürlichen Bedingungen bewirkt die Tryptase Clara, die von bronchialen Epithelzellen in den natürlichen Wirten Maus und Ratte sezerniert wird, die extrazelluläre Spaltung der Vorläufereinheit F0 (TASHIRO et al., 1990, 1992). In Zellkultur lässt sich eine Spaltung und Aktivierung der Sendai-Viren bzw. ihres Fusionsproteines durch die Zugabe einer exogenen Serin-Protease wie Trypsin erreichen (HOMMA & OHUCHI, 1973; SCHEID & CHOPPIN, 1974). Mit einer fakultativen, d.h. Trypsin-abhängigen Aktivierung des SeV-Fusionsproteins ließ sich dieser Infektionsweg abgrenzen von der durch das RSV-Fusionsprotein vermittelten Infektion, die Trypsin-unabhängig ist. Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Fusionsproteinen RSV-F und SeV-F ist das Bindungsvermögen. RSV-F ist auch dann fusionsaktiv, wenn es unabhängig von den beiden anderen RSV-Oberflächenproteinen (G und SH) exprimiert wird (PASTEY & SAMAL, 1997). Die Deletionsmutante cp-52 ohne G und SH zeigt, dass RSV auch dann in Zellkultur vermehrt werden kann, wenn das F-Protein das alleinige Oberflächenprotein ist (KARRON et al., 1997). Das Fusionsprotein kann bei RSV also nicht nur die Membranfusion vermitteln, sondern auch die Bindung an Zellen. Dies kann über Heparin-ähnliche Strukturen geschehen (MARTINÉZ & MELERO, 2000) oder über einen noch nicht identifizierten Proteinrezeptor (TECHAARPORNKUL et al., 2002). Im Infektionsgeschehen des Sendai-Virus ist ein Zusammenspiel der beiden Oberflächenproteine, d.h. des Fusionsproteins und des Hämagglutinin-NeuraminidaseProteins essentiell. Das HN-Protein vermittelt die Bindung an sialinsäurehaltige Rezeptoren und induziert dadurch im F-Protein den Übergang zur fusionsaktiven Form. Es kommt nur bei einer Koexpession beider Proteine zu einer Fusion von Virushülle und Plasmamembran der Wirtszelle (BOUSSE et al., 1994). 88 Diskussion Die Infektionsversuche mit dem Vergleichsvirus rSeV-DsRed auf BHK21-Zellen zeigten die typische Wachstumscharakteristik für dieses Virus (vgl. Kapitel „5.3 Wachstumseigenschaften“). Eine Infektion der Zellen war nur bei Zugabe von Trypsin zu beobachten. Ohne Aktivierung war kein Virustiter zu messen (vgl. Kapitel „5.4 Replikationsverhalten der rekombinanten Viren“). Das rekombinante Virus rSeV-RSV-Fch war theoretisch unabhängig von der Zugabe von Trypsin, da es über ein zweites Fusionsprotein verfügte, welches in den BHK21-Zellen durch das ubiquitäre Furin gespalten wird. Diese Theorie belegten die Infektionsversuche mit dem Konstrukt. Sowohl ohne als auch mit Trypsinzugabe war eine Infektion zu beobachten (siehe Kapitel „5.3 Wachstumseigenschaften“). Wenn zusätzlich zum ohnehin fusionsaktiven RSVF-Protein noch das SeV-Fusionprotein durch Trypsinzugabe aktiviert war, wies das Virus rSeV-RSV-Fch einen um eine Logarithmusstufe höheren Titer auf (siehe Kapitel „5.4 Replikationsverhalten der rekombinanten Viren“). Das eingebaute chimäre RSV- Fusionsprotein war also in der Lage, eine trypsinunabhängige Infektion für das rekombinante Sendai-Virus zu vermitteln. Der im Vergleich zum Trypsin-behandelten Virus erniedrigte Titer spricht dafür, dass nur vergleichsweise geringe Mengen des RSV-F-Proteins in den SeV-Partikeln vorliegen. Das Virus rSeV-RSV-Fnat erbrachte wieder einen überraschenden Befund. Nachdem das native RSV-F entgegen den ursprünglichen Erwartungen in Viruspartikel eingebaut wurde, nahmen wir an, dass es ebenso wie RSV-Fch eine Infektion einleiten kann. Allerdings verhielt sich dieses Virus wie das Kontrollvirus. Ohne Gabe einer exogenen Protease war keine Infektion mit der Immunfluoreszenztechnik oder in der Analyse der Replikationskinetik zu ermitteln (vgl. Kapitel 5.3 und 5.4). Nur nach Aktivierung des SeV-Fusionsproteins durch Trypsin war eine Infektion zu beobachten. Der Membrananker bzw. der zytoplasmatische Abschnitt des SeV-F-Proteins ist zwar nicht nötig für den Einbau von Fremdproteinen in