Untersuchungen zur Verteilung von Toxoplasma gondii
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Aus dem Institut für Parasitologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Untersuchungen zur Verteilung von Toxoplasma gondii-Stadien in Geweben von Puten nach experimenteller Infektion Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Birte Zöller aus Bremen Leipzig, 2015 Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Prof. Dr. Manfred Coenen Betreuer: Prof. Dr. Arwid Daugschies Gutachter: Prof. Dr. Arwid Daugschies, Institut für Parasitologie, Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig, Leipzig Dr. Gereon Schares, Institut für Epidemiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald - Insel Riems Tag der Verteidigung: 01. September 2015 Meinen Eltern und meiner Schwester Imke. Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG ............................................................................................................................. 1 2 LITERATURÜBERSICHT ....................................................................................................... 3 2.1 Toxoplasma gondii ................................................................................................................... 3 2.1.1 Historische Übersicht und Taxonomie .................................................................................. 3 2.1.2 Vorkommen und Morphologie der Entwicklungsstadien ..................................................... 5 2.1.2.1 Tachyzoiten .................................................................................................................... 5 2.1.2.2 Bradyzoiten und Gewebezysten ..................................................................................... 5 2.1.2.3 Oozysten......................................................................................................................... 6 2.2 Lebenszyklus von Toxoplasma gondii.................................................................................... 7 2.2.1 Entwicklung im Zwischenwirt .............................................................................................. 7 2.2.2 Entwicklung im Endwirt Katze ............................................................................................. 7 2.3 Genetik ..................................................................................................................................... 9 2.4 Toxoplasma gondii als Zoonoseerreger ................................................................................. 9 2.4.1 Epidemiologische Bedeutung der Infektionswege und -quellen ........................................... 9 2.4.1.1 Tachyzoiten .................................................................................................................. 10 2.4.1.2 Gewebezysten (Bradyzoiten) ....................................................................................... 10 2.4.1.3 Oozysten....................................................................................................................... 12 2.4.2 Toxoplasmose des Menschen .............................................................................................. 13 2.4.2.1 Seroprävalenzen ........................................................................................................... 13 2.4.2.2 Klinische Symptomatik ................................................................................................ 14 2.4.2.2.1 Postnatale Infektion .................................................................................................. 14 2.4.2.2.2 Pränatale Infektion ................................................................................................... 14 2.4.2.2.3 Okuläre Toxoplasmose ............................................................................................. 15 2.5 Aviäre Toxoplasmose ............................................................................................................ 15 2.6 Toxoplasmose bei der Pute (Meleagris gallopavo).............................................................. 16 2.6.1 Seroprävalenzen .................................................................................................................. 16 2.6.2 Klinisches Bild und pathologische Befunde ....................................................................... 17 2.6.3 Experimentelle Infektion ..................................................................................................... 18 I Inhaltsverzeichnis 3 EIGENE WISSENSCHAFTLICHE ORIGINALARBEITEN............................................. 20 3.1 Ziele ........................................................................................................................................ 20 3.2 Allgemeiner Studienaufbau .................................................................................................. 20 3.3 Publikationen......................................................................................................................... 24 3.3.1 Tissue tropism of Toxoplasma gondii in turkeys (Meleagris gallopavo) after parenteral ...... infection ............................................................................................................................... 24 3.3.2 Experimental Toxoplasma gondii oocyst infections in turkeys (Meleagris gallopavo)...... 30 4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ........................................................................................ 36 4.1 Diskussion .............................................................................................................................. 36 4.1.1 Experimentelle Infektion ..................................................................................................... 38 4.2 Schlussfolgerungen und Ausblick ........................................................................................ 42 5 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................... 45 6 SUMMARY ............................................................................................................................... 47 7 LITERATURVERZEICHNIS................................................................................................. 49 8 DANKSAGUNG ....................................................................................................................... 62 II Verzeichnis der Abkürzungen Verzeichnis der Abkürzungen AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome BfR Bundesinstitut für Risikobewertung BLASTN Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide BMELV Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz bp Basenpaare (base pairs) ca. circa DNA Desoxyribonukleinsäure (Deoxyribonucleic Acid) EFSA Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (European Food Safety Authority) e.g. exempli gratia ELISA Enzymgekoppelter Immunoadsorbtionstest (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) et al. et alii etc. et cetera g Gramm i.e. id est IFAT Indirekter Fluoreszenz Antikörper Test (Indirect Fluorescence Antibody Test) IHAT Indirekter Hämagglutinationstest (Indirect Hemagglutination Test) i.m. intramuskulär i.v. intravenös IZKF Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung KELA kinetischer Enzymgekoppelter Immunoadsorbtionstest (Kinetic Enzyme Linked Immunosorbent Assay) kg Kilogramm LAT Latex-Agglutinationstest (Latex Agglutination Test) LD100 Letale Dosis LD50 Mittlere letale Dosis III Verzeichnis der Abkürzungen MAT Modifizierter Agglutinationstest (Modified Agglutination Test) µm Mikrometer mg Milligramm ml Milliliter n Anzahl no. number (Nummer) OT Okuläre Toxoplasmose p Signifikanzwert PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) p.i. post infectionem RKI Robert Koch-Institut T. gondii Toxoplasma gondii USA Vereinigte Staaten von Amerika (United States of America) z. B. zum Beispiel IV Einleitung 1 Einleitung Toxoplasma (T.) gondii ist ein weltweit vorkommender einzelliger Parasit. Im fakultativ heteroxenen Lebenszyklus sind die Feliden alleinige Endwirte des Erregers. Als Zwischenwirte können jedoch zahlreiche Säugetier- und Vogelarten dienen. Auch der Mensch ist im Sinne eines Fehlwirtes für die Toxoplasmose empfänglich. Je nach Immunkompetenz des Wirtes und anderer Einflussfaktoren kann eine Krankheitsbilder hervorrufen. Infektion Aufgrund schwerwiegende, der geringen mitunter tödlich Wirtsspezifität, des verlaufende ubiquitär opportunistischen Auftretens und pathogenen Potentials zählt T. gondii zu den bedeutendsten parasitären Erregern in der Human- und Veterinärmedizin. Die Infektion kann sowohl vertikal, durch diaplazentare Übertragung des Parasiten, als auch horizontal über die Aufnahme exogener Dauerstadien (Oozysten), die mit dem Endwirtkot in die Umwelt gelangen, erfolgen. Ein weiterer, insbesondere für den Menschen bedeutender, horizontaler Infektionsweg besteht in der Aufnahme parasitärer Gewebestadien (Zysten) durch den Verzehr von rohem oder ungenügend erhitztem Fleisch infizierter Zwischenwirte. Gewebezysten sind endogene Dauerstadien, welche sich bereits wenige Tage nach einer T. gondii-Infektion entwickeln. Sie variieren hinsichtlich ihrer Persistenz, Anzahl und Lokalisation je nach Wirtsspezies. Bei landwirtschaftlichen Nutztieren konnten Gewebezysten am häufigsten im Fleisch von Schweinen und kleinen Wiederkäuern (Schaf und Ziege), weniger häufig im Hühnerfleisch und nur selten im Rindfleisch nachgewiesen werden (TENTER et al. 2000). Inwieweit hingegen Putenfleisch ein potentielles Infektionsrisiko birgt und welche Bedeutung die Pute in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose besitzt, ist bislang nicht ausreichend geklärt. Dabei ist bereits bekannt, dass Truthühner generell für eine T. gondii-Infektion empfänglich sind und zum Teil hohe Seroprävalenzen innerhalb einer Vogelpopulation auftreten können. Die Entwicklung von Gewebezysten bei Puten ist allerdings nur vereinzelt untersucht worden. Dabei konnten infektiöse Zysten in verschiedenen Geweben, darunter auch häufig in der Muskulatur, nachgewiesen werden (DUBEY et al. 1993a, SEDLÁK et al. 2000). Der Pro-Kopf-Verbrauch von Putenfleisch in Deutschland liegt bei ca. 5,7 kg pro Jahr (2012) (BMELV 2013). Neben Fleischteilstücken und Innereien werden auch bereits verzehrfertige Putenfleischerzeugnisse, wie frisch gereifte Rohwürste (z.B. Putenzwiebelmettwurst) und kurz gereifte Rohpökelwaren (z.B. Putenlachsschinken) für den Verbraucher angeboten. In der Regel unterliegen Rohwürste und kurz gereifte Rohpökelwaren bei ihrer Herstellung keinem adäquaten 1 Einleitung Verfahren zur sicheren Abtötung potentiell vorhandener Toxoplasmen. Infolgedessen muss insbesondere bei diesen Erzeugnissen eine potentielle Infektionsgefahr in Betracht gezogen werden (TENTER und FEHLHABER 2002, BfR 2005, POTT et al. 2012). Ausgehend vom derzeitigen Wissensstand lässt sich eine Verbrauchergefährdung durch den Verzehr von zystenhaltigem Putenfleisch, beziehungsweise unzureichend thermisch behandelten Putenfleischprodukten, nicht grundsätzlich ausschließen. Diese Ausgangsituation erforderte die eingehendere Betrachtung der T. gondii-Infektion bei Puten, insbesondere hinsichtlich der Dissemination und Persistenz von Dauerstadien in den essbaren Organen und der Muskulatur. