Weitere chemische, histochemische und histologische

Weitere chemische, histochemische und histologische Untersuchungen
über Veränderungen in G e w e b e n von Säuglingsmäusen
nach Coxsackie-Virus-Infektion*
Von
WOLFGANG ALBRECHT
u n d ROLAND
GÄDEKE
Aus der Univ.-Kinderklinik Freiburg i. Br. (Dir.: Prof. Dr. W. K e l l e r )
(Z. Naturforsdig. 11 b, 241
247 [1956]; e i n g e g a n g e n am 14. J a n u a r 1956)
Nadi Infektion mit Coxsackie Aj-, A.,- oder A 3 -Viren wurden im Skelettmuskel der Säuglingsmaus in morphologisdi beeinträchtigten Muskelfasern außer Fe(III) und Fettstoffen RibosePolynucleotide färberisch darstellbar. UV-spektroskopisch ließ sidi in Extrakten solcher Muskelbereiche gegenüber Normalkontrollen eine Erhöhung sowohl der Extinktion im Bereiche der
Gesamt-NS- als auch der Eiweißabsorption nachweisen; dabei waren die Proteine relativ stärker vermehrt. Die quantitative Analyse der Muskulatur ergab dagegen keine signifikante Erhöhung des RNS- und DNS-Gehaltes gegenüber Normaltieren. Auch der Eiweißgehalt zeigte
keine Veränderungen. Bei der photometrisch ermittelten NS- und Eiweißvermehrung handelt
es sich danach lediglich um eine leichtere Extrahierbarkeit dieser Substanzen aus dem geschädigten Muskel.
Der Lipidphosphor und der gesamt-säurelösliche Phosphor ließen keine signifikanten Unterschiede zwischen gesunden Mäusen und infizierten Tieren im Lähmungsstadium erkennen. Das
anorganische Phosphat dagegen war im manifest gelähmten Muskel gegenüber den Kontrollen
signifikant erhöht.
Im Gehirn von Säuglingsmäusen, welche mit Coxsackie B t -Virus infiziert waren, blieben die
verschiedenen Phosphorfraktionen unverändert.
D
ie Abklärung der Frage, welcher Art die Auswirkungen einer Coxsackie-Virus-Infektion seien,
ging ursprünglich von histologischen Untersuchungen
an der Säuglingsmaus aus. Als feingewebliches Substrat gelten dabei Skelettmuskel-Veränderungen im
Sinne einer Z e n k e r sehen Degeneration 1 ; sekundäre, durch den Muskelgewebs-Untergang bedingte
Auswirkungen stellen Nierenschäden dar 2 , welche
— in ihrer Entstehung zwanglos erklärbar — das
histologische Bild einer myoglobinurischen Nephrose
bieten. Den Coxsackie-B-Virus-Infektionen der Säuglingsmaus wird vordringlich die morphologisdie Trias:
Encephalitis, Myositis, Panniculitis, unterstellt.
Die Kenntnisse über stoffliche Reaktionen, welche
während einer Coxsackie-Virus-Infektion in den formal und funktionell beeinträditigten Geweben ablaufen, sind lückenhaft. Sie allein aber können letzten
Endes Fragen der grundsätzlichen Vorgänge während einer Auseinandersetzung zwisdien dem Virus
und dem befallenen Wirt abklären. Im einzelnen ist
bekannt, daß nach der Coxsackie-A-Virus-Infektion
im Skelettmuskelgewebe der Säuglingsmaus das Virus in erheblichen Mengen nachweisbar wird 3, daß
mit zunehmender Infektionsdauer ein Kaliumschwund und Natriumanstieg im Muskel erfolgt 4- 5 ,
daß eine Verminderung des Muskelkreatinins festgestellt werden kann 5 und daß der Glykogengehalt
der gelähmten Muskulatur nach Infektion mit dem
Ao-Stamm signifikant erniedrigt wird 6 . Wie Untersuchungen über die Phosphatase-Aktivität im Muskelgewebe ergeben haben 8 " 8 , bestehen signifikante
Unterschiede zwischen gesunden Kontrollmäusen und
gelähmten Tieren nach Coxsackie-A2-Virus-Infektion;
nach Infektion mit dem A1-Stamm konnte in der ge-
* Die Untersuchungen wurden durch Mittel der
D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t , der
D e u t s c h e n V e r e i n i g u n g zur B e k ä m p f u n g
d e r K i n d e r l ä h m u n g e. V. und des B a d i s c h e n
Komitees
zur B e k ä m p f u n g und
Erfors c h u n g d e r s p i n a l e n K i n d e r l ä h m u n g unterstützt.
i R. G i f f o r d u. G. D a l l d o r f , Amer. J. Pathol.
