Korrelation von Apoptose- und Proliferationsrate mit der

Aus der
Urologischen Klinik
des Marienhospital Herne –Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. J. Noldus
Korrelation von Apoptose- und Proliferationsrate mit der
Telomeraseaktivität in Prostatakarzinomzellen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Marc Eric Stranghöner
aus Bielefeld
2008
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. J. Noldus
Korreferent: Prof. Dr. med. A.Tannapfel
Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2008
2
Abstract
Stranghöner
Marc
Korrelation von Apoptose- und Proliferationsrate mit der Telomeraseaktivität in Prostatakarzinomzellen
Problem: Das Prostatakarzinom gehört neben den Malignomen der Lunge und des Dickdarms zu den häufigsten Krebserkrankungen des Mannes. Aufgrund der zunehmenden Bedeutung des Prostatakarzinoms ist es
erforderlich, die Mechanismen des Tumorwachstums besser zu verstehen, um Ansätze für neue Therapieoptionen zu entwickeln. Seit Jahren sind die Ursachen für unkontrolliertes Zellwachstum Gegenstand der Forschung. Ein möglicher Erklärungsansatz eröffnete sich durch die Entdeckung des Enzyms Telomerase. In
dieser Dissertation soll untersucht werden, ob eine Korrelation zwischen Telomeraseaktivität und Proliferations- bzw. Apoptoseverhalten in Prostatakarzinomgewebe in Abhängigkeit von Tumorstadium und Differenzierungsgrad (Grading) bzw. Gleason score besteht. Des Weiteren soll diskutiert werden, ob sich aus den
Ergebnissen klinische Konsequenzen für das Prostatakarzinom ergeben.
Methode: Das im Rahmen dieser Arbeit verwendete Prostatagewebe aus der Tumorbank der Urologischen
und Neurourologischen Klinik der Ruhr-Universität-Bochum, Marienhospital in Herne wurde unmittelbar
nach radikaler Prostatektomie in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Ein weiterer Teil wurde unfixiert tiefgefroren. Es standen Proben von 52 Patienten zur Verfügung. Zur Quantifizierung apoptotisch sterbender Epithelzellen wurden Paraffinschnitte mit dem „Terminale Transferase Assay“ zum Nachweis der
spezifischen DNA-Doppelstrangbrüche aufgearbeitet. Es erfolgte die Bestimmung von proliferierenden Zellen mit dem Antikörper MIB-1. Beim Nachweis der Telomeraseaktivität wurden die von der Telomerase
hergestellten Produkte (Telomerleitern) zunächst mit Hilfe einer PCR amplifiziert, um anschließend in einem
ELISA nachgewiesen zu werden. Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Statistikprogramm
SPSS (Statistical Package for the Social Sciences). Als deskriptive Maße dienten Mittelwert± Standardabweichung und der Wertebereich der erhobenen Variablen. Zur Analyse von bivariaten Zusammenhängen wurden
Produktmomentkorrelationskoeffizienten (Pearson‘r) verwendet.
Ergebnis: Die Proliferationsrate lag im Mittel bei 3,3±3,4%. Nur zwei Tumore zeigten eine normale Proliferationsrate < 0,2 %. Die Proliferationsrate nahm mit dem Tumorstadium signifikant zu (r = 0,343). Der Zusammenhang zwischen Grading und Gleason-Score war nicht signifikant. Die Apoptoserate zeigte keinen
signifikanten Zusammenhang zum Tumorstadium, dem Grading, dem Gleason Score oder der Proliferationsrate. Telomeraseaktivität war in allen Gewebeproben nachweisbar. Sie lag im Mittel bei 0,56±0,39.
24 Tumore wiesen eine Aktivität zwischen >0,20 und 0,50 auf. In der univariaten Analyse wies die Telomeraseaktivität signifikante Zusammenhänge mit dem Tumorstadium (r = 0,434), dem Grading (r = 0,323) und
der Proliferationsrate (r = 0,428) auf, nicht jedoch mit dem Gleason-Score und der Apoptoserate. In der multivariaten Regression unter Einschluss von Tumorstadium, Grading, Gleason Score, Proliferations- und
Apoptoserate zeigten nur die Proliferationsrate und das Staging einen unabhängigen signifikanten Zusammenhang mit der Telomeraseaktivität (standardisiertes ß = 0,415 für die Proliferationsrate, ß = 0,296 für das
Staging). Die univariat festgestellte Korrelation der Telomeraseaktivität mit dem histologischen Grading war
unter Berücksichtigung der übrigen Parameter gerade eben nicht mehr signifikant nachweisbar.
Diskussion: Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Telomerase ein entscheidendes Schlüsselenzym in der Beeinflussung des zellulären Fließgleichgewichts ist. Mit zunehmender Proliferationsrate
nimmt die Telomeraseaktivität zu. Eine positive Korrelation besteht auch zwischen der Telomeraseaktivität
und dem Tumorstadium. Unterschiedliche Arbeitsgruppen konnten mit der Hemmung der Telomeraseaktivität eine Hemmung des Zellwachstums und ein Zell-Zyklus-Arrest erreichen. Zusammenfassend lässt sich die
Reaktivierung der Telomeraseaktivität als ein Baustein der zellkinetischen Veränderungen beim Tumorwachstum und somit als eine von vielen vorstellbaren Therapieansätzen bei der Behandlung epithelialer Tumoren
herausstellen.
3
Inhaltsverzeichnis
I EINLEITUNG
6
I.1 Anatomie der Prostata
I.1.1 Makroskopie
I.1.2 Gliederung der Prostata nach embryologischen, topographischen und
pathologischen Gesichtspunkten
I.1.3. Histologie und hormonelle Regulation der Prostata
I.1.4 Leitungsbahnen
7
7
8
10
13
I.2 Prostatakarzinom
I.2.1 Epidemiologie und Ätiologie des Prostatakarzinoms
I.2.2 Manifestationsformen des Prostatakarzinoms
I.2.3 Pathogenese des Prostatakarzinoms
I.2.4 Histologie des Prostatakarzinoms
I.2.5 Diagnostik des Prostatakarzinoms und TNM-Klassifikation
13
13
14
15
16
17
I.3 Apoptose und Telomerase
I.3.1 Apoptose
I.3.1.1 Allgemeines
I.3.1.2 Morphologische und biochemische Veränderungen während der
Apoptose
I.3.1.3 Regulation der Apoptose
I.3.2 Telomerase
I.3.2.1 Telomere
I.3.2.2 Telomerase
22
23
23
II MATERIAL UND METHODE
29
II.1 Material
II.1.1 Chemikalien
II.1.2 Lösungen
II.1.3 Geräte
29
29
30
31
24
25
26
26
27
II.2 Methoden
32
II.2.1 Herkunft des Prostatakarzinomgewebes
32
II.2.2 Immunzytochemie
32
II.2.2.1 Vorbereitung der Paraffinschnitte für die Färbungen
32
II.2.2.2 Färbemethode zur Bestimmung von proliferierenden Zellen mit dem
Antikörper MIB-1
33
II.2.3 Färbemethode der Apoptose mittels terminaler Transferase
36
II.2.4 Auswertung der Gewebeschnitte
37
II.3 Aktivitätsbestimmung der Telomerase
II.3.1 Geräte
II.3.2 Chemikalien
II.3.3 Zellen und Gewebe
II. 3.3.1 Humanes Prostatagewebe
II.3.4 Methoden
II.3.4.1 Herstellung eines Zellysates aus Prostatagewebe
II.3.4.2 Proteinbestimmung
39
39
39
40
40
40
40
41
4
II.3.4.3 Bestimmung der Telomeraseaktivität
II.3.4.3.1 Herstellung von DEPC-behandeltem Aqua destillata
II.3.4.3.2 Telomerase-PCR ELISA
41
41
42
II.4 Statistische Auswertung
43
III ERGEBNISSE
44
III.1 Tumorstadien und Grading
44
III.2 Proliferationsrate
46
III.3 Apoptoserate
49
III.4 Telomeraseaktivität
54
III.5 Zusammenhänge zwischen der Telomeraseaktivität und den anderen
Tumorparametern
55
III.5.1 Zusammenhang der Telomeraseaktivität mit Tumorstadium, Grading und
Gleason Score
55
III.5.2 Zusammenhang der Telomeraseaktivität mit Proliferations- und
Apoptoserate
58
III.5.3 Zusammenhang der Telomeraseaktivität mit Proliferations- und
Apoptoserate unter Berücksichtigung von Tumorstadium, Grading und Gleason
score
60
III.6 Zusammenfassung der Ergebnisse
61
IV. DISKUSSION
62
V. ZUSAMMENFASSUNG
74
VI. LITERATURVERZEICHNIS
76
5
I Einleitung
In der Bundesrepublik Deutschland erkranken jährlich mehr als 30.000 Männer an
einem Prostatakarzinom. Damit zählt das Prostatakarzinom neben den Malignomen der Lunge und des Dickdarms zu der häufigsten Krebserkrankung des Mannes. Untersuchungen des Tumorregisters München haben gezeigt, dass sich die
Inzidenz des Prostatakarzinoms in der männlichen Bevölkerung in den letzten
Jahren verdoppelt hat [76].
Im Zeitraum von 1987-1989 wurde im Tumorzentrum München eine Prostatakarzinom-Inzidenz von 50,5 Männer/100.000 Einwohner registriert, 1996-1998 lag
die Inzidenz bei 100,9/100.000. Demgegenüber hat sich die Mortalität in diesem
Zeitraum nicht verändert und betrug je 100.000 Einwohner 30,3 (1987-1989) bzw.
30,6 (1996-1998) [57, 76]. Im Jahr 2000 betrug die Inzidenz des Prostatakarzinoms in Deutschland etwa 90/100.000 bei einer Mortalitätsrate von 25/100.00
Einwohner/Jahr [49].
Nach neueren Daten verzeichneten die Krebsregister in Deutschland im Jahr 2002
unter 100.000 Männern zwischen 45 und 59 Jahren rund 66 Erkrankungsfälle. In
der Altersgruppe der 60- bis 74Jährigen waren bereits rund 430 von 100.000
Männern betroffen. Diese Erkrankungsrate verdoppelte sich für die über
75jährigen sogar noch einmal [31].
In Abhängigkeit von Alter des Patienten und jeweiligem Tumorstadium haben
sich drei Therapieoptionen beim Prostatakarzinom bewährt: Hierzu gehören die
radikale Prostatektomie, die Strahlentherapie und die Androgendeprivation
[58].Alternativ kann auch ein abwartendes Kontrollieren (watchful waiting) indiziert sein.
Aufgrund der zunehmenden Bedeutung des Prostatakarzinoms, ist es erforderlich,
die Mechanismen des Tumorwachstums besser zu verstehen, um Ansätze für neue
Therapieoptionen zu entwickeln.
Berges et al. konnten zeigen, dass in normalem Prostatagewebe nur eine sehr
niedrige Proliferationsaktivität besteht [5]. Die Zellen stehen zudem in einem ausgeglichenen Aktivitätsverhalten, d.h. Proliferation und programmierter Zelltod
stehen in einem Gleichgewicht. Mit zunehmender Transformation der Zellen wird
dieses Gleichgewicht gestört. Es kommt zu einem Wachstumsüberhang.
6
Seit Jahren sind die Ursachen für unkontrolliertes Zellwachstum Gegenstand der
Forschung. Ein möglicher Erklärungsansatz eröffnete sich durch die Entdeckung
des Enzyms Telomerase. Diese wurde zunächst in primär unsterblichen Zellen
(Keimzellen) oder durch Mutation nachträglich unsterblich gewordener Zellen
(Tumorzellen) nachgewiesen. Heute ist bekannt, dass die Telomerase eine entscheidende Rolle bei Alterung (Seneszenz) und Tod, aber auch bei der Immortalität von Zellen spielt. Ist das Fließgleichgewicht zwischen proliferierenden und
sterbenden Zellen einmal gestört, kann es zu einer Nettozunahme an Zellen und
somit zum Tumorwachstum kommen. Eine medikamentöse Hemmung der Telomerase stellt daher einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms dar.
In dieser Dissertation soll untersucht werden, ob eine Korrelation zwischen Telomeraseaktivität bzw. Proliferations- und Apoptoseverhalten in Prostatakarzinomgewebe in Abhängigkeit von Tumorstadium und Differenzierungsgrad (Grading)
bzw. Gleason score besteht.
Des Weiteren soll diskutiert werden, ob sich aus den Ergebnissen klinische Konsequenzen für das Prostatakarzinom ergeben.
I.1 Anatomie der Prostata
I.1.1 Makroskopie
Die Prostata (Vorsteherdrüse) ist ein etwa 3 cm langes, 4 cm breites und 2 cm
dickes, kastaniengroßes Organ. Sie wiegt bei jugendlichen Erwachsenen ca. 20 g
und ist somit die größte akzessorische Drüse. An ihrer nach oben gerichteten Basis ist die Prostata mit dem Blasenboden verbunden und hat hier ihren größten
Durchmesser. Nach kaudal verjüngt sich die Drüse; sie hat somit eine konische
Form.
Die nach unten gerichtete Spitze (Apex) reicht bis zum Diaphragma urogenitale.
Die Ampulle des Rektums liegt ihrer Facies posterior durch ein rektovesikales
Septum getrennt von dorsal an. Das Ligamentum puboprostaticum fixiert die Facies anterior ventral am Schambein [40].
Die Harnröhre verläuft durch die Prostata (Pars prostatica urethrae). Die Ductus
ejaculatorii erstrecken sich vom hinteren oberen Rand in die Prostata und ziehen
7
in einem Winkel von 40° schräg nach vorn unten. Sie münden auf dem Colliculus
seminalis.
Nach außen ist die Prostata von der festen, bindegewebigen Capsula prostatae
umhüllt, die viele glatte Muskelzellen, z.T. auch quergestreifte Muskulatur
enthält. Im Bereich des neurovaskulären Bündels, der Apexregion und des Blasenausgangs fehlt diese Kapsel, was einerseits die extraprostatische Ausdehnung
des Prostatakarzinoms begünstigt (Loci minoris resistentiae), andererseits die Beurteilung, inwieweit ein Tumor bereits die Organgrenzen überschritten hat, erschwert oder unmöglich macht [9].
Im fibromuskulären Stroma der Prostata findet man 30-50 tubuloalveoläre Drüsen, die mit 15-30 Öffnungen in die Harnröhre münden [40].
I.1.2 Gliederung der Prostata nach embryologischen, topographischen und
pathologischen Gesichtspunkten
Innenzone
Außenzone
Urethra
Periurethrale Mantelzone
Abb.1: Querschnitt durch die Prostata eines 27jährigen Mannes [40]
Die zentrale Zone macht ca. 25% des glandulären Prostataparenchyms aus und
bildet ein konusförmiges Areal zwischen Blasenausgang, Ductus ejaculatorii und
proximalem Urethrasegment. Histologisch erinnert die zentrale Zone an die
8
Samenblase und besteht aus großen Drüsen und Gangstrukturen mit kompaktem
muskulären Stroma. Das Epithel der zentralen Zone ist komplex aufgebaut mit
papillären und kribriformen Proliferationen, z.T. basophilem Zytoplasma, leicht
verschobener Kern-Plasma-Relation. Daher kann es leicht mit der prostatischen
intraepithelialen Neoplasie verwechselt werden [9].
Die Transitionalzone umfaßt das periurethrale Drüsenparenchym im Bereich des
proximalen
Urethrasegmentes
und
liegt
überwiegend
entstehen
die
meisten
vor
der
Urethra
(anterolaterale Zone) [9].
In
der
Transitionalzone
Formen
der
benignen
Prostatahyperplasie. Der Home´sche Mittellappen resultiert aus einer Hyperplasie
periurethraler Drüsen, die hinter dem proximalen Urethrasegment liegen.
Die periphere (posterolaterale) Zone bildet die Hauptmasse der Prostata (70%),
umfaßt die Hinter- und Seitenlappen, die Apexregion und umschließt
hufeisenförmig die Transitionalzone [9].
In der folgenden Tabelle ist die zonale Gliederung der Prostata in Bezug zur Embryologie und zur Anatomie dargestellt.
Tab.1: Zonale Gliederung der Prostata: Embryologie und Anatomie [9]
Transitionalzone
Periphere Zone
Sinus urogenitalis
Sinus urogenitalis
25%
5%
70%
Proximales
Proximales Segment
Distales Segement
Konus zwi-
Antero-zentral (PS),
Postero-lateral, apikal
schen PS und
periurethral (PS)
Embryonaler Urs- Wolff-Gang
prung
Volumenanteil
(normale Prostata)
Anatomie:
Bezug zur Urethra
Segment (PS)
Lagebeziehung
Ductus ejaculatorius
Epithel
Komplex, dun-
Einfach, hellzellig
Einfach, hellzellig
9
kelzellig
Stroma
Kompakt (mus- Kompakt
kulär)
Locker
(fibro-muskulär)
I.1.3. Histologie und hormonelle Regulation der Prostata
Das Epithel der 30-50 tubuloalveolären Drüsen ist uneinheitlich. Meist ist es einschichtig hochprismatisch, kann aber auch mehrschichtig oder mehrreihig sowie
in Gebieten mit weitem Lumen platt und kubisch sein [44].
Die hochprismatischen Zellen stellen die eigentlichen Drüsenzellen dar. Sie
enthalten in der apikalen Region zahlreiche Sekretgranula, die an der Zelloberfläche abgegeben werden.
An der Basalmembran liegen zwischen den hochprismatischen Drüsenzellen sogenannte Basalzellen. Es handelt sich hierbei um Vorläuferzellen der Drüsenzellen, die der Erneuerung des Prostataepithels dienen [40].
Abb.2: Prostata. HE-Färbung. Vergr. 300-fach [44]
Das Prostataepithel besteht aus drei Zelltypen, die sich in ihrer hormonellen Regulation und Markerexpression unterscheiden. Das sekretorische Epithel, also die
Drüsenepithelzellen, ist androgenabhängig und exprimiert verstärkt Androgenrezeptoren. Die Basalzellen sind androgenunabhängig und exprimieren z.T. Östro10
gen- und Progesteronrezeptoren. Nur der sekretorische Typ enthält das Prostataspezifische-Antigen (PSA) und die saure Phosphatase. Die Basalzelle ist negativ
für diesen Marker und exprimiert hochmolekulare Zytokeratine.Hierzu gehören
die Expression von Bcl-2 als Apoptosesuppressor als auch Wachstumsregulatoren
wie EGF-R, erbB-2, erbB-3 und HSP-27 [11].
