molecular targeting of carbonic anhydrase ix using human

Diss. ETH N° 18288
MOLECULAR TARGETING OF CARBONIC ANHYDRASE IX
USING HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES AND
SMALL ORGANIC LIGANDS
A dissertation submitted to
ETH ZURICH
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
JULIA KATHARINA JOHANNA AHLSKOG
Dipl. Biotech., Ecole Supérieure de Biotechnologie Strasbourg
born on February 27, 1979
citizen of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Dario Neri, examiner
Prof. Dr. Cornelia Halin Winter, co-examiner
2009
1. SUMMARY
A major feature of solid tumors is hypoxia, the decreased availability of oxygen, which
increases patient treatment resistance and favors tumor progression. Hypoxic conditions
trigger a molecular response via the hypoxia-inducible factor. Among the target genes of
this key transcription factor are carbonic anhydrases IX and XII, two transmembrane
proteins frequently upregulated in solid tumors. Due to their role in pH regulation, they
confer a survival advantage to tumor cells within an acidic and hypoxic tumor
environment.
This thesis describes the generation of high-affinity human monoclonal antibodies
specific to CA IX. These antibodies were able to stain CA IX ex vivo and to target the
cognate antigen in vivo. After intravenous administration of the antibodies their staining
pattern was compared to the one of a chemical marker of hypoxia (pimonidazole) by
multi-fluorescence analyis. While there was a perfect overlap for both agents in the
colorectal adencarcinoma model LS174T, a complementary pattern of targeted tumor
regions could be observed in the second model SW1222. Moreover, not all CA IX
positive areas were reachable in this tumor model.
The results support the hypothesis of a dynamic blood flow within tumors that may vary
over time, thereby controlling the accessibility of certain tumor regions.
The new human anti-CA IX antibodies are expected to be non-immunogenic and may
serve as broadly applicable reagents for the non-invasive imaging of hypoxia and for
pharmacodelivery applications.
The second part of the thesis describes the synthesis and characterization of two
acetazolamide derivatives, which contain either a charged fluorophore or an albuminbinding moiety. The fluorescent acetazolamide was shown to preferentially target tumors
in vivo. The rationale for the synthesis of the albumin-binding acetazolamide was to
prevent cellular internalization through the engagement of serum albumin thereby
restricting the scope of the inhibitor to membrane-associated carbonic anhydrases. The
ability of the bifunctional compound to cause tumor growth retardation was assessed in
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two xenograft models of cancer (LS174T and SK-RC-52) alone and in combination with
chemotherapeutic drugs (5-fluorouracil and sunitinib).
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2. ZUSAMMENFASSUNG
Solide Tumoren zeichnen sich häufig durch einen erheblichen Sauerstoffmangel im
Gewebe aus. Dieses Phänomen ist in der Literatur als Hypoxie beschrieben. Hypoxie
kann die Grundlage für das Nichtansprechen auf bestimmte Krebstherapien sein.
Desweiteren ist bekannt, dass Hypoxie das Fortschreiten einer Krebserkrankung fördern
kann.
Der durch Sauerstoffmangel aktiv gewordene Transkriptionsfaktor “hypoxia-inducible
factor” induziert die Transkription von Genen, welche die Tumorzellen an die veränderte
Umgebung anpassen. Dazu zählen auch die Gene der carbonischen Anhydrasen (CA) IX
und XII. Ihre Überexpression in zahlreichen Krebsarten ist bekannt. Aufgrund ihrer pHregulierenden Rolle erhalten die Tumorzellen einen Selektionsvorteil in dem sauren und
hypoxischen Tumormilieu.
Diese Doktorarbeit beschreibt die Generierung von CA IX-spezifischen hoch-affinen
menschlichen monoklonalen Antikörpern. Diese ermöglichten die Immunfärbung von
CA IX ex vivo, sowie das gezielte Erreichen des Tumormarkers („targeting”) in vivo.
Mittels Multi-Fluoreszenz Analyse wurde die Immunfärbung nach der intravenösen
Verabreichung
der
Antikörper
mit
derer
eines
chemischen
Hypoxiemarkers
(Pimonidazol) verglichen.
Während die Färbung für die beiden Agenzien im kolorektalen Adenokarzimom Modell
LS174T überlappte, konnte eine eher komplementäres Färbungsmuster in einem weiteren
Modell, SW1222, beobachtet werden. Ferner wurden nicht alle CA IX positiven
Regionen dieses Tumors durch die intravenös verabreichten Antikörper erreicht.
Diese Resultate untermauern die Hypothese eines dynamischen Blutflusses innerhalb von
Tumoren, welcher im Verlaufe der Zeit grossen Änderungen unterliegen kann. Dieser
wiederum hat eine direkte Auswirkung auf die Erreichbarkeit einiger Tumorregionen
durch den Blutstrom.
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Es wird erwartet, dass die neuen Antikörper nicht immunogen sind und dass sie eine
breite Anwendung im nicht-invasiven „imaging“ von Hypoxie finden werden oder als
Vehikel für Pharmazeutika in der gezielten Krebstherapie dienen werden.
Der zweite Teil dieser Doktorarbeit beschreibt die Synthese und Charakterisierung zweier
Acetazolamidderivate, welche entweder ein geladenes Fluorophor oder eine Albuminbindende Einheit beinhalten. In vivo zeigte das fluoreszierende Acetazolamid eine
präferentielle Akkumulation in Tumoren.
Durch seine Bindung an Albumin, liegt der Vorteil des zweiten Acetazolamidderivats in
der verminderten Zellinternalisierung. Hierdurch beschränkt sich die Bindung des
Inhibitors hauptsächlich auf membran-assoziierte carbonische Anhydrasen. Die
Auswirkungen des Albumin-bindenden Acetazolamidderivats auf das Tumorwachstum
wurde in zwei Tumormodellen (LS174T und SK-RC-52), u.a. in Kombination mit den
beiden Chemotherapeutika 5-Fluoruracil und Sunitinib getestet.
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