27, 1047 [1951].
^ R. G ä d e k e , Naturwissenschaften 39, 71 [1952];
A.M.A. Arch. Pathol. 54, 276 [1952],
3 J.
L. M e 1 n i c k u. G. C. G o d m a n , J. exp.
Medicine 93, 247 [1951].
4 R. G ä d e k e
u. H. W a l t e n b e r g e r , Z. Naturforschg. 7 b, 524 [1952].
5 R. G i f f o r d u. G. D a l l d o r f , Proc. Soc. exp.
Biol. Med. 71, 589 [1949].
« W. A l b r e c h t , Z. Naturforschg. 9 b , 583 [1954],
" G. A. K a u s c h e , C b . L a n d s c h ü t z u. R.
S a u t h o f f , Z. Naturforschg. 6 b, 445 [1951].
8 W. A 1 b r e c h t u. R. S a u t h o f f , Z. Naturforschg. 9 b, 340 [1954],
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lähmten Mäusemuskulatur diese Aktivitätssteigerung
der alkalischen und sauren Phosphatase nicht gefunden werden. Auch schienen signifikante Unterschiede
zwischen anorganischem und Gesamtphosphor nicht
zu bestehen 8.
Die experimentellen Ergebnisse einer histochemischen Analyse stofflicher Abweichungen in der Muskulatur der mit Coxsaekie-A-Virus infizierten Säuglingsmäuse sind spärlidi. Nachgewiesen sind Anhäufungen von Fettstoffen und Fe(III) in körnigen, perlschnurförmigen basophilen Strukturen in den „hyalingeschwollenen" Muskelfasern 2 ' 9 . Eine gelungene histochemische Darstellung von Calcium wurde mittels der nicht sehr spezifischen Methode von C o s s a
durch P e 11 e 10 u. a. 9 mitgeteilt; unsere eigenen Prüfungen mit der Calciumdarstellung nach K r e t i n
verliefen negativ; auch die Ergebnisse einer sehr präzisen histologischen Darstellung von A u m o n i e r 1 1
spricht gegen eine Muskelverkalkung im akuten Stadium. Eine Aktivierungssteigerung saurer und alkalischer Phosphatase konnte histochemisch nicht nachgewiesen werden 1 2 . Die Ergebnisse histiospektrographischer Untersuchungen 1:5 lassen den Schluß zu,
daß sich im Verlaufe der Infektion mit dem Coxsackie-Ao-Virusstamm im Säuglingsmuskel eiweißund nucleoproteidreiche perinucleäre Verdichtungszonen bilden, die sich rasch über den ganzen Muskelfaser-Querschnitt ausbreiten.
Eine Erweiterung und Vertiefung der aufgeführten Ergebnisse waren vorzüglich durch Prüfungen des
Verhaltens der Nucleotide sowie deren Spaltprodukte zu erwarten. Zu diesem Zwecke verglichen wir
spektrographisch den relativen Nucleinsäure- und
Proteingehalt in dem Skelettmuskelgewebe gesunder
und mit Coxsackie-A-Virus infizierter Säuglingsmäuse.
Ergänzend wurde mittels histochemischer Methoden
versucht, die Lokalisation nachweisbarer Nucleotide
zu ermitteln. Zur Differenzierung der damit gewinnbaren und nur sehr überschlägigen Aussagen führten wir weiterhin quantitative Untersudiungen über
den Gehalt des Muskelgewebes an RNS und DNS
durch. Da bei der Methodik der schon zitierten früheren Untersuchungen s über die Phosphatase-Aktivität die Möglichkeit bestanden hatte, daß fermentative Abbauprozesse organischer, labiler Phosphor-
Verbindungen die Werte des anorganischen und säurelöslichen Phosphors beeinflussen, wurden entsprechende Untersuchungen mit geänderter Methodik
wiederholt und auf Phospholipide ausgedehnt. Zusätzlich wurde neben den Coxsackie-A r und -A2Viren der A 3 -Stamm in diese Untersuchungen einbezogen, da dieser — entsprechend dem Coxsackie-A r
Virus — keine Aktivitätsvermehrung der sauren und
alkalischen Phosphatase in der gelähmten Muskulatur verursacht 14 .
