Änderung der Zahl im Blut zirkulierender tumorverdächtiger Zellen

Änderung der Zahl im Blut zirkulierender tumorverdächtiger Zellen und
Korrelation zum rezidivfreien Überleben unter adjuvanter Therapie beim
Mammakarzinom
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von Frank Fröhlich
geboren am 27. Juli 1968 in Burgstädt
Gutachter:
1. Prof. Dr. med. K. Pachmann (Jena)
2. Prof. Dr. med. I. Runnebaum (Jena)
3. Prof. Dr. med. A. Schneider (Berlin)
Tag der öffentlichen Verteidigung: 05. September 2006
1
Verzeichnis der Abkürzungen
Abb.
Abbildung
bzw.
beziehungsweise
ca
circa
CMF
Cyclophosphamid/Methotrexat/Fluorouracil
DRK
Deutsche Rotes Kreuz
EC
Epirubicin/Cyclophosphamid
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EpCAM
Epitheliales Zelladhäsionsmolekül
Er
Östrogenrezeptor
ET
Epirubicin/Cyclophosphamid
FEC
Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamid
G
Grading
Gy
Gray
H1 H2
Histaminrezeptor 1 und 2
ID
Identifikationsnummer der Patientin
IG
Irinotecan/Gemcitabine
iv.
intravenös
LSC
Laser-Scanning-Cytometer
m2
Quadratmeter
Max
Maximum
MBC
Metastasierter Brustkrebs
MET
Metastase
mg
Milligramm
min
Minute
Min
Minimum
ml
Milliliter
MT1
Basiszellzahlanalyse
MT2
erste Folgeanalyse
MT3
zweite Folgeanalyse
N
Anzahl
2
NMBC
Nichtmetastasierter Brustkrebs
Pat.
Patientin
Pr
Progesteronrezeptor
sc
Subcutan
T
Therapie
Tab.
Tabelle
TNM
Tumor, Nodes and Metastases
TZB
Transfusionsmedizinisches Zentrum Bayreuth
X, X-Ray
Bestrahlung
ZTZ
Zirkulierende tumorverdächtige Zellen
ZZA
Zellzahlanalyse
3
Inhaltsverzeichnis
Seite
1.
Zusammenfassung
6
2.
Einführung
8
3.
Fragestellung der Arbeit
11
4.
Material und Methoden
12
4.1.
Patientenauswahl und Anzahl der Zellzahlanalysen
12
4.2.
Anreicherung der tumorverdächtigen Zellen
14
4.3.
Nachweis der der tumorverdächtigen Zellen
14
4.4.
Angewandte Therapieschemata
15
4.5.
Rezidivfreie Zeit und rezidivfreies Überleben
18
5.
Auswertung
19
5.1.
Demografische Daten
19
5.2.
Basiszellzahlanalyse
21
5.2.1. Basiszellzahlanalyse, Rezidivfreie Zeit
und Gesamtüberleben
23
5.3.
Erste Folgeuntersuchung
25
5.4.
Zweite Folgeuntersuchung
29
5.5.
Weitere Zellzahlanalysen
33
4
6.
Diskussion
39
6.1.
Zellzahlanalyse und Demografie
39
6.2.
Basiszellzahlanalyse
41
6.3.
Erste Folgeuntersuchung
43
6.4.
Zweite Folgeuntersuchung
46
6.5.
Diskussion weitere Zellzahlanalysen
51
7.
Schlussfolgerung
52
8.
Literatur- und Quellenverzeichnis
53
9.
Anhang
65
9.1.
Bild einer fluoreszierenden Zelle
65
9.2.
Befundbogen des TZB
66
9.3.
Danksagung
67
9.4.
Lebenslauf
68
9.5.
Ehrenwörtliche Erklärung
69
5
1.Zusammenfassung
Brustkrebs ist auch heute die häufigste Krebserkrankung der Frau. Zum Zeitpunkt der Erstdiagnose zeigen die meisten Patientinnen keinen Hinweis auf eine Metastasierung und doch
rezidivieren oder metastasieren innerhalb der ersten fünf Jahre 50 Prozent der Fälle (Taubert
et al., 2004). Als limitierender Faktor wird die hämatogene Streuung von Tumor-zellen gesehen (Chambers et al., 2000). Dass Tumorzellen zirkulieren ist lange bekannt (Ashworth,
1869). Die Veränderungen der Zellzahlen unter Therapie hingegen sind bisher wenig untersucht.
Diese Arbeit untersucht die Änderungen der Zahl zirkulierender tumorverdächtiger Zellen im
periphervenösen Blut unter adjuvanter Therapie und die Beziehung zur rezidivfreien Zeit.
Aus einem Patientenpool von 86 Patienten wurden 29 Frauen des DRK Krankenhauses
Chemnitz – Rabenstein prospektiv untersucht. Bei diesen Patientinnen wurden zwischen 1999
und 2004 Zellzahlanalysen unter adjuvanter Therapie durchgeführt. Ausgangspunkt war die
perioperativ erhobene Basiszellzahl. Es schlossen sich die erste Folgeuntersuchung im Mittel
am 106. postoperativen Tag nach Abschluss der ersten Zyklen Chemotherapie und die zweite
Folgeuntersuchung im Mittel am 284. postoperativen Tag unter Fortführung der adjuvanten
Therapieschemata an. Weitere Zellzahlanalysen folgten nach den individuellen Gegebenheiten. Zur Basiszellzahlanalyse (n = 29) wurden bei allen Patientinnen ZTZ nachgewiesen. Die
Höhe der Zellzahl korrelierte nicht mit dem rezidivfreien Überleben. Unter adjuvanter Therapie sanken bei den meisten Patientinnen die Zellzahlen, bei 20 Prozent waren keine ZTZ mehr
nachweisbar. Weder die Höhe der Zellzahl bei der ersten Folgeuntersuchung (n = 20) noch
die Änderung korrelierten mit dem rezidivfreien Überleben. Der negative Zell-Nachweis hatte
keinen prognostischen Vorteil, im Gegenteil, zwei dieser Patientinnen entwickelten im weiteren Verlauf Metastasen. Die Ergebnisse der zweiten Folgeuntersuchung (n = 11) zeigten bei
vier Patientinnen einen Wiederanstieg der Zellzahlen, bezogen auf die erste Folgeuntersuchung. Drei der Frauen metastasierten. Bei zwei Patientinnen erfolgte der Anstieg unter Taxol, bei einer Patientin unter CMF. Ob dieser Tatsache eine Taxolresistenz zugrunde liegt
oder eine tumorbiologische Eigenschaft (Doebroessy, 1968) ist bisher nicht klar. Die weiteren
Zellzahlanalysen brachten keine Vorteile hinsichtlich der Bewertung der Länge des rezidivfreien Überlebens. Im Gegensatz zu Berichten bei metastasierten Mammakarzinomen
(Christofanilli et al., 2004) konnte für die Nicht-metastasierten kein Zusammenhang zwischen
der Höhe der Zellzahl und dem rezidivfreien Überleben festgestellt werden. Dem Wiederan-
6
stieg der Zellzahl nach erfolgter Therapie könnte jedoch eine prognostische Bedeutung zukommen, wenn prospektive Studien zeigen, dass die hier an Einzelfällen beschriebenen Effekte statistisch belegbar sind.
In der hier vorgetellten Arbeit konnte gezeigt werden, dass die verwendete Methode sehr gut
geeignet ist, die Änderung der Zahl zirkulierender tumorverdächtiger Zellen im peripheren
Blut durch die Therapie zu überwachen und dass ein Anstieg unter der Therapie ein Hinweis
auf ein drohendes Rezidiv ist.
7
2. Einführung
Brustkrebs ist nach wie vor mit etwa 45.000 Neuerkrankungen im Jahr die häufigste Krebserkrankung bei Frauen und mit 18.000 Todesfällen die häufigste Krebstodesursache in der
weiblichen Bevölkerung in Deutschland (Becker, 2001), ebenso in England und Wales mit
36000 Neuerkrankungen pro Jahr (Earl and Iddawela, 2004). Weltweit sterben 300000 Frauen
jährlich (Chambers et al., 2000). Zum Zeitpunkt der Erstdiagnose zeigt die Mehrzahl der Patientinnen in den Routineuntersuchungen (klinisch, radiologisch und laborchemisch) keinen
Hinweis auf Metastasen. Allerdings treten innerhalb von fünf Jahren nach Tumorresektion in
50 Prozent der Fälle, die als M0 eingestuft wurden, Metastasen auf (Kvalheim 1996, Bauer et
al. 2002, Bischoff et al. 2003, Taubert et al., 2004). Außerdem ist das Mammakarzinom eine
Tumorform, die sehr frühzeitig neoplastische Zellen in den Kreislauf einschwemmt ( Eaton et
al. 1997, Hildebrandt et al. 1997, Naume et al. 1997, Brandt et al.1998, Racila et al. 1998,
Beitsch and Clifford 2000)
Neben der Operation wurde die adjuvante Therapie mit dem Ziel eingeführt, vermutete Tumorreste und oder Mikrometastasen in heilender Absicht zu behandeln (Kahlert et al., 2003).
Die adjuvante Therapie ist heute wohl etabliert. Es ist unumstritten, dass die adjuvante Therapie die rezidivfreie Zeit verlängern kann (Lalle et al. 2000, Shimizu et al. 2002, Earl und Iddawela, 2004), aber es gibt derzeit keine Methode, den Benefit der systemischen adjuvanten
Therapie innerhalb der rezidivfreien Zeit nachzuweisen. (Loprinzi und Thome, 2001).
Der die Prognose bestimmende Faktor ist, darüber besteht Einigkeit in der Literatur, die hämatogene Streuung von Tumorzellen und die folgende Metastasenbildung (Glaves 1983,
Brandt et al. 1996, Engers und Gabbert 1998, Moss 1998, Bae et al. 2000, Braun and Pantel
2000, Chambers et al. 2000, Lalle et al. 2000, Terstappen et al. 2000, Zhong 2000, Pachmann
et al. 2001 b, Bischoff et al. 2003, Gaforio et al. 2003, Kubens et al. 2003, Pantel et al. 2003,
Taubert et al. 2004). Wenn der Brustkrebs metastasiert ist, ist er nicht mehr heilbar. (Christofanilli et al. 2005). Trotz der Verfügbarkeit von Hormon-, Chemo- und biologischer Therapie
bleibt die Behandlung palliativ ( Zielinski et al. 2005). Weniger als 10 Prozent dieser Patienten bleiben mehr als fünf Jahre progressionsfrei (Falkson et al. 1991, Greenberg et al.1996,
Conte et al. 2001). Deshalb muss es ein vordringliches Ziel sein, die Krankheit vor der Manifestation von Metastasen zu behandeln.
8
Die zirkulierenden Tumorzellen bilden die Verbindung zwischen Primärtumor und Metastasenbildung (Taubert et al., 2004).
Dass Tumorzellen im Blut zirkulieren können, ist seit langem bekannt. Bereits 1864 fanden
Sanders (1864) und Ashworth (1869) in Blutausstrichen von Tumorpatienten Tumorzellen.
Erstmalig wies Hannover 1862 Einbrüche maligner Tumoren in Blutgefäße nach. Weitere
Funde von Tumorzellen in Blutausstrichen durch Ashoff (1906), Schleip (1907) und Marcus
(1919) führten zur Bestätigung der Theorie der hämatogenen Fernmetastasierung. Quensel
(1921) unternahm erstmals den Versuch, Tumorzellen im Blut von Tumorträgern mit einem
Verfahren der Anreicherung zu studieren. Während Quensel nur das Blut verstorbener Patienten untersuchte, fahndeten Pool und Dunlop (1934) im Blut lebender Patienten nach Tumorzellen. (Magdon et al., 1966). Nicht nur die Tatsache an sich, dass Tumorzellen im Blut
zirkulieren, scheint von Bedeutung zu sein, sondern die Zellzahl kann sich offenbar mit oder
ohne Therapie ändern. So stellte Doebroessy (1968) in einer tierexperimentellen Arbeit fest,
dass Tumorzellen im Blut zirkulieren und dass sich deren Zahl unter Therapie und auch
spontan ändert. Dieses Phänomen wurde von ihm als „Secundary outflow“ beschrieben, allerdings nicht weiter erklärt. Während der erste Tumorzellnachweis im histologischen Präparat
erfolgte und zum Teil erst nach dem Ableben des Patienten möglich war, verwendet man
heute überwiegend spezifische Oberflächenmerkmale zum Auffinden zirkulierender Tumorzellen. Da für den Nachweis Epithelantigene verwendet werden, stellt sich die Frage, ob die
nachgewiesenen Zellen wirklich Tumorzellen sind.