SeV-Partikel, aber er scheint notwendig zu sein für eine infektionsvermittelnde Wirkung in SeV-Partikeln. Diskussion 89 Die genaue Rolle dieser Proteinabschnitte bei der Einleitung einer Infektion ist nicht bekannt. Vielleicht ist die Interaktion mit dem SeV-Matrixprotein wichtig, damit der Fusionsvorgang zwischen Virushülle und Plasmamembran ablaufen kann. 6.3 Neutralisation der Infektionswege Eine Infektionsvermittlung über das RSV-Fusionsprotein im Virus rSeV-RSV-Fch sollte durch neutralisierende Antikörper, die sich gegen dieses Antigen richten, zu verhindern sein. In Plaquereduktionstests (siehe Kapitel „5.5.2 Infektionshemmung mit einem Antikörper gegen RSV-F“) verhielt sich das Virus rSeV-RSV-Fch wie erwartet. Wenn das SeV-F-Protein nicht aktiviert war, die Infektionsvermittlung also nur über RSV-F erfolgte, wurde die Infektion durch die gegen RSV-F gerichteten Antikörper vollständig gehemmt. Bei Aktivierung des SeV-Fusionsproteins war die Infektiosität des Virus trotz einer Inkubation mit neutralisierenden Antikörpern gegen RSV-F unvermindert. Die Hemmung der Infektion durch polyklonales gegen Sendai-Virus gerichtetes Serum erbrachte ein überraschendes Ergebnis (siehe Kapitel „5.5.3 Infektionshemmung mit Antikörpern gegen SeV“). Unabhängig davon, ob das Virus rSeV-RSV-Fch durch Trypsin aktiviert war oder nicht, wurde die Infektion durch das SeV-Antiserum vollständig gehemmt. Die Ursache für die fehlende Infektionsvermittlung durch RSV-Fch kann nicht in einer unspezifischen Bindung der SeV-Antikörper an das RSV-F-Protein liegen, da eine Kreuzreaktivität der Antikörper in verschiedenen Tests ausgeschlossen wurden. Deshalb wurde eine andere mögliche Erklärung in Erwägung gezogen. Das RSV-F-Protein kann im rekombinanten Sendai-Virus vermutlich nur die Fusionsaktivität zur Infektionsvermittlung beisteuern, nicht jedoch die Bindungsfunktion. In diesem Fall wäre das Virus auf die Bindungsaktivität des HN-Proteins angewiesen und würde durch die u.a. gegen HNgerichteten Antikörper vollständig neutralisiert. 90 6.4 Diskussion Abhängigkeit des RSV-F von Sendai-HN Über das HN-Protein bindet das Sendai-Virus an die potentielle Wirtszelle, genauer gesagt, an Sialinsäure-haltige Strukturen auf der Zielzelle (WU et al., 1980, MARKWELL et al., 1981, 1984). Diese Funktion übt das HN-Protein auch im Virus rSeV-RSV-Fch aus, wie sich durch unsere Versuche zeigte, in denen die Sialinsäuren enzymatisch von der Zelloberfläche entfernt wurden (vgl. Kapitel „5.6 Infektionsvermögen in Abhängigkeit von Sialinsäuren“). Dies gelang mit Neuraminidase aus dem bakteriellen Cholera-Erreger Vibrio cholerae (MARKWELL & PAULSON, 1980). Sowohl das Vergleichsvirus rSeV-DsRed als auch das Virus rSeV-RSV-Fch mit aktiviertem bzw. inaktivem SeV-Fusionsprotein war nach Entfernung des Bindungspartners für das HN-Protein nur in stark vermindertem Maße in der Lage, die Zellen zu infizieren. Die Bindungsqualitäten der Ektodomäne des RSVFusionsproteins können im Zusammenhang einer rSeV-RSV-Fch-Infektion das SeV-HNProtein offenbar nicht ersetzen. Nach einer Regeneration der SeV-Rezeptoren mit Hilfe von Gangliosiden aus bovinem Gehirnmaterial (HOLMGREN et al., 1980) war sowohl für das Kontrollvirus als auch für rSeV-RSV-Fch erneut eine Infektion möglich. Der Bindungspartner für das HN-Protein war wiederhergestellt, und damit war die Fusion durch das SeV-Fusionsprotein und auch durch das chimäre Fusionsprotein wieder möglich. Die Infektion durch rSeV-RSV-Fch über das RSV-Fusionsprotein ist damit zwar unabhängig von einer Aktivierung des SeVFusionsproteins, nicht aber unabhängig von der Bindungsfunktion des HN-Proteins. Ohne diesen Bindungsschritt an die Zielzelle hat das RSV-Fusionsprotein offenbar nicht die Möglichkeit, mit der Plasmamembran der potentiellen Wirtszelle zu interagieren. Sowohl die Immunfluoreszenz-Analyse der infizierten Zellen als auch der Hämagglutinationstest der Zellkultur-Überstände zeigten den Sachverhalt der sinkenden Infektiosität der Viren nach Neuraminidase-Behandlung und die gesteigerte Infektiosität nach anschließender GangliosidBehandlung. Dieser Effekt lässt sich mit einem mengenmäßig geringen Einbau des chimären Fusionsproteins im Vergleich zum SeV-Fusionsprotein in die rSeV-Partikel erklären. Diese geringe Menge an RSV-Fch in den rekombinanten Sendai-Virionen reicht, um das Virus 91 Diskussion fusionsaktiv zu machen; aber sie reicht nicht für eine Bindung der Viruspartikel an die Zielzellen. 