!) G. C. G o d m a n , H. B u n t i n g
u. J. L. M e 1 n i c k , Amer. J. Pathol. 28, 583 [1952].
H. P e 11 e , Mschr. Kinderheilkunde 100, 155 [1952],
" F. J. A u m o n i e r , J. Rov. Microsc. Soc. Ser. 3, 72,
218 [1953].
R. S a u t h o f f , unveröffentlichte Mitt.
13 G. A. K a u s c h e
u. H. H o f f m a n n - B e r l i n g ,
Z. Naturforschg. 7 b, 518 [1952].
14 W. A l b r e c h t , unveröffentlichte Mitt.
* Methodik nach P i r i n g e r , s. bei R o m e i s , Mikroskopische Technik, München 1948, §§ 1264, 1265.
Um die Frage zu klären, ob nach Coxsackie-B r
Infektion im Gehirn von Säuglingsmäusen ähnliche
Veränderungen wie in der Muskulatur nach Infektion
mit den Coxsackie-A-Viren auftreten, wurde das Gehirn erkrankter Säuglingsmäuse nach Verabreichung
von Coxsackie-Bj-Virus auf die Aktivität der sauren
und alkalischen Phosphatase und auf das Verhalten
der schon aufgeführten Phosphorfraktionen untersucht.
Material und Methodik
T i e r m a t e r i a l u n d V i r u s s t ä m m e : Wir verwendeten ein bis drei Tage alte Albinomäuse. Die Infektion erfolgte s.e. oder i.p. mit ca. 0,01 ccm einer bakterienfreien NaCl-Muskel/Gehirnsuspension von Säuglingsmaus-Passagen der Coxsackie-Virustypen A r A„ oder
A.j bzw. B r Insgesamt wurden ca. 450 Mäuse für die
Hauptversuche eingesetzt.
U n t e r s u c h u n g s g ä n g e : Nach 45—50 Stdn. waren die Mäuse in typischer Weise mit Strecklähmungen
der hinteren Extremitäten schwer krank. Zur histochemischen Untersuchung töteten wir einen Teil der Tiere im
Äther. Paraffinschnitte unterschiedlidier Skelettmuskelbereiche, in welchen die charakteristischen Läsionen vorlagen, wurden folgenden Färbungen und Reaktionen unterzogen:
1. Übersichtsfärbung mit Hämatoxylin/Alaun-Eosin,
2. Fettfärbung mit Scharlachrot,
3. Eisenreaktionen:
a) nach T u r n b u l l [Fe(III)],
b) Berlinerblaureaktion [Fe(II)],
4. Methylgrün Pyroninfärbung,
5. F e u 1 g e n sehe Nuklealreaktion,
6. Färbung mit Acetat/Veronal ( M i c h a e l i s ) - gepufferter Methylenblaulösung bei konstantem
von
4,9
7. Behandlung der Schnitte mit B i a 1 s Reagenz.
Die gleichen Untersuchungen wiederholten wir an
Schnitten, welche über 8 Stdn. bei 37° C in einer 0,01-
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proz. trvpsin-freien Ribonuclease-Lösung gestanden hatten **.
Zur Kontrolle des Verhaltens der histologisch erfaßbaren Innenstruktur der Muskelfasern färbten wir in weiteren Schnitten die Myofibrillen mit Eisenhämatoxylin
nach Heidenhain.
Um Fehlerbreiten durch unterschiedliche Blutverteilungen in der Muskulatur einzuengen, wurden für alle anderen Untersuchungsgänge die Kontrollmäuse und die infizierten Tiere auf Filtrierpapier entblutet.
UV- s p e k t r o s k o p i s c h e U n t e r s u c h u n g e n :
Von jeweils 3 Säuglingsmäusen zusammen wurde 10 bis
20 mg Skelettmuskelgewebe aus dem Bereiche des Bekkens, der hinteren Extremitäten und der langen Rückenmuskeln präpariert und nach Wägung in 10-proz. NaClLösung über 4 Stdn. kalt extrahiert (— 18° C). Nach Entfernung der Muskelstückchen erfolgte eine 8-stdg. Dialyse des Extraktes im Cellophanschlauch gegen 10-proz.