Der dritte Phänotyp zeigt eine neuroendokrine Differenzierung, die mit Chromogranin A und anderen endokrinen Markern nachweisbar ist [9].
Zwischen den verschiedenen Zelltypen des Prostataepithels bestehen morphogenetische Beziehungen. Die größte Differenzierungspotenz besitzen Basalzellen,
aus denen alle Zelltypen des Prostataepithels über intermediäre Differenzierungsformen entstehen. Das Proliferationskompartiment des normalen und hyperplastischen Prostataepithels liegt in der Basalschicht. Etwa 70% der proliferierenden
Epithelzellen exprimieren Basalzell-spezifische Zytokeratine und sind phänotypisch Basalzellen. Die restlichen 30% befinden sich im sekretorischen Epithel [9].
Der programmierte Zelltod wird androgen reguliert und findet ausschließlich im
sekretorischen Epithel statt. Das mitochondriale Onkoprotein Bcl-2, ein potenter
Suppressor des programierten Zelltods, wird ausschließlich in den Basalzellen
exprimiert, wo das Proliferationskompartiment vor dem apoptotischen Tod geschützt wird [9, 34].
Im sekretorischen Epithel wird Bcl-2 nicht exprimiert. Diese Zellen sterben nach
terminaler Differenzierung ab und werden durch regenerierende Basalzellen ersetzt.
Somit liegt die Vermutung nahe, dass sich Prostatastammzellen in der Basalzellschicht befinden [9].
Die Basalzellschicht ist in ihrer Funktion androgenunabhängig und wird nach Östrogengabe oder Androgenentzug hyperplastisch. Zirkulierende Androgene sind
jedoch an der Regulation der Basalzelle beteiligt. Die Basalzellschicht enthält
nicht nur Androgenrezeptoren, sondern exprimiert auch vorzugsweise die 5-αReduktase. Durch dieses Enzym im Androgenstoffwechsel entsteht in der Zielzelle das biologische aktive Dihydrotestosteron (DHT), das mit hoher Affinität an
den Androgenrezeptor bindet. Somit können bestimmte Basalzellpopulationen auf
zirkulierende Androgene reagieren und die androgene Stimulation einen Differenzierungswandel zum sekretorischen Zelltyp auslösen [9].
11
Neben den Androgenen und Östrogenen sind auch nichtsteroidale Wachstumsfaktoren an der Proliferation der Basalzellschicht beteiligt. Der epidermale Wachstumsfaktor EGF, der vorzugsweise im sekretorischen Epithel gebildet wird, ist
ein potentes Mitogen für das Prostataepithel. EGF bindet an entsprechenden Rezeptoren der Basalzellschicht und führt die Proliferation der Basalzellen herbei
[59, 12].
12
I.1.4 Leitungsbahnen
Die Prostata wird von dorsal und lateral durch die Äste der A. rectalis media und
der A. vesicalis inferior versorgt. Ventral enthält sie Äste der A. pudenda interna.
Gelegentlich ist eine Mitversorgung der Drüse durch die A. obturatoria zu beobachten.
Venös ist die Vorsteherdrüse über den Plexus vesicoprostaticus, über die Vv. vesicales an die V. iliaca interna angeschlossen.
Die Lymphbahnen der Prostata folgen den versorgenden Arterien und schließen
sich dem Ductus deferens an. Verbindung besteht zu Lymphbahnen der Harnblase
und des Rektums. Regionäre Lymphknotenstationen sind die Nodi lymphatici
iliaci externi und interni.
Die nervale Versorgung der Drüse kommt von Sakralnerven der Segmente S3 und
S4 über den Plexus pelvicus. Die Kapsel der Prostata enthält Ganglienzellen, sensible Nervenendigungen und VATER-PACINIsche Körperchen [40].
I.2 Prostatakarzinom
I.2.1 Epidemiologie und Ätiologie des Prostatakarzinoms
Die Inzidenz des Prostatakarzinoms beträgt in Deutschland etwa 90/100.000 bei
einer Mortalitätsrate von 25/100.00 Einwohner/Jahr. Für das Jahr 2000 wurde für
Deutschland die Zahl an Neuerkrankungen auf 40.000 geschätzt; damit ist das
Prostatakarzinom die häufigste Krebserkrankung des Mannes und darüber hinaus
auch die dritthäufigste Krebstodesursache [49].
In den meisten Fällen tritt das Prostatakarzinom sporadisch auf, d.h. in einer Familie ist lediglich ein Angehöriger an einem Prostatakarzinom erkrankt. Eine familiäre Häufung des Prostatakarzinoms wurde jedoch seit 1956 wiederholt beschrieben.
Merkle und Mitarbeiter konnten zeigen, dass Brüder von Prostatakarzinompatienten, die im 7. Lebensjahrzehnt erkranken, eine viermal höhere Inzidenz aufwiesen,
an einem Prostatakarzinom zu erkranken, als Männer im gleichen Alter ohne familiäre Vorgeschichte eines Prostatakarzinoms [55]. Smith et al. fanden auf dem
13
Chromosom 1 genetische Veränderungen bei einem familiären Prostatakarzinom
und benannten die Region HPC 1 (human prostate cancer 1). Allerdings sollen nur
3% der Prostatakarzinome vererbbar sein. Durch zytogenetische Untersuchungstechniken gelang der Nachweis von Defekten der Chromosome 7, 10 und 16 [69].
Für die Karzinomentstehung werden neben dem Alter und der ethnischen Zugehörigkeit auch Ernährungsgewohnheiten verantwortlich gemacht. Zwischen 10 und
70% aller Karzinomerkrankungen sollen auf Ernährungsgewohnheiten zurückzuführen sein [25, 35, 46]. Ist die Ernährung in den westlichen Industrieländern eher
durch einen hohen Gehalt an tierischen Fetten gekennzeichnet, steht in den asiatischen Ländern der Verzehr von Früchten und Gemüse im Vordergrund [35].
Mit der Aufnahme von tierischem Fett ist ein erhöhtes Risiko für die Entstehung
des Prostatakarzinoms verbunden, während Fettsäuren aus Fischöl eher einen protektiven Effekt besitzen [35, 36, 43]. Weitere protektive Substanzen sollen z.B.
Phytoöstrogene (enthalten in verschiedenen Gemüsearten, Getreidefrüchten), Vitamin E, Vitamin D und Selen sein [35].
I.2.2 Manifestationsformen des Prostatakarzinoms
Das Prostatakarzinom manifestiert sich klinisch in unterschiedlicher Form.
So unterscheidet man inzidentelle von latenten, okkulten oder klinisch manifesten
Prostatakarzinomen [55]
Zu den klinisch diagnostizierten Karzinomen gehören die inzidentellen Prostatakarzinome, die bei unauffälligem Primärbefund zufällig im Rahmen der histologischen Untersuchung der Präparate nach transurethraler Resektion oder transvesikaler Prostatektomie aufgrund einer klinisch diagnostizierten benignen Prostatahyperplasie gefunden werden und meist gut differenziert sind [57]
Sehr selten ist das okkulte Prostatakarzinom, das bei klinisch unbekanntem Primärtumor aufgrund der histologischen Untersuchung von Metastasen diagnostiziert wird [57].
Das klinisch manifeste Prostatakarzinom fällt klassischerweise durch einen rektal
palpablen Tumor z.B. im Rahmen einer Vorsorgeuntersuchung auf [57].
Neben den klinisch signifikanten Tumoren kommen in der Prostata so genannte
latente Tumoren vor, die durch ein geringes Tumorvolumen und durch einen
überwiegend guten Differenzierungsgrad charakterisiert sind. Diese Tumoren
werden praktisch nur im Rahmen sorgfältiger Autopsiestudien entdeckt [57].
14
Durch die in der Vorsorge bestehende Kombination aus digital-rektaler Untersuchung, Endosongraphie der Prostata und PSA-Wert-Bestimmung haben die Prostatakarzinome durch Erhöhung des PSA-Wertes ohne pathologischen digitalen
oder endosongraphischen Befund einen besonderen Stellenwert bekommen. Prostatakarzinome die lediglich aufgrund eines erhöhten PSA-Wertes ermittelt werden, werden als pT1c Tumoren klassifiziert.
I.2.3 Pathogenese des Prostatakarzinoms
Das Prostatakarzinom entwickelt sich zu 70-80% in der peripheren (posterolateralen) Zone, seltener mit ca. 20-25% in der Transitionalzone und nur zu 5% in der
zentralen Zone [9].
Die prämalignen Vorläufer werden unter dem Begriff „Prostatische intraepitheliale Neoplasie“ zusammengefasst.
Man unterscheidet zwischen Low-grade (LGPIN) und High-grade-(HGPIN) PIN.
LGPIN ist eine mögliche Vorstufe von HGPIN. Ob aus LGPIN Prostatakarzinome
entstehen können, ist unklar.
HGPIN entsteht typischerweise in der peripheren Zone und ist ein Vorläufer der
Prostatakarzinome der Kategorie Gleason ≥ 6. Ein möglicher Vorläufer der hochdifferenzierten Prostatakarzinome (Gleason2-5) ist die atypische adenomatöse
Hyperplasie (AAH). HGPIN verursacht keine PSA-Erhöhung und erzeugt keinen
suspekten Ultraschall- bzw. Tastbefund.
Tab.2: Morphogenese der benignen Prostatahyperplasie und des Prostatakarzinoms [9]
Pathologie
Zentrale Zone
Benigne Prostatahy- sehr selten
Transitionalzone
Periphere Zone
Häufig
Selten
Selten
häufig
perplasie und Varianten
Atrophie und postat- sehr selten
rophe Hyperplasie
15
Prostatische intrae-
5%
20%
75%
5%
25%
70%
pitheliale Neoplasie
Prostatakarzinom
Bei der malignen Transformation verlagert sich die Proliferationsaktivität aus dem
Proliferationskompartiment (Basalzellschicht) in das Differenzierungskompartiment (sekretorisches Epithel). Ein Grund für diese Proliferationsstörung soll eine
Überexpression von Wachstumsfaktoren sein. Ferner kommt es zu einer Blockade
des programmierten Zelltodes über eine Bcl-2-Überexpression infolge der verminderten Androgenrezeptivität des dysplastischen Epithels [9, 10]. Nach dem
Stammzellmodell entsteht das Prostatakarzinom nicht aus dem sekretorischen
Epithel, sondern aus transformierten Stammzellen in der Basalzellschicht. Die
transformierten Zellen verlieren über den Verlust von Adhäsionsmolekülen (z.B.
Cadherine) den Halt im Zellverband und können sich aus diesem lösen. Die so
veränderten Zellen bilden bei der Stromainvasion eine neue Basalmembranähnliche Matrix, die ihnen den Weg durch die Grundsubstanz ebnet.
Dieser Prozess gilt als Voraussetzung für das Fortschreiten des Prostatakarzinoms
und letztlich für dessen Metastasierungsfähigkeit [9, 11].
I.2.4 Histologie des Prostatakarzinoms
In 95-97% aller Prostatakarzinome handelt es sich um azinäre Adenokarzinome.
Diese gehen vom Epithel der Azini und terminalen Gänge aus. Die azinären Adenokarzinome zeigen große Unterschiede in Struktur und Zytologie und weisen
auch ein unterschiedliches biologisches Verhalten auf. In Adenokarzinomen
kommen hauptsächlich 3 Zelltypen vor: helle (klare) Zellen, dunkle Zellen und
eosinophile Zellen [8, 57]. Als Teilkomponente können sich auch neuroendokrine
Zellen finden. Sie erklären seltene paraneoplastische Syndrome und bedeuten im
individuellen Fall eine schlechtere Prognose [57].
16
Die prostatische intraepitheliale Neoplasie, „high Grade“ (HGPIN) ist der wichtigste prämaligne Vorläufer des Prostatakarzinoms. Entstehungsort sind meistens
die nicht-hyperplastischen duktuloazinären Strukturen der peripheren Zone. Seltener mit 5-20% finden sich die HGPIN in der zentralen und in der Transitionalzone
[9].
HGPIN-Läsionen zeigen charakteristischerweise Kernveränderungen, wie sie gewöhnlich nur im gering differenzierten Prostatakarzinom beobachtet werden.
Die klinische Bedeutung von HGPIN liegt in der hohen prädiktiven Aussagekraft
über das Vorliegen eines Karzinoms. Wird in einer tumorfreien Stanzbiopsie
HGPIN diagnostiziert, dann findet man in mehr als 35% der Fälle ein Prostatakarzinom in der nachfolgenden Biopsie. Es gibt prämaligne Proliferationsstörungen,
wobei nur 10% der proliferierenden Zellen noch im Proliferationskompartiment
zu finden sind. Es kommt zu einer Proliferationszonenverschiebung nach luminal
in das Differenzierungskompartiment. Ebenfalls wird die Expression von Bcl-2
nach luminal verschoben, gleichbedeutend mit einer Unterdrückung des programmierten Zelltodes. Einige Wachstumsfaktoren, die üblicherweise in der Basalzellschicht exprimiert werden, werden nun auch zunehmend im sekretorischen
Epithel gebildet, was die enge Beziehung zwischen HGPIN und dem Prostatakarzinom erhärtet [9]. Eine Sonderstellung innerhalb der histologischen Diagnose des
Prostatakarzinoms nehmen die sogenannten atypical small acinar proliferation in
the Prostate (ASAP) ein. Aus einer Unsicherheit bei herdförmig erfassten Karzinomherden entstand der Begriff ASAP. Darunter versteht man eine atypische
mikroazinäre Läsion, die zwar verdächtig, aber nicht beweisend für ein Prostatakarzinom ist. Der histopathologische Befund eines ASAP erfordert immer die
Rebiopsie [19, 23, 47].
I.2.5 Diagnostik des Prostatakarzinoms und TNM-Klassifikation
Obligate Voraussetzung jeder Therapie ist die histologische Sicherung des Prostatakarzinoms.
Die
Verdachtsdiagnose
kann
aufgrund
einer
PSA-
Serumkonzentration und eines auffälligen Befundes bei der digitorektalen Palpation und der transrektalen sonographie gestellt werden. Die endgültige Diagnose
17
und das Grading mittels Gleason-Score erfordern aber immer eine histologische
Analyse.
Die überwiegende Mehrzahl der Karzinome ist in der peripheren Zone lokalisiert
und kann mittels digitorektaler Palpation erst bei einem Volumen >0,2ml erfasst
werden. Das Tumorrisiko bei positivem Palpationsbefund ist signifikant anhängig
von der Höhe des PSA-Serumspiegels [24, 39].
Tab.3: PSA und Prostatakarzinomrisiko bei suspektem Palpationsbefund der Prostata [39]
PSA (ng/ml)
Positiv prädiktiver Wert für das Prostatakarzinom
0-1
2,8-5%
1-2,5
10,5-14%
2,5-4
22-30%
4-10
41%
>10
69%
Das Prostata-spezifische Antigen (PSA) ist eine Kallikrein-ähnliche Serinprotease, die nahezu ausschließlich von den Epithelzellen der Prostata synthetisiert wird.
Das PSA ist ein organspezifischer, aber nicht tumorspezifischer Marker. Erhöhte
PSA-Serumspiegel können außer beim Karzinom auch bei benigner Prostatahyperplasie, Prostatitis und Manipulationen vorliegen. Es bleibt jedoch ein sensitiverer Marker für die Verdachtsdiagnose Prostatakarzinom als die rektale Palpation
oder der transrektale Ultraschall [39]. In Screeningprogrammen beträgt das kumulative 7-Jahres-Erkrankungsrisiko bei initialen PSA-Werten von 3-6ng/ml 34%,
bei PSA Werten von 6-10ng/ml 44% und bei Werten über 10ng/ml 71%. In den
meisten klinischen Studien und in der täglichen Routine liegt der Schwellenwert
bei 4ng/ml. Hierüber existiert jedoch kein international anerkannter Konsens bezüglich des unteren Schwellenwertes. Bei Männern im Alter von 50-66 Jahren mit
einem PSA-Wert von 3-4ng/ml liegt die Detektionsrate bei 13%. Hiervon waren
alle detektierten Karzinome behandlungsbedürftig.
Hieraus resultiert die Forderung, einen niedrigeren PSA-Grenzwert einzuführen
[39].
18
Tab.4: Prostata-Risiko in Abhängigkeit vom PSA-Serumspiegel [39]
PSA-Spiegel (ng/ml)
Prostatakarzinomrisiko
0-0,5
6,6%
0,6-1
10,1%
1,1-2
17,0%
2,1-3
23,9%
3,1-4
26,9%
Allein auf dem Boden der PSA-Werte eine Prostatastanzbiopsie durchzuführen,
würde zu einer Vielzahl unnötiger Eingriffe führen.
Um die Aussagekraft zu optimieren wurde eine Vielzahl von PSA-Parametern
analysiert und mit dem Erkrankungsrisiko korreliert.
Im klinischen Alltag haben sich insbesondere der PSA-Quotient (<20%) und die
PSA-Velocity (>0,75ng/ml/Jahr) als Entscheidungshilfen für die Indikation einer
Stanzbiopsie der Prostata durchgesetzt.
Bei einem PSA-Quotienten <20% liegt die Karzinom-Detektionsrate bei ca. 65%.
Bei alleiniger Betrachtung des absoluten PSA-Wertes bei 40%.
Insbesondere bei Männern unter 60 Jahren müssen absoluter PSA-Wert und PSAVelocity als Indikationskriterien zur Stanzbiopsie altersadaptiert werden.
In der transrektalen Sonographie stellt sich ein Prostatakarzinom klassischer Weise als hypodense Raumforderung in der peripheren Zone der Drüse dar [39].