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, ein reproduzierbares Infektionsmodell bei Puten für T. gondii zu entwickeln und zu etablieren. Um die Verteilung und Persistenz von Gewebestadien zu ermitteln, wurden Organe und Gewebe infizierter Tiere einzeln mittels der PolymeraseKettenreaktion (PCR) auf die Präsenz des Erregers untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss ausgewählter Parameter (Infektionsstadium, Infektionsdosis, Applikationsmodus und Untersuchungszeitpunkt) auf die Entwicklung parasitärer Gewebestadien betrachtet. Die vorliegende Arbeit wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung im Rahmen des TOXONET 01 unter dem Titel "Verbundprojekt: Etablierung einer Methode zum Nachweis von Toxoplasma gondii bei der Pute und Studien zur Tenazität in Putenfleisch und fleischerzeugnissen" gefördert (Förderkennzeichen: 01KIO762). 2 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Toxoplasma gondii 2.1.1 Historische Übersicht und Taxonomie Eine erste detaillierte Beschreibung des Toxoplasmose–Erregers wurde im Jahr 1908 durch NICOLLE und MANCEAUX (1908) veröffentlicht, die den Parasiten in einem Gundi (Ctenodactylus gundi), einem nordafrikanischen Wüstennagetier, entdeckt hatten. In Anlehnung an das Wirtstier und die Form des Einzellers, bezeichneten sie den Organismus Toxoplasma gondii (Toxon = Bogen; plasma = Gebilde; gondii = von Ctenodactylus gundi) und führten die Gattung Toxoplasma ein (NICOLLE und MANCEAUX 1909). In den darauffolgenden Jahren wurden Toxoplasmen bei verschiedenen Tierarten sowie beim Menschen entdeckt und entsprechend ihrer Wirtsherkunft benannt (TENTER et al. 2000). Die Annahme, dass es sich dabei um verschiedene Spezies innerhalb der Gattung Toxoplasma handelte, konnte jedoch 1939 durch SABIN (1939) widerlegt werden. Ebenfalls Ende der 30er Jahre wurde erstmals über den tödlichen Verlauf einer T. gondii-Infektion eines Kindes berichtet und das humanpathogene Potential des Erregers sowie die Möglichkeit einer kongenitalen Übertragung erkannt (WOLF und. COWEN 1937, WOLF et al. 1939, WOLF et al. 1940, WOLF et al. 1941). Mit Hilfe eines von SABIN und FELDMAN (1948) entwickelten serologischen Tests zum Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper zeigte sich in anschließenden epidemiologischen Studien, dass die Infektion sowohl bei Menschen als auch bei Haustieren wesentlich häufiger als bisher angenommen vorkam (FERGUSON 2009). Die kongenitale Infektion als alleiniger Übertragungsweg konnte allerdings nicht die weitläufige Verbreitung der Erkrankung erklären (DUBEY 2008). Da bislang nur die endogenen Stadien des Parasiten (Tachyzoiten und Gewebezysten) bekannt waren, vermuteten WEINMAN und CHANDLER (1954), dass unzureichend erhitztes Fleisch möglicherweise eine Infektionsquelle sein könnte. Diese Hypothese konnte einige Jahre später in einer experimentellen Studie durch DESMONTS et al. (1965) bestätigt werden. Jedoch konnten weder die orale Aufnahme von ungarem zystenhaltigem Fleisch noch der kongenitale Übertragungsweg die hohe Anzahl T. gondii-positiver Tiere und Menschen erklären, die sich ausschließlich pflanzlich ernährten (DUBEY 2008). HUTCHISON (1965) fand schließlich eine weitere infektiöse Form des Erregers im Kot von Katzen, isolierte sie, und zeigte zudem, dass dieses parasitäre Stadium resistenter war als die bisher bekannten Entwicklungsstadien. Die Entdeckung einer sexuellen Phase des Parasiten im Dünndarm der Katze und der daraus 3 Literaturübersicht hervorgehenden Oozyste führte letztendlich zur vollständigen Aufklärung des Lebenszyklus von T. gondii (HUTCHISON et al. 1969, FRENKEL et al. 1970, SHEFFIELD und MELTON 1970, DUBEY et al. 1970a, DUBEY et al. 1970b, HUTCHISON et al. 1971). Zeitgleich ergab sich durch die Entwicklung in der Elektronenmikroskopie die Möglichkeit, vergleichende Studien zur Ultrastruktur verschiedener Parasiten durchzuführen (FERGUSON 2009). Dabei erkannte man einen Komplex spezifischer Organellen, den sogenannten Apikalkomplex, bei T. gondii und anderen Parasiten, von denen man bisher angenommen hatte, dass sie in keinem verwandtschaftlichen Verhältnis stehen würden (SCHOLTYSECK und MEHLHORN 1970). Diese neuen Erkenntnisse erforderten eine Überarbeitung der Klassifikation bei den Protozoen und führten zur Ernennung eines neuen Stammes namens Apicomplexa (LEVINE et al. 1980). Innerhalb des Stammes Apicomplexa wird T. gondii in die Klasse der Kokzidien eingeordnet und ist die einzige Art seiner Gattung (SCHNIEDER et al. 2006). Klassifizierung (nach SCHNIEDER et al. 2006) Stamm Apicomplexa Klasse Coccidea Unterklasse Eucoccidia Ordnung Eimeriida Familie Sarcocystidae Gattung Toxoplasma Art Toxoplasma gondii 4 Literaturübersicht 2.1.2 Vorkommen und Morphologie der Entwicklungsstadien Im Lebenszyklus des obligat intrazellulären Parasiten können drei infektiöse Stadien (Tachyzoiten, Bradyzoiten und sporulierte Oozysten) auftreten, die sich hinsichtlich ihrer Morphologie und biologischen Eigenschaften voneinander unterscheiden (DUBEY et al. 1998). 2.1.2.1 Tachyzoiten Tachyzoiten (tachy [griechisch] = schnell) sind halbmondförmige Zellen, ca. 2x6 µm groß und besitzen einen zentral gelegenen Zellkern (DUBEY et al. 1998). Im Vorderende befindet sich der Apikalkomplex, eine Gruppe spezifischer Organellen, die unter anderem bei der Anheftung und Penetration der Wirtszelle eine essentielle Rolle spielen (DUBEY et al. 1998, KIM und WEISS 2008, BLADER und SAEIJ 2009). Tachyzoiten können aktiv in nahezu alle kernhaltigen Zellen warmblütiger Tiere (Säugetiere und Vögel) und Menschen eindringen (DOBROWOLSKI und SIBLEY 1996, DUBEY et al. 1998, BLADER und SAEIJ 2009). Unmittelbar nach der Zellinvasion wird der Parasit von einer Vakuole (sogenannte Pseudozyste) umgeben und beginnt mit der für dieses Stadium charakteristischen schnellen Vermehrung (DUBEY et al. 1998, BLADER und SAEIJ 2009). Die Replikation erfolgt asexuell durch wiederholte Endodyogenie, einer Form der Zweiteilung bei der aus einer Mutterzelle zwei Tochterzellen entstehen (SHEFFIELD u. MELTON 1968). Dieser Vorgang wiederholt sich bis die befallene Wirtzelle rupturiert und die freigesetzten Tachyzoiten neue Zellen infizieren (DUBEY et al. 1998, MONTOYA und LIESENFELD 2004). Tachyzoiten treten während der akuten Phase oder bei einer Reaktivierung der Infektion auf. Mit Einsetzen der wirtseigenen Immunantwort differenzieren sie sich zu den Bradyzoiten (MONTOYA und LIESENFELD 2004, KIM und WEISS 2008). 2.1.2.2 Bradyzoiten und Gewebezysten Bradyzoiten (brady [griechisch] = langsam) repräsentieren das enzystierte Dauerstadium des Parasiten, sind bogenförmig und besitzen einen exzentrischen Zellkern (DUBEY et al. 1998). Im Gegensatz zu den Tachyzoiten teilen sie sich nur langsam durch wiederholte Endodyogenie innerhalb einer dickwandigen Gewebezyste (FERGUSON und HUTCHISON 1987a, DUBEY et al. 1998, BOHNE et al. 1999). Diese Gewebezysten befinden sich im Zytoplasma der Wirtszelle und können hinsichtlich Größe und Form je nach Gewebelokalisation und Anzahl enthaltener Bradyzoiten variieren (DUBEY et al. 1998). Zum Beispiel nehmen Zysten im Gehirn eine kugelige Form an und erreichen selten einen Durchmesser von 70 µm, während sie in der Muskulatur eher 5 Literaturübersicht länglich sind und eine Größe von 100 µm erreichen können (DUBEY et al. 1998). Bereits 3 Tage nach einer Infektion können sich Gewebezysten entwickeln (DUBEY und FRENKEL 1976). Sie treten überwiegend in neuronalen und muskulären Geweben, seltener in viszeralen Organen auf (DUBEY et al 1998, WEISS und KIM 2000). Diese endogene "Ruheform" des Parasiten persistiert meist reaktionslos im Wirtsgewebe jahre-, vermutlich sogar lebenslang (FERGUSON und HUTCHISON 1987b, BOHNE et al. 1999, MONTOYA und LIESENFELD 2004, KIM und WEISS 2008). Beim Zerfall oder Rupturieren einer Gewebezyste differenzieren sich Bradyzoiten wieder zu Tachyzoiten und es erfolgt eine Reaktivierung der latenten Toxoplasmose, einhergehend mit einer erneuten Invasion weiterer Organe und Gewebe (TENTER et al. 2000, WEISS und KIM 2000). 2.1.2.3 Oozysten Das exogene T. gondii-Stadium, die Oozyste, entsteht bei der sexuellen Vermehrung des Parasiten, die ausschließlich im Darm der Endwirte (Feliden) stattfindet (MILLER et al. 1972, DUBEY 2009a). Oozysten sind rundlich und im unsporulierten Zustand ca. 10 bis 12 µm groß (DUBEY et al. 1998). Das Innere wird fast vollständig durch den Sporonten ausgefüllt. Nach der Ausscheidung mit dem Endwirtkot beginnt bei günstigen Umweltbedingungen die Sporulation innerhalb von 1 bis 5 Tagen (DUBEY et al. 1998). Dabei entwickeln sich in jeder Oozyste 2 ellipsoidale ca. 6 x 8 µm große Sporozysten, die jeweils 4 Sporozoiten enthalten (DUBEY et al. 1970a, DUBEY et al. 1970b, FERGUSON et al. 1979). Erst durch die Sporulation in der Außenwelt erlangt dieses Erregerstadium seine Infektiosität. Alle drei Stadien (Tachyzoiten, Bradyzoiten [Gewebezyste], Sporozoiten [Oozyste])sind sowohl für den Zwischen- und als auch den Endwirt infektiös. 6 Literaturübersicht 2.2 Lebenszyklus von Toxoplasma gondii Der Lebenszyklus von T. gondii ist fakultativ zweiwirtig. Der weltweit vorkommende Einzeller besitzt die Fähigkeit nahezu alle warmblütigen Tiere sowie den Menschen zu infizieren (DUBEY et al. 1998, TENTER et al. 2000, BLADER und SAEIJ 2009). Als Endwirt dienen ausschließlich Mitglieder aus der Familie der Feliden, von denen der Hauskatze die größte epidemiologische Bedeutung zukommt (MILLER et al. 1972, TENTER et al 2000, SCHARES et al.2008, ELMORE et al. 2010). Lediglich im Endwirt ist eine sexuelle Vermehrung des Parasiten möglich (MILLER et al. 1972, DUBEY 2009a). Die Übertragung des Parasiten kann sowohl vom Zwischenwirt auf den Endwirt als auch umgekehrt erfolgen. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit der Erregerübertragung zwischen den Endwirten untereinander, sowie von Zwischenwirt zu Zwischenwirt (TENTER et al. 2000). 2.2.1 Entwicklung im Zwischenwirt Bei einer Infektion mit Gewebezysten oder Oozysten über die Nahrung oder aus der Umwelt wird die Zysten- beziehungsweise Oozystenwand durch proteolytische Enzyme im Magen-Darm-Trakt aufgelöst. Die dabei freigesetzten Bradyzoiten oder Sporozoiten penetrieren die Epithelzellen des Darms und vermehren sich asexuell durch wiederholte Endodyogenie (DUBEY et al. 1998, TENTER et al. 2000). Nach Ruptur infizierter Zellen gelangen die Parasiten zunächst in die lokalen Lymphknoten und verbreiten sich dann auf lympho-hämatogenem Weg im gesamten Organismus. In den infizierten Organen und Geweben replizieren sich die Tachyzoiten erneut durch rasche intrazelluläre Endodyogenie. Mit dem Einsetzen der Immunantwort erfolgt die Umwandlung der Tachyzoiten zu Bradyzoiten und persistierende Gewebezysten entstehen (DUBEY et al. 1998, MONTOYA und LIESENFELD 2004, KIM und WEISS 2008). Im Rahmen anderer Grunderkrankungen, die mit einer Immunsupprimierung einhergehen, kann eine Reaktivierung der Toxoplasmose auftreten, die sich mitunter in Form von schwerwiegenden Erkrankungen manifestiert (GROSS et al. 1996, GROSS et al. 2001, MONTOYA und LIESENFELD 2004, KIM und WEISS 2008). 