NaCl-Lösung; in Stichproben versicherten wir uns, daß
danach die niedermolekularen Bestandteile aus dem Extrakt entfernt waren (Bestimmung des anorganischen und
säurelöslichen Phosphors mittels der Molybdänblau-Methode). Die anschließende UV-Absorptionsmessung wurde
mit dem Zeißschen Spektralphotometer vorgenommen.
Wir bestimmten die Absorption der Extrakte bei den
Banden 250—300 mu. Aus dem Verhältnis der Absorption 280 m«/Absoq:>tion 260 m« ermittelten wir Annäherungswerte des relativen Gesamt-Nucleinsäuregehaltes
der Extrakte. Wir bedienten uns dabei entsprechend der
Angaben von W a r b u r g und C h r i s t i a n 1 5 der in
Abb. 1 angefügten Kurve. Die Trennung der RNS von
der DNS erfolgte nach S c h m i d t und T h a n n h a u s e n « durch Alkalispaltung (2-n. NaOH) der RNS bei
38° C, anschließend der DNS-Fällung des eiswasser-gekiihlten Muskelextraktes mit HC10 4 und nochmaliger
Absorptionsmessung des angesäuerten Extraktes.
Die diemischen
Untersudiungen
wurden nach Homogenisierung der Muskulatur in 6 ccm 7-proz. Trichloressigsäure durchgeführt. In einem Aliquot der aufgewirbelten Suspension wurde nach K j e 1 d a h 1 der GesamtN bestimmt. 3 ccm der jeweiligen Suspension wurde zentrifugiert, das Zentrifugat nach S c h n e i d e r 1 7 mit 10proz. Trichloressigsäure ausgewaschen und in den vereinigten Extrakten der anorganische und gesamt-säurelösliche Phosphor bestimmt. Der Niederschlag wurde nach
Suspension in 1 ccm destilliertem Wasser nach Zusatz von
4 ccm 96-proz. Alkohol sowie ein zweites Mal mit 96proz. Alkohol in der Kälte extrahiert; anschließend wurde
die Extraktion mit Alkohol-Äther-Gemisch 3 : 1 in der
Wärme 3-mal wiederholt. Die Veraschung des säurelöslichen Phosphates und des lipoidgebundenen Phosphors
** Wir erhielten die Ribonuclease durch die CIBA-AG,
Wehr/Baden, von der Worthington Biochemical Sales
Co., Freehold, New Jersey, USA, zur Verfügung gestellt.
Wir danken der CIBA-AG bestens für die Überlassung.
15 O. W a r b u r g u. W. C h r i s t i a n , Biochem. Z.
310, 384 [1941],
G. S c h in i d t u. S. J. T h a n n h a u s e r , J. biol.
Chemistry 161, 83 [1945],
W. C. S c h n e i d e r , J. biol. Chemistry 161, 293
[1945].
wurde (nach Evaporierung des Lösungsmittels) nach K a h a n e w mit 65-proz. HNO., und 60-proz. HC10 4 durchgeführt.
Zur Bestimmung der RNS wurde der im Vakuum getrocknete Niederschlag nach T h a n n h a u s e r 1,1 in 2-n.
KOH bei 37° gelöst, nach Abkühlung im Eiswasser mit
6 ccm 1-n. HC10 4 versetzt und nach Zentrifugation die
Extinktion bei 260 m« im Überstand bestimmt. Die Extraktion der DNS erfolgte entsprechend dem Vorschlag
von D a v i d s o n 1 9 nach der modifizierten Methode von
O g u r und R o s e n - 0 durch Behandlung des Niederschlages mit 1-n. HClOj bei 80° C über 30 Minuten. Im
Überstand wurde die Extinktion bei 260 m« nach Abkühlung in Eiswasser und Zentrifugation bestimmt.
Ergebnisse
Zu dem gewählten Zeitpunkt der
Untersuchung
erwiesen sich nach dem histologischen Bild Muskelfaserbezirke als so schwer beeinträchtigt, daß sich
lediglich die leeren Sarkolemschläuche in einem zellarmen
interstitiellen Ödem darstellten.
Soweit
die
Fasern noch erhalten waren, boten sie das bekannte
Bild der „hyalinen Schwellung" mit kettenförmigen
basophilen Einlagerungen.