Terstappen et al., (2000) , Fehm et al., (2002), Christofanilli et al., (2005) wiesen nach, dass
solche Zellen Zeichen der Malignität haben. Die biologische Bedeutung dieser Zellen wird
aber noch sehr kontrovers diskutiert. So konnten in tierexperimentellen Studien durch Injektion von zirkulierenden Tumorzellen sehr wohl Metastasen induziert werden (Pretlow et al.,
2000), andererseits entstehen nur aus einem geringen Anteil der disseminierten Tumorzellen
Metastasen (Chambers et al., 2000) und der zeitliche Zusammenhang zwischen Zelldisseminierung und Metastasenbildung kann noch nicht hergestellt werden.
Mit Hilfe der Laser Scanning Cytometrie (LCS®) gelingt heute die quantitative und qualitative Erfassung, auch geringster Mengen, tumorverdächtiger Zellen im Blut (Pachmann et al.,
2005). Jedoch wurde bisher noch nicht ausreichend untersucht, wie sich die Zellzahl unter
adjuvanter Therapie ändert und ob das Bedeutung für das rezidivfreie Überleben hat. Disseminierte Tumorzellen können nicht nur im Blut sondern auch im Knochenmark nachgewiesen
9
werden. Der Nachweis der Tumorzellen im Knochemmark wird mit einer ungünstigen Prognose verknüpft (Kvalheim, 1996) und fand 1997 optional Eingang in die TNM-Klassifikation.
Wie immer wird der Status dieses Parameters als unabhängiger Prognosefaktor kontrovers
diskutiert. So überblickten Funke und Schaut 1998 in ihrer Metaanalyse 112 Arbeiten zum
Tumorzellnachweis im Knochenmark. Sie werteten letztlich 20 prospektive Arbeiten mit 2494
Patienten aus und kamen zu dem Schluss, dass der eigentliche Beweis der unabhängigen
prognostischen Wertigkeit noch nicht erbracht sei (Funke I. and Schaut W., 1998). Diel hingegen sah bereits 1997 auf der Grundlage von 2000 ausgewerteten Knochenmarkproben beim
primären Mammakarzinom den Nachweis des unabhängigen Prognosefaktors als erbracht und
fand eine hochsignifikante Korrelation mit dem rezidivfreien und dem Gesamtüberleben (Diel
et al., 1997). Janni et al. (2000) bezeichneteten bei metastasierten Mammakarzinomen eine
erhöhte Zahl von Tumorzellen im Knochenmark ebenfalls als unabhängigen Prognosefaktor.
Gebauer et al. (2001) dagegen schreiben zum Operationszeitpunkt im Knochenmark aufgefundenen epithelialen Zellen nur begrenztes metastatische Potential zu.
Einigkeit besteht zur Zeit nur in der Tatsache, dass weitere Studien folgen müssen, um den
Stellenwert zirkulierender Tumorzellen im periphervenösen Blut und von Mikrometastasen
im Knochenmark abschließend beurteilen zu können.
10
3. Fragestellung
Die vorgelegte Arbeit untersucht, ob im periphervenösen Blut zirkulierende Tumorzellen auch
bei Brustkrebspatientinnen ohne Metastasen nachgewiesen werden können, wie sich die Zellzahlen unter adjuvanter Therapie ändern und untersucht die Korrelation zum rezidivfreien
Überleben.
11
4. Material und Methoden
4.1. Patientenauswahl und Anzahl der Zellzahlanalysen
86 Patienten des DRK Krankenhauses Chemnitz-Rabenstein wurden über einen Zeitraum von
1999 bis 2005 prospektiv untersucht (Abb. 1).
Abb. 1 Zusammensetzung des Patientenpools
Gesamtpatientenpool
n = 86
Zellzahlanalysen unter
Therapieeinfluß
n = 51
Perioperative Gruppe
n = 29
Basiszellzahlanalyse
n =2 9
Adjuvante Therapie
n = 18
Zellzahlanalysen ohne
Therapieeinfluß
n = 35
Nachsorgegruppe
n = 22
>= 1Folgeanalyse
n = 20
Neoadjuvante Therapie
n=2
EC – Schema
n = 14
CMF – Schema
n=2
Hormontherapie
n=2
In dieser Arbeit sollten vornehmlich Patientinnen, bei denen die Zellzahlanalysen während
einer Therapie durchgeführt wurden, genauer untersucht werden. Sie wurden nach dem Zeit-
12
punkt der ersten Analyse in zwei Gruppen unterteilt. Erfolgte die erste Zellzahlanalyse bis
zum fünfundzwanzigsten postoperativen Tag, wurden die Patientinnen der perioperativen
Gruppe zugeordnet. Erfolgte die erste Zellzahlanalyse zu irgendeinem späteren Zeitpunkt im
Rahmen der Tumornachsorge, wurden die Patientinnen in der Nachsorgegruppe eingruppiert.
Die Daten der Nachsorgegruppe wurden auf Grund der Heterogenität des Datenmaterials
nicht weiterverfolgt. Die Auswertung bleibt einer weiteren Arbeit vorbehalten.
Ausgewertet wurden die Daten der Patientinnen der perioperativen Gruppe, unterschieden
nach der Zahl der Zellzahlanalysen und der Art der Therapie. Tabelle 1 zeigt die Anzahl der
durchgeführten Zellzahlanalysen in der perioperativen Gruppe.
Tab. 1 Anzahl der Zellzahlanalysen der perioperativen Gruppe
Basiszell
1.Folge-
2. Folge-
zahlanalyse
analyse
analyse
Patientenzahl
n=29
n=20
n=11
n=7
n=5
n=2
n=2
Zellzahlanalysen
1
2
3
4
5
6
7
Zeitpunkt*
8.Tag
106.Tag
284.Tag
Weitere Analysen
individuell
*mittlerer Zeitpunkt, vom Tag der Operation gerechnet
Tabelle 1 stellt die Anzahl der durchgeführten Zellzahlanalysen den eingeschlossenen Patientinnen und dem
Zeitpunkt der Durchführung gegenüber.
Die Basiszellzahlanalyse wurde in der adjuvanten Therapiesituation postoperativ (mit zwei
Ausnahmen, bei denen die Basiszellzahl vor einer neoadjuvanten Therapie und präoperativ
bestimmt wurde, Pat. ID 17 und Pat. ID 49) zwischen dem ersten und fünfundzwanzigsten
Tag durchgeführt. Die erste Folgeanalyse wurde im Mittel am 106. postoperativen Tag durchgeführt. Die zweite Folgeanalyse erfolgte im Mittel am 284. Tag nach der Operation. Die Anzahl der Zellzahlanalysen richtete sich ab der vierten Analyse nach den individuellen Gegebenheiten. Die Patientinnen wurden vierteljährlich einem klinischem Restaging unterzogen.
Die Zellzahlanalysen führte das TZB (Transfusionsmedizinische Zentrum Bayreuth, Labor für
Spezielle Immunhämatologie, Dr. med. Ulrich Pachmann, Arzt für Transfusionsmedizin,
Kurpromenade 2, 95448 Bayreuth) durch.
Den Patientinnen wurde nach Aufklärung über den Zweck der Analyse, mit ihrem Einverständnis, 20ml periphervenöses Blut per punctionem entnommen. Die Blutprobe wurde mit
13
EDTA antikoaguliert und in das Transfusionsmedizinische Institut gesandt. Dort erfolgte innerhalb von 36 Stunden die Analyse der Proben.
4.2. Anreicherung der tumorverdächtigen Zellen
Für die Analyse wurden die Tumorzellen angereichert.
Die Anreicherung der dissiminierten Tumorzellen erfolgte über funktionalisierte Magnetpartikel (Labsoft Diagnostics AG Halle) mit Hilfe von Antikörpern, die gegen epitheliale Antigene eines Epitops des EpCAM-Moleküls auf der Zelloberfläche gerichtet sind (Pachmann et
al. 2001).
Die Erythrozyten wurden lysiert und die Leukozyten einschließlich der tumorverdächtigen
Zellen durch Zentrifugation sedimetiert. Die Zellsuspension wurde mit Magnetpartikel und
fluorchrommarkierten Antikörpern inkubiert. Danach wurden die an Magnetpartikeln gebundenen Zellen mit einem Magneten an die Wand des Röhrchens gezogen. Die übrige Zellsuspension wurde entfernt. Die Anreicherung wurde nur einmal durchgeführt, um möglichst wenige markierte Zellen zu verlieren. ( Pachmann et al. 2001).
4.3. Nachweis der tumorverdächtigen Zellen
1 x 105 Zellen werden auf ein festgelegtes Areal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf
einem Objektträger aufgebracht.
Der Zellnachweis erfolgte über den fluorochromarkierten Antikörper (Anhang 9.1.), der sich
an die Oberflächenantigene der lebenden Zelle heftet. Die Verifizierung der Zellen geschah
durch automatisierte Auswertung im Laser-Scanning-Cytometer (LSC®) (CompuCyte, Cambridge Mass). Das Präparat wird dabei von einem Laserstrahl abgetastet und die Zellen werden über Vorwärtsstreulicht erkannt. Über jeder Zelle wird die Intensität gemessen und als
Pixel gespeichert(ca. 200 Messungen pro Zelle). Die Intensitätswerte werden als maximale
Intensität und als Integral der Intensität gelistet. Jedes positive Ereignis wurde nochmals relokalisiert und Visuell kontrolliert. Damit werden die Spezifität der Markierung und die Morphologie der Zelle beurteilbar. ( Pachmann et al. 2001).
14
Anschließend wurde die gefundene Zellzahl auf ein Kreislaufvolumen von 5000 ml hochgerechnet.
Die Ergebnisse wurden uns nach drei Tagen in Form eines Befundberichtes (Anhang 9.2.)
zugesandt.
4.4. angewandte Therapieschemata
Die angewandten adjuvanten und neoadjuvanten Therapieschemata sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
Tab. 2 Angewandte adjuvante und neoadjuvante Therapieschemata
Abkürzung
EC
Anzahl der Zyklen
4
ET
4
Medikamente
Epirubicin
90 mg/m2
Cyclophosphamid
600 mg/m2
Epirubicin
90 mg/m2
Taxol
175 mg/m2
Cyclophosphamid
CMF
6
Taxol
4
IG
6
FEC
4
Hormone
60 Monate
X-Ray
4 Wochen
Dosis
600 mg/m2
Methotrexat
40 mg/m2
Fluoruracil
600mg/m2
Taxol
175 mg/m2
Irinotecan
80 mg/m2
Gemcitabine
250 mg/m2
Fluoruracil
500 mg/m2
Epirubicin
90 mg/m2
Cyclophosphamid
500 mg/m2
Tamoxifen
20 mg /Tag oral
2 Gy Einzel
50 Gy Gesamt
.Tabelle 2 zeigt die verwendeten Chemotherapeutika, Hormone und Bestrahlung, ihre Dosierung (Chemotherapeutikadosierung bezogen auf die Körperoberfläche) und die Anzahl der Zyklen
15
Epirubicin/Cyclophosphamid (EC) wurden einmal pro Zyklus am Tag 1 jeweils über 15 Minuten intravenös verabreicht. Die Zyklusdauer lag bei 21 Tagen. Vorbereitend erhielten die
Patientinnen Dexamethason 20 mg iv, Zofran 8 mg über 30 min iv, Uromitexan 200 mg iv.
Nach erfolgter EC-Gabe wurden 1000ml Thomaejonin, Dexamethason 8mg oral, Urometexan
400mg oral 2 und 6 Stunden nach EC, Zofran 8mg oral nach 10 Stunden und Dexamethason 8
mg oral ebenfalls nach 10 Stunden verabreicht.