6.5 Ausblick In Vorbereitung sind Tests mit rekombinanten Sendai-Viren, in denen ein chimäres Fusionsprotein eingebaut ist, bei dem die Ektodomäne und der Transmembrananker dem RSV-Fusionsprotein entstammen und nur der zytoplasmatische Abschnitt dem SeVFusionsprotein. Mit diesem Ansatz soll gezeigt werden, ob der zytoplasmatische Abschnitt des SeV-F-Proteins ausreichend ist für einen korrekten Einbau und für eine erfolgreiche Infektionsvermittlung durch das chimäre Fusionsprotein im Zusammenhang mit der SendaiVirus-Infektion. Weiterhin ist ein rekombinantes Konstrukt in Vorbereitung, in dem analog zum Virus rSeVRSV-Fch zwar das chimäre RSV-Fusionsprotein mit Transmembrananker und zytoplasmatischen Abschnitt des SeV-Fusionsprotein vorliegt, aber das Gen für das SeVFusionsprotein deletiert ist. Dieses Virus würde nur noch das chimäre Fusionsprotein neben dem HN-Protein auf seiner Oberfläche tragen und wäre in seinem Infektionsvermögen allein von diesem abhängig. Ließe sich ein solches Virus in vermehrungsfähiger Form erzeugen, so wäre dies ein direkter Beweis, dass das RSV-F-Protein eine infektionsvermittelnde Wirkung hat und das rekombinante Sendai-Virus nicht auf das SeV-Fusionsprotein angewiesen ist. Das rekombinante Virus rSeV-RSV-Fch und darauf aufbauende Konstrukte können im weiteren als Vektor dienen, um die Oberflächenproteine von RSV oder ggf. auch anderer schwer amplifizierbarer Viren zu exprimieren und stellen eine gute Alternative zum PlasmidVektor-System dar. Mit Hilfe dieses mausspezifischen, attenuierten Stammes Fushimi des Sendai-Virus kann das Hauptantigen des respiratorischen Synzytialvirus in einem Tierversuch in das Modell Maus eingeschleust werden. Damit lässt sich möglicherweise die Bildung neutralisierender Antikörper gegen RSV im Wirtsorganismus Maus induzieren, was grundlegende Erkenntnisse zur Weiterentwicklung einer Vakzine gegen RSV erbringen 92 Diskussion könnte. So wurde das RSV-Fusionsprotein zum Beispiel in rekombinante Viren der Vesikulären Stomatitis (VSV) eingebaut, denen das eigene G-Protein fehlt. Diese Viren konnten zwar die Bildung von Serum-Antikörpern induzieren, allerdings nicht die Bildung neutralisierender Antikörper (KAHN et al., 2001). Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ergibt sich auch eine interessante Ausweitung des Sendai-Virus-Systems. Ersetzt man das HN-Protein durch einen Antikörper gegen ein Tumorantigen, so erhält man Viren, die gezielt an Tumorzellen binden und durch das RSV-FProtein in diese Zellen eindringen können. Daraus ergibt sich die Perspektive einer gerichteten Zerstörung tumorös entarteter Zellen mit Hilfe von Viren. Es gibt andere Ansätze, mit Hilfe von Virus-Vektor-Systemen Antigene von RSV in ein Tiermodell einzuschleusen. So wurden Hunde und Schimpansen mit rekombinanten Adenoviren des Typs 4, 5 und 7 intratracheal behandelt, welche das Fusionsprotein von RSV exprimierten. Diese Viren erzeugten in den Hunden eine gewisse Bildung neutralisierender Antikörper, und diese wirkten protektiv gegen eine RSV-Infektion. Die orale Verabreichung dieser rekombinanten Adenoviren bei einem Schimpansen führten nur zu einer geringen Antikörper-Antwort auf das RSV-Antigen (HSU et al., 1992). Eine gefriergetrocknete Subunit-Vakzine aus gereinigten RSV-Fusionsprotein, -Glykoprotein und -Matrixprotein