D e r Ausfall
der histiochemischen
ist in
Reaktionen
der Abb. 2 * und in der Tab. 1 dargestellt. Die Ergebnisse bestätigen, daß in den basophilen Einlagerungen ionisiertes F e ( I I I ) und Fettstoffe
vorliegen.
Die negative Nuclealreaktion ( F e u l g e n ) weist aus,
daß diese Formationen keine D N S
enthalten.
Die
rote Tingierung der Granula und Streifen in der Methylgriin-Pyroninfärbung ist als Effekt lokaler R N S Anreicherungen zu interpretieren-' 1 ; allerdings muß
berücksichtigt
werden,
polymerisation
bung bewirken
daß mit zunehmender
auch DNS-Bruchstücke eine
können - 2 .
Durch
De-
Rotfär-
Behandlung
mit
Methylenblaulösung bei pu 4,9 werden die uns interessierenden Granula tief blau angefärbt; nach den
Angaben von H a e n e 1
spricht dies dafür, daß sie
reichlich Ribose-Polynucleotide enthalten. Die schwache Rötung nach Behandlung mit Bials Reagens läßt
wiederum
ein Vorhandensein
von
Thymonuclein-
säure vermuten. Alle aufgeführten Reaktionen waren
sehr erheblich abgeschwächt oder aufgehoben, wenn
die Gewebsschnitte mit Ribonuclease
vorbehandelt
E. K a h a n e , Bull. Soc. Chim. biol. 14, 284 [1932],
J. N. D a v i d s o n , The Biochemistry of the
nucleic acids, II. Aufl., London, New York 1953, S. 74 ft.
20 M. O g u r
u. G. R o s e n , Arch. Biochemistry 25,
262 [1950],
* Abb. 2 u. 3 s. Tafel S. 272 d u. e.
21 J. B r ä c h e t ,
C. R. Seances Soc. Biol. Filiales 1,
88 [1940],
N. K u r n i c k , J. gen. Physiol. 33, 243 [1950].
23 U. H a e n e l , Helv. med. Acta 17, 627 [1950],
1!)
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5500
E
5000
1500
1000
3500
% Nucleinsäure
—
Abb. 1. Funktion von Absorptionsquotient Protein/Nueleinsäure zu prozentualem
Nueleinsäuregehalt einer Misehung beider Stoffgruppen
(nach O. W a r b u r g und
W. C h r i s t i a n , Biochem.
Z. 310, 384 [1941]).
2500
2000
250
260
270
280
290
300
Wellenlänge in
rn.fi
—
°
Wellenlänge in m/i
Abb. 4 a.
Abb. 4.
UV-Absorptionskurven
wässeriger Muskelgewebsextrakte
von Säuglingsmäusen, a) Normalkontrollen. b) 45—50 Stdn. nadi
Coxsackie-Ai-Virus-Infektion.
c)
45—50 Stdn. nach Coxsackie-A«Virus-Infektion. d) 45—50 Stdn.
nach Coxsackie-As-Virus-Infektion.
I. Gesamtextrakte (Protein und
Gesamt-NS enthaltend). II. Extrakte nach Alkali-Säure-Behandlung (RNS-Bruchstiieke enthaltend).
3000
E
2500
2000
290
300
250
Wellenlänge in mfi
Abb. 4 b.
260
—»-
worden waren. Die parallel laufende
Darstellung der Myofibrillen ließ im Stadium der hyalinen Sdiwellung eine Verklumpung der normalen Innenstruktur
der Muskelfasern mit nadifolgender Auflösung erkennen (Abb. 3).
Ein Vergleich der UV-Absorptionskurven von Muskelextrakten gesunder Säuglingsmäuse und von Tieren, die mit
Coxsackie-A1,A2,A3-Viren infiziert waren,
ließ im Bereich der 260—280-m//-Banden eine Erhöhung der Extinktionswerte
erkennen; der Gehalt der Extrakte an
Gesamt-NS oder deren Bruchstücke
scheint danach ebenso wie der Eiweißgehalt vermehrt zu sein (Abb. 4 a, b, c,
d I). Nadi Alkali/'Säurebehandlung sprachen — verglidien mit Normalkontrollen
— die Absorptionsmeßwerte von Muskelextrakten von Säuglingsmäusen, die
mit Coxsackie-A-Virus infiziert waren,
gegen Vermehrungen von RNS-Bruchstücken (Abb. 4 a, b c, d l l ) . Berücksichtigt man die Funktion (Abb. 1) zwischen
dem Quotienten von Absorption 280 m/r
Absorption 260 mfi und dem GesamtNS-Gehalt ( W a r b ü r g und C h r i s t i a n ) , so kann in unseren Meßergebnissen nach Coxsackie-A-Virus-Infektion
eine leichtere Extrahierbarkeit der Proteine im Verhältnis zu den Nucleinsäuren festgestellt werden (Tab. 2), als sie
bei den Normaltieren ermittelt wurde.