40% der Karzinome stellen sich jedoch sonomorphologisch hyperdens oder gar
isodens dar, so dass ihre Detektion erschwert und die geringe Sensitivität der
TRUS bei der Früherkennung erklärt.
Der TRUS kommen derzeit zwei wesentliche Aufgaben in der Diagnostik des
Prostatakarzinoms zu. Zum einen die Identifikation von suspekten, karzinomverdächtigen Arealen und zum Anderen die Verbesserung der Treffsicherheit der
transrektalen Stanzbiopsie.
Die Prostatastanzbiopsie wird transrektal bzw. perineal sonographisch gesteuert
unter antibiotischer Prophylaxe durchgeführt. Hierzu werden mindestens zehn
Biopsien aus der posterolateralen peripheren Zone beider Seitenlappen entnommen. Die Anzahl der zu entnehmenden Biopsien richtet sich aber auch bei großer
Prostata nach Alter, PSA und Prostatavolumen.
19
Tab.5: Anzahl der Prostatastanzbiospien bei einem PSA-Serumspiegel von 210ng/ml in Abhängigkeit von Alter und Drüsenvolumen [39]
Volumen
< 50 Jahre
51-60 Jahre
61-70 Jahre
>70 Jahre
0-30ml
8
8
8
6
31-40ml
12
10
8
6
41-50ml
14
12
10
8
51-60ml
16
14
12
10
61-70ml
18
16
14
12
>70ml
18
18
16
14
Die Technik der Multiscore-Biopsie erhöht die Detektionsrate gegenüber der früher üblichen Sextantenbiopsie um nahezu 50%.
Ist eine Erstbiopsie negativ, kann in 10-35% mit einer Rebiopsie gerechnet werden.
Bei negativer Rebiopsie wird in der Regel eine erneute Biopsie erst bei kontinuierliche ansteigendem PSA-Serumwerten und einer PSA-Velocity von 0,75
ng/ml/Jahr durchgeführt. Bei Nachweis einer prostatischen intraepithelialen Neoplasie (PIN) oder einer atypischen adenomatösen Hyperplasie bzw. einer atypical
small acinar proliferation in the Prostate (ASAP) ist eine Rebiopsie erforderlich,
da bei 50-100% der Patienten ein Karzinom mit dem Befund assoziiert ist [19].
Zum Grading des Prostatakarzinoms wird der sogenannte Gleason score verwendet. Hierbei kann ein Score von 2 bis 10 beschrieben werden. Der Gleason score
setzt sich aus der Summe der beiden häufigsten mikroskopisch nachweisbaren
Wachstumsmuster des Prostatakarzinoms zusammen. Für die Beschreibung des
Gleason score ist stanzbioptisches Material oder das Prostatektomie bzw. TUR-P
Material notwendig, zytologisch ist die Bestimmung nicht möglich [32]. Ein
Gleason score von 2 definiert die am wenigsten aggressive Wachstumsvariante,
während ein Gleason score von 10 die maximal aggressive biologische Variante
beschreibt. Mittlerweile wird auch ein tertiärer Grad angegeben, sofern dieser
mehr als 5% des Wachstumsmusters ausmacht. Stellt das tertiäre Wachstumsmuster das insgesamt schlechteste Muster dar, so sollte es in den Score miteinbezogen
werden [3, 22].
20
Die im Weiteren exakte Definition des T-Stadiums und vor allem die Differenzierung von lokal und lokoregionär fortgeschrittenen Stadien sind wichtig für die
weitere Therapieplanung [32].
Die Tabelle 3 beschreibt die TNM-Klassifikation von 1992 und 2002. Die Präparate für die Untersuchung zu dieser Dissertation wurden noch nach der alten TNM
Klassifikation von 1992 bewertet. Zum Vergleich und zur besseren Einordnung
der damaligen Befunde wurden die beiden Klassifikationen einander gegenüberstellt.
Tab.6: UICC und TNM von 1992 und 2002 [57]
4.Auflage 2.Revision 1992
Definitionen
6. Auflage 2002
TX
Primärtumor nicht beurteil- TX
bar
T0
Kein Anhalt für Primärtumor T0
T1
Tumor weder tastbar noch in T1
bildgeb. Verfahren sichtbar
T1a
Zufallsbefund,≤ 5% des re- T1a
sezierten Gewebes
T1b
Zufallsbefund,> 5% des re- T1b
sezierten Gewebes
T1c
Diagnose durch Nadelbiop- T1c
sie
T2
Tumor begrenzt auf Prostata T2
T2a
≤ Hälfte eines Lappens
T2a
T2b
> Hälfte eines Lappens
T2a
T2c
Beide Lappen bis an die T2b
Kapsel befallen
T3
Extrakapsuläre Ausbreitung
T3
T3a
Einseitig extrakapsulär, Sa- T3a
menblase frei
T3b
Beidseitig
extrakapsulär, T3b
Befall der Samenblase
T4
Tumor fixiert oder mit Infilt- T4
ration anderer Nachbarstruk21
turen als Samenblasen
T4a
Infiltration von Blasenhals, T4 wirdnicht mehr in T4a
Sphincter externus und/oder und T4b unterteilt
Rektum
T4b
Infiltration des Levatormuskels und Fixation an Beckenwand
Tab.7: UICC und TNM von 1992 und 2002 [57]
Klassifikation 1992 und 2002 NX u. N0
NX
Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden.
N0
Keine regionären Lymphknoten
N1
Regionäre Lymphknotenmetastasen
Fernmetastasen
2002
MX
Fernmetastasen können nicht beurteilt werden
M0
Keine Fernmetastasen
M1
Fernmetastasen
M1a
Nichtregionäre Lymphknoten
M1b
Knochen
M1c
Andere Lokalisationen
I.3 Apoptose und Telomerase
Jeder Organismus lebt von einem regulierten Gleichgewicht zwischen Zellteilung
und Zelltod. Wachstumsstimulierende bzw. wachstumsinhibierende Faktoren sorgen im gesunden Organismuns für dieses Gleichgewicht. So wie die Zellteilung
22
von positiv stimulierenden Faktoren kontrolliert wird, wird auch der Zelltod
(Apoptose) von äußeren Signalen über entsprechende Rezeptoren an der Zelloberfläche ausgelöst. Ein Ungleichgewicht zwischen Apoptose- und Proliferationsrate
kann zu Tumorwachstum führen [4, 14].
I.3.1 Apoptose
I.3.1.1 Allgemeines
Die Apoptose (griech. Apoptosis: „eine Blume, die ihre Blütenblätter verliert“)
stellt den physiologischen, programmierten Zelltod dar. Er tritt in allen lebenden
Organismen während ihrer embryonalen und adulten Entwicklung bis hin zum
individuellen Tod auf [30, 67]. Die Apoptose dient der Anpassung des Gewebes
an wechselnde Belastungen und der Elimination sowohl überflüssig gewordener
Zellen bei der Embryonalentwicklung als auch Tumorzellen, virusbefallener Zellen oder immunkompetenter Zellen, die sich gegen körpereigene Antigene richten
[30]. Die Apoptose dient somit der Zerstörung unerwünschter, funktionell gestörter oder mutierter Zellen ohne Beeinträchtigung der zellulären Integrität.
Im Gegensatz hierzu beschreibt die Nekrose den pathologischen Zelltod. Dieser
tritt unter extremen Bedingungen wie mechanischer Gewalt, Hitze oder chemischer Einwirkung durch Zerstörung der zellulären Integrität auf [45].
23
I.3.1.2
Morphologische und biochemische Veränderungen während der
Apoptose
Während der Apoptose durchlaufen Zellen einige charakteristische Phasen und
morphologische Veränderungen [30].
Bekommt eine Zelle das Zeichen, die Apoptose zu starten, z.B. in Form von Entzug von Wachstumsfaktoren, ionisierender Strahlung, Toxinen, etc. verliert diese
zunächst den Kontakt zu ihren Nachbarzellen. Es kommt zur Schrumpfung des
Zytoplasmas und zu einer Kondensation zytoplasmatischer Proteine. Das Chromatin verdichtet sich und wird durch Endonukleasen internukleosomal fragmentiert.
Andere Zellorganellen bleiben zunächst intakt. Im weiteren Verlauf kommt es zur
Auffaltung der Zellmembran und Separierung zellulärer, insbesondere nukleärer
Fragmente. Diese nun membranassoziierten Fragmente werden als „Apoptotic
bodies“ bezeichnet. Es folgt die Phagozytose der apoptotischen Zelle durch Nachbarzellen oder Makrophagen.
Charakteristische morphologische und molekulare Unterschiede zwischen Apoptose und Zellnekrose sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Tab.8: Unterschiede zwischen Apoptose und Nekrose [30]
Apoptose
Nekrose
Morphologische Kriterien
Untergang einzelner Zellen
Untergang ganzer Zellgruppen
Kein Verlust der zellulären Integrität
Verlust der zellulären Integrität
Zellschrumpfung, „apoptotic bodies“
Zellschwellung, Verteilung des Chromatins
und Zellyse
Phagozytose durch Nachbarzellen und Mak- Phagozytose durch Makrophagen
rophagen
Fehlende inflammatorische Reaktion
Heftige inflammatorische Reaktion
Intakte Lysosomen
Freisetzung lysosomaler Enzyme
24
Biochemische Kriterien
Induktion durch physiologische Signale
Induktion durch unphysiologische Noxen
Konrollierter Stoffwechselprozess
Verlust der zellulären Homöostase
Energieabhängiger Vorgang
Energieunabhängiger Prozess
Synthese von Makromolekülen
Fehlende Nukleinsäure- und Proteinsynthese
Aktiver Vorgang mit mRNA Synthese
Fehlende Gentranskription
Internukleosomale DNA-Fragmentierung
Randomisierte DNA-Fragmentierung
I.3.1.3 Regulation der Apoptose
Eines der am besten untersuchten Modelle der Apoptoseregulation ist die zytokinvermittelte Apoptose. Tumor-Nekrose-Factor α (TNFα) und Fas-Ligand (FasL)
sind in der Lage, sowohl in gesunden als auch in malignen Zellen rezeptorvermittelte Apoptose zu induzieren. Die Aktivierung der entsprechenden Rezeptoren
(TNF-R I und II) bzw. Fas (CD 95) induziert eine intrazelluläre Signalkaskade. Es
kommt zur Aktivierung von proteinspaltenden Caspasen, die ihrerseits Sphingomyelinasen aktivieren. Die Sphingomyelinasen führen zur Freisetzung des Lipidmeditors Ceramid. Ceramid aktiviert weitere Caspasen und leitet die späteren,
irreversiblen Phasen des programmierten Zelltodes ein [20, 28, 48].
Tab. 9: Kontrollgene und ihre Auswirkungen auf die Apoptose [30]
Kontrollgen
Zelluläre Lokalisation des Pro- Auswirkung auf die Apoptose
teinprodukts
Bcl-2
Äußere mitochondrale Membran, Blockierung
Endoplasmatisches
Retikulum,
Kernmembran
Bax
Kernmembran,
Endoplasmati- Stimulation
sches Retikulum
c-myc
Zellkern
Stimulation (ebenso Stimulation
der Zellproliferation)
p53
Zellkern
Stimulation durch Wildtyp p53
Blockierung durch mutiertes p53
25
Apo-1/Fas
Zellmembran
Stimulation
Die Regulation der Apoptose unterliegt unterschiedlichen Kontrollgenen. Das
p53-Gen kodiert für einen multifunktionellen Transkriptionsfaktor, der die genetische Stabilität der Zelle überwacht. Es besteht aus 393 Aminosäuren und kann in
vier Hauptfunktionsdomänen unterteilt werden, die an der DNA einer Zelle binden können [13, 64, 79]. Liegt in der Zelle ein DNA-Schaden vor, kann p53 den
Übergang in den programmierten Zelltod induzieren. Fehlt oder mutiert das p53Gen, sind die betroffenen Zellen häufig nicht mehr strahlensensibel und resistent
gegen Chemotherapeutika [30]. Das p53–Protein hält während der G1-Phase den
Zellzyklus an [77].
Das bcl-2 Gen kodiert für ein Protein, das primär in der äußeren Mitochondrienmembran in der Kernhülle und im endoplasmatischen Retikulum vorkommt. Es
ist das einzige Onkogen, das nicht die Proliferationsrate erhöht, sondern die
Apoptoserate vermindert. Es wird angenommen, dass bcl-2 mit mehreren „Todesproteinen“ Komplexe bilden kann. Eines dieser „Todesproteine“ heißt bcl-2 assoziiertes X-Protein (Bax). Es bildet innerhalb der Zelle Homodimere und erhöht
dadurch die Apoptoserate. Der antiapoptotische Effekt von bcl-2 wird so erklärt,
dass es die Bildung von Homodimeren durch Komplexbildung mit Bax verhindert
[20]. Expression von p53 bewirkt physiologischerweise eine verminderte Expression von bcl-2 und eine erhöhte Expression von Bax und wirkt damit apoptotisch
[20].
I.3.2 Telomerase
I.3.2.1 Telomere
Die Enden jedes menschlichen Chromosoms werden als Telomere bezeichnet. Sie
bestehen aus einer einheitlichen Basenabfolge (5´-TTAGGG-3´), so genannten
Wiederholungseinheiten (Repeats). Je nach Gewebeart können diese zwischen 50
und 200.000 Basenpaare lang sein. Telomere enthalten keine transkribierbaren
26
Gene [2, 33, 62, 65]. Telomere sind essentiell für das Überleben jeder Zelle. Sie
erlauben es, defekte von intakten Zellen zu unterscheiden und verhindern die Fusion mit anderen Chromosomen. Eine weitere wesentliche Funktion ist die Verhinderung des Abbaus kodierender Sequenzen.
Bei der Zellteilung muss eine Zelle ihre gesamte DNA verdoppeln, damit in jeder
Tochterzelle die identische genetische Information enthalten ist. Dabei erfolgt an
der Einzelstrang-DNA zunächst die Synthese eines kurzen RNA-Fragments, der
sogenannten Primer-RNA, die komplementär zu dem DNA-Matrizenstrang ist.
Die DNA kann nur vom 5´-Ende zum 3´-Ende wachsen. Am Ende der Replikation
wird der RNA-Primer hydrolytisch abgebaut, so dass am 5´-Ende eines Tochterstrangs eine Lücke entsteht, die die DNA-Polymerase nicht schließen kann. Durch
dieses Unvermögen gerät der neue Strang an einem der Telomere eines jeden
künftigen Chromosoms zu kurz. Man bezeichnet dieses Phänomen als EndReplikations-Problem. Das Vorhandensein von Telomeren an den Enden der
Chromosomen verhindert einen Abbau von kodierenden Sequenzen. Mit jeder
Zellteilung verkürzen sich die Telomere. Die Zahl der Zellteilungen ist damit je
nach Gewebeart auf 50-70 begrenzt. Ohne Kompensationsmechanismus würde
mit der Entstehung weiterer Zellgenerationen die schützende, genfreie TelomerDNA schwinden. Theoretisch könnte dann auch gentragende Erbsubstanz verloren gehen [21, 36, 37, 62].
I.3.2.2 Telomerase
Das Enzym Telomerase steuert dem Schwund telomerer Sequenzen entgegen. Es
ist ein Ribonukleoprotein mit einer RNA-Komponente mit einer Länge von etwa
150 Nukleotiden, die als Matrize für die Synthese des Telomers dient. Somit werden die Sequenzeigenschaften durch die RNA der Telomerase und nicht vom
Chromosom selbst festgelegt [65]. Die Telomerase Reverse Transkriptase
(hTERT) ist die katalytische Untereinheit des Enzyms und eng mit der Telomeraseaktivität korreliert [61].
Physiologischerweise wird die Telomerase in der Embryonalentwicklung synthetisiert. Hier gewährleistet sie die Teilungsfähigkeit von Keim- und Stammzellen.
Ist die Organogenese abgeschlossen, sistiert die Telomeraseaktivität, so dass sich
die Telomere der somatischen Zellen bis zu einer individuell kritischen Telomerlänge verkürzen und die Zellteilung schließlich stoppt. Dieses Phänomen wird als
27
Seneszenz bezeichnet. In dieser Phase beträgt die durchschnittliche Länge der
Telomere je nach Zelltyp 6-8 kb.
Durch eine oder mehrere Mutationen in der DNA kann sich eine Zelle solange
weiter teilen, bis sich die Telomere auf 2-4 kb verkürzt haben. Diese Phase wird
als „Crisis“ bezeichnet. Im Normalfall sterben solche Zellen ab. Wenn aber durch
genetische Veränderungen die Telomerase vor Eintritt der Crisis aktiviert wird,
werden die Telomere, wenn auch verkürzt, erhalten und diese Zelle kann sich weiter teilen. Sie ist unsterblich geworden und erfüllt somit alle Kriterien einer Tumorzelle [65].
28
II Material und Methode
II.1 Material
II.1.1 Chemikalien
ABC-Kit(avidin Biotin Complex)
Vector Laboratories Inc. Burlingame USA
BSA(bovines Serumalbumin)
Serva Elektrophoresis Gmbh
Heidelberg Deutschland
Cacodylat-Puffer
Sigma Deisenhofen Deutsch-
land
DAB( 3,3`Diaminobenzidine Tablet)
Sigma Deisenhofen Deutsch-
land
Di Natriumhydrogenphosphat Dihydrat
Merck Darmstadt Deutschland
Haematoxylin nach Mayer
Merck Darmstadt Deutschland
Histoclear
Shandon
Gmbh
Frankfurt/
Main
Deutschland
Histomount
Shandon
Gmbh
Frankfurt/
Main
Deutschland
Kaliumhydrogenphosphat
Merck Darmstadt Deutschland
Kobaltchlorid
Sigma Deisenhofen Deutsch-
land
Proteinase K
Boehringer
Mannheim
Boehringer
Mannheim
Boehringer
Mannheim
Deutschland
Terminale Transferase-Kit
Deutschland
Trizma Base
Deutschland
29
II.1.2 Lösungen
PBS Stammlösung: 18 g Di Natriumhydrogenphosphat Dihydrat
3 g Kaliumhydrogenphosphat
auf 1000 ml Aqua destillata auffüllen
PBS Gebrauchslösung: 100 ml Stammlösung
+ 7,2 g Natriumchlorid
auf 1000 ml mit Aqua destillata auffüllen
Auf pH 7,4 durch Zugabe von Salzsäure bzw. Natronlauge einstellen.