konnte zwar in Versuchsmäusen keine Bildung neutralisierender Antikörper stimulieren, aber einen gewissen Schutz in den Lungen vor einer intranasalen RSV-Infektion bewirken (LEVINE et al., 1989). Ebenso konnte gereinigtes RSVFusionsprotein und -Glykoprotein zwar die Bildung von Serumantikörpern in Ratten herbeiführen, nicht aber die von neutralisierenden Antikörpern im Wirtsorganismus provozieren (MURPHY et al., 1989). Intranasale Infektion von BALB/c-Mäusen mit RSV führen zu einer höheren Atemfrequenz und zu einer Dysfunktion der Surfactant-Produktion durch die Pneumozyten des Typs II (VAN SCHAIK, 1997, 1998), nicht aber zu einer Bildung neutralisierender Antikörper. Diskussion 93 Bei Infektionsversuchen finden auch andere Reaktionen des Immunsystems im Tiermodell Beachtung. So kann intraperitoneal verabreichtes RSV in Mäusen das T-Zell-Gedächtnis ansprechen und in vitro zytotoxische T-Zellen aktivieren (BANGHAM et al., 1985). Die CD8+-T-Lymphozyten spielen bei der Eradikation von RSV im Wirtsorganismus eine wichtige Rolle und sind nach einer intranasalen RSV-Infektion als größte LymphozytenFraktion in der bronchoalveolären Spülflüssigkeit auszumachen (OPENSHAW et al., 1989). Sie können im Falle einer Virus-Infektion mit MHC-I präsentierenden Zellen interagieren und bei den betroffenen Zellen eine Apoptose herbeiführen (O’DONNELL et al., 1999). Versuchsreihen mit verimpftem gereinigtem RSV-Fusionsprotein bei natürlich RSVinfizierten Kindern führten beispielsweise zu keiner effektiven Immunität, weder in Bezug auf neutralisierende Antikörper noch auf eine Schleimhautimmunität durch Immunglobuline der Klasse A (IgA) im Respirationstrakt von Kindern (BELSHE et al., 1993). Es gibt Ansätze zu Prototypen von Kombinationsimpfstoffen gegen das humane Parainfluenzavirus 3 und HRSV. Zum Beispiel wurde ein chimäres Protein verimpft, welches Epitope des RSVFusionsproteins und des hPIV-3-Hämagglutinin-Neuraminidase-Proteins präsentiert, welche im Mausmodell die Bildung neutralisierender Antikörper induzierten (DU et al., 1994). Als Baustein zur Entwicklung von Impfstoffen gegen RSV können die rekombinanten Sendai-Viren ebenso beitragen wie als Instrument in der Gentherapie. Hier gibt es die Perspektive, mit diesen Viren therapeutische Gene in Zielzellen einzuschleusen. Aufgrund der Tatsache, dass die Replikation des Sendai-Virus im Zytoplasma stattfindet, kann eine Interaktion des viralen Genoms mit der chromosomischen DNA der Wirtszelle und damit auch eine Komplikation durch mögliche Insertionsmutagenesen, wie z.B. bei Retroviren, ausgeschlossen werden. 7 Zusammenfassung Matthias Hinz Chakterisierung des Fusionsproteins des respiratorischen Synzytialvirus mit Hilfe rekombinanter Sendai-Viren Das respiratorische Synzytialvirus (RSV) ist ein Pneumovirus und gehört zur Familie Paramyxoviridae. Es ist der wichtigste virale Erreger von Infektionen des unteren Respirationstraktes bei Kindern und Kälbern. Für die humane Variante von RSV gibt es keinen zugelassenen Impfstoff. Das Fusionsprotein (F) ist eines von drei Oberflächen-Glykoproteinen bei RSV. Es induziert die Bildung neutralisierender Antikörper im Wirtsorganismus. Darüber hinaus ist es in der Lage, an Heparansulfat-haltige Strukturen zu binden und vermittelt die Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran der Wirtszelle. Wie bei allen anderen Paramyxoviren, muss das inaktive Vorläufer-Fusionsprotein in die Untereinheiten F1 und F2 gespalten werden, um Fusionsaktivität zu erlangen. Multibasische Motive zwischen F1 und F2 ermöglichen die Spaltung durch die ubiquitäre Protease Furin im Trans-Golgi-Netzwerk. Eine Deletionsmutante von RSV, die das Fusionsprotein als alleiniges Oberflächenprotein besitzt, ist in der Lage, Zellen zu infizieren. Um dieses virale Oberflächenprotein genauer zu untersuchen, wurden zwei rekombinante Sendai-Viren konstruiert (rSeV). Das eine