Epirubicin/Taxol (ET) wurden einmal pro Zyklus am Tag 1 verabreicht. Die Zyklusdauer lag
bei 21 Tagen. Epirubicin wurde über 15 min intravenös injiziert, Taxol über 180 min. Vor der
Taxolgabe erhielten die Patientinnen wegen des allergenen Potentials von Taxol eine Blockade der Histaminrezeptoren H1 und H2 mit Clemastin 2 mg iv. und Cimetidin 300mg iv.
Vorbereitend vor ET wurden Dexamethason 20 mg iv., Zofran 8 mg iv., Thomaejonin 1000
ml verabreicht. Nach ET wurden Zofran 8 mg und Dexamethason 10mg 10 Stunden nach ETGabe verabreicht.
Cyclophosphamid/Methotrexat/Fluoruracil (CMF) wurden am Tag 1 und Tag 8 des Zykluses
verabreicht. Die Zyklusdauer lag bei 28 Tagen. Die Methotrexatgabe erfolgte über 15 min iv.,
Cyclophosphamid und Fluoruracil wurden über 60 min iv. injiziert. Die Vorbereitung erfolgte mit Calciumfolinat als Mundspülung (4stündlich), Zofran 8 mg iv., Thomaejonin 1000
ml iv., Dexamethason 8 mg iv. Im Anschluss an CMF erhielten die Patientinnen Thomaejonin
1000ml über 2 Stunden, Uromitexan 200 mg 4 und 8 Stunden nach CMF, Dexamethason 8
mg oral und Zofran bei Bedarf 8 stündlich 1 Tablette oral.
Taxol wurde einmal pro Zyklus am Tag 1 verabreicht. Die Zyklusdauer lag bei 21 Tagen. Die
Taxolgabe erfolgte über 180 min. Vorbereitend erhielten die Patientinnen Dexamethason
20mg oral und iv., Clemastin 2 mg iv., Cimetidin 300 mg iv, Zofran 8 mg iv. Nach Taxol
wurden Dexamethason 8 mg iv und Zofran 8 stündlich eine Tablette oral bei Bedarf verabreicht.
Irinotecan/Gemcitabine (IG) wurde dreimal pro Zyklus am Tag 1, Tag 8 und Tag 15 verabreicht. Die Zyklusdauer lag bei 28 Tagen. Die Irinotecangabe erfolgte über 30 min iv., Gemcitabine wurde über 360 min iv. injeziert. Vorbereitend erhielten die Patientinnen Dexametha-
16
son 20 mg iv., Thomaejonin 500ml iv., Zofran 8 mg iv., Atropin 0,25 mg sc. Im Anschluss an
IG Thomaejonin 500ml iv, Zofran 8 mg iv.
Cyclophosphamid/Epirubicin/Fluorouracil (FEC) wurde einmal pro Zyklus am Tag 1 gegeben. Die Zyklusdauer lag bei 21 Tagen. Die Epirubicingabe erfolgte über 15 min iv., Cyclophosphamid und Fluorouracil wurden über 30 min iv. injiziert. Vorbereitend erhielten die
Patientinnen Calciumfolinat 1Ampulle als Mundspülung, Zofran 8 mg iv, Thomaejonin 1000
ml iv., Dexamethason 8 mg iv., Uromitexan 200 mg iv. Im Anschluss an FEC wurden 1000
ml Thomaejonin iv., Uromitexan 200 mg iv., Dexamethason 8 mg iv. und Zofran 8mg oral 8
stündlich bei Bedarf verabreicht.
Den Bezug der durchgeführten Therapieschemata zu den Zellzahlanalysen der Patientinnen
mit mindestens zwei Analysen zeigt Tabelle 3.
EC
EC
CMF
EC
EC
EC
ET
EC
EC
EC
EC
EC
EC + Taxol
Taxol
Taxol
2. Folgeuntersuchung
CMF
EC
FEC
EC
EC
1.Folgeuntersuchung
Basiszellzahlanalyse
ID
6
53
4
49
72
39
24
69
43
3
45
11
13
17
44
32
83
52
71
62
Tab. 3 Zellzahlanalysen und adjuvante Therapien
Therapie
Therapie
4.ZZA Therapie 5.ZZA 6.ZZA 7.ZZA
Taxol
IG
ID Patienten-Identifikation, ZZA Zellzahlanalyse
Tabelle 3 zeigt die angewandten Therapiechemata zu den einzelnen Analysepunkten für jede einzelne Patientin.
Gelb – primäre postoperative Hormontherapie, Blau – Chemotherapie, Violett – kombinierte Chemotherapie und
Bestrahlung, Grün – kombinierte Chemo- und Hormontherapie
17
4.5. Rezidivfreie Zeit und rezidivfreies Überleben
Die rezidivfreie Zeit wurde als die Zeit zwischen Erstdiagnose und dem Auftreten von Metastasen oder Lokalrezidiven bzw. dem letzten Restaging in unserer Ambulanz und damit dem
Ende des Beobachtungszeitraumes festgelegt. Der Beobachtungszeitraum lag im Mittel bei
1354 Tagen (Minimum 190 Tage, Maximum 1735 Tage). Rezidivfreies Überleben war die
Zeit zwischen Erstdiagnose und Ende des Beobachtungszeitraumes bzw. dem Rezidiv.
18
5. Auswertung
5.1. Demografische Daten
Ausgewertet wurden die demografischen Daten der Patientinnen der perioperativen Gruppe.
Tabelle 4 Patienten – Demografie n = 29
Wert
Prozent
Geschlecht
männlich
0
0
weiblich
29
100
Rasse
weiß
29
100
Alter
Minimum
24
Maximum
74
Mittleres
48
Tumorart
Invasiv duktal
20
69
Invasiv lobulär
9
31
Tumorhistologie
T1
10
34,5
T2
15
51,7
T3
2
6,9
T4
2
6,9
N0
15
51,7
N1
14
48,3
M0
29
100
Rezeptorstatus
Er - / Pr –
14
48
Er + / Pr +
15
52
Präoperativ
Sonografie
Unauffällig
100
Röntgen Thorax
Unauffällig
100
Skelettszintigrafie
Unauffällig
100
Beckenkammbiopsie (n=9) Unauffällig
100
Operation
Mastektomie
29
100
Axilläre LNE
29
100
Plastische Versorgung
18
62
Rezidivfreie Zeit
Minimum
107
Maximum
1735
Mittlere
1324
90
Gesamtüberleben
5
17,2
Metastasen
Hirn1
3,4
Knochen2
6,9
Leber2
6,9
Abkürzungen: Er Estrogenrezeptor, Pr Progesteronrezeptor, T Tumor, N Nodes, M Metastases, LNE
Lymphonodektomie
Tab. 4 zeigt die demografischen Daten sowohl
in Absolut- als auch in Prozentwert.
19
Die neunundzwanzig untersuchten Patientinnen waren ausnahmslos Frauen weißer Rasse. Das
Durchschnittsalter lag bei 48 Jahren. In 69 % der Fälle handelte es sich um invasiv duktale
Karzinome, 31 % waren invasiv lobulär. Die Patientinnen wurden nach TNM klassifiziert.
Die T-Unterstadien zeigt Abb. 2.
Abb. 2 T-Klassifikation
T3
7%
T4
7%
T1c
34%
T2
52%
Abbildung 2 zeigt die prozentuale Aufteilung der Patientinnen
der perioperativen Gruppe in den T–Unterstadien der TNM-Klassifikation
51,7 Prozent der Frauen waren nodal negativ. Im Primärstaging konnten bei keiner Patientin
Metastasen nachgewiesen werden. Positive Hormonrezeptoren wiesen 15 (52 %) Frauen auf.
Alle Patientinnen wurden mastektomiert, die axillären Lymphknoten wurden in drei Leveln
reseziert, in zwei Drittel der Fälle erfolgte ein primärer plastischer Wiederaufbau der Brust.
Die rezidivfreie Zeit lag zwischen 107 und 1735 Tagen. In dieser Zeit wurden bei fünf Patientinnen (17,2 %) Metastasen gesichert, eine Hirn-, zwei Leber- und zwei Knochenmetastasen.
20
5.2. Prävalenz der ZTZ
Bei allen neunundzwanzig Patientinnen wurden während des Beobachtungszeitraumes zirkulierende tumorverdächtige Zellen im periphervenösen Blut aufgefunden. In der Basisanalyse
wurden bei allen Frauen ZTZ nachgewiesen (Abb. 3).
Abb. 3 Höhe der Basis - ZTZ
100000000
76000000
16500000
10000000
Zellzahl /5l
2925714
2403000
1920000
1240500
1164000
1000000
1070000
637500 647500
547500
171428
427500
219000
180000
137142
100000
82500
40909
31428
54000
184500
91500
21818
13500
11400
10000
7500
3158
2143
1500
1000
0
10
20
30
40
50
Patienten-ID
60
70
80
90
Abb3 zeigt die Höhe der Basiszellzahl (hochgerechnet auf ein Kreislaufvolumen von 5 l der
Patientinnen der perioperativen Gruppe (Patienten-ID Patientenidentifikationsnummer)
Die Zahl der ZTZ variierte, hochgerechnet auf ein Kreislaufvolumen von 5 Litern, zwischen
1500 und 76.000.000 Zellen. Tabelle 5 gibt einen Überblick über die Prävalenz der ZTZ in
den Patientenuntergruppen der perioperativen Gruppe. In der Gesamtgruppe lag bei 86 % die
Zellzahl über 10000 ZTZ/5l (2 ZTZ/ml). In der Gruppe der unter 35 jährigen Frauen lag die
Basiszellzahl zu 100 % über 50000 ZTZ/5l (10 ZTZ/ml). In den T-Unterstadien zeigten für T1
80 % der Patientinnen Zellzahlen über 50000 ZTZ/5l, für T2 60 % über 50000 ZTZ/5l, für T3
und T4 jeweils 50 %. Die invasiv duktalen und die invasiv lobulären Karzinome differierten
bei den Zellzahlen größer 500000 ZTZ/5l deutlich (25 % versus 67 %). Gruppiert nach der
Östrogenrezeptorverteilung lagen die Zellzahlen in einer Schwankungsbreite von 4 bis 18
Prozent. Die nodal negativen Frauen hatten alle Zellzahlen über 10000 ZTZ/5l während nur
21
71 % der Nodalpositiven über dieser Zellzahl lagen. Die Basiszellzahlen der Patientinnen die
im Beobachtungszeitraum metastasierten lagen in 80 % der Fälle über 50000 ZTZ/5l in 20 %
allerdings unter 1500 ZTZ/5l.
Tab. 5 Prävalenz Zirkulierender Tumorverdächtiger Zellen in der perioperativen Gruppe
Variable
No
>1500ZTZ
%
>3000ZTZ
%
>10000ZTZ
%
>30000ZTZ
%
>50000ZTZ
%
>500000ZTZ
%
Gesamtpatienten
Periop. Gruppe
29
96
93
86
76
69
38
Alter <35
3
100
100
100
100
100
Alter >35
Tumorgröße
T1
26
96
92
85
73
65
42
10
100
100
90
90
80
40
T2
15
93
93
87
67
60
40
T3
2
100
100
100
100
50
50
T4
Tumorhistologie
2
100
50
50
50
50
Invasiv duktal
20
100
95
85
75
65
25
Invasiv lobulär
Rezeptorstatus
ER/PR positiv
9
89
89
89
78
78
67
15
93
93
87
80
67
47
ER/PR negativ
Lymphknotenstatus
Nodal negativ
14
100
93
86
71
71
29
15
100
100
100
87
73
40
Nodal positiv
Metastasenart
Hirn-
14
93
86
71
64
64
29
1
100
100
100
100
100
Leber-
2
100
100
100
100
100
100
Knochen2
50
50
50
50
50
ZTZ zirkulierende tumorverdächtige Zellen, ER Östrogenrezeptor, PR Progesteronrezeptor
Tabelle 5 zeigt die Häufigkeiten der Zellzahlen in Prozent bei verschiedenen, willkürlich festgelegten Schwellenwerten in der gesamten perioperativen Gruppe und deren Untergruppen
22
5.2.1. Basiszellzahlanalyse, Rezidivfreie Zeit und Gesamtüberleben
Der Beobachtungszeitraum lag zwischen 190 und 1735 Tagen, im Mittel bei 1356 Tagen. In
dieser Zeit metastasierten fünf Patientinnen (mittlere rezidivfreie Zeit 1287 Tage, min. 107
max. 1735), drei davon starben. Die Metastasierungsrate lag bei 17,24 Prozent, das Gesamtüberleben bei 89,65 Prozent. Tabelle 6 und Abbildung 4 stellen die Absolutzahlen der Basiszellanalyse der rezidivfreien Zeit gegenüber.