Stammlösung A:
21,01 g Zitronensäuremonohydrat auf 1000 ml Aqua destillata auffüllen
Stammlösung B:
29,41 g Natriumcitrat auf 1000 ml Aqua destillata auffüllen
Citratpuffer für die Mikrowelle:
41 ml Stammlösung A
9 ml Stammlösung B
auf 500 ml Aqua destillata auffüllen
auf pH 6 durch Zugabe von HCL oder NaOH
einstellen
TB Puffer:
4,5 g Natriumchlorid
2,18 g Natriumcitrat
auf 250 ml Aqua destillata auffüllen
TdT Puffer:
0,9 g Trizma Base
22,4 g Natriumcacodylat
0,06 g Kobaltchlorid
mit HCL auf pH 7,2 einstellen
1 ml Terminale Transferase Reagenz:
12 µl TdT
6,4 µl Biotin
981,6 µl TdT Puffer
30
II.1.3 Geräte
Kamera
Olympus C-35AD
Mikroskop
Olympus BH2 Japan
Mikrotom
Enno Vieth Mikrotome Gmbh Modell Hn 40
Mikrowelle
Objektive
WHK 10×20
Objektträger
Superfrost Plus 25×75×1,0 mm Menzelgläser USA
31
II.2 Methoden
II.2.1 Herkunft des Prostatakarzinomgewebes
Das im Rahmen dieser Arbeit verwendete Prostatagewebe stammt aus der Tumorbank der Urologischen und Neurourologischen Klinik der Ruhr-UniversitätBochum, Marienhospital in Herne. Das Gewebematerial wurde unmittelbar nach
radikaler Prostatektomie in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Ein weiterer Teil wurde unfixiert tiefgefroren. Die Gewebeproben wurden mit einem Mikrotom in 4 Mikrometer dicke Schnitte geschnitten und auf Objektträger übertragen. Von jeder Probe wurden 6 Schnitte angefertigt, die vor weiteren Untersuchungen mindestens 48 Stunden trocken gelagert wurden. Für die Versuchsreihe
standen Proben von 52 Patienten zur Verfügung. Die Begutachtung der Gewebe
erfolgte am Institut für Pathologie, Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung
von Herrn Prof. Dr. med. K. Morgenroth. Da primär nur ein WHO-Grading angegeben wurde, mussten alle Schnitte in der Folge durch einen unabhängigen Pathologen inklusive Angabe der Gleason scores nachbefundet werden.
II.2.2 Immunzytochemie
II.2.2.1 Vorbereitung der Paraffinschnitte für die Färbungen
Die Paraffinschnitte wurden in Histoclear für 2 mal 20 Minuten entparaffiniert.
Es folgte die Rehydrierung in einer absteigenden Alkoholreihe (99%, 96%, 70%,
50%). Die Gewebeschnitte verblieben jeweils für 2-3 min in den einzelnen Lösungen. Anschließend wurden die Prostataproben für 2-3 Min mit phosphate buffered saline (PBS) gespült.
32
II.2.2.2 Färbemethode zur Bestimmung von proliferierenden Zellen mit dem
Antikörper MIB-1
Zur Vorbereitung wurden die entparaffinierten Schnitte in Zitratpuffer zweimal 10
Min. in der Mikrowelle gekocht. Nach Abkühlen wurden die Schnitte in Glasküvetten überführt und für jeweils zweimal 5 min mit PBS-Lösung gespült. Das anschließende Inkubieren in 0,3%-igem Wasserstoffperoxid in 50% Methanol für 20
Minuten diente der Hemmung der endogenen Peroxidase, die andernfalls eine
verfälschende Hintergrundfärbung verursacht.
Nach Entfernen der zuvor verwendeten Lösung durch erneutes Spülen (2x 5 min
mit PBS) wurden die einzelnen Gewebeschnitte 20 Min. bei Zimmertemperatur
mit Pferdeserum inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen im Gewebe zu blockieren. Durch diesen Schritt wurde die Adsorption des primären Antikörpers an
Kollagen und zellverbindende Elemente vermieden. Es folgte die Inkubation mit
dem primären Antikörper MIB-1
(Vector Laboratories Inc. Burlingame USA)
(Verdünnung 1:40, 60 Min., 37°C), bzw. mit PBS für die Kontrollschnitte. Der
primäre monoklonale Antikörper MIB-1 reagiert mit dem Kernantigen Ki-67 in
allen proliferierenden Zellen. Ki-67 liegt in der späten G1- sowie in der S-, Mund G2-Phase vor, jedoch nicht in der G0-Phase [29]. Somit wurden proliferierende Zellen spezifisch markiert. Nach Spülen (2 x 5 Min. mit PBS-Lösung) wurden die Schnitte mit dem sekundären, biotinylierten Antikörper (Pferd anti Maus,
Konzentration 7,5‰, 30 Min., 37°C) inkubiert. Der sekundäre Antikörper bindet
spezifisch an den primären Antikörper. Durch die Bindung mehrerer sekundärer
Antikörper an einen primären Antikörper kommt es zu einer Verstärkung der Färbungsreaktion. Es folgte die dreimalige Spülung mit PBS für jeweils 5 min.. Anschließend wurden die Gewebeschnitte 30 min mit ABC-Reagenz bei Zimmertemperatur inkubiert. Der verwendete ABC-Standardkit besteht aus dem Enzym
Peroxidase, dem Glykoprotein Avidin und dem Vitamin Biotin. Die freien Stellen
des Avidin binden an das Biotin des sekundären Antikörpers und bildeten Komplexe. Nach Zugabe von Diaminobenzidin (DAB) wird Wasserstoffperoxid reduziert und DAB oxidiert, wodurch es als brauner Farbstoff erscheint.
Anschließend erfolgte die schon zuvor beschriebene Gegenfärbung mit Hämatoxylin, die Dehydrierung in aufsteigender Alkoholreihe und das Eindecken mit
Histomount.
33
34
Abb.3 : Immunhistochemischer Nachweis der Proliferation beim Prostatakarzinom – ein Schema
35
II.2.3 Färbemethode der Apoptose mittels terminaler Transferase
Zur Quantifizierung apoptotisch sterbender Epithelzellen wurden Paraffinschnitte
wie zuvor beschrieben angefertigt und mit dem „Terminale Transferase Assay“
zum Nachweis der für Apoptose spezifischen DNA-Doppelstrangbrüche aufgearbeitet.
Die entparaffinierten Gewebeschnitte wurden mit Proteinkinase K inkubiert (15
Min., 37°C) und anschließend gespült (3 x 5 Min mit PBS-Lösung). Zur Blockade
der endogenen Peroxidase wurden die entparaffinierten Schnitte in eine Lösung
von 0,3% Wasserstoffperoxid in 50% Methanol gegeben (20 Min.) und erneut
gespült (3 x 5 Min mit destilliertem Wasser). Nach Eintauchen der einzelnen
Prostataschnitte für 10 Sekunden in TdT-Puffer erfolgte die eigentliche enzymatische Reaktion mit dem Enzym terminale Transferase –TdT- (TdT-Enzym, biotinyliertes dUTP als Substrat, Fa. Boehringer Mannheim) zum Nachweis von DNADoppelstrangbrüchen in 30mMol Trizma Base (pH 7,2) mit 140mMol Nacacodylat und 1mMol Kobaltchlorid unter Anwesenheit von Substrat im Überschuss (biotinyliertes dUTP, 37°C, 1 Stunde). Die Reaktion wurde mit Na-Chlorid
(300mMol)/Na-Zitrat (30mMol)-Pufferlösung angehalten, danach wurde überschüssiges Substrat und Enzym durch dreimaliges gründliches Spülen mit PBS
von den Präparaten entfernt.
Die Visualisierung erfolgt durch die Standard ABC-Methode mit Diaminobenzidin als Substrat. Die Gegenfärbung erfolgt mit Hämatoxylin.
36
Abb. 4: Immunhistochemischer Nachweis der Apoptose beim Prostatakarzinom –
ein Schema
II.2.4 Auswertung der Gewebeschnitte
Die Versuchsreihen wurden mit je 10-15 Gewebeschnitten durchgeführt.
Dabei diente pro Gewebeprobe ein Schnitt als Negativkontrolle, bei dem keine
spezifische Apoptose- oder Proliferationsmarkierung erfolgte. Jede Versuchsreihe
beinhaltete zudem eine Positivkontrolle. Dieser Gewebeschnitt wurde aus Dünnbzw. Dickdarmepithel angefertigt und auf Apoptose- bzw. Proliferationsreichtum
37
in der oben genannten Färbetechnik erprobt. Dadurch wurden falsch negative Ergebnisse ausgeschlossen und jede Versuchsreihe auf Richtigkeit überprüft.
Die Auswertung der einzelnen Proben erfolgte durch manuelles Zählen mit Hilfe
des Mikroskopes. Hierfür wurde ein Okular mit einem 10x10 Kästchen messenden Raster verwendet. 2000 zufällig ausgewählte Epithelzellen einer Gewebeprobe wurden bei 100-facher Vergrößerung gezählt (Random-Field-Technik) und der
Anteil der gezählt positiven Zellen an den insgesamt 2000 Epithelzellen ermittelt.
38
II.3 Aktivitätsbestimmung der Telomerase
II.3.1 Geräte
ELISA-Reader:
Tecan Rainbow, Tecan, Crailsheim (BRD)
Gefriermikrotom:
Kryostat HR, SLEE, Mainz (BRD)
PCR-Cycler:
Eppendorf Mastercycler 5330, Hamburg
(BRD)
Photometer:
Beckmann DU 640 Spektrometer, Fullerton,
CA (USA)
Sterilbank:
Heraeus Lamin AIR LB-48-C, Düsseldorf
(BRD)
Wasserbad:
Köttermann, Hänigsen (BRD)
Zentrifugen:
Hettich Universal 16, Tuttlingen (BRD)
1K15 Sigma Laborzentrifugen, Osterode
(BRD)
II.3.2 Chemikalien
Roche, Mannheim (BRD):
AEBSF
CHAPS
DIG Luminescent Detection Kit
DIG Oligonukleotid Tailing Kit
dNTP´s
EDTA
EGTA
ESL Proteinbestimmungs Kit
Roche, Mannheim (BRD):
RNase
Telomerase-PCR-ELISA
Tris
Sigma Aldrich, Deisenhofen (BRD): DEPC
DTT
Glyzerin
2-Mercaptoethanol
39
II.3.3 Zellen und Gewebe
II. 3.3.1 Humanes Prostatagewebe
Das Gewebematerial für die Telomerasebestimmung wurde nicht in Paraffin eingebettet, sondern unmittelbar nach radikaler Prostatektomie bei -80°C eingefroren.
II.3.4 Methoden
II.3.4.1 Herstellung eines Zellysates aus Prostatagewebe
Mit einem Gefriermikrotom wurden jeweils ca. 50 Schnitte mit einer Dicke von 5
- 10 µm angefertigt. Der 1., 20. und 35. Schnitt wurde auf einen Objektträger gebracht und bei -20°C eingefroren. Die Schnitte wurden mit 250 µl Lysepuffer in
ein Eppendorfgefäß gegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte eine
Zentrifugation bei 21000 x g für 30 min bei 4°C. Der Überstand wurde anschließend portioniert und bei -80°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
Lysepuffer:
10 mM Tris/HCl pH 7,5
1 mM MgCl2
1 mM EGTA
0,5% CHAPS (w/v)
10 % Glyzerin (w/v)
5 mM ß-Mercaptoethanol
0,1 mM AEBSF
40
II.3.4.2 Proteinbestimmung
Die Bestimmung der Proteinmenge in den Proben wurde mit dem ESL-Kit der
Firma Roche nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. 50 µl Probe
wurden mit 100 µl Reagenz A für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, bevor 1
ml Reagenz B hinzupipettiert wurde. Anschließend wurde nach 30 s der Abfall
der Extinktion bei 485 nm photometrisch bestimmt. Anhand einer Eichgerade
konnten die Proteinmengen in den Proben berechnet werden.
II.3.4.3 Bestimmung der Telomeraseaktivität
Der Nachweis der Telomeraseaktivität erfolgte mittels Telomerase PCR-ELISA.
Bei dieser Methode wurde die von der Telomerase hergestellten Produkte (Telomerleitern) zunächst mit Hilfe einer PCR amplifiziert, um anschließend in einem
ELISA nachgewiesen zu werden. Der Versuch zur Aktivitätsbestimmung der Telomerase wurde in RNase-freien Gefäßen und Lösungen durchgeführt.
II.3.4.3.1 Herstellung von DEPC-behandeltem Aqua destillata
Um die RNA-Matrize der Telomerase vor Hydrolyse durch RNasen zu schützen,
wurden alle Lösungen mit DEPC (Pyrocarbonic Acid Diethyl Ester)-behandeltem
Aqua destillata angesetzt. Dazu wurde Aqua destillata mit 0,1 % DEPC über
Nacht bei 37°C inkubiert und anschließend für 20 Minuten autoklaviert.
41
II.3.4.3.2 Telomerase-PCR ELISA
Zum Nachweis der Telomeraseaktivität wurde bei diesem Testsystem zunächst
eine Telomerasereaktion für 30 Minuten bei 25°C durchgeführt, bei der das Enzym Hexanukleotide an einen Primer hängt. Bei der anschließenden PCR, die zur
Amplifikation der Telomeraseprodukte diente, wurde ein biotin-markierter Primer
eingesetzt, der es ermöglichte, die PCR-Produkte an eine mit Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte zu binden. Im darauffolgenden Schritt wurde eine mit
Digoxygenin markierte telomerspezifische Sonde an die PCR-Produkte hybridisiert. Ein Anti-DIG-Peroxidase-Konjugat band an das Digoxygenin und der Peroxidase-Anteil dieses Komplexes katalysierte eine Farbreaktion, deren Extinktion
mit einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt wurde.
Der Telomerase-ELISA wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
Nach den Angaben des Herstellers wurden Proben als positiv gewertet, deren Extinktion nach Abzug des Leerwertes über 0,2 lag.
42
II.4 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit Statistikprogramm SPSS (Statistical Package for the Social Sciences). Als deskriptive Maße dienten Mittelwert±Standardabweichung und der Wertebereich der erhobenen Variablen. Zur
Analyse
von
bivariaten
Zusammenhängen
wurden
Produktmoment-
korrelationskoeffizienten (Pearson‘ r) verwendet. Da von einer hohen Vernetztheit
der Variablen ausgegangen werden musste, wurde zur Aufklärung der untereinander unabhängigen Einflüsse eine multiple Regressionsanalyse berechnet. Die
Stärke und Richtung des Zusammenhangs von Einflussfaktoren mit dem Zielkriterium Telomeraseaktivität wurde durch standardisierte Korrelationskoeffizienten
(ß) ausgedrückt. Ergebnisse mit p < 0,05 werden als signifikant beschrieben.
43
III Ergebnisse
III.1 Tumorstadien und Grading
Insgesamt wurden Gewebeproben von 52 Prostatakarzinomen eingeschlossen.
Davon befanden sich 23 Tumore (44,2 %) im Stadium pT2, 27 Tumore (51,9 %)
im Stadium pT3 und zwei Tumore (3,8 %) im Stadium pT4 (siehe Tabelle 10)
Tab. 10: Tumorstadium der 52 Prostatakarzinome, von denen Gewebeproben eingeschlossen wurden (TNM-Klassifikation UICC 1992).
Stadium
A
2
B
C
A
3
B
C
4
A
Anzahl
9
3
11
5
4
18
2
Anteil ( %)
17,3
5,8
21,2
9,6
7,7
34,6
3,8
Bei den Tumoren lag weit überwiegend (n = 40, 76,9 %) ein histologisches Grading 2 vor. 9 Tumoren (17,3 %) wurden als G1 und nur ein Tumor (1,9 %) als G3
eingestuft. Bei zwei Tumoren (3,8 %) war ein histologisches Grading nicht dokumentiert. Die geringe Streuung der Werte erschwert den Nachweis von Korrelationen anderer Parameter mit dem histologischen Grading. Da der Einzelfall mit
histologischem Grading G3 bei Korrelationen ein zu großes Gewicht erhalten
würde, wurden die Korrelationen mit dem histologischen Grading ohne Berücksichtigung dieser Gewebeprobe errechnet.
Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen Tumorstadium und histopathologischem Grading ließ sich nicht nachweisen (Pearson‘ Korrelationskoeffizient,
44
r = 0,265, p = 0,066, siehe Abbildung 5). Beide Tumore ohne Dokumentation des
histologischen Grading waren als Stadium 3a klassifiziert worden.
16
14
Histologisches
Grading
G1
12
G2
G3
Häufigkeiten
10
8
6
4
2
0
2a
2b
2c
3a
3b
3c
4a
Tumorstadium
Abb. 5: Histopathologisches Grading bei den Tumoren der unterschiedlichen Stadien (zwei Tumore ohne Grading).
Im Summenwert des Gleason Scores wiesen 25 Tumore (48,1 %) 6 Punkte,
16 Tumore (30,8 %) 7 Punkte, 7 Tumore (13,5 %) 8 Punkte und zwei Tumore
(3,8 %) 9 Punkte auf. Bei zwei Tumoren wurde der Gleason-Score nicht angegeben. Das vorherrschende Gewebemuster wurde bei 37 Tumoren (71,2 %) als Grad
3, bei 12 Tumoren (23,1 %) als Grad 4 und nur bei einem Tumor (1,9 %) als Grad
5 eingestuft.
Es bestand eine statistisch signifikante, direkte Korrelation zwischen dem Tumorstadium und dem Gleason Score, sowohl für den Summenwert als auch für die
Beurteilung des vorherrschenden Gewebemusters (Pearson‘ Korrelationskoeffizient, Summenwert: r = 0,441, p = 0,0013 (siehe Abbildung 6), vorherrschendes
Gewebemuster: r = 0,369, p = 0,0084). Die Tumore ohne Dokumentation des
Gleason Scores waren als Stadium 2a bzw. 3a klassifiziert worden. Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen dem Grading und dem Gleason Score ließ
45
sich dagegen nicht nachweisen (Pearson‘ Korrelationskoeffizient, Summenwert:
r = 0,199, p = 0,167, vorherrschendes Gewebemuster: r = 0,249, p = 0,082).