2.2.2 Entwicklung im Endwirt Katze Die Besonderheit der T. gondii-Infektion bei den Feliden liegt in der entero-epithelialen Entwicklungsphase, die in der Ausscheidung exogener Dauerstadien (Oozysten) resultiert (DUBEY et al. 1970b, DUBEY et al. 1970c, Dubey 2009a). Katzen können sich wie Zwischenwirte über die 7 Literaturübersicht orale Aufnahme sporulierter Oozysten oder Gewebezysten infizieren (DUBEY und FRENKEL 1976, DUBEY 1996). Nach der Aufnahme von Zysten, z. B. durch den Verzehr infizierter Nagetiere oder Vögel, infizieren die nach der Magen-Darm-Passage frei gewordenen Bradyzoiten die Epithelzellen des Dünndarms und leiten die Entwicklung zahlreicher T. gondii-Generationen ein (DUBEY und FRENKEL 1972, DUBEY et al. 1998). Die ungeschlechtliche Vermehrung erfolgt initial als Endodygenie und anschließend in Form wiederholter Endopolygenien. Die Endopolygenie ist eine Sonderform der Merogonie, bei der aus einer Mutterzelle eine Vielzahl von Tochterzellen, auch als Merozoiten bezeichnet, entstehen. In der darauffolgenden Phase, der Gamogonie, erfolgt die Differenzierung der Merozoiten in die geschlechtlichen Makro- und Mikrogamonten, aus denen schließlich die sessilen Makrogameten und die beweglichen Mikrogameten hervorgehen (DUBEY und FRENKEL 1972, FREYRE et al. 1989). Nach der Befruchtung der Makrogameten durch die Mikrogameten entstehen die Oozysten. Durch Ruptur infizierter Epithelzellen gelangen die Oozysten in das Darmlumen und werden für 1 bis 21 Tage mit dem Kot ausgeschieden (HEYDORN 1979). Während dieser Patenz können bis zu 1 Million Oozysten pro Gramm Kot ausgeschieden werden. Analog zur Entwicklung im Zwischenwirt findet auch im Endwirt eine extraintestinale Vermehrung mit Gewebszystenbildung statt, da ein Teil der Merozoiten über die Lymph- und Blutgefäße im Körper disseminiert. Bei einer Infektion mit Oozysten wird angenommen, dass die Sporozoiten erst zu Tachyzoiten konvertieren und dann in den Körperkreislauf gelangen, um die extraintestinalen Gewebe zu besiedeln (DUBEY et al 1998). Dort erfolgt die Transformation zu den Bradyzoiten in den Gewebezysten. Durch Ruptur einer Gewebezyste können die Parasiten ins intestinale Epithel zurückkehren und initiieren dort die Bildung der Oozysten. Im Gegensatz zur BradyzoitenInfektion, bei der bereits nach 3 bis 10 Tagen Oozysten ausgeschieden werden, dauert die Präpatenz bei einer Oozysten- Infektion mindestens 18 Tage (FREYRE et al. 1989, DUBEY 1996). Nach einer überstandenen Infektion besteht keine lebenslange Immunität. Experimentell konnte ein erneutes Ausscheiden von Oozysten durch eine Superinfektion, die ca. 6,5 Jahre nach der Primärinfektion erfolgte, hervorgerufen werden (DUBEY 1995). Gelegentlich tritt ein sogenanntes Reshedding von Oozysten ohne eine vorausgegangene Superinfektion auf. Die auslösenden Faktoren dafür sind nicht eindeutig geklärt. Experimentell konnte dies durch eine Sekundärinfektion 8 Literaturübersicht mit Isospora felis (CHESSUM 1972, DUBEY 1976) oder durch die Applikation von Kortikosteroiden und die damit einhergehende Immunsuppression induziert werden (DUBEY und FRENKEL 1974, LAPPIN et al. 1991). 2.3 Genetik T. gondii-Stämme lassen sich drei klonalen Linien und sogenannten "atypischen" Stämmen zuordnen (HOWE u. SIBLEY 1995, SIBLEY et al. 2009). Geographisch dominieren in Nordamerika und Europa die Genotypen I, II und III, während in Südamerika neben den Genotypen I und III auch häufig atypische Stämme vorherrschen (PEYRON et al. 2006). Die klonalen Linien unterscheiden sich hinsichtlich der Wachstumsrate, der Virulenz im Mausmodell und der Fähigkeit Zysten zu bilden. Bereits erforscht ist die unterschiedliche Virulenz der Genotypen I, II und III (HOWE et al. 1996, MORDUE et al. 2001). Während Stämme des Genotyp I sich durch eine hohe Virulenz (letale Dosis (LD100) ~1 Parasit) im Mausmodell auszeichnen, weisen Stämme der Genotypen II und III eine deutlich geringere Virulenz (mittlere letale Dosis (LD50) ≥ 105) auf (SIBLEY u. BOOTHROYD 1992, SIBLEY et al. 2009). 2.4 Toxoplasma gondii als Zoonoseerreger 2.4.1 Epidemiologische Bedeutung der Infektionswege und -quellen Das ubiquitäre Auftreten von T. gondii bei Mensch und Tier ist, neben der geringen Wirtsspezifität, auf eine Vielzahl von Übertragungswegen sowie die Überlebensfähigkeiten der einzelnen Entwicklungsstadien zurückzuführen. Die Infektion des Menschen kann zum einen horizontal über Oozysten, Gewebezysten, selten auch Tachyzoiten, zum anderen vertikal über Tachyzoiten erfolgen (HILL und DUBEY 2002, MONTOYA und LIESENFELD 2004, PETERSEN et al. 2010). Viele Faktoren, wie die Präsenz von Katzen, regionale Klimabedingungen, kulturell bedingte Unterschiede der Zubereitungs- und Essgewohnheiten, sowie Hygienestandards beeinflussen das Vorkommen und die Verbreitung des Parasiten und folglich auch die Infektionsmöglichkeiten für den Menschen (TENTER et al. 2000, HILL und DUBEY 2002, KJILSTRA und JONGERT 2008, PETERSEN et al. 2010). Diese Variablen erschweren die Bewertung der einzelnen T. gondiiStadien und Übertragungswege hinsichtlich ihrer epidemiologischen Bedeutung für die humane Toxoplasmose. Zudem verläuft die Erkrankung beim Mensch überwiegend subklinisch oder asymptomatisch, weshalb Infektionszeitpunkt und -weg in den meisten Fällen nicht mehr bestimmt werden können (PETERSEN et al. 2010). Seroepidemiologische Studien zeigen jedoch, dass die 9 Literaturübersicht Mehrheit humaner T. gondii-Infektionen durch eine horizontale T. gondii-Übertragung verursacht wird (TENTER et al. 2000, TENTER 2009). Welcher relative Anteil dabei auf eine Oozysten-, beziehungsweise Zysteninfektion entfällt, ist nicht bekannt (DUBEY et al. 2005, KIJLSTRA und JONGERT 2008, JONES und DUBEY 2012, HILL und DUBEY 2013). 2.4.1.1 Tachyzoiten Tachyzoiten sind von größter Bedeutung für den vertikalen Infektionsweg des Parasiten. Eine diaplazentare Übertragung auf den Fetus bei einer Erstinfektion während der Schwangerschaft kann in Abhängigkeit vom Infektionszeitpunkt zum Abort oder zu schwerwiegenden Schädigungen des Ungeborenen führen (GROSS et al. 2001, LOPES et al. 2007). Auch die horizontale Übertragung von Tachyzoiten ist möglich, wenngleich dieser Weg von untergeordneter epidemiologischer Bedeutung ist (TENTER et al. 2000). So können Toxoplasmose - bedingte Komplikationen bei Organtransplantationen auftreten, wobei diese sowohl durch Tachyzoiten als auch durch Gewebezysten induziert sein können (McGREGOR et al. 1984, BARCÁN et al. 2002, HILL und DUBEY 2002, DEROUIN und PELLOUX 2008). Eine akute Toxoplasmose kann bei Transplantationspatienten einerseits durch die Übertragung eines Organs von einem seropositiven Spender auf einen seronegativen Empfänger, andererseits durch die Reaktivierung einer latenten Infektion in einem seropositiven Empfänger hervorgerufen werden (HILL und DUBEY 2002, MONTOYA und LIESENFELD 2004, DEROUIN und PELLOUX 2008). Eine Tachyzoiten-Infektion über Bluttransfusionen ist ebenfalls möglich, jedoch äußerst selten (DEROUIN und PELLOUX 2008). Da Tachyzoiten auch in der Milch verschiedener Zwischenwirte, darunter Schaf, Ziege und Kuh, auftreten können, ist ein Infektionsrisiko beim Verzehr von Rohmilch nicht auszuschließen (FUSCO et al. 2007, JONES et al. 2009,TENTER 2009, HILL und DUBEY 2013). Fälle akuter humaner Toxoplasmose sind bislang jedoch nur vereinzelt im Zusammenhang mit dem Konsum frischer Ziegenmilch beschrieben worden (RIEMANN et al. 1975, SACKS et al. 1982, SKINNER et al. 1990). 2.4.1.2 Gewebezysten (Bradyzoiten) Die im Fleisch, in Fleischprodukten und Innereien infizierter Zwischenwirte enthaltenen T. gondiiZysten sind von entscheidender Bedeutung in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose (TENTER et al. 2000, COOK et al. 2000, EFSA 2007, PETERSEN et al. 2010). Der Verzehr von rohem oder unzureichend erhitztem Fleisch wird regelmäßig als ein bedeutender, mitunter sogar als 10 Literaturübersicht wichtigster Risikofaktor für die T. gondii-Infektion des Menschen genannt (BUFFOLANO et al. 1996, KAPPERUD et al. 1996, BOBIC et al 1998, BARIL et al. 1999, COOK et al. 2000, SPALDING et al. 2005, LÓPEZ-CASTILLO et al. 2005, KOLBEKOVA et al. 2007, BOBIC et al. 2007, JONES et al. 2009, MUNOZ-ZANZI et al. 2010). In einer länderübergreifenden europäischen Fallkontrollstudie wurden zwischen 30% und 63% der Infektionen bei schwangeren Frauen auf den Konsum von rohem oder geräuchertem, beziehungsweise gepökeltem Fleisch zurückgeführt (COOK et al. 2000). Mehrfach sind Ausbrüche akuter humaner Toxoplasmose beschrieben, die mit dem Verzehr von rohem oder halbgarem Fleisch assoziiert wurden (McDONALD et al. 1990, ROBSON et al. 1995, CHOI et al. 1997, CARME et al. 2002). Darüber hinaus ist anzunehmen, dass schon allein der häufige Umgang mit rohem Fleisch, wie dies bei Fleischern oder Jägern der Fall ist, mit einem erhöhten Infektionsrisiko verbunden ist (McDONALD et al. 1990, DIAS et al. 2005, JONES et al. 2009). Mangelnde Hygiene bei der Verarbeitung von Fleisch gilt ebenfalls als Risikofaktor (KAPPERUD et al. 1996). So stellten KAPPERUD et al (1996) fest, dass Frauen, die Küchenmesser nach der Zubereitung von rohem Fleisch selten abwaschen, einem erhöhtem Infektionsrisiko ausgesetzt sind. Welche Tierart, beziehungsweise Fleischsorte, als T. gondii-Infektionsquelle prädisponiert ist, wird von unterschiedlichen Faktoren beeinflusst. Studien zur Seroprävalenz belegen, dass die T. gondiiInfektion bei fleischliefernden Nutz- und Wildtieren weit verbreitet ist (ausführlich referiert in TENTER et al. 2000). Insbesondere Weidetiere, wie Schafe, Ziegen und Rinder, oder auch Hühner aus Freilandhaltungen weisen zum Teil hohe Prävalenzen auf (TENTER et al. 2000, DUBEY 2010, TENTER 2009). Allerdings ist die Seropositivität der Tiere nicht zwangsläufig mit der Präsenz von Gewebezysten verbunden (TENTER 2009, OPSTEEGH et al. 2011). Zum Beispiel korreliert bei Schafen und Schweinen die T. gondii-Seroprävalenz stark mit der Zystenpräsenz, während es beim Rind, trotz hoher Prävalenzen, bislang nur selten gelungen ist, Zysten nachzuweisen (OPSTEEGH et al. 2011). Neben tierartspezifischen Unterschieden, ist die Prädisposition bestimmter Fleischsorten als Infektionsquelle abhängig von den in der Bevölkerung vorherrschenden religiösen und kulturellen Gegebenheiten sowie Präferenzen hinsichtlich bestimmter Tierarten und Zubereitungsmethoden (COOK et al. 2000, KJILSTRA und JONGERT 2008, PETERSEN et al. 2010). Fleisch und Fleischerzeugnisse werden für den menschlichen Genuss mit verschiedenen lebensmitteltechnologischen Verfahren zubereitet beziehungsweise be- oder verarbeitet. Nicht alle 11 Literaturübersicht Verfahrensprozesse sind gleichermaßen für die Abtötung infektiöser Gewebezysten geeignet. So kann die Infektiosität im Fleisch enthaltener Zysten bei einer Lagerungstemperatur von -1bis -3,9°C für bis zu 3 Wochen, bei -6,7°C für 11 Tage erhalten bleiben (KOTULA et al. 1991). Eine sichere Inaktivierung des Erregers wird erst bei -12°C erreicht (KOTULA et al. 1991, JONES und DUBEY 2012). Die Erhitzung auf 67°C führt ebenfalls zur Abtötung von T. gondii-Zysten (DUBEY et al. 1990). Auch andere Verfahren, wie Salzen, Pökeln und Räuchern, können den Erreger inaktivieren. Ihre Effizienz kann allerdings von verschiedenen Variablen, wie beispielsweise der Salz- oder Pökelsalzkonzentration, Einwirkungszeit und Räuchertemperatur beeinflusst werden (MIE et al. 2008, TENTER 2009, JONES und DUBEY 2012). Folglich kann bei bestimmten Fleischerzeugnissen, wie kurzgereiften Rohwürsten, die in ihrem Herstellungsprozess keinem adäquaten Abtötungsverfahren unterzogen wurden, ein potentielles Infektionsrisiko nicht ausgeschlossen werden (TENTER und FEHLHABER 2002, BfR 2005). 