ID
Tabelle 6 Basisanalyse und rezidivfreie Zeit
BasiszellzahlBeobachtungsanalyse
Rezidivfreie
zeitraum
ZTZ/5l
in Tagen
Differenz
Zeit in Tagen
219000
107
190
40
16500000
519
519
66
11400
700
700
18
21818
930
930
62
76000000
488
953
24
2925714
1156
1156
48
1070000
1169
1169
43
82500
1230
1230
52
91500
801
1239
438
3
2143
600
1243
643
13
54000
1268
1268
47
647500
939
1294
69
184500
1376
1376
83
13500
1407
1407
32
137142
1427
1427
6
547500
1506
1506
2
171428
1554
1554
72
1500
1580
1580
39
637500
1615
1615
16
1164000
1623
1623
49
2403000
1625
1625
4
1920000
1697
1697
55
180000
1698
1698
11
1240500
1700
1700
53
7500
1717
1717
25
3158
1721
1721
45
40909
1726
1726
44
31428
1726
1726
427500
1735
1735
71
83
Tod
17
465
355
ID Identifikation, ZTZ zirkulierende tumorverdächtige Zellen
Tabelle 6 zeigt die Höhe der Basiszellzahl und stellt sie der rezidivfreien Zeit in Tagen
gegenüber. Die Differenz bedeutet, dass vor Ende des Beobachtungszeitraumes ein Rezidiv
auftrat. Tod bezeichnet die Patientinnen die innerhalb des Beobachtungszeitraumes verstarben.
Die Patientinnen, die vor Ende des Beobachtungszeitraumes metastasierten sind rot aufgetragen.
23
Abb. 4 Verhältnis von Basiszellzahl zu rezidivfreier Zeit
2000
Rezidivfreie Zeit in Tagen
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1000
10000
100000
1000000
Zellzahl ZTZ/5l
10000000
100000000
Abbildung 4 illustriert die Zahlenwerte der Tabelle 5 grafisch. Aufgetragen ist die rezidivfreie Zeit in
Tagen über die auf ein Kreislaufvolumen von 5 Litern hochgerechnete Basiszellzahl
Eine Korrelation zwischen den beiden Parametern Basiszellzahl und rezidivfreie Zeit besteht
nicht, ebenso wenig kann man im vorliegenden Patientengut innerhalb des gegebenen Beobachtungszeitraumes von der Höhe der Basiszellzahl auf das Gesamtüberleben schließen.
24
5.3. Erste Folgeuntersuchung
Das erste Follow up erfolgte im Mittel am 106 postoperativen Tag (min. -20.Tag, max. 277.
Tag) nach den ersten Zyklen Chemotherapie. Zwanzig der neunundzwanzig Patientinnen die
eine Basiszellzahlanalyse hatten, konnten weiterverfolgt werden. Neun erhielten keine weiteren Zellzahlanalysen, blieben aber im klinischen Restaging. Tabelle 7 zeigt die Patientenverteilung nach den demografischen Daten und der Höhe der erhobenen Zellzahlen.
Tab. 7 Erste Folgeuntersuchung Zirkulierender Tumorverdächtiger Zellen in der perioperativen Gruppe
Variable
No
>1500ZTZ
%
>3000ZTZ
%
>10000ZTZ
%
>30000ZTZ
%
>50000ZTZ
%
>500000ZTZ
%
Gesamtpatienten
Periop. Gruppe
20
80
80
70
60
45
20
Alter <35
3
67
67
67
33
33
0
Alter >35
Tumorgröße
T1
17
82
82
71
65
47
24
8
100
100
100
87
75
50
T2
8
62
62
37
37
37
0
T3
2
50
50
50
50
0
0
T4
Tumorhistologie
2
100
100
100
50
0
0
Invasiv duktal
14
71
71
64
50
36
21
Invasiv lobulär
Rezeptorstatus
ER/PR positiv
6
100
100
83
83
67
17
10
100
100
80
70
50
30
ER/PR negativ
Lymphknotenstatus
Nodal negativ
10
60
60
60
50
40
10
12
92
92
75
67
50
25
Nodal positiv
Metastasen
8
4
62
50
62
50
62
50
50
25
37
0
25
0
Hirn-
1
0
Leber-
1
0
Knochen2
100
100
100
50
0
0
ZTZ zirkulierende tumorverdächtige Zellen, ER Östrogenrezeptor, PR Progesteronrezeptor
Tabelle 7 zeigt die Häufigkeiten der Zellzahlen der ersten Folgeuntersuchung in Prozent bei bestimmten
Schwellenwerten in der gesamten perioperativen Gruppe und deren Untergruppen
25
Vergleicht man die Basiszellzahl mit den Zellzahlen der ersten Folgeuntersuchung und setzt
einen Schwellenwert bei einer Zellzahl von 3000 ZTZ/5l, so änderten sich die Zahl der ZTZ
folgendermaßen (Tab. 8).
Tab. 8 Vergleich Basiszellzahl zu 1. Follow up
1. Follow
Basiszellzahl
up
Variable
>3000ZTZ
>3000ZTZ
%
%
Gesamtpatienten
Periop. Gruppe
93
80
Alter <35
100
67
Alter >35
Tumorgröße
T1
92
82
100
100
T2
93
62
T3
100
50
T4
Tumorhistologie
50
100
Invasiv duktal
95
71
Invasiv lobulär
Rezeptorstatus
ER/PR positiv
89
100
93
100
ER/PR negativ
Lymphknotenstatus
Nodal negativ
93
60
100
92
Nodal positiv
Metastasenart
Hirn-
86
62
100
0
Leber-
100
0
Knochen50
100
Tabelle 8 zeigt die Häufigkeiten der Basiszellzahlen und der Zellzahlen
der ersten Folgeuntersuchung in Prozent bei dem idealisierten
Schwellenwerten von 3000 ZTZ
Hatten in der Basisanalyse 93 Prozent der Patientinnen über 3000 ZTZ/5l so waren es nach
Beginn der adjuvanten Therapie nur noch 80 Prozent. Bei 33 Prozent der unter 35 Jährigen
26
war nach Behandlung die ZTZ unter 3000 gefallen, bei den Frauen über 35 waren nur 10 %
unter diese Schwelle gesunken.
Im Tumorstadium T1 ergab sich keine Änderung, in T2 und T3 sank die Zahl der Frauen mit
Zellzahlen oberhalb des Schwellenwertes deutlich. Bei den T4 Tumoren dagegen war ein Anstieg zu verzeichnen. Bei den invasiv duktalen Karzinomen sank die Zellzahl ab. In der invasiv lobulären Gruppe wurde ein Anstieg um 11 Prozent verzeichnet.
Sieben Prozent der Frauen mit negativen Rezeptorstatus lagen initial unter 3000 ZTZ/5l nach
Behandlung 40 Prozent. Rezeptorpositive zeigten einen Anstieg. Bei den Nodalnegativen
blieben 92 % über der Schwellenzellzahl, in der nodalpositiven Gruppe änderten sich die
Verhältnisse deutlich. Bemerkenswerterweise sanken die Zellzahlen bei den Frauen, die später Hirn- und Lebermetastasen entwickelten unter 3000 ZTZ/5l. Bei einer der zwei Patientinnen mit Knochenmetastasen ebenfalls.
Die durchgeführte adjuvante Therapie bestand aus verschiedenen Therapieschemata. Tabelle
9 zeigt die Veränderungen der absoluten Zellzahlen unter den verschiedenen Regimen.
Tab. 9 Zellzahlveränderungen 1. Follow up
1. Folrezidivfreie
ID Chemotherapie Basiszellzahl low up
Differenz
Tage
3
CMF
2143
48571
46428
600
53
CMF
7500
3057000 3049500
1717
62
EC+Taxol
76000000
0
-76000000
488
11
EC+X-Ray
1240500
36000
-1204500
1700
4
EC
1920000
784500
-1135500
1697
71
EC
427500
0
-427500
1735
39
EC
637500
244500
-393000
1615
32
EC
137142
4500
-132642
1427
52
EC
91500
0
-91500
801
13
EC
54000
21428
-32572
1268
44
EC
31428
9000
-22428
1726
83
EC
13500
0
-13500
1407
43
EC
82500
85714
3214
1230
45
EC
40909
45000
4091
1726
69
EC
184500
202667
18167
1376
72
EC
1500
300000
298500
1580
17
ET
219000
10500
-208500
107
49
FEC
2403000
743571
-1659429
1625
Hormontherapie
24 TAMOXIFEN
2925714
211500
-2714214
1156
6
TAMOXIFEN
547500
6555882 6008382
1506
Tabelle 9 zeigt die angewandten adjuvanten Therapien, die Basiszellzahl, die Zellzahl am ersten Follow up. Weiterhin ist die Differenz der Zellzahl von ersten
Follow up und der Basiszellzahl aufgezeigt. Die rezidivfreien Tage der Patientinnen, die vor Ende des Beobachtungszeitraumes rezidivierten sind rot aufgetragen.
27
Unter CMF (n=2) stiegen die Zellzahlen bei beiden Patientinnen an. Bei 9 von 14 Patientinnen, die EC(n=14) erhielten, sank die Zellzahl ab, bei 3 erhöhte sich die Zellzahl geringfügig,
im Maximum 110 %, bei 2 Patientinnen erhöhte sich die Zellzahl deutlich. Nach ET (n=1)und
FEC(n=1) sanken die Zellzahlen. Unter alleiniger postoperativer Hormontherapie (n=2) stieg
bei Patientin 6 die Zellzahl an, bei Patientin 24 verringerte sie sich. Eine Beziehung zur Länge
des rezidivfreien Intervalls ergab sich aus der Differenz der Zellzahlen von 1. Follow up und
Basiszellzahl nicht.
Abb. 5 Zellzahländerungen der Patientinnen
der Perioperativen Gruppe nach 4 Zyklen EC
100000
83
52
71
62
44
13
11
45
43
69
39
4
72
6
Zellzahländerung in %
des Ausgangswertes
10000
1000
100
10
1
0,1
0,01
0
75
150
perioperative Tage
Abbildung 5 zeigt die Zellzahlverlaufe der Patientinnen nach vier Zyklen EC aus der Tabelle 9 zeitlich.
28
5.4. Zweite Folgeuntersuchung
Das zweite Follow up (n =11) erfolgt im Mittel am 284. postoperativen Tag (min 89. Tag,
max 578. Tag. Tab. 10 enthält die Prozentuale Verteilung der Patientenuntergruppen in den
einzelnen Zellzahlkategorien.
Tab.10 Zweites Follow up Zirkulierender Tumorverdächtiger Zellen in der perioperativen Gruppe
>1500ZTZ >3000ZTZ >10000ZTZ >30000ZTZ >50000ZTZ > 500000ZTZ
Variable
No
%
%
%
%
%
%
Gesamtpatienten
Perioperative
Gruppe
11
91
91
91
82
73
45
Alter <35
2
100
100
100
100
100
0
Alter >35
Tumorgröße
T1
9
89
89
89
78
67
56
4
100
100
100
100
75
75
T2
4
75
75
75
50
50
25
T3
2
100
100
100
100
100
50
T4
Tumorhistologie
1
100
100
100
100
100
0
Invasiv duktal
6
100
100
100
100
84
50
Invasiv lobulär
Rezeptorstatus
ER/PR positiv
5
80
80
80
60
60
40
5
80
80
80
60
60
60
ER/PR negativ
Lymphknotenstatus
Nodal negativ
6
100
100
100
100
84
33
5
80
80
80
80
60
40
Nodal positiv
Metastasenart
Hirn-
6
3
1
100
100
100
100
100
100
100
100
100
84
100
100
84
100
100
50
33
0
Leber-
1
100
100
100
100
100
100
Knochen1
100
100
100
100
100
0
ZTZ zirkulierende tumorverdächtige Zellen, ER Östrogenrezeptor, PR Progesteronrezeptor
Tabelle10 zeigt die Häufigkeiten der Zellzahlen der zweiten Folgeuntersuchung in Prozent bei bestimmten
Schwellenwerten in der gesamten perioperativen Gruppe und deren Untergruppen
29
In Tabelle 11 werden die Patientinnen, die über der Schwelle von 3000 ZTZ/5l lagen in ihren
Subgruppen verglichen.