Virus (rSeV-RSV-Fnat) erlaubt die Expression des nativen RSV-Fusionsproteins, das andere Virus (rSeV-RSV-Fch) die Expression eines chimären Fusionsproteins, in dem der zytoplasmatische Abschnitt und der Membrananker durch die entsprechenden Abschnitte des SeV-Fusionsproteins ersetzt wurden. Zum Vergleich wurde ein rekombinantes Sendai-Virus eingesetzt, welches ein Gen für einen autofluoreszierenden roten Farbstoff (DsRed) anstelle des Gens für das chimäre Fusionsprotein enthielt (rSeV-DsRed). Dieses Kontrollvirus benötigte für die Bildung infektiöser Virionen die Zusetzung von exogenem Trypsin, weil das SeV-Fusionsprotein anstatt eines multibasischen Spaltmotives nur ein singuläres Arginin an der Spaltstelle besitzt. 95 Zusammenfassung Wie erwartet, war rSeV-DsRed in Zellkultur nur unter Zusetzung von Trypsin vermehrungsfähig. rSeV-RSV-Fch benötigte keine Gabe einer exogenen Protease für das Wachstum in Zellkultur und war folglich unabhängig vom SeV-Fusionsprotein. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Ektodomäne des RSV-Fusionsproteins eine Infektion für das SendaiVirus vermitteln kann. Ebenso wie das chimäre Fusionsprotein wurde das native RSVFusionsprotein in die SeV-Partikel eingebaut, allerdings war es nicht in der Lage, eine Infektion zu vermitteln. Die Anteile des SeV-Fusionsproteins im chimären Konstrukt schienen für die Einleitung der Fusion wichtig zu sein, möglicherweise über eine Interaktion mit den anderen SeV-Proteinen. Eine Behandlung von Zellkulturen mit Neuraminidase führte dazu, dass die Zellen resistent wurden gegen eine Infektion mit rSeV-RSV-Fch. Offenbar ist rSeV-RSV-Fch abhängig von dem Bindungsvermögen des SeV-HN-Proteins an Sialinsäure-haltige Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Das RSV-Fusionsprotein kann also eine Fusion, nicht aber eine Bindung im Zusammenhang einer Sendai-Virus-Infektion vermitteln. Diese These wird dadurch gestärkt, dass sowohl Antikörper gegen RSV-F als auch gegen SeV eine Infektion mit rSeV-RSV-Fch vollständig neutralisierten. rSeV-RSV-Fch ist ein interessantes Werkzeug, um die Immunantwort zu untersuchen, die durch das RSV-F-Protein hervorgerufen wird. Die gezeigten Ergebnisse helfen, den Charakter des RSV-Fusionsproteins zu verstehen und können zur Verbesserung viraler Impfstoffentwicklung beitragen. Vektorsysteme für die Gentherapie und die 8 Summary Matthias Hinz Characterisation of the fusion protein of respiratory syncytial virus in the context of a recombinant Sendai virus infection Respiratory syncytial virus (RSV) is a Pneumovirus belonging to the family Paramyxoviridae. It is the major cause of lower respiratory tract disease in infants and calves. There is no licensed vaccine available for the human variant. The fusion protein (F) is one of three surface glycoproteins of RSV. It induces neutralizing antibodies in the host organism. Furthermore it is able to bind to heparan sulfate structures and mediates fusion of the viral membrane with the plasma membrane of the target cell. Like in all other paramyxoviruses, the inactive precursor fusion protein has to be cleaved into the F1 and F2 subunits to acquire fusion activity. Multibasic motifs between F1 and F2 allow cleavage by the ubiquitous protease furin in the trans-Golgi-network. An RSV deletion mutant containing F as the only surface protein can infect cells. In order to analyze this viral surface protein in more detail two recombinant Sendai viruses (rSeV) were generated. One virus (rSeV-RSV-Fnat) allowed the expression of native RSV-F protein, another one (rSeV-RSV-Fch) the expression of a chimeric fusion protein in which the cytoplasmic tail and the membrane anchor were replaced by the corresponding portions of the SeV fusion protein. For comparison, a recombinant Sendai virus was used, that contained the gene for the red fluorescent protein (DsRed) in place of the chimeric