2.4.1.3 Oozysten Da ausschließlich die Endwirte, Katzen und andere Feliden, Oozysten mit dem Kot ausscheiden, sind sie für die Verbreitung des Parasiten von entscheidender Bedeutung (DUBEY 1995, TENTER et al. 2000, HILL und DUBEY 2002, DABRITZ et al. 2007). Bereits die Aufnahme einer Bradyzoite oder einer Gewebezyste reicht aus, um die Oozystenausscheidung bei der Katze zu induzieren (DUBEY 1995, DUBEY 2001). Trotz der kurzen Patenzzeit von 2-3 Wochen, werden nach einer Erstinfektion millionenfach Oozysten freigesetzt und gelangen in die Umwelt, wo sie unter günstigen Bedingungen innerhalb weniger Tage sporulieren können (DUBEY und FRENKEL 1972, DUBEY 1995, DUBEY 2001). Durch Wind, Regen und Oberflächenwasser werden die Oozysten weiter verbreitet und führen zur weitläufigen Kontamination der Umgebung (HILL und DUBEY 2002, TENTER 2009, PETERSEN et al. 2010). Auch Invertebraten, wie Fliegen oder Regenwürmer, können als Transportwirte zur Verbreitung des Parasitenstadiums beitragen (RUIZ und FRENKEL 1980, HILL und DUBEY 2002). Sporulierte Oozysten besitzen eine hohe Tenazität gegenüber Umwelteinflüssen und können beispielsweise in feuchter Erde über 18 Monate infektiös bleiben (FRENKEL et al. 1975, DUBEY 1998). Oozysten können zur Kontamination von Trinkwasser, Obst, Gemüse sowie der Umgebung führen und stellen eine bedeutsame Infektionsquelle für den Menschen dar (KAPPERUD et al. 1996, BOWIE et al. 1997, COOK et al. 2000, BAHIA- OLIVIERA et al. 2003). Mehrfach wird mit Oozysten verunreinigtes Wasser als eine wichtige Infektionsquelle beschrieben (BAHIAOLIVIERA et al. 2003, ERTRUG et al. 2005, JONES et al. 2005, HEUKELBACH et al. 2007). 12 Literaturübersicht Darüber hinaus konnten einige Studien einen Zusammenhang zwischen Toxoplasmose Ausbrüchen und verunreinigtem Trinkwasser herstellen (BOWIE et al. 1997, BAHIA-OLIVEIRA et al. 2003, DUBEY 2004). Allgemein wird angenommen, dass, aufgrund der Wasser- oder Bodenkontamination, der Verzehr von ungewaschenem, rohem Gemüse und Obst ein potentieller Übertragungsweg sein kann (TENTER et al. 2000, KJILSTRA und JONGERT 2008). Experimentell konnte gezeigt werden, dass mit Oozysten-gespikten Beeren eine T. gondiiÜbertragung auf Mäuse möglich ist (KNIEL et al. 2002). In einer Fall-Kontrollstudie aus Norwegen konnte mit dem Verzehr von ungewaschenem Gemüse oder Obst ein erhöhtes Infektionsrisiko assoziiert werden (KAPPERUD et al. 1996). Schon allein der Kontakt mit kontaminierter Erde ist als Risikofaktor nicht zu unterschätzen (COOK et al. 2000). In einer europäischen Studie wurden 6% bis 17% der Infektionen auf den Kontakt mit Erde, zum Beispiel bei der Gartenarbeit zurückgeführt (COOK et al. 2000). Hingegen ist der direkte tägliche Kontakt mit Katzen laut COOK et al. (2000) und KAPPERUD et al. (1996) nicht zwingend mit einem erhöhten Infektionsrisiko verbunden. 2.4.2 2.4.2.1 Toxoplasmose des Menschen Seroprävalenzen Schätzungen zufolge ist ca. ein Drittel der Weltbevölkerung mit dem Erreger infiziert (ASPINALL et al. 2002, HILL und DUBEY 2002, MONTOYA und LIESENFELD 2004, WEISS und DUBEY 2009). Die T. gondii-Seroprävalenz innerhalb der Bevölkerung variiert jedoch deutlich je nach Kontinent, Land, Region und Personengruppe (TENTER et al. 2000, PAPPAS et al. 2009). Prävalenzen in Lateinamerika sind im Allgemeinen höher als in Nordamerika und Ostasien (PAPPAS et al. 2009). Deutliche Unterschiede zwischen den Ländern innerhalb eines Kontinents sind auch in Europa ersichtlich. Beispielsweise ermittelten BIRGISDOTTIR et al. (2006) mit über 50% eine deutlich höhere Prävalenz für Estland als für Schweden (23%) oder Island (9,8%). Generell ist in den letzten Jahrzehnten eine Abnahme der Seroprävalenz in einigen europäischen Ländern sowie in Nordamerika zu verzeichnen (JONES et al. 2007, PAPPAS et al. 2009). In Deutschland wird die durchschnittliche Durchseuchungsrate der Bevölkerung auf ca. 50% geschätzt (RKI 2009). Für schwangere Frauen werden Prävalenzen zwischen 26% und 54% angegeben (GROSS 2004). Die Seroprävalenz nimmt mit steigendem Lebensalter in Deutschland um ca. 1% pro Lebensjahr zu und kann bei über Fünfzigjährigen bis zu 70% erreichen (GROSS 2004, RKI 2009). 13 Literaturübersicht 2.4.2.2 Klinische Symptomatik 2.4.2.2.1 Postnatale Infektion Die T. gondii-Erstinfektion verläuft bei immunkompetenten Menschen in der Regel asymptomatisch oder subklinisch (HILL und DUBEY 2002, MONTOYA und LIESENFELD 2004). In wenigen Fällen treten unspezifische, grippeähnliche Symptome, wie Abgeschlagenheit, Fieber, Muskel- und Gliederschmerzen, auf (GROSS et al. 2001, MONTOYA und LIESENFELD 2004). Eine typische klinische Manifestation ist die Lymphadenitis, die überwiegend lokal im Kopfund Halsbereich vorkommt. In Einzelfällen kommt es zur generalisierten Lymphknotenschwellung. Äußerst selten sind eine Myokarditis, Polymyositis, Pneumonitis, Hepatitis oder Enzephalitis zu beobachten (GROSS et al. 2001, MONTOYA und LIESENFELD 2004, RKI 2009). Für Personen, bei denen aufgrund anderer Erkrankungen (AIDS) oder im Rahmen einer Organtransplantation, eine Immunsuppression vorliegt, stellt die T. gondii-Infektion eine lebensbedrohliche Gefahr dar (LIESENFELD et al. 1999, MELE et al. 2002, HAPPE et al. 2002, MONTOYA und LIESENFELD 2004, DEROUIN und PELLOUX 2008). In den meisten Fällen ist die schwere Form der Toxoplasmose auf die Reaktivierung einer latenten Infektion zurückzuführen (PORTER et al. 1992, GROSS et al. 2001, MONTOYA und LIESENFELD 2004). Klinisch überwiegt das Bild einer Enzephalitis einhergehend mit Bewusstseinsstörungen und Krampfanfällen. In Folge einer generalisierten Ausbreitung des Erregers können zudem Retinochorioiditis, Pneumonitis oder ein Multiorganversagen auftreten (LIESENFELD et al. 1999, RKI 2009). 2.4.2.2.2 Pränatale Infektion Eine kongenitale Übertragung der Infektion erfolgt in der Regel nur bei der Erstinfektion einer Schwangeren, wobei das fetale Infektionsrisiko und Krankheitsbild vom Graviditätsstadium der Mutter zum Zeitpunkt der Infektion abhängig sind (GROSS et al. 2001, LOPES et al. 2007, RKI 2009). Während mit zunehmender Dauer der Schwangerschaft das Risiko der diaplazentaren Übertragung steigt, nimmt der Schweregrad der Erkrankung beim Kind ab (DUNN et al. 1999, MONTOYA und REMINGTON 2008). Infiziert sich eine werdende Mutter im ersten Trimenon, so besteht ein geringes Risiko von ca. 14%, dass der Erreger übertragen wird. Eine derart frühe Infektion führt meist zum Abort oder zu einer ausgeprägten Form der fetalen Toxoplasmose (GROSS et al. 2001, LOPES et al. 2007). Eine Infektion im zweiten oder dritten Trimenon ist mit 14 Literaturübersicht einem erhöhten Übertragungsrisiko von 29%, beziehungsweise 59%, verbunden und kann sich beim Neugeboren unterschiedlich schwer manifestieren. Bei nur etwa 2% der Fälle findet sich die klassische Trias (Hydrozephalus, Retinochorioiditis und zerebrale Kalzifikationen) (GROSS et al. 2001, MONTOYA und LIESENFELD 2004). Viele Neugeborene zeigen nach einer Spätinfektion eher unspezifische Symptome, wie Fieber, Konvulsionen oder einen prolongierten Ikterus. Infizierte Kinder, die bei der Geburt unauffällig waren, entwickeln klinische Manifestationen in Form von Strabismus, Retinochorioiditis, Taubheit und mentale Retardierung erst viele Jahre später (FRIESE et al. 1996, GROSS et al. 2001, LOPES et al. 2007). 2.4.2.2.3 Okuläre Toxoplasmose Die okuläre Toxoplasmose (OT) manifestiert sich überwiegend als Retinochorioiditis mit einer fokal nekrotisierenden Entzündung von Netz- und Aderhaut, die von den inneren Schichten der Retina ausgeht. Sie kann uni- oder bilateral auftreten (BOSCH-DRIESSEN et al. 2002, PLEYER et al. 2007). Die Symptome bei einer akuten OT reichen von verminderter Sehschärfe, "Flocken im Gesichtsfeld" bis hin zu einem Sehverlust (PLEYER et al. 2007). Bislang wurde angenommen, dass es sich bei der okulären Toxoplasmose um eine Spätmanifestation und Reaktivierung der kongenitalen Infektion handelt. Neuere Untersuchungen zeigen jedoch, dass mindestens zwei Drittel der OT auf postnatale Infektionen zurückzuführen sind (MONTOYA und REMINGTON 1996, GILBERT und STANFORD 2000, EFSA 2007). 2.5 Aviäre Toxoplasmose Vögel sind grundsätzlich für die Infektion mit T. gondii empfänglich (TENTER 2009, DUBEY 2009b, BANGOURA et al. 2011). Weltweit konnten bei zahlreichen Wild-, Zoo- und Ziervögeln, sowie beim Nutzgeflügel Antikörper nachgewiesen werden (ausführlich referiert in DUBEY 2002 und DUBEY 2009b). Die aviäre Toxoplasmose verläuft bei den meisten Vogelarten überwiegend asymptomatisch oder subklinisch (DUBEY 2002). Jedoch kann die Infektion bei einigen Vogelspezies (z. B.: Kanarienvögel und Tauben) zu schwerwiegenden Erkrankungen führen und plötzliche Todesfälle verursachen (DUBEY 2002). Beispielsweise kann sich die Toxoplasmose bei Kanarienvögeln in Form von Chorioretinitiden, welche mit einer Meningitis oder Enzephalitis einhergehen manifestieren (VICKERS et al. 1992, LINDSAY et al. 1995, GIBBENS et al. 1997, WILLIAMS et al. 2001). Auch Tauben scheinen empfindlicher auf eine T. gondii-Infektion zu reagieren, als andere Vogelarten (BANGOURA et al. 2011). So wurde bereits mehrfach von plötzlichen Todesfällen oder klinischen Symptomen, wie Koordinationsstörungen und Durchfall 15 Literaturübersicht berichtet (HUBBARD et al. 1986, BIANCIFIORI et al. 1986). Bei Haushühnern hingegen werden äußerst selten klinische Manifestationen beobachtet (BIANCIFIORI et al. 1986, KANETO et al. 1997, DUBEY 2010). 2.6 Toxoplasmose bei der Pute (Meleagris gallopavo) Auch Puten sind für eine T. gondii-Infektion empfänglich und infizieren sich mit Oozysten aus der Umwelt oder über kontaminierte Futtermittel. Ferner ist die Aufnahme parasitärer Gewebestadien beim Verzehr beziehungsweise Bepicken kleiner infizierter Schadnager als ein weiterer Übertragungsweg in Betracht zu ziehen. 2.6.1 Seroprävalenzen Es existieren weltweit relativ wenige Daten zum Vorkommen der T. gondii-Infektion bei Truthühnern. In den USA sind bislang lediglich bei Wildputen Seroprävalenzstudien durchgeführt worden. QUIST et al. (1995) untersuchten 130 Wildputen aus verschiedenen Staaten der USA und stellten eine Gesamtprävalenz von 10,0% (mittels MAT) fest. Der Anteil positiv getesteter Tiere innerhalb der Bundesstaaten variierte regional zwischen 0.0% und 40,0% (QUIST et al. 1995). Zuvor wurde bei Wildtieren in Alabama eine Prävalenz von 71,0% (n= 17; MAT) ermittelt, wohingegen in Florida bei keiner der freilebenden Puten (n=20) Antikörper (IHAT) nachgewiesen werden konnten (BURRIDGE et al. 1979, LINDSAY et al. 1994). Für domestizierte Puten werden zum Teil auffällig hohe Seroprävalenzraten von 24,0% (n=25; IHAT) im Iran und 76,63% (n=107; LAT) im Irak beschrieben (GHORBANI et al. 1990, BUTTY E.T. 2009). In Ägypten werden Prävalenzwerte zwischen 29,4% (IHAT) und 59,5% (n=173; MAT) angegeben (EL-MASSRY et al. 2000, HARFOUSH und TAHOON 2010). Die untersuchten Tiere stammten überwiegend aus bäuerlichen Kleinbetrieben, präzise Angaben zu den Haltungsbedingungen sind jedoch nicht publiziert. Zur Seroprävalenz bei Truthühnern im europäischen Raum sind bisher nur Daten aus der Tschechischen Republik und Deutschland verfügbar. Bei landesweiten Untersuchungen in der Tschechischen Republik testeten BÁRTOVÀ et al. (2009) konventionell gehaltene Mastputen (n=60) mittels IFAT, konnten allerdings bei keinem Tier Antikörper nachweisen. Ebenfalls negativ fiel der SF-Test bei einem Einzeltier in einem kleinbäuerlichen Betrieb aus (LITERÁK und HEJLÍCEK 1993). Im Gegensatz dazu, ermittelten KOETHE et al. (2011) bei Puten in Deutschland mit 18,4% (KELA) eine deutlich höhere Seroprävalenz. Insgesamt wurden 1.913 Masttiere aus verschieden Betrieben mit reiner Stallhaltung untersucht. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass der Anteil T. gondii-positiver Tiere nicht 16 Literaturübersicht nur bei den verschiedenen Putenfarmen, sondern auch bei den einzelnen Mastperioden innerhalb eines Betriebes stark variierte (KOETHE et al. 2011). Bei dem Vergleich von Seroprävalenzdaten sind, neben Faktoren wie Anzahl, Alter und Herkunft der Tiere, auch die jeweils gewählten diagnostischen Nachweisverfahren zu beachten, da sie sich hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität deutlich unterscheiden. Für den T. gondiiAntikörpernachweis bei Puten werden der LAT und IHAT als wenig geeignet, der SFT als gänzlich ungeeignet angesehen. Als zuverlässige und sensitive Methoden sind sowohl der MAT als auch der ELISA einzuschätzen (DUBEY et al. 1993a). 2.6.2 Klinisches Bild und pathologische Befunde Es ist anzunehmen, dass die T. gondii-Infektion bei Truthühnern überwiegend klinisch inapparent verläuft, da nur vereinzelt Krankheitserscheinungen oder Todesfälle beschrieben werden (DROHBECK et al. 1953, DUBEY et al. 1993a, QUIST et al. 1995, SEDLÁK et al. 2000). Erstmals beobachtete SCHULTE (1954) das Auftreten einer klinisch manifesten Toxoplasmose mit letalem Ausgang bei Puten in einem Geflügelbestand. Die erkrankten Tiere (n=4) zeigten neben unspezifischen Symptomen wie Apathie und Anorexie, neurologische Auffälligkeiten in Form von Koordinations- und Bewegungsstörungen bis hin zum völligen Orientierungsverlust und verstarben innerhalb von 14 bis 21 Tagen. Bei der Obduktion stellte SCHULTE (1954) pathologische Veränderungen in Form einer herdförmigen, teilweise nekrotischen, Meningoenzephalitis mit Beteiligung von Lymphozyten, Leukozyten und Plasmazellen fest und beschrieb zudem hochgradig erweiterte und flüssigkeitsgefüllte Ventrikel (Hydrocephalus internus). Histologisch waren in den Entzündungsgebieten zahlreiche im Gewebe frei liegende Tachyzoiten, in den unveränderten Gehirnarealen auch Gewebezysten des Erregers erkennbar (SCHULTE 1954). In den USA wurden 2 Todesfälle bei wildlebenden Truthühnern auf eine systemische Toxoplasmose zurückgeführt (HOWERTH und RODENROTH 1985, QUIST et al. 1995). Eine vorangegangene klinische Symptomatik ist nicht bekannt. HOWERTH und RODENROTH (1985) diagnostizierten bei der Sektion eine Splenomegalie, Pneumonie und Enteritis. In zahlreichen Organen (Milz, Lunge, Leber, Niere, Nebenniere, Ösophagus, Drüsenmagen, Gehirn und Kolon) waren multifokale, teils konfluierende, nicht-suppurative Nekrosen vorhanden. In den nekrotischen Bereichen und angrenzenden Arealen fanden sich neben hochgradigen Infiltrationen mit Makrophagen und Lymphozyten auch häufig Gefäßthrombosen. Tachyzoiten konnten sowohl intra- als auch extrazellulär in den Entzündungsgebieten der oben genannten Organe nachgewiesen werden (HOWERTH und RODENROTH 1985). Auch QUIST et al. (1995) stellten bei einem verstorbenen 17 Literaturübersicht Wildtruthahn multifokale und konfluierende Nekroseherde in Leber, Niere, Milz, sowie im Pankreas und Myokard fest. Intrazelluläre Tachyzoiten ließen sich immunhistochemisch in Leber, Milz und Niere nachweisen. Neben T. gondii-assoziierten Organveränderungen, beschrieben QUIST und ihre Mitarbeiter (1995) einen hochgradigen Nematodenbefall, sowie eine Dermatitis im Kopfbereich. Sie vermuteten, dass der fatale Verlauf der Toxoplasmose durch eine Immunsupprimierung des Tieres, infolge einer möglicherweise vorangegangenen Geflügelpockeninfektion, begünstigt wurde (QUIST et al. 1995). 2.6.3 Experimentelle Infektion Mehrere experimentelle Studien belegen, dass bei Puten nach einer T. gondii-Infektion in verschiedenen Organen parasitäre Dauerstadien auftreten können (DROHBECK et al. 1953, SIMITCH et al. 1965, DUBEY et al. 1993a, SEDLÁK et al. 2000). DROHBECK et al. (1953) untersuchten die Persistenz infektiöser Gewebezysten und Dauer der Parasitämie bei Puten (n=22) nach einer intraperitonealen Applikation von Tachyzoiten. Es zeigte sich, dass eine Parasitämie vereinzelt bis zu 18 Tage p.i. andauerte und infektiöse Gewebestadien bis zu 9 Wochen p.i. persistierten (DROHBECK et al. 1953). SIMITCH und seine Mitarbeiter (1965) erforschten, ob die Empfänglichkeit von Puten für eine T. gondii-Infektion durch das jeweils applizierte Parasitenstadium beeinflusst wird. Dafür infizierten sie 6 Truthühner mit Tachyzoiten und eine weitere Gruppe (n=12) mit Gewebezysten, die zuvor aus Mäusen generiert wurden. Leber, Gehirn, Lunge und Milz wurden einzeln mikroskopisch untersucht und in gepoolter Form als Homogenisat an Mäuse verfüttert. Im Mäuseversuch konnte bei allen zysteninfizierten Truthühnern, aus der Gruppe der Tachyzoiten-infizierten Tiere lediglich bei einer Pute eine erfolgreiche Infektion nachgewiesen werden. Eine histologische Darstellung des Erregers gelang bei 3 Tieren der Tachyzoiten-infizierten Truthühner (SIMITCH et al.1965). Eine weitere Studie zur experimentellen Toxoplasmose bei Puten erfolgte durch DUBEY et al. (1993a), wobei, neben der Evaluierung serologischer Testmethoden, die Verteilung von T. gondiiZysten nach einer Oozysteninfektion im Fokus stand. Hierfür wurden den Tieren 7, beziehungsweise 9 Wochen p.i. Gehirn, Brust- und Beinmuskel, sowie Leber und Herz entnommen und diese einzeln oder gepoolt im Mäusefütterungsversuch auf das Vorhandensein von Gewebezysten untersucht. Der Erreger konnte aus allen gepoolten Organproben (n= 9) isoliert werden. Bei der Einzelorganuntersuchung gelang der positive T. gondii-Nachweis bei allen (5 /5) Herzen. In 2 (von 5) beziehungsweise 4 (von 5) Proben der Brust- und Beinmuskulatur konnte der 18 Literaturübersicht Erreger ebenfalls isoliert werden, während die Untersuchung von Leber und Gehirn negativ ausfiel. SEDLÁK et al. (2000) beschreiben eine Isolationsrate von 20% bis 100% nach einer Oozysteninfektion bei Puten. Wie bei DUBEY et al. (1993a) konnte der Erreger am häufigsten aus dem Herzen (5/5) isoliert werden. Weitere im Mäusefütterungsversuch positiv getestete Organe waren Gehirn (3/5), Leber (2/5), Muskulatur (2/5) und Milz (1/5) (SEDLÀK et al. 2000). In allen experimentellen Studien traten bei den Puten keine klinische Symptome auf, die auf die T. gondiiInfektion zurückführen sind (DROHBECK et al. 1953, SIMITCH et al. 1965, DUBEY et al. 1993a, SEDLÁK et al. 2000). 19 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 3 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 3.1 Ziele Es sind bislang keine näheren Informationen zur Rolle der Pute und der aus ihr gewonnenen Lebensmittel als Infektionsquelle für die Toxoplasmose des Menschen bekannt. Vor diesem Hintergrund untersucht die vorliegende Arbeit verschiedene Aspekte der T. gondii-Infektion bei der Pute mit folgenden Zielen: 1. Entwicklung und Etablierung eines reproduzierbaren Infektionsmodells bei der Pute 2. Ermittlung der Verteilung und Persistenz von T. gondii-Gewebestadien nach experimenteller Tachyzoiteninfektion (Publikation 1) 3. Ermittlung der Verteilung und Persistenz von T. gondii-Gewebestadien nach experimenteller Oozysteninfektion (Publikation 2) 4. Untersuchung und Vergleich verschiedener Parameter wie Infektionsstadium, Infektionsdosis und Applikationsmodus hinsichtlich ihres Einflusses auf die Ausbildung von Gewebestadien im Organismus der Pute (Publikation 2). 3.2 Allgemeiner Studienaufbau Für alle Teilversuche der Studie wurden Puten der Rasse BUT (British United Turkey) Big 6 an Tag 1 nach dem Schlupf im Institut für Parasitologie der Universität Leipzig eingestallt und unter den gleichen Bedingungen (Fütterung, Haltung, Pflege) gehalten. Der Gesundheitszustand der Versuchstiere wurde täglich adspektorisch begutachtet. Direkt vor der Infektion und im Anschluss wöchentlich wurden von jeder Pute Blutproben entnommen, um die Seronegativität zu Versuchsbeginn und den Infektionserfolg zu verifizieren. Die serologische Untersuchung zum Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper wurde mittels KELA (siehe KOETHE et al. 2011) durchgeführt. Nach einer Aufzuchtperiode von 4 bis 8 Wochen erfolgte die Infektion mit Tachyzoiten oder Oozysten. Entsprechend der Versuchsgruppe wurden in unterschiedlich hohen Dosen T. gondiiTachyzoiten vom Stamm ME49 (LUNDE und JACOBS 1983) intravenös und/oder intramuskulär , 20 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten beziehungsweise Oozysten vom Stamm ME49 (LUNDE und JACOBS 1983), DX (VAN DER ZYPEN und PIEKARSKI 1967) oder Hannover 1 (WAGNER et al. 2009) oral verabreicht (siehe Tabelle 1 und 2). Alle eingesetzten Stämme werden dem Genotyp II zugeordnet. Je nach Gruppenzugehörigkeit wurden die Puten 6 bis 8 (früher Untersuchungszeitpunkt) oder 10 bis 12 Wochen (später Untersuchungszeitpunkt) nach der Infektion getötet. Bei der Sektion wurden folgende Organe und Muskelproben entnommen: Brust-, Oberschenkel- und Unterschenkelmuskulatur, Herz, Leber, Muskel- und Drüsenmagen, Lunge, Milz, Nieren, Darm, Pankreas und Hoden (sofern vorhanden). Jedes einzelne Organ wurde im Ganzen mit Hilfe eines Zerkleinerers (La Moulinette, Tefal Groupe SEB, Offenbach, Deutschland) homogenisiert. Bei den Muskeln wurden Proben (insgesamt 300 g pro Muskel) von verschiedenen Lokalisationen entnommen und ebenfalls getrennt homogenisiert. Für die anschließende DNA-Extraktion aus den Homogenatproben wurde der QIAamp DNA Mini Kit® verwendet. Um einschätzen zu können, ob während der Probenaufbereitung eine versehentliche Übertragung von T. gondii-DNA auftritt, wurden beispielhaft In-Prozeß-Kontrollen durchgeführt. Hierfür wurde abwechselnd DNA aus Organproben negativer Kontrolltiere und infizierter Puten extrahiert und anschließend dem PCRVerfahren zugeführt Der Nachweis von T. gondii-DNA in den Gewebeproben erfolgte durch ein gelbasiertes PCRVerfahren. Zunächst wurde eine direkte PCR, basierend auf der Amplifikation eines 469bpFragments des Toxoplasma B1-Gens (nach der Methode von JALAL et al. 2004) durchgeführt. Um die Sensitivität zu erhöhen, erfolgte anschließend die nested PCR mit selbst designten Primern (Länge Zielfragment: 375bp). Beide PCR-Verfahren wurden im iCycler® Thermal Cycler (BioRad, Hercules, CA, USA) durchgeführt. Für die Gelelektrophorese wurden ca. 12 µl von jedem PCR-Produkt auf ein 1,5%-Agarosegel aufgetragen. Nach der Färbung des Gels erfolgte die Sichtbarmachung der DNA-Banden durch ultraviolettes Licht. Eine Gewebeprobe wurde als T. gondii-positiv bewertet, wenn in einer der beiden PCR-Techniken Banden erkennbar waren. Bei jeder PCR diente T. gondii-DNA, die zuvor aus in vitro-generierten ME49 Tachyzoiten extrahiert wurde, als Positivkontrolle, als Negativkontrolle wurde Wasser eingesetzt. Zu Beginn der Studie wurde zusätzlich zur molekularbiologischen eine lichtmikroskopische Untersuchung einzelner Organe in Form nativer Quetschpräparate (400fache Vergößerung) auf T. gondii-Zysten durchgeführt. 21 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten Für die statistische Auswertung wurden aus den einzelnen Versuchsgruppen je nach Infektionsstadium, Infektionsdosis (Dosiskategorien: niedrig, mittel, hoch) und Untersuchungszeitpunkt p.i. (früh/spät) statistische Einheiten gebildet. Zudem wurden Organe, die als Lebensmittel verwendet werden, als sogenannte essbare Organe zusammengefasst und gesondert analysiert. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden als signifikant beurteilt, wenn der ermittelte p-Wert kleiner als 0,05 war. TABELLE 1: Studiendesign für die Infektion mit T. gondii-Tachyzoiten Infektionsdosis ME49 Tachyzoiten UZPa UZP Infektionsroute Frühb (n)c Spätb (n) Dosiskategorie (i.v. Infektion) 1 x 106 Niedrig i.v. 4 8 5 x 106 Mittel i.v. - 4 7,5 x 106 Mittel i.v. 3 4 2 x 107 Hoch i.v. 3 4 3-maligd 1 x 107 - i.m. 3 - 1 x 107 je Route - i.v. und i.m. 3 - Summe 16 20 Kontrollgruppe 3 5 a UZP: Untersuchungszeitpunkt b c Früh: 6-8 Wo. p.i.; Spät: 10-12 Wo. p.i. n: Anzahl der Tiere d Inokulation mit 1,0 x 107 Tachyzoiten pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen 22 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten TABELLE 2: Studiendesign für die Infektion mit T. gondii-Oozysten UZPa UZP Dosiskategorie Frühb (n)c Spätb (n) 5 x 105 mittel 3 4 1 x 107 hoch 4 4 Infektionsdosis T. gondii(Oozysten pro Summe Stamm Tier) ME49 mittel 6 4 5 x 104 niedrig - 4 5 x 105 mittel - 4 5 x 105 mittel - 3 3 Summe 13 23 36 - 4 4 5 x 105 DX Hannover1 25 3-maligd 8 Kontrollgruppe a UZP: Untersuchungszeitpunkt b c Früh: 6-8 Wo. p.i.; Spät: 10-12 Wo. p.i. n: Anzahl der Tiere d Inokulation von 5 x 105 Oozysten pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen 23 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten Parasitol Res. 2013;112:1841-7. 3.3 Publikationen 3.3.1 Tissue tropism of Toxoplasma gondii in turkeys (Meleagris gallopavo) after parental infection (Publikation 1) 24 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 25 Parasitol Res. 2013;112:1841-7. Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 26 Parasitol Res. 2013;112:1841-7. Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 27 Parasitol Res. 2013;112:1841-7. Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 28 Parasitol Res. 2013;112:1841-7. Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 29 Parasitol Res. 2013;112:1841-7. Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 3.3.2 Vet Parasitol. 2013;196:272-7. Experimental Toxoplasma gondii oocyst infections in turkeys (Meleagris gallopavo) (Publikation 2) 30 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 31 Vet Parasitol. 2013;196:272-7. Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 32 Vet Parasitol. 2013;196:272-7. Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 33 Vet Parasitol. 2013;196:272-7. Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 34 Vet Parasitol. 2013;196:272-7. Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten 35 Vet Parasitol. 2013;196:272-7. Übergreifende Diskussion 4 Übergreifende Diskussion 4.1 Diskussion In der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose wird, neben der Aufnahme von Oozysten, die horizontale Übertragung von T. gondii-Gewebezysten als einer der Hauptinfektionswege betrachtet (TENTER et al. 2000, HILL und DUBEY 2002, PETERSEN et al. 2010, HILL und DUBEY 2013). Viele Studien zur Risikobewertung bezeichnen den Verzehr von zystenhaltigem Fleisch im rohen oder ungenügend erhitzten Zustand als bedeutende, teilweise sogar als wichtigste, Infektionsquelle für den Menschen (BUFFOLANO et al. 1996, KAPPARUD et al. 1996, BARIL et al. 1999, COOK et al. 2000, BOBIC et al. 2007, EFSA 2007, PETERSEN et al. 2010). Bereits der professionelle Umgang mit rohem Fleisch (McDONALD et al. 1990, JONES und DUBEY 2012) sowie hygienische Mängel bei der Fleischzubereitung (KAPPARUD et al. 1996) werden als Risikofaktoren angesehen. Gewebezysten werden zwar bei allen natürlich infizierten Tieren gebildet, variieren jedoch in ihrer Anzahl und Lokalisation je nach Wirtsspezies (TENTER et al. 2000, TENTER 2009). Entsprechend wird das vom Fleisch ausgehende Gefährdungspotential für den Menschen für die verschiedenen lebensmittelliefernden Tiere als unterschiedlich hoch eingestuft. Neben tierartspezifischen Unterschieden, sind religiöse und kulturelle Gegebenheiten, sowie Zubereitungsmethoden weitere Faktoren, die bei der Risikobewertung der verschiedenen Fleischsorten berücksichtigt werden müssen (COOK et al. 2000, KJILSTRA und JONGERT 2008, PETERSEN et al. 2010). Die Toxoplasmose der Pute und die Bedeutung von Putenfleischerzeugnissen als potentielle Infektionsquelle für den Menschen sind in der bisher zugänglichen Literatur kaum betrachtet worden. Seroprävalenzen wurden nur vereinzelt in wenigen Ländern ermittelt, beschreiben aber zum Teil auffällig hohe Prävalenzen innerhalb einer Vogelpopulation (BURRIDGE et al. 1979, LINDSAY et al. 1994, QUIST et al. 1995, GHORBANI et al. 1990, EL-MASSRY et al. 2000, BUTTY E.T. 2009, BÁRTOVÀ et al. 2009, HARFOUSH und TAHOON 2010). In Deutschland ermittelten KOETHE et al. (2011) bei Schlachtputen eine relativ hohe T. gondii -Seroprävalenz von 18,4%. Da es sich dabei um Tiere aus der konventionellen Masthaltung handelte, ist zu vermuten, dass die Puten sich über Oozysten-kontaminiertes Futter oder Einstreu infiziert hatten. Auch die Infektion mit Zysten durch den Verzehr oder das Bepicken kleiner infizierter Schadnager ist in Erwägung zu ziehen. Anhand serologischer Daten kann jedoch nur ein Rückschluss auf den Erregerkontakt, nicht jedoch auf die Zystenpräsenz und die damit verbundene potentielle 36 Übergreifende Diskussion Infektionsgefahr für den Menschen gezogen werden. Die wenigen Untersuchungen zur Toxoplasmose bei der Pute belegen allerdings, dass sowohl bei natürlich (SCHULTE 1954, HOWERTH und RODENROTH 1985, QUIST et al. 1995) als auch experimentell (DROHBECK et al. 1953, SIMTICH et al. 1965, DUBEY et al. 1993a, SEDLÁK et al. 2000) infizierten Tieren infektiöse Zysten in verschiedenen Geweben, darunter auch in der Muskulatur, auftreten können. Eine Bewertung des Verbraucherrisikos ausgehend vom Putenfleisch, beziehungsweise unzureichend thermisch behandelten Putenfleischprodukten, wie frisch gereifte Rohwürste oder kurz gereifte Rohpökelwaren, ist anhand der bisher veröffentlichen Literatur nicht möglich. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, durch die Entwicklung eines T. gondiiInfektionsmodells nähere Erkenntnisse zur Verteilung parasitärer Stadien in den Organen und der Muskulatur der Pute zu erlangen und Ansatzpunkte für die Bewertung des Toxoplasmose-Risikos für den Verbraucher zu gewinnen. Für die Experimente wurden Puten entweder mit Tachyzoiten oder Oozysten in unterschiedlich hohen Dosen infiziert. Als Infektionsstämme wurden ME49 (LUNDE und JACOBS 1983), DX (VAN DER ZYPEN und PIEKARSKI 1967) und Hannover 1 (WAGNER et al. 2009) gewählt, die dem Genotyp II zugeordnet werden. Typ II - Stämme sind sowohl in Europa (PEYRON et al. 2006, SCHARES et al. 2008), als auch in Nordamerika (DUBEY und SU 2009) am häufigsten vertreten. Zudem belegten vorherige Studien, das eine Infektion mit Typ II-Stämmen bei Puten eine subklinische Toxoplasmose induzieren (DUBEY et al. 1993a, SEDLÀK et al 2000), während nach Infektionen mit Typ I - Stämmen bei Hühnervögeln mit schwerwiegenden, zum Teil fatalen, Krankheitsbildern zu rechnen ist (DUBEY et al. 1993b, DUBEY et al 1994, DUBEY et al.1995). Für die Infektion mit Tachyzoiten wurden ausschließlich ME49 -Tachyzoiten eingesetzt. Die Infektion mit Tachyzoiten entspricht zwar nicht dem natürlichen Infektionsweg, bietet hinsichtlich der Handhabung allerdings einige Vorteile. Die Vermehrung in der Zellkultur erfolgt unter standardisierten Bedingungen und ist wenig zeitaufwendig. Darüber hinaus sind im Vorfeld keine zusätzlichen Tierversuche erforderlich, wie dies für die Gewinnung von Oozysten der Fall ist. Um die Auswirkungen der Tachyzoiteninfektion mit denen einer natürlichen Infektion vergleichen zu können, wurde ein Teil der Puten mit Oozysten infiziert. Neben der Aufnahme von Oozysten ist auch die Infektion über Gewebezysten als natürlicher Infektionsweg bei Puten in Betracht zu 37 Übergreifende Diskussion ziehen. In der vorliegenden Arbeit wurden Zysten als Infektionsmedium nicht berücksichtigt, da eine Quantifizierung von Zysten in Mäusehirnen schwierig und ein standardisierbarer Parameter kaum erreichbar ist, der aber für die Entwicklung eines Infektionsmodells notwendig wäre. Zum Nachweis des Erregers in Gewebeproben gilt der Bioassay mit Mäusen oder Katzen als Goldstandard. Allerdings sind diese Verfahren äußerst arbeits- und zeitintensiv und aus tierethischer Sicht problematisch, wenn die Untersuchung einer größeren Anzahl von Proben beabsichtigt ist, wie es in der vorliegenden Studie der Fall war. Als Alternative wurde ein PCR-basiertes Verfahren eingesetzt. Die konventionelle PCR-Methode ist ein etabliertes und sensitives Verfahren zur T. gondii - Detektion und bietet die Möglichkeit, viele Proben innerhalb kurzer Zeit zu überprüfen. Im Vergleich zum Bioassay weist die PCR bei der Untersuchung von Fleischproben allerdings eine geringere Sensitivität auf (GARCIA et al. 2006, OPSTEEGH et al. 2010). Im Bioassay mit Katzen können nach vorheriger künstlicher Verdauung Fleischproben von bis zu 500 g verfüttert werden, während für die PCR DNA aus maximal 50 mg Probenmaterial isoliert wird (OPSTEEGH et al. 2010). Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Erregerpräsenz im Tier erkannt wird, hängt von der Probenmenge ab und ist deutlich geringer, wenn sie klein ist. Weitere Faktoren, die den sicheren Zystennachweis mittels PCR erschweren sind die inhomogene Verteilung der Zysten und eine geringe Zystendichte im untersuchten Gewebe. Zu beachten ist außerdem, dass mit Hilfe der in der vorliegenden Studie eingesetzten PCR lediglich die DNA und damit die Präsenz von T. gondii nachgewiesen wurde. Ein Beweis der Vitalität und damit Infektionsfähigkeit des Erregers ist aber auf diesem Weg nicht möglich. Dazu wären Bioassays erforderlich gewesen, die aber aus den oben bereits genannten Gründen nicht verfügbar waren. 4.1.1 Experimentelle Infektion Während der Studie konnten ungeachtet der Infektionsdosis und des inokulierten Parasitenstadiums bei keinem der Versuchstiere klinische Symptome einer Toxoplasmose beobachtet werden. Bei der Sektion der Puten waren keine pathologisch-anatomischen Veränderungen an den Organen erkennbar. Diese Beobachtungen stimmen mit den Erkenntnissen aus experimentellen Studien anderer Autoren überein und unterstützen die Annahme, dass die T. gondii - Infektion bei der Pute überwiegend subklinisch verläuft (DROHBECK et al. 1953, SIMITCH et al. 1965, DUBEY et al. 1993a, SEDLÁK et al. 2000). QUIST et al (1995) berichteten über die systemische Toxoplasmose eines Wildtruthahns und vermuteten, dass der fatale Verlauf durch eine Immunsuppression des Tieres, infolge einer möglicherweise vorangegangenen Geflügelpockeninfektion, begünstigt wurde. In der vorliegenden Studie wurden die Puten in Kleingruppen unter weitgehend von Stress und von 38 Übergreifende Diskussion Begleitinfektion freien Haltungsbedingungen gehalten. Inwieweit dies für den subklinischen Verlauf bestimmend war, bleibt unklar. Es ist daher nicht auszuschließen, dass die in dieser Studie eingesetzten Infektionsdosen unter Feldbedingungen zum Auftreten einer klinisch apparenten Toxoplasmose führen würden. Bisher sind nur vereinzelt Fälle akuter Toxoplasmosen bei natürlich infizierten Puten beschrieben wurden (SCHULTE 1954, HOWERTH und RODENROTH 1985, QUIST et al. 1995). Allerdings ist es fraglich, inwiefern Toxoplasmose-bedingte Symptome oder Todesfälle beispielsweise in großen Mastanlagen überhaupt als solche erkannt werden. Anhand der zum Versuchsbeginn und im Anschluss wöchentlich entnommenen Blutproben konnte bei allen infizierten Puten die serologische