Tab.11 Vergleich von Basiszellzahl 1. und 2. Follow up
Variable
Basiszellzahl
1. Follow up
2. Follow up
>3000ZTZ
>3000ZTZ
>3000ZTZ
%
%
%
Gesamtpatienten
Primäre Gruppe
93
80
91
Alter <35
100
67
100
Alter >35
Tumorgröße
T1
92
82
89
100
100
100
T2
93
62
75
T3
100
50
100
T4
Tumorhistologie
50
100
100
Invasiv duktal
95
71
100
Invasiv lobulär
Rezeptorstatus
ER/PR positiv
89
100
80
93
100
80
ER/PR negativ
Lymphknotenstatus
Nodal negativ
93
60
100
100
92
80
Nodal positiv
Metastasenart
Hirn-
86
62
100
100
0
100
Leber-
100
0
100
Knochen-
50
100
100
Tabelle 11 zeigt die Häufigkeiten der Zellzahlen der zweiten Folgeuntersuchung
in Prozent bei dem idealisierten Schwellenwerten von 3000 ZTZ
In der Gesamtgruppe nähert sich die Zahl der Frauen mit >3000 ZTZ/5l wieder dem Ausgangswert, ebenso in den Altersuntergruppen. Die T-Stadien zeigen für T1 unverändert T2
und T3 Wiederanstieg und bei T4 das 2.Follow up unverändert zu 1. Follow up. Nachdem in
der rezeptornegativen Gruppe die Zahl der Frauen mit einer Zellzahl > 3000 nach erfolgter
30
Chemotherapie bei 60 Prozent lag, kam es am zweiten Follow up zu einen Anstieg auf 100
Prozent. In der Rezeptor-positiven Gruppe sank die Zahl. Die Gruppe der nodal negativen
Patientinnen mit Zellzahlen über dem Schwellenwert verringert sich, die nodal positive
Gruppe vergrößerte sich wieder.
Die Frauen, bei denen Metastasen nachgewiesen wurden, lagen am zweiten Follow up alle
über den Schwellenwert, während zum ersten Follow up noch bei zwei Patientinnen keine
ZTZ im peripheren Blut aufgefunden werden konnten.
In Tabelle 12 sind die Zellzahlen der ZTZ mit Angabe der Therapie aufgelistet.
Tab. 12 Vergleich der erhobenen Zellzahlen unter Therapie
1.Follow
2.Follow
Rezidivfreie
ID
Therapie
up
Therapie
up
Rezidiv-Art
Tage
6
6555882
662857
rezidivfrei
1506
53
CMF
3057000
2643000
rezidivfrei
1717
49
FEC
743571
Taxol
718571
rezidivfrei
1625
72
EC
300000
Taxol
25500
rezidivfrei
1580
39
EC
244500
55500
rezidivfrei
1615
24
211500
0
rezidivfrei
1156
69
EC
202667
36000
rezidivfrei
1376
11
EC
36000
1210909
rezidivfrei
1700
Knochen17
219000
ET
10500
286154
Metastasen
107
52
91500
EC
0
Taxol
474000
Hirn-Metastasen
801
62
76000000
EC + Taxol
0
3000000 Leber-Metastasen
488
ID Identifikation, ZZA Zellzahlanalyse, Met Metastase
Tabelle 12 vergleicht die angewandten Therapieschemata zu den einzelnen Analysepunkten für jede
einzelne Patientin. Gelb – primäre postoperative Hormontherapie, Blau – Chemotherapie, Violett – kombinierte
Chemotherapie und Bestrahlung, Grün – kombinierte Chemo- und Hormontherapie Die rezidivfreien Tage der
Patientinnen, die vor Ende des Beobachtungszeitraumes rezidivierten sind rot aufgetragen.
Basiszellzahl
547500
7500
2403000
1500
637500
2925714
184500
1240500
Die Zahl der ZTZ bezogen auf die Basiszellzahl sank am zweiten Follow up bei 36,4 %, bezogen auf das 1. Follow up bei 63,6 % der Patientinnen.
Drei von 11 Patientinnen mit mindestens drei Zellzahlanalysen metastasierten im Beobachtungszeitraum. Abbildung 6 zeigt die Zellzahländerungen des zweiten Follow up bezogen auf
die Ausgangszellzahl und bezogen auf die erste Analyse nach Chemotherapie.
31
Abb. 6 Zellzahlveränderungen bei verschiedenen Bezugspunkten
(MT2-MT1 MT3-MT1 MT3-MT2)
10000000
M
M
1000000
Änderung in %
100000
10000
M
MT2%MT1
1000
MT3%MT1
100
10
MT3%MT2
24
72
69
39
17
52
6
49
11
53
62
1
0,1
0,01
ID
Abbildung 6 zeigt die Zellzahlveränderungen in Prozent, Patienten bezogen, bei unterschiedlichen Ausgangswerten; MT1 Basiszellzahl, MT2 Zellzahl 1.Follow up, MT3 Zellzahl 2. Follow up; MT2%MT1 Zellzahl erstes
Follow up bezogen auf Basiszellzahl; MT3%MT1 Zellzahl zweites Follow up bezogen auf Basiszellzahl;
MT3%MT2 Zellzahl zweites Follow up bezogen auf Zellzahl erstes Follow up
Die Änderung der Zellzahl der ersten Folgeanalyse (MT2) nach den ersten Zyklen Chemotherapie bezogen auf die Basiszellzahl( MT1) steht in keiner Beziehung zum rezidivfreien Überleben. Auch die Zellzahl der zweiten Folgeanalyse (MT3) im Verhältnis zur Ausgangszellzahl
ergibt ebenfalls keine Beziehung zum rezidivfreien Überleben. Vergleicht man jedoch MT3
im Verhältnis zu MT2, so findet sich bei vier Patientinnen ein Zellzahlwiederanstieg, drei
davon, Patientin 17, 52 und 62, metastasierten im Beobachtungszeitraum.
32
5.5. Weitere Zellzahlanalysen
Bei sieben Patientinnen wurden über das 2. Follow up hinaus Zellzahlerhebungen durchgeführt. Die einzelnen Zellzahlverläufe zeigen die Abbildungen 7 bis 12.
Zellzahländerung in %
des Ausgangswertes
Abb.7 Zellzahlverlauf Patientin ID 69
100000
10000
1000
100
69
10
1
EC
0,1
0,01
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
postoperative Tage
Abb.7: Die Patientin 69 wurde initial mastektomiert , die axillären Lymphknoten wurden reseziert ( axilläre LNE), Stadium T1N0M0G2E+P+. Die Zellzahl stieg nach vier Zyklen EC
geringfügig an, sank dann unter die Nachweisgrenze. Die Patientin blieb bis zum Ende des
Beobachtungszeitraumes von 1376 Tagen rezidivfrei.
33
Zellzahländerung in %
des Ausgangswertes
Abb.8 Zellzahlverlauf Patientin ID 39
100000
10000
1000
100
10
1
39
EC
Hormontherapie
0,1
0,01
0
200
400
600
800
1000 1200 1400 1600 1800
postoperative Tage
Abb.8: Nach Mastektomie und axillärer LNE (Stadium T2N0M0G3E+P+) folgten bei Patientin 39 vier Zyklen EC. Eine Hormontherapie mit 20 mg Tamoxifen/Tag schloss sich an. Die
Zellzahl sank kontinuierlich. Die Patientin blieb bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes
von 1615 Tagen rezidivfrei.
Zellzahländerung in %
des Ausgangswertes
Abb.9 Zellzahlverlauf Patientin ID 11
100000
10000
1000
100
10
1
0,1
0,01
11
EC
Bestrahlung
Hormontherapie
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
postoperative Tage
34
Abb.9: Nach Mastektomie, axillärer LNE (Stadium T2N0M0G2E+P+) und plastischen Wiederaufbau folgten bei Patientin 11 vier Zyklen EC und Bestrahlung. Die Zellzahl stieg nach
der Bestrahlung an. Unter Hormontherapie sank sie dann aber bei den folgenden drei Zellzahlbestimmungen unter die Nachweisgrenze. Die Patientin blieb bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes von 1700 Tagen rezidivfrei.
Zellzahländerung in %
des Ausgangswertes
Abb. 10 Zellzahlverlauf Patientin ID 52
100000
10000
1000
100
10
1
0,1
0,01
EC
Taxol
52
Hormontherapie
IG
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
postoperative Tage
Abb.10: Nach Mastektomie, axillärer LNE (Stadium T3N1M0G3E-P-) und plastischen Wideraufbau wurde die Patientin 52 mit vier Zyklen EC behandelt. Darauf folgten 4 Zyklen Taxol, darunter stieg die Zellzahl an. Unter Hormontherapie mit Enantone und Tamoxifen sank
die Zellzahl erneut unter die Nachweisgrenze Am Tag 796 nach Erstdiagnose wurde eine
Hirnmetastase diagnostiziert, am Tag 1150 Leber- und Knochenmetastasen. Daraufhin wurde
die Patientin mit sechs Zyklen Irinotecan / Gemcitabine (IG) behandelt, jedoch mit erneutem
Anstieg der Zellzahl.
Bei einer zweiten der drei Patientinnen, die nach der initialen EC-Therapie Taxol erhielten,
kam es zu einem Wiederanstieg der ZTZ. Diese beiden erlitten ein Rezidiv im Beobachtungszeitraum.
Zwei Patientinnen wurden ab dem ersten postoperativen Tag mit einer Hormontherapie behandelt.
35
Abb.11 Zellzahlverläufe Patientinnen ID 6 und ID 24
Zellzahländerung in %
des Ausgangswertes
10000
1000
100
24
10
6
1
0,1
0,01
0
75 150 225 300 375 450 525 600 675 750 825 900 975 1050
postoerative Tage
Abb.11 Nach einem initialen Zellzahlanstieg bei Patientin 6 fielen bei beiden Patientinnen die
Zellzahlen kontinuierlich ab. Sie blieben innerhalb des Beobachtungszeitraumes (Pat. 24
[Stadium T2N0M0G2E+P+]1156 Tage, Pat. 6 [Stadium T1N0M0G2E+P+] 1506 Tage) rezidivfrei.
Abb. 12 Zellzahlverlauf Patient ID 53
100000
Zellzahl in %
10000
53
1000
CMF
100
ETaxol
10
1
0
50
100
150
200
250
300
350
400
postoperative Tage
Abb.12 Patientin 53 erhielt zunächst CMF, darunter stieg die Zellzahl an. im Anschluss erhielt sie Epirubicin/Taxol kombiniert, daraufhin sank die Zellzahl. Die Patientin blieb bis zum
Ende des Beobachtungszeitraumes von 1714 Tagen rezidivfrei. (Stadium T1cN1M0G3E-P-)
In der Tab. 13 sind die Werte tabellarisch aufgeführt.
36
Tab. 13 weitere Zellzahlerhebungen
2.Follow
rezidivfreie
up
4.ZZA 5.ZZA 6.ZZA 7.ZZA 8.ZZA
Rezidiv-Art
Tage
1210909 792857 79500 73500 146667
rezidivfrei
1700
662857 400000 795000 4500000 800000 10500
rezidivfrei
1506
55500 300000
rezidivfrei
1615
0
0
0
rezidivfrei
1156
474000
0
136500
Hirnmetastase
801
2643000 60000
rezidivfrei
1717
36000
0
0
rezidivfrei
1376
ID Patientenidentifikation, ZZA Zellzahlanalysen
Tab. 13 zeigt die Zellzahlverläufe und die rezidivfreie Zeit der Patientinnen mit mehr als drei Zellzahlanalysen
1.Follow
ID Basiszellzahl
up
11
1240500
36000
6
547500
6555882
39
637500
244500
24
2925714
211500
52
91500
0
53
7500
3057000
69
184500
202667
Die Patientinnen 11, 6, 39, 24 und 52 erhielten nach dem zweiten Follow up weiterhin eine
Hormontherapie. Patientin 53 und 69 erhielten keine weitere Therapie. Bei Patientin 52 wurde
zusätzlich zur Hormontherapie vor der fünften ZZA eine Chemotherapie mit IG durchgeführt.