Bei der quantitativen chemischen Analyse wurden die Werte für Phosphor auf
den Gesamt-N bezogen und als Quotient mg P : mg Gesamt-N ausgedrückt.
Der Nueleinsäuregehalt ist in mg NS angegeben; als Testsubstanz diente reinste
Ribo-Nucleinsäure ( B a y e r ) . Auch hier
wurde auf den Gesamt-N bezogen.
Außerdem wurde das Frischgewicht als
Bezugssystem gewählt, doch lag die mittlere Fehlerbreite hier deutlich über dem
Stickstoffwert. Wie aus Tab. 1 hervorgeht, waren die Werte für anorganischen
und gesamt-säurelöslichen Phosphor bei
den Kontrollen niedriger als bei den gelähmten Tieren. Besonders deutlidi beobachteten wir dies bei anorganischem P,
während bei gesamt-säurelöslichem Phos-
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phor die Werte innerhalb der
Fehlersehwankungs-Breiten lagen.
Nach Infektion mit dem Aj-Stamm
war der anorganische P nur mäßig
erhöht, dagegen lagen die Werte
bei Infektion mit den CoxsackieA 2 - und A 3 -Viren erheblich höher;
die Vermehrung des anorganischen
Phosphats erwies sich in der gelähmten Muskulatur für alle drei
Stämme signifikant. Der Lipoidphosphor verhielt sich bei den
Kontrollen und den erkrankten
Tieren gleich. Nach Infektion mit
dem Coxsackie-Bj-Virus entsprachen die Werte der einzelnen Phosphatfraktionen im Gehirn denen
der gleichaltrigen Kontrollen (Tab.
3). Die Aktivität der alkalischen
und sauren Phosphatase des Gehirngewebes entsprach derjenigen
der Altersklasse.
Die Untersuchung des Nucleinsäuregehaltes ergab, daß durch
Infektion mit Coxsackie-A-Viren
keine signifikanten quantitativen
Veränderungen in der gelähmten
Muskulatur geschaffen werden. Wie
Tab. 1 zeigt, blieb der DNS-Gehalt
durch die Virusinfektion völlig unverändert. Die RNS wies gewisse
Schwankungen auf, welche aber
nicht als signifikant anzusprechen
sind. Bei Infektion mit den Coxsackie-Viren Aj und A3 war ein
leichtes Ansteigen der RNS zu beobachten, nach A 2 -Infektion lag
der RNS-Wert etwas unterhalb
der Norm. Nach Coxsackie-B r Virus-Infektion entsprachen die ermittelten Nucleinsäurewerte des
Gehirns denen der Normalkontrollen.
Besprechung der Ergebnisse
Der Widerspruch, den die Ergebnisse unserer Untersuchungen
auf den ersten Blick in sich zu tragen scheinen, löst sich bei einer
sinnvollen Zuordnung der Befunde
auf. Nach der Coxsackie-A-Virus-
1000
E
-
M
§
n
260
270
280
Wellenlänge in mfi -
290
i
250
i
i
i
i
260 210 280
290
Wellenlänge in m^i
300
Abb. 4 c.
3000
2500
2000
250
260
210
280
290
300
Wellenlänge in m/u.
-
500
i i
250
Abb. 4 d.
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n
260
270
280
Wellenlänge in m/n
i
i
290
i i
300
CoxsaekieAa-Stamm
CoxsackieAi-Stamm
CoxsackieA:j-Stamm
Kontrollen
Histoehemische Reaktionen
unterschiedliche kleine Fetttröpfehen in den Muskelfasern
grobe Streifen und Granula
negativ
rötliche Streifen und Granula in
den Muskelfasern
negativ
kräftig blaue Streifen und Granula in den Muskelfasern
feine rötliche und wenige blaßgrüne Granula in den Muskelfasern
+
+
+
+
Turnbullblaureaktion [Fe(III)]
Berlinerblaureaktion [Fe(II)]
Methvlgrün-Pyroninfärbung
+
+
Feulgensche Nuklealreaktion
Acetat-Veronal-gepuffertes
Methylenblau von pu 4,9
Bials Reagens
1+
Fettfärbung mit Scharlachrot
keine basophilen
Strukturen
+ I +
+
+
Kräftige basophile Streifen und
Granula
+
Übersichtsfärbung mit H.E.