fusion protein (rSeVDsRed). This control virus required the addition of exogenous trypsin for the formation of infectious virions, because SeV-F protein contains a single arginine at the cleavage site rather than a multibasic amino acid motif. As expected, rSeV-DsRed grew in cell culture only in the presence of trypsin. rSeV-RSV-Fch did not require the addition of exogenous proteases for growth in cells and, therefore, was independent of the SeV-F protein. This result demonstrates that the ectodomain of the RSV Summary 97 fusion protein can mediate a SeV infection. The native RSV fusion protein was incorporated into Sendai virions like the chimeric fusion protein, but was not able to mediate an infection. The SeV-F portions in the chimeric construct appear to be important for the entry process maybe by interacting with other SeV proteins. Pretreatment with neuraminidase rendered cells resistant to infection by rSeV-RSV-Fch. Evidently rSeV-RSV-Fch depends on the ability of the HN protein of SeV to attach to sialic acid containing receptors on the cell surface. Therefore, the F protein of RSV can mediate fusion, but not attachment in the context of a SeV infection. This conclusion is supported by the finding that the infection by rSeV-RSV-Fch is prevented both by anti-RSV-F antibodies and anti-SeV antibodies. rSeV-RSV-Fch is an interesting tool to analyze the immune response elicited by the RSV-F protein. The results presented here help to understand the characteristics of the RSV fusion protein and can be important for improving viral vector systems for gene therapy and vaccination. 9 Literaturverzeichnis ABINANTI, F., CHANOCK, R., COOK, M. & WONG, D. (1961): Relationship of human and bovine strains of myxovirus para-influenza 3. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 106, 466-469. ALI, A. & NAYAK, D. P. 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Abbildungsverzeichnis Seite ABBILDUNG 1: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES RESPIRATORISCHEN SYNZYTIALVIRUS ........ 7 ABBILDUNG 2: PROTEOLYTISCHE PROZESSIERUNG DES RSV-FUSIONSPROTEINS...................... 15 ABBILDUNG 3: GENOMORGANISATION DES RESPIRATORISCHEN SYNZYTIALVIRUS ................... 17 ABBILDUNG 4: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES SENDAI-VIRUS .......................................... 20 ABBILDUNG 5: DAS FUSIONSPROTEIN DES SENDAI-VIRUS ........................................................ 24 ABBILDUNG 6: SCHEMA DER GENOME DER DREI REKOMBINANTEN VIREN ............................... 35 ABBILDUNG 7: EXPRESSION DER TRANSGENE RSV-FNAT UND RSV-FCH IN MIT RSEV INFIZIERTEN BHK21-ZELLEN............................................................................................ 67 ABBILDUNG 8: WESTERN BLOT MIT RSEV DSRED, RSEV RSV-FCH UND RSEV RSV-FNAT .... 69 ABBILDUNG 9: ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG DER PROTEINE GEREINIGTER REKOMBINANTER SENDAI-VIRIONEN (RSEV-DSRED UND RSEV-FSV-FCH) MIT NACHFOLGENDER COOMASSIE-FÄRBUNG.......................................................................... 70 ABBILDUNG 10: AKTIVIERUNG DER FUSIONSPROTEINE VON SEV UND RSV ............................. 72 ABBILDUNG 11: INFEKTION VON BHK21-ZELLEN DURCH RSEV-DSRED, RSEV-RSV-FCH BZW. RSEV-RSV- FNAT IN GEGENWART ODER ABWESENHEIT VON EXOGENEM TRYPSIN ......... 73 ABBILDUNG 12: VERMEHRUNGSKURVE VON RSEV-DSRED (A), RSEV-RSV-FCH (B) UND RSEV-RSV-FNAT (C) IN BHK21-ZELLEN ........................................................................ 76 ABBILDUNG 13: NEUTRALISATIONSVERMÖGEN DIVERSER ANTIKÖRPER GEGEN RSV-F........... 77 ABBILDUNG 14: PLAQUEREDUKTIONSTEST MIT EINEM NEUTRALISIERENDEN ANTIKÖRPER GEGEN RSV-F ................................................................................................................... 79 ABBILDUNG 15: INFEKTIONSHEMMUNG MIT POLYKLONALEM SENDAI-ANTISERUM.................. 