Fasst man die vorstehenden Tabellen zusammen, stellen sich die Zellzahlveränderungen unter adjuvanter Therapie über den gesamten Beobachtungszeitraum wie folgt dar (Tab. 14)
Tab. 14 Zusammenfassung der Tabellen 3,6,9 und 12
ID
6
53
4
49
72
39
24
69
43
3
45
11
13
17
44
32
83
52
71
62
Basiszellzahl
Therapie
(T)
2.Follow
up
4.ZZA
6555882
662857
400000
CMF
3057000
2643000
60000
1920000
EC
784500
2403000
FEC
743571
Taxol
718571
1500
EC
300000
Taxol
25500
637500
EC
244500
547500
7500
2925714
1.Follow
up
T
T
5.ZZA
795000
7.ZZA
8.ZZA
4500000 800000
6.ZZA
10500
Rezidivfreie
Tage
1506
1717
1697
1625
1580
55500
300000
1615
211500
0
0
0
184500
EC
202667
36000
0
0
82500
EC
85714
1230
2143
CMF
48571
600
40909
EC
45000
1240500
EC
36000
1156
1376
1726
1210909
792857
79500
73500
146667
1700
54000
EC
21428
219000
ET
10500
31428
EC
9000
137142
EC
4500
1427
13500
EC
0
1407
91500
EC
0
427500
EC
EC +
Taxol
0
76000000
0
1268
286154
107
1726
Taxol
474000
0
IG
136500
801
1735
3000000
488
ID Identifikation, Chemo Chemotherapie, ZZA Zellzahlanalyse, Met Metastase
Tabelle 14 zeigt die angewandten Therapiechemata zu den einzelnen Analysepunkten für jede einzelne Patientin.
Gelb – primäre postoperative Hormontherapie, Blau – Chemotherapie, Violett – kombinierte Chemotherapie und
Bestrahlung, Grün – kombinierte Chemo- und Hormontherapie Die rezidivfreien Tage der Patientinnen, die vor
Ende des Beobachtungszeitraumes rezidivierten sind rot aufgetragen.
37
Abb. 13 Zellzahländerungen der Patientinnen der Perioperative Gruppe mit mindestens 2
Zellzahlanalysen
83
52
32
45
49
11
39
3
6
24
Zellzahländerungen in% des
Ausgangswertes
100000
10000
MET klinisch
600 d
1000
100 MET klinisch
107 d
10
MET klinisch
488 d
1
17
71
44
53
4
13
43
72
69
62
MET klinisch
801 d
0,1
-300
0,01
-100
100
300
500
700
900
1100
Tage
Abbildung 13 zeigt die Zellzahländerungen aller Patientinnen während des Beobachtungszeitraumes als
Diagramm. Pat.17 metastasiert am 107.Tag, Pat 62 metastasiert am 488.Tag, Pat.3 metastasiert am 600.
Tag, Pat 52 metastasiert am 801. Tag,
38
6. Diskussion
6.1. Zellzahlanalysen und demografische Daten
Die in der Auswertung einzeln aufgeführten Zellzahlhäufigkeiten in den demografischen Untergruppen fasst Tabelle 15 noch einmal zusammen.
Tab. 15 Zusammenfassung der Zellzahlhäufigkeiten in den demografischen Untergruppen.
Variable
Patientenzahl
>1500ZTZ
>3000ZTZ
>10000ZTZ
>30000ZTZ
>50000ZTZ
> 500000ZTZ
No
%
%
%
%
%
%
Basis
F1 F2
Basis
F1
F2
Basis
F1
F2
Basis
F1
F2
Gesamtpatienten
perioperative
Gruppe
Alter <35
Basis F1
F2
Basis F1
F2
Basis F1
F2
29
20 11
96
80
91
93
80
91
86
70
91
76
60
82
69
45
73
38
20
45
3
3
2
100
67
100
100
67
100
100
67
100
100
33 100
100
33 100
0
0
0
Alter >35
26
17
9
96
82
89
92
82
89
85
71
89
73
65
78
65
47
67
42
24
56
T1
10
8
4
100
100 100
100
100 100
90
100 100
90
87 100
80
75
75
40
50
75
T2
15
8
4
93
62
75
93
62
75
87
37
75
67
37
50
60
37
50
40
0
25
T3
2
2
2
100
50
100
100
50
100
100
50
100
100
50 100
50
0
100
50
0
50
T4
2
2
1
100
100 100
50
100 100
50
100 100
50
50 100
50
0
100
0
0
0
20
14
6
100
71
100
95
71
100
85
64
100
75
50 100
65
36
84
25
21
50
9
6
5
89
100
80
89
100
80
89
83
80
78
83
60
78
67
60
67
17
40
15
10
5
93
100
80
93
100
80
87
80
80
80
70
60
67
50
60
47
30
60
14
10
6
100
60
100
93
60
100
86
60
100
71
50 100
71
40
84
29
10
33
Tumorgröße
Tumorhistologie
Invasiv
duktal
Invasiv
lobulär
Rezeptorstatus
ER/PR
positiv
ER/PR
negativ
39
Fortsetzung Tab. 15 Zusammenfassung der Zellzahlhäufigkeiten in den demografischen Untergruppen.
Variable
Patientenzahl
>1500ZTZ
>3000ZTZ
>10000ZTZ
>30000ZTZ
>50000ZTZ
No
%
%
%
%
%
Basis
F1 F2
Basis
F1
F2
Basis
F1
F2
Basis
F1
F2
Basis F1
F2
Basis F1
> 500000ZTZ
%
F2
Basis F1
F2
Lymphknotenstatus
Nodal negativ
15
12
5
100
92
80
100
92
80
100
75
80
87
67
80
73
50
60
40
25
40
Nodal positiv
14
8
6
93
62
100
86
62
100
71
62
100
64
50
84
64
37
84
29
25
50
Metastasenart
Hirn-
1
1
1
100
0
100
100
0
100
100
0
100
100
0
100
100
0
100
0
0
0
Leber-
2
1
1
100
0
100
100
0
100
100
0
100
100
0
100
100
0
100
100
0
100
Knochen-
2
2
1
50
100 100
50
100 100
50
100 100
50
50 100
50
0
100
0
0
0
ER Estrogenrezeptor, PR Progesteronrezeptor, Basis Basiszellzahlanalyse, F1 ersten Folgeuntersuchung, F2 zweite Folgeuntersuchung
% Prozent der Patienten
Eine vergleichbare Zuordnung der Zellzahlen zu den demografischen Daten hat Christofanilli
(Christofanilli et al. 2005), allerdings für metastasierte Mammakarzinome (MBC), durchgeführt. Er definierte einen Schwellenwert bei 5 ZTZ/7,5 ml. Dies entspricht in dieser Arbeit
einem Wert von 3333 Zellen/5l (auf 3000 /5l idealisiert). Diesen Schwellenwert setzte
Christofanilli, weil sich bei ihm damit ein Plateau ergab und es erst oberhalb dieser Zellzahl
zu Unterschieden zwischen den Patientengruppen kam. Patientinnen mit höheren Zellzahlen
hatten bei ihm ein signifikant kürzeres Überleben. Dies konnte in der vorliegenden Arbeit bei
nicht metastasierten Patientinnen nicht bestätigt werden. Viel mehr konnte gezeigt werden,
dass es abhängig von der Therapie zu einschneidenden Veränderungen der Zellzahlen kommt,
wobei drei Patientinnen, die sehr gut auf die Epirubicinhaltige Therapie ansprachen, unter
Taxol wieder anstiegen und anschließend rezidivierten.
Daraus ergibt sich, dass es für die Prognose der einzelnen Patientin nicht sinnvoll ist, einen
Schwellenwert zu definieren, vielmehr ist das Verhalten der Zellen in der Längsschnittanalyse
aussagekräftig.
40
6.2. Basisszellzahlanalyse
Bei allen Patientinnen konnten vor Beginn der Therapie epitheliale Zellen im Blut nachgewiesen werden. Das entspricht einer Detektionsrate von 100 Prozent. Solche epitheliale Zellen
werden bei Normalprobanden nicht gefunden. In der Literatur wird davon ausgegangen, dass
es sich bei zirkulierenden epithelialen Zellen um Tumorzellen handelt. Es kann sich dabei
aber auch um falsch positive Ergebnisse handeln. Traystman et al. 1997 aber auch Gaforio et
al. 2003 erwähnen eine illegitime Expression von Zytokeratin, Bestandteil des Zytoskeletts
epithelialer Zellen, durch mononukleäre Zellen des peripheren Blutes in gesunden Probanten.
Zirkulierende Tumorzellen können im Blut von Patienten mit metastasierten und mit primären
Karzinomen detektiert werden (Christofanilli et al., 2005). Die Autoren merkten an, daß epitheliale Zellen in Gesunden in einem Prozent von 345 Personen auftreten jedoch Zahlen
>3/7,5ml (2000/5l) nicht überschreiten. Terstappen et al.(2000). Fehm et al. (2002) bezeichneten zirkulierende epitheliale Zellen ebenfalls als maligne. Pretlow et al. (2000) zeigte in
seiner experimentellen Arbeit an nackten Mäusen, dass die von Patienten entnommenen und
in die Maus übertragenen ZTZ eines Prostatakarzinoms in den Mäusen Metastasen hervorrufen und somit malignen Charakter haben. Eine Metaanalyse der Detektionsrate der ZTZ zeigt
äußerst unterschiedliche Ergebnisse. Das kann daran liegen, dass das Studiendesign und die
Nachweismethoden uneinheitlich waren. Deswegen wird die Forderung nach Standardisierung der Messmethode immer vordringlicher (Gaforio et al. 2003). Pachmann (Pachmann et
al. 2005) verglichen erstmals die unterschiedlichen Nachweismethoden hinsichtlich der Detektionsraten und konnten in Modelluntersuchungen ähnlich hohe Detektionsraten wie
Christofanilli für die in der vorliegenden Arbeit angewandte Methode nachweisen. Die zum
Teil deutlich höheren Prozentsätze positiver Patientinnen ergeben sich daraus, dass wir auch
bei kleineren Mengen nachgewiesener Zellen keinen Schwellenwert setzen. Zum anderen
wurden die Basiszellzahlen mit zwei Ausnahmen postoperativ erhoben. Die Studienlage zur
perioperativen Einschwemmung von Tumorzellen ist schwierig, da die zumeist älteren Studien nur bedingt mit den aktuellen Daten verglichen werden können. Roger (Roger et al.,
1972) fand Tumorzellen in der die Tumorregion drainierenden Vene. Sellwood (Sellwood
et al.1965), Foss et al. und in Fortsetzung Roger et al. 1972 beschrieben ebenfalls zirkulierende Tumorzellen nach Manipulation. Die Detektionsraten in einem Studienvergleich von
Romsdahl et al., 1965 variierten deutlich. Die Autoren führten dies auf unterschiedliche Krite-
41
rien bei der Diagnose der malignen Zellen zurück. Einigkeit besteht aber in der Tatsache,
dass durch Manipulation (Operation) Tumorzellen eingeschwemmt werden können (Denis et
al. 1996, Eschwege et al. 1995, Hansen et al. 1995, Weitz et al. 1998, Uschikara et al. 2002).
Eine neuere Arbeit von Rolle et al. 2005 zeigt für Bronchialkarzinome, dass präoperativ bei
86 Prozent, zwei und zwanzig Wochen post operationem bei allen Patienten (100 %) zirkulierende epitheliale Zellen aufgefunden wurden. Vor diesem Hintergrund erscheint die postoperative Zellzahlanalyse von besonderer Bedeutung, wenn gleich die präoperative Zellzahlbestimmung den Charakter der Ausgangsanalyse behalten könnte.