Konversion 6 bis 14 Tage nach der Infektion nachgewiesen werden (siehe KOETHE et al. 2011). Ein direkter Nachweis des Befalls der Puten konnte bei der PCR - Analyse der Organproben nicht für alle Tiere erzielt werden. In der Gruppe der Tachyzoiten-infizierten Tiere (n=36), konnte bei 5, in der Gruppe der Oozysten-infizierten Tiere (n=36) bei 4 Puten keine T. gondii-DNA nachgewiesen werden. Eine mögliche Erklärung für die negativen Ergebnisse könnte die geringe Anzahl an Zysten im Gewebe sein. Schätzungen zufolge ist in 100 g Fleisch mit lediglich einer Gewebezyste zu rechnen (HILL und DUBEY 2002). Neben der geringen Zystendichte könnten eine inhomogene Verteilung der Zysten und die für die PCR Analyse eingesetzte sehr geringe Probenmenge zu falsch-negativen Ergebnissen geführt haben. Vor diesem Hintergrund sind die vorliegenden Zahlen T. gondii - positiver Puten und Gewebeproben als Minimalwerte zu betrachten und es kann von einer tatsächlich höheren Anzahl infizierter Organe ausgegangen werden. In der Literatur finden sich nur wenige Untersuchungsergebnisse zur T. gondii-Zystenbildung und verteilung bei der Pute. Eine Auswertung und der direkte Vergleich der bisherigen Erkenntnisse mit den vorliegenden Ergebnissen werden durch die unterschiedlichen Studienbedingungen (Anzahl untersuchter Tiere, Untersuchungsmethode, Infektionsmedium etc.) erschwert. Häufig wurden für den Nachweis parasitärer Stadien die Organproben nicht einzeln sondern in gepoolter Form mittels Bioassay untersucht (DROHBECK et al. 1953, SIMITCH et al. 1965, DUBEY et al. 1993a, LITERÁK und HEJLÌCEK 1993). Zudem wurde nur eine geringe Auswahl von Organen beprobt. Hingegen wurden in der eigenen Studie erstmals viele verschiedene Organe und Gewebe (n=14) einzeln auf T. gondii-DNA getestet, um nähere Erkenntnisse zur Verteilung der Zysten zu gewinnen und potentielle Zielorgane zu erfassen. 39 Übergreifende Diskussion Bei der Betrachtung der Untersuchungsergebnisse aller Studiengruppen, fiel auf, dass jedes Organ mindestens einmal positiv getestet wurde. Zudem konnten deutliche Schwankungen in der Befallshäufigkeit der Organe sowohl zwischen den Tieren verschiedener Infektionsgruppen als auch innerhalb einer Infektionsgruppe festgestellt werden. So variierte die Anzahl positiv getesteter Organe bei den Tachyzoiten-infizierten Puten zwischen 0 und 7, bei den Oozysten-infizierten Puten zwischen 0 und 9 Organe pro Tier. Um den Einfluss der Infektionsdosis auf die Ausbildung von Gewebestadien im Organismus der Pute zu untersuchen, wurden bei den Studiengruppen unterschiedlich hohe Infektionsdosen von Tachyzoiten oder Oozysten appliziert. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Anzahl T. gondii-positiver Puten oder positiver Organproben pro Tier festgestellt werden. Allerdings konnte ein Zusammenhang zwischen der applizierten Dosis von Oozysten und der Befallshäufigkeit des Gehirns beobachtet werden, da mit ansteigender Infektionsdosis die Anzahl positiver Proben signifikant zunahm (p= 0,012). Vorangegangene Studien konnten eine Persistenz infektiöser T. gondii-Zysten bei der Pute bis zu 9 Wochen p.i. nachweisen (DROHBECK et al. 1953, DUBEY et al 1993a). In der eigenen Studie gelang der T. gondi-Nachweis bis 12 Wochen p.i.. Der späte Untersuchungszeitpunkt (12 Wo. p.i.) wurde als Annäherung an die Mastdauer der konventionellen Mastputenhaltung gewählt. Bei dem Vergleich der beiden Untersuchungszeitpunkte "früh" (6 bis 8 Wo. p.i.) und "spät" (10 bis 12 Wo. p.i.) konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Anzahl positiver Puten oder Organe beobachtet werden. Lediglich die Befallshäufigkeit des Brustmuskels nach der Infektion mit Oozysten war signifikant höher zum frühen Untersuchungszeitpunkt mit 3 positiven von 13 Proben während zum späten Untersuchungszeitpunkt bei keiner Brustmuskelprobe T. gondii-DNA nachgewiesen werden konnte. Inwieweit die unterschiedliche Befallshäufigkeit des Brustmuskels tatsächlich im Zusammenhang mit dem Untersuchungszeitpunkt steht, ist zweifelhaft. Durchaus wahrscheinlicher ist dieses Ergebnis auf die bereits erwähnten limitierenden Faktoren der Untersuchungsmethode zurückzuführen. Durch die zu Beginn der Studie mitgeführten lichtmikroskopischen Untersuchungen nativer Quetschpräparate konnte in insgesamt 3 Organen (2x Muskulatur und Leber), welche auch in der PCR als T. gondii–positiv befundet wurden, das Vorhandensein von Zysten nachgewiesen werden. Da die Nachweisrate von Zysten sich jedoch generell als sehr gering erwies, wurde aufgrund des 40 Übergreifende Diskussion hohen Arbeitsaufwandes das lichtmikroskopische Screening in den darauffolgenden Teilexperimenten nicht weiter durchgeführt. Bei der vergleichenden Betrachtung der Ergebnisse aus der Gruppe der Tachyzoiten-infizierten Tiere mit denen aus der Gruppe der Oozysten-infizierten Tiere waren keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Gesamtanzahl positiver Organe oder der Summe befallener essbarer Organe festzustellen. Allerdings waren einzelne Organe, Brustmuskel und Leber, signifikant häufiger positiv nach der Infektion mit Tachyzoiten als nach der Oozysteninfektion. Hingegen wurde nach der Oozysteninfektion signifikant häufiger T. gondii-DNA im Gehirn nachgewiesen als nach der Tachyzoiteninfektion. Interessanterweise konnten DUBEY et al. (1993a) bei der Einzelorganuntersuchung nach einer Oozysteninfektion weder in der Leber noch im Gehirn Zysten nachweisen. Dies könnte jedoch durch die geringe Anzahl an untersuchten Proben (n=5 je Organ) begründet sein. Anhand der vorliegenden Studie wird deutlich, dass T. gondii im gesamten Organismus der Pute streut. Weder ein bestimmtes Verteilungsmuster noch ein definiertes Zielorgan waren erkennbar. Allerdings zeigte sich, dass Muskelgewebe und andere essbare Organe zu den wesentlichen Zielorganen zählen, ungeachtet des applizierten Infektionsmediums. Während nach der Tachyzoiteninfektion am häufigsten Leber (43,3%), gefolgt von Brustmuskel (26,7%) und Herz (20,0%) infiziert waren, konnte bei den Oozysten-infizierten Tieren der Erreger, abgesehen vom Gehirn (47,2%), am häufigsten in der Oberschenkelmuskulatur (25,0%), gefolgt von Herz und Unterschenkelmuskulatur (je 22, 2%) nachgewiesen werden. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene und des Verbraucherschutzes bedeutet dies, dass im Fall einer T. gondii–Infektion regelmäßig essbare Organe betroffen sind und ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann. Die für Deutschland ermittelte T. gondiiSeroprävalenz von 18,4% bei Mastputen (KOETHE et al. 2011) deutet auf eine relativ weite Verbreitung des Erregers hin. Seroprävalenzen für deutsche Puten aus ökologischer Haltung sind bisher nicht veröffentlicht. Es ist zu vermuten, dass bei Tieren aus der Freilandhaltung aufgrund des erhöhten Expositionsrisikos eine ebenso hohe, oder sogar eine höhere Prävalenz vorliegt, wie dies bereits für Hühner beschrieben ist (DUBEY 2010). Da eine klinische Symptomatik eher selten auftritt, gelangen T. gondii–positive Puten unerkannt in die Lebensmittelkette und zum Verbraucher. Eine kürzlich veröffentlichte Studie von POTT et al. (2012) konnte belegen, das Zysten in Putenrohwürsten bis 24 Stunden nach der Herstellung infektiös waren. Diese Autoren 41 Übergreifende Diskussion weisen darauf hin, dass bestimmte Rohwurstsorten bereits nach sehr kurzer Reifezeit in den Handel kommen und innerhalb von 12 bis 24 Stunden nach der Herstellung verzehrt werden können. Bei küchenhygienischen Mängeln in der Zubereitung von Putenfleisch, oder wenn Fleischerzeugnisse, wie zum Beispiel Rohwürste, keinem adäquatem Verfahren zur Abtötung des Erregers unterzogen werden, kann es somit zu einer zoonotischen Übertragung kommen. In den eigenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Infektionsdosis, der Untersuchungszeitpunkt oder das Infektionsmedium (Tachyzoiten oder Oozysten) als variable Parameter insgesamt keinen entscheidenden Einfluss auf die Gesamtanzahl T. gondii–positiver Proben pro Tier oder auf die Verteilung im Schlachtkörper nehmen. Die beobachteten signifikanten Unterschiede beziehen sich lediglich auf einzelne Organe. Allerdings ist es vorstellbar, dass bei Verfügbarkeit einer sensitiveren Methode wie z.B. der sequence capture-PCR, oder einer deutlich größeren Stichprobe solche Unterschiede in den Hintergrund treten würden. Für die eigene Untersuchung waren die Möglichkeiten sowohl hinsichtlich Methode als auch Stichprobenumfang begrenzt, so dass diese Frage derzeit offen bleiben muss. Bezüglich des Infektionsmediums repräsentiert die Oozysteninfektion den natürlichen Infektionsweg. Allerdings sind Oozysteninfektionen nicht immer verlässlich reproduzierbar, da Oozystensuspensionen üblicherweise vor der Anwendung gelagert werden und das Alter der Oozysten die Exzystierung im Intestinaltrakt beeinflussen kann (SINSKI und BEHNKE 2004). Zudem erfordert die Gewinnung von Oozysten einen Tierversuch an Katzen, wie schon eingangs erwähnt wurde. Da die Bildung und Verteilung von Gewebestadien im Organismus der Pute vom Infektionsmedium weitgehend unabhängig ist, ist ein Infektionsmodell basierend auf der artifiziellen parenteralen Applikation von Tachyzoiten der Oozysteninfektion vorzuziehen. Der Einsatz der herkömmlichen PCR-Methode hat sich für die Untersuchung großvolumiger Organproben als ungünstig erwiesen. Um dennoch keine Katzen- oder Mäusebioassays in Anspruch nehmen zu müssen, wäre für zukünftige Untersuchungen zum Zystennachweis in den Organen der Pute die magnetic capture-based PCR zu empfehlen, die den Nachweis von Toxoplasmen in Fleischproben von bis zu 100 g ermöglicht (OPSTEEGH et al. 2010). 4.2 Schlussfolgerungen und Ausblick Mit den vorgestellten konnte gezeigt werden, dass bei der Pute eine T. gondii-Empfänglichkeit besteht und artifizieller Infektionen zum Befall diverser Gewebe mit dem Erreger führen. Die für 42 Übergreifende Diskussion die experimentellen Infektionen gewählten Parasitenstadien, Tachyzoiten und Oozysten, erwiesen sich als gleichermaßen geeignete Infektionsmedien und führten hinsichtlich der Verteilung des Erregers im Körper der Pute zu vergleichbaren Ergebnissen. Da Tachyzoiten keine zusätzlichen Tierversuche erfordern und sich wenig zeitaufwendig in der Zellkultur vermehren lassen, ist bei zukünftigen Versuchen mit dem vorgestellten Infektionsmodell die parenterale Applikation von Tachyzoiten einer Oozysteninfektion, für die infizierte Zwischenwirte an Katzen verfüttert werden müssten, vorzuziehen. Mit Hilfe der konventionellen PCR und anschließender nested PCR konnte nachgewiesen werden, dass T. gondii sich heterogen im gesamten Organismus verteilt und bis zu 12 Wochen p.i. persistieren kann. Neben der Heterogenität konnte mit 0-9 betroffenen Geweben pro Tier eine hohe individuelle Variabilität bezüglich der Anzahl positiv getesteter Organe beobachtet werden. Allerdings kann dieses Ergebnis durch die inhomogene Verteilung der Zysten und einer geringen Zystendichte im untersuchten Gewebe zustande gekommen sein. Darüber hinaus erwies sich der Einsatz einer konventionellen PCR für die Untersuchung großvolumiger Organproben, wie zum Beispiel des Brustmuskels als nicht ideal, da nur eine geringe Probenmenge dem Verfahren zugefügt werden kann. Bei weiterführenden Untersuchungen zur Zystenverteilung bei der Pute könnte daher die, zum Zeitpunkt der Studie nicht verfügbare, magnetic capture-based PCR eine gute Alternative darstellen. Es konnte kein spezifischer Organtropismus des Erregers festgestellt werden. Es fiel aber auf, dass T. gondii nach experimentellen Infektionen regelmäßig im Muskelgewebe und in anderen essbaren Organen auftritt. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene und des Verbraucherschutzes bedeutet dies, dass im Fall einer T. gondii-Infektion ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann. Zukünftig sollte geklärt werden, ob es sich bei den nachgewiesenen Parasiten um infektionstüchtige Erreger handelt und welchen Einfluss die jeweiligen Verfahren zur Herstellung der Putenfleischprodukte auf den Parasiten besitzen und ob sie zu einer Abtötung des Erregers führen. Somit könnte das Verbraucherrisiko bestimmt werden. Des Weiteren wäre zu klären, welche Auswirkungen eine Infektion mit T. gondii-Zysten, die neben den Oozysten eine weitere natürliche Infektionsquelle darstellen können, bei der Pute hervorruft 43 Übergreifende Diskussion und inwieweit Unterschiede hinsichtlich der Tachyzoiteninfektion bestehen. 44 Zystenverteilung im Vergleich zur Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Birte Zöller Untersuchungen zur Verteilung von Toxoplasma gondii-Stadien in Geweben bei Puten nach experimenteller Infektion Institut für Parasitologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im Dezember 2014 48 Seiten, 2 Tabellen, 164 Literaturangaben (ohne eigene Publikationen) Schlüsselwörter: Toxoplasma gondii, Pute, Infektionsmodell, Gewebetropismus Einleitung: Toxoplasma (T.) gondii zählt zu den häufigsten intrazellulären Parasiten weltweit. Alleinige Endwirte im fakultativ heteroxenen Lebenszyklus sind die Feliden. Als Zwischenwirte können jedoch zahlreiche Säugetier- und Vogelarten dienen, in denen sich parasitäre Gewebezysten entwickeln. Einer der Hauptübertragungswege auf den Menschen stellt der Verzehr von T. gondiihaltigem Fleisch infizierter Nutztiere dar. Inwieweit Putenfleisch ein potentielles Infektionsrisiko birgt und welche Bedeutung Puten in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose besitzen ist nicht ausreichend geklärt. Ziel der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein reproduzierbares Infektionsmodell bei Puten für T. gondii zu entwickeln, um die Verteilung und Persistenz des Parasiten im Gewebe zu ermitteln. Es wurden verschiedene Parameter, wie Infektionsstadium, Infektionsdosis, Applikationsmodus und Untersuchungszeitpunkt hinsichtlich ihres Einflusses auf die Entwicklung parasitärer Gewebestadien verglichen. Material und Methoden: Insgesamt wurden 74 Puten nach einer Aufzuchtperiode von 4 bis 8 Wochen experimentell mit T. gondii-Tachyzoiten oder Oozysten infiziert. Je nach Versuchsgruppe wurden Tachyzoiten vom Stamm ME49 intravenös und/oder intramuskulär appliziert oder Oozysten vom Stamm ME49, DX oder Hannover 1 oral verabreicht. Die Verifikation der Infektion erfolgte über den Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper mit Hilfe eines kinetischen ELISA. Drei bis acht Puten jeder Versuchsgruppe wurden 6 bis 8 oder 10 bis 12 Wochen nach der Infektion getötet. Von jedem Tier wurden folgende Gewebeproben entnommen: Brust-, Oberschenkel- und Unterschenkelmuskulatur, Herz, Leber, Muskel- und Drüsenmagen, Gehirn, Lunge, Milz, Nieren, 45 Zusammenfassung Darm, Pankreas und Hoden (sofern vorhanden). Die Organe wurden getrennt vollständig homogenisiert. Bei den Muskeln wurden Proben von verschiedenen Lokalisationen entnommen und ebenfalls einzeln homogenisiert. Der Nachweis von T. gondii-DNA in den Gewebeproben erfolgte mittels konventioneller PCR, basierend auf der Amplifizierung eines 469 bp Fragments des B1Gens, und anschließender nested PCR (Länge Zielfragment: 375 bp). Zusätzlich wurden zu Beginn der Studie lichtmikroskopische Untersuchungen einzelner Organe in Form nativer Quetschpräparate (400fache Vergrößerung) auf T. gondii-Zysten durchgeführt. Ergebnisse: Ungeachtet der Infektionsdosis und des inokulierten Parasitenstadiums konnten bei keinem der Versuchstiere klinische Symptome einer Toxoplasmose beobachtet werden. Die unterschiedlich hohen Infektionsdosen hatten im Allgemeinen keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl positiv getesteter Puten oder Organproben. Lediglich die Anzahl positiver Gehirnproben nahm mit ansteigender Oozystendosis signifikant zu. Bei der Betrachtung aller Versuchsgruppen fiel auf, dass die Befallshäufigkeit der Organe sowohl zwischen den Tieren verschiedener Infektionsgruppen als auch innerhalb einer Infektionsgruppe stark schwankte. So variierte die Anzahl positiv getesteter Organe bei den Tachyzoiten-infizierten Puten zwischen 0 und 7, bei den Oozysten-infizierten Puten zwischen 0 und 9 Organen pro Tier. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass sich T. gondii heterogen in der Pute verteilt und mindestens 12 Wochen persistieren kann. Bezogen auf alle Versuchstiere gab es kein Organ, dass durchgängig negativ blieb. Nach der Tachyzoiteninfektion waren am häufigsten Leber (43,3%), gefolgt von Brustmuskel (26,7%) und Herz (20,0%) infiziert, während bei den Oozysten-infizierten Tieren der Erreger am häufigsten im Gehirn (47,2%), gefolgt von Oberschenkelmuskulatur (25,0%) und Herz und Unterschenkelmuskulatur (je 22,2%) nachgewiesen werden konnte. Schlussfolgerungen: Tachyzoiten und Oozysten erwiesen sich als gleichermaßen geeignete Infektionsmedien und führten hinsichtlich der systemischen Verteilung des Parasiten in der Pute zu vergleichbaren Ergebnissen. Ein spezifischer Organtropismus des Erregers konnte nicht festgestellt werden. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene und des Verbraucherschutzes bedeuten die Ergebnisse, dass im Fall einer T. gondii-Infektion ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann. 46 Summary 6 Summary Birte Zöller Studies on the dissemination of Toxoplasma gondii-stages in tissues of turkeys after experimental infection Institute of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig Submitted in December 2014 48 pages, 2 tables, 164 references (without own publications) Keywords: Toxoplasma gondii, turkey, infection model, tissue tropism Introduction: Toxoplasma (T.) gondii is one of the most prevalent intracellular parasites worldwide. Felidae are the only definitive hosts in the facultatively heteroxenous life cycle. However, numerous mammal and bird species can act as intermediate hosts, in which parasitic tissue cysts will develop. One of the main transmission routes for human beings is the consumption of T. gondii-containing meat of infected livestock. The extent to which turkey meat involves a potential risk of infection and the relevance of turkeys in the epidemiology of human toxoplasmosis has not been clarified sufficiently. Objective of the investigations: The aim of the present work was to develop a reproducible T. gondii-infection model for turkeys to determine the dissemination and persistence of the parasite in tissues. Different parameters as infectious stage, dose of infection, mode of application and time point of examination were compared with regard to their influence on the development of parasitic tissue cysts. Material and methods: A total of 74 turkeys were experimentally infected after a rearing period of 4 to 8 weeks with T. gondii tachyzoites or oocysts. Depending on the test group tachyzoites of the ME49 strain were applied intravenously and/or intramuscularly or oocysts of the strain ME49, DX or Hannover I were inoculated orally. The verification of the infection was effected by the means of the detection of T. gondii-specific antibodies by a kinetic ELISA. Three to eight turkeys of each test group were killed 6 to 8 or 10 to 12 weeks after the infection. Of each animal the following tissue samples were taken: breast muscle, thigh muscle, drumstick muscle, heart, liver, gizzard, proventriculus, brain, lung, spleen, kidneys, intestine, pancreas and testicles (if present). The organs 47 Summary in total were homogenized separately. Samples of muscles were taken from different locations and homogenized separately likewise. T. gondii-DNA detection in tissue samples was conducted by using a conventional PCR, based on the amplifying a 469 bp fragment of the B1 gene, followed up by a nested PCR (length target fragment: 375 bp). Additionally light microscopy examinations for T. gondii cysts were performed on single organs in form of native squash preparations (400 fold magnification) at the beginning of the study. Results: No clinical symptoms of toxoplasmosis were observed in any bird irrespective of the infectious dose and the inoculated parasite stage. In general the different infectious doses had no significant influence on the number of turkey tested positive or organ samples. Only the number of positive brain samples increased significantly with an ascending dose of oocysts. Considering all test groups it was apparent that the frequency of affected organs varied strongly between animals of different test groups as well as within one test group. Thus the number of organs tested positive for turkeys infected with tachyzoites ranged between 0 and 7 organs, for turkeys infected with oocysts between 0 and 9 organs per animal. The study results demonstrate that T. gondii disseminates heterogeneously in the turkey and may persist for at least 12 weeks. With reference to all study animals there was no organ, which was consistently negative. After the tachyzoite infection, the liver was the most frequent infested organ (43,3%), followed by the breast muscle (26,7%) and the heart (20,0%), whereas of the oocyst infected animals the pathogen was detected most frequently in the brain (47,2%), followed by the thigh muscle (25,0%) and the heart and drumstick muscle (22.2% each). Conclusions: Tachyzoites and oocysts turned out to be similarly suitable infectious mediums and resulted in comparable findings concerning the systemic distribution of the parasite in the turkey. A specific organotropism could not be determined. Concerning food safety and consumer protection the results indicate that a potential risk of a human infection through infected turkey meat cannot be ruled out. 48 Literaturverzeichnis 7 Literaturverzeichnis Aspinall TV, Damain M, Hyde JE, Sims PF. Prevalence of Toxoplasma gondii in commercial meat products as monitored by polymerase chain reaction - food for thought? Int J Parasitol 2002;32:1193-9. Bahia-Oliviera LM, Jones JL, Azevedo-Silva J, Alves CC, Oréfice F, Addiss DG. Highly endemic, waterborne toxoplasmosis in north Rio de Janeiro state, Brazil. Emerg Infect Dis. 2003;9:55-62. Bangoura B, Zöller B, Daugschies A. Vorkommen und Bedeutung der aviären Toxoplasma gondiiInfektionen in Europa. Berl Münch Tierärztl Wochenschr. 2011;124:485-96. Barcán LA, Dallurzo ML, Clara LO; Valledor A, Macías S, Zorkin E, Gerona S, Livellara B. Toxoplasma gondii pneumonia in liver transplantation: survival after a severe case of reactivation. Transpl Infect Dis. 2002;4:93-6. 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Ganz besonders möchte ich mich bei Fr. Dr. Berit Bangoura bedanken für ihre immer gewährte Unterstützung, ihre Geduld und die schönen und lustigen Momente. Weiterhin bedanke ich mich bei allen Kollegen des Instituts für Parasitologie für die gute Zusammenarbeit. Nicht zuletzt danke ich all meinen Freunden, insbesondere Annika und Anne, von Herzen für den Beistand während dieser Zeit, was sicherlich nicht immer einfach war. 62