80 ABBILDUNG 16: DESIALYLIERUNG UND GANGLIOSID-BEHANDLUNG VON VERO-ZELLEN ........ 83 Tabellenverzeichnis Seite TABELLE 1: VERTRETER DER FAMILIE PARAMYXOVIRIDAE ........................................................... 2 TABELLE 2: FUNKTION UND EIGENSCHAFT DER RSV-PROTEINE................................................. 8 TABELLE 3: FUNKTION UND EIGENSCHAFTEN DER SEV-PROTEINE ........................................... 21 TABELLE 4: SPALTSTELLENMOTIVE VIRALER GLYKOPROTEINE ................................................ 26 Abkürzungsverzeichnis °C A AEC APS BHK BCA bp BRSV BVD bzw. C Ca CD cDNA Cl cm DABCO d.h. DNA DMF DMSO Ds(Red) DTT ELISA EMEM env ER et al. F Fa. FELASA Fch FITC FKS Fnat G G H20 HAU HN hPIV Grad Celsius Adenin 5-Amino-9-ethylcarbazol Ammoniumpersulfat baby hamster kidney Bicinchonininsäure Basenpaar bovines respiratorisches Synzytialvirus bovine Virus Diarrhoe beziehungsweise Cytosin Kalzium cluster of differentiation (Differenzierungscluster) komplementäre DNA Chlor Zentimeter 1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-oktan das heisst desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Discosoma(Red) 1,4-Dithiothreit enzyme-linked immunosorbend assay Earl`s Minimum Essential Medium envelope Endoplasmatisches Retikulum et alii (und andere) Fusionsprotein Firma Federation of European Laboratory Animal Science Associations chimäres Fusionsprotein Fluoresceinisothiocyanat fetales Kälberserum natives Fusionsprotein Glykoprotein Guanin Wasser hämagglutinierende Einheiten Hämagglutinin-Neuraminidase humanes Parainfluenza-Virus HRSV Ig K kDa L M M MA m.o.i. Mab MD MDCK Mg mg mm mM MHC ml µl MRM mRNA N N2 Na NH2 nm NS P p.i. PO4 PAGE PBS PBSM PFU pH POD PPRV PVM RNA rpm RSV Schw. SDS SeV SH humanes respiratorisches Synzytialvirus Immunglobulin Kalium Kilo-Dalton large protein (großes Protein) Matrixprotein Mol Milliampere multiplicity of infection monoclonal antibody (monokonaler Antikörper) mucosal disease Madin Darby Canine Kidney Magnesium Milligramm Millimeter millimolar major histocompatibility complex (Haupthistokompatiblitätskomplex) Milliliter Mikroliter murine respiratorische Mykoplasmose messenger RNA Nukleokapsidprotein Stickstoff Natrium Ammonium Nanometer Nichtstrukturprotein Phosphoprotein post infectionem (nach Infektion) Phosphat Polyacrylamidgel-Elektrophorese phosphate buffered saline PBS ohne Calcium- und Magnesiumsalze plaque forming units (Plaque-bildende Einheiten) potentia hydrogenii Peroxidase peste-des-petits-ruminants virus (Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer) pneumovirus of mice (Pneumonievirus der Maus) ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) respiratorisches Synzytialvirus Schwein sodium dodecylsulfat (Natriumdodecylsulfat) Sendai-Virus small hydrophobic protein (kleines hydrophobes Protein) S-S T Tab. TEMED TRIS TRTV T-(Zelle) V vgl. VSV z.B. Disulfidbrücke Thymin Tabelle N,N,N’,N’-Tetramethyl-Ethylendiamin Tris(hydroxymethyl)-aminomethan turkey rhino tracheitis virus (Rhinotracheitisvirus der Pute) T = im Thymus herangereift Volt vergleiche Virus der Vesikulären Stomatitis zum Beispiel Aminosäuren A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y Alanin Cystein Asparaginsäure Glutaminsäure Phenylalanin Glycin Histidin Isoleucin Lysin Leucin Methionin Asparagin Prolin Glutamin Arginin Serin Threonin Valin Tryptophan Tyrosin Tagungsbeiträge Teile der vorliegenden Arbeit wurden auf folgenden Tagungen präsentiert: Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Erlangen, 8.-11. April 2002 Poster: “Expression of the fusion protein of respiratory synzytial virus by recombinant Sendai virus” Hinz, M., Zimmer, G., Bossow, S., Neubert, W. und Herrler, G. Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Berlin, 26.