Die postoperativ erhobene Basiszellzahlanalyse korreliert bei den hier untersuchten Patientinnen nicht mit dem rezidivfreien Überleben. In der Literatur wird in verschiedenen Fallreporten ( Ashworth 1869, Carey 1976, Myerowitz 1977,Gallivan and Lokisch 1984), aber auch in
Studien das Zirkulieren epithelialer Zellen sowohl beim Mammakarzinom (Terstappen et al
2000, Smith et al. 2000, Stathopoulou et al. 2002) als auch bei anderen Karzinomen ( Thorban
et al 2000, Hoon et al. 2000, de la Taille et al 1999, Okegawa et al. 1999, Ghossein et al. 1997
) mit verkürztem Überleben verknüpft. Pantel K. et al. (2003) hingegen hält die Datenlage der
vorgelegten Studien für nicht ausreichend, um die ZTZ als Prognosefaktor zu etablieren.
Christofanilli (Christofanilli M. et al., 2005) sieht für metastasierte Mammakarzinome eine
Korrelation zwischen der Höhe der Zellzahl und dem rezidivfreien Überleben.
42
6.3. Erste Folgeuntersuchung
Bisher wurde die Wirksamkeit einer adjuvanten Therapie anhand der Tumorprogredienz, dem
rezidivfreien Überleben und dem Gesamtüberleben beurteilt. Zirkulierende Tumorzellen sind
ein neuer Aspekt und könnten die Therapieentscheidungen beeinflussen (Pantel et al., 2003,
Ring et al., 2004), wenn gezeigt werden kann, dass sie das Ansprechen auf die Therapie widerspiegeln. Da wir bei allen Patientinnen solche Zellen nachweisen konnten, war es möglich,
deren Veränderungen im Verlauf der Therapie zu bestimmen.
Unter adjuvanter Therapie änderte sich bei allen Patientinnen die Zellzahl. Bei 65 % sank die
Zellzahl bei 35 % stieg sie an. Terstappen (Terstappen et al., 2000) berichtet für metastasierte
Mamma-Karzinome eine Verbindung zwischen wirksamer Chemotherapie und sinkender
Zellzahl. Der Zellanstieg könnte die Patientinnen widerspiegeln, die auf Chemotherapeutika
vermindert oder gar nicht ansprechen. Nach Christofanilli und Hortobagyi 2001 liegt für
Anthrazykline die Ansprechrate bei 30 - 55 % bei metastasierten Mammakarzinomen. Da
Vergleichsdaten rar sind werden die angewandten Chemotherapeutika einzeln disskutiert.
Bei den beiden Patientinnen, die CMF erhielten, stiegen die Zellzahlen an. Bisher wurde die
Wirksamkeit von CMF anhand der Rezidivrate und dem Gesamtüberleben beurteilt. Nach
Earl und Iddawela 2004 sinkt unter CMF die jährliche Rückfallrate und Todesrate signifikant
bei den unter 50-jährigen Patientinnen. CMF gilt bei Patientinnen mit mehr als 10 befallenen
Lymphknoten als wenig effektiv bis inaktiv (Bonadonna et al. 1995, Levine et al. 1998, Kahlert et al. 2003). Die Bestimmung der ZTZ verdeutlicht diesen Aspekt zusammen mit der Zahl
der befallenen Lymphknoten. Pat. 53 mit 3 befallenen Lymphknoten lebt bis heute rezidivfrei
(allerdings erhielt sie eine weitere Therapie mit einer Reduktion der Zellzahl), Pat. 3 mit 14
befallenen Lymphknoten war nach 596 Tagen metastasiert. Zwei Patientinnen wurden ausschließlich hormonell (Tamoxifen) behandelt. Beim ersten Follow up war bei einer Patientin
die Zellzahl höher als in der Basisanalyse, bei der anderen war sie nicht angestiegen. In der
Literatur wird der Hormoneffekt an die Dauer der Behandlung geknüpft, mit einem optimalen
Ergebnis hinsichtlich der Rezidivfreiheit nach 5jähriger Behandlung (Kahlert et al., 2003).
Die Zellzahl sank bei beiden Patientinnen über den gesamten Beobachtungszeitraum deutlich
ab, bei Patientin 24 waren dabei nach dem ersten Follow up über 3 Zellzahlanalysen hinweg
kein ZTZ nachweisbar. Beide Patientinnen blieben bisher rezidivfrei.
Nach ET und FEC sank die Zellzahl. Nach EC sank in der Mehrheit der behandelten Patientinnen ebenfalls die Zahl der ZTZ, bei zwei Patientinnen stiegen sie allerdings deutlich an.
43
Für Epirubicin (E) einer Strukturmodifikation des ersten Antracyklins Doxorubicin, ist bekannt, dass die Ansprechrate bei ca. 50 Prozent bei metastasierten Mammakarzinomen liegt
(Earl and Iddawela 2004). Für nichtmetastasierte Mammakarzinome sind noch keine Daten
bekannt.
Die Änderung der Zellzahl beim 1. Follow up korrelierte nicht mit der rezidivfreien Zeit oder
dem Gesamtüberleben, Anstieg oder Abfall geben aber Auskunft über die Wirkung der adjuvanten Therapie auf die zirkulierenden Zellen (Ring et al., 2004). Bemerkenswert ist, dass in
der ersten Folgeuntersuchung bei einem Teil der Patientinnen keine zirkulierenden tumorverdächtigen Zellen im periphervenösen Blut nachgewiesen werden konnten. Die angewandte
Nachweismethode erhebt den Anspruch, auch geringste Zellmengen aufzuzeigen (Christofanilli et al., 2004, Ring et al., 2004, Pachmann et al., 2005). In der Basiszellzahlanalyse wurden zudem bei allen Patientinnen ZTZ nachgewiesen, so dass der fehlende Nachweis solcher
Zellen nicht als Schwäche der Methode angesehen werden kann. Vielmehr fragt sich, ob das
Fehlen von Tumorzellen im Blut bedeutet, dass die Patientinnen tumorfrei sind. Patientin 24
war über die letzten drei Analysen hinweg ZTZ negativ und ist bis heute rezidivfrei. Die Patientinnen 52 und 62, ebenfalls mit null ZTZ zur ersten Folgeuntersuchung, wiesen jedoch im
weiteren Verlauf wieder einen Anstieg der Zellzahl auf und metastasierten letztlich. Offensichtlich werden die Zellen soweit reduziert , dass sie auch mit der angewendeten Methode
nicht mehr nachweisbar sind. Der erneute Anstieg der Zahl zirkulierender Zellen könnte bedeuten, dass die Zellen zwar vollständig aus dem Blut entfernt wurden, dann aber möglicherweise wieder Zellen aus okkulten noch nicht nachweisbaren Metastasen erneut ins Blut gelangen. In 10 (13 %) von 77 Analysen (alle Zeitpunkte zusammengenommen) konnten keine
tumorverdächtigen Zellen nachgewiesen werden. Pantel et al. (2003) bezeichnen ”blood only
(as) a temporary compartment”.
Ein zusätzlicher Aspekt ergibt sich, wenn man die Daten der Nachsorgegruppe betrachtet.
Dort wurden bei einer Patientin (Abb.14) mit metastasierten Mamma-Karzinom mit diffuser
Pleurakarzinose zweimal keine zirkulierenden Tumorzellen gefunden. Es handelt sich dabei
um eine Patientin im Alter von 56 Jahren, die Erstddiagnose wurde 1995 gestellt, Tumorstadium T1N0M0. Die Patientin wurde initial mastektomiert und 2003 mit vier Zyklen Epirubicin (90mg) und Cyclophosphamid (600mg), anschließend vier Zyklen Taxol (175mg) therapiert. Im gleichen Jahr wurde eine Pleurakarzinose diagnostiziert. In dieser Situation erfolgte
44
die erste Zellzahlanalyse. Trotz progredientem Leiden (Lungen und Lebermetastasen) blieben
die weiteren zwei Zellzahlanalysen negativ. Möglicherweise wurden in diesem Fall die Zellen
im Blut komplett eliminiert, Tumorzellen aber über direkten Kontakt fortgeleitet.
Abb. 14 Zellzahlverlauf Patientin ID 9
3500000
11.12.1995
Mastektomie
01/03 maligner Pleuraerguß
01-06/03 4 Zyklen EC, 4
Zyklen Taxol
07/03-01/04 Navelbine
01/04 Femara
03.04 Lungen-,
Lymphknoten- und
Lebermetastasen
04/04 Xeloda
3000000
Zellzahl/5l
2500000
2000000
1500000
3000000
1000000
500000
Jan 95
Jan 96
Jan 97
Jan 98
Jan 99
0
Jan 00
0
Jan 01
Jan 02
Jan 03
Jan 04
0
Jan 05
Jahr
Abbildung 14 zeigt den Zellzahlverlauf von Patientin 9 und die vorangegangenen Therapien.
Damit lässt ein einzelner negativer Zellnachweis am vorliegenden Patientengut nicht den
Schluss zu, dass es sich definitiv um Tumorfreiheit handelt. Zu dem gleichen Ergebnis
kamen Pachmann et al. 2004.
45
6.4. Zweite Folgeuntersuchung
Bei der zweiten Folgeuntersuchung, die im Mittel um den 284. postoperativen Tag durchgeführt wurde, änderten sich die erhobenen Zellzahlen erneut. Abhängig vom Bezugspunkt können diese Ergebnisse unterschiedlich interpretiert werden. Wenn die Basiszellzahlanalyse als
Bezugspunkt genommen wird, sank die Zellzahl bei ca. 1/3 der Patientinnen. Aus der Änderung der Zellzahl gegenüber der Basiszellzahl ergab sich kein Bezug zum rezidivfreien Überleben. Dabei darf nicht vergessen werden, dass zwischen diesen Analysezeitpunkten verschiedene Therapieschemata angewendet worden waren. Anders liegen die Verhältnisse,
wenn man die Zellzahlen auf die erste Folgeuntersuchung bezieht, hier stieg die Zellzahl bei
ca. 1/3 der Patientinnen. Bei vier Patientinnen stiegen die Zellzahlen an, drei davon metastasierten später. Interessanterweise erfolgte bei zwei der Patientinnen, die anschließend Metastasen erlitten, der Anstieg unter bzw. nach einer Taxol-Therapie (Abb. 15 und 16), bei der
einen Patientin mit Hirnmetastase trotz einer nachfolgenden Zellzahlreduktion unter Hormontherapie.
des Ausgangswertes
Zellzahländerung in %
Abb. 15 Zellzahlverlauf Patientin ID 62
100000
10000
1000
100
62
EC
10
1
0,1
0,01
Taxol
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
postoperative Tage
Abbildung 15 zeigt den Zellzahlverlauf und die durchgeführten Therapien der Patientin 62 als Prozentuale Änderung gegenüber der Basiszellanalyse.
46
des Ausgangswertes
Zellzahländerung in %
Abb. 16 Zellzahlverlauf PatientinID 52
100000
10000
1000
100
10
1
0,1
0,01
EC
Taxol
52
Hormontherapie
IG
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
postoperative Tage
Abbildung 16 zeigt den Zellzahlverlauf und die durchgeführten Therapien der Patientin 52 als Prozentuale Änderung gegenüber der Basiszellanalyse.
Bei einer Patientin, die ebenfalls metastasierte, stieg die Zellzahl nach der Kombination Epirubicin/Taxol neoadjuvant und nach Operation an (Abb.17).
100000
10000
1000
100
10
1
0,1
0,01
-50
des Ausgangswertes
Zellzahländerung in %
Abb. 17 Zellzahlverlauf PatientinID 17
-125
17
Epi/Taxol
25
100
175
250
325
400
475
postoperative Tage
Abbildung 17 zeigt den Zellzahlverlauf und die durchgeführten Therapien der Patientin 17 als Prozentuale Änderung gegenüber der Basiszellanalyse.
Bei Patientin 11(Abb.18) trat der Zellanstieg nach erfolgter Bestrahlung auf, und fielen unter
nachfolgender Hormontherapie sukzessive ab, sie blieb unter bisher rezidivfrei.
des Ausgangswertes
Zellzahländerung in %
Abb. 18 Zellzahlverlauf Patientin ID 11
100000
10000
1000
100
11
10
1
0,1
0,01
EC
Bestrahlung
Hormontherapie
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
postoperative Tage
Abbildung 18 zeigt den Zellzahlverlauf und die durchgeführten Therapien der Patientin 11 als Prozentuale Änderung gegenüber der Basiszellanalyse.