Abb. 6: Gleason Score (Summenwert) bei den Tumoren der unterschiedlichen
Stadien (zwei Tumore ohne Gleason-Score). Der Zusammenhang war statistisch
signifikant (Pearson‘ Korrelationskoeffizient, r = 0,441, p = 0,0013).
III.2 Proliferationsrate
Ki-67 als Marker der Proliferation wurde im Mittel in 3,3±3,4 % der Zellen nachgewiesen, minimal in 0 %, maximal in 16 % der Zellen (jeweils n = 1). Nur bei
zwei Tumoren (3,8 %) lag die Proliferationsrate unter 0,2 % und damit im Normalbereich für Prostatagewebe. 45 Tumoren (86,5 %) wiesen eine Proliferationsrate von maximal 5 % auf (siehe Abbildung 7). Bei einem der Tumoren gelang
der Nachweis Ki-67 aus technischen Gründen nicht.
46
24
22
20
18
Häufigkeiten
16
14
12
10
8
6
4
2
0
-1%
-2%
-5%
-10%
-15%
-20%
Proliferationsrate
Abb. 7: Proliferationsrate (%) in Kategorien (Anzahl der Tumore). Ein Tumor
ohne Angabe der Proliferationsrate wurde nicht berücksichtigt.
Mit zunehmendem Tumorstadium nahm die Proliferationsrate zu, der Zusammenhang war schwach, aber statistisch signifikant (siehe Tabelle 11 und Abbildung
8).
Die Proliferationsrate lag bei den Tumoren mit histologischem Grading G1 im
Mittel bei 1,7±1,3 %, bei den Tumoren mit G2 dagegen im Mittel bei 3,5±3,2 %.
Der Tumor mit Grading G3 wies eine Proliferationsrate von 2,2 % auf. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Proliferationsrate und dem histologischen Grading ließ sich nicht nachweisen (siehe Tabelle 11), der einzelne G3Tumor wurde von dieser Auswertung ausgeschlossen.
Bei Tumoren mit einem Gleason Score Grad 3 im vorherrschenden Gewebemuster lag die Proliferationsrate im Mittel bei 3,1±2,9 %, bei Tumoren mit Grad 4 bei
4,4±4,6 % und bei dem Tumor mit Grad 5 bei 4,5 %. Beim Summenwert des
Gleason Scores zeigten die Tumoren mit den höchsten Werten auffallend geringe
Proliferationsraten (Summenwert 6: 2,9±2,9 %, 7: 3,8±3,4 %, 8: 4,7±5,2 %, 9:
2,4±1,4 %). Ein statistisch signifikanter Zusammenhang mit der Proliferationsrate
47
ließ sich aufgrund der hohen Streubreite, wie sie auch in der hohen Standardabweichung erkennbar ist, weder für den Summenwert noch für die Beurteilung des
vorherrschenden Gewebemusters im Gleason-Score nachweisen (siehe Tabelle
11).
Tab. 11: Korrelation zwischen Proliferationsrate und Tumorstadium, histologischem Grading sowie Gleason Score (ein Tumor ohne Angabe der Proliferationsrate)
Tumorstadium
Histologisches Gradinga
Proliferationsrate ( %) Gleason Score:
Summenwert
Gleason Score: vorherrschendes Gewebemuster
Pearson‘
Korrelationskoeffizient r
0,343
0,227
0,111
Signifikanzniveau p
0,160
0,277
0,015
0,124
0,451
a = nur G1 und G2, ein Tumor mit G3 wurde ausgeschlossen
48
16
Proliferationsrate (%)
12
8
4
0
2a
2b
2c
3a
3b
3c
4a
Tumorstadium
Abb. 8: Zusammenhang zwischen Proliferationsrate und Tumorstadium. Der Zusammenhang war statistisch signifikant (Pearson‘ Korrelationskoeffizient,
r = 0,343, p = 0,015).
III.3 Apoptoserate
Im terminale Transferase-Assay waren im Mittel 4,7±14,2 % der Zellen positiv
und wurden somit als in der Apoptose befindlich eingestuft, der Anteil reichte von
0 % bis 65 % der Zellen.
Bei mehr als der Hälfte der Tumoren (n = 33, 63,5 %) wurden keine Zellen in der
Apoptose nachgewiesen, bei 3 Tumoren lag die Apoptoserate im Normalbereich.
15 Tumoren (28,8 %) wiesen eine Apoptoserate über dem Normalbereich von
0,2 % auf. Besonders auffällig waren darunter 3 Tumoren mit Apoptoseraten zwischen 55 % und 65 % (siehe Abbildung 9). Bei einem Tumor gelang die Bestimmung der Apoptoserate aus technischen Gründen nicht.
49
36
33
30
27
Häufigkeiten
24
21
18
15
12
9
6
3
0
0%
-1%
-5%
-10%
-50%
>50%
Apoptoserate
Abb. 9: Apoptoserate (%) in Kategorien (Anzahl der Tumore, ein Tumor ohne
Angabe).
50
Tab. 12: Korrelation zwischen Apoptoserate und Tumorstadium, histologischem
Grading, Gleason-Score sowie Proliferationsrate
Apoptoserate (%)
Tumorstadium
Histologisches Gradinga
Gleason Score:
Summenwert
Gleason Score: vorherrschendes Gewebemuster
Proliferationsrate (%)
Pearson‘
Korrelationskoeffizient r
-0,004
-0,145
0,170
Signifikanzniveau p
0,033
0,824
0,100
0,492
0,978
0,330
0,248
a = nur G1 und G2, ein Tumor mit G3 wurde ausgeschlossen
Die Apoptoserate zeigte keinen statistisch signifikanten Zusammenhang mit dem
Tumorstadium (siehe Tabelle 12). Von den drei Tumoren mit Apoptoseraten zwischen 55 % und 65 % befand sich ein Tumor im Stadium 2a und zwei Tumore im
Stadium 3c. Der Anteil der Tumore ohne Nachweis von Zellen in der Apoptose
war in den Tumoren der Stadien 3c, 2c und 2a am höchsten (siehe Tabelle 13).
Tab. 13: Anteil der Tumore ohne Nachweis von Zellen in der Apoptose in den
verschiedenen Tumorstadien
Stadium
a
2
b
c
a
3
b
c
4
a
Anzahl
6
1
7,0
4
3
11
1
Anteil ( %)
18,2
3,0
21,2
12,1
9,1
33,3
3,0
Die Tumore mit dem histologischen Grading G1 wiesen im Mittel eine Apoptoserate von 9,8±19,7 % auf, die Tumore mit G2 im Mittel 24,1±13,4 %. In dem einzigen Tumor mit G3 wurden keine Zellen in der Apoptose nachgewiesen. Der
Anteil der Tumore mit einer Apoptoserate im Normalbereich (<0,2 %) betrug bei
51
den Tumoren mit histologischem Grading G1 50 % und bei den G2-Tumoren
72,5 %. Es bestand kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der
Apoptoserate und dem histopathologischen Grading (siehe Tab. 12).
Bei Tumoren mit einem Gleason-Score Grad 3 im vorherrschenden Gewebemuster lag die Apoptoserate im Mittel bei 5,1±14,4 %, bei Tumoren mit Grad 4 bei
4,9±15,8 %. Bei dem Tumor mit Grad 5 wurden keine Zellen in der Apoptose
nachgewiesen. Für den Summenwert des Gleason Scores sind die Apoptoserate
und der Anteil der Tumoren ohne Nachweis von Zellen in der Apoptose in Tabelle 13 dargestellt. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang mit der Apoptoserate ließ sich aufgrund der hohen Streubreite weder für den Summenwert noch für
die Beurteilung des vorherrschenden Gewebemusters im Gleason Score nachweisen (siehe Tabelle 12).
Tab. 14: Anteil der Tumore ohne Nachweis von Zellen in der Apoptose und mittlere Apoptoserate bei den Tumoren mit unterschiedlichem Summenwert im Gleason Score
Summenwert
im GleasonScore
6
7
8
9
Keine Angabe
Anzahl
25
16
7
2
2
Anteil ( %) der Tumore
ohne Nachweis von Zellen
in der Apoptose
60,0
62,5
71,4
50,0
100,0
Apoptoserate (%)
(Mittelwert ±
Standardabweichung)
7,0 ± 17,2
4,3 ± 13,8
0,1 ± 0,1
1,9 ± 2,7
0,0 ± 0,0
Auch zwischen Apoptose- und Proliferationsrate war kein statistisch signifikanter
Zusammenhang nachweisbar (siehe Tabelle 12 und Abbildung 10).
52
70
60
Apoptoserate (%)
50
40
30
20
10
0
0
4
8
12
16
Proliferationsrate (%)
Abb. 10: Zusammenhang zwischen Apoptoserate und Proliferationsrate. Der Zusammenhang war nicht statistisch signifikant (Pearson‘ Korrelationskoeffizient,
r = 0,100, p = 0,492.
53
III.4 Telomeraseaktivität
Zum Nachweis der Telomeraseaktivität wurden die von der Telomerase hergestellten Produkte (Telomerleitern) zunächst mit Hilfe einer PCR amplifiziert, um
anschließend in einem ELISA nachgewiesen zu werden. Die hieraus resultierenden Produkte wurden photometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt
und korrelierten mit der Aktivität der Telomerase. Die Telomeraseaktivität lag
zwischen 0,05 und 1,59, im Mittel bei 0,56±0,39. Bei ca. der Hälfte der Tumoren
(n = 24, 46,2 %) lag die Telomeraseaktivität zwischen >0,20 und 0,50 (siehe Abbildung 11).
26
24
22
20
18
Häufigkeiten
16
14
12
10
8
6
4
2
0
-0.1
-0.2
-0.5
-1.0
>1.0
Aktivität der Telomerase (Extinktion)
Abb. 11: Aktivität der Telomerase (Extinktion) in Kategorien
54
III.5 Zusammenhänge zwischen der Telomeraseaktivität und den
anderen Tumorparametern
III.5.1 Zusammenhang der Telomeraseaktivität mit Tumorstadium, Grading
und Gleason Score
Die Telomeraseaktivität nahm mit zunehmendem Tumorstadium zu, der Zusammenhang war schwach, aber statistisch signifikant (siehe Abbildung12 und Tabelle 14).
Aktivität der Telomerase (Extinktion)
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
2a
2b
2c
3a
3b
3c
4a
Tumorstadium
Abb. 12: Zusammenhang zwischen Telomeraseaktivität und Tumorstadium. Der
Zusammenhang war statistisch signifikant (Pearson‘ Korrelationskoeffizient,
r = 0,434, p = 0,002).
Bei den Tumoren mit histologischem Grading G1 lag die Telomeraseaktivität bei
im Mittel 0,30±0,12, bei den Tumoren mit G2 bei 0,62±0,41 und bei dem Tumor
mit G3 bei 0,83. Die Telomeraseaktivität nahm mit zunehmendem histologischem
Grading zu (siehe Tabelle 15 und Abbildung 13), der einzige G3-Tumor wurde
von der statistischen Analyse ausgeschlossen.
55
Tab. 15: Korrelation zwischen der Aktivität der Telomerase (Extinktion) und Tumorstadium, histologischem Grading sowie Gleason Score
Pearson‘
Korrelationskoeffizient r
0,434
0,303
0,081
Signifikanzniveau p
Tumorstadium
Histologisches Gradinga
Gleason Score:
Summenwert
Gleason Score: vorherr0,216
schendes Gewebemuster
a = nur G1 und G2, ein Tumor mit G3 wurde ausgeschlossen
Telomeraseaktivität
(Extinktion)
0,002
0,030
0,583
0,140
Bei Tumoren mit einem Gleason Score Grad 3 im vorherrschenden Gewebemuster lag die Telomeraseaktivität im Mittel bei 0,51±0,35, bei Tumoren mit Grad 4
bei 0,64±0,47. Der Tumor mit Grad 5 wies eine Telomeraseaktivität von 1,15 auf.
Für den Summenwert des Gleason Scores sind die Telomeraseaktivitäten in Tabelle 16 dargestellt. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang mit der Apoptoserate ließ sich für den Summenwert bzw. für die Beurteilung des vorherrschenden Gewebemusters im Gleason Score nicht nachweisen (siehe Tabelle 16).
Tab. 16: Mittlere Telomeraseaktivität bei den Tumoren mit unterschiedlichem
Summenwert im Gleason Score
Summenwert im
Gleason-Score
Anzahl
6
7
8
9
Keine Angabe
25
16
7
2
2
Telomeraseaktivität
(Mittelwert ±
Standardabweichung)
0,50 ± 0,37
0,58 ± 0,39
0,73 ± 0,48
0,40 ± 0,28
0,67 ± 0,59
56
Aktivität der Telomerase (Extinktion)
(Mittelwert, Standardabweichung, Minimum und Maximum)
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
G1
G2
G3
Histologisches Grading
Abb. 13: Zusammenhang zwischen Telomeraseaktivität und histologischem Grading. Der Zusammenhang war statistisch signifikant (Pearson‘ Korrelationskoeffizient, r = 0,303, p = 0,030 unter Ausschluss des G3-Tumors).
57
III.5.2 Zusammenhang der Telomeraseaktivität mit Proliferations- und
Apoptoserate
Die Telomeraseaktivität nahm mit der Proliferationsrate der Tumore zu, der Zusammenhang war schwach, aber statistisch signifikant (siehe Tabelle 17 und Abbildung 14). Die Apoptoserate zeigte dagegen keinen Zusammenhang mit der
Aktivität der Telomerase (siehe Abbildung 15).
Tab. 17: Korrelation zwischen Telomeraseaktivität (Extinktion) und Proliferations- sowie Apoptoserate
Telomeraseaktivität
(Extinktion)
Pearson‘
Korrelationskoeffizient r
0,428
-0,001
Proliferationsrate (%)
Apoptoserate (%)
Signifikanzniveau p
0,002
0,996
Aktivität der Telomerase (Extinktion)
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
0
4
8
12
16
Proliferationsrate (%)
Abb. 14: Zusammenhang zwischen Telomeraseaktivität und Proliferationsrate.
Der Zusammenhang war statistisch signifikant (Pearson‘ Korrelationskoeffizient,
r = 0,428, p = 0,002).
58
Aktivität der Telomerase (Extinktion)
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
Apoptoserate (%)
Abb. 15: Zusammenhang zwischen Telomeraseaktivität und Apoptoserate. Der
Zusammenhang war nicht statistisch signifikant (Pearson‘ Korrelationskoeffizient,
r = -0,001, p = 0,996).
59
III.5.3 Zusammenhang der Telomeraseaktivität mit Proliferations- und
Apoptoserate unter Berücksichtigung von Tumorstadium, Grading und
Gleason score
In einer multiplen Regression wurde der Zusammenhang von Tumorstadium, histopathologischem Grading, Gleason Score, Proliferationsrate und Apoptoserate
unter rechnerischer Berücksichtigung der jeweils anderen Einflüsse auf die Aktivität der Telomerase geprüft (siehe Tabelle 18). Der einzige Grad 3-Tumor wurde
dabei ausgeschlossen.
Nach Berücksichtigung der anderen Einflüsse zeigten das Staging und die Proliferationsrate einen statistisch signifikanten und unabhängigen Zusammenhang mit
der Aktivität der Telomerase. Der Zusammenhang war direkt proportional, d.h.
mit zunehmendem Staging und mit zunehmender Proliferationsrate nahm die Aktivität der Telomerase zu.
Das Tumorstadium, das histologische Grading, die beiden Parameter des Gleason
Scores und die Apoptoserate wiesen keinen unabhängigen signifikanten Zusammenhang mit der Telomeraseaktivität auf. Der univariat festgestellte Zusammenhang zwischen Grading und Telomeraseaktivität war unter Berücksichtigung der
übrigen Einflüsse gerade eben nicht mehr statistisch signifikant nachweisbar.
Tab. 18: Multiple Regression der Einflüsse auf die Aktivität der Telomerase (Extinktion)
Tumorstadium
Histologisches Gradinga
Gleason Score:
Summenwert
Gleason Score: vorherrschendes Gewebemuster
Proliferationsrate (%)
Apoptoserate (%)
Standardisierter Kor- Standardfehler
relations-koeffizient ß
von ß
0,296
0,146
0,244
0,129
-0,310
0,198
Signifikanzniveau p
0,049
0,066
0,126
0,221
0,191
0,255
0,365
-0,055
0,133
0,127
0,009
0,666
a = nur G1 und G2, ein Tumor mit G3 wurde ausgeschlossen
60
III.6 Zusammenfassung der Ergebnisse
Insgesamt wurden Gewebeproben von 52 Prostatakarzinomen untersucht. Die
Tumore befanden sich überwiegend im Stadium 2 (n = 23) oder im Stadium 3
(n = 27) und wurden histopathologisch weit überwiegend als mäßig differenziert
[G2] (n = 40) eingestuft. Das histologische Grading wies eine sehr geringe Streuung auf, der Zusammenhang zwischen Tumorstadium und histologischem Grading war nicht signifikant. Der Summenwert des Gleason Score lag zwischen 6
und 9 Punkten und korrelierte direkt mit dem Staging (r 0,441).
Die Proliferationsrate lag im Mittel bei 3,3±3,4 %. Nur zwei Tumore zeigten eine
normale Proliferationsrate < 0,2 %. Die Proliferationsrate nahm mit dem Tumorstadium signifikant zu (r = 0,343). Der Zusammenhang zwischen Grading und
Gleason-Score war nicht signifikant.
In 33 Gewebeproben waren keine Zellen in der Apoptose nachweisbar. Dies entspricht 63,36%. Bei 3 Tumoren lag die Apoptoserate im Normbereich von
< 0,2 %. 15 Tumore wiesen eine erhöhte Apoptoserate auf. Darunter waren
3 Tumore mit Apoptoseraten zwischen 55 % und 65 %. Die Apoptoserate zeigte
keinen signifikanten Zusammenhang zum Tumorstadium, dem Grading, dem
Gleason Score oder der Proliferationsrate.