-29. März 2003 Poster: “Expression of the fusion protein of respiratory synzytial virus by recombinant Sendai virus” Hinz, M., Zimmer, G., Bossow, S., Neubert, W. und Herrler, G. XII International Conference on Negative Strand Viruses, Pisa/Italien, 14.-19. Juni 2003 Vortrag: “Functional analysis of the fusion protein of the respiratory synzytial virus in the context of a Sendai virus infection” M Hinz, G Zimmer, S Bossow, W Neubert and G Herrler Danksagung Mein Dank gilt besonders Herrn Prof. Dr. Georg Herrler für die Bereitstellung des Themas und für die stets hervorragende Betreuung der Arbeit. Ich danke Herrn Dr. Gert Zimmer für seine fachlichen Anregungen und seine Unterstützung bei technischen Sachfragen im Labor. Der AG Neubert des Max-Planck-Institutes für Biochemie danke ich für die Vermehrung der rekombinanten Viren und die Unterstützung bei fachlichen Fragen, namentlich Herrn Prof. J. Dr. Wolfgang Neubert, Herrn Dr. Sascha Bossow und Frau Christine Baumann. Bei allen Kolleginnen und Kollegen der Abteilung Molekulare Virologie bedanke ich mich sehr für das ausgesprochen angenehme Arbeitsklima und die sehr gute Kollegialität. Namentlich sind dies Sandra Bauer, Andrea Hanika, Martina Kaps, Wiebke Köhl, Birthe Larisch, Diana Panayotova, Dr. Christel Schwegmann-Weßels, die mich für die Virologie gewonnen hat, Brigitte Voges, Christine Winter und die Ehemaligen Christine Pohl, Oliver Schlenker und Ina Trotz. Ich bedanke mich bei allen anderen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Institutes für Virologie für die gute Atmosphäre im Hause, insbesondere beim Kuchenclub, bei den spielstarken Virus All Stars, meinem Kollegen in der Anmeldung Dennis Bente, meinem Waidgenossen Sebastian Fischer, unserem Experten für Radsport und Individualtourismus Helmut Schulz und unserem Kollegen in Übersee Ariel Pereda. Von Herzen danke ich meinen Eltern, meiner ganzen Familie, meinen Freunden und Mitbewohnern und meiner Freundin Karolina, die mich während meiner Doktorarbeit einfach dadurch unterstützt haben, dass es sie in meinem Leben gibt. Anhang Nukleotidsequenz von RSV-Fch mit den Schnittstellen MlUI und BssHII ACGCGTACAATGGAGTTGCCAATCCTCAAAGCAAATGCAATTACCACAATCCTCGCTGCAGTCAC ATTTTGCTTTGCTTCTAGTCAAAACATCACTGAAGAATTTTATCAATCAACATGCAGTGCAGTTAGC AAAGGCTATCTTAGTGCTCTAAGAACTGGTTGGTATACTAGTGTTATAACTATAGAATTAAGTAAT ATCAAGGAAAATAAGTGTAATGGAACAGATGCTAAGGAAAAATTGATAAAACAAGAATTAGATAA ATATAAAAATGCTGTAACAGAATTGCAGTTGCTCATGCAAAGCACATCAGCAGCAAACAATCGAG CCAGAAGAGAACTACCAAGGTTTATGAATTATACACTCAACAATACCAAAAAAACCAATGTAACA TTAAGCAAGAAAAGGAAAAGAAGATTTCTTGGTTTTTTGTTAGGTGTTGGATCTGCAATCGCCAGT GGCATTGCTGTATCTAAGGTCCTGCACTTAGAAGGAGAAGTGAACAAGATCAAAAGTGCTCTACTA TCCACAAACAAGGCCGTAGTCAGCTTATCAAATGGAGTTAGTGTCTTAACCAGCAAAGTGTTAGAC CTCAAAAACTATATAGATAAACAATTGTTACCTATTGTGAATAAGCAAAACTGCAGAATATCAAAT ATAGAAACTGTGATAGAGTTCCAACAAAAGAACAACAGACTACTAGAGATTACCAGGGAATTTAG TGTTAATGCAGGTGTAACTACACCTGTAAGCACTTACATGTTAACTAATAGTGAATTATTGTCATTA ATCAATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAAAAAGTTAATGTCCAACAATGTTCAAATAGTTAGA CAGCAAAGTTACTCTATCATGTCCATAATAAAAGAGGAAGTCTTAGCATATGTAGTACAATTACCA CTATATGGTGTGATAGATACACCTTGTTGGAAATTACACACATCCCCTCTATGTACAACCAACACA AAAGAAGGGTCAAACATCTGTTTAACAAGAACTGACAGAGGATGGTACTGTGACAATGCAGGATC AGTATCTTTCTTCCCACAAGCTGAAACATGTAAAGTTCAATCGAATCGAGTATTTTGTGACACAATG AACAGTTTAACATTACCAAGTGAAGTAAATCTCTGCAATGTTGACATATTCAATCCCAAATATGAT TGTAAAATTATGACTTCAAAAACAGATGTAAGCAGCTCCGTTATCACATCTCTAGGAGCCATTGTG TCATGCTATGGCAAAACTAAATGTACAGCATCCAATAAAAATCGTGGAATCATAAAGACATTTTCT AACGGGTGTGATTATGTATCAAATAAAGGGGTGGACACTGTGTCTGTAGGTAACACATTATATTAT GTAAATAAGCAAGAAGGCAAAAGTCTCTATGTAAAAGGTGAACCAATAATAAATTTCTATGACCC ATTAGTATTCCCCTCTGATGAATTTGATGCATCAATATCTCAAGTCAATGAGAAGATTAACCAGAG TTTAGCATTTATTCGTAAATCCGATGAATTATTACATCATGTAAATGCTGGTAAATCAACCACAAAT ACTGTGATTACGATCATAGTAGTTATGGTCGTAATATTGGTGGTCATTATAGTGATCGTCATCGTGC TTTATAGACTCAAAAGGTCAATGCTAATGGGTAATCCAGATGACCGTATACCGAGGGACACATATA CATTAGAGCCGAAGATCAGACATATGTACACAAACGGTGGGTTTGATGCGATGGCTGAGAAAAGA TGAGCGCGC