0.058 ± 0,007
0.068 + 0,012
0,068x0,011
0,044 + 0,005
0,090 ± 0 , 0 1 6
0,096 + 0,015
0,090 + 0,011
0,080 + 0,006
0,027 + 0,004
0,025 + 0,004
0,026 + 0,002
0,027 + 0,004
0,35 ± 0,06
0,31 + 0,06
0,39 :r 0,05
0,32
0,22
0,22
0,22 x 0,03
0,19 + 0,02
560 + 50
350 + 40
500 + 80
320 + 50
Ergebnisse der chemischen Analyse:
anorgan. P
Gesamt-N
gesamtsäurelösliches P
mg
Gesamt-N
Lipid-P
" 1 § Gesamt-N
RNS
m g
Gesamt-N
DNS
mg
Gesamt-N
mg°/ 0 RNS
mg°/o DNS
mg
&
,,
-0,03
520 + 70
350 + 50
+0,03
450+100
300 + 50
+0,04
Tab. 1. Ergebnisse histoehemiseher und chemischer Untersuchungen an Muskelgewebe von mit Coxsackie-A-Virus
infizierten Mäusen.
wie bei Ai, —
negativ.
* Z a h l der V e r s u c h e zwischen 20 und 30 für j e d e n W e r t . F ü r die
B e r e c h n u n g des M i t t e l w e r t e s w u r d e nach S . K o l l e r ( G r a p h i s c h e
T a f e l n zur B e u r t e i l u n g statistischer Z a h l e n . V e r l a g T h . SteinkopfF,
D r e s d e n u. L e i p z i g 1943) das f - f a c h e des m i t t l e r e n F e h l e r s g e w ä h l t .
Bei
Coxsackie-Ai -Infektion
Coxsackie-A,-Infektion
Coxsackie-A 3 -Infektion
Kontrollen
so d a ß mit e i n e r W a h r s c h e i n l i c h k e i t von 99.73% d e r M i t t e l w e r t inn e r h a l b der a n g e g e b e n e n G r e n z e n liegt.
* * Z a h l der Versuche für j e d e n W e r t zwischen 30 und 40. M i t t e l w e r t b e r e c h n u n g wie o b e n .
Nucleinsäure im extrahierten ProteinNS-Gemisch
[%]
2,32
2,79
3,4
4,24
+ 0,44
+ 0,87
+0,25
+ 0,93
Tab. 2. Prozentualer Anteil der Gesamt-NS im wäßrigen
Muskelextrakt von Säuglingsmäusen, 45—50 h nach Coxsackie-A-Virus-Infektion. Ermittlung der Werte durch Berechnung des Quotienten der UV-Absorption der Extrakte
bei 280 m « / 2 6 0 m « ; den daraus entnommenen prozentualen NS-Werten sind die Angaben von W a r b u r g
und C h r i s t i a n (s. Abb. 1) zugrunde gelegt. Zahl der
Versuche für jeden Wert zwischen 8 und 11; jeder Versuch stellt wiederum einen Poolwert von 3 Tieren dar.
m g
m g
m g
anorgan.P
Gesamt-N
ges. säurelösl. P
Gesamt-N
Lipid-P
Gesamt-N
Kontrollen
2 — 3 Tage alt
Coxsackie-Infektion, Stamm B,,
Tiere 2 — 3 Tage
alt
0,022 — 0,003
0,020 + 0,001
0,065 + 0,006
0,062 + 0,003
0,055 + 0,007
0,056 + 0,004
0,40 + 0 , 0 2
0,44 ± 0,04
RNS
Gesamt-N
0,27 + 0 , 0 1
0,27 + 0 , 0 4
DNS
m g Gesamt-N
Tab. 3. Ergebnisse der chemischen Untersuchungen an
Gehirngewebe von mit Coxsackie-Bi-Virus infizierten
Säuglingsmäusen. Zahl der Versuche für jeden Wert zwischen 30 und 40. Mittel Wertberechnung wie in Tab. 1.
m g
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Infektion werden in den strukturell geschädigten MäuseMuskelfasern mittels histochemischer Methoden Ribose-Polynueleotide erfaßbar; sie treten in Form körniger und streifiger Strukturen in der Längsachse der
Muskelfasern auf. Bei gesunden Tieren können sie
nicht nachgewiesen werden. Im wäßrigen Muskelextrakt von mit Coxsackie-A-Virus infizierten Mäusen
ist UV-photometrisch nach der Virusinfektion eine Erhöhung der Extinktionswerte sowohl in dem Absorptionsbereich der Gesamt-Nucleinsäuren als auch der
Eiweißstoffe nachweisbar; allerdings ist hierbei, verglichen mit den Normalkontrollen, der Quotient von
Proteinen : Nucleinsäuren zugunsten eines relativ
höheren Gehaltes an Eiweißstoffen verschoben. Schon
hieraus kann vermutet werden, daß die histochemische Darstellbarkeit kein Ausweis für eine echte Nucleinsäure-Vermehrung ist; vielmehr ist daraus zu
entnehmen, daß bei den im Gefolge der Virusinfektion einsetzenden Störungen der Faserinnenstruktur,
wie sie auch in der Myofibrillenfärbung sichtbar
wird, lediglich lokale Ribose-Polynucleotid-Kondensationen, also eine Art „Phanerose", eintreten. Die
Überhöhung der Extinktionen sowohl der NS- als
auch noch stärker der eiweiß-absorbierenden Banden
sind zwanglos durch die Erleichterung der Extraktion dieser Substanzen aus dem geschädigten Muskelgewebe zu erklären, wobei ein relativ vermehrter Proteinübertritt in den Extrakt statthat. Eine
echte Eiweißvermehrung ist auszuschließen, da das
Verhältnis Muskelgewicht : Gesamt-N bei gesunden
und gelähmten Tieren gleichbleibt. Die ungefähr
gleiche Absorption von alkali-/säure-behandelten
Muskelextrakten infizierter und normaler Mäuse zeigt,
daß die Extinktionserhöhungen im NS-Bandenbereich
bei Messung des Gesamt-NS-Extraktes vorzüglich
durch den DNS-Anteil bedingt sein dürfte; dieser
muß, wenn man sich auf die histochemischen Untersuchungsergebnisse bezieht, im wesentlichen der
Nuklearsubstanz des Muskelgewebes entstammen.
Auch die quantitativen
Untersuchungen von RNS
und DNS ergeben im Verhältnis zu Gesamt-N und
Gewicht keine signifikanten Unterschiede zwischen
gesunden und gelähmten Tieren. Über die qualitativen Zusammensetzungen der NS — also auch evtl.
Umbau von Muskel-NS zu Virus-NS — ist in diesen
Untersuchungen nichts auszusagen. Im Gegensatz zu
zurückliegenden Untersuchungen wurde in dieser
Studie eine Vermehrung des anorganischen Phosphates im gelähmten Muskel gefunden; der säurelösliche Phosphor und die Phospholipide ließen keine
signifikanten Unterschiede zwischen dem Muskelgewebe gelähmter Tiere und Normalkontrollen erkennen. Es fällt auf, daß die Vermehrung des anorganischen Phosphates am geringsten nach Aj-Infektion
ausgeprägt ist. Wir nehmen an, daß diese Zunahme
im geschädigten Muskel mit einer Störung des kontinuierlichen Aufbaues der muskeleigenen, labilen,
phosphorhaltigen Energieträger zusammenhängt. Die
Befunde sprechen dafür, daß bei der Hemmung dieser Vorgänge im Gefolge einer Coxsackie-A-Virus-Infektion ein Zeitfaktor eine Rolle spielt, da bei Kontrolluntersuchungen von Tieren 24 Stdn. nach Infektion die Vermehrung von anorganischem Phosphat
noch nicht nachweisbar war. Damit sind auch die
negativen Ergebnisse früherer Untersuchungen 8 erklärt, da diese zu einem Zeitpunkt vor Einsetzen
schwerer Muskelschäden und manifester Lähmungen
gemacht worden waren.
Für technische Assistenz haben wir Frl. G. L i p s und
Frl. Ch. P e r n e r zu danken.
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