Die Aktivität der Telomerase wurde photometrisch als Extinktion bei 450 nm bestimmt. Telomeraseaktivität war in allen Gewebeproben nachweisbar. Sie lag im
Mittel bei 0,56±0,39. 24 Tumore wiesen eine Aktivität zwischen >0,20 und 0,50
auf. In der univariaten Analyse wies die Telomeraseaktivität signifikante Zusammenhänge mit dem Tumorstadium (r = 0,434), dem Grading (r = 0,323) und der
Proliferationsrate (r = 0,428) auf, nicht jedoch mit dem Gleason-Score und der
Apoptoserate. In der multivariaten Regression unter Einschluss von Tumorstadium, Grading, Gleason Score, Proliferations- und Apoptoserate zeigten nur die
Proliferationsrate und das Staging einen unabhängigen signifikanten Zusammenhang mit der Telomeraseaktivität (standardisiertes ß = 0,415 für die Proliferationsrate, ß = 0,296 für das Staging). Die univariat festgestellte Korrelation der Telomeraseaktivität mit dem histologischen Grading war unter Berücksichtigung der
übrigen Parameter gerade eben nicht mehr signifikant nachweisbar.
61
IV. Diskussion
Seit Jahren versuchen verschiedene Arbeitsgruppen, Ursachen für unkontrolliertes
Tumorzellwachstum zu finden. Hierbei galten die physiologischen zellkinetischen
Prozesse Apoptose und Proliferation und deren Regulationsmechanismen als ein
grundlegender Ansatz. Jeder Organismus lebt von einem regulierten Gleichgewicht zwischen Zellteilung und Zelltod. Wachstumsstimulierende bzw. wachstumsinhibierende Faktoren sorgen im gesunden Organismus für dieses Gleichgewicht. So wie die Zellteilung von positiv stimulierenden Faktoren kontrolliert
wird, wird auch der Zelltod (Apoptose) von äußeren Signalen über entsprechende
Rezeptoren an der Zelloberfläche ausgelöst. Ungleichgewicht zwischen Apoptoseund Proliferationsrate kann zu Tumorwachstum führen [4, 14, 30].
G0Phase
MPhase
G1Phase
G2Phase
S-Phase
Abb.16: Zellzyklus [18]
Der in Abbildung 16 schematisch dargestellte Zellzyklus zeigt die unterschiedlichen Stadien, die eine Zelle auf dem Weg zur Zellteilung zu durchlaufen hat.
Zwischen der vorausgegangenen Mitose und der erneuten Verdopplung der
Chromosomen in einer Zelle liegt die G1-Phase. In dieser Phase nimmt die Zelle
62
an Größe zu und produziert zahlreiche Proteine, die die Chromosomenverdopplung für die nächste Teilung vorbereiten. Wird ein bestimmter Punkt in der Zelle
überschritten, der sogenannte Restriktionspunkt, tritt sie unwiderruflich in die
nächste Phase, die S-Phase, ein [45]. In diesem Abschnitt kommt es zur Verdopplung des Erbgutes. Die nun folgende G2-Phase dient der Vorbereitung zur Mitose.
Nach der G2-Phase folgt die M-Phase, in der die Zellteilung stattfindet. Nach Vollendung der Mitose kann die Zelle erneut in den Zellzyklus eintreten, oder in die
Ruhephase, die G0-Phase, übergehen. In dieser Ruhephase sind die Zellen in ihrem genetisch vorgegebenen differenzierten Phänotyp metabolisch und funktionell aktiv [5,45].
Die normale Proliferations- bzw. Apoptoserate in der Prostata liegt bei ca. 0,2
Prozent [5].
Abhängig davon in welchem Zyklusstadium sich die Zelle befindet, können unterschiedliche Wachstumsfaktoren die Zelle zur Proliferation oder zum Stillstand
stimulieren [51, 71].
Normalerweise reagiert die Zelle auf extrazelluläre Signale während der G1Phase. Hier spielen besonders EGF (Epidermal growth factor), TGF-α (Transforming growth factor-α) und FGF (Fibroblast growth factor) eine entscheidende
Rolle. Diese Wachstumsfaktoren führen dazu, dass Zellen aus dem Ruhezustand
zur Zellteilung angeregt werden. Um nun von der G1-Phase in die S-Phase des
Zellzyklus zu gelangen, bedarf es des IGF-I (Insulin-like growth factor I) [71].
Zu den wachstumsinhibierenden Faktoren gehört z.B. TGF-β1 (Transforming
growth factor β1), der die Zelle der G1-Phase verharren lassen kann und den
Übergang zur S-Phase verhindert [18].
Im Gegensatz zu normalen Zellen sind diese Regulationsmöglichkeiten bei Tumorzellen häufig verloren gegangen. Maligne Zellen benötigen weniger wachstumsstimulierende Signale, um den Zellzyklus zu durchlaufen und reagieren
nicht auf wachstumsinhibierende Faktoren wie TGF-β1 [18, 71, 72].
Intrazelluläre wachstumsregulierende Signale gehen von Protoonkogenen und
Tumorsuppressorgenen aus. Auch hier ist es wichtig, dass ein ausgeglichenes
Verhältnis besteht. Unausgewogenheit kann wiederum zu Tumorwachstum führen
[28].
63
Wachstumsinhibierende
Faktoren
Wachstumfaktoren
Rezeptor
Rezeptor
Protoonkogene
Signale
Signale
Tumorsuppressorgene
Gene
Zellzyklus
Abb.17: Einfluss von Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen auf den Zellzyklus [71]
Protoonkogene und Tumorsuppressorgene sind zwei Klassen von Genen, die zusammen nur einen kleinen Anteil der genetischen Ausstattung einer Zelle ausmachen, aber in der Krebsentstehung und -promotion eine wesentliche Rolle spielen.
In der normalen Zelle dirigieren sie den Lebenszyklus der Zelle – sie steuern die
verwickelte Abfolge von Vorgängen, durch die sich eine Zelle vergrößert und bei
Bedarf teilt. Protoonkogene fördern das Wachstum, Tumorsuppressorgene bremsen es [78].
Mutiert ein Protoonkogen in der Regulator- oder in der Strukturregion, wird zu
viel wachstumsförderndes Protein synthetisiert oder es wird übermäßig aktiviert.
64
Somit ist durch die Mutation ein krebsbegünstigender Faktor entstanden. Ebenso
kann durch Mutation ein Tumorsuppressorgen verändert bzw. inaktiviert werden,
so dass wachstumshemmende Signale entfallen [78].
TGF-α
EGF
IGF
FGF
TGF-β1
Tumorsuppressorgene
Epithellzelle der
Prostata
Abb. 18: Einfluss der unterschiedlichen Wachstumsfaktoren auf die Epithelzelle
der
Prostata
[72]
Zu den in der Prostata vorkommenden Peptid-Wachstumsfaktoren gehören EGF,
IGF, FGF und Mitglieder der TGF-β Familie. In Anwesenheit von Androgenen
entsteht ein Gleichgewicht zwischen Wachstumsförderung und -inhibition. In
Abwesenheit z.B. nach Kastration fallen IGF, EGF, TGF-α ab, und TGF-β1 steigt
an [18, 70]. Nach Steiner et al. 1995 wirken Peptidwachstumsfaktoren direkt und
die Androgene indirekt auf das Wachstumsverhalten des Prostatagewebes.
EGF und TGF-α binden an dieselben Rezeptoren. Es gibt jedoch in Abhängigkeit
vom Lebensalter eine quantitative Gewichtung der beiden Wachstumsfaktoren. So
wird TGF-α besonders in der Pränatal- und Neonatalphase, EGF besonders beim
Erwachsenen exprimiert. Beiden Faktoren kommt eine mitogene Wirkung zu. Sie
machen ca. 80% der wachstumsfördernden Signale im Prostatagewebe aus [71].
Ebenso wie die beiden zuvor beschriebenen Faktoren haben auch FGF und IGF
eine mitogene Wirkung auf die Prostata. Hervorzuheben ist, dass EGF, FGF und
TGF-α sowohl auf die Epithel- als auch die Stromazellen eine mitogene Wirkung
haben. Beim IGF liegt die wachstumsfördernde Wirkung lediglich im Bereich der
Epithelzellen.
65
TGF-β1 hingegen stoppt das Zellwachstum und kann, falls zusätzlich EGF fehlt,
den programmierten Zelltod induzieren [26, 71].
Um das Proliferations- und Apoptoseverhalten besser zu verstehen, führten Berges et al. Untersuchungen normaler, der präkanzeröser und kanzeröser Prostatae
durch, um zunächst das „normale“ Gleichgewicht im biologischen System der
Prostata zu analysieren. Die Proliferations- und Apoptoserate in gesundem Prostatagewebe lag hier bei <0,2%/d. Zunächst nimmt bei einer frühen präkanzerösen
Transformation die Proliferationsrate im Vergleich zur Apoptoserate zu, so dass
ein Nettowachstum resultiert. Im weiteren Verlauf gleichen sich zunächst Apoptoserate und Proliferationsrate an. Das Wachstum sistiert. Bei der Weiterentwicklung zum lokalen Prostatakarzinom nimmt die Apoptoserate verhältnismäßig stärker ab, als die Proliferationsrate zunimmt. Zunehmende maligne Transformation
der Zellen führt zu einer Zunahme des Proliferationsumsatzes gegenüber der
Apoptoserate. Der Tumor wächst [5, 6].
Claus et al. untersuchten das zellkinetische Verhalten von stromalen und epithelialen Zellen der Prostata bei benigner Prostatahyperplasie. Es ließ sich keine Korrelation zwischen Proliferations- bzw. Apoptoserate in stromalem und epithelialem Gewebe und dem Alter des Patienten bzw. dem Prostatavolumen herstellen.
Lediglich die Tatsache, dass sich in stromalem Gewebe keine Apoptosezellen
nachweisen ließen, ließ ein zellkinetisches Verhalten zugunsten der Proliferation
ableiten [17].
Ein weiterer möglicher Erklärungsansatz für unkontrolliertes Zellwachstum eröffnete sich durch die Entdeckung des Enzyms Telomerase. Es wurde zunächst in
Keimzellen und in durch Mutation unsterblich gewordenen Zellen (Tumorzellen)
nachgewiesen. Die Telomerase ist ein Ribonukleoprotein mit einer RNAKomponente, die als Matrize für die Synthese des Telomers dient [54, 65]. Die
Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT) ist die katalytische Untereinheit des
Enzyms und eng mit der Telomeraseaktivität korreliert [61].
66
Eine Verkürzung der Telomere in Keimzellen wäre fatal, da hierdurch die Lebensspanne nachfolgender Generationen verkürzt würde. Um dies zu verhindern,
existiert das Enzym Telomerase, das Telomere neu synthetisieren kann. Zunächst
war beim Menschen die Rolle der Telomerase nur während der Embryogenese
bekannt. Postnatal ist in den meisten somatischen Zellen die Telomeraseaktivität
unterdrückt. Dadurch kommt es zu einer Telomerverkürzung und Alterung in fast
allen menschlichen Geweben und Organen [7].
Telomerverkürzungen stellen einen Risikofaktor für die Entstehung von Tumoren
dar. Es kommt zur chromosomalen Instabilität und Tumorentstehung. Für den
Tumorprogress ist eine Reaktivierung der Telomerase erforderlich. Die Funktion
der Telomerase verhindert weitere chromosomale Instabilität und sichert das
Überleben der Tumorzellen. Auf Grundlage des zunehmenden Verständnisses der
Funktion von Telomeren und Telomerase bei der Regeneration, Organhomöostase
und Krebsentstehung erscheinen Telomere und Telomerase als viel versprechende
molekulare Angriffspunkte für zukünftige Therapien [42].
In dieser Dissertation wurde der mögliche Zusammenhang zwischen Telomeraseaktivität bzw. Proliferations- und Apoptoseverhalten in Prostatakarzinomgewebe in Abhängigkeit von Tumorstadium und Differenzierungsgrad (Grading) bzw.
Gleason score untersucht. Des Weiteren sollte diskutiert werden, ob sich aus den
Ergebnissen klinische Konsequenzen für das Prostatakarzinom ergeben.
Es konnte anhand der statistischen Auswertung in dieser Arbeit nachgewiesen
werden, dass die Proliferationsrate der untersuchten Prostatakarzinome im Mittel
bei 3,3±3,4 % lag, nur zwei Tumore zeigten eine normale Proliferationsrate <
0,2 %. Die Proliferationsrate nahm mit dem Tumorstadium signifikant zu
(r = 0,343), der Zusammenhang mit WHO-Grading und Gleason score war nicht
signifikant.
In einer Arbeit von Feneley et al. wurde der Wert des Proliferationsindexes für
frühe Stadien des Prostatakarzinoms ermittelt. Es wurden mittels TUR-P und radikaler Prostatektomie gewonnene Resektate von T1-Prostatakarzinomen durch
Färbung mit Ki-67 untersucht. In den mittels TUR-P gewonnenen Resektaten
konnte eine signifikante Korrelation des Proliferationsindexes sowohl mit Grading
als auch Staging nachgewiesen werden [27]. Auch die Forschungsgruppe von
Furuya et al. konnte zeigen, dass der Proliferationsindex in schlecht differenzierten Prostatakarzinomen signifikant höher war als in mittelgradig differenzierten
Prostatakarzinomen [28].
67
In einer Arbeit von Cheng wurde das Proliferationsverhalten mittels Ki-67 als
Progressionsmarker in lymphogen metastasierten Prostatakarzinomen untersucht.
Hierzu wurden 138 Patienten nach radikaler Prostatektomie und pelvinem
Lymphstaging im Mittel 6,7 Jahre beobachtet. 93% dieser Patienten hatten eine
antiandrogene Therapie erhalten. Ki-67 korrelierte mit dem Gleason score und der
nodalen Tumormasse und war signifikanter Prädiktor für das progressionsfreie
Überleben [15].
Die Arbeitsgruppe um Taftachi konnte ebenfalls einen Zusammenhang zwischen
Ki-67, dem progressionsfreien Überleben, Gleason score und Tumorstadium herstellen. Hierzu wurden 114 Patienten nach radikaler Prostatektomie und Bestimmung der Proliferationsrate mittels Ki-67, Gleason score und Tumorstadium im
Mittel 33 Monate beobachtet [74]
In einer Arbeit von Pollack et al wurden 537 Patienten mit einem Prostatakarzinom im Mittel 96,3 Monate nach erfolgter Radiatio und Androgendeprivation
beobachtet. Auch hier erwies sich Ki-67 als Prädiktor für Fernmetastasen und
Mortalität bei Patienten mit einem Prostatakarzinom mit erfolgter Radiatio und
Androgendeprivation [63].
Im Gegensatz zu den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen konnte in dieser Arbeit
lediglich ein Zusammenhang zwischen der Proliferationsrate und dem Tumorstadium nachgewiesen werden. Eine Korrelation zwischen der Proliferationsrate und
dem Gleason score konnte nicht hergestellt werden. Eine mögliche Erklärung ist,
dass dieser Arbeit Proben mit einer geringen Streuungsbreite im histopathologischen Grading zugrunde lagen, so dass an diesem Kollektiv keine Korrelation
zwischen Grading und Proliferationsrate herzustellen war. Im Gegensatz dazu
wurde ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Proliferationsrate und
Tumorstadium gefunden, der auch von anderen Arbeitsgruppen bestätigt wurde
[5, 38, 52]. Somit scheint, auch gerade im Hinblick auf die Ergebnisse anderer
Arbeitsgruppen, in denen eine eindeutige Korrelation von Proliferationsrate, dem
Gleason score und auch der Progression hergestellt werden konnte, dem Prozess
der Proliferation eine wesentliche Rolle in der Tumorprogression zuzukommen.
Zudem sollte die Rolle der Apoptoserate beim Tumorwachstum untersucht werden. In 33 von 52 Gewebeproben (63,36%) waren keine Zellen in der Apoptose
nachweisbar. Bei 3 Tumoren lag die Apoptoserate im Normbereich von < 0,2 %.
15 Tumore wiesen eine erhöhte Apoptoserate auf. Darunter waren 3 Tumore mit
Apoptoseraten zwischen 55 % und 65 %. Die Apoptoserate zeigte keinen signifi68
kanten Zusammenhang mit dem Tumorstadium, dem Grading, dem Gleason score
oder der Proliferationsrate.
In einer Arbeit von Choi und Vesalainen konnte eine Korrelation zwischen Apoptose und Tumorstadium herstellen werden. Es zeigte sich, dass mit Zunahme des
Tumorstadiums eine erhöhte Apoptoserate vorhanden war [16].
Die Arbeitsgruppe um Aihara et al. konnte zeigen, dass ein niedriger Apoptose
Index eine niedrige Progressionsrate zur Folge hatte. Eine hohe Progressionsrate
war mit einer hohen Apoptoserate assoziiert. Hierbei waren jedoch nur Gleason 3
Karzinome untersucht worden [1]. Letztlich lassen die Ergebnisse dieser Arbeit
mit fehlendem Zusammenhang der Apoptoserate mit Tumorstadium, Grading,
Gleason score und Proliferationsrate keine Rückschlüsse auf die Rolle der Apoptose bei der Tumorprogression des Prostatakarzinoms zu.
Möglicherweise handelt es sich bei Prostatakarzinomzellen um eine weitaus heterogenere Gruppe mit komplexerem Wachstumsverhalten als bisher angenommen.
Andererseits repräsentieren die Gewebeproben, die dieser Arbeit zu Grunde lagen,
auch nur einen Teil des gesamten Karzinoms. Vielleicht waren aggressivere Tumoranteile vorhanden, die jedoch in den vorliegenden Gewebeschnitten nicht miterfasst wurden.
Etablierte Therapieoption beim fortgeschrittenen Prostatakarzinom ist die Androgendeprivation. Sie führt zur Involution der Prostata durch Induktion von Apoptose [14, 18, 30, 48, 60]. Initial profitieren fast alle Patienten vom Androgenentzug
in Form einer Reduktion der Tumormasse und Tumorprogression [20]. Im Tierexperiment starben durchschnittlich 70% der androgenabhängigen Drüsenzellen
bis zum 7. Tag nach Kastration [18]. Unter physiologischen Bedingungen halten
sich Proliferation und Apoptose die Waage mit einer Rate von jeweils 1-2% [18,
20]. Nach der Kastration treten weniger Zellen in die S-Phase ein. Die Prostatazellen durchlaufen die Apoptose, ohne in die G1-Phase eines defekten Zellzyklus
eingetreten zu sein. Beim programmierten Zelltod durch Androgenentzug ist p53
nicht involviert [20]. Bei den Peptidwachstumsfaktoren kommt es zu einem Abfall von EGF, IGF und FGF; Rezeptoren für diese Faktoren werden an den Epithelzellen vermehrt exprimiert. Anders verhält es sich mit TGF-β1. Zwar kommt
es auch zum Anstieg der TGF-β-Rezeptoren, jedoch ebenfalls auch zu einem Anstieg von TGF-β1 [71]. Dadurch wird die Zellproliferation des Prostataepithels
gestoppt und der epitheliale programmierte Zelltod ermöglicht [71].
69
Vermutlich überleben allerdings wenige androgenunabhängige Zellen und es
kommt zu erneutem Tumorwachstum, das durch Androgenentzug nicht mehr zu
beeinflussen ist. Somit werden Therapieverfahren erforderlich, die das Wachstum
hormonunabhängig hemmen. Beim hormonrefraktären Prostatakarzinom werden
als Chemotherapeutika z.B. die Taxane Docetaxel und Paclitaxel eingesetzt, die
über einen androgenunabhängigen Weg die Apoptose induzieren. Sie wirken über
eine Phosphorylierung von Bcl-2 am Mikrotubulus der Tumorzelle [56]. In einigen Studien konnte ein signifikanter Überlebensvorteil nachgewiesen werden,
sodass die Taxane von der FDA zur Behandlung des hormonrefraktären PCA zugelassen wurden. Eine Heilung ist jedoch nicht zu erzielen.
Um einen zusätzlichen Baustein in dem zellkinetischen Verständnis des Tumorwachstums zu gewinnen, wurde in dieser Arbeit der mögliche Zusammenhang
zwischen Proliferationsrate, Apoptoserate, Tumorstadium, Grading und Gleason
score im Hinblick auf die Telomeraseaktivität untersucht.
Telomeraseaktivität war in allen Gewebeproben nachweisbar, sie lag im Mittel bei
0,56±0,39. 24 Tumore wiesen eine Aktivität zwischen >0,20 und 0,50 auf. In der
univariaten Analyse wies die Telomeraseaktivität signifikante Zusammenhänge
mit dem Tumorstadium (r = 0,434), dem Grading (r = 0,323) und der Proliferationsrate (r = 0,428) auf, nicht jedoch mit der Apoptoserate. In der multivariaten
Regression unter Einschluss von Tumorstadium, Grading, Proliferations- und
Apoptoserate zeigte nur die Proliferationsrate einen unabhängigen signifikanten
Zusammenhang mit der Telomeraseaktivität (standardisiertes ß = 0,415).
Die Korrelationen der Telomeraseaktivität mit dem Tumorstadium und dem histologischen Grading sind am ehesten durch die Zunahme der Proliferationsrate mit
zunehmendem Tumorstadium bzw. Grading erklärbar. Eine erhöhte Apoptoserate
war in den meisten Karzinomgeweben nicht nachweisbar.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Telomerase ein entscheidendes
Schlüsselenzym in der Beeinflussung des zellulären Fließgleichgewichts ist. Sie
ist für die Immortalisierung der Zellen und für das unkontrollierte Tumorwachstum beim Prostatakarzinom mitverantwortlich. Wird die Telomerase in einer
entdifferenzierten Zelle aktiviert, so wird die Zelle unsterblich. Die Proliferation
kann ungebremst voranschreiten, und Apoptose ist in den meisten Zellen nicht
mehr möglich.
Mit zunehmender Proliferationsrate nimmt die Telomeraseaktivität zu. Eine positive Korrelation besteht auch zwischen der Telomeraseaktivität und dem Tumor70
stadium. Je höher das Tumorstadium ist, desto höher ist auch die gemessene Telomeraseaktivität. Dieses impliziert, dass ohne erhöhte Telomeraseaktivität keine
gesteigerte Proliferation und somit kein progredientes Tumorwachstum möglich
ist.
In den meisten menschlichen somatischen Zellen ist Telomerase-Expression sehr
gering oder gar nicht vorhanden. Beim Erwachsenen beschränkt sie sich auf Zellen der Hämatopoese, Keimzellen und Stammzellen. Eine Reaktivierung der Telomerase wird in mehr als 80% der menschlichen Tumore beobachtet [66]. Tumoren mesenchymalen Ursprungs bedienen sich eines alternativen, Telomeraseunabhängigen Weges zur Erhaltung der Telomerenlänge (ALT) [53]. TelomeraseExpression fördert die Transformation menschlicher Zellen in vitro. Die Tumorgenese wiederum wird durch die Verkürzung der Telomere im Tiermodell inhibiert.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Reaktivierung der Telomeraseaktivität auch beim progredienten Tumorwachstum des Prostatakarzinoms eine entscheidende Rolle spielt.
Ob die Telomeraseaktivität auch zur Tumordiagnostik ausgenutzt werden kann,
wurde kürzlich von einer Forschungsgruppe untersucht. Sie bestimmten die molekularen Marker Cytokeratin 20, CD4 mRNA und die Expression der Telomerase
mRNA, die für die katalytische Untereinheit kodiert im Urin. Die Sensitivität der
Urinzytologie zur Detektion eines Harnblasenkarzinoms könnte durch Kombination dieser Messverfahren deutlich gesteigert werden [68]. Ähnliche Ansätze für
das Prostatakarzinom liegen zurzeit nicht vor.
Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Arbeit eröffnen sich neue experimentelle
Konzepte in der Therapie des Prostatakarzinoms, die auf einer Hemmung der Telomeraseaktivität beruhen.
Ein Therapieansatz besteht in der Anwendung von Antisense-Oligonukleotiden,
also kurzen, der Ziel-RNA der Telomerase komplementären Einzelstrang DNA
Sequenzen, die direkt die Telomeraseaktivität hemmen. Durch den Einsatz einer
solchen Antisense-Telomerase an humanen Magen- und Kolon- Karzinomzellen
RNA konnte eine Hemmung des Zellwachstums und ein Zell-Zyklus-Arrest erreicht werden [80]. Ähnliche Effekte konnten auch bei der Anwendung beim Zervix-, Ovarial-, Blasen-und Prostatakarzinom, sowie beim Glioblastom nachgewiesen werden [50,80]. Die direkte Injektion der Antisense-Oligonukleotide in trans-
71
plantierte Prostatakarzinomzellen im Nackt-Maus-Modell führte zu einer Reduktion des Tumorvolumens um 14% [1].
Auch Reverse Transkriptase-Inhibitoren, wie sie in der HIV-Therapie Anwendung
finden, hemmen die Telomeraseaktivität in vitro. Das Nukleosidanalogon Didesoxyguanosin inhibiert die Telomeraseaktivität und bewirkt eine zunehmende Verkürzung der Telomere in immortalisierten humanen Lymphozyten-Zelllinien. Der
Einsatz von zytotoxischen T-Zellen, die sich spezifisch gegen Telomerasepositive Tumorzellen richten und diese lysieren, ist ein weiterer Ansatz der antitumorösen Therapien. Denkbar wäre auch eine Hemmung der Aktivität des Promotors der Telomerase, z.B. durch eine entsprechende Gentherapie oder durch
onkolytische Viren [53].
Ein weiterer Ansatz liegt in der Downregulation der Telomeraseaktivität durch
Histondeacetylasehemmer [73].
Histondeacetylasen (HDACs) entfernen Acetylgruppen von acetyliertem Lysin
auf dem N-terminalen Histonende. Durch die Deacetylierung bekommt die Aminosäure Lysin wieder eine positive elektrische Ladung. Dies erhöht die Affinität
des Histonendes für das negativ geladene Phosphat-Gerüst der DNA. Durch die
folgende Blockierung der DNA für Transkriptionsfaktoren wird die DNATranskription herunterreguliert. Dies geht meist mit der Bildung von vor allem
inaktivem Heterochromatin einher [73].
Die Arbeitsgruppe von Suenaga et al. behandelten Prostatakarzinomzellen mit den
HDAC-Inhibitoren Trichostatin A und Natrium-Butyrat und wiesen eine Downregulation der Telomeraseaktivität durch Suppression der hTERT mRNA Epression
nach [73].
Die Behandlung einer Ovarialkarzinomzelllinie durch die Arbeitsgruppe von Zhu
et al. Führte zwar zur Inhibtion der Zellproliferation und Induktion von Apoptose,
hatte jedoch keinen Effekt auf die Telomeraseaktivität [81].
Eine weitere Substanz zur Hemmung der Telomeraseaktivität wurde von Thelen
et al. an androgensensitiven Prostatazelllinien untersucht. Silibinin, ein Wirkstoffkomplex aus dem Extrakt der Mariendistel, regulierte die Telomeraseaktivität und
die PSA-Sekretion herunter, so dass Silibinin als potenzielle antiproliferative
Substanz bei der Therapie des Prostatakarzinoms gilt [75].
Die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen zellkinetischen Veränderungen im
Tumor in Korrelation zur Telomerase unterstreichen die Relevanz der Erforschung weiterer diesbezüglicher Therapieansätze.
72
Die Funktion der Telomere selbst bei Tumorentstehung und -progress ist ebenfalls
Gegenstand multipler Studien. Offenbar erscheinen schon in frühen Stadien der
Karzinogenese des Prostatakarzinoms Telomerverkürzungen. Bei der Untersuchung von PIN fanden sich in 93% verkürzte Telomere. Sie gelten somit als Precursor für die Entstehung eines Adenokarzinoms der Prostata [53].
Kurze, dysfunktionelle Telomere fördern durch Induktion chromosomaler Instabilitäten die Tumorinitiation. Können Telomere ein Chromosom nicht mehr vor
Anomalien schützen, kann es zur Fusion von Schwesterchromosomen und somit
zur Entstehung dizentrischer Chromosomen kommen, die in der nächsten Mitose
zu weiteren Anomalien führen. Tumorzellen stabilisieren die dysfunktionellen
Telomere durch Reaktivierung der Telomerase. Es kommt zur Immortalisation.
Die strukturellen Chromosomenveränderungen setzen sich jedoch fort und es
entsteht eine heterogene Gruppe neuer Tumorzellen [53].
Inzwischen wurde die Relevanz der Telomeraseaktivität in der Karzinogenese
auch für andere Tumorentitäten untersucht.
So konnte in einer japanischen Arbeit gezeigt werden, dass in kolorektalen serösen Adenomen hTERT stärker exprimiert wurde als in hyperplastischen Polypen,
sodass eine Tendenz zur malignen Tranformation als wahrscheinlich gilt. Zudem
schlossen die Autoren, dass das Tumorsupressorgen p53 durch down-Regulation
der Transkription hTERT inhibiert. Ohne p53 komme es auch bei kolorektalen
serösen Adenomen zur zellulären Immortalisierung als Voraussetzung zur neoplastischen Transformation [61].
Für Brustkrebszellen konnte ebenfalls ein positiver Zusammenhang zwischen der
Telomeraseaktivität und der proliferativen Aktivität von Krebszellen nachgewiesen werden. Mit steigender Proliferationsaktivität stieg die Zahl der Zellen, in
denen hTERT und Ki-67 nachgewiesen wurden, an, ebenso bei Vorliegen von
Lymphknotenmetastasen [41].
Zusammenfassend lässt sich die Reaktivierung der Telomeraseaktivität als ein
Baustein der zellkinetischen Veränderungen herausstellen, der Proliferation begünstigt und die Apoptosefähigkeit einer Zelle hemmt.
Die Telomerasereaktivierung ist angesichts der Komplexität der zellkinetischen
Veränderungen beim Tumorwachstum jedoch nur ein Baustein und nur einer von
vielen vorstellbaren Therapieansätzen bei der Behandlung epithelialer Tumoren.
73
V. Zusammenfassung
Das Prostatakarzinom zählt neben den Malignomen der Lunge und des Dickdarms
zu der häufigsten Krebserkrankung des Mannes. In der Bundesrepublik Deutschland erkranken jährlich mehr als 30.000 Männer an einem Prostatakarzinom, und
die Inzidenz hat sich in den letzten Jahren verdoppelt. Daher kommt dem Verständnis der Entstehung und des Wachstums des Prostatakarzinoms zur Etablierung von neuen Therapieansätzen eine besondere Bedeutung zu.
Hierzu sollte in dieser Dissertation untersucht werden, ob eine Korrelation zwischen Telomeraseaktivität bzw. Proliferations- und Apoptoseverhalten in Prostatakarzinomgewebe in Abhängigkeit von Tumorstadium und Differenzierungsgrad
(Grading) bzw. Gleason score besteht.
Des Weiteren sollte diskutiert werden, ob sich aus den Ergebnissen klinische
Konsequenzen für das Prostatakarzinom ergeben.
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden Gewebeproben von Prostatakarzinomen hinsichtlich der Proliferationsaktivität, der Apoptoserate und der Telomeraseaktivität untersucht.
Die Tumore befanden sich überwiegend im Stadium pT2 (n = 23) oder im Stadium pT3 (n = 27) und wurden histopathologisch weit überwiegend als mäßig
differenziert [G2] (n = 40) eingestuft. Das histologische Grading wies eine sehr
geringe Streuung auf, der Zusammenhang zwischen Tumorstadium und histologischem Grading war nicht signifikant. Der Summenwert des Gleason-Score lag
zwischen 6 und 9 Punkten und korrelierte direkt mit dem Staging (r 0,441).
Die Proliferationsrate lag im Mittel bei 3,3±3,4 %. Nur zwei Tumore zeigten eine
normale Proliferationsrate < 0,2 %. Die Proliferationsrate nahm mit dem Tumorstadium signifikant zu (r = 0,343). Der Zusammenhang zwischen Grading und
Gleason-Score war nicht signifikant.
In 33 Gewebeproben waren keine Zellen in der Apoptose nachweisbar. Dies entspricht 63,36%. Bei 3 Tumoren lag die Apoptoserate im Normbereich von
< 0,2 %. 15 Tumore wiesen eine erhöhte Apoptoserate auf. Darunter waren
3 Tumore mit Apoptoseraten zwischen 55 % und 65 %. Die Apoptoserate zeigte
keinen signifikanten Zusammenhang zum Tumorstadium, dem Grading, dem
Gleason Score oder der Proliferationsrate.
74
Die Aktivität der Telomerase wurde photometrisch als Extinktion bei 450 nm bestimmt. Telomeraseaktivität war in allen Gewebeproben nachweisbar. Sie lag im
Mittel bei 0,56±0,39. 24 Tumore wiesen eine Aktivität zwischen >0,20 und 0,50
auf. In der univariaten Analyse wies die Telomeraseaktivität signifikante Zusammenhänge mit dem Tumorstadium (r = 0,434), dem Grading (r = 0,323) und der
Proliferationsrate (r = 0,428) auf, nicht jedoch mit dem Gleason-Score und der
Apoptoserate. In der multivariaten Regression unter Einschluss von Tumorstadium, Grading, Gleason-Score, Proliferations- und Apoptoserate zeigten nur die
Proliferationsrate und das Staging einen unabhängigen signifikanten Zusammenhang mit der Telomeraseaktivität (standardisiertes ß = 0,415 für die Proliferationsrate, ß = 0,296 für das Staging). Die univariat festgestellte Korrelation der Telomeraseaktivität mit dem histologischen Grading war unter Berücksichtigung der
übrigen Parameter gerade eben nicht mehr signifikant nachweisbar.
Die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen zellkinetischen Veränderungen im
Tumor in Korrelation zur Telomerase unterstreichen die Relevanz der Erforschung weiterer diesbezüglicher Therapieansätze.
Zusammenfassend lässt sich die Reaktivierung der Telomeraseaktivität als ein
Baustein der zellkinetischen Veränderungen herausstellen, der Proliferation begünstigt und die Apoptosefähigkeit einer Zelle hemmt.
Die Telomerasereaktivierung ist angesichts der Komplexität der zellkinetischen
Veränderungen beim Tumorwachstum jedoch nur ein Baustein und nur einer von
vielen vorstellbaren Therapieansätzen bei der Behandlung epithelialer Tumoren.
Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Arbeit eröffnen sich neue experimentelle
Konzepte in der Therapie des Prostatakarzinoms, die auf einer Hemmung der Telomeraseaktivität beruhen.
75
VI. Literaturverzeichnis
[1] Aihara, M., Sacardino, P., Truong, L., Wheeler, T., Goad, J., Yang, G.,
Thompson, T. (1994). Ther frequency of apoptosis correlates with prognosis
of gleason grade 3 adenocarcinoma of the prostate. Cancer 75, 522-529
[2] Akiyama, M., Hideshima, T., Munshi, N. C., Anderson, K. C. (2002). Telom-
erase Inhibitors as Anticancer Therapy. Curr. Med. Chem. 2, 567-575
[3] Andren, O., Fall K., Franzen, L., Andersson S.-O., Johansson, J.-E., Rubin M.
A. (2006). How well does the Gleason score predict Prostate Cancer Death? A
20-Year followup of a Popluation based Cohort in Sweden. The Journal of
Urology 175, 1337-1340
[4] Berges, R., Furuya, Y., Remington, L., English, H. F., Jacks, T., Isaacs, J. T.
(1993). Cell proliferation, DNA repair, and p53 function are not required for
programmed death of prostatic glandular induced by androgen ablation. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90, 8910-8914
[5] Berges, R., Isaacs, J. (1993). Programming events in the regulation of cell pro-
liferation and death. Clin. Chem. 39(2), 356-361
[6] Berges, R., Jasminka, Vukanovic, Jonathan, I. Epstein, Marne, CarMichel,
Lars, Cisek, Douglas, E. Johnson, Robert, W. Veltri, Patrick, C., Walsh, John
Isaacs (1995). Implication of Cell Kinetic Changes during the Progression of
Human Prostatic Cancer. Clinical Cancer Research 5, 473-480
[7] Biroccio, A., Leonetti, C. (2004). Telomerase as a new target for the treatment
of hormone-refractory prostate cancer. Endocrine related Cancer 11, 407-421
[8] Böcking, A., Riede, U. A. (1995). Vorsteherdrüse. Allgemeine und spezielle
Pathologie, Georg Thieme Verlag Stuttgart
[9] Bonkhoff, H., Remberger, K. (1998). Morphogenese der benignen Prostata-
hyperplasie und des Prostatakarzinoms. Pathologe 19, 12-20
76
[10] Bonkhoff, H., Remberger, K. (1996). Differentiation pathways and histoge-
netic aspects of normal and abnormal prstatic growth: a stem cell model. Prostate 28, 98-106
[11] Bonkhoff, H., Stein, U., Remberger, K. (1995). Endocrine-paracrine cell-
types in the Prostate and prostatic adenocarcinoma are postmitotic cells. Hum
Pathol 26, 167-170
[12] Bostwick, D.G. (1995). High grade prostatic intraepithelial neoplasia. The
most likely precursor of prostate cancer. Cancer 75, 1823-1836
[13] Burns, T., El-Deiry, S. (1999). The p53 pathway and apoptosis. Journal of
Cellular Physiology 181, 231-239
[14] Carson, D. A., Ribeiro, J. M. (1993). Apoptosis and disease. The lancet 341
(15), 1251-1254
[15] Cheng, L., Pisansky, T. M., Sebo, T. J., Leibovich, B.C., Ramnani, D. M.,
Weaver, A. L., Scherer G. B., Blute, M. L., Zincke, H., Bostwick, D. G.
(1999). Cell proliferation in Prostate Cancer patients with Lymph Node Metastasis: A Marker of Progression. Clinical Cancer Research 5, 2820-2823
[16] Choi. N. G., Sohn, J. H., Park, H. W., Jung, T. Y. (1999). Apoptosis and nu-
clear shapes in bengin prostate hypetplasia and prostate adenocarcinoma:
comparison with and relation to Gleason score. Int j. Urol 6, 13-18
[17] Claus, S., Berges, R., Senge, T., Schulze, H. (1997). Cell kinetic in epithe-
lium and stroma of benign prostatic hyperplasia. Journal of Urology 158, 2-3
[18] Coffey, D. S., Isaacs, J. T. (1981). Prostate Tumor Biology and Cell Kinetics-
Theory. Urology 17 (3), 40-53
[19] David, G., Bostwick, Meiers, I. (2006). Atypical small acinar proliferation in
the prostate. Arch Pathol, Lab Med 130, 952-957
77
[20] Denmeade, S. R., Lin, X. S., Isaacs, J. T. (1996). Role of programmed (apop-
totic) cell death during the progression and Therapy for prostate cancer. Prostate 28 (4), 251-265
[21] Djojosubroto, Wolundar, M., Choi, Y. S., Lee, H. W., Rudolph, K. L. (2003).
Telomeres and Telomerase in Aging, Regeneration and Cancer. Mol. Cells 15
(2), 164-175
[22] Epstein, J. I., Allsbrook, W. C., Amin, M. B., Egevad, L. L. (2005). The 2005
International Society of Urological Pathology (ISUP) Consensus cenference
on gleason grading of prostatic carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 29, 1228-1242
[23] Epstein, J. I., Herawi, M. (2006). Prostate needle biopsies containing prostatic
intraepithelial neoplasia or atypical focia suspicious for carcinoma: Implications for patient care. The Journal of urology 175, 820-834
[24] Eastham, J. A., May, R., Robertson, J. L., Sartor, O., Kattan M. W. (1999).
Development of a nomogram that predicts the probalitity of a positive prostate
biopsy in men with abnormal digital rectal examination and a prostate-spezific
antigen between 0 and 4bg/ml. Urology 54,708-713
[25] Fair, W. R., Fleischer, N. E., Heston, W. (1997). Cancer of the prostate: a nu-
trional diasease. Urology 50, 840-848
[26] Farnworth, W. E. (1999). Prostate Stroma: Physiology. The Prostate 38, 60-
72
[27] Feneley, M. R., Young, M. P. A., Chinyama, C., Kirby, R. S., Parkinson, M.
C. (1996). Ki-67 expression in early prostate cancer and associated pathological lesions. Clin Pathol. 49, 741-748
[28] Furuya, Y., Kawauchi, Y., Fuse, H. (2003). Cell proliferation, apoptosis and
prognosis in patients with metastatic Prostate Cancer. Anticancer Research 23,
577-581
78
[29] Gerdes, J., Schwab, U., Lemke, H., Stein, H. (1983). Production of a mouse
monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with
cell proliferation. Int. J. Cancer 31, 13-20
[30] Geschwend, J. E. (1996). Apoptose – Grundlagen und Bedeutung des prog-
rammierten Zelltodes für das Prostatakarzinom. Urologe A 35, 390-399
[31] Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. (GE-
KID), Robert Koch Institut (Herausgeber) (2006). Krebs in Deutschland. 5.
überarbeitete Auflage
[32] Gleason, D. F., Mellinger, G. T. (1974). Prediction of prognosis for prostatic
adenocarcinoma by combined histological grading and clinical staging. J Urol
111, 58-64
[33] Greider, C. W., Blackburn, E. H. (1996). Telomere, Telomerase und Krebs.
Spektrum der Wissenschaft 4, 30-36
[34] Griffiths, K, Khoury, S. (1994). Primer on molecular control of prostatic
growth. Jersy Scientific Communications international
[35] Hammerer, P., Graefen, M., Steuber, T., Huland, H. (2000). Chemopräven-
tion des Prostatakarzinoms. Urologe A 39, 304-308
[36] Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. (1990). Telomeres shorten dur-
ing ageing of human fibroblasts. Nature 345, 458-460
[37] Harley, C. B., Vaziri, H., Counter, C. M., Allsopp, R. C. (1992). The telomere
hypothesis of cellular aging. Exp Gerontol 27, 375-382
[38] Haussler, O., Epstein J. I., Amin, M. B., Heitz, P. U., Hailemariam, S. (1999).
Cell proliferation, apoptosis, oncogene, and tumor suppressor genes in adenosis with comparison to benign prostatic hyperplasia, prostatic intraepithelial
neoplasia, and cancer. Hum Pathol 30(9), 1077-86
79
[39] Heidenreich, A. (2007). Screening, Diagnostik und Staging des Prostatakarzi-
noms. Focus Onkologie 3,54-61
[40] Holstein, A. F. (1994). Männliche Geschlechtsorgane. Benninghoff Anatomie
Band 2, Urban & Schwarzenberg München
[41] Ikeda, S., Shibata, T., Eishi, Y., Takizawa, T., Koike, M. (2003). Correlation
between the expression of telomerase reverse transcriptase and proliferative
activity in breast cancer cells using an immunocytochemical restaining
method. Pathol Int 53 (11), 762-8
[42] Izekowski, K. A., Pantazis, C. G., McGreogor, D. H., Wu, Y., Tawfik, O. W.
(2002). Telomerase reverse transcriptase subunit immunoreactivity: a marker
for high-grade prostate carcinoma. Cancer 95, 2487-2493
[43] Jarred, R., Keikha, M., Dowling, C., McPherson, S., Clare, A., Husband, A.,
Pedersen, J., Frydenberg, M., Risbridger, G.(2002). Induction of Apoptosis in
low to moderate-grade human Prostate carcinoma by red clover-derived dietary isoflavones. Cancer Research 11, 1689-1696
[44] Junqueira, Carneiro (1996). Prostata. Histologie 4. Auflage, Springer Verlag
Berlin
[45] Kassen, A., Hofmockel, G. (2000). Molekularbiologische und zellbiologische
Grundlagen der Entstehung von malignen Tumoren. Urologe A 39, 214-221
[46] Kelloff, G. J., Liebermann, R., Stelle, V. E. , Boone, C. W., Lubet R., Kelpo-
vitch, L. (1999). Chemoprevention of prostate: Concepts and strategies. Eur
Urol 35, 342-350
[47] Kenneth A., Iczkowski (2006). Current prostate biopsy interpretation. Arch
Pathol Lab Med 130, 835-843
[48] Kilche, K. O., Clement, J. H., Höffken, K. (1999). Apoptose – Mechanismen,
Regulation und therapeutische Modulation als klinische Perspektive. Onkologe 5, 891-897
80
[49] Klatte, T., Klatte, D., Böhm, M., Allhoff, E. P.(2006). Die Skelettszintigra-
phie beim neu diagnostizierten Prostatakarzinom. Urologe 45, 1293-1299
[50] Kondo, Y., Koga S., Komata T., Kondo S. (2000). Treatment of prostate can-
cer in vitro and in vivo with 2-5A-anti-telomerase RNA component. Oncogene 18, 2205-11
[51] McKenzie, Shaun, N., Kyprianou (2006). Apoptosis Evasion: The Role of
Survival Pathways in Prostate Cancer Progression and Therapeutic Resistance.
Journal of Cellular Biochemistry 97, 18-32
[52] Limas, C., Frizelle, S. P. (1995). Proliferative activity in benign and neoplas-
tic prostatic epithelium. J Pathol. 174(3), 201-208
[53] Meeker, Alan K., De Marzo, A. M. (2003). Recent advances in telomere bi-
ology: implications for human cancer. Curr Opin Oncol 16, 32-38
[54] Meeker, A. K. (2006). Telomers and telomerase in prostatic intraepithelial
neoplasia and prostate cancer biology. Urologic Oncology 24, 122-130
[55] Merkle, W. (1997). Prostatakarzinom. Duale Reihe, Hippokrates Verlag
Stuttgart, 182-193
[56] Miller, K. C., Börgermann, Thüroff, J., Albers, P., Wirth, M. (2006). Thera-
pieoptionen beim hormonrefraktären Prostatakarzinom. Urologe 45, 580-585
[57] Miller, K., Weißbach, L. (1999). Leitlinien zur Diagnostik von Prostatakarzi-
nomen. Urologe A 38, 388-401
[58] Miller, K.; Weißbach, L. (1999). Leitlinien zur Therapie von Prostatakarzino-
men. Urologe A 38, 630-639
[59] Myers, R. B., Grizzle, W. E. (1996). Biomarkerexpression in prostatic intra-
epithelia neoplasia. Eur Urol 30, 153-166
81
[60] Nagata, S. (1997). Apoptosis by Death factor. Cell 88, 355-365
[61] Oka, S., Tanaka, S., Hiyama, T., Kitadai, Y., Yoshihara, M., Shimamoto, F.,
Haruma, K., Chayama, K. (2002). Human Telomerase Reverse Transcriptase,
p53 and Ki-67 Expression and Apoptosis in Colorectal Serrated Adenoma.
Scand J gastroenterol 10, 1194-1200
[62] Plentz, R. R., Rudolph, K. L. (2006). Telomer-Dysfunktion und Telomerase:
Pathogenetische Relevanz während der Alterung und bei chronischen Erkrankungen. Dtsch Med Wochenschr 131, 2087-2090
[63] Pollack, A., deSilvio, M., Khor, L. Y., Li, R., Hammond, M. E. (2004). Ki-67
Staining is a strong Predictor of distant Metastasis and Mortality for Men with
Prostate Cancer Treated with Radiotherapy plus Androgen Deprivation: Radiation Therapy Oncology Trial 92-02. Journal of clinical oncology 22, 21332140
[64] Ramsamooj, P., Kuettel, M., Dritschilo, A., Jung, M. (1997). p53-
independent tumorgenic progression of human prostate cells. Radiation Oncology Investigations 5, 269-274
[65] Rohde, V., Sommerfeld, H.-J., Sattler, H.-P., Wullich, B. (1998). Telomerase
in Tumoren: Fakten und Perspektiven. Urologe A 37, 386-394
[66] Sharpless, N. E., DePinho, R. A. (2004). Telomeres, stem cells, senescence
and cancer. J. Clin. Invest. 113, 160-168
[67] Silbernagel, S., Lang, F. (1998). Apoptotischer Zelltod. Taschenatlas der Pa-
thophysiologie, Georg Thieme Verlag Stuttgart
[68] Siracusano, S., Niccolini, B., Knez, R., Tiberio A., Benedetti, E., Bonin, S.,
Ciciliato, S., Pappagello, G. L., Belgrano, E., Stanta, G. (2005). The simultaneous Use of Telomerase, Cytokeratin 20 and CD4 for Bladder Cancer Detecion in Urine. European Urology 47, 327-333
82
[69] Smith, J. R., Freier, D., Carpten, J., Grönberg, H. (1996). Major suspectibility
locus for prostate cancer on chromosome 1 suggested by genomic wide
search. Science 274, 337
[70] Soda, H., Raymond, E., Sharma, S., Lawrence, R., Davidson, K., Oka, M.,
Kohno, S., Izbicka, E., von Hoff, D. (2000). Effects of androgen on telomerase activity in normal and malignant prostate cells in vitro. The Prostate 43,
161-168
[71] Steiner, M. S. (1995). Review of peptide growth factors in benign prostatic
hyperplasia and urological malignancy. The Journal of Urology 153, 10851095
[72] Steiner, M. S., Satterwhite D. J., Moses H. L. (1995). Molecular Insights into
Altered Cell Cycle – Regulation and Genitourinary Malignancy. Urol Oncol 3,
3-17
[73] Suenaga, M., Soda, H., Oka, M., Yamaguchi, A., Nakatomi, K., Shiozawa,
K., Kawabata, S., Kasai, T., Yamada, Y., Kamihira, S., Tel, C., Kohno, S.
(2002). Histone deacetylase inhibitors supress telomerase reserve transcriptase
mRNA expression in prostate cancer cells. Int. J. Cancer 97, 621-625
[74] Taftachi, R., Ayhan, A., Ekici, S., Ozen, H. (2005). Proliferating-cell nuclear
antigen (PCNA) as an independent prognostic marker in patients after
prostatectomy: a comparison of PCNA and KI-67. BJU 95, 650-654
[75] Thelen, P., Wuttke, W., Jarry, H., Grzmil, M., Ringert, R. (2004). Inhibition
of telomerase activity and secretion of prostate specific antigen by silibinin in
prostate cancer cells. J. Urol 171, 1934-1938
[76] Tumorregister München (2001). Jahresbericht 2000. Schwerpunkt: Ösopha-
gus, Magen, Prostata. Zuckschwerdt, München
83
[77] Uzoaru, I., Rubenstein, M., Mirochnik, Y., Slobodskoy, L., Shaw, M., Gui-
nan, P. (1998). An evaluation of the marker p53 and Ki-67 for their predictive
value in prostate cancer. Journal of Surgical Oncology 67, 33-37
[78] Weinberg, R. A. (1996). Wie Krebs entsteht. Spekrum der Wissenschaft Spe-
zial Krebsmedizin 5, 7-17
[79] White, R., Deitch, A., Gumerlock, P., Shi, X. B. (1999). Use of yeast assay to
detect functional alteration in p53 in Prostate Cancer: Review and future directions. The Prostate 41, 134-142
[80] Wong, S. C. H., Hanry, Y., Shabbir, M., Moochhala, J., So, B. Y. (2003). An-
tisense Telomerase Induced Cell Growth Inhibition, Cell Cycle Arrest and Telomerase Activity Down-regulation in Gastric and Colon Cancer Cells. Anticancer Research 23, 465-470
[81] Zhu, K., Sakamoto, T., Fukasawa, I., Hayashi, M., Inaba, N. (2007). Telom-
erase expression and cell proliferation in ovarian cancer cells induced by histone deacetylase inhibitors. Arch Gynecol Obstet 7, 15-18
84
Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Noldus für die übernommene Patenschaft
meiner Dissertation und Herrn Dr. med. Hinkel für die engagierte Betreuung während dieser Zeit. Dank auch dem urologischen Labor für die Unterstützung bei der
Ausführung des experimentellen Abschnittes dieser Arbeit.
85
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Vorname
Geburtsdatum/-ort
Wohnort
Familienstand
Konfession
Stranghöner
Marc Eric
19.10.1972 in Bielefeld
Hermannstr. 30
32423 Minden
verheiratet
neuapostolisch
Schulbildung
1979-1983
1983-1993
Grundschule Herford-Elverdissen
Ravensberger Gymnasium Herford
Bundeswehr
1993-1995
07/1993-10/1993
10/1993-03/1994
03/1994-06/1994
07/1994-10/1994
10/1994-12/1994
01/1995-06/1995
07/1996
Wehrdienst auf Zeit bei der deutschen Bundesmarine
Ausbildung zum Sanitätssoldaten
Sanitätssoldat in der Sanitätsstaffel auf Borkum
Ausbildung zum Marineunteroffizier an der
MUS in Plön
Fachliche Ausbildung zum MarineUnteroffizier der Versorgung in List auf Sylt
Ausbildung zum Marineoffizier der Reserve
an der Marineschule in Mürwik
Marineoffiziersanwärter im Stab 6.MGS in
Wilhelmshaven
Ernennung zum Leutnant zur See der Reserve
Hochschulstudium
10/1995- 11/2001
08/1998
08/2000
10/2000-11/2001
Ruhr-Universität-Bochum: Studiengang Humanmedizin
Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Praktisches Jahr: Bergmannsheil Bochum;
Marienhospital Herne
86
Klinische Weiterbildung:
01.12.2001-31.03.2003
Klinikum Nord Hamburg
Abteilung für Chirurgie
(Prof. Dr. med. Rückert)
01.04.2003-30.04.2004
Medizinisches Zentrum Aachen
Abteilung für Urologie
(Prof. Dr. med. Hofmockel)
01.05.2004-31.12.2005
Stadtkrankenhaus Worms
Abteilung für Urologie
(Prof. Dr. med. Hofmockel)
01.01.2006-heute
Klinikum Minden
Abteilung für Urologie
(Prof. Dr. med. Piechota)
27.10.2007
Facharzt für Urologie
87