47
Dabei drängt sich die Frage auf, ob dieser Wiederanstieg der Zellzahl ein tumorbiologisches
Problem ist oder ein Effekt der adjuvanten Therapie im Allgemeinen bzw. Taxol im Besonderen. Wenn es ein tumorbiologisches Problem ist, warum versagt die adjuvante Therapie?
Zum tumorbiologischen Problem beschreibt Doebroessy 1968 (Doebroessy et al., 1968) in
einer experimentellen Studie einen second flow Effekt bei zirkulierenden Tumorzellen (Abb.
19 und 20).
Abbildung19 (Doebroessy et al, 1968)
Abbildung 20 (Doebroessy et al, 1968)
Er hielt dies für eine Eigenschaft der Tumorzellen an sich, da dieser Zellzahlwiederanstieg im
Blut sowohl in der unbehandelten Kontrollgruppe als auch in der mit Chemotherapeutika behandelten Gruppe auftrat. Unter Therapie war der Effekt abgeschwächt und es fanden sich
zum Teil beschädigte Zellen. Er fand, dass dieser secundary outflow in direktem Zusammen-
48
hang mit der Bildung von Metastasen steht. Bei den behandelten Ratten mit dem verringerten
Outflow bildeten sich keine Metastasen.
Auch die Wachstumspotenz der ZTZ könnte von Bedeutung sein. Die adjuvante Chemotherapie greift vor allem Zellen im aktiven Zellzyklus an, ruhende Zellen bleiben relativ unbeeinflusst. Kubens zeigte 2003 (Kubens et al., 2003), dass Tumorzellen, die migrieren und proliferieren, Zellen in der aktiven Phase des Zellzyklus sind. Das gute Ansprechen der Zellen mancher Patientinnen könnte darauf beruhen, dass sich ein Großteil der Zellen im Zellzyklus befindet und damit durch Epirubicin zerstört werden. Der Wiederanstieg der Zellzahlen wäre
dann auf wenige (teilweise nicht mehr nachweisbare) Restzellen zurückzuführen, die in der
Lage sind, wieder rasch zu proliferieren.
Die andere Frage ist die nach dem Wirkungsmechanismus von Taxol (Paclitaxel). Paclitaxel
wird als effektives Medikament in der Krebstherapie bei nichtkleinzelligen Bronchialkarzinomen, Ovarialkarzinomen, Brustkarzinomen und Melanomen beschrieben (Einzig et al.
1991, Forastiere et al 1991, Holmes et al. 1991, Murphy et al.1993, McGuire et al 1996,
Maeno et al 2003). Paclitaxel, isoliert aus der Rinde von Taxus brevifolia und erstmals charakterisiert von Wani et al., 1971, gehört zur Gruppe der Taxane. Es ist bekannt, dass es unter
Taxol Therapieversager gibt (Maeno et al. 2003). Pachmann et al. (2005) konnte in der neoadjuvanten Therapiesituation eindrucksvoll zeigen, dass es unter Taxol zu einem massiven
Anstieg der Zahl zirkulierender Zellen kommt. Griffon-Etienne et al. (1999) zeigte, dass der
erhöhte Tumorinnendruck durch Taxol reduziert wird. Die Patientinnen der Rabensteiner Klinik wurden alle mastektomiert, der Primärtumor ist damit entfernt. Allerdings ist bekannt,
dass selbst kleine Tumore bereits Millionen von Zellen in die Zirkulation abgeben können
(Engers und Gabbert, 1998). Butler und Gullino (Buttler and Gullino, 1975) konnten im
Tiermodel zeigen, dass in 24 Stunden 3,2 Millionen Zellen pro Gramm Tumorgewebe in die
Blutzirkulation eingeschwemmt werden. Diese Zellen können im nachfolgenden Kapillarbett
arretiert werden (Chambers et al., 2000) und ein Teil davon überlebt. Sie könnten ihrerseits,
im Sinne eines Reservoirs Ausgangspunkt für die Erhöhung der Zellzahl sein.
Marcus beschreibt 2005 eine Taxolresistenz durch veränderte Mikrotubuli. Möglicherweise
haben dadurch taxolresistente Zellen einen potentiellen Wachstumsvorteil. Die eigentliche
Ursache der Taxolresistenz ist noch nicht bekannt (Maeno et al 2003). Unser Wissen über die
Wechselwirkungen zwischen Tumor (Metastasen) und Zirkulation ist noch unzureichend.
49
Weitere Untersuchungen über die Änderungen der Zellzahl mit und ohne Therapie werden
neue Einsichten bringen.
Betrachtet man den zeitlichen Aspekt der Wiederanstiege, so stieg die Zahl der ZTZ bei Patientin 17 achtzehn Tage und bei Patientin 52 627 Tage vor der klinischen Diagnose der Metastasen. Wenn sich der Zellwideranstieg in zukunftigen Studien tatsächlich als prognostisch
verwertbarer Marker erweist, wäre ein erheblicher
therapeutischer Gewinn vorstellbar. Ziel ist es, vor
der Metastasierung zu behandeln. Metastasierter
Brustkrebs ist nicht heilbar (Christofanilli et al.,
2005). Zwar ist bisher nicht bekannt, ob eine beAbb. 21 Metastasierungskaskade
(Engers und Gabbert, 1998
stimmte Zahl an ZTZ notwendig ist, um Metastasen
hervorzurufen (Pantel et al. 2003), bei einer stei-
genden Zellzahl ist jedoch die Wahrscheinlichkeit höher, dass eine dieser Zellen dazu in der
Lage ist, sich abzusiedeln. Nach Engers (Engers und Gabbert, 1998) verläuft die Metastasierungskaskade für jede individuelle Tumorzelle nach dem Alles-oder-Nichts-Gesetz (Abb. 21).
Das bedeutet, eine Tumorzelle muss jede einzelne Stufe der Kaskade überleben, um eine Metastase zu bilden. Dies gelingt aber nur einem verschwindend geringen Anteil der Tumorzellen. Die ständige Wiederholung der Kaskade soll, so Engers, die Metastasenentstehung begünstigen. Hier könnte sich der Kreis mit der Theorie von Doebroessy(1968) schließen, der
bei weiteren Kontrollen einen wellenförmigen Verlauf hätte finden müssen. Genau dies bestätigt sich bei Patientinnen dieser Arbeit, die länger beobachtet wurden. Allerdings sind sie
infolge der geringen Patientenzahl zunächst Einzelfallbeispiele ohne Anspruch auf Allgemeingültigkeit. Die Forderung, dass weitere Zellzahlanalysen zur Verlaufskontrolle notwendig sind, erscheint mir wichtig.
50
6.5. Diskussion weitere Zellzahlanalysen
Während man bei der Basiszellzahlanalyse die postoperative Situation analysiert, standen zur
ersten und zweiten Folgeuntersuchung die spezifischen adjuvanten Therapien im Vordergrund. Die, nach der zweiten Folgeuntersuchung durchgeführten Zellahlanalysen, waren im
Wesentlichen von der Fortführung der Hormontherapie beeinflusst oder sind Kontrollen ohne
Therapie. Die Zellzahlen änderten sich zu jeder weiteren Analyse.
Auch wenn die Änderungen noch nicht im Detail verstanden sind, berechtigt allein die Tatsache, dass sich die Zellzahlen sowohl spontan als auch unter Therapie ändern können, ein Monitoring der Zellzahlen anzustreben.
51
7. Schlussfolgerungen
Es wurden 29 Patientinnen im Stadium des nicht-metastasierten Mammakarzinoms untersucht. Bei allen wurden zirkulierende tumorverdächtige Zellen nachgewiesen. Eine Beziehung
zum rezidivfreien Überleben konnte aus der Höhe der Basiszellzahl nicht hergestellt werden.
Unter adjuvanter Therapie änderten sich die Zellzahlen. Die Zellzahlen zur ersten Folgeuntersuchung korrelierten ebenfalls nicht mit dem rezidivfreien Überleben. Der negative Zellnachweis ist nicht gleichbedeutend mit definitiver Tumorfreiheit.
Dagegen könnte dem Zellwiederanstieg nach Chemotherapie im Rahmen der zweiten Folgeuntersuchung eine prognostische Bedeutung zu kommen. Zwar ist die Fallzahl noch zu gering, um allgemeingültige Aussagen treffen zu können, wenn jedoch die Analyse zirkulierender Tumorzellen im periphervenösen Blut als Prognosefaktor etabliert werden kann, so könnte
der zeitliche Gewinn in der Diagnostik, aber auch in der Beeinflussung der Therapiestrategie
enorme Bedeutung erlangen.
Die Änderungen, insbesondere die Zellzahlerhöhungen unter adjuvanter Therapie sind im
Detail noch nicht verstanden. Es bedarf weiterer Studien, um das Potential, dass in der Analyse zirkulierender Tumorzellen steckt, auszuschöpfen.
52
8. Literatur- und Quellenverzeichnis
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9. Anhang
9.1. Bild einer fluoreszierenden Tumorzelle
A n a ly s is o f e p ith e lia l-a n tig e n
p o s itiv e c e lls
Relocalisation of positive cells
-
Abb. 22 Mit freundlicher Genehmigung von Frau Professor Katharina Pachmann
65
9.2. Befundbogen des Transfusionsmedizinischen Instituts Bayreuth
66
9.3. Danksagung
Ich danke allen Familienmitgliedern, Kollegen, Freunden und Mitmenschen, die mir durch
ihre Geduld, ihren Ansporn und auch durch ihre Kritik halfen, diese Arbeit voran zu bringen.
Besonderer Dank gebührt Herrn Dr. med. K. Lobodasch, der als Klinikvorstand der Frauenklinik des DRK-Krankenhauses Chemnitz-Rabenstein durch seinen Weitblick, Zellzahlanalysen neben dem klinischen Routineprogramm eines kleinen Krankenhauses durchzuführen, die
Planung dieser Arbeit überhaupt ermöglichte und mir stets in allen Fragen zur Seite stand.
Besonderer Dank gebührt Frau Prof. Dr. med. Katharina Pachmann für die großartige Betreuung während der gesamten Zeit. Ihre Begeisterung trieb mich stets voran und ihr wissenschaftlicher Beistand ließ mich nie vom Weg abkommen.
Bedanken möchte ich mich bei meiner Ehefrau Mandy und unserem Sohn Tim, die in den
letzten drei Jahren stets zu mir standen auch wenn ich die ohnehin knapp bemessene gemeinsame Freizeit oft dem Gelingen dieser Arbeit widmete.
67
9.4. Lebenslauf
Frank Fröhlich
geboren am 27. Juli 1968 in Burgstädt
1975 – 1985 Polytechnische Oberschule Pestalozzi Limbach - Oberfrohna
1985 – 1987 Erweiterte Oberschule Ernst Thälmann Limbach - Oberfrohna
1987
Abitur
1988 – 1994 Studium der Medizin an der Universität Greifswald
1994
Hochschulabschluss an der Universität Greifswald
1994 – 1996 Pflichtassistenz und Arzt im Praktikum am Stadtkrankenhaus Limbach –
Oberfrohna
1996 – 2000 Facharztausbildung zum Facharzt für Anästhesie am DRK Krankenhaus Chemnitz - Rabenstein
2000
Facharztprüfung
2000 – heute tätig als Facharzt für Anästhesie am DRK Krankenhaus Chemnitz - Rabenstein
Limbach – Oberfrohna, 01. Juni 2005
68
9.5. Ehrenwörtliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass mir die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität bekannt ist,
ich die Dissertation selbst angefertigt habe und alle von mir benutzten Hilfsmittel, persönlichen Mitteilungen und Quellen in meiner Arbeit angegeben sind,
mich folgende Personen bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskripts unterstützt haben: Prof. Dr. med. Katharina Pachmann,
die Hilfe eines Promotionsberaters nicht in Anspruch genommen wurde und dass Dritte weder
unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen von mir für Arbeiten erhalten haben, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen,
dass ich die Dissertation noch nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder andere wissenschaftliche Prüfung eingereicht habe und
dass ich die gleiche, eine in wesentlichen Teilen ähnliche oder eine andere Abhandlung nicht
bei einer anderen Hochschule als Dissertation eingereicht habe.
Limbach – Oberfrohna